Probióticos nos alimentos:
aspectos tecnológicos,
funcionais e de segurança
Ana Gomes
Centro de Biotecnologia e Química Fina
Universidade Católica Portuguesa
Rua Dr. António Bernardino Almeida
P-4200-072 Porto, Portugal
Ciência 2008 – Encontro com a Ciência em Portugal
Fundação Calouste Gulbenkian, 2 de Julho
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Ciência 2008 −2 de Julho
Probiótico
Probióticos
Desafios
Tecnológicos
Desafios
funcionais
Desafios em
segurança
Tendências
futuras
“Suplemento bioactivo, que afecta
benéficamente o hospedeiro (após
ingestão em números suficientes)
por melhoria das propriedades da
microflora indígena; (i.e. melhor
equilíbrio microbiano intestinal) ”
FAO, 2001
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Ciência 2008 −2 de Julho
Probiótico – Mecanismos de acção
Supressão de
patogénicos
Probióticosendógenos ex. diarreia
Desafios
Tecnológicos
Desafios
funcionais
Resistência
Colonização
Supressão de
patogénicos
exógenos ex. diarreia
Alívio de sintomas
Controlo do
de alergias
Síndrome
alimentares
Inflamatório
em crianças
Intestinal
Resposta imunitária
Imunidade inata
equilibrada
melhorada
Composição
normalisada
microbiota
intestinal
Imunomodulação
Desafios em
segurança
Tendências
futuras
Probióticos
Desconjugação de
sais biliares
Colesterol
sanguíneo
AGCC, vitaminas (folato),
glutamina
Efeitos Metabólicos
ao epitélio colon
Níveis baixos de reacçoes
toxigénicas/mutagénicas
Factores de Risco
Cancro do Colon
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Hidrólise
Lactose
Tolerância à
Lactose
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Leite fermentado
Enterococcus
Queijo
Biopeptídos:
Caracterização e validação biológica
Requeijão
Biopeptidos em
queijo
Bifidobacterium/
Lactobacillus
Biopeptidos de
proteína de soro
Coalho vegetal
Coalho vegetal
Hidrólise de
caseína /queijo
modelo
Hidrólise de
proteínas de soro
Tecnologia
Ciência e Tecnol-ogia
de queijo
ALIMENTOS
ALIMENTOS FUNCIONAIS
Ciências da Saúde
Probióticos:
Validação biológica e aplicações tecnológicas
Melhoramento
Requeijão
Isolamento/selecção
de enterococos com
potencial
tecnológico
Isolamento/selecção
de BAL autóctones
como culturas de
arranque
Melhoramento de
queijo
Queijos tradicionais —
Caracterização e melhoramento
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Meio de cultura
para produção de
exopolissacarídeos
Requeijão
Soro — caracterização e
valorização
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Áreas de Investigação
Probióticos
Desafios
Tecnológicos
Desafios
funcionais
Desafios em
segurança
Tendências
futuras
Funcionalidade
Tecnologias de
protecção
Probióticos
Vectores
alimentares
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Segurança
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Microrganismos probióticos:
Novos vectores alimentares
Probióticos
Desafios
Tecnológicos
VALORIZAÇÃO DO SORO POR
ADIÇÃO DE PROBIÓTICOS
Desafios
funcionais
Desafios em
segurança
Tendências
futuras
Madureira, A. R., Gião, M. S., Pintado, M. E., Gomes, A. M. P., Freitas, A. C. & Malcata, F.X.
(2005). Journal of Food Science 70(3): M160-M165.
Madureira, A. R., Pintado, M. E., Gomes, A. M. P., Freitas, A. C. & Malcata, F. X. (2006).
Matrizes proteícas como veiculos para probióticos. Anil Leite I+D+T 1 (4), 8-10
Madureira, A. R., Soares, J. C., Gomes, A. M., Pintado, M. E. Freitas, A. C. & Malcata, F. X.
(2008). Dairy Science Technology (aceite para publicação)
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Ciência 2008 −2 de Julho
Estirpes probióticas
- Bifidobacterium animalis Bo
10% (v/v)
- Bifidobacterium animalis BLC1
adição a matrizes
proteicas de soro
homogeneização
- Lactobacillus acidophilus Ki
- Lactobacillus acidophilus LAC1
- Lactobacillus paracasei ssp.
paracasei
- Lactobacillus brevis
distribuição por
frascos estéreis
- Controlo (sem bactérias)
Análise
• viabilidade
• controlo microflora contaminante
• perfil acidificação
• análises químicas
0, 3, 7, 14, 21 e 21 d
amostragem
armazenamento
a 7 ºC, durante
21 d
Madureira, A. R., Gião, M. S., Pintado, M. E., Gomes, A. M. P., Freitas, A.
C. & Malcata, F.X. (2005). Journal of Food Science 70(3): M160-M165.
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Ciência 2008 −2 de Julho
• Matrizes:
Probióticos
Desafios
Tecnológicos
Desafios
funcionais
Desafios em
segurança
Tendências
futuras
• 80 % soro de vaca + 20 % leite de vaca
• 90 % soro de vaca + 10 % leite de ovelha
• 100 % soro de ovelha
• 90 % soro de ovelha + 10 % soro de ovelha
• 100 % mistura de soro (resultante de produção queijo com 90% leite de
ovelha + 10 % leite de vaca)
• 90 % mistura de soro + 10 % leite de vaca
• 90 % mistura de soro + 10 % leite de ovelha
• Aditivos:
Matrizes salgadas
- 0.8% Sal
- 0.8% Sal + 0.35% Xantano
- 0.8% Sal+ 0.05% alho + 0.05% ervas
aromáticas
Matrizes doces
• 5% açúcar
• 10% doce de morango
• 5% açúcar + 3% aloe Vera
• 5% açúcar+ 4.7% chocolate + 4.5% fibra de chocolate
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Viabilidade com aditivos doces
Lactobacillus paracasei ssp. paracasei
Probióticos
Desafios
funcionais
Log (cfu/g)
Desafios
Tecnológicos
9.5
9.0
8.5
8.0
7.5
0
Desafios em
segurança
Tendências
futuras
4
8
12
Time (d)
16
20
i) Simples (x);
ii) 5% açúcar (
)
iii) 10% doce de morango (
);
);
iv) 5% açúcar + 3% aloe vera (
v) 5% açúcar + 4.7% chocolate
+ 4.5% fibra de chocolate (
)
- Perfil de viabilidade de L. paracasei semelhante em todas
as matrizes => número de células mais elevado na matriz
com chocolate => potential efeito prebiótico de fibra de
chocolate
- viabilidade de L. paracasei estatisticamente afectada por
tempo de armazenagem e presença de aditivos
Madureira, A. R., Soares, J. C., Gomes, A. M., Pintado, M. E. Freitas, A. C. &
Malcata, F. X. (2008). Dairy Science Technology (aceite para publicação)
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Microrganismos probióticos:
Novos vectores alimentares
Probióticos
Desafios
Tecnológicos
Desafios
funcionais
VECTORES ALIMENTARES NÃO
LACTEOS
Desafios em
segurança
Tendências
futuras
Inácio, J., Franco, M. I., Gomes, A. M. P.,. & Malcata, F.X. (2008). International Probiotic
Conference (comunicação oral)
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Microrganismos probióticos:
Matriz de aveia
Probióticos
Desafios
funcionais
Desafios em
segurança
Fermentation time (h)
Desafios
Tecnológicos
6
5
Tempo de
fermentação
4
3
2
1
0
C - oat matrix
Br
NC - oat matrix
Bu
Ki
Bo
Tendências
futuras
9
8
Viabilidade
log (CFU/ml)
7
6
5
4
3
2
1
0
Innoculum
C - oat matrix
Br
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Bu
Ki
NC - oat matrix
Bo
Ciência 2008 −2 de Julho
Microrganismos probióticos:
Sobrevivência no tracto gastrointestinal
Probióticos
Desafios
Tecnológicos
Desafios
funcionais
PERFORMANCE DE PROBIÓTICOS
SOB CONDIÇÕES
GASTRINTESTINAIS SIMULADAS
Desafios em
segurança
Tendências
futuras
Madureira, A. R., Pereira, C. I., Truszkowska, K., Gomes, A. M., Pintado, M. E. & Malcata, F.
X. (2005). International Dairy Journal 15(6-9): 921-927.
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Ciência 2008 −2 de Julho
Simulação de condições de GI
Estirpes probióticas
Probióticos
e Pepsina
Desafios
Tecnológicos
Desafios
funcionais
Desafios em
segurança
Tendências
futuras
• Bifidobacterium animalis BLC-1
• Lactobacillus acidophilus LAC-1
• Lactobacillus paracasei ssp.
paracasei LCS-1
• B. animalis Bo
• L. acidophilus Ki
• L. brevis LMG 6906
• B. animalis Bb-12
Estômago
Intestino
Adição de
Sais biliares
Madureira, A. R., Pereira, C. I., Truszkowska, K., Gomes,
A. M., Pintado, M. E. & Malcata, F. X. (2005).
International Dairy Journal 15(6-9): 921-927.
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Lactobacillus acidophilus Lac1
i.
Desafios
funcionais
Desafios em
segurança
Log (cfu mL-1)
Desafios
Tecnológicos
Nº Viable
célulasnumbers
viáveis
Probióticos
Tendências
futuras
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
SB
BS
BS
SB
0
30
60
90
120
150
Time (min)
Tempo
(min)
180
210
240
(
) - controlo (sem SG* ou SB)
(
) - 60 min SG + 60 min SB
(
) - 120 min SG + 120 min SB
* Suco gástrico
Madureira et al., (2005). International Dairy Journal 15(6-9): 921-927.
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Probióticos
Desafios
Tecnológicos
Desafios
funcionais
Desafios em
segurança
Tendências
futuras
Strain
Lactobacillus
acidophilus LAC-1
Lactobacillus
acidophilus Ki
Lactobacillus paracasei
ssp. paracasei LCS-1
Bifidobacterium animalis
BLC-1
Bifidobacterium animalis
Bo
Bifidobacterium animalis
Bb-12
Lactobacillus brevis
LMG 6906
Death rates (log cfu g-1 min-1)
GJ
GJ/BS
-0.0017±0.0013
0.0642±0.0908
-0.0010±0.0010
0.0514±0.0741
0.0293±
±0.0006
0.1873±
±0.0351
-0.0030±0.0010
0.2221±
±0.0004
0.0009±0.0010
0.0061±0.0040
0.0122±0.0019
0.0119±0.0004
-0.0003±0.0027
0.0111±0.0050
Madureira et al., (2005). International Dairy Journal 15(6-9): 921-927.
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Ciência 2008 −2 de Julho
Microrganismos probióticos:
Produção de ácido linoleico conjugado
Probióticos
Desafios
Tecnológicos
Desafios
funcionais
PAPEL DE
Desafios em
segurança
PROBIÓTICOS NA
Tendências
futuras
PRODUÇÃO DE CLA
0
Rodríguez-Alcalá, L., Braga, T., Silva, J., Teixeira, P., Gomes, A.M., Malcata, F.X., Fontecha,
J. (2008) International Journal of Food Microbiology (submetido)
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Ciência 2008 −2 de Julho
Ácido linoleico conjugado
O
Ácido cis-9, cis-12 linoleico
Probióticos
15
17
Desafios
Tecnológicos
Desafios
funcionais
Desafios em
segurança
13
12
10
H3C
9
13
13
12
10
9
Processo
de
conjugação
5
7
12
10
3
C
OH
9
t10,c12 CLA
c9,t11 CLA
Tendências
futuras
CLA
Efeitos fisiológicos
- Controlo do peso corporal:
aumento de
massa magra/massa gorda
- Actividade antioxidante
- Redução de LDL/HDL
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Ciência 2008 −2 de Julho
Ácido linoleico conjugado
Count: LA
Contagens:
LA
Count: Safflower
Contagens:
Safflower
10
10
9
9
8
8
7
7
6
6
0h
5
4
0h
5
24h
48h
4
3
3
2
2
1
1
0
0
LA
C
LA
Bb12
C
LA
BLC
C
Lac1
LA
C
L lactis
LA
C
Cr
L plantarum
C
Bb12
Cr
C
BLC
Cr
C
Lac1
Cr
C
L lactis
Cr
C
L plantarum
mg CLA/ mL Leite magro
Estirpe
Safflower
Ácido linoleico
L. lactis
23,053
45,513
B. animalis BLC
18,413
48,246
B. animalis Bb12
22,290
42,207
L. acidophilus Lac1
4,683
40,936
L. plantarum
21,527
51,678
Rodriguez-Alcalá L. et al. (2008) International Journal of Food Microbiology (submetido)
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Ciência 2008 −2 de Julho
Probióticos
Microrganismos probióticos:
Estirpes isoladas de produtos
tradicionais
Desafios
Tecnológicos
Desafios
funcionais
PAPEL DE ENTEROCOCOS ISOLADOS DE
QUEIJO TERRINCHO
Desafios em
segurança
Tendências
futuras
Pimentel, L. L.; Semedo, T.; Pintado, M. M. E.; Tenreiro, R.; Crespo, M.T.B. & Malcata, F. X.
Journal of Food Protection 70, 2161-2167.
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Ciência 2008 −2 de Julho
Triagem de enterococos
Selecção de
estirpes
• Identificação
• Susceptibilidade a
antibióticos (12 ab)
• Factores de
virulência (10
genes)
• Resistência aos sais
biliares e baixo pH
• Adesão a células
Caco-2
73 isolados
Propriedades
tecnológicas
Sobrevivência
no tracto
gastrointestinal
• Crescimento em
meio de
fermentação
(GEM)
• Estabilidade em leite
e iogurte
4 estirpes
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• E. faecium 32
• E. durans 37
• 4 voluntários
• iogurte 5 d
• amostras fecais
2 estirpes
Ciência 2008 −2 de Julho
Selecção de estirpes
Distribuição de espécies
3%
E. casseliflavus
48%
37%
E. durans
E. faecalis
E. faecium
E. gallinarum
11%
1%
Susceptibilidade antibióticos e factores
de virulência
•6 em 73 isolados com resistência a 2
antibióticos
•2 isolados (E. faecalis) com genes de
virulência (gelE)
Adesão a células Caco-2
Percentagem de adesão semelhante para
ambas as estirpes (13%)
50,00%
45,00%
46,58%
40,00%
35,00%
30,00%
25,00%
20,00%
15,00%
12,66%
12,68%
E. durans 37
E. faecium 32
5,27%
10,00%
5,00%
Tolerância a sais biliares e baixo pH
• Variável entre enterococos
• E. faecium 32 e E. durans 37
tolerantes a pH 1.5 e 0.3% sais
biliares
0,00%
Control +
Control -
Pimentel, L. L.; Semedo, T.; Pintado, M. M. E.; Tenreiro, R.; Crespo, M.T.B. &
Malcata, F. X. Journal of Food Protection 70, 2161-2167.
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Ciência 2008 −2 de Julho
Propriedades tecnológicas
Crescimento em GEM
(meio de cultura de
baixo custo)
comparável a MRS
Probióticos
Desafios
Tecnológicos
Boa estabilidade em
iogurte e leite a 4 ºC
.
Desafios em
segurança
.
Desafios
funcionais
10,0
log(cfu/ml)
Tendências
futuras
9,0
8,5
8,0
MRS
7,5
GEM
lo g ( c f u / m l )
9,5
7,0
0
12
24
36
48
60
tempo (h)
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8,0
7,5
7,0
6,5
6,0
5,5
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
E.d 37
E.fcm 32
0
2
4
6
8
10
12
14
16
tempo (dias)
Ciência 2008 −2 de Julho
Propriedades tecnológicas
Crescimento em fermentador
Probióticos
Desafios
Tecnológicos
Desafios
funcionais
E. faecium 32
E. durans 37
Desafios em
segurança
Tendências
futuras
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Ciência 2008 −2 de Julho
Sobrevivênvia no tracto gastrointestinal
in vivo
Amostras fecais tratadas em
câmara de anaerobiose
Probióticos
Desafios
Tecnológicos
Desafios
funcionais
300 g/d
Desafios em
segurança
(107 cfu/ml)
Tendências
futuras
Ingestão
de iogurte
0
F
Cultura em meios selectivos
Follow-up
5
10 d
F
F
F = amostra fecal
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2 morfootipos
Detecção com RAPD- PCR
Ciência 2008 −2 de Julho
Sobrevivênvia no tracto gastrointestinal
in vivo
• Nenhuma estirpe detectada nas fezes, antes do período de
ingestão (linha de base)
Desafios
Tecnológicos • Ambas as estirpes detectadas durante período de ingestão,
em todos os voluntários
Desafios
funcionais
• E. faecium 32 apresenta número de células viáveis 10 vezes
superiores aos de E. durans 37
Desafios em
Probióticos
segurança
Linha de base
Tendências
futuras
Período experimental
37 32
37 32
0
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Ciência 2008 −2 de Julho
Conclusão
• Selecção rigorosa de estirpes em termos de viabilidade,
colonização e adesão => necessário estabelecer padrões
Desafios
de comunicação de função
Tecnológicos
Probióticos
Desafios
funcionais
Desafios em
segurança
Tendências
futuras
• Importância dos prebióticos como factor bifidogénico e
papel complementar/potenciador do efeito probiótico
• Identificação de estirpes resistentes a factores
ambientais e novos/melhorados veículos alimentares
para assegurar a sobrevivência e viabilidade =>
fortalecer a sua importância na dieta alimentar
0•
Aplicação da genômica e proteómica para identificação
mecanística da funcionalidade probiótica e prebiótica=>
ciclo de inovação com desenvolvimento de novos
alimentos funcionais => trinómio ciência, indústria,
consumidor
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Ciência 2008 −2 de Julho
Agradecimentos
Probióticos
Desafios
Tecnológicos
Desafios
funcionais
Desafios em
segurança
Tendências
futuras
0
Equipa
Xavier Malcata (Coord)
Ana Raquel Madureira
Ligia Pimentel
Teresa Braga
Manuela Pintado
Joana Inácio
Isabel Franco
Ana Isabel Pintado
ITQB-IBET
CSIC (Espanha)
Teresa Crespo
Luis Rodriguez-Alcalá
Javier Fontecha
ICAT
Rogério Tenreiro
VTT (Finlândia)
Maria Saarela
REQUIMTE Isabel Ferreira
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Ciência 2008 −2 de Julho
Probióticos
Desafios
Tecnológicos
Desafios
funcionais
Muito obrigado !
Desafios em
segurança
Tendências
futuras
0
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