PROPRIEDADES EMULSIONANTES E
SOLUBILIDADE DA CASEÍNA BOVINA:
2. Efeito da adição de NaCl1
Ângela Jardim DUARTE2, Raquel Linhares
CARREIRA2, Roberto Gonçalves JUNQUEIRA2, José
Virgílio COELHO2, Marialice Pinto Coelho
SILVESTRE2,*
RESUMO
O efeito da adição de NaCl sobre algumas
propriedades funcionais da caseína e de seus
hidrolisados trípticos, foi estudado em dois
valores de pH (4,0 e 5,0). Para tal, foi
adicionado um teor de 0,02M do sal às
soluções-tampão empregadas no preparo das
amostras. Foram determinadas a solubilidade
protéica, a capacidade emulsificante (EC), o
índice de atividade emulsificante (EAI) e a
estabilidade das emulsões (ES), e o raio médio
dos glóbulos de gordura (R) foi calculado. Os
resultados obtidos indicaram que, nos dois
valores de pH estudados, a adição de NaCl
levou a um aumento significativo da
solubilidade e da EC da caseína e de todos os
hidrolisados trípticos. Por outro lado, diminuiu
os valores de EAI da caseína e elevou os dos
hidrolisados, tendo sido observado o oposto
para o tamanho dos glóbulos de gordura. Com
relação à ES, a da caseína apresentou ligeiro
aumento no pH 5,0, enquanto que apenas
alguns hidrolisados trípticos tiveram a sua ES
elevada em pH 4,0 ou 5,0.
Palavras-chave: caseína, solubilidade,
prorpiedades emulsificantes, hidrólise tríptica,
NaCl
SUMMARY
EMULSIFYING PROPERTIES AND
SOLUBILITY OF CASEIN: 2. EFFECTS OF
the NaCl ADDITION. The effect of the NaCl
addition on the emulsifying properties of casein
and tryptic casein hydrolysates was studied in
two pH values (4,0 e 5,0). A 0.02 M
concentration of salt was added to the buffer
solutions used for preparing the samples. The
protein solubility, the emulsifying capacity
(EC), the emulsifying activity index (EAI) and
the emulsion stability (ES) were determined.
The mean radius (R) of fat droplets was also
calculated. The results showed that the addition
of NaCl increased the solubility and the EC of
casein and casein hydrolysates, in both pH
values. However, this salt addition reduced the
EAI of casein and increased that of the
hydrolysates.The opposite was observed
relating to the R of fat droplets. Regarding the
ES, that of casein presented little increase in
pH 5.0, and the same result was obtained for
only some hydrolysates in pH 5.0 or 4.0.
Keywords: casein, solibility, emulsifying
properties, triptic hydrolysis, NaCl.
1 - INTRODUÇÃO
A crescente demanda do consumidor por produtos naturais e
saudáveis, tem contribuído para aumentar o interesse pelo
estudo dos ingredientes utilizados na fabricação de alimentos,
tais como os agentes emulsificantes. Diversos trabalhos têm
mostrado que as proteínas alimentares, bem como seus
hidrolisados enzimáticos, auxiliam na formação e na
estabilidade de emulsões [3, 9, 13, 18, 21, 22, 25, 29].
Por outro lado, uma vez que o NaCl tem sido empregado
extensivamente pelas indústrias alimentícias, visando
melhorar as propriedades funcionais através do aumento da
absorção de água e da solubilidade protéica, além de
contribuir para o sabor dos alimentos [29], torna-se importante
verificar o efeito desse ingrediente nas propriedades
emulsificantes das proteínas.
Segundo CHEFTEL et al. [6], a natureza e a concentração de
íons exercem efeitos significativos sobre a absorção de água e
a solubilidade das proteínas. Assim, concentrações salinas
compreendidas entre 0,5 e 1M (para os sais neutros), podem
elevar a solubilidade da proteína (efeito "salting in") devido ao
aumento da solvatação. Essa ação benéfica do sal tem sido
aproveitada pelas indústrias alimentícias, que utilizam o NaCl
como ingrediente alimentar, visando aumentar a solubilidade e
a estabilidade, melhorando, assim as propriedades
emulsificantes de vários produtos [29]. Por outro lado, quando
os níveis de sais são mais elevados, predominam as interações
água-sal, em detrimento das interações água-proteína (efeito
"salting out"), contribuindo para reduzir a solubilidade
protéica [6].
A caseína e seus hidrolisados enzimáticos apresentam boas
propriedades emulsificantes podendo, portanto, serem
utilizados pelas indústrias de alimentos, como agente
funcional [5, 9, 11, 14, 20, 26, 27, 28]. Entretanto, não são
muitos os trabalhos relatando a ação do sal sobre as
propriedades emulsificantes de proteínas e, nada foi
encontrado na literatura que mencionasse a influência desse
ingrediente sobre essas propriedades de hidrolisados protéicos.
Assim sendo, esse trabalho teve como objetivo estudar o efeito
da adição de NaCl sobre as propriedades emulsificantes da
caseína e de seus hidrolisados trípticos, em pH 4,0 e 5,0.
2 — MATERIAL E MÉTODOS
2.1 – Preparo dos hidrolisados de caseína
Para o preparo dos hidrolisados trípticos de caseína, foi
utilizada a metodologia descrita por DUARTE et al. [9].
Resumidamente, empregou-se como substrato a caseína
(caseína bovina, Sigma Chemical Co.), que foi misturada com
a tripsina (de pâncreas bovino, tipo XIII, tratada com TPCK,
Sigma Chemical Co); ambas solubilizadas em tampão fosfato
dissódico (0,2 M)-ácido cítrico (0,1M), pH 8,0, de maneira a
se obter uma relação enzima:substrato de 0,1%. Após
incubação em banho-maria a 37º C sob agitação, por
intervalos de tempo variando entre 5, 10, 15, 30 e 60 minutos,
obteve-se os hidrolisados T1, T2, T3, T4 e T5,
respectivamente. A reação enzimática foi interrompida,
abaixando-se o pH para 2,0 com ácido clorídrico. Os
hidrolisados foram, então, liofilizados (liofilizador, modelo
L4KR, Edwards do Brasil) e mantidos em freezer a uma
temperatura de -18º C, até o momento de utilização.
2.2 – Preparo das amostras
Seguiu-se o procedimento descrito por DUARTE et al. [9].
Assim, a caseína e seus hidrolisados trípticos foram
solubilizados em solução tampão fosfato dissódico (0,2 M)ácido cítrico (0,1 M), em pH 4,0 e 5,0, na concentração de
0,1g %. Após 30 min, em banho-maria a 35º C, estas soluções
foram centrifugadas (centrífuga de alta rotação, modelo T-23,
Janetzki) a 6.500g por 10 minutos e filtradas em papel de filtro
(quantitativo faixa azul, Framex). Os filtrados assim obtidos
foram utilizados, imediatamente, para as análises, ou então
armazenados no freezer, a uma temperatura de -18º C até o
momento de uso.
2.3 – Determinação da solubilidade
A solubilidade foi determinada como descrito por DUARTE et
al. [9], tendo o teor de proteína solúvel, sido estimado de
acordo com o método de Lowry et al. [17], modificado por
Hartree [12], utilizando-se a albumina (albumina sérica
bovina, Sigma Chemical Co.) como padrão. O teor total de
proteína (N x 6,38) foi determinado pelo método de Kjëldhal
[1] A solubilidade foi expressa em porcentagem de proteína
solúvel (g %)
2.4 – Determinação da Capacidade Emulsificante (EC)
Para a determinação da capacidade emulsificante, foi utilizada
a adaptação do método de VUILLEMARD et al. [30], descrita
por DUARTE et al. [9]. Resumidamente, após ajuste da
temperatura para 10º C, uma alíquota do filtrado das amostras
foi homogeneizada com óleo de milho (Mazola), em
liquidificador de alta rotação (Fisher, mod.14057-5,
18000rpm), até ocorrer a inversão da emulsão, detectada pela
súbita queda da corrente elétrica, empregando-se uma lâmpada
de 120 V. A EC foi, então, calculada pela fórmula (1).
na qual OE e OB correspondem à quantidade (g) de óleo
emulsificada, respectivamente, pelas amostras e pelo branco
(solução tampão sem caseína ou hidrolisado).
2.5 – Determinação do índice de atividade emulsificante
(EAI)
Na determinação do EAI, foi utilizada a adaptação da
metodologia de PEARCE e KINSELLA [23], descrita por
DUARTE et al. [9]. Resumidamente, após ajuste da
temperatura para 20º C, volumes de 30 mL do filtrado das
amostras e de 10 mL de óleo de milho, foram
homogeneizados, em liquidificador, durante um minuto na
velocidade máxima. Posteriormente, a absorbância de
alíquotas dessa emulsão foi lida a 500nm, em
espectrofotômetro (modelo 160-A, Shimadzu), após diluição
com uma soluçãode dodecil sulfato de sódio (SDS) a 0,1% e
NaCl 0,1 M. O EAI foi calculado pela fórmula (2), proposta
por CAMERON et al. [4],
na qual T é a turbidez = 2,303 . A . fator de diluição / L (A=
absorbância a 500 nm; fator de diluição = 100 e L = caminho
óptico das cubetas = 0,01m); θ é a fração de óleo gasto para
formar a emulsão = 0,25 e C é a concentração inicial de
proteína ou hidrolisado = 0,1 g%.
2.6 – Determinação da estabilidade da emulsão (ES)
A ES foi determinada empregando-se a adaptação da
metodologia de CHOBERT et al. [7], descrita por DUARTE
et al. [9]. Assim, as absorbâncias das emulsões formadas para
a determinação do EAI e diluídas com SDS a 0,1%, foram
lidas a 500nm, logo após a sua formação. Depois de um
período de 24 horas de armazenamento sob refrigeração,
foram lidas novamente, como também, após aquecimento a 80
o C por 30 min. Calculou-se, então, o D EAI %, pela fórmula
(3).
(3)
na qual o EAI max é o maior valor obtido para as emulsões
diluídas logo após sua formação, e EAI min é o menor valor
de EAI, obtido pelas alíquotas após o armazenamento por 24
horas ou pelas alíquotas após o aquecimento a 80º C. Os
valores de ES foram calculados pela fórmula (4).
2.7 Cálculo do tamanho dos glóbulos de gordura
O tamanho dos glóbulos de gordura da fase dispersa das
emulsões foi estimado, de acordo com PEARCE e
KINSELLA [23], pela fórmula (5).
(5)
na qual R é o raio médio dos glóbulos de gordura da fase
dispersa das emulsões, θ é a fração de óleo utilizado na
emulsão = 0,25 e T é a turbidez calculada pela absorbância
lida logo após a formação das emulsões.
2.8 – Efeito da adição de NaCl
Para estudar a influência da adição de NaCl na solubilidade e
nas propriedades emulsificantes, foi adicionado à solução
tampão (pH 4,0 e 5,0) um volume de uma solução de NaCl a
0,2M, de maneira a se obter uma concentração final de sal de
0,02M. Posteriormente, as soluções de caseína e de seus
hidrolisados trípticos foram aquecidas, centrifugadas, filtradas
e armazenadas como descrito anteriormente. Procedeu-se,
então, às determinações da solubilidade e das propriedades
emulsificantes, como também, ao cálculo do tamanho dos
glóbulos de gordura.
2.9 – Análise Estatística
As determinações de proteína solúvel, proteína bruta, EC,
EAI, ES e raio médio dos glóbulos de gordura foram
realizadas em triplicata.
Para verificar o efeito da adição de NaCl sobre as
propriedades funcionais e o raio médio dos glóbulos de
gordura, nos dois valores de pH, e para os 5 hidrolisados de
caseína, foram feitos delineamentos em parcelas subsubdivididas (nos quais os tempos de hidrólise eram as
parcelas, os valores de pH as sub-parcelas e a presença ou
ausência de NaCl as sub-sub-parcelas), com análise de
variância, para cada propriedade (p < 0,05) e, em seguida,
utilizado o teste T de Student (DMS) para a comparação das
médias [16].
3 — RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 – Efeito da adição de NaCl sobre a solubilidade
Observa-se na Figura 1 que a adição de NaCl levou a um
aumento significativo da solubilidade da caseína e de todos os
hidrolisados trípticos, nos dois valores de pH estudados. Para
a proteína, este efeito foi mais pronunciado em pH 5,0,
enquanto que para a maioria dos hidrolisados foi no pH 4,0.
FIGURA 1. Efeito da adição de 0,02 M de NaCl sobre a
solubilidade da caseína e de seus hidrolisados trípticos: T1, T2,
T3, T4, T5 - Hidrolisados de caseína obtido aos 5, 10, 15, 30 e 60
min de reação, respectivamente.
No presente estudo, a adição de 0,02M de NaCl, corresponde
a uma concentração final de sal em torno de 0,44M (NaCl e
tampão). Observa-se, portanto, que apesar desse valor situarse abaixo da faixa de 0,5 a 1M, ocorreu o efeito de "salting in"
para a caseína, uma vez que a sua solubilidade aumentou em
ambos os valores de pH estudados.
Alguns autores estudaram a influência da adição de sal sobre a
solubilidade da caseína e/ou de suas frações. Assim, CAYOT
et al. [5] estudaram a solubilidade da b -caseína na ausência e
na presença de 0,1M de NaCl e verificaram que o efeito do sal
foi positivo apenas em pH 5,0, pois em pH 2,0 e 8,0 este
procedimento diminuiu sua solubilidade. VAN HEKKEN e
STRANGE [29], trabalharam com a caseína nativa e
defosforilada, em soluções contendo 0,15M de NaCl, em uma
faixa de pH entre 3,0 e 8,0 e verificaram que a solubilidade de
ambas as caseínas foi bem maior no pH 5,0 que no pH 4,0. No
entanto, FOLEY e O’CONNELL [10] obtiveram resultados
diferentes, quando mostraram que a presença de sal (7,59 g/L)
não influenciou a solubilidade do caseinato de sódio, em pH
4,0 e 5,0.
3.2 – Efeito da adição de NaCl sobre a capacidade
emulsificante
Pode-se notar na Figura 2 que, como descrito para a
solubilidade, a adição de sal, aumentou a EC da caseína e dos
hidrolisados trípticos, em ambos os valores de pH. Nesse caso,
porém, para todas as amostras analisadas, o efeito foi mais
acentuado em pH 5,0.
FIGURA 2. Efeito da adição de 0,02 M de NaCl sobre a
capacidade emulsificante da caseína e de seus
hidrolisados trípticos.T1, T2, T3, T4, T5: Hidrolisados
de caseína obtido aos 5, 10, 15, 30 e 60 min de reação,
respectivamente.
Alguns autores verificaram a influência da adição de sal na EC
da caseína em diferentes formas. Assim, Pearson et al. [24]
verificaram que, para o caseinato de potássio, em pH ácido e
próximo à neutralidade (pH=6,9), a EC elevou-se quando a
força iônica passou de 0,05 para 0,3 com adição de KCl.
MOHANTY et al. [19] estudaram o efeito da adição de NaCl
na EC da caseína ácida (pH 2,5) e caseinato de sódio (pH 7,0)
e mostraram que, com a adição de 100 mM de NaCl, a EC do
caseinato aumentou bruscamente e continuou a crescer,
embora em menor proporção, até a concentração de NaCl
atingir 1000mM. Quanto à caseína, a adição de NaCl até 5mM
aumentou sua EC, enquanto que acima desta concentração, a
EC decresceu, e a partir de aproximadamente 10mM, a EC
atingiu níveis inferiores ao apresentado pela mesma proteína,
na ausência de sal. Por outro lado, Klemaszewsk1 et al. [15]
trabalharam com o caseinato de sódio e verificaram que, em
pH 7,0 (tampão fosfato), sua EC diminuiu quando a força
iônica da solução aumentou de 0,1 para 0,2.
3.3 – Efeito da adição de NaCl sobre o índice de atividade
emulsificante
Na Figura 3, observa-se que a adição de sal, ao contrário do
obtido para a solubilidade e a EC, diminuiu os valores de EAI
da caseína em pH 4,0 e 5,0. Por outro lado, da mesma maneira
como observado para a solubilidade e a EC, esse
procedimento contribuiu para melhorar o EAI de todos os
hidrolisados trípticos, nos dois valores de pH estudados.
FIGURA 3. Efeito da adição de 0,02 M de NaCl sobre o
índice de atividade emulsificante da caseína e de seus
hidrolisados trípticos. T1, T2, T3, T4, T5: Hidrolisados
de caseína obtido aos 5, 10, 15, 30 e 60 min de reação,
respectivamente.
Alguns autores verificaram o efeito da adição de sal sobre o
EAI da caseína em diferentes formas. Desta maneira,
PEARCE e KINSELLA [23] relataram que a adição de uma
concentração equivalente a 1M de NaCl em soluções de
caseína (pH 6,5 e 8,0), elevou ligeiramente seu EAI.
Entretanto, BARRACHIO e VAN DE VOORT [2]
trabalharam com caseína ácida extrusada, caseína extraída de
leite em pó desnatado e com caseinato de sódio, e relataram
que os valores de EAI diminuíram quando a força iônica
passou de 0,05 para 0,3, não tendo sido indicado o pH das
soluções.
3.4 –Efeito da adição de NaCl sobre a estabilidade das
emulsões
Pelos dados apresentados na Figura 4, observa-se que na
presença de NaCl, a ES da caseína não sofreu alterações no
pH 4,0, enquanto que no pH 5,0, houve um pequeno aumento.
Com relação aos hidrolisados trípticos, no pH 4,0 a adição de
NaCl elevou a ES de T3 e T4, não tendo influenciado os
resultados obtidos para as outras amostras. No pH 5,0, o efeito
benéfico da adição de sal sobre a ES somente foi observado
para T2, uma vez que a ES de T1 diminuiu e a dos demais
hidrolisados manteve-se inalterada.
FIGURA 4. Efeito da adição de 0,02 M de NaCl sobre a
estabilidade das emulsões de caseína e de seus
hidrolisados trípticos. ES = 1/∆EAI%x103.T1, T2, T3,
T4, T5: Hidrolisados de caseína obtido aos 5, 10, 15, 30
e 60 min de reação, respectivamente.
De acordo com DAS e KINSELLA [8], a adição de sal pode
levar a uma redução da estabilidade de emulsões óleo/água,
nas quais o agente emulsionante é uma proteína. Nessas
emulsões, as gotículas de gordura possuem carga elétrica
resultante dos grupamentos protéicos ionizados, como também
dos íons provenientes da água. Dessa maneira, os íons
oriundos do sal se depositam em uma dupla camada, uma vez
que o sistema necessita estar eletricamente neutro. Como a
densidade de cargas decresce exponencialmente com a
distância do centro desse sistema, a adição de quantidade
crescente de sal provoca uma redução das forças de repulsão
entre as gotículas de gordura que, então, tendem a se
aproximar levando à floculação e à perda da estabilidade [8].
Assim, a quantidade de sal adicionada no presente estudo,
provavelmente não foi suficiente para produzir esse efeito
negativo na ES da caseína.
A influência do sal na ES da caséina, em diferentes formas, foi
igualmente estudada por outros autores. Segundo Pearson et
al. [24], emulsões formadas pelo caseinato de potássio foram
mais estáveis após a adição de KCl (µ = 0,3) às soluções, que
na ausência de sal. PEARCE e KINSELLA [23] relataram
que, em pH 6,5, a adição de NaCl em concentrações acima de
0,1M, aumentou a estabilidade das emulsões formadas pela
caseína. Da mesma forma, BARRACHIO e VAN DE Voort
[2] verificaram que, quando a força iônica passou de 0,05 para
0,3, houve um aumento na estabilidade de emulsões formadas
pela caseína ácida extrusada, pela caseína extraída de leite em
pó desnatado e pelo caseinato de sódio, não tendo sido
indicado o pH e nem o sal adicionado.
3.5 – Efeito da adição de NaCl sobre o tamanho dos
glóbulos de gordura
Observa-se na Tabela 1 que a adição de sal, em pH 4,0 e 5,0,
aumentou o tamanho dos glóbulos de gordura das emulsões
formadas pela caseína, tendo provocado o efeito contrário,
quando os hidrolisados trípticos foram utilizados como
agentes emulsificantes.
TABELA 1. Raio médio dos glóbulos de gordura (R) de
emulsões formadas pela caseína e seus hidrolisados
trípticos na presença de 0,02 M de NaCl.
pH
Caseína
T1
T2
T3
T4
T5
4,0
2.21 a
1.33 b
0.93 c
0.89 c
1.09 b
0.81 c
5,0
1.83 c
1.18 c
0.89 d
0.88 c
0.99 c
0.82 c
Médias indicadas por letras iguais não
diferem significativamente entre si a
5%.
De acordo com DUARTE et al. [9], o tamanho dos glóbulos
de gordura (R) se relaciona inversamente com a estabilidade
das emulsões. Entretanto, este parâmetro não foi medido,
tendo sido feito apenas um cálculo pela equação proposta por
PEARCE e KINSELLA [23], visando estabelecer uma
correlação aproximada com a estabilidade das emulsões.
Assim sendo, pode-se verificar que, em relação à caseína, essa
relação inversa não foi observada, uma vez que a adição de sal
levou a um aumento do tamanho dos glóbulos de gordura em
ambos os valores de pH, mas não ocorreu a diminuição da ES.
Quanto aos hidrolisados trípticos, essa relação inversa foi
obtida para T3 e T4, no pH 4,0 e para T2 no pH 5,0.
Finalmente, é importante ressaltar que com relação aos
hidrolisados protéicos, não foram encontrados relatos na
literatura abordando o efeito da adição de sal sobre a
solubilidade, as propriedades emulsificantes e o tamanho dos
glóbulos de gordura.
4 — CONCLUSÕES
A adição de NaCl exerceu efeitos variados sobre as
propriedades funcionais das amostras analisadas. Assim, no
caso da caseína, tanto em pH 4.0 como em pH 5.0, esse
procedimento foi vantajoso para a solubilidade, a EC e o
tamanho dos glóbulos de gordura, tendo, por outro lado,
reduzido o EAI. A presença do sal aumentou ligeiramente a
sua ES, apenas no pH 5.0. Quanto aos hidrolisados trípticos,
obteve-se efeitos semelhantes ao da caseína no que se refere à
solubilidade e à EC, e resultados opostos com relação ao EAI
e ao tamanho dos glóbulos de gordura. Em cada pH estudado,
o NaCl afetou positivamente a ES de apenas alguns
hidrolisados.
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6 — AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à CAPES e ao CNPq, pelo
oferecimento de recursos sob a forma de bolsas e à
FAPEMIG, pelo apoio financeiro.
1
Recebido para publicação em 26/01/98. Aceito para publicação em
19/08/98. Esse trabalho é parte da Dissertação de Mestrado do primeiro
autor.
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* A quem a correspondência deve ser endereçada