Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
Enzyme immunoassay for the detection of antibodies to HIV1, HIV2
and HIV1 (subtype O) antigens
Enzymimmunoassay zum Nachweis von Antikörpern gegen HIV1-,
HIV2- und HIV1 (Subtyp O)-Antigene
Test immunoenzymatique pour le dépistage des anticorps antiantigènes VIH1, VIH2 et VIH1 (sous-type O)
Metodo immunoenzimatico per l'identificazione degli anticorpi contro
gli antigeni HIV1, HIV2 e HIV1 (sottotipo O)
Prueba inmunoenzimática para la detección de anticuerpos contra los
antígenos HIV1, HIV2 y HIV1 (subtipo O)
Teste imunoenzimático para detecção de anticorpos contra os
antigénios HIV1, HIV2 e HIV1 (subtipo O)
English:
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2
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Summary of Test Procedure
Kurzanleitung Testdurchführung
La technique en bref
Istruzioni en breve, esecuzione del test
Resumen de la técnica
Resumo da técnica
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49
Bibliography/Literatur/Littérature/
Bibliografia/Bibliografía/Bibliografia
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OQFK G13 C0542 (908) H/R
1
50
Edition February 2004
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
Intended Use
Enzyme immunoassay for the detection of antibodies to antigens of HIV1, HIV2 and HIV1 (subtype O) in
serum or plasma. The enzyme immunoassay is processed on the BEP® II, BEP® III and BEP® 2000 ELISA processors. The test was developed for investigation of individual samples, not pooled samples. The product is for in
vitro diagnostic use only.
Summary and Explanation
Acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) was first recognized in 1981 as a clinical picture in its own right.
The disease is today considered to involve two different Human Immunodeficiency Viruses (HIV1 and HIV2) as
causal agents. The HIV1 virus (synonym: LAV/HTLV-III) was isolated as early as in 19831,2 and a further such
pathogenic human virus (HIV2) was isolated in 1986 3. A high level of importance is attached to the serological
determination of antibodies to HIV, especially in the field of transfusion medicine where measures are needed to
prevent the further spread of the disease.
Consequently, from 1985 onwards, donor blood was screened for HIV1 antibodies, both by blood banks and
manufacturers of plasma products. Subsequent information on the spread of HIV2 infections revealed that blood
donors need to be tested not only for anti-HIV1 antibodies but also for anti-HIV2 on a routine basis in order to
exclude to the greatest possible extent the potential risk of transmission via blood transfusions or blood-derived
products.
In 1990 a new HIV subtype was reported.4 In 1994 two independent teams succeeded, simultaneously, in sequencing this new subtype5,6. Parallel to this virological research, several teams were able to demonstrate the
serological significance of the virus, by then known as HIV1 Subtype O 7. This research showed that some antiHIV 1+2 assays exhibit weaknesses in detecting Subtype O antibodies 8. Consequently, a need arose for reliable
concurrent detection of this new HIV variant along with the established HIV1 and HIV2 isolates.
Although the detection of antibodies specific for HIV1 and HIV2 does not allow definite conclusions to be made
on whether infectious HIV1 or HIV2 is present in the blood at the time of the test, in the same way that a negative
result does not exclude the presence of HIV1 or HIV2 with certainty, currently the test provides the best means
of detecting and eliminating blood donations from HIV-infected donors with a high level of probability.
Principle of the Method
HIV-specific immunoglobulins contained in the test sample bind to the recombinant HIV1, HIV2, and/or HIV1
(Subtype O) proteins bound to the surface of the microtitration plate.
The unbound sample components are washed out and then the conjugate is bound to the HIV-specific antibodies.
The excess conjugate is removed and the enzyme activity of the bound conjugate is then determined (blue
colour reaction). The enzymatic reaction with the chromogen is terminated by the addition of Stopping Solution
POD (yellow colour reaction). The colour intensity is proportional to the concentration of antibody present in
the sample.
Reagents
Materials provided
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
HIV-Ag/POD-Conjugate
Sample Buffer (Anti-HIV)
Control Serum, positive (Anti-HIV1)
Control Serum, negative (Anti-HIV)
Washing Solution POD (concentrate)**
Buffer/Substrate TMB**
Chromogen TMB**
Stopping Solution POD**
Empty bottle
Label marked "Empty bottle for conjugate"
Adhesive foils
Instruction for Use
Barcode table
PE bag
Further packs: 570 x 96 (Q)
2 x 96
10 x 96
2 test plates
2 x 15 ml
2 x 15 ml
2 x 1.4 ml
2 x 2.8 ml
6 pcs.
1 pcs.
1 pcs.
1 pcs.
10 test plates
10 x 15 ml
4 x 15 ml
3 x 1.4 ml
3 x 2.8 ml
2 x 100 ml
4 x 30 ml
4 x 3 ml
2 x 100 ml
1 pcs.
1 pcs.
30 pcs.
1 pcs.
1 pcs.
1 pcs.
** These components are also included in the Supplementary Reagents for Enzygnost* TMB kit (code no. OUVP).
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2
Edition February 2004
Additional materials required, but not provided, for the 2 x 96 kit
Supplementary Reagents for Enzygnost* TMB (code no. OUVP)
Composition
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus (test plate)
Microtitration plate coated with a mixture of recombinant HIV(env) proteins (E. coli). The proteins represent
immunoreactive regions of the following viral proteins:
gp 41 (HIV1), gp 41 (HIV1 Subtype O), gp 36 (HIV2).
HIV Ag/POD Conjugate
Recombinant HIV protein and synthetic HIV peptides, peroxidase(POD)-conjugated, ready-for-use, with the
additives Tris-hydroximethylaminomethan (36 g/l) and sodium chloride (6 g/l).
Preservative:
phenol (max. 1 g/l)
Sample Buffer (Anti-HIV)
Contains glycerin (100 g/l), Tween 20 (20 g/l), sodium chloride (8.8 g/l), EDTA (1.9 g/l), bovine albumin (1 g/l),
polygeline and phosphate (50 mmol/l).
Preservative:
phenol (max. 1 g/l)
Control Serum, positive (Anti-HIV1)
Heat-treated human serum containing antibodies to HIV1 antigens, stabilized.
Preservative:
phenol (max. 1 g/l)
Control Serum, negative (Anti-HIV)
Human serum without antibodies to HIV1, HIV2 and HIV1 (Subtype O) antigens, stabilized.
Preservative:
phenol (max. 1 g/l)
Washing Solution POD (concentrate)
Phosphate buffer solution (90 mmol/l) containing Tween (18 g/l).
Preservative:
phenol (max. 1 g/l)
Buffer/Substrate TMB
Hydrogen peroxide (approx. 0.1 g/l) in acetate buffer solution (25 mmol/l).
Preservative:
n-butanol (max. 1%)
Chromogen TMB
Tetramethylbenzidine dihydrochloride (5 g/l).
Stopping Solution POD
0.5 N sulfuric acid.
Empty bottle for working chromogen solution
Polyethylene bag for storing unused test strips
Barcode table
Warnings and Precautions
1. For in vitro diagnostic use.
2. Each individual blood donation for use in manufacture of the control sera is tested for HBsAg, anti-HCV,
anti-HIV1 and anti-HIV2 by FDA-required test. The Control Serum, negative, is produced using only sera
with negative findings. The positive control serum has been heat-treated (no less than 1 hour at +56 °C).
Nevertheless, since absence of infectious agents cannot be proven, all samples (e.g. patient sera) and
products (e.g. control sera) obtained from human blood should always be handled with due care, observing the precautions recommended for biohazardous material9.
3. It is advisable to wear protective gloves throughout the entire test procedure.
4. For disposal, it is recommended that solid infectious materials should be autoclaved for at least one hour
at +121 °C. All aspirated solutions should be collected in two receptacles connected in series, which
should both contain a disinfectant suitable for inactivating pathogenic human viruses. The concentrations
and reaction times specified by the manufacturer must be observed.
5. The pack contains a matched set of reagents. Reagents must not be interchanged with other kits unless
the reagents are from an identical lot (i.e. they must display the required 6-digit lot numbers printed on the
pack and given in the enclosed barcode table of values). Washing Solution POD, Stopping Solution POD
and Working Chromogen Solution are exceptions to this requirement. Note that the Working Chromogen
Solution must first be prepared from matched components (do not use Chromogen TMB and Buffer/Substrat TMB from kits with a different number).
Preparation of the Reagents
Bring all reagents and samples to +18 to +25 °C before the start of the test, without removing the test plates
from the container.
The pack of Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus 10 x 96 includes a barcoded label for an empty bottle for the HIV-Ag/
POD Conjugate. When running large series of samples, to avoid frequent changing of the syringes on the
BEP® III it may be expedient to pour several vials of the HIV-Ag/POD Conjugate into a larger bottle (e.g. a
surplus unused empty bottle for Working Chromogen Solution or a rinsed bottle of Stopping Solution POD), to
label this bottle with the label "Empty bottle for conjugate" and to insert the labelled bottle into the reagent rotor.
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3
For each test plate, dilute 20 ml Washing Solution POD to 400 ml with distilled or demineralized water.
Working Chromogen Solution: For each test plate, dilute 1 ml Chromogen TMB with 10 ml Buffer/Substrate TMB in the plastic bottle supplied with the kit (= working chromogen solution) and store closed and
protected from light. Rinse the bottle thoroughly with distilled water after use.
For technical reasons (overfill) it is not permissible to pour together the full contents of the Chromogen TMB
vial and the full contents of the Buffer/Substrate TMB vial.
Storage and Stability
Stored unopened at the stated temperature all the components of the Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus kit may be
used up to the dates given on the labels.
For details on the stability and storage of the opened and diluted reagents, see Table 1 in the Appendix.
Equipment required:
For automatic dispensing of reagent and washing
BEP® II:
BEP® III:
For automatic processing of the test after dispensing the samples as well as for evaluation
BEP® 2000:
For fully automatic processing and evaluation of the test
Pipettes:
piston-type pipettes 25, 100 and 1000 µl
Incubator:
Covered water bath (+37 ± 1 °C) or comparable incubation methods
All the equipment used in the test must have been validated.
Specimens
Suitable specimens are individual samples (human sera or EDTA/heparinized/citrated plasma) obtained by
standard laboratory techniques. The samples should be stored for not more than 3 days at +2 to +8 °C. If the
samples are to be stored for a longer period of time, they must be frozen.
Procedure
Test procedure using the BEP® II
1. Pipetting scheme:
Ascertain the number of wells required (number of samples to be investigated plus 6 wells for controls). Remove
from the holder any strips which are not required for the test and store for later use (See Table 1 for stability data).
2. Introduce sample buffer:
Fill each well with a receiving volume of 25 µl of sample buffer.
3. Dispense samples:
Pipette 100 µl/well of the negative control into 4 wells and 100 µl/well of the positive control into 2 wells.
Dispense 100 µl/well of undiluted sample into the following wells. Cover the finished test plate with foil and
place in the incubator as soon as possible, max. 15 min after completion of the sample dispensing step.
As an alternative to the above pipetting scheme, it is also possible to pipette the positive control once at
the start and once at the end of the series.
Pipetting scheme: Pipette 100 µl/well of negative Control, into 4 wells, 100 µl of positive control into the
next well and then fill the following wells with 100 µl/well of undiluted sample. At the end of the series /
plate pipette 100 µl of positive control once more.
4. Incubate:
Incubate at +37 ± 1 °C for 30 ± 2 minutes, then proceed immediately to the washing step.
5. Wash:
Remove the foil, aspirate all the wells and wash 4 times with approx. 0.3 ml/well of washing solution.
6. Dispense conjugate:
Fill each well with 100 µl conjugate, cover with fresh foil and immediately place into the incubator.
7. Incubate:
Incubate at +37 ± 1 °C for 30 ± 2 minutes as described in "4. Incubate", then proceed immediately to the
next wash step.
8. Wash:
Remove the foil and wash as described in "5. Wash".
9. Dispense substrate:
Pipette 100 µl of the Working Chromogen Solution into each well and cover the plate with fresh foil.
10. Incubate:
Incubate at +18 to +25 °C for 30 ± 2 minutes, protected from light.
11. Stop reaction:
Remove the foil and add 100 µl of Stopping Solution POD to each well, keeping to the same timing as
in "9. Dispense substrate".
12. Read:
At 450 nm within one hour.
The absorbances of the control and patient samples are to be measured at a wavelength of 450 nm. The
wavelength recommended for the reference reading is 650 nm (if necessary between 615 nm and 690 nm).
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4
Test procedure using the BEP® III
Before using the BEP® III, prepare the test plates and sample dispensing steps (Section 1 and 2 at "Test
procedure with the BEP® II"). Immediately afterwards place the uncovered test plates (i.e. not covered with
adhesive foil) into the BEP® III. Note that partially filled test plates need to be made up to at least half plates (6
test strips) by adding "water-filled strips". The test is then processed fully automatically (see BEP® III instruction manual).
The settings for the incubation times in the BEP® III software may differ from the times on the BEP® II for
technical reasons (system speed) but have been validated for Enzygnost* on the BEP® III.
Test procedure using the BEP® 2000
The sample dispensing steps and subsequent processing steps in the test are performed fully automatically in
the instrument (see instruction manual for the BEP® 2000).
Test validation
The individual values of the absorbances for the control sera must comply with the following specification:
-0.010 ≤ Aneg. ≤ 0.150
Apos. ≥ 0.700
If one of the four absorbance values of the Control Serum, negative, is outside the specification, this value can
be neglected.
Both absorbance values of the positive control must comply with the specification.
If these conditions are not fulfilled, the test is to be repeated.
Evaluation
On the BEP® 2000 and BEP® III the results are evaluated automatically. Please consult the instruction manuals
for further details in this respect. The following sections apply if the results are evaluated without software
assistance.
Calculate the mean absorbance value of the valid negative controls and then calculate the cut-off value by
adding 0.400:
_
Aneg. + 0.400 = cut-off
The retest range is defined as:
Cut-off to cut-off - 10%
Based on the criteria of the test, the samples are classed as follows:
Test result:
1.
Asample
^ "negative"
< cut-off - 10% =
2.
Asample
> cut-off
^ "reactive"
=
^= "equivocal"
3.
cut-off - 10% ≤ Asample ≤ cut-off
Samples with absorbances within or above the retest range are to be retested in dual determination. If in the
retest absorbances below the retest range are yielded, the sample is to be considered antibody negative as
defined by the criteria of the test.
If the mean absorbance of the sample is again within the retest range or above this range, the sample is to be
considered repeatedly reactive. All samples which are equivocal or reactive in the retest must be checked in a
confirmatory test (e.g. Western Blot analysis).
Limitations of the Procedure
1. Anticoagulants such as heparin, EDTA and citrate do not interfere with the test result.
2. Lipaemic, icteric or haemolytic samples do not interfere with the test.
3. Samples containing potential interference factors, rheumatoid factors, EBV/IgM antibodies, VZV/IgM antibodies, E.-Coli antibodies, ANA and AMA, as well as sera from pregnant women, were checked in the test.
The samples used were found not to interfere with the results.
4. No interference was observed with samples which had been repeatedly frozen and thawed, or with sera
which had been heat-treated (30 min, +56 °C).
5. Inadequately coagulated sera, or microbially contaminated samples, should not be used. Any particulate
constituents (e.g. fibrin clots, erythrocytes) must be removed before the assay.
6. For thawed samples ensure good homogenisation of the material.
7. The test is suitable only for testing individual samples and not for pooled or diluted samples.
8. Reagents must not be interchanged with other kits unless the reagents are from an identical lot (i.e. they
must display the required 6-digit lot numbers printed on the pack and given in the enclosed barcode table).
Exceptions are Washing Solution POD, Stopping Solution POD and the Working Chromogen Solution
(which is prepared from Chromogen TMB and Buffer/Substrate TMB using the required lots).
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5
9. Buffer/Substrate TMB, Working Chromogen Solution and Stopping Solution POD must not be allowed to
come into contact with heavy metal ions or oxidizing substances (do not use pipettes with metal parts
which are in direct contact with the liquid). Do not perform the substrate reaction in the proximity of disinfectants containing hypochlorite. If the Working Chromogen Solution has developed a blue colour before
transferral into the test plate, this indicates that the solution is contaminated; in such cases prepare a fresh
solution in a clean container. Skin contact with the above-mentioned solutions is to be avoided.
10. The test plate should be protected from vibration during the incubation phase (e.g. placed on a secured
floatation aid, or in a non-circulating water bath); the wells of the plate must be in contact with the thermostated water. If stabilizers are used to prevent microbial contamination of the water, care must be taken that
neither the surface of the test plate nor the wells come into contact with these solutions since such contamination can lead to unspecific reactions.
11. Highly reactive samples may cause precipitation of the dye during the stopping reaction. This does not
interfere with the photometric evaluation.
12. The control sera have been prepared from native human sera. As a result, turbidity may occur but this has
no effect on the test result.
13. Dade Behring has validated use of these reagents on various analyzers to optimize product performance
and meet product specifications. User defined modifications are not supported by Dade Behring as they
may affect performance of the system and assay results. It is the responsibility of the user to validate
modifications to these instructions or use of the reagents on analyzers other than those included in Dade
Behring Application Sheets or these instructions for use.
14. Results of this test should always be interpreted in conjunction with the patient’s medical history, clinical
presentation and other findings.
Specific Performance Characteristics
Sensitivity and Specificity
The results of the study on sensitivity and specificity are summarized in Tables 2 + 3 (see Appendix).
To establish the sensitivity, a total of 566 anti-HIV1, 317 anti-HIV2 and 22 anti-HIV1 (Subtype O) positive
samples were investigated. All the tested 905 anti-HIV-positive samples were found to be positive as defined by the criteria of the Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus test. The reactivity of the test with regard to seroconversion samples was studied using 31 seroconversion panels. The results of the study show that, in the
detection of seroconversions, Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus exhibits a degree of sensitivity which matches
that of comparable tests. Nevertheless the possibility cannot be ruled out that isolated samples may escape
detection when the test is used on a large scale.
To establish the specificity, a total of 9243 anti-HIV-negative samples were investigated and the specificity was
found to be 99.3 to 100 % (initial testing) and 99.9 % (retest result). Deviations from these findings may occur
due to variations in sample population, test procedure, etc.
Current knowledge indicates that a positive result in the anti-HIV test does not yield definite evidence that the
blood contains infectious HIV1 or HIV2, just as a negative test result also does not definitely exclude the
presence of HIV1 or HIV2.
Reproducibility
The results on intra-assay and inter-assay reproducibility are summarized in Table 4 (in the Appendix). The
data shown are typical results. Depending on various factors (procedure, etc), different values may well be
obtained.
*
Enzygnost is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in Germany and other countries.
BEP is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in the USA, in Germany and other countries.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
USA Distributor: Dade Behring Inc.
Newark, DE 19714 U.S.A.
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0197
Tab. 1 Stability and Storage
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
State
Storage
Stability•
Enzygnost Anti-HIV 1/2 Plus
(Test plate/remaining strips)
once opened
+2 to +8 °C
in the bag with
the desiccant
6 weeks
HIV-Ag/POD Conjugate
once opened
+2 to +8 °C
+18 to +25 °C
4 weeks
2 days
Sample Buffer (Anti-HIV)
once opened
+2 to +8 °C
4 weeks
Control Serum, positive
(Anti-HIV 1)
Control Serum, negative
(Anti-HIV)
once opened
+2 to +8 °C
< -20 °C
+2 to +8 °C
< -20 °C
4 weeks
3 months
4 weeks
3 months
Material/reagent
*
•
once opened
Chromogen TMB
once opened
+2 to +8 °C
expiry date
Buffer/Substrate TMB
once opened
+2 to +8 °C
expiry date
Working Chromogen Solution
once mixed
+2 to +8 °C
+18 to +25 °C
in closed container
protected from light
5 days
8 hours
Washing Solution POD
(concentrate)
once opened
once mixed
+2 to +8 °C
+2 to +8 °C
+18 to +25 °C
expiry date
1 week
1 day
Stopping Solution POD
once opened
+2 to +8 °C
expiry date
use each component by the expiry date at the latest
Tab. 2 Sensitivity
The sensitivity studies performed at four independent centres (Br, F, G, E) yielded the following data:
Sample population
(Br) Anti-HIV1 pos. (Europe)
Anti-HIV1 pos. (USA)
Anti-HIV1 pos. (Africa)
Anti-HIV2 pos.
Anti-HIV1 (subtype O) pos.
Serokonversion panel
(F)
Anti-HIV1 pos.
Anti-HIV2 pos.
Anti-HIV1 (subtype O) pos.
(G) Anti-HIV1 pos.
Anti-HIV2 pos.
Anti-HIV1 (subtype O) pos.
(E) Anti-HIV1 pos.
Anti-HIV2 pos.
Number of samples
Initially reactive
51
55
136
54
7
31 Anti-HIV 1 panels
51
55
136
54
7
Sensitivity matches that
of comparable tests
77
48
10
150
44
5
97
171
77
48
10
150
44
5
97
171
Tab. 3 Specificity
The specificity studies performed at four independent centres (Be, Br, E, F) yielded the following data:
Sample population
Number
Initially reactive
Retest reactive
of samples
(Be) Normal negative sera (Germany)
3160
0
(Br) Normal negative sera (Germany)
2397
4
3
Normal negative plasmas (Germany)
197
0
Normal negative sera (West-Africa)
436
3
not testet
(E) Normal negative sera (Germany)
2003
0
(F) Normal negative sera (France)
1050
0
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7
Tab. 4 Reproducibility
In the reproducibility studies the samples were tested in 8-fold determinations on each of 5 days. The coefficient of variation (CV) was calculated using the variance component model.
Sample
Mean absorbance
F1
F2
F3
F4
F5
F6
OQFK G13 C0542 (908) H/R
2.36
1.74
0.54
0.75
0.51
0.06
8
% CV
Intra-assay
Inter-assay
4.7
3.0
7.0
5.9
3.9
9.2
12.6
11.4
5.2
16.3
17.0
39.5
Tab. 5 Test procedure and programming steps
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
Test procedure
Menu programming
for the
(BEP® II, BEP® III, BEP® 2000)
BEP® 2000
Prepare reagents
BEP® II
MENU NO
25 µl Sample Buffer
OPERATE 1
YES
Dispense Sample Buffer
4 x 100 µl Control Serum, negative
2 x100 µl Control Serum, positive
100 µl / well undiluted sample
BEP® II
BEP® III
30 min ± 2 min
(37 ± 1 °C)
In the case of partially
filled plates: Add
"water-filled strips"
to half fill the plates
Wash 4x:
BEP® II
100 µl conjugate
0
NO
0
25
3
NO
OPERATE 2
YES
Wash and dispense conjugate
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
4
NO
0
100
2
NO
OPERATE 3
YES
Wash and dispense chromogen
30 min ± 2 min
(37 ± 1 °C)
Automatic
assay processing
Wash 4x:
BEP® II
100 µl Working
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
4
NO
0
100
4
NO
OPERATE 4
YES
Dispense Stopping Solution
Chromogen Solution
30 min ± 2 min
+18 °C to +25 °C
(protected from light)
100 µl Stopping Solution
(after max. 1 h)
Read at 450 nm
(Reference wavelength:
650 nm)
Test result
OQFK G13 C0542 (908) H/R
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
9
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
0
NO
0
100
5
PHOT
YES
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
450
650
NO
1
NO
4
0.150
0.400
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
Anwendungsbereich
Enzymimmunoassay zum Nachweis von Antikörpern gegen HIV1-, HIV2- und HIV1 (Subtyp O)-Antigene in Serum
oder Plasma. Die Abarbeitung des Enzymimmunoassays erfolgt mit den ELISA Prozessoren BEP® II, BEP® III und
BEP® 2000. Der Test wurde entwickelt für die Untersuchung von Einzelproben, nicht von gepoolten Proben. Das
Produkt darf nur für in vitro diagnostische Zwecke angewendet werden.
Diagnostische Bedeutung
Das erworbene Immundefektsystem (AIDS) wurde erstmalig 1981 als eigenständiges Krankheitsbild erkannt.
Als ursächliche Erreger gelten heute zwei verschiedene Human Immundefizienz Viren (HIV1 und HIV2). Die
Isolierung des HIV1 (Synonyom: LAV/HTLV III) gelang bereits 19831, 2 . Im Jahre 1986 wurde ein weiteres
Virus (HIV2) isoliert, das ebenfalls als humanpathogen gilt3. Die Bedeutung der serologischen Bestimmung
von Antikörpern gegen HIV hat besonders für die Transfusionsmedizin unter dem Gesichtspunkt der Prävention zur Verhütung der weiteren Ausbreitung der Erkrankung einen hohen Stellenwert.
Folgerichtig wurde ab 1985 begonnen, Spenderblut auf Anti-HIV1-Antikörper sowohl in Blutbanken als auch
bei Herstellern von Plasmaprodukten zu testen. Zwischenzeitliche Informationen über die Verbreitung von
HIV2-Infektionen ergaben das Bedürfnis einer routinemäßigen Untersuchung von Blutspendern außer auf
Anti-HIV1- auch auf Anti-HIV2-Antikörper, um eine potentielle Übertragung durch Transfusion oder aus Blut
hergestellten Präparaten nach Möglichkeit auszuschließen.
Im Jahre 1990 wurde ein neuer HIV Subtyp beschrieben4. 1994 gelang gleichzeitig die Sequenzierung dieses
neuen Subtyps bei zwei unabhängigen Arbeitsgruppen5 ,6. Parallel zu den virologischen Arbeiten konnte von
mehreren Arbeitsgruppen die serologische Bedeutung von dem nun HIV1-Subtyp O7 genannten Virus gezeigt
werden. Danach zeigen manche Anti-HIV 1+2-Assays Schwächen bei der Detektion von Anti-Subtyp O-Antikörpern8. Folgerichtig entstand der Bedarf zum gleichzeitigen sicheren Nachweis dieser neuen HIV-Variante
und den etablierten HIV1- und HIV2-Isolaten.
Obwohl der Nachweis von HIV1- und HIV2-spezifischen Antikörpern keine sicheren Aussagen darüber erlaubt, ob zum Zeitpunkt des Testes infektiöses HIV1 bzw. HIV2 im Blut vorhanden ist, als auch bei negativem
Ergebnis keineswegs die Anwesenheit von HIV1 oder HIV2 sicher ausgeschlossen werden kann, stellt der
Antikörpertest dennoch die derzeit beste Möglichkeit dar, Blutspenden von HIV-Infizierten mit großer Wahrscheinlichkeit zu erkennen und zu eliminieren.
Prinzip der Methode
In der Untersuchungsprobe enthaltene HIV-spezifische Immunglobuline binden sich an die auf der Oberfläche
der Mikrotitrationsplatte fixierten rekombinanten HIV1-, HIV2- und/oder HIV1 (Subtyp O)-Proteine.
Nach Entfernung der ungebundenen Probenbestandteile wird das Konjugat an die HIV-spezifischen Antikörper gebunden.
Nach Entfernung des überschüssigen Konjugates wird die gebundene Enzymaktivität des Konjugates bestimmt (blaue Farbreaktion). Die enzymatische Umsetzung des Chromogens wird durch Zusatz von Stopplösung POD unterbrochen (gelbe Farbreaktion). Die Farbintensität ist der in der Probe vorhandenen Antikörperkonzentration proportional.
Reagenzien
Inhalt der Handelspackung
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
HIV-Ag/POD-Konjugat
Proben-Puffer (Anti-HIV)
Kontroll-Serum, positiv (Anti-HIV1)
Kontroll-Serum, negativ (Anti-HIV)
Waschlösung POD (Konzentrat)**
Puffer/Substrat TMB**
Chromogen TMB**
Stopplösung POD**
Leerflasche
Etikett "Leerflasche für Konjugat"
Abklebefolien
Packungsbeilage
Barcode-Tabelle
PE-Beutel
Weitere Handelspackung: 570 x 96 (Q)
2 x 96
10 x 96
2 Testplatten
2 x 15 ml
2 x 15 ml
2 x 1,4 ml
2 x 2,8 ml
6 Stück
1 Stück
1 Stück
1 Stück
10 Testplatten
10 x 15 ml
4 x 15 ml
3 x 1,4 ml
3 x 2,8 ml
2 x 100 ml
4 x 30 ml
4 x 3 ml
2 x 100 ml
1 Stück
1 Stück
30 Stück
1 Stück
1 Stück
1 Stück
** Diese Komponenten sind auch Bestandteile der Packung Zusatz-Reagenzien für Enzygnost* TMB (Bestell-Nr. OUVP).
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10
Ausgabe Februar 2004
Zusätzlich benötigte Materialien für den Kit 2 x 96
Zusatz-Reagenzien für Enzygnost* TMB (Bestell-Nr. OUVP)
Zusammensetzung
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus (Testplatte)
Mit einem Gemisch von rekombinanten HIV(env)-Proteinen (E.Coli) beschichtete Mikrotitrationsplatte. Die
Proteine repräsentieren immunreaktive Bereiche folgender Virusproteine:
gp41 (HIV1), gp41 (HIV1-Subtyp O), gp36 (HIV2).
HIV-Ag/POD-Konjugat
Rekombinantes HIV-Protein und synthetische HIV-Peptide, Peroxidase (POD)-konjugiert, gebrauchsfertig mit
Zusatz von Tris-hydroximethylaminomethan (36 g/l) und Natriumchlorid (6 g/l).
Konservierungsmittel:
Phenol (max. 1 g/l)
Proben-Puffer (Anti-HIV)
Enthält Glycerin (100 g/l), Tween 20 (20 g/l), Natriumchlorid (8,8 g/l), EDTA (1,9 g/l), Albumin vom Rind (1 g/l),
Polygeline und Phosphat (50 mmol/l).
Konservierungsmittel:
Phenol (max. 1 g/l)
Kontroll-Serum, positiv (Anti-HIV1)
Hitzebehandeltes Humanserum mit Antikörpern gegen HIV1-Antigene, stabilisiert.
Konservierungsmittel:
Phenol (max. 1 g/l)
Kontroll-Serum, negativ (Anti-HIV)
Humanserum ohne Antikörper gegen HIV1-, HIV2- und HIV1 (Subtyp O)-Antigene, stabilisiert.
Konservierungsmittel:
Phenol (max. 1 g/l)
Waschlösung POD (Konzentrat)
Tween-haltige (18 g/l) Phosphat-Pufferlösung (90 mmol/l).
Konservierungsmittel:
Phenol (max. 1 g/l)
Puffer/Substrat TMB
Wasserstoffperoxid (ca. 0,1 g/l) in Acetat-Pufferlösung (25 mmol/l).
Konservierungsmittel:
n-Butanol (max. 1 %)
Chromogen TMB
Tetramethylbenzidin-dihydrochlorid (5 g/l).
Stopplösung POD
0,5 N Schwefelsäure.
Leerflasche für Chromogen-Gebrauchslösung
PE-Beutel zur Aufbewahrung nicht benötigter Testriegel
Barcode-Tabelle
Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen
1. Nur zur in vitro diagnostischen Anwendung.
2. Jede individuelle Blutspende, die zur Herstellung von Kontroll-Sera vorgesehen ist, wurde auf HBsAg, Anti-HCV,
Anti-HIV1 und Anti-HIV2 untersucht. Für die Herstellung des Kontroll-Serums, negativ, werden nur Sera mit negativem Befund verwendet. Das positive Kontroll-Serum wurde hitzebehandelt (mindestens 1 Stunde bei +56 °C).
Unabhängig davon sollten alle aus menschlichem Blut gewonnenen Proben (z. B. Patientensera) und
Produkte (z. B. Kontrollsera) wegen nie auszuschließender Gefährdung durch Krankheitserreger mit angemessener Sorgfalt unter Einhaltung der bei Biogefährdung empfohlenen Sicherheitsmaßnahmen gehandhabt werden9.
3. Das Tragen von Untersuchungshandschuhen während der gesamten Testdurchführung wird angeraten.
4. Für die Entsorgung fester infektiöser Materialien empfiehlt sich eine Autoklavierung von mindestens 1
Stunde bei +121 °C. Alle abgesaugten Lösungen sind in zwei hintereinandergeschalteten Vorlagen zu
sammeln. Die Vorlagen sollten ein Desinfektionsmittel enthalten, das geeignet ist, human-pathogene Viren zu inaktivieren. Die vom Hersteller angegebenen Konzentrationen und Einwirkungszeiten müssen
beachtet werden.
5. Die Reagenzien (ausgenommen Waschlösung POD, Stopplösung POD und die aus den chargengebundenen Reagenzien Chromogen TMB und Puffer/Substrat TMB hergestellte Chromogen-Gebrauchslösung) sind nur chargengebunden zu verwenden, d.h. nur in der Kombination der einzelnen 6-ziffrigen
Chargen-Bezeichnungen, die auf der Packung aufgedruckt bzw. der separat beigepackten Barcode-Wertetabelle zu entnehmen sind.
Vorbereitung der Reagenzien
Alle Reagenzien und Proben vor Testbeginn auf +18 bis +25 °C erwärmen. Dabei die Testplatte nicht dem
Behältnis entnehmen.
Der Packung Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus 10 x 96 liegt ein barcodiertes Etikett für eine Leerflasche für das HIVAg/POD-Konjugat bei. Um bei großen Serienlängen einen häufigen Spritzenwechsel am BEP® III zu vermeiden,
kann es sinnvoll sein, mehrere Abfüllungen des HIV-Ag/POD-Konjugats in eine größere Flasche (z.B. noch unbenutzte überzählige Leerflasche für Chromogen-Gebrauchslösung oder gespülte Flasche der Stopplösung POD)
umzuschütten, mit dem Etikett "Leerflasche für Konjugat" zu etikettieren und ins Reagenzienrad einzustellen.
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Je Testplatte 20 ml Waschlösung POD mit destilliertem oder entionisiertem Wasser auf 400 ml verdünnen.
Chromogen-Gebrauchslösung: Je Testplatte 1 ml Chromogen TMB mit 10 ml Puffer/Substrat TMB in der
mitgelieferten Kunststoffflasche verdünnen (Chromogen-Gebrauchslösung) und verschlossen unter Lichtschutz aufbewahren. Flasche nach Gebrauch sorgfältig mit destilliertem Wasser spülen.
Wegen technisch bedingter Überfüllung ist das Zusammengießen der Flascheninhalte von Chromogen TMB
und Puffer/Substrat TMB nicht zulässig.
Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen
Ungeöffnet sind alle Bestandteile der Kombinationspackung Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus bei der angegebenen Lagertemperatur bis zu den auf den Etiketten angegebenen Daten verwendbar.
Die Haltbarkeit und Lagerbedingungen der geöffneten bzw. gebrauchsverdünnten Reagenzien sind der Tabelle 1 im Anhang zu entnehmen.
Erforderliche Geräte:
Zur automatischen Durchführung der Reagenzien-Dosierung und der Waschschritte
BEP® II:
BEP® III:
Zur automatischen Testabarbeitung nach der Probendosierung sowie Auswertung
BEP® 2000:
Zur vollautomatischen Testabarbeitung sowie Auswertung
Pipetten:
Kolbenhubpipetten 25, 100 und 1000 µl
Inkubator:
Bedecktes Wasserbad (+37 ± 1 °C) oder vergleichbare Inkubationsmethoden
Alle zur Testdurchführung eingesetzten Geräte müssen validiert sein.
Untersuchungsmaterial
Zur Untersuchung können Einzelproben (Human-Seren oder -EDTA/Heparin/Citrat-Plasmen) verwendet werden, welche nach Standard-Labortechniken entnommen wurden. Die Proben sollten maximal 3 Tage bei +2 bis
+8 °C gelagert werden. Zur längeren Lagerung sind die Proben einzufrieren.
Testdurchführung
Testdurchführung mit BEP® II
1. Ansatzschema:
Benötigte Anzahl der Auftragsstellen feststellen (Anzahl der zu untersuchenden Proben plus 6 Vertiefungen für Kontrollen). Für die Testdurchführung nicht benötigte Riegel dem Halterahmen entnehmen und für
die spätere Verwendung lagern (siehe Tabelle 1).
2. Proben-Puffer-Vorlage:
Je Vertiefung 25 µl Proben-Puffer vorlegen.
3. Proben-Dosierung:
In 4 Vertiefungen je 100 µl negative und in 2 Vertiefungen je 100 µl positive Kontrolle einfüllen; in die
folgenden Vertiefungen je 100 µl unverdünnte Probe dosieren, mit Folie abkleben und baldmöglichst,
maximal 15 min nach Beendigung der Proben-Dosierung, in den Inkubator stellen.
Alternativ zu oben aufgeführtem Pipettierschema ist es auch erlaubt, die positive Kontrolle einmal zu
Beginn und einmal am Ende der Testreihe aufzutragen.
Pipettierschema: In 4 Vertiefungen je 100 µl negative, in eine Vertiefung 100 µl positive Kontrolle, in die
folgenden Vertiefungen je 100 µl unverdünnte Probe und am Ende der Serie bzw. Testplatte noch einmal
100 µl positive Kontrolle dosieren.
4. Proben-Inkubation:
30 ± 2 Minuten bei +37 ± 1 °C inkubieren, Waschvorgang unmittelbar anschließen.
5. Waschen:
Folie abziehen, alle Vertiefungen aussaugen und mit je ca. 0,3 ml Waschlösung 4mal waschen.
6. Konjugat-Dosierung:
In jede Vertiefung 100 µl Konjugat einfüllen, mit neuer Folie abkleben und sofort in den Inkubator stellen.
7. Konjugat-Inkubation:
30 ± 2 Minuten bei +37 ± 1 °C, wie unter 4. beschrieben, inkubieren, Waschvorgang unmittelbar anschließen.
8. Waschen:
Folie entfernen und wie unter 5. beschrieben waschen.
9. Substrat-Dosierung:
In jede Vertiefung 100 µl Chromogen-Gebrauchslösung einfüllen, Platte mit neuer Folie abkleben.
10. Substrat-Inkubation:
30 ± 2 Minuten bei +18 bis +25 °C lichtgeschützt inkubieren.
11. Stoppreaktion:
Die Folie entfernen. Je Vertiefung 100 µl Stopplösung POD zugeben, dabei den gleichen Zeittakt wie bei
Punkt 9. einhalten.
12. Messung:
Innerhalb einer Stunde bei 450 nm photometrieren.
Die Extinktionsmessung der Kontroll- und Patientenproben erfolgt bei 450 nm, als Wellenlänge der Referenzmessung wird 650 nm (ggfs. zwischen 615 und 690 nm) empfohlen.
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12
Testdurchführung mit BEP® III
Bei der Abarbeitung mit BEP® III müssen die Testplatten einschließlich der Probendosierung (Punkt 1 und 2
der "Testdurchführung mit BEP® II") vorbereitet werden. Unmittelbar im Anschluss daran werden die Testplatten offen, d.h. nicht mit Folie abgeklebt, in den BEP® III eingegeben. Dabei ist zu beachten, dass teilbestückte
Testplatten mit "Wasserriegeln" auf mindestens halbe Testplatten (6 Testriegel) zu ergänzen sind. Die anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch (siehe BEP® III-Bedienungsanleitung).
Die in der BEP® III Software eingestellten Inkubationszeiten können auf Grund der technischen Rahmenbedingungen (Gerätetaktung) von denen der BEP® II Prozessierung abweichen, sind jedoch in der Kombination
BEP® III/Enzygnost* validiert worden.
Testdurchführung mit BEP® 2000
Die Probendosierung und anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch im Gerät (siehe BEP® 2000Bedienungsanleitung).
Testvalidierung
Die Einzelwerte der Extinktionen für die Kontroll-Sera müssen folgende Spezifikationen erfüllen:
- 0,010 ≤ Eneg. ≤ 0,150
Epos. > 0,700
Von den vier Extinktionswerten des Kontroll-Serums, negativ, kann ein außerhalb der Spezifikation liegender
Wert vernachlässigt werden.
Die Extinktionswerte der positiven Kontrolle müssen beide die Spezifikation erfüllen.
Werden diese Bedingungen nicht erfüllt, ist der Test zu wiederholen.
Testauswertung
Die Auswertungen erfolgen mit BEP® 2000 und BEP® III automatisch. Bitte dazu die Bedienungsanleitungen
heranziehen. Die nachfolgenden Kapitel sind bei Auswertung ohne Softwareunterstützung zu beachten.
Aus den validen Extinktionswerten der negativen Kontrolle wird der Mittelwert gebildet.
Zur Grenzwertberechnung wird zum Extinktionsmittelwert der negativen Kontrolle ein Wert von 0,400 addiert:
_
Eneg. + 0,400 = Grenzwert (cut off)
Als Grauzone wird definiert:
Grenzwert bis Grenzwert -10 %
Nach den Kriterien des Tests werden die Untersuchungsproben wie folgt klassifiziert:
Testergebnis:
1. EProbe
< cut off -10 % ^= "negativ"
2. EProbe
> cut off
^ "reaktiv"
=
^ "grenzwertig"
=
3. cut off -10 % ≤ EProbe ≤ cut off
Proben, die Extinktionswerte in der Grauzone oder höhere Extinktionen ergeben, sind in Doppelbestimmung
erneut zu testen. Ergeben sich bei der Wiederholungstestung Extinktionswerte unterhalb der Grauzone, ist die
Probe nach den Kriterien des Tests als Antikörper-negativ anzusehen.
Bei erneut grenzwertigen oder höheren Extinktionsmittelwerten gilt die Probe als wiederholt reaktiv. Alle wiederholt grenzwertig oder reaktiv reagierenden Proben müssen einer Bestätigung mit Hilfe sogenannter Konfirmationstests (z.B. Western-Blot-Analyse) zugeführt werden.
Einschränkungen der Testdurchführung
1. Antikoagulantien wie Heparin, EDTA und Citrat beeinflussen das Testergebnis nicht.
2. Lipämische, ikterische oder hämolytische Proben führen zu keiner Testbeeinträchtigung.
3. Proben mit den potentiell störenden Substanzen Rheumafaktoren, EBV/IgM-Antikörper, VZV/IgM-Antikörper, E.-Coli-Antikörper, ANA und AMA sowie Seren von Schwangeren wurden mit dem Test überprüft. Mit
den eingesetzten Proben wurde keine Beeinflussung des Testergebnisses beobachtet.
4. Bei mehrfach eingefrorenen und aufgetauten Proben sowie bei hitzebehandelten Seren (30 min. +56 °C)
wurden keine Störungen beobachtet.
5. Ungenügend geronnene Seren und mikrobiell kontaminierte Untersuchungsproben sollten nicht eingesetzt werden. Eventuell vorhandene partikuläre Komponenten (z.B. Fibrin-Gerinnsel, Erythrozyten) müssen vor der Testdurchführung entfernt werden.
6. Bei aufgetauten Proben ist auf eine gute Homogenisierung des Materials zu achten.
7. Der Test ist nur für die Untersuchung von Einzelproben, nicht von gepoolten oder verdünnten Proben geeignet.
8. Die Reagenzien (ausgenommen Waschlösung POD, Stopplösung POD und die aus den chargengebundenen Reagenzien Chromogen TMB und Puffer/Substrat TMB hergestellte Chromogen-Gebrauchslösung) sind nur chargengebunden zu verwenden, d.h. nur in der Kombination der einzelnen 6-ziffrigen
Chargen-Bezeichnung, die auf der Packung aufgedruckt bzw. der separat beigepackten Barcode-Tabelle
zu entnehmen sind.
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13
9. Puffer/Substrat TMB, Chromogen-Gebrauchslösung und Stopplösung POD dürfen nicht in Kontakt mit
Schwermetallionen oder oxidierenden Substanzen kommen (keine Pipetten mit flüssigkeitsführenden
Metallteilen verwenden). Die Substratreaktionen nicht in der Nähe von Hypochlorit-haltigen Desinfektionsmitteln durchführen. Eine spontane Blaufärbung der Chromogen-Gebrauchslösung vor der Übertragung in
die Testplatte deutet auf Kontamination hin; eine frische Lösung ist in einem sauberen Gefäß anzusetzen.
Hautkontakt mit den vorgenannten Lösungen ist zu vermeiden.
10. Die Testplatte soll während der Inkubation ruhig liegen (z.B. auf fixierter Schwimmhilfe oder im nicht zirkulierenden Wasserbad); die Kavitäten sind dabei in Kontakt mit dem temperierten Wasser. Werden Stabilisatoren zur Verhinderung der Verkeimung des Wassers verwendet, so ist sorgfältig darauf zu achten, dass
weder die Testplattenoberfläche noch die Näpfchen mit diesen Lösungen in Kontakt kommen, da dadurch
unspezifische Reaktionen hervorgerufen werden könnten.
11. Bei stark reaktiven Proben kann bei der Stoppreaktion der Farbstoff ausfallen. Die photometrische Auswertung wird dadurch nicht beeinflusst.
12. Die Kontrollsera sind unter Verwendung nativer Humansera hergestellt. Daher können Trübungen auftreten, die das Testergebnis jedoch nicht beeinflussen.
13. Dade Behring hat den Einsatz dieser Reagenzien auf verschiedenen Analysengeräten auf optimale Produktleistung und Einhaltung der Produktspezifikationen überprüft. Vom Benutzer vorgenommene Änderungen werden von Dade Behring nicht unterstützt, da sie die Leistung des Systems und die Testergebnisse beeinflussen können. Es liegt in der Verantwortung des Benutzers, Änderungen an diesen Anleitungen
oder die Verwendung dieser Reagenzien auf anderen als in den Applikationsvorschriften von Dade
Behring oder diesen Gebrauchsanweisungen genannten Analysengeräten zu validieren.
14. Resultate dieses Tests sollten stets in Verbindung mit der Vorgeschichte des Patienten, dem klinischen
Bild und anderen Untersuchungsergebnissen interpretiert werden.
Leistungsmerkmale des Tests
Sensitivität und Spezifität
Die Ergebnisse zur Prüfung der Sensitivität und Spezifität sind in den Tabellen 2 + 3 (im Anhang) zusammengefaßt.
Bei der Ermittlung der Sensitivität wurden insgesamt 566 Anti-HIV1, 317 Anti-HIV2 und 22 Anti-HIV1 (Subtyp O) positive
Proben untersucht. Alle getesteten 905 Anti-HIV positiven Proben wurden nach den Kriterien des Enzygnost* Anti-HIV 1/2
Plus positiv gefunden. Die Reaktivität des Tests bei Serokonversionsproben wurde anhand von 31 Serokonversionspanel
untersucht. Dabei zeigte sich, dass Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus eine Sensivität bzgl. der Erkennung von Serokonversionen aufweist, die der Empfindlichkeit vergleichbarer Tests entspricht. Unabhängig davon kann nicht ausgeschlossen
werden, daß sich bei breiter Anwendung des Tests einzelne Proben dem Nachweis entziehen können.
Bei der Ermittlung der Spezifität wurden insgesamt 9243 Anti-HIV- negative Blutproben untersucht und eine
Spezifität von 99,3 bis 100 % (initiale Testung) bzw. 99,9 % (Retestung) ermittelt. Bedingt durch das Untersuchungskollektiv, die Testdurchführung u.a. sind abweichende Werte möglich.
Nach derzeitigem Kenntnisstand kann aus einem positiven Ergebnis der Anti-HIV-Testung nicht mit Sicherheit
abgeleitet werden, dass infektiöses HIV1 oder HIV2 im Blut vorhanden ist, wie auch ein negatives Testergebnis keineswegs die Anwesenheit von HIV1 oder HIV2 sicher ausschließt.
Reproduzierbarkeit
Die Ergebnisse zur Intra/Inter-assay Reproduzierbarkeit sind in der Tabelle 4 (im Anhang) zusammengefasst.
Es handelt sich hierbei um beispielhaft ermittelte Daten. Abhängig von der Testdurchführung u.a. sind durchaus abweichende Werte möglich.
* Enzygnost ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in Deutschland und anderen
Ländern.
BEP ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in den USA, Deutschland und anderen
Ländern.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
OQFK G13 C0542 (908) H/R
14
0197
Tab. 1 Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
Zustand
Lagerung
Stabilität•
*
Enzygnost Anti-HIV 1/2 Plus
(Testplatte / restliche Riegel)
nach Öffnen
+2 bis +8 °C
im Beutel mit
Trockenkapseln
6 Wochen
HIV-Ag/POD-Konjugat
nach Öffnen
+2 bis +8 °C
+18 bis +25 °C
4 Wochen
2 Tage
Proben-Puffer (Anti-HIV)
nach Öffnen
+2 bis +8 °C
4 Wochen
Kontroll-Serum, positiv
(Anti-HIV 1)
Kontroll-Serum, negativ
(Anti-HIV)
nach Öffnen
+2 bis +8 °C
< -20 °C
+2 bis +8 °C
< -20 °C
4 Wochen
3 Monate
4 Wochen
3 Monate
Material/Reagenz
nach Öffnen
Chromogen TMB
nach Öffnen
+2 bis +8 °C
bis Verfallsdatum
Puffer/Substrat TMB
nach Öffnen
+2 bis +8 °C
bis Verfallsdatum
Chromogen-Gebrauchslösung
nach Ansatz
+2 bis +8 °C
+18 bis +25 °C
geschlossenes Gefäß,
lichtgeschützt
5 Tage
8 Stunden
Waschlösung POD
(Konzentrat)
nach Öffnen
nach Ansatz
+2 bis +8 °C
+2 bis +8 °C
+18 bis +25 °C
bis Verfallsdatum
1 Woche
1 Tag
Stopplösung POD
nach Öffnen
+2 bis +8 °C
bis Verfallsdatum
•
In keinem Fall länger als bis zum Verfallsdatum!
Tab. 2 Sensitivität
Bei den Untersuchungen zur Sensitivität wurden an vier unabhängigen Zentren (Br, F, G, E) folgende Daten ermittelt:
Probenkollektiv
Probenanzahl
(Br) Anti-HIV1 pos. (Europa)
Anti-HIV1 pos. (USA)
Anti-HIV1 pos. (Afrika)
Anti-HIV2 pos.
Anti-HIV1 (Subtyp O) pos.
Serokonversionspanel
(F)
Anti-HIV1 pos.
Anti-HIV2 pos.
Anti-HIV1 (Subtyp O) pos.
(G) Anti-HIV1 pos.
Anti-HIV2 pos.
Anti-HIV1 (Subtyp O) pos.
(E) Anti-HIV1 pos.
Anti-HIV2 pos.
51
55
136
54
7
31 Anti-HIV
Panels
77
48
10
150
44
5
97
171
initial reaktiv
51
55
136
54
7
Sensitivität entspricht der Empfindlichkeit vergleichbarer Tests
77
48
10
150
44
5
97
171
Tab. 3 Spezifität
Bei den Untersuchungen zur Spezifität wurden an vier unabhängigen Zentren (Be, Br, E, F) folgende Daten ermittelt:
Probenkollektiv
(Be) normal negative Seren (Deutschland)
(Br) normal negative Seren (Deutschland)
normal negative Plasmen (Deutschland)
normal negative Seren (West-Afrika)
(E) normal negative Seren (Deutschland)
(F) normal negative Seren (Frankreich)
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15
Probenanzahl
initial reaktiv
retest reaktiv
3160
2397
197
436
2003
1050
0
4
0
3
0
0
3
nicht getestet
-
Tab. 4 Reproduzierbarkeit
Bei den Untersuchungen zur Reproduzierbarkeit wurden die Proben an 5 Tagen in jeweils 8fach-Bestimmung
getestet. Die Berechnung der Variationskoeffizienten (VK) erfolgte nach dem Varianzkomponentenmodell.
Probe
F1
F2
F3
F4
F5
F6
OQFK G13 C0542 (908) H/R
16
ExtinktionsMittelwert
Intra-assay
%VK
Inter-assay
2,36
1,74
0,54
0,75
0,51
0,06
4,7
3,0
7,0
5,9
3,9
9,2
12,6
11,4
5,2
16,3
17,0
39,5
Tab. 5 Testdurchführung und -programmierung
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
Menüprogrammierung
Testdurchführung
(BEP® II, BEP® III, BEP® 2000)
Vorbereitung der Reagenzien
für den
BEP® 2000
BEP® II
MENU NO
25 µl Probenpuffer
OPERATE 1
4 x 100 µl Kontrollserum, negativ
2 x 100 µl Kontrollserum, positiv
je 100 µl unverdünnte Probe
BEP® II
BEP® III
30 min ± 2 min
(37 ± 1 °C)
teilbestückte Platten mit
"Wasserriegeln" auf halbe
Platten ergänzen
4 x Waschen:
BEP® II
100 µl Konjugat
Dosierung Probenpuffer
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
0
NO
0
25
3
NO
OPERATE 2
YES
Waschen und Dosierung Konjugat
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
4
NO
0
100
2
NO
OPERATE 3
YES
Waschen und Dosierung Chromogen
30 min ± 2 min
(37 ± 1 °C)
automatische
Testabarbeitung
4 x Waschen:
BEP® II
100 µl Chromogen-
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
4
NO
0
100
4
NO
OPERATE 4
YES
Dosierung Stopplösung
Gebrauchslösung
30 min ± 2 min
+18 °C bis +25 °C
lichtgeschützt
100 µl Stopplösung
nach maximal 1 h
Auswertung 450 nm
(Referenzwellenlänge:
650 nm)
Testergebnis
OQFK G13 C0542 (908) H/R
YES
17
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
0
NO
0
100
5
PHOT
YES
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
450
650
NO
1
NO
4
0.150
0.400
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
Domaines d'utilisation
Test immunoenzymatique pour le dépistage des anticorps anti-antigènes VIH1, VIH2 et VIH1 (sous-type O)
dans le sérum ou le plasma. La réalisation du test immunoenzymatique se fait à l’aide des ELISA Processeurs
BEP® II, BEP® III et BEP® 2000. Le test a été mis au point pour l'analyse d'échantillons individuels, et non de
pools d'échantillons. Le produit ne doit être utilisé qu'à des fins de diagnostic in vitro.
Intérêt Diagnostique
Le Syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA) a été reconnu pour la première fois en 1981 comme tableau clinique autonome. Deux virus différents d’immunodéficience humaine (VIH1 et VIH2) sont aujourd’hui
considérés comme responsables de la maladie. L’isolement de l'VIH1 (synonymes : LAV/HTLV III) a réussi
dès 19831,2. En 1986, un deuxième virus (VIH2), également pathogène pour l’Homme, a été isolé3. Le dosage
sérologique des anticorps anti-VIH présente un intérêt particulier pour la médecine transfusionnelle, puisqu’il
permet de prévenir la propagation de la maladie.
Depuis 1985, la recherche d’anticorps anti-VIH1 sur les dons de sang est obligatoire aussi bien pour les
centres de transfusion sanguine que pour les fabricants de produits sanguins. Des informations complémentaires sur le développement d’infections à VIH2 ont depuis généralisé le dépistage en routine des anticorps
anti-VIH1 et VIH2, dans le souci d’exclure le transfert possible de la maladie par la transfusion ou l’utilisation
de préparations sanguines.
En 1990, un nouveau sous-type d'VIH a été décrit4. Ce n'est qu'en 1994 que deux équipes indépendantes
l'une de l'autre ont réussi simultanément à définir la séquence de ce nouveau sous-type5, 6. Parallèlement à
ces travaux virologiques, plusieurs équipes de recherche ont pu montrer l'intérêt sérologique du virus,
aujourd'hui appelé VIH1-sous-type O7. Certains test anti-VIH 1+2 ont alors montré leur faiblesse à révéler les
anticorps anti-sous-type O8. Le besoin est donc apparu de disposer d'un test fiable pour la recherche simultanée de ce nouveau variant VIH et des isolats VIH1 et VIH2 déjà établis.
Bien que la mise en évidence d’anticorps anti-VIH1 ou anti-VIH2-spécifiques ne permette pas de dire avec certitude si
le sang contient de l’VIH1 ou de l’VIH2 infectieux au moment du test, de même qu’un résultat négatif ne permet pas
d’exclure avec certitude la présence d’VIH1 ou d’VIH2, le test des anticorps constitue pourtant actuellement la meilleure solution pour dépister et éliminer avec une grande probabilité les donneurs infectés par l’VIH.
Principe de la méthode
Les immunoglobulines VIH-spécifiques contenues dans l'échantillon à tester se lient aux protéines VIH1, VIH2
et/ou VIH1 (sous-type O) recombinantes fixées à la surface de la plaque de microtitration.
Après élimination par lavage des éléments non liés de l'échantillon, le conjugué se fixe aux anticorps VIH-spécifiques.
Après élimination du conjugué en excès, l'activité enzymatique du conjugué fixé est mesurée (réaction colorée bleue). La transformation enzymatique du chromogène est stoppée par l'addition de Solution d'arrêt POD
(réaction colorée jaune). L'intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration d'anticorps présents
dans l'échantillon.
Réactifs
Contenu du coffret
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
*
Enzygnost Anti-HIV 1/2 Plus
Conjugué Ag-HIV/POD
Tampon échantillons (Anti-HIV)
Sérum de contrôle positif (Anti-HIV1)
Sérum de contrôle négatif (Anti-HIV)
Solution de lavage POD (concentrée)**
Tampon/substrat TMB**
Chromogène TMB**
Solution d'arrêt POD**
Flacon vide
Etiquette «Flacon vide pour POD»
Feuilles adhésives
Fiche technique
Tableau de codes à barres
Sachet PE
Autre conditionnement: 570 x 96 (Q)
2 x 96
10 x 96
2 plaques-tests
2 x 15 ml
2 x 15 ml
2 x 1,4 ml
2 x 2,8 ml
6
1
1
1
10 plaques-tests
10 x 15 ml
4 x 15 ml
3 x 1,4 ml
3 x 2,8 ml
2 x 100 ml
4 x 30 ml
4 x 3 ml
2 x 100 ml
1
1
30
1
1
1
** Ces éléments font également partie du Coffrert de réactifs complémentaries pour Enzygnost* TMB (code OUVP).
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Edition Février 2004
Autres réactifs nécessaires pour le coffret 2 x 96
Réactifs complémentaires pour Enzygnost* TMB (code OUVP)
Composition
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus (plaque-test)
Plaque de microtitration recouverte d'un pool de protéines VIH (env) recombinantes (E. coli). Les protéines
représentent les domaines immunoréactifs des protéines virales suivantes :
gp41 (VIH1), gp41 (VIH1 sous-type O), gp 36 (VIH2).
Conjugué Ag-HIV/POD
Protéine VIH recombinante et peptides VIH synthétiques.
Conjugué à la peroxydase (POD), prêt à l'emploi après addition de Tris-hydroximethylaminomethan (36 g/l) et
de chlorure de sodium (6 g/l).
Agent de conservation :
phénol (max. 1 g/l)
Tampon échantillons (anti-VIH)
Contient de la glycérine (100 g/l), du Tween 20 (20 g/l), du chlorure de sodium (8,8 g/l), de l'EDTA (1,9 g/l), de
l'albumine bovine (1 g/l), de la polygéline et du phosphate (50 mmol/l).
Agent de conservation :
phénol (max. 1 g/l)
Sérum de contrôle positif (anti-VIH1)
Sérum humain traité par la chaleur et contenant des anticorps anti-antigène VIH1, stabilisé.
Agent de conservation :
phénol (max. 1 g/l)
Sérum de contrôle négatif (anti-VIH)
Sérum humain exempt d'anticorps anti-antigènes VIH1, VIH2 et VIH1 (sous-type O), stabilisé.
Agent de conservation :
phénol (max. 1 g/l)
Solution de lavage POD (concentrée)
Solution tampon phosphate (90 mmol/l) additionnée de Tween (18 g/l).
Agent de conservation :
phénol (max. 1 g/l)
Tampon/substrat TMB
Peroxyde d'hydrogène (env. 0,1 g/l) en solution tampon acétate (25 mmol/l).
Agent de conservation :
n-butanol (max. 1%)
Chromogène TMB
Tétraméthylbenzidine-dihydrochlorure (5 g/l).
Solution d'arrêt POD
Acide sulfurique 0,5 N.
Flacon vide pour la solution d'emploi du chromogène
Sachets PE pour la conservation des barrettes non utilisées immédiatement
Tableau de codes à barres
Mises en garde et précautions d’emploi
1. Ne doit être employé que pour un usage in vitro.
2. Tout don de sang prévu pour la préparation des sérums de contrôle est soumis à une recherche
d'AgHBs, d'anti-VHC, d'anti-VIH1 et d'anti-VIH2. Pour la préparation du sérum de contrôle négatif, seuls
les sérums trouvés négatifs sont utilisés. Le sérum de contrôle positif est traité par la chaleur (au moins
1 heure à +56 °C).
Indépendamment de cela, tout échantillon (par ex. sérum de patient) ou produit (par ex. sérum de contrôle) obtenu à partir de sang humain doit être manipulé avec les précautions nécessaires en cas de risque
biologique, dans la mesure où on ne peut exclure totalement tout risque d'infection9.
3. Il est recommandé de porter des gants de protection pendant toute la réalisation du test.
4. Pour décontaminer le matériel de laboratoire infecté, l’autoclaver pendant au moins 1 heure à +121°C.
Toutes les solutions aspirées doivent être récoltées dans deux récipients reliés l’un à l’autre et contenant
chacun un désinfectant spécialement prévu pour inactiver les virus pathogènes pour l’homme. Respecter
les concentrations et temps d’incubation indiqués par le fabricant.
5. Les réactifs (à l’exception de la Solution de lavage POD, de la Solution d’arrêt POD et de la solution
d’emploi du chromogène obtenue à partir des lots de réactifs indiqués pour le Chromogène TMB et le
Tampon/substat TMB) ne peuvent être utilisés que selon la combinaison des numéros de lots à 6 chiffres
indiqués sur le coffret et dans le tableau des valeurs codes-barres joint.
Préparation des réactifs
Porter tous les réactifs et échantillons à +18/+25 °C avant le début du test, sans sortir la plaque-test de son emballage.
Le coffret Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus 10 x 96 contient une étiquette avec code à barres pour un flacon vide
destiné au Conjugué Ag-HIV/POD. Pour éviter de changer trop souvent de seringue sur le BEP® III si on
effectue de grandes séries d’analyses, verser le contenu de plusieurs flacons de Conjugué Ag-HIV/POD dans
un flacon plus grand (par ex. le flacon vide pour la solution d’emploi du chromogène si on ne l’utilise pas, ou un
flacon rincé de Solution d’arrêt POD), apposer l’étiquette «Flacon vide pour Conjugué», et placer le flacon
dans le carrousel réactifs.
OQFK G13 C0542 (908) H/R
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Pour une plaque, diluer 20 ml de Solution de lavage POD avec de l'eau distillée ou désionisée en complétant à 400 ml.
Solution d'emploi du chromogène : pour une plaque, diluer 1 ml de Chromogène TMB avec 10 ml de
Tampon/substrat TMB dans le flacon vide joint au coffret (solution d'emploi du chromogène), et conserver la
solution, le flacon fermé, à l’abri de la lumière. Après utilisation, bien rincer le flacon à l’eau distillée.
Pour des raisons de remplissage du flacon, il est impossible de verser la totalité du contenu d'un flacon de
Chromogène TMB dans un flacon de Tampon/substrat TMB.
Stabilités et conditions de conservation
Avant leur ouverture, tous les éléments du coffret Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus se conservent à la température
indiquée jusqu'à la date indiquée sur l'étiquette.
Pour les stabilités et conditions de conservation après ouverture des flacons et préparation des réactifs à leur
dilution d'emploi, se reporter au tableau 1 en annexe.
Matériel nécessaire:
pour la distribution automatique des réactifs et l'automatisation des étapes de lavage
BEP® II :
BEP® III:
pour l'automatisation du test après la distribution des échantillons et de l'exploitation
des résultats
pour l’entière automatisation du test et de l’ exploitation des résultats
BEP® 2000 :
Pipettes:
pipettes à embout de 25, 100 et 1000 µl
Incubateur:
bain-marie couvert (+37 ± 1 °C) ou méthode d'incubation équivalente
Tout le matériel utilisé pour la réalisation du test doit être validé.
Echantillons à tester
Utiliser des échantillons (sérums humains ou plasmas citratés, héparinés ou prélevés sur EDTA) obtenus
selon les techniques standard des laboratoires. Les échantillons peuvent être conservés 3 jours maximum à
+2/+8 °C. Pour une conservation plus longue, les congeler.
Réalisation du test
Réalisation du test à l’aide du BEP® II
1. Plan de distribution :
déterminer le nombre de cupules nécessaires (nombre d'échantillons à tester + 6 cupules pour les contrôles). Sortir du cadre les barrettes inutiles et les conserver pour un test futur (cf. Tableau 1).
2. Prédistribution du Tampon échantillons :
distribuer dans chaque cupule 25 µl de Tampon échantillons.
3. Distribution des contrôles et échantillons :
distribuer dans 4 cupules 100 µl de contrôle négatif, dans 2 cupules 100 µl de contrôle positif, puis 100 µl
de chacun des échantillons non dilués dans les cupules suivantes. Couvrir d'une feuille adhésive et
placer la plaque le plus rapidement possible dans l'incubateur, au plus tard 15 min après la fin de la
distribution des échantillons.
Comme alternative au schéma de pipetage indiqué ci-dessus, on peut également déposer le contrôle
positif une fois en début et une fois en fin de série.
Schéma de pipetage : distribuer 100 µl de contrôle négatif dans les 4 premières cupules, 100 µl de
contrôle positif dans la cupule 5, 100 µl de chacun des échantillons non dilués dans les cupules suivantes, puis de nouveau 100 µl de contrôle positif à la fin de la série ou de la plaque.
4. Incubation des échantillons :
laisser incuber 30 ± 2 min à +37 ± 1 °C, et enchaîner immédiatement le processus de lavage.
5. Lavage :
retirer la feuille adhésive, aspirer le contenu de toutes les cupules, et laver 4 fois avec env. 0,3 ml de
solution de lavage.
6. Distribution du conjugué :
ajouter dans chaque cupule 100 µl de conjugué, couvrir d'une feuille adhésive et placer la plaque immédiatement dans l'incubateur.
7. Incubation du conjugué :
laisser incuber 30 ± 2 min à +37 ± 1 °C comme décrit en 4., et enchaîner immédiatement le processus de
lavage.
8. Lavage :
retirer la feuille adhésive et laver comme décrit en 5.
9. Distribution du substrat :
ajouter dans chaque cupule 100 µl de la solution d’emploi du chromogène et couvrir la plaque d’une
nouvelle feuille adhésive.
10. Incubation du substrat :
laisser incuber 30 ± 2 minutes à +18/+25 °C à l’abri de la lumière.
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20
11. Arrêt de la réaction :
retirer la feuille adhésive et ajouter dans chaque cupule 100 µl de Solution d'arrêt POD en respectant le
même rythme qu’en 9.
12. Mesure :
faire une mesure photométrique dans l'heure qui suit à 450 nm.
La mesure de la densité optique des contrôles et des échantillons de patients se fait à 450 nm. Une longueur
d’onde de référence de 650 nm est recommandée (éventuellement comprise entre 615 et 690 nm).
Réalisation du test sur le BEP® III
Pour une utilisation sur le BEP® III, les plaques-tests doivent être préparées jusqu’y compris la distribution des
échantillons (points 1 et 2 du paragraphe «Réalisation du test sur le BEP® II»). Immédiatement après cette étape,
placer la plaque ouverte, c’est-à-dire non recouverte d’une feuille adhésive, dans le BEP® III. Si la plaque n’est
pas totalement utilisée, la compléter au moins pour moitié (6 barrettes) avec des barrettes remplies d’eau. La
suite du test est ensuite effectuée entièrement automatiquement (cf. Manuel d’utilisation du BEP® III).
Les temps d’incubation prévus dans le logiciel du BEP® III peuvent, du fait de conditions techniques (cadence
de l’appareil), diverger par rapport à ceux du BEP® II. Ils ont toutefois été validés dans la combinaison BEP® III/
Enzygnost*.
Réalisation du test sur le BEP® 2000
La distribution des échantillons ainsi que la réalisation du test sont effectuées entièrement automatiquement
par l’appareil (cf. Manuel d’utilisation du BEP® 2000).
Validation du test
Les différentes densités optiques obtenues pour les sérums de contrôle doivent répondre aux critères suivants :
-0,010 ≤ Enég ≤ 0,150
Epos ≥ 0,700
Pour les quatre valeurs du contrôle négatif, si une seule ne répond pas au critère indiqué, ne pas en tenir
compte pour le calcul de la moyenne.
Les deux valeurs du contrôle positif doivent répondre au critère indiqué.
Si ces conditions ne sont pas remplies, le test doit être recommencé.
Exploitation du test
L’exploitation des résultats est effectuée automatiquement par le BEP® 2000 et le BEP® III. Respecter les
instructions indiquées pour l’appareil utilisé. Ci-dessous le protocole d’exploitation du test en l’absence d’un
logiciel.
Calculer la valeur moyenne des densités optiques obtenues pour le contrôle négatif, et y ajouter une valeur de
0,400 pour obtenir la valeur-seuil :
–
Enég + 0,400 = valeur-seuil (cut off)
La zone grise est déterminée comme suit :
valeur-seuil jusqu'à valeur-seuil -10%
Selon les critères du test, les échantillons sont classés comme suit :
Résultat du test :
1.
Eéchan
< cut off - 10% ^= «négatif»
2.
Eéchan
> cut off
3.
cut off - 10% ≤ Eéchan ≤ cut off
^= «réactif»
^= «douteux»
Les échantillons trouvés dans la zone grise ou supérieurs à cette zone grise, doivent être retestés en double. Si
un échantillon trouvé initialement douteux donne des valeurs inférieures à la zone grise dans le retest, le
considérer comme négatif selon les critères du test.
Si les deux valeurs du retest sont de nouveau trouvées dans la zone grise ou supérieures à la zone grise,
l'échantillon doit être considéré comme de nouveau réactif. Tous les échantillons retrouvés douteux ou réactif
doivent être confirmés à l'aide d'un test dit de confirmation (par ex. une analyse Western-Blot).
Limites du test
1. Les anticoagulants, comme l’héparine, l’EDTA et le citrate, n’ont pas d’influence sur le résultat du test.
2. Les échantillons lipémiques, ictériques ou hémolytiques n’ont pas d’influence sur le test.
3. Des tests ont été effectués sur échantillons contenant des substances éventuellement interférentes, tels
les facteurs rhumatoides, les anticorps anti-EBV/IgM, anti-VZV/IgM, anti-E. Coli, les ANA et AMA, ainsi
que sur sérums de femmes enceintes. Aucune interférence sur les résultats du test n'a été observée.
4. L’utilisation d’échantillons plusieurs fois congelés ou de sérums traités à la chaleur (30 mn à +56 °C) n’a
permis l’observation d’aucune perturbation.
OQFK G13 C0542 (908) H/R
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5. Ne pas utiliser de sérums incomplètement coagulés ni contaminés par voie microbienne. En cas de
présence d’éléments particulaires (par ex. caillot de fibrine ou érythrocytes), les éliminer avant le test.
6. Si on utilise des échantillons décongelés, veiller à bien les homogénéiser avant emploi.
7. Le test ne permet l’analyse que d’échantillons individuels. Ne pas utiliser d’échantillons poolés ni dilués.
8. Les réactifs du coffret (à l’exception de la Solution de lavage POD, de la Solution d’arrêt POD et de la
solution d’emploi du chromogène obtenue à partir des lots indiqués de chromogène TMB et de Tampon/
substrat TMB) ne peuvent être utilisés que selon la combinaison de lots indiquée sur le coffret et le tableau
des codes à barres joint au coffret.
9. Le Tampon/substrat TMB, la solution d’emploi de Chromogène et la Solution d’arrêt POD ne doivent pas
entrer en contact avec des ions de métaux lourds ni des substances oxydantes (ne pas utiliser de pipettes
à parties métalliques au niveau du passage des solutions). La réaction du substrat ne doit pas être effectuée à proximité de désinfectants contenant de l’eau de Javel. Une coloration bleue de la solution d’emploi
du chromogène avant son transfert dans la plaque indique une contamination ; préparer une nouvelle
solution dans un récipient propre. Eviter tout contact de la peau avec les solutions sus-mentionnées.
10. La plaque doit rester immobile pendant l’incubation (la placer par ex. sur un support fixe ou dans un bainmarie sans circulation d’eau) ; le fond des cupules doit être en contact avec l’eau thermostatée. Si l’eau
contient des stabilisateurs pour éviter la contamination, bien veiller à ce que ni la surface supérieure de la
plaque ni l’intérieur des cupules n’entrent en contact avec cette eau, au risque d’obtenir des réactions nonspécifiques.
11. En cas d’échantillons fortement réactifs, il peut y avoir absence de coloration au moment de l’arrêt de la
réaction, sans que cela ait d’influence sur l’exploitation photométrique.
12. Les sérums de contrôle sont obtenus à partir de sérums humains natifs. Ils peuvent donc devenir trouble,
sans que cela ait d’influence sur le résultat du test.
13. Dade Behring a validé l’utilisation de ces réactifs sur plusieurs analyseurs afin d’optimiser les performances du produit et répondre à ses spécifications. Les modifications apportées par l’utilisateur ne sont
pas sous la responsabilité de Dade Behring dans la mesure où elles peuvent affecter les performances du
système et les résultats des dosages. Il est de la responsabilité de l’utilisateur de valider toutes modifications apportées à ces instructions ou à l’utilisation des réactifs sur les analyseurs autres que ceux mentionnés dans les protocoles d’application Dade Behring ou dans la présente notice d’utilisation.
14. Les résultats de ce test doivent toujours être interprétés en rapport avec les antécédents médicaux du
patient, les signes cliniques et autres constatations.
Charactéristiques du test
Sensibilité et spécificité
Les résultats des études de sensibilité et de spécificité sont résumés dans les tableaux 2 + 3 (en annexe).
Pour déterminer la sensibilité du test, un total de 566 échantillons anti-VIH1-positifs, 317 anti-VIH2-positifs et
22 anti-VIH1 (sous-type O)-positifs a été testé. La totalité des 905 échantillons anti-VIH-positifs ont été trouvés
positifs d'après les critères du test Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus. La réactivité du test vis-à-vis des échantillons
en phase de séroconversion a été testée sur 31 panels de séroconversions. L'étude a montré que le test
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus présentait la même sensibilité, c'est-à-dire la même détection des séroconversions, que les tests comparables. Malgré ces résultats, on ne peut exclure, dans le cadre d'une large utilisation
du test, que certains échantillons ne soient pas révélés.
Pour déterminer la spécificité du test, un total de 9243 échantillons sanguins anti-VIH-négatifs a été testé, et
une spécificité de 99,3 à 100 % a été trouvée en test initial, et de 99,9 % en retest. Des valeurs divergentes
peuvent être trouvées, dues par ex. au collectif étudié ou à la réalisation du test.
Selon l'état des connaissances actuelles, un résultat trouvé positif dans un test VIH ne permet pas de conclure
avec certitude que le sang contient de l'VIH1 ou de l'VIH2 infectieux, de même qu'un résultat négatif ne permet
en aucun cas d'exclure avec certitude la présence d'VIH1 ou d'VIH2.
Reproductibilité
Les résultats de l’étude de reproductibilité et de répétabilité sont résumés dans le tableau 4 (en annexe). Ils
ont été obtenus à partir de données prises à titre d’exemple. Les valeurs obtenues peuvent donc varier en
fonction en particulier des conditions de réalisation du test.
* Enzygnost est une marque déposée de Dade Behring Marburg GmbH en Allemagne et dans d’autres pays.
BEP est une marque déposée de Dade Behring Marburg GmbH aux USA, en Allemagne et dans d’autres
pays.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
OQFK G13 C0542 (908) H/R
22
0197
Tabl. 1 Stabilités et conditions de conservation
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
Échantillons/réactifs
état
conservation
stabilité•
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
(plaque/barrette)
après ouverture
+2/+8 °C
dans sachet avec
capsule dessicative
6 semaines
Conjugué Ag-HIV/POD
après ouverture
+2/+8 °C
+18/+25 °C
4 semaines
2 jours
Tampon échantillons (anti-VIH)
après ouverture
+2/+8 °C
4 semaines
Sérum de contrôle positif
(anti-VIH1)
Sérum de contrôle négatif
(anti-VIH)
après ouverture
+2/+8 °C
< -20 °C
+2/+8 °C
< -20 °C
4 semaines
3 mois
4 semaines
3 mois
Chromogène TMB
après ouverture
+2/+8 °C
date de péremption
Tampon/substrat TMB
après ouverture
+2/+8 °C
date de péremption
Solution d'emploi
du chromogène
à la dilution
+2/+8 °C
+18/+25 °C
dans récipient
fermé à l'abri
de la lumière
5 jours
8 heures
Solution de lavage POD
(concentrée)
après ouverture
à la dilution
+2/+8 °C
+2/+8 °C
+18/+25 °C
date de péremption
1 semaine
1 jour
Solution d'arrêt POD
après ouverture
+2/+8 °C
date de péremption
•
après ouverture
jamais au-delà de la date de péremption !
Tabl. 2 Sensibilité
Résultats de l'étude de sensibilité a quatre centres indépendentes (Br, F, G, E):
collectif d'échantillons
(Br) anti-VIH1-positifs (l'Europe)
anti-VIH1-positifs (USA)
anti-VIH1-positifs (Afrique)
anti-VIH2-positifs
anti-VIH1 (sous-type O)-positifs
panel de séroconversions
(F)
anti-VIH1-positifs
anti-VIH2-positifs
anti-VIH1 (sous-type O)-positifs
(G) anti-VIH1-positifs
anti-VIH2-positifs
anti-VIH1 (sous-type O)-positifs
(E) anti-VIH1-positifs
anti-VIH2-positifs
nombre d'échantillons
51
55
136
54
7
31 anti-VIH1 panels
77
48
10
150
44
5
97
171
positifs en test initial
51
55
136
54
7
la sensibilité correspond à
celle des tests comparables
77
48
10
150
44
5
97
171
Tabl. 3 Spécificité
Résultats de l'étude de spécificité a quatre centres indépendentes (Be, Br, E, F,):
collectif d'échantillons
nombre
positifs en
d'échantillon
test initial
(Be) sérums négatifs normaux (Allemagne)
3160
0
(Br) sérums négatifs normaux (Allemagne)
2397
4
plasmas négatifs normaux (Allemagne)
197
0
sérums négatifs normaux
436
3
(Afrique occidentale)
(E) sérums négatifs normaux (Allemagne)
2003
0
(F) sérums négatifs normaux (la France)
1050
0
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23
positifs après
retest
3
non déterminé
-
Tabl. 4 Reproductibilité
Dans le cadre de l’étude de reproductibilité, les échantillons ont été testés 8 fois sur 5 jours. Le calcul des
coefficients de variation (CV) s’est fait par analyse multivariée.
Echantillons
Valeur moyenne de
densité optique
Répétabilité
Reproductibilité
2,36
1,74
0,54
0,75
0,51
0,06
4,7
3,0
7,0
5,9
3,9
9,2
12,6
11,4
5,2
16,3
17,0
39,5
F1
F2
F3
F4
F5
F6
OQFK G13 C0542 (908) H/R
24
CV %
Tabl. 5 Réalisation et programmation du test
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
Réalisation du test
Programmation
(BEP® II, BEP® III, BEP® 2000)
du menu pour le
BEP® 2000
préparation des réactifs
25 µl de Tampon échantillons
4 x 100 µl de Sérum de contrôle négatif
2 x 100 µl de Sérum de contrôle positif
100 µl de chaque échantillon non dilué
BEP® II
BEP® III
30 min ± 2 min
(37 ± 1°C)
compléter les plaques
incomplètes à mi-plaque
avec des barrettes
remplies d'eau
4 lavages :
BEP® II
100 µl de conjugué
MENU NO
OPERATE 1
YES
Distribution du Tampon échantillons
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
0
NO
0
25
3
NO
OPERATE 2
YES
Lavage et distribution du Conjugué
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
4
NO
0
100
2
NO
OPERATE 3
YES
Lavage et distribution du Chromogène
30 min ± 2 min
(37 ± 1°C)
réalisation
automatique du test
4 lavages :
BEP® II
100 µl de solution
d'emploi du chromogène
30 min ± 2 min
+18 à +25°C
à l'abri de la lumière
100 µl de solution d'arrêt
après 1 h maximum
exploitation à 450 nm
(longueur d'onde de
référence : 650 nm)
résultat du test
OQFK G13 C0542 (908) H/R
BEP® II
25
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
4
NO
0
100
4
NO
OPERATE 4
YES
Distribution de la Solution d'arrêt
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
0
NO
0
100
5
PHOT
YES
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
450
650
NO
1
NO
4
0.150
0.400
Enzygnost* Anti-HIV 1/ 2 Plus
Settori d'impiego
Metodo immunoenzimatico per I'identificazione degli anticorpi contro gli antigeni HIV1, HIV2 e HIV1 (sottotipo O)
nel siero o nel plasma. Il test immunoenzimatico viene impiegato sugli analizzatori BEP® II, BEP® III e BEP® 2000
ELISA. Il test è stato realizzato per la determinazione di campioni singoli, e non per pool di campioni. Il prodotto
deve essere utilizzato solo per scopi diagnostici in vitro.
Significato diagnostico
La sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) è stata riconosciuta per la prima volta nel 1981 come
forma clinica a sé stante. Come agenti patogeni della malattia sono stati fino ad oggi riconosciuti due diversi
virus dell'immunodeficienza umana (HIV1 e HIV2). Il virus HIV1 (sinonimo LAV/HTLV III) è stato isolato nel
1983.1, 2 Nel 1986 è stato isolato un altro virus, l'HIV2, anch'esso risultato essere patogeno per l'uomo.3 La
determinazione sierologica degli anticorpi anti-HIV riveste particolare importanza nella medicina trasfusionale, per prevenire l'ulteriore diffusione della malattia.
Di conseguenza a partire dal 1985 è iniziato il controllo degli anticorpi anti-HIV1 presso le banche del sangue
e presso i produttori di emoderivati. Informazioni più recenti sulla diffusione delle infezioni da HIV2 hanno
dimostrato la necessità di un controllo sistematico degli anticorpi anti-HIV1 e anti-HIV2 nei donatori di sangue,
per escludere per quanto possibile, ogni potenziale trasmissione del virus mediante trasfusioni di sangue o da
emoderivati.
Nel 1990 è stato descritto un nuovo sottotipo di HIV.4 Nel 1994 è stato possibile, da parte di due diversi gruppi di
lavoro, determinare la sequenza nucleotidica di questo nuovo sottotipo.5, 6 Parallelamente a queste ricerche
virologiche è stato possibile dimostrare, da parte di diversi gruppi di lavoro, l’importanza sierologica del virus ora
denominato HIV1- sottotipo O.7 Inoltre alcuni test anti-HIV 1 + 2 dimostrano scarsa sensibilità per quanto riguarda la determinazione degli anticorpi anti-sottotipo O.8 Di conseguenza è scaturita la necessità di un accertamento più sicuro di questa nuova variante dell’HIV accanto alle consuete indagini per i virus HIV1 e HIV2.
Sebbene l’identificazione degli anticorpi specifici anti-HIV1 e anti-HIV2 non possa escludere con certezza la
presenza dei virus HIV1 o HIV2 nel sangue al momento dell'esecuzione del test, così come non si può in
nessun caso escludere con sicurezza la presenza di HIV1 o HIV2 in caso di risultato negativo, tuttavia il test
anticorpale oggi rappresenta la migliore possibilità per riconoscere ed eliminare con alto grado di probabilità i
campioni di sangue infetti da HIV.
Principio del metodo
Gli anticorpi specifici per l'HIV contenuti nel campione in esame, si legano con le proteine ricombinanti dell'HIV1,
dell'HIV2 e/o dell’HIV1 (sottotipo O) fissate sulla superficie della piastra di microtitolazione.
Dopo l'eliminazione delle componenti del campione non legate, il coniugato si lega agli anticorpi specifici dell'HIV.
Dopo l'eliminazione del coniugato in eccesso viene valutata l'attività enzimatica del coniugato (reazione di
colore blu). La trasformazione enzimatica del cromogeno viene interrotta mediante l'aggiunta di soluzione
bloccante POD (reazione di colore giallo). L'intensità del colore sviluppato è proporzionale alla concentrazione
degli anticorpi presenti nei campioni in esame.
Reagenti
Materiali forniti
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
Coniugato HIV-Ag/POD
Tampone per campioni (Anti-HIV)
Siero di controllo, positivo (Anti-HIV1)
Siero di controllo, negativo (Anti-HIV)
Soluzione di lavaggio POD (concentrata)**
Tampone/Substrato TMB**
Cromogeno TMB**
Soluzione bloccante POD**
Flacone vuoto
Etichetta «Flacone vuoto per coniugato»
Fogli adesivi
Istruzioni per l'uso
Tabella con i codici a barre
Sacchetto in PE
Ulteriori confezioni: 570 x 96 (Q)
2 x 96
10 x 96
2 piastre test
2 x 15 mL
2 x 15 mL
2 x 1,4 mL
2 x 2,8 mL
6
1
1
1
10 piastre test
10 x 15 mL
4 x 15 mL
3 x 1,4 mL
3 x 2,8 mL
2 x 100 mL
4 x 30 mL
4 x 3 mL
2 x 100 mL
1
1
30
1
1
1
** Questi componenti sono inclusi anche nel Kit Reagenti Supplementari per Enzygnost* TMB (codice OUVP).
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Edizione Febbraio 2004
Materiali supplementari richiesti, ma non forniti, per il kit 2 x 96
Reagenti supplementari per Enzygnost* TMB (Codice OUVP)
Composizione
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus (piastra test)
Piastra per microtitolazione sensibilizzata con una miscela di proteine ricombinanti di HIV (env) da E. Coli. Le
proteine impiegate rappresentano l’ambito immunoreattivo delle seguenti proteine virali:
gp 41 (HIV1), gp 41 (HIV1 sottotipo O), gp 36 (HIV2).
Coniugato HIV-Ag/POD
Proteine ricombinanti HIV e peptidi sintetici HIV coniugati con perossidasi (POD), pronto per l’uso, contenente
Tris-idrossimetil-aminometano (36 g/L) e cloruro di sodio (6 g/L).
Conservante:
fenolo (mass. 1 g/L)
Tampone per campioni (Anti-HIV)
Contiene glicerina (100 g/L), tween 20 (20 g/L), cloruro di sodio (8,8 g/L), EDTA (1,9 g/L), albumina bovina
(1 g/L), poligelina e fosfato (50 mmol/L).
Conservante:
fenolo (mass. 1 g/L)
Siero di controllo, positivo (Anti-HIV1)
Siero umano inattivato contenente anticorpi contro l’antigene HIV-1, stabilizzato.
Conservante:
fenolo (mass. 1 g/L)
Siero di controllo, negativo (Anti-HIV)
Siero umano privo di anticorpi contro l’antigene HIV1, HIV2 e HIV1 (sottotipo 0), stabilizzato.
Conservante:
fenolo (mass. 1 g/L)
Soluzione di lavaggio POD (concentrata)
Soluzione tampone fosfato (90 mmoL/L) contenente Tween (18 g/L).
Conservante:
fenolo (max. 1 g/L)
Tampone/Substrato TMB
Perossido d’idrogeno (ca. 0,1 g/L) in soluzione tampone acetato (25 mmoL/L).
Conservante:
n-butanolo (mass. 1%)
Cromogeno TMB
Tetrametilbenzidina diidrodoruro (5 g/L)
Soluzione bloccante POD
0,5 N acido solforico
Flacone vuoto per la soluzione d'uso di cromogeno
Sacchetto di polietilene per la conservazione delle file di pozzetti non utilizzate
Tabella con i codici a barre
Avvertenze e precauzioni
1. Solo per uso diagnostico in-vitro.
2. Ogni donazione di sangue impiegata per la produzione dei sieri di controllo è stata esaminata per la ricerca
dell’HBsAg, dell’anti HCV, dell'anti-HIV1 e dell'anti-HIV2. Per la produzione del siero di controllo negativo
vengono impiegati solo sieri che risultano negativi. Il siero di controllo positivo viene inattivato per l'HIV
mediante un trattamento al calore (almeno 1 ora a +56 °C).
Tuttavia tutti i campioni di siero umano (ad es. siero dei pazienti) ed i derivati (ad es. sieri di controllo)
devono essere trattati con le necessarie precauzioni rispettando le norme di sicurezza sul rischio biologico
in quanto non si può escludere con assoluta certezza il pericolo di agenti patogeni.9
3. Si consiglia l'uso di guanti di protezione durante l'intera esecuzione del test.
4. Per la distruzione del materiale solido infettivo si consiglia il trattamento in autoclave per almeno 1 ora a +
121 °C. Tutti i liquidi aspirati devono essere raccolti in due raccoglitori collegati in serie. I raccoglitori
dovrebbero contenere un disinfettante adatto all'inattivazione dei virus patogeni umani. Osservare le concentrazioni ed i tempi di azione indicati dal produttore.
5. E' necessario utilizzare solo reagenti appartenenti tutti ad uno stesso lotto (ad esclusione della soluzione
di lavaggio POD, la Soluzione bloccante POD e la Soluzione d'uso del cromogeno preparata con i reagenti
Cromogeno TMB e Tampone/Substrato TMB appartenenti tutti allo stesso lotto). La combinazione ammessa dei numeri di lotto a 6 cifre e quella stampata sulla confezione ed anche riportata nell'allegata tabella dei
codici a barre.
Preparazione dei Reagenti
Portare tutti i reagenti ed i campioni in esame a + 18/+ 25 °C, prima dell’inizio del test, senza togliere le piastre
dal contenitore.
La confezione di Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus 10x96 contiene una etichetta con codice a barre per 1 flacone
vuoto per il Coniugato HIV-Ag/POD. Analizzando una grande quantità di campioni, per evitare che la siringa
venga cambiata spesso sul BEP® III, si consiglia di versare il contenuto di diverse fiale del coniugato HIV-Ag/
POD in un flacone più grande (es. un grande flacone vuoto non utilizzato per la Soluzione d’uso del Cromogeno oppure un flacone lavato della Soluzione Bloccante POD), etichettare questo flacone con la rispettiva
etichetta «Flacone vuoto per coniugato» e posizionare il flacone etichettato nel rotore reagente.
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Per ogni piastra test, diluire 20 ml di Soluzione di Lavaggio POD con 400 ml di acqua distillata o deionizzata.
Soluzione d’uso di Cromogeno: per ogni piastra test, diluire 1 ml di Cromogeno TMB con 10 ml di Tampone/Substrato TMB nel flacone vuoto appositamente fornito (soluzione d’uso di cromogeno) e conservare ben
chiuso al riparo dalla luce. Dopo l‘uso, lavare accuratamente il flacone con acqua distillata.
Per motivi tecnici, non è possibile versare il Cromogeno TMB direttamente nel flacone del Tampone/Substrato
TMB.
Conservazione e validità
Prima dell'apertura, tutte le componenti della confezione Enzygnost* anti-HIV 1/2 Plus possono essere utilizzate fino alla data di scadenza indicata in etichetta, purché conservate alla temperatura indicata.
La conservazione e la validità dei reagenti diluiti per l'uso, dopo l'apertura, sono riportate in appendice nella
Tabella 1.
Strumentazione necessaria:
Per la dispensazione automatica dei reagenti e della soluzione di lavaggio
BEP® II:
BEP® III:
Per l'esecuzione automatica e valutazione del test, dopo la distribuzione dei campioni
BEP® 2000:
Per l'esecuzione completamente automatica del test e la valutazione dei risultati
Pipette:
Pipette automatiche da 25, 100 e 1000 µl
Sistema di incubazione: bagnomaria coperto (+37 ± 1 °C) o analoghi metodi di incubazione
Tutta la strumentazione usata nel test deve essere validata.
Campioni in esame
Si impiegano come campioni in esame quelli singoli (siero umano o plasma citratato/eparinizzato/EDTA) ottenuti da tecniche standard di laboratorio. I campioni devono essere conservati a + 2/+ 8 °C per non più di 3
giorni. Se i campioni devono essere conservati per un lungo periodo di tempo, devono essere congelati.
Esecuzione del test
Esecuzione del test con il BEP® II
1. Schema di distribuzione:
definire il numero dei pozzetti necessari (numero dei campioni in esame + 6 pozzetti per i controlli). Per
l’esecuzione del test togliere le file di pozzetti non necessarie e conservarle per successive determinazioni
(vedi. Tabella 1).
2. Distribuzione del tampone per i campioni:
distribuire 25 µL di tampone per i campioni in ogni pozzetto.
3. Distribuzione dei campioni:
distribuire 100 µL di siero di controllo negativo in ognuno dei primi 4 pozzetti e 100 µL di siero di controllo
positivo nei 2 pozzetti successivi; distribuire in ognuno dei successivi pozzetti 100 µL di campione non
diluito, coprire con un foglio adesivo e inserire la micropiastra nel sistema di incubazione il più presto
possibile, al massimo entro 15 min dalla distribuzione dei campioni.
In alternativa al suriportato schema di distribuzione, è possibile distribuire il controllo positivo all’inizio ed
alla fine della serie.
Schema di distribuzione: distribuire 100 µL/pozzetto di controllo negativo in 4 pozzetti, 100 µL di controllo positivo nel pozzetto successivo, quindi distribuire 100 µL/pozzetto del campione non diluito nei
pozzetti successivi. Alla fine della serie o della piastra distribuire ancora una volta 100 µL di controllo
positivo.
4. Incubazione dei campioni:
incubare per 30 ± 2 min a +37± 1 °C, iniziare quindi immediatamente la fase di lavaggio.
5. Lavaggio:
rimuovere il foglio adesivo, aspirare il contenuto di tutti i pozzetti e lavare utilizzando ogni volta ca. 0,3 mL
di soluzione di lavaggio per 4 volte.
6. Distribuzione del coniugato:
distribuire in ogni pozzetto 100 µL di coniugato, ricoprire con un nuovo foglio adesivo e inserire subito la
micropiastra nel sistema di incubazione.
7. Incubazione del coniugato:
ricoprire con un nuovo foglio adesivo e incubare per 30 ±2 min, a +37± 1 °C come descritto al punto 4. Al
termine inserire immediatamente la piastra nel dispositivo di lavaggio.
8. Lavaggio:
rimuovere il foglio adesivo e lavare come descritto al punto 5.
9. Distribuzione del substrato:
distribuire in ogni pozzetto 100 µL di soluzione d'uso di cromogeno e ricoprire con un nuovo foglio adesivo.
10. Incubazione del substrato:
incubare per 30 ± 2 min. a + 18/+25 °C al riparo dalla luce.
11. Arresto della reazione:
rimuovere il foglio adesivo e aggiungere in ogni pozzetto 100 µL di soluzione bloccante POD, con lo stesso
ordine seguito al punto 9.
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12. Lettura: leggere i risultati al fotometro a 450 nm entro 1 ora.
Effettuare la misurazione dei valori di estinzione dei campioni di controllo e dei pazienti a 450 nm. La
lunghezza d'onda della misura di riferimento dovrebbe essere 650 nm (evtl. fra 615 nm e 690 nm).
Esecuzione del test usando il BEP® III
Prima di utilizzare il BEP® III, preparare le piastre test ed eseguire le operazioni di dispensamento dei campioni (Paragrafo 1 e 2 in «Esecuzione del test con il BEP® II»). Subito dopo porre le piastre non coperte da foglio
adesivo nel BEP® III. Attenzione: le piastre parzialmente riempite devono essere completate almeno a metà
piastra (6 strip) aggiungendo «strip riempite con acqua». Il test viene quindi eseguito in modo completamente
automatico (v. Manuale d’uso BEP® III).
Le impostazioni per i periodi di incubazione nel software del BEP® III possono differire dai periodi del BEP® II
per motivi tecnici (velocità del sistema), ma sono state validate per i metodi Enzygnost* sul BEP® III.
Esecuzione del test usando BEP® 2000
Le fasi di dispensazione del campione e la successiva esecuzione del test sono eseguite in maniera completamente automatica dallo strumento (v. manuale d’uso del BEP® 2000).
Validità del test
I singoli valori di estinzione per i sieri di controllo devono essere rispondenti ai seguenti protocolli:
-0,010 < E neg. < 0,150
E pos. > 0,700
Se uno dei quattro valori di estinzione del siero di controllo negativo non è compreso nell'ambito specificato,
può essere trascurato.
I valori di estinzione dei controlli positivi devono entrambi essere compresi nell'ambito indicato. Se non sussistono queste condizioni, il test deve essere ripetuto.
Valutazione del test
Sul BEP® 2000 e sul BEP® III il calcolo dei risultati viene eseguito automaticamente. Per maggiori informazione consultare il manuale d'uso. I seguenti capitoli permettono la valutazione dei risultati senza l'ausilio del
software.
Dai valori di estinzione validi dei controlli negativi si calcola il valore medio.
Per calcolare il valore soglia si somma al valore medio di estinzione dei controlli negativi il valore di 0,400:
–
Eneg. + 0,400 = Valore soglia (cut off)
La zona grigia è definita dall’ambito compreso fra il valore soglia ed il valore soglia diminuito del -10%.
Secondo i criteri del test i campioni in esame vengono così classificati:
Risultato del test:
1.
Ecampione
< cut off - 10% ^= campione «negativo»
2.
Ecampione
> cut off
^= campione «reattivo»
3.
cut off - 10% < Ecampione < cut off
^ campione «dubbio»
=
I campioni per i quali risultano valori di estinzione entro la zona grigia o superiori, devono essere risottoposti ad
un nuovo test in doppio.
Se, nella ripetizione del test, i valori di estinzione risultano inferiori alla zona grigia, tali campioni sono da
considerarsi, secondo i criteri del test, negativi.
Se il valore medio di estinzione risulta nuovamente entro l'ambito limite o più alto, il campione è da considerarsi
reattivo. Tutti i campioni che reagiscono ripetutamente con valori entro l'ambito limite o in modo reattivo,
dovrebbero in ogni caso essere sottoposti ai cosiddetti test di conferma (ad es. Western-Blot).
Limitazioni della esecuzione del test
1. Anticoagulanti come l’eparina, EDTA e citrato non interferiscono con il risultato del test.
2. Campioni lipemici, itterici o emolitici non interferiscono con il test.
3. Campioni contenenti sostanze potenzialmente interferenti come fattori reumatoidi, anticorpi EBV/IgM, anticorpi VZV/IgM, anticorpi E.-Coli, ANA e AMA, così come sieri di donne in gravidanza sono stati analizzati
con il test. Sui campioni esaminati non si sono osservate interferenze sul risultato del test.
4. Non sono state rilevate interferenze utilizzando campioni congelati e scongelati più volte, come pure i sieri
inattivati al calore (30 min. a + 56 °C).
5. Non devono essere utilizzati sieri coagulati inadeguatamente o campioni contaminati. Qualsiasi particella
(es. coaguli di fibrina, eritrociti) devono essere eliminati prima del test.
6. Per i campioni scongelati assicurare una buona omogeneizzazione del materiale.
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7. Il test è indicato solo per analizzare i campioni singoli e non per un pool di campioni o campioni diluiti.
8. I reagenti non devono essere interscambiati con altri kit a meno che non siano dello stesso lotto (devono
avere la combinazione ammessa dei numeri di lotto a 6 cifre stampati sulla confezione e riportata
nell’allegata tabella dei codici a barre).
Sono esclusi la Soluzione di lavaggio POD, la Soluzione bloccante POD e la Soluzione d’uso di cromogeno (preparata con il cromogeno TMB ed il Tampone/Substrato TMB appartenenti tutti allo stesso lotto).
9. Il Tampone/Substrato TMB, la Soluzione d’uso di Cromogeno e la Soluzione Bloccante POD non devono
venire in contatto con ioni di metalli pesanti o sostanze ossidanti (non usare pipette con parti metalliche a
diretto contatto con il liquido). Non eseguire la reazione con il substrato in presenza di disinfettanti contenenti ipoclorito. Se la Soluzione d’uso di Cromogeno ha sviluppato un colore blu prima della dispensazione nella piastra test, questo indica che la soluzione è contaminata; in tal caso preparare una soluzione
fresca in un contenitore pulito. Evitare il contatto delle suddette soluzioni con la cute.
10. Durante il periodo di incubazione la piastra deve essere protetta da vibrazioni (ad es. utilizzare un supporto fisso ed evitare bagnomaria a circolazione d’acqua); i pozzetti devono venire a contatto con l’acqua
termostatata. Se vengono utilizzati conservanti per evitare la contaminazione dell’acqua, occorre fare
attenzione che la superficie della piastra test ed i pozzetti non vengano a contatto con queste soluzioni, in
quanto simili contaminazioni possono produrre reazioni aspecifiche.
11. Campioni altamente reattivi possono causare la formazione di un precipitato entro la soluzione colorata
durante la reazione bloccante. Questo non interferisce con la valutazione fotometrica.
12. Il siero di controllo è stato ottenuto da siero umano nativo. Possono manifestarsi intorbidamenti, che però
non interferiscono sui risultati del test.
13. Dade Behring ha validato l’uso di questi reagenti su vari analizzatori per ottimizzare le prestazioni e rispettare le specifiche dei prodotti. Le modifiche definite dall’utente non sono supportate da Dade Behring
poiché possono influire sulle prestazioni del sistema e sui risultati del test. Pertanto è responsabilità
dell’utente validare tutte le modifiche apportate a queste istruzioni, l’uso dei reagenti su analizzatori diversi
da quelli inclusi nei fogli di istruzioni o nelle istruzioni d’uso fornite da Dade Behring.
14. I risultati di questo test devono essere sempre interpretati alla luce della anamnesi del paziente, della
presentazione clinica e valutando contestualmente l’esito di altri accertamenti.
Caratteristiche del test
Sensibilità e specificità
I risultati per la valutazione della sensibilità e specificità sono riportati nelle tabelle 2 e 3 (in appendice).
Per la valutazione della sensibilità sono stati esaminati in totale 566 campioni anti-HIV1 positivi, 317 anti-HIV2
positivi e 22 anti-HIV1 (sottotipo O) positivi. Tutti i 905 campioni anti HIV positivi esaminati sono risultati
positivi al test secondo i criteri dell'Enzygnost* anti-HIV1/2 Plus.
La reattività al test per campioni in sieroconversione è stata verificata esaminando 31 pannelli di sieri di
pazienti durante la fase di sieroconversione. L’Enzygnost* anti-HIV 1/ 2 Plus ha dimostrato una sensibilità
corrispondente alla sensibilità di test analoghi in merito alla precocità di rilevamento della sieroconversione.
Non si può tuttavia escludere la possibilità che, con l'impiego del test su vasta scala, qualche particolare
campione possa risultare non identificato.
Per la valutazione della specificità sono stati esaminati in totale 9243 campioni di sangue anti-HIV negativi ed
è stata rilevata una specificità da 99,3 a 100% (test iniziale) e di 99,9% (dopo ripetizione del test). Possibili
scostamenti da tali valori possono dipendere dal tipo di collettività esaminata, dalle modalità di esecuzione del
test o da altre variabili.
Secondo lo stato attuale delle conoscenze un risultato positivo al test anti-HIV non esclude con assoluta
sicurezza la presenza del virus HIV1 o HIV2 nel sangue. Anche in caso di risultato negativo non si può escludere con assoluta certezza la presenza del virus HIV1 o HIV2.
Riproducibilità
I risultati sulla riproducibilità intra e inter-serie sono riassunti nella Tabella 4 (in Appendice). I dati indicati sono
da considerarsi come risultati tipici. In base a vari fattori (procedure, ecc.) si possono ottenere valori differenti.
* Enzygnost è un marchio registrato della Dade Behring Marburg GmbH negli Germania e altri paesi.
BEP è un marchio registrato della Dade Behring Marburg GmbH negli Stati Uniti, Germania e altri paesi.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
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30
0197
Tab. 1 Conservazione e validità
Enzygnost* anti-HIV 1/ 2 Plus
•
Campioni/Reagenti
Enzygnost* anti-HIV 1/2 Plus
(Piastra test / file rimanenti)
Condizioni
dopo apertura
Coniugato HIV-Ag/POD
dopo apertura
Tampone per campioni (anti-HIV)
Siero di controllo anti-HIV1
positivo
Siero di controllo anti-HIV
negativo
Cromogeno TMB
Tampone/Substrato TMB
Soluzione d’uso di cromogeno
dopo apertura
dopo apertura
dopo apertura
dopo apertura
dopo diluizione
Soluzione di lavaggio POD
(concentrata)
dopo apertura
dopo diluizione
Soluzione bloccante POD
dopo apertura
dopo apertura
Conservazione
+ 2/+8 °C
(nel sacchetto
con l’essiccante)
+ 2/+8 °C
+18/+25 °C
+2/+8 °C
+ 2/+8 °C
< -20 °C
+ 2/+8 °C
< -20 °C
+ 2/+8 °C
+ 2/+8 °C
+ 2/+8 °C
+ 18/+25 °C
(ben chiuso, protetto dalla luce)
+ 2/+8 °C
+ 2/+8 °C
+ 18/+25 °C
+ 2/+8 °C
Stabilità•
6 settimane
4 settimane
2 giorni
4 settimane
4 settimane
3 mesi
4 settimane
3 mesi
data di scadenza
data di scadenza
5 giorni
8 ore
data di scadenza
1 settimana
1 giorno
data di scadenza
In nessun caso oltre la data di scadenza!
Tab. 2 Sensibilità
Per la valutazione della sensibilità sono stati forniti da quattro centri indipendenti (Br, F, G, E) i seguenti dati:
Insieme di campioni
Numero di campioni
(Br)
anti-HIV1 pos. (Europa)
anti-HIV1 pos. (USA)
anti-HIV1 pos. (Africa)
anti-HIV2 pos.
anti-HIV1 (sottotipo O) pos.
pannello di sieroconversione
51
55
136
54
7
31 pannelli
(F)
anti-HIV1 pos.
anti-HIV2 pos.
anti-HIV1 (sottotipo O) pos.
anti-HIV1 pos.
anti-HIV2 pos.
anti-HIV1 (sottotipo O) pos.
anti-HIV1 pos.
anti-HIV2 pos.
77
48
10
150
44
5
97
171
(G)
(E)
Inizialmente reattivi
51
55
136
54
7
la precocità di valutazione corrisponde a quella di test analoghi
77
48
10
150
44
5
97
171
Tab. 3 Specificità
Per la valutazione della specificità sono stati forniti da quattro centri indipendenti (Be, Br, E, F) i seguenti dati:
Insieme di campioni
Nr. campioni
(Be) sieri normali negativi (Germania)
(Br) sieri normali negativi (Germania)
plasmi normali negativi (Germania)
sieri normali negativi (Africa occ.)
(E) sieri normali negativi (Germania)
(F) sieri normali negativi (Francia)
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31
3160
2397
197
436
2003
1050
inizialmente
reattivi
0
4
0
3
0
0
reattivi
dopo ripetizione
3
non esaminati
-
Tab. 4 Riproducibilità
Negli studi per la riproducibilità i campioni sono stati analizzati in determinazioni ripetute 8 volte per ciascuno
dei 5 giorni. Il coefficiente di variazione (CV) è stato calcolato utilizzando il modello della varianza delle componenti di un risultato.
Campione
Assorbanza media
F1
F2
F3
F4
F5
F6
OQFK G13 C0542 (908) H/R
2,36
1,74
0,54
0,75
0,51
0,06
32
CV %
Intra-serie
Inter-serie
4,7
3,0
7,0
5,9
3,9
9,2
12,6
11,4
5,2
16,3
17,0
39,5
Tab. 5 Esecuzione del test e programmazione
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
Esecuzione del test
Programmazione
del Menu per il
(BEP® II, BEP® III, BEP® 2000)
BEP® 2000
Preparazione dei reagenti
25 µL di tampone per campioni
BEP® II
MENU NO
OPERATE 1
YES
Dispensazione Tampone per campioni
4 x 100 µL di siero di controllo negativo
2 x 100 µL di siero di controllo positivo
100 µL ciascuno di campione indiluito
BEP® II
BEP® III
30 min ± 2 min
(37 ± 1 °C)
nel caso di piastre
incomplete (meno di
piastra) aggiungere strip
con pozzettiriempiti
di acqua
4 lavaggi:
BEP® II
100 µL di coniugato
0
NO
0
25
3
NO
OPERATE 2
YES
Lavaggio e dispensazione Coniugato
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
4
NO
0
100
2
NO
OPERATE 3
YES
Lavaggio e dispensazione Cromogeno
30 min ± 2 min
(37 ± 1 °C)
elaborazione
automatica
del test
4 lavaggi:
BEP® II
100 µL di soluzione d’uso
di cromogeno
30 min ± 2 min.
+ 18 / +25 °C
al riparo dalla luce
100 µL di soluzione bloccante
dopo max 1 ora
lettura a 450 nm
(lunghezza d’onda
di riferimento:
650 nm)
Risultato del test
OQFK G13 C0542 (908) H/R
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
33
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
4
NO
0
100
4
NO
OPERATE 4
YES
Dispensazione Soluzione Bloccante
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
0
NO
0
100
5
PHOT
YES
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
450
650
NO
1
NO
4
0.150
0.400
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
Campos de aplicación
Prueba inmunoenzimática para la detección de anticuerpos contra los antígenos HIV1, HIV2 y HIV1 (subtipo O) en
sueros o plasmas. La realización del ensayo inmunológico se lleva a cabo con los ELISA Procesadores BEP® II, BEP®
III y BEP® 2000. El test fue desarollado para la investigación de muestras aisladas, no para muestras en pool. El
producto debe ser usado únicamente en diagnósticos in vitro.
Significado diagnóstico
El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) fue reconocido por primera vez en 1981 como una enfermedad con un cuadro clínico propio. Como causantes de esta enfermedad se conocen hoy dos virus de la
inmunodeficiencia humana diferentes (HIV1 y HIV2). En 1983 fue posible aislar el HIV1 (sinónimo: LAV/HTLV
III)1,2. En el año 1986 se logró aislar un nuevo virus (HIV2), que también es válido como patógeno humano3. La
determinación serológica de los anticuerpos contra HIV tiene un significado muy importante en especial, bajo
el aspecto preventivo, para la medicina de transfusiones con el fin de evitar una mayor propagación de la
enfermedad.
En 1985 se empezó a investigar la existencia de anticuerpos contra Anti-HVI 1 en sangre donada, tanto en los bancos
de sangre como en la produccion de productos del plasma. Informaciones aparecidas en este período sobre la
propagación de infecciones por HIV2, crearon la necesidad de una investigación de rutina para las donaciones de
sangre no sólo para anticuerpos contra Anti-HIV1 si no también contra Anti-HIV2, y así de esta forma poder evitar un
potencial contagio por medio de transfuciones o por preparados producidos a partir de sangre.
En 1990 se describió un nuevo subtipo de HIV4 , pero sólo en 1994 pudieron dos grupos de trabajo, al mismo
tiempo e independientemente el uno del otro, determinar la secuencia de este nuevo subtipo5, 6. Paralelamente con los trabajos virológicos pudieron otros grupos de trabajo demostrar el significado serológico del virus
ahora denominado HIV1- subtipo O7. Después de esto se encontró que con algunos de los ensayos para AntiHIV1+2 se tenía muchas dificultades para detectar el anticuerpo contra Anti-subtipo O 8. Como consecuencia
de esto se presentaba la necesidad de encontrar un método seguro para el reconocimiento de esta nueva
variante de HIV y de los ya establecidos HIV1 y HIV2.
Aunque el reconocimiento de anticuerpos específicos de HIV1 y HIV2 no permite una declaración segura
sobre si existen, en el momento del test, HIV1 y HIV2 infecciosos en la sangre, ni tampoco un valor negativo
excluye la presencia de HIV1 o HIV2, ofrece el test de anticuerpos la mayor posibilidad para reconocer y
eliminar sangres donadas infectadas con HIV.
Principio del método
La inmunoglobulina específica para HIV existente en la muestra a investigar se une a la proteína recombinante HIV1, HIV2 y/o HIV1 (subtipo O) fijadas a la superficie de la placa de microtitulación.
Después de retirar las partes no enlazadas de la muestra, se une el conjugado al anticuerpo específico para HIV.
Después de retirar el exceso de conjugado se determina la actividad enzimática del conjugado (reacción cromática
azul). La transformación enzimática del cromógeno se interrumpe por adición de la solución de parada POD (reacción cromática amarilla). La intensidad del color es proporcional a la concentración de anticuerpo en la muestra.
Reactivos
Contenido del envase comercial
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
Conjugado HIV-Ag/POD
Tampón para muestras (Anti-HIV)
Suero control, positivo (Anti-HIV1)
Suero control, negativo (Anti-HIV)
Solución de lavado POD (concentrado)**
Tampón/Sustrato TMB**
Cromógeno TMB**
Solución de parada POD**
Frasco vacío
Etiqueta "Frasco vacío para conjugado"
Láminas adhesivas
Boletín informativo
Tabla de código de barras
Bolsa de PE
Otros envases comerciales: 570 x 96 (Q)
2 x 96
10 x 96
2 placas de prueba
2 x 15 ml
2 x 15 ml
2 x 1,4 ml
2 x 2,8 ml
6 unidades
1 unidad
1 unidad
1 unidad
10 placas de prueba
10 x 15 ml
4 x 15 ml
3 x 1,4 ml
3 x 2,8 ml
2 x 100 ml
4 x 30 ml
4 x 3 ml
2 x 100 ml
1 unidad
1 unidad
30 unidades
1 unidad
1 unidad
1 unidad
** Estos componentes también vienen includíos en el kit de Reactivos adicionales para Enzygnost* TMB (N°
de pedido OUVP).
OQFK G13 C0542 (908) H/R
34
Edición Febrero 2004
Materiales adicionales necesarios para el kit 2 x 96
Reactivos complementarios para Enzygnost* TMB (N° de pedido OUVP)
Composición
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus (Placa de prueba)
Placa de microtitulación recubierta con una mezcla de recombinantes de proteínas-HIV(env) (E.Coli). Las
proteínas representan rangos inmunoreactivos de las siguientes proteínas virales:
gp41 (HIV1), gp41 (HIV1-subtipo O), gp36 (HIV2).
Conjugado HIV-Ag/POD
Proteína recombinante-HIV y péptido sintético-HIV, conjugados con peroxidasa POD, listo para el uso al
añadir Tris-hydroximethylaminomethan (36 g/l) y cloruro de sodio (6 g/l).
Medio de conservación:
Fenol (máx. 1 g/l)
Tampón para muestras (Anti-HIV)
Contiene glicerina (100 g/l), Tween 20 (20 g/l), cloruro de sodio (8,8 g/l), EDTA (1,9 g/l), albúmina bovina
(1 g/l), polygelina y fosfato (50 mmol/l).
Medio de conservación:
Fenol (máx. 1 g/l)
Suero control, positivo (Anti-HIV1)
Suero humano con anticuerpos contra el antígeno HIV1, tratado por calor y estabilizado.
Medio de conservación:
Fenol (máx. 1 g/l)
Suero control, negativo (Anti-HIV)
Suero humano sin anticuerpos contra los antígenos HIV1, HIV2 y HIV1 (subtipo O), estabilizado.
Medio de conservación:
Fenol (máx. 1 g/l)
Solución de lavado POD (concentrado)
Solución tampón de fosfato (90 mmol/l) conteniendo Tween (18 g/l).
Medio de conservación:
Fenol (máx. 1 g/l)
Tampón/Sustrato TMB
Peróxido de hidrógeno (aprox. 0,1 g/l) en solución tampón de acetato (25 mmol/l).
Medio de conservación:
n-Butanol (máx. 1%)
Cromógeno TMB
Clorhidrato de tetrametilbencidina (5 g/l).
Solución de parada POD
Ácido sulfúrico 0,5N.
Frasco vacio para la solución de uso del cromógeno
Bolsa de PE para conservar los elementos no utilizados
Tabla de código de barras
Advertencias y medidas de precaución
1. Sólo para ser utilizado en diagnósticos in-vitro.
2. Cada donación individual de sangre, destinada a la preparación de los sueros de control ha sido sometida
a pruebas para detectar el HBsAg, los anti-HCV, los anti-HIV1 y los anti-HIV2.
Para la elaboración sólo se utilizan donaciones con resultados negativos. El suero de control positivo se
somete a un tratamiento por calor (por lo menos 1 hora a + 56 °C)
Independientemente de esto, todas las muestras obtenidas a partir de sangre humana (p. ej. sueros de
pacientes) y productos (p. ej. sueros de control) deben ser manipuladas con las precauciones necesarias,
siguiendo las medidas de seguridad recomendadas en caso de riesgo biológico, puesto que nunca se
puede excluir completamente el peligro de una contaminación bacteriana9.
3. Se aconseja utilizar guantes de seguridad durante el desarrollo del test.
4. Para la eliminación del material infeccioso sólido se recomienda colocarlo en el autoclave por lo menos 1
hora a + 121°C. Las soluciones aspiradas se deben recoger en dos recipientes conectados uno con el
otro. Los recipientes deben contener un medio de desinfección apropiado para inactivar virus patógenos
humanos. Deben observarse la concentración y el tiempo de acción dados por el fabricante.
5. Los reactivos (con exepción de la solución de lavado POD, la solución de parada y la solución de uso del
cromógeno, la cual ha sido preparada a partir de los reactivos dependientes del lote, cromógeno TMB y
Tampón/sustrato TMB ) sólo se pueden utilizar juntos si provienen del mismo lote, esto es, con el mismo
número de 6 cifras que está impreso en el envase o que se puede tomar de la tabla de valores de códigos
de barras incluida en él.
Preparación de reactivos
Antes de iniciar el test calentar todos los reactivos y las muestras a investigar entre +18 y +25 °C. No sacar del
recipiente la placa de prueba.
En el envase Enzygnost* Anti-HIV1/2 Plus 10 x 96 viene una etiqueta para un frasco vacío para el conjugado
HIV-Ag/POD. Para evitar el cambio frecuente de jeringa en el BEP® III cuando se trabaja una serie grande de
muestras, puede ser de gran utilidad mezclar varias soluciones de conjugado HIV-Ag/POD en un frasco
grande (por ej. un frasco vacío sobrante de solución de uso de cromógeno o un frasco lavado de solución de
parada), marcarlo con la etiqueta frasco vacío para conjugado y colocarlo en la rueda de reactivos.
OQFK G13 C0542 (908) H/R
35
Para cada placa de prueba diluir 20 ml de la solución de lavado POD con agua destilada o desionizada
hasta obtener 400 ml.
Solución de uso del cromógeno: Por cada placa diluir 1 ml de cromógeno TMB con 10 ml de tampón/sustrato
TMB dentro de la botella de plástico que viene en el envase para este fin (solución lista de cromógeno), mantenerla
cerrada y protegida de la luz. Lavar el frasco esmeradamente con agua destilada después de su uso.
Por razones técnicas (sobrellenado) no está permitido verter el contenido del cromógeno TMB en el frasco de
tampón/sustrato TMB.
Estabilidad y almacenaje
Todos los componentes del envase combinado Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus aún cerrados, conservados a la
temperatura indicada, son utilizables hasta las fechas de vencimiento dadas en las etiquetas.
La estabilidad y las condiciones de almacenamiento de los envases ya abiertos o de los reactivos ya diluidos
listos para el uso se pueden tomar de la Tabla 1 del apéndice.
Equipo necesario:
BEP® II:
BEP® III:
Para el desarollo automático de la dosificación de reactivos y de las etapas de lavado
Para la realización completamente automática del test después de la distribución de
las muestras, así como para la evaluación
®
Para la realización completamente automática del test
BEP 2000:
Pipetas:
Pipetas a émbolo 25, 100 y 1000 µl
Incubadora:
Baño de agua cubierto (+37 ± 1 °C) u otros métodos de incubación similares
Todos los instrumentos utilizados para el desarrollo del test deben estar validados.
Material a investigar
Para la investigación se pueden utilizar muestras aisladas (sueros humanos o plasma con EDTA/heparina/citrato),
las cuales hayan sido tomadas según las técnicas estándar de laboratorio. Las muestras se pueden almacenar
máximo 3 días entre 2 y 8 °C. Para tiempos más largos de almacenamiento las muestras se deben congelar.
Procedimiento
Procedimiento con el BEP® II
1. Esquema de distribución:
Determinar el número necesario de pocillos de la placa (número de muestras a investigar más 6 pocillos
para los controles). Los elementos de la placa de prueba no utilizados se deben retirar del marco que los
contiene y se deben guardar para ser utilizados posteriormente (ver Tabla 1).
2. Distribución del tampón para muestras:
En cada uno de los pocillos colocar 25 µl de tampón para muestras.
3. Dosificación de las muestras:
Llenar 4 pocillos c/u con 100 µl de control negativo y 2 pocillos c/u con 100 µl de control positivo; en los
siguientes pocillos dosificar 100 µl de las muestras sin diluir por cada uno, cubrir con la lámina adhesiva,
y lo más pronto posible, máximo 15 min después de terminar la dosificación de las muestras, colocar la
placa en el incubador.
Como una alternativa para el esquema de pipeteo descrito anteriormente se permite también colocar un
control positivo al comienzo y otro al final de cada serie del test.
Esquema de pipeteo: Dosificar en cuatro pocillos 100 µl del control negativo por c/u, en un pocillo 100 µl del
control positivo y en cada uno de los siguientes pocillos 100 µl de la muestra sin diluir. Al final de la serie o de
la placa de ensayo dosificar una vez más 100 µl del control positivo.
4. Incubación de las muestras:
Incubar durante 30 ± 2 min a + 37 ± 1 °C, lavar a continuación.
5. Lavado:
Retirar la lámina adhesiva, aspirar el contenido de todos los pocillos y lavar 4 veces con aprox. 0,3 ml de la
solución de lavado cada vez.
6. Distribución del conjugado:
Colocar en cada pocillo 100 µl de conjugado, cubrir la placa con nueva lámina adhesiva e inmediatamente colocar en el incubador.
7. Incubación del conjugado:
Incubar durante 30 ± 2 min a +37 ± 1°C, como se describe en el punto 4 y lavar inmediatamente después.
8. Lavado:
Retirar la lámina adhesiva y lavar como está descrito en el punto 5.
9. Distribución del sustrato:
Agregar en cada pocillo 100 µl de solución de cromógeno lista para el uso y cubrir la placa con un nueva
lámina adhesiva.
10. Incubación del sustrato:
30 ± 2 min entre +18 y +25 °C protegiendo de la luz.
OQFK G13 C0542 (908) H/R
36
11. Reacción de parada:
Retirar la lámina adhesiva y agregar en cada pocillo 100 µl de solución de parada POD; mantener el
mismo ritmo que en el punto 9.
12. Medición:
Realizar la medición en el fotómetro a 450 nm en el termino de una hora.
La medida de la extinción de los controles y de las muestras de pacientes se hace a 450 nm, como
longitud de onda de la medida de referencia se aconseja 650 nm (eventualmente entre 615 y 690 nm).
Procedimiento en el BEP® III
Para el desarrollo del test en el BEP® III, las placas de prueba se deben preparar hasta la distribución de las
muestras (punto 1 hasta punto 3 del "Procedimiento en el BEP® II"). Directamente después de esto, colocar
las placas de prueba abiertas, esto es, sin lámina adhesiva en el BEP® III. Aquí es importante observar que las
placas de prueba que no estén llenas se deben completar con "elementos con agua" hasta por lo menos la
mitad de la placa de prueba (6 elementos). Todas las etapas subsiguientes van a ser realizadas de forma
completamente automática por el aparato (ver manual de funcionamiento del BEP® III).
Los tiempos de incubación ajustados en el software del BEP® III pueden desviarse de los del procedimiento
en el BEP® II debido a condiciones técnicas básicas (ritmo del aparato), están sin embargo validados en la
combinación BEP® III/Enzygnost*.
Procedimiento con el BEP® 2000
La dosificación de las muestras y la subsiguiente realización del test se efectúan de forma completamente
automática en el aparato (ver manual de funcionamiento del BEP® 2000).
Validez del test
Cada valor de la extinción para los sueros de control debe cumplir las siguientes especificaciones:
- 0,010 < Eneg. < 0,150
Epos. > 0,700
De los cuatro valores de extinción del control negativo, puede uno estar fuera de las especificaciones y éste
se puede descartar.
Los dos valores de extinción del control positivo deben cumplir las especificaciones anteriores.
Si estas condiciones no se cumplen se debe repetir el test.
Valoración del test
Las valoraciones se efectúan automáticamente con el BEP® 2000 y el BEP® III. Para esto consultar, por favor,
los manuales de funcionamiento. Los siguientes capítulos son para tener en cuenta en caso de evaluaciones
sin la ayuda del software.
De los valores válidos de la extinción del control negativo se halla el valor promedio.
Para calcular el valor límite se añade un valor de 0,400 al valor promedio de extinción del control negativo:
_
Eneg. + 0,400 = Valor límite (cut off)
Como rango limitante se define:
Valor límite hasta valor límite - 10%
De acuerdo a los criterios del test, las muestras a investigar se clasifican de la siguiente manera:
Resultados del test:
1.
Emuestra < cut off - 10%
^ "negativo"
=
2.
Emuestra > cut off
^= "reactiva"
3.
cut off - 10% < Emuestra < cut off
^= "valor limítrofe"
Muestras que tengan valores de extinción en la zona gris o extinciones mayores se deben repetir en una doble
determinación. Si después de la repetición del test se encuentran valores por debajo de éste, de acuerdo con
los criterios del test, se deben tomar estas muestras como anticuerpo-negativo.
Para nuevos valores promedios de extinción limítrofes o mayores se considera la prueba como reactiva.
Todos los valores limítrofes repetitivos o todas las muestras 2 x reactivas deben ser necesariamente confirmadas con ayuda de los llamados test de confirmación (por ej. Análisis Western -Blot).
Limitaciones del Procedimiento
1. Los anticoagulantes como heparina, EDTA y citrato no influyen sobre los resultados del test.
2. Las muestras lipémicas, ictéricas o hemolíticas no alteran el desarrollo del test.
3. Con el test se examinaron sustancias potencialmente alterantes como factores reumatoides, anticuerpos
EBV/IgM, anticuerpos VZV/IgM, anticuerpos E-coli, ANA y AMA, así como, sueros de embarazadas. En
ninguna de las muestras se encontró influencia sobre los resultados del test.
4. En muestras congeladas y descongelas varias veces, así como en sueros tratados por calor (30 min., +56
°C) no se observó ninguna alteración.
OQFK G13 C0542 (908) H/R
37
5. No deben ser utilizados sueros no coagulados totalmente y muestras contaminadas. Si eventualmente
existentes partículas (por ej., coagulo de fibrina, eritocitos) estas deben ser retiradas antes de empezar
con el desarrollo del test.
6. En las muestras descongeladas se debe observar que haya una buena homogenización del material.
7. El test es apropiado únicamente para el estudio de muestras individuales y no de muestras en pool o
diluidas.
8. Los reactivos (con excepción de la solución de lavado POD, la solución de parada POD y la solución de
uso del cromógeno elaborada a partir de los reactivos dependientes del lote, cromógeno TMB y Tampón/
sustrato TMB) sólo se pueden utilizar juntos si provienen del mismo lote, esto es, con el mismo número de
6 cifras que está impreso en el envase o que se puede tomar de la Tabla de código de barras incluida.
9. El tampón substrato TMB, la solución de uso del cromógeno y la solución de parada POD no deben entrar
en contacto con iones de metales pesados ni con sustancias oxidantes (no utilizar pipetas con partes
metálicas que entren en contacto con el líquido). No efectuar la reacción del sustrato en la proximidad de
sustancias desinfectantes que contengan hipoclorito. Una coloración espontánea azul de la solución de
uso del cromógeno antes de colocarla en la placa de prueba indica una contaminación; en este caso, se
deberá preparar una solución fresca en un recipiente limpio. Evite el contacto cutáneo con las soluciones
arriba mencionadas.
10. Durante la incubación debe mantenerse la placa de ensayo quieta (p. ej. sobre un flotador fijo o en un
baño de agua no circulante); los pocillos permanecen de esta manera en contacto con el agua. En el caso
de usar medios de conservación en el agua, para evitar su contaminación, debe observarse cuidadosamente que ni la superficie de la placa de prueba ni los pocillos entren en contacto con estas soluciones, ya
que una contaminación de este tipo puede ocasionar reacciones inespecíficas.
11. Para muestras con reactividad alta puede, durante la reacción de parada, precipitarse el colorante. Esto
no afecta el resultado de la valoración fotométrica.
12. Los sueros de control son fabricados a partir de sueros humanos nativos. Por esta razón puede aparecer
turbidez, la cual no influye sobre los resultados del test.
13. Dade Behring ha validado el uso de los reactivos en varios analizadores para optimizar el rendimiento del
producto y cumplir con las especificaciones del mismo. Las modificaciones definidas por el usuario no
están garantizadas por Dade Behring dado que pueden afectar al rendimiento del sistema y a los resultados del ensayo. Es responsabilidad del usuario validar las modificaciones realizadas a estas instrucciones o el uso de los reactivos en analizadores distintos a los incluidos en las hojas de aplicaciones de Dade
Behring o en estas instrucciones de uso.
14. Los resultados de esta prueba deberán interpretarse siempre de acuerdo con la historia clínica del paciente, la sintomatologia clínica y otras observaciones.
Caracteristicas del test
Sensibilidad y especificidad
Los resultados de la prueba de sensibilidad y especificidad se encuentran resumidos en las Tablas 2 + 3 (en el
apéndice).
Para averiguar la sensibilidad se investigaron en total 566 muestras positivas para Anti-HIV1, 317 para Anti
HIV-2 y 22 para Anti-HIV1 (subtipo O). Todas la 905 muestras Anti-HIV positivas se encontraron positivas,
según los criterios del Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus. La reactividad del ensayo con muestras con seroconversión se investigó usando 31 panels con seroconversión. En este caso, se pudo observar que el Enzygnost*
Anti-HIV 1/2 Plus presenta en relación al reconocimiento de seroconversiones una sensibilidad que corresponde a la sensibilidad de cualquier otro test similar a éste. Independientemente de esto, no se puede excluir
que para un empleo más amplio del test algunas muestras aisladas no se puedan reconocer.
Para averiguar la especificidad se investigaron en total 9243 muestras de sangre Anti-HIV negativas y se encontraron valores para ésta de 99,3 hasta 100% (ensayo inicial) o 99,9 % (repetición del ensayo)). Valores
diferentes a estos son también posibles dependiendo entre otros, de la colectividad a investigar y del desarrollo
del test.
De acuerdo a los conocimientos actuales no se puede deducir de un resultado positivo del Anti-HIV-test, con
seguridad, que existan en la sangre HIV1 o HIV2 infecciosos, como tampoco un resultado negativo de ninguna manera deja excluir con seguridad la presencia de HIV1 o de HIV2.
Reproducibilidad
Los resultados de los ensayos de reproducibilidad intra/inter-ensayo están resumidos en la Tabla 4 (en el
apéndice). En este caso se trata de un datos obtenidos de un ejemplo. Debido a la diferencias, entre otras, en
el desarrollo del test es posible que aparezcan valores discrepantes.
*
Enzygnost es una marca registrada de Dade Behring Marburg GmbH en Alemania y en otros países.
BEP es una marca registrada de Dade Behring Marburg GmbH en USA, Alemania y en otros países.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
OQFK G13 C0542 (908) H/R
38
0197
Tab. 1. Estabilidad y almacenaje
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
Estado
Almacenaje
Estabilidad•
Enzygnost Anti-HIV 1/2Plus
(placa de ensayo/
elementos sobrantes)
abierto
entre +2 y +8 °C en
envase con cápsulas
deshidratantes
6 semanas
Conjugado HIV-Ag/POD
abierto
entre +2 y +8 °C
entre +18 y +25 °C
4 semanas
2 días
Tampón-muestras (Anti HIV)
abierto
entre +2 y +8 °C
4 semanas
Suero control, positivo
(Anti HIV1)
Suero control, negativo
(Anti HIV)
abierto
entre +2 y + 8 °C
< - 20 °C
entre + 2 y + 8 °C
< - 20 °C
4 semanas
3 meses
4 semanas
3 meses
entre +2 y +8 °C
fecha de caducidad
Material/reactivo
*
abierto
Cromógeno TMB
•
abierto
Tampón/substrato TMB
abierto
entre +2 y +8 °C
fecha de caducidad
Solución de uso del
cromógeno
diluido
entre +2 y +8 °C
entre + 18 y + 25 °C
cerrado
protegido de la luz
5 días
8 horas
Solución de lavado POD
(concentrado)
abierto
diluido
entre +2 y +8 °C
entre +2 y +8 °C
entre + 18 y + 25 °C
fecha de caducidad
1 semana
1 día
Solución de parada POD
abierto
entre +2 y +8 °C
fecha de caducidad
En ningún caso más allá de la fecha de caducidad
Tab. 2 Sensibilidad
En las investigaciones sobre la sensibilidad se encontraron, en cuatro centros independientes (Br, F, G, E) los
siguientes datos:
Colectivo de muestras
(Br) Anti-HIV1 pos. (Europa)
Anti-HIV1 pos. (USA)
Anti-HIV1 pos. (Africa)
Anti-HIV2 pos.
Anti-HIV1 (subtipo O) pos.
Panel de seroconversión
(F)
Anti-HIV1 pos.
Anti-HIV2 pos.
Anti-HIV1 (subtipo O) pos.
(G) Anti-HIV1 pos.
Anti-HIV2 pos.
Anti-HIV1 (subtipo O) pos.
(E) Anti-HIV1 pos.
Anti-HIV2 pos.
Número de muestras
51
55
136
54
7
31 paneles Anti-HIV1
77
48
10
150
44
5
97
171
reactividad inicial
51
55
136
54
7
La sensibilidad corresponde a la
sensibilidad de métodos similares
77
48
10
150
44
5
97
171
Tab. 3 Especificidad
En las investigaciones sobre la especificidad se encontraron en cuatro centros independientes (Be, Br, E,F)
los siguientes datos:
Colectividad de muestras
Número de muestras reactividad inicial reactividad repetida
(Be) Sueros normales negativos (Allemania)
3160
0
(Br) Sueros normales negativos (Allemania)
2397
4
3
Plasmas normales negativos (Allemania)
197
0
Sueros normales negativos
436
3
no se midió
(Africa occidental)
(E) Sueros normales negativos (Allemania)
2003
0
(F) Sueros normales negativos (Francia)
1050
0
OQFK G13 C0542 (908) H/R
39
Tab. 4 Reproducibilidad
Para las investigaciones de la reproducibilidad fueron chequeadas las muestras 5 días cada una en 8 determinaciones. El cálculo del coeficiente de variación (CV) se hizo según el modelo componentes de varianza.
Muestra
Valor promedio de
Extinción
Intra-ensayo
Inter-ensayo
2,36
1,74
0,54
0,75
0,51
0,06
4,7
3,0
7,0
5,9
3,9
9,2
12,6
11,4
5,2
16,3
17,0
39,5
F1
F2
F3
F4
F5
F6
OQFK G13 C0542 (908) H/R
40
% CV
Tab.5 Realización y programación de la prueba
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
Procedimiento
Menú de programación
para
(BEP® II, BEP® III, BEP® 2000)
BEP® 2000
Preparación de reactivos
BEP® II
MENU NO
25 µl tampón para muestras
OPERATE 1
YES
Dosificación tampón para muestras
4 x 100 µl suero control, negativo
2 x 100 µl suero control, positivo
100 µl de cada muestra sin diluir
BEP® II
BEP® III
30 min + 2 min
(37 + 1°C)
Completar las placas
a medio armar hasta
la mitad con
"elementos con agua"
4 x lavar:
BEP® II
100 µl de conjugado
0
NO
0
25
3
NO
OPERATE 2
YES
Lavado y dosificación del conjugado
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
4
NO
0
100
2
NO
OPERATE 3
YES
Lavado y dosificación del cromógeno
30 min + 2 min
(37 + 1°C)
realización
automática del test
4 x lavar:
BEP® II
100 µl sol. de cromógeno
lista para usar
30 min ± 2 min
entre +18 y + 25 °C
protegido de la luz
100 µl sol. de parada
después de 1 hora
como máximo
Valoración a 450 nm
(longitud de onda de
referencia: 650 nm)
Resultado de la prueba
OQFK G13 C0542 (908) H/R
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
41
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
4
NO
0
100
4
NO
OPERATE 4
YES
Dosificación solución de parada
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
0
NO
0
100
5
PHOT
YES
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
450
650
NO
1
NO
4
0.150
0.400
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
Campo de aplicação
Teste imunoenzimático para detecção de anticorpos contra os antígenos HIV1, HIV2 e HIV1 (subtipo O) em
soros ou plasmas. O processamento do teste imunoenzimático efectua-se com os processadores ELISA BEP® II,
BEP® III e BEP® 2000. O teste foi desenvolvido para o exame de amostras singulares, não de amostras em
pool. O produto só pode ser utilizado para fins de diagnóstico in vitro.
Significado diagnóstico
A síndrome de imunodeficiência adquirida (SIDA) foi identificada pela primeira vez em 1981 como enfermidade com um quadro clínico próprio. Como seus agentes patogénicos são considerados hoje em dia dois vírus
diferentes da imunodeficiência humana (HIV1 e HIV2). já em 1983 foi possível isolar o HIV1 (sinónimo: LAV/
HTLV III) 1, 2. Em 1986 foi isolado um novo vírus (HIV2), considerado tambémele patogénico em relação ao ser
humano 3. A determinação serológica dos anticorpos contra HIV é particularmente relevante, sobretudo sob o
aspecto preventivo, para a medicina de transfusões com vista a evitar a propagação da enfermidade.
Consequentamente deu-se iníco em 1985 à detecção sistemática de anticorpos anti-HIV1 dádivas de
sangue, tanto em bancos de sangue como no fabrico de produtos do plasma. Informações divulgadas nesse
período sobre a propagação de infecções por HIV2 tornaram necessário implementar também uma rotina de
determinação de anticorpos anti HIV2, a fim de excluir na medida do possível qualger perigo de transmissão
atraves de transfusões ou de preparados fabricados a partir do sangue.
Em 1990 foi descrito um novo subtipo de HIV 4, cuja sequência pôde ser definada, em 1994, simultaneamente, mas independentemente, por dois grupos de investigação 5, 6. Paralelamente aos trabalhos virológicos
lograram outros grupos demonstrar o significado serológico do vírus agora denominado HIV1-subtipo 0 7.
Estas investigações revelaram certas deficiências por parte de alguns testes anti-HIV1 e anti-HIV2 na detecção de anticorpos do subtipo 0 8. Urgia pois desenvolver um método capaz de reconhecer com segurança
não só os tipos já isolados HIV1 e HIV2, mas também esta nova variante.
Ainda que a identificação de anticorpos específicos Anti-HIV1 e Anti-HIV2 não permita concluir com segurança
que, no momento de realização do teste, existiam efectivamente vírus infecciosos HIV1 ou HIV2 no sangue e
um resultado negativo tão-pouco permita excluir com segurança a sua presença, o teste de anticorpos constitui, ainda assim, o melhor meio ao nosso alcance de detectar e eliminar, com alto grau de probabilidade,
dádivas de sangue infectadas pelo HIV.
Princípio metodológico
As imunoglobulinas HIV-específicas contidas na amostra ligam-se às proteínas recombinantes dos HIV 1,
HIV 2 e/ou HIV 1 (subtipo O) fixadas à superfície da placa de microtitulação.
Após eliminação dos componentes não ligados, o complexo conjugado é ligado aos anticorpos
HIV-específicos.
Após eliminação do conjugado em excesso, é determinada a actividade enzimática (reacção cromática azul).
A transformação enzimática do cromógeno é interrompida por adição da solução para bloqueio POD (reacção
cromática amarela). A intensidade da cor é proporcional à concentração de anticorpos na amostra.
Reagentes
Conteúdo da embalagem
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
Conjugado HIV-Ag/POD
Tampão para amostras (Anti-HIV)
Soro de controlo, positivo (Anti-HIV1)
Soro de controlo, negativo (Anti-HIV)
Solução de lavagem POD (concentrado)**
Tampão/substrato TMB**
Cromógeno TMB**
Solução para bloqueio POD**
Frasco vazio
Rótulo «Frasco vazio para o conjugado»
Películas aderentes
Folheto da embalagem
Tabela de código de barras
Bolsa de PE
Outras embalagens comerciais: 570 x 96 (Q)
2 x 96
10 x 96
2 Placas de ensaio
2 x 15 ml
2 x 15 ml
2 x 1,4 ml
2 x 2,8 ml
6 unidades
1 unidade
1 unidade
1 unidade
10 Placas de ensaio
10 x 15 ml
4 x 15 ml
3 x 1,4 ml
3 x 2,8 ml
2 x 100 ml
4 x 30 ml
4 x 3 ml
2 x 100 ml
1 unidade
1 unidade
30 unidades
1 unidade
1 unidade
1 unidade
** Estes componentes também são uma parte integrante da embalagem dos reagentes acidionais para
Enzygnost* TMB (ref. OUVP).
OQFK G13 C0542 (908) H/R
42
Edição Fevereiro 2004
Outro material necessário para o Kit 2 x 96
Reagentes adicionais para Enzygnost* TMB (ref. OUVP)
Composição
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus (Placa de ensaio)
Placa de microtitulação revestida com proteínas recombinantes de HIV (env)(E. Coli). Nas proteínas estão
representados os âmbitos imuno-reactivos das seguintes proteínas virais:
gp41 (HIV1), gp41 (HIV1-subtipo O), gp36 (HIV2).
Conjugado HIV-Ag/POD
Proteína recombinante HIV e peptídeos sintéticos do HIV, conjugados com peroxidase (POD); pronto para o
uso com os aditivos tris-hidroximetilaminometano (36 g/l) e cloreto de sódio (6 g/l).
Conservante: fenol (máx. 1 g/l)
Tampão para amostras (Anti-HIV)
Contém glicerina (100 g/l), tween 20 (20 g/l), cloreto de sódio (8,8 g/l), EDTA (1,9 g/l), albumina bovina (1 g/l),
poligelina e fosfato (50 mmol/l).
Conservante: fenol (máx. 1 g/l)
Soro de controlo, positivo (Anti-HIV1)
Soro humano com anticorpos contra o antígeno HIV1, tratado por calor e estabilizado.
Conservante: fenol (máx. 1 g/l)
Soro de controlo, negativo (Anti-HIV)
Soro humano sem anticorpos Anti-HIV1, Anti-HIV2 e Anti-HIV1 (subtipo O), estabilizado..
Conservante: fenol (máx. 1 g/l)
Solução de lavagem POD (concentrado)
Solução-tampão de fosfato (90 mmol/l) com o aditivo twenn (18 g/l).
Conservante: fenol (máx. 1 g/l)
Tampão/substrato TMB
Peróxido de hidrogénio (aprox. 0,1 g/l) em solução-tampão de acetato (25 mmol/l).
Conservante: n-butanol (máx. 1%)
Cromógeno TMB
Diidrocloreto de tetrametilbenzidina (5 g/l).
Solução para bloqueio POD
Ácido sulfúrico 0,5 N.
Frasco vazio para a solução cromógena
Bolsa de polietileno para conservação de fileiras de poços de ensaio não utilizadas
Tabela de código de barras
Advertências e medidas de precaução
1. Só para uso diagnóstico in-vitro.
2. Cada dádiva individual de sangue destinada à preparação de soros de controlo foi previamente examinada com vista à detecção de HBsAg, Anti-HCV, Anti-HIV1 e Anti-Hiv2. Na preparação de soro de controlo
negativo, só se utilizam soros com resultado negativo. O soro de controlo positivo foi submetido a um
tratamento por calor (pelo menos 1 hora a + 56 °C)
Independentemente disto, todas as amostras obtidas a partir de sangue humano (p. ex. soros de pacientes) e produtos (p. ex. soros de controlo) devem ser manipuladas com as precauções necessárias, seguindo as medidas de segurança recomendadas em caso de risco biológico, uma vez que nunca se pode
excluir inteiramente o risco de contaminação por agentes patogénicos9.
3. Recomenda-se utilizar luvas para análise durante toda a realização do teste.
4. Para desinfecção de materiais sólidos, convém colocá-los na autoclave durante pelo menos 1 hora a uma
temperatura de, pelo menos, + 121 °C. Todas as soluções aspiradas devem ser recolhidas em dois receptáculos ligados em série, que devem conter um desinfectante apropriado para inactivação de vírus patogénicos humanos. Devem observar-se a concentração e o tempo de acção indicados pelo fabricante.
5. Os reagentes (com excepção da solução de lavagem POD, da solução de interrupção POD e da solução
de uso do cromogénio, preparada esta última a partir dos reagentes específicos de cada lote Cromogénio
TMB e Tampão/substrato TMB) só podem ser utilizados como constituintes de um mesmo lote, isto é,
somente na combinação de 6 cifras que vem impressa na embalagem e indicada na tabela de valores do
código de barras adjunta.
Preparação dos reagentes
Antes de iniciar o teste, levar todos os reagentes e amostras à temperatura de +18 a +25 °C, tirar a placa de
ensaio do seu recipiente.
A embalagem de Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus 10 x 96 contém em anexo um rótulo com códico de barras para um
frasco vazio destinado ao conjugado HIV-Ag/POD. Para evitar ter de mudar muitas vezes a seringa no BEP® III
quando se procede a uma longa série de análises, pode ser útil verter várias soluções de conjugado HIV-Ag/POD
para um frasco maior (p. ex. um frasco vazio, supranumerário e ainda não utilizado, destinado à solução cromógena usual ou um frasco lavado da solução para bloqueio POD), etiquetá-lo com o rótulo «Frasco vazio para conjugado» e colocá-lo no suporte de reagentes.
OQFK G13 C0542 (908) H/R
43
Para cada placa de ensaio, diluir 20 ml da solução de lavagem POD com água destilada ou desionizada até
obter 400 ml.
Solução cromógena usual: Diluir, por placa, 1 ml de cromógeno TMB com 10 ml de tampão/substrato
TMB no frasco de plástico anexo à embalagem (solução cromógena usual) e conservar fechado e protegido
da luz. Depois do uso, lavar bem o frasco com água destilada.
Por razões técnicas (tamanho dos frascos) não é permitido verter conjuntamente os conteúdos dos frascos
de cromógeno TMB e tampão/substrato TMB.
Estabilidade e condições de conservação
Antes de abertos, e enquanto conservados à temperatura de armazenagem indicada, todos os componentes
da embalagem combinada Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus mantêm-se utilizáveis até ao termo do prazo de
validade indicado nos rótulos.
A estabilidade e condições de conservação dos reagentes abertos ou diluídos para uso podem depreender-se
da tabela 1 em anexo.
Aparelhos necessários:
para a execução automática da dosagem dos reagentes e das fases de lavagem
BEP® II:
BEP® III:
processamento automático do ensaio e interpretação após dosagem das amostras
BEP® 2000:
para o processamento automático e avaliação do teste
Pipetas:
pipetas com êmbolo 25, 100 e 1000 µl
Incubador:
banho-maria tapado (+37 ± 1 °C) ou outros métodos de incubação comparáveis
Todos os aparelhos utilizados no ensaio têm de estar validados.
Amostras
Para a análise podem ser utilizadas amostras individuais (soros humanos e plasmas EDTA/Heparina/Citrato),
colhidos de acordo com as técnicas do laboratório. As amostras poderão ser conservadas durante de 3 dias,
no máximo, entre 2 - 8 °C. Se se pretender conservá-las durante um período de tempo superior, deverão ser
congeladas.
Procedimento
Realização do teste com o BEP® II
1. Esquema de distribuição
Determinar o número de poços de ensaio necessários (número das amostras a investigar mais 6 poços
para os controlos). Retirar do caixilho as fileiras de poços não necessárias e guardá-las para serem
utilizadas mais tarde (v. tabela 1).
2. Distribuição do tampão para amostras
Colocar em cada cavidade 25 µl de tampão para amostras
3. Distribuição de controlos e amostras
Deitar 100 µl de controlo negativo em cada uma de 4 cavidades e 100 µl de controlo positivo em cada uma
de 2 cavidades, depois 100 µl de amostra não-diluída em cada uma das cavidades seguintes. Cobrir com
película aderente e, o mais brevemente possível, no máximo 15 min após a distribuição das amostras,
colocar na incubadora.
Alternativamente ao esquema de pipetagem acima indicado é permitido também distribuir o controlo positivo uma vez no início e outra vez no fim da série de teste.
Esquema de pipetagem: distribuir em 4 poços, 100 µl em cada um, de soro de controlo negativo, em 1
poço 100 µl de soro de controlo positivo, nos poços seguintes 100 µl, em cada um, de amostra não diluída
e no fim da série de teste ou da placa de ensaio novamente 100 µl de soro de controlo positivo.
4. Incubação das amostras
Deixar incubar durante 30 ± 2 min aprox. a + 37 ± 1 °C, imediatamente a seguir dar início à lavagem.
5. Lavagem
Retirar a película aderente, aspirar o conteúdo de todas as cavidades e lavar 4 vezes com aprox. 0,3 ml,
para cada um, de solução de lavagem.
6. Distribuição do conjugado
Deitar 100 µl de conjugado em cada cavidade, cobrir com uma nova película aderente e colocar imediatamente na incubadora.
7. Incubação do conjugado
Deixar incubar durante 30 ± 2 min aprox. a + 37 ± 1 °C, como descrito na alínea 4, e imediatamente a
seguir dar iníco à lavagem.
8. Lavagem
Retirar a película aderente e lavar como descrito em 5.
9. Distribuição do substrato
Deitar 100 µl de solução cromógena em cada cavidade, cobrir a placa com nova película aderente.
10. Incubação do substrato
Deixar incubar durante 30 ± 2 min protegido da luz entre + 18 e + 25 °C.
OQFK G13 C0542 (908) H/R
44
11. Reacção de paragem
Retirar a película aderente. Acrescentar a cada cavidade 100 µl de solução de paragem, mantendo o
mesmo ritmo que em 9.
12. Leitura
Fazer uma leitura fotométrica no espaço de 1 hora.
Efectuar a medição das extinções das amostras de controlo e das dos pacientes a 450 nm; como comprimento de onda de referência aconselha-se 650 nm (eventualmente entre 615 e 690 nm).
Realização do teste com BEP® III
No caso do processamento ser feito com BEP® III é necessário preparar as placas de ensaio incluindo a
dosagem das amostras (ponto 1 e 2 da «execução do teste com BEP® II»). Imediatamente a seguir, as placas
de ensaio são colocadas no BEP® III abertas, ou seja, sem película colada. Nas placas de teste ”incompletas”,
estas necessitam de ter no mínimo 6 strips ainda que sejam preenchidas com água. O processamento subsequente do teste realiza-se automaticamente (vide instruções de serviço do BEP® III).
Devido às condições técnicas básicas (ciclo dos aparelhos), os tempos de incubação ajustados no software
do BEP® III podem divergir dos tempos do processamento com o BEP® II, mas foram validados na combinação BEP® III/Enzygnost*.
Execução do teste com o BEP® 2000
A dosagem das amostras e subsequente processamento do teste efectua-se de forma completamente automática no aparelho (vide instruções de serviço do BEP® 2000).
Validação do teste
Cada valor de extinção para os soros de controlo deve obedecer às seguintes especificações:
- 0,010 ≤ Eneg.≤0,150
Epos.≥0,700
Dos quatro valores de extinção do soro de controlo, negativo, pode estar um fora da especificação e ser
desprezado.
Os dois valores do controlo positivo têm de corresponder ambos à especificação.
Não estando preenchidas estas condições, há que repetir o teste.
Avaliação do teste
As avaliações efectuam-se automaticamente com o BEP® 2000 e BEP® III. Para o efeito, consultar as instruções
de serviço. Deverão observar-se os capítulos seguintes no caso da avaliação ser efectuada sem a assistência
de Software.
De todos os valores de extinção (positivos e negativos) válidos, tira-se o valor médio para cada conjunto de
valores positivos e negativos.
Para calcular o valor-limite (cut off) junta-se um valor de 0,400 ao valor médio de extinção do controle negativo:
–
E neg. + 0,400 = valor-limite (cut off)
Como zona de incerteza define-se:
Valor-limite a valor-limite - 10%
De acordo com os critérios do teste, as amostras são classificadas do seguinte modo:
Resultados do teste:
1.
Eamostra
< cut off - 10% ^= «negativo»
2.
Eamostra
> cut off
3.
cut off - 10% ≤ Eamostra ≤ cut off
^= «reactivo»
^= «duvidoso»
Amostras que mostrem extinções na zona de incerteza ou superiores devem ser sujeitas a novo teste, numa
dupla determinação.
No caso de reanálise da amostra, esta deve ser considerada anticorpo-negativa caso as absorvâncias se
encontrem fora do intervalo estipulado, definido no teste.
Se os valores médios do novo teste se acharem novamente na zona de incerteza ou acima dele, a amostra será
considera novamente reactiva. Todas as amostras que acusem repetidamente valores duvidosos ou reactivos
têm de ser sujeitas a um teste dito de confirmação (p. ex. uma análise Western-Blot).
Limitações do procedimento
1. Os anticoagulantes como a heparina, EDTA e citrato não influenciam o resultado do teste.
2. As amostras lipémicas, ictéricas ou hemolíticas não afectam o teste.
3. As amostras com substâncias potencialmente perturbadoras de factores reumatóides, anticorpos de EBV/
IgM, anticorpos de VZV/IgM, anticorpos de E.-Coli, ANA e AMA, bem como os soros de mulheres grávidas
foram controladas com o teste. Não foi observada qualquer influência no resultado do teste com as amostras
usadas.
OQFK G13 C0542 (908) H/R
45
4. Nas amostras congeladas e descongeladas várias vezes, assim como nos soros tratados com calor (30
min., +56 °C) não se registaram quaisquer perturbações.
5. Não deverão utilizar-se soros insuficientemente coagulados nem amostras de teste contaminadas por
micróbios. Antes da realização do teste, os componentes de partículas existentes (p. ex., coágulo de
fibrina, eritrócitos) têm de ser eliminados.
6. Tratando-se de amostras descongeladas, é necessário prestar atenção a que o material fique bem homogeneizado.
7. O teste só é adequado para a análise de amostras individuais, não para amostras de pool ou diluídas.
8. Os reagentes (excluindo a solução de lavagem POD, a solução de paragem e a solução cromógena
pronta para uso fabricada a partir de reagentes associados a lotes de cromógeno TMB e tampão/substrato TMB) só deverão ser utilizados associados a lotes, ou seja, unicamente na combinação de 6 números
da designação do lote impressa na embalagem ou retirados, respectivamente, da tabela do código de
barras embalada separadamente.
9. O tampão/substrato TMB, a solução cromógena pronta para uso e a solução de paragem POD não podem
entrar em contacto com iões de metal pesado ou substâncias oxidantes (não utilizar pipetas que contenham
partes metálicas que contactem com soluções). Não executar as reacções do substrato na proximidade de
desinfectantes contendo hipoclorito. A coloração espontânea da solução cromógena pronta a usar antes de
ser transferida para a placa de ensaio indicia que há contaminação; é necessário preparar uma solução
fresca num recipiente limpo. Evitar o contacto da pele com as soluções referidas anteriormente.
10. Durante a incubação, a placa de ensaio deverá repousar (p. ex., sobre um flutuador fixo ou em banhomaria não circulante); neste caso, as cavidades ficam em contacto com a água temperada. Se forem
utilizados estabilizadores para impedir a propagação dos germes na água, é necessário ter todo o cuidado para que nem a superfície das placas de ensaio, nem os poços entrem em contacto com estas soluções, uma vez que essa circunstância pode provocar reacções não específicas.
11. Nas amostras fortemente reactivas, na reacção de paragem o corante pode perder-se. A interpretação
fotométrica não é influenciada por esse facto.
12. Os soros de controlo são preparados utilizando soros humanos congénitos. Por essa razão, podem ocorrer turvações que, todavia, não influenciam o resultado do teste.
13. A Dade Behring validou a utilização destes reagentes em vários analisadores, com o intuito de optimizar
o desempenho do produto e satisfazer as especificações do produto. As modificações definidas pelo
utilizador não são suportadas pela Dade Behring, na medida em que podem afectar o desempenho do
sistema e os resultados do ensaio. Constitui responsabilidade do utilizador validar as modificações efectuadas nestas instruções ou em relação ao uso dos reagentes noutros analisadores que não os incluídos
nas folhas de instruções de aplicação da Dade Behring ou nestas instruções de utilização.
14. Os resultados deste teste devem sempre ser interpretados em conjunto com o histórico médico do doente, estado clínico e outros dados de interesse.
Características do teste
Sensibilidade e especificidade
Os resultados das provas de sensibilidade e especificidade encontram-se resumidos nas tabelas 2 + 3 (em anexo).
Para averiguar a sensibilidade foram investigadas um total de 566 amostras positivas para Anti-HIV1, 317
para Anti-HIV2 e 22 para Anti-HIV1 (subtipo 0). Todas as 905 amostras Anti-HIV positivas foram declaradas
positivas segundo os critérios do Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus.
A reactividade ao ensaio relativamente a amostras em seroconversão foi testada utilizando 31 painéis de
soros de pacientes durante a fase de seroconversão. Pôde observar-se que o Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
apresenta, no que diz respeito à sensibilidade a ou reconhecimento de seroconversões, um grau de sensibilidade correspondente à de métodos similares. Não pode todavia excluir-se que, num emprego do teste a
mais alta escala, algumas amostras escapem a um reconhecimento.
Para determinação da especificidade foi testado um total de 9243 amostras sanguíneas Anti-HIV negativas e
achados valores de 99,3% a 100% (ensaio inicial) ou de 99,9% (repetição do ensaio). Valores diferentes
destes são também possíveis, dependendo isso, entre outros factores, da amostragem testada ou da modalidade de execução do teste.
No estado actual de conhecimentos, não se pode inferir com certeza de um resultado positivo do teste AntiHIV que existam efectivamente no sangue HIV1 ou HIV2 infecciosos, nem tão-pouco um resultado negativo
permite excluir com certeza a sua presença.
Reproduetibilidade
Os resultados relacionados com a reprodutibilidade Intra/Inter-ensaio encontram-se resumidos na tabela 4
(apêndice). Tratam-se de dados determinados a título de exemplo. Independentemente da realização do
teste, é perfeitamente possível obterem-se valores divergentes.
* Enzygnost e uma marca registada da Dade Behring Marburg GmbH na Alemanha e noutros países.
BEP e uma marca registada da Dade Behring Marburg GmbH nos EUA, na Alemanha e noutros países.
Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76
D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
OQFK G13 C0542 (908) H/R
46
0197
Tabela 1. Estabilidade e condições de conservação
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
•
Material/reagente
Estado
Conservação
Estabilidad•
Enzygnost* Anti-HIV 1/2Plus
(Placa de ensaio/
fileiras restantes)
após abertura
entre +2 e +8 °C en
na bolsa com cápsulas desidratantes
6 semanas
Conjugado HIV-Ag/POD
após abertura
entre +2 e +8 °C
entre +18 e +25 °C
4 semanas
2 días
Tampão-amostras (Anti HIV)
após abertura
entre +2 e +8 °C
4 semanas
Soro de controlo, positivo
(Anti HIV 1)
Soro de controlo, negativo
(Anti HIV)
após abertura
entre +2 e + 8 °C
< - 20 °C
entre + 2 e + 8 °C
< - 20 °C
4 semanas
3 meses
4 semanas
3 meses
Cromógeno TMB
após abertura
entre +2 e +8 °C
até termo do prazo de validade
Tampão/substrato TMB
após abertura
entre +2 e +8 °C
até termo do prazo de validade
Solução cromógena de uso
após diluição
entre +2 e +8 °C
5 días
entre + 18 e + 25 °C 8 horas
em recipiente fechado
protegido de la luz
Solução de lavagem POD
(concentrado)
após abertura
após diluição
entre +2 e +8 °C
entre +2 e +8 °C
entre + 18 e + 25 °C
até termo do prazo de validade
1 semana
1 día
Solução para bloqueio POD
após abertura
entre +2 e +8 °C
até termo do prazo de validade
após abertura
Nunca depois da data de expiração!
Tabela 2 Sensibilidade
Resultados do exame da sensibilidade fornecidos por 4 centros independentes (Br, F, G, E):
Colectivos de amostras
(Br) Anti-HIV 1 pos. (Europa)
Anti-HIV 1 pos. (USA)
Anti-HIV 1 pos. (África)
Anti-HIV 2 pos.
Anti-HIV 1 (subtipo O) pos.
Painel de seroconversões
(F)
Anti-HIV 1 pos.
Anti-HIV 2 pos.
Anti-HIV 1 (subtipo O) pos.
(G) Anti-HIV 1 pos.
Anti-HIV 2 pos.
Anti-HIV 1 (subtipo O) pos.
(E) Anti-HIV 1 pos.
Anti-HIV 2 pos.
Número de amostras
51
55
136
54
7
31 painéis Anti-HIV 1
77
48
10
150
44
5
97
171
Reactividade inicial
51
55
136
54
7
A sensibilidade corresponde 'a de
métodos similares
77
48
10
150
44
5
97
171
Tabela 3 Especificidade
Resultados do exame da especifidade fornecidos por 4 centros independentes (Be, Br, E,F):
Número de amostras reactividade inicial
Colectivos de amostras
(Be) Soros normais negativos (Alemanha)
3160
0
(Br) Soros normais negativos (Alemanha)
2397
4
Plasmas normais negativos (Alemanha)
197
0
Soros normais negativos
436
3
(África Oc.)
(E) Soros normais negativos (Alemanha)
2003
0
(F) Soros normais negativos (França)
1050
0
OQFK G13 C0542 (908) H/R
47
reactividade repetida
3
não determinada
-
Tabela 4 Reproduetibilidade
Nas análises de reprodutibilidade, as amostras foram sempre testadas durante 5 dias com uma determinação óctupla. O cálculo dos coeficientes de variação (VK) foi feito de acordo com o modelo dos componentes de variância.
Amostra
F1
F2
F3
F4
F5
F6
OQFK G13 C0542 (908) H/R
48
Média das
absorções
Intra-assay
%VK
Inter-assay
2,36
1,74
0,54
0,75
0,51
0,06
4,7
3,0
7,0
5,9
3,9
9,2
12,6
11,4
5,2
16,3
17,0
39,5
Tabela 5 Procedimento e programação do ensaio
Enzygnost* Anti-HIV 1/2 Plus
Execução
Programação do Menu
para o
(BEP® II, BEP® III, BEP® 2000)
BEP® 2000
Preparação dos reagentes
25 µl de tampão para amostras
4 x 100 µl de soro de controlo, negativo
2 x 100 µl de soro de controlo, positivo
100 µl de cada amostra sem diluir
BEP® II
BEP® III
30 min + 2 min
(37 + 1°C)
Placas incompletas
completar até meia placa
com «fileiras de poços»
cheias de água
BEP® II:
lavar 4 vezes
100 µl de conjugado
BEP® II
MENU NO
OPERATE 1
YES
Dosagem do tampão amostra
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
0
NO
0
25
3
NO
OPERATE 2
YES
Lavagem e dosagem do conjugado
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
4
NO
0
100
2
NO
OPERATE 3
YES
Lavagem e dosagem do cromógeno
30 min + 2 min
(37 + 1°C)
execução
automática do teste
BEP® II:
lavar 4 vezes
100 µl de solução cromógena pronta para uso
30 min + 2 min
entre +18 e + 25 °C
protegido da luz
100 µl de solução de paragem
passada 1 hora no máximo
Leitura a 450 nm
(comprimento de onda de
referência: 650 nm)
Resultado do ensaio
OQFK G13 C0542 (908) H/R
49
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
PHOT
4
NO
0
100
4
NO
OPERATE 4
YES
Dosagem da solução de paragem
WASHINGS
ASPIRATE
SOAKTIME
DISP VOL
CHANNEL NO
0
NO
0
100
5
PHOT
YES
MEAS WL
REF WL
BLK COR
EVAL MODE
GEN CUT
NEG CONT
MAX NEG
MIN NEG
FACT NEG
MAX POS
THRESH
CUT OFF
450
650
NO
1
NO
4
0.150
0.400
Bibliography/Literatur/Littérature/Bibliografia/Bibliografía/Bibliografia
1. Barré-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, et al. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk
for Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). Science 1983; 220: 868-71.
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9. U.S. Department of Health and Human Services CDC, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, HHS Publication (CDC) 93-8395; 1999; Section II; 8-16.
Symbols Key / Symbolschlüssel / Explication des Symboles /
Interpretazione simboli / Clave de los Símbolos / Chave dos Símbolos
Manufactured by / Hergestellt von / Fabriqué par / Prodotto da / Fabricado por
IVD
LOT
EXP
CCYY-MM-DD
In Vitro Diagnostic Medical Device / In Vitro Diagnosticum / Dispositif Médical
Diagnostic In Vitro / Dispositivo Medico per Diagnostica In Vitro / Producto sanitario
para Diagnóstico In Vitro
Lot Number / Chargenbezeichnung / Numéro de Lot / Numero di Lotto / Número de
Lote
Expiration Date / Verfalldatum / Date de Péremtion / data di scadenza / Fecha de
vencimiento / termo da validade
Storage Temperature / Lagertemperatur / Température de Conservation / Temperatura
di conservazione / Temperatura de almacenamiento / Temperatura de armazenagem
CE Mark / CE-Zeichen / Marquage CE / Marchio CE / CE Marca / Marca CE
REF
Catalogue Number / Katalog Nummer / Référence / Codice Catalogo / Número de
Catálogo
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OQFK G13 C0542 (908) H/R
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