Subprograma de Genética de Populações
SEÇÃO 16
16.8. SUBPROGRAMA DE GENÉTICA DE POPULAÇÕES
Subprograma de Genética de Populações
Sumário
16.8. Subprograma de genética de populações ............................................................................................................................... 1 16.8.1 Apresentação/objetivos .............................................................................................................................................................. 1 16.8.2. Histórico ............................................................................................................................................................................................... 2 16.8.3. Atividades desenvolvidas .......................................................................................................................................................... 4 16.8.4. Considerações Finais .................................................................................................................................................................... 7 16.6.5. Ações subsequentes..................................................................................................................................................................... 7 Subprograma de Genética de Populações
Lista de Quadros
QUADRO 16.8.1 - Número de amostras coletadas, por espécie, para análise genética.................................................. 5 QUADRO 16.8.2 - Dados relativos à espécie Brachyplatystoma platynemum (babão). N= número de
amostras disponíveis, DNA = número de amostras com DNA extraído, PCR = número de
amostras com o gene D-loop já amplificado, SEQUÊNCIA = número de amostras com o gene Dloop já sequenciado. .......................................................................................................................................................................... 7 Subprograma de Genética de Populações
16.8. SUBPROGRAMA DE GENÉTICA DE POPULAÇÕES
16.8.1 Apresentação/objetivos
A “história genética” das populações é o resultado da dispersão dos peixes e reflete a conexão direta
entre rios e bacias, cuja história, por sua vez, reflete o delineamento geológico da região (Lunderbeg,
1993; Berminghan; Martin, 1998). Nesse cenário, os peixes migradores, como os grandes bagres e
outros representantes da ictiofauna do rio Madeira, são fundamentais para a realização do presente
estudo, pois são capazes de refletir a história biogeográfica recente dos maiores rios da Amazônia e da
América do Sul, contribuindo para formar um quadro da evolução da p
aisagem do Neotrópico (Sivasundar et al., 2001). Além disso, não se sabe se os grandes bagres
migradores têm populações fechadas ou abertas e se retornam sempre aos afluentes que nasceram
para se reproduzir.
O isolamento geográfico e reprodutivo decorrente de atividades antrópicas, como barramentos
artificiais, pode comprometer populações ou impedir o intercâmbio de material gênico das espécies.
A elucidação de estoques genéticos naturais visando à estimativa e caracterização da variabilidade
genética das populações orienta também a implantação de estratégias de manejo dos recursos
pesqueiros. Armazenar informações sobre as condições atuais dos estoques contribui com informação
sobre os processos de especiação e substituição de espécies no ambiente.
A futura caracterização dos estoques e a detecção de suas origens monitoram uma possível invasão
de novas áreas e perdas de diversidade genética, ou seja, monitoram a biodiversidade e subsidiam
decisões sobre a operação do Sistema de Transposição - STP, e sobre a necessidade, ou não, da
instalação de um Centro de Reprodução da Ictiofauna (em conjunto com os resultados dos
subprogramas de Ecologia e Biologia, Inventário Taxonômico, Ictioplâncton e Monitoramento Social
da Atividade Pesqueira), como solicitado na condicionante 2.6 da Licença Prévia nº 251/2007.
O subprograma de Genética de Populações fornecerá dados para o manejo da ictiofauna nas áreas de
influência do empreendimento e poderá elucidar questões sobre as migrações dos grandes bagres na
bacia do rio Madeira, repercutindo em diversos setores. Do ponto de vista puramente científico,
obtem-se o histórico da distribuição das espécies e os estoques explorados, já que tratam-se de peixes
comercialmente importantes.
De acordo com o exposto no Projeto Básico Ambiental - PBA (Madeira Energia, 2009), como objetivo
principal deste subprograma destaca-se a coleta de amostras de tecido das espécies inventariadas
pelos subprogramas de Ecologia e Biologia, Inventário Taxonômico e Resgate de Peixes em todo o
trecho de estudo, montando-se um banco de dados gênico para futuros estudos sobre a distribuição
das espécies e seus estoques na bacia. Além disso, será organizado um cronograma de estudo
genético das populações das espécies-alvo migradoras com foco nos grandes bagres no que se refere
à variabilidade genética das populações. Essas ações irão e orientar os subprogramas do Programa de
Conservação e Resgate da Ictiofauna.
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Subprograma de Genética de Populações
Dentre os objetivos específicos destacam-se:
• Gerar resultados sobre as distâncias genéticas entre as amostras de cada espécie em questão,
obtidas ao longo dos pontos de coleta, para subsidiar decisões no STP e o eventual centro de
reprodução de peixes;
• Determinar se as populações dos grandes bagres são diferenciadas no Madeira, em relação aos
demais rios da bacia amazônica (comportamento de homing).
16.8.2. Histórico
Após análise do PBA pelo IBAMA, este subprograma foi aprovado com o estabelecimento de
Condicionantes. A condicionante 2.17, que trata do Programa de Conservação da Ictiofaunasubprograma de Genética de Populações, foi apresentada na forma dos itens de “a” a “c”, os quais são
relacionados abaixo junto das ações relevantes do presente subprograma.
A seguir são apresentados os fatos relevantes que ocorreram no âmbito deste subprograma.
No item “a” foi solicitada a avaliação da distância genética de espécies de interesse acima e abaixo do
obstáculo geográfico (cachoeira do Teotônio), visando a determinar se elas pertencem a uma mesma
população, além da definição das espécies a serem estudadas.
Durante o primeiro ano, através dos subprogramas de Ecologia e Biologia e Monitoramento da
Atividade Pesqueira, foram coletadas e armazenadas no Laboratório de Ictiologia e Pesca -LIP da
Universidade Federal de Rondônia -UNIR, 430 amostras que possibilitará o cumprimento do item “a”
da condicionante. Nesse âmbito, as espécies escolhidas para a realização dos estudos foram
asespécies-alvo dos grandes bagres, ou seja, as espécies que possuem importância econômica na
região de estudos.
A SAE informa que as análises genéticas do presente estudo estão sendo desenvolvidas no
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes, Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências,
Universidade Estadual Paulista – UNESP, campus de Botucatu e no Laboratório Temático de Biologia
Molecular - LTBM, Coordenação de Pesquisas em Biologia Aquática -CPBA, do Instituto Nacional de
Pesquisas da Amazônia – INPA.
Durante o Seminário do Meio Biótico, realizado entre 23 e 27 de agosto de 2010 com a participação do
IBAMA, ficou acordado que a SAE e ESBR farão as análises genéticas da dourada (Brachyplatystoma
rousseauxii) e que o estudo das demais espécies de bagres alvo filhote (B. filamentosum), babão (B.
platynemum) e piramutaba (B. vaillantii) poderão ser acordadas entre as empresas, no sentido de
otimizar o esforço para análises genéticas.
No referido seminário ficou acertado também que as empresas apresentariam para o IBAMA uma
listagem de espécies de peixes de escamas migratórios (Characiformes) definidas para análises
genéticas, com o intuito de se verificar se há algum grau de isolamento genético das populações
locais a montante e jusante do trecho de corredeiras do rio Madeira. Cumpre ressaltar que a SAE já
antecipou a coleta de amostras para três espécies: Prochilodus nigricans (curimatã), Semaprochilodus
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insignis (jaraqui) e Potamorhina latior (branquinha), por serem espécies migradoras e de importância
na pesca.
No item “b” solicitou a avaliação do comportamento de homing, para as espécies B. rousseauxii, B.
vailanti e B. platynema.
Dada as suas distribuições geográficas – que abrangem o território político de mais de que cinco
países amazônicos – algumas espécies de grandes bagres, incluindo a dourada (B. rousseauxii), a
piramutaba (B. vaillantii) e o babão (B. platynemum), são capturadas, ao longo de todo o sistema
Estuário-Solimões-Amazonas. Sua pesca é realizada pela frota comercial e artesanal desde Belém, no
estuário do rio Amazonas, até Pucallpa, no Peru, a aproximadamente 4500km a oeste, próximo aos
Andes Peruanos.
As espécies não são geneticamente homogêneas, mas estruturadas em grupos de indivíduos
geneticamente semelhantes, estando o seu grau de isolamento diretamente relacionado à dispersão
de indivíduos entre esses grupos. Os mecanismos que promovem o isolamento das populações
incluem separação geográfica, a capacidade de dispersão restrita dos indivíduos e o comportamento
de homing ou filopatria (retorno ao local de nascimento para reprodução). Uma troca limitada de
indivíduos reprodutores entre os grupos resulta em uma diferenciação genética entre eles. O padrão
de distribuição da variação genética dentro e entre populações é referido como “estrutura genética
populacional” de uma espécie e a identificação desta estrutura e diversos outros parâmetros é
possível mediante a utilização de técnicas morfológicas e moleculares.
Nesse âmbito, a hipótese de migração para a dourada (B. rousseauxii) foi pioneiramente abordada e
verificada sob o ponto de vista genético a partir de 911 pb da região controle do DNA mitocondrial de
indivíduos coletados em três localidades no eixo Estuário-Amazonas-Solimões - EAS: Belém (área de
criação), Manaus (área de alimentação) e Tabatinga, no alto Solimões (proximidades da área de
reprodução) (Batista, 2001; Batista e Alves-Gomes, 2006). Dois resultados dessa abordagem merecem
ser mencionados: (1) não foi encontrada segregação geográfica entre os haplótipos encontrados nos
três locais – esse resultado corrobora, a princípio, a hipótese de que um único estoque na Amazônia
migra desde o estuário amazônico até as cabeceiras para desovar; (2) a variabilidade genética diminui
no sentido Leste–Oeste (do estuário para as cabeceiras) – a este cenário sugere que a menor
variabilidade genética encontrada em Tabatinga/Letícia pode ser o resultado da migração seletiva de
populações para afluentes específicos do rio Solimões (Batista, 2001; Batista e Alves-Gomes, 2006).
Assim, há indicativos de que pode haver homing para as espécies de grandes bagres, porém somente
com a análise de amostras oriundas dos principais tributários onde essas espécies se reproduzem
(como o rio Madeira) é que será possível corroborar ou refutar essa hipótese.
O item “c” da condicionante solicita que o subprograma de Genética de Populações deve discutir em
termos de método, resultado e custos a diferença a ser obtida entre as metodologias conhecidas de
microsatélite e D-Loop.
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Subprograma de Genética de Populações
Conforme o registro da reunião realizada em 07 de novembro de 2008 (Ofício de nº 133/2010 –
COHID/CGENE/DILIC/IBAMA), (Anexo 16.11) e a discussão da reunião de 13 de agosto de 2010, cuja
memória é apresentada no Anexo 16.9, o IBAMA esclarece que caso seja utilizada a metodologia do
D-Loop esta condicionante deverá ser retirada sem necessidade de justificativa.
De acordo com o resumo do projeto e nos objetivos específicos do plano de trabalho do
Departamento de Morfologia do Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista - UNESP
Campus de Botucatu, onde os trabalhos laboratoriais estão sendo realizados, é demonstrada a
utilização da metodologia do D-loop.
Para a elaboração deste relatório que diz respeito a situação atual do andamento deste subprograma
foram compiladas informações nos seguintes documentos:
• Ata de Reunião SAE-IBAMA realizada em 13 de agosto de 2010(Anexo 16.9);
• Oficio IBAMA 133/2010 (Anexo 16.11) e
• Projeto Estudo do Impacto da construção da barragem de Santo Antônio nas populações naturais de
grandes bagres e Characiformes migradores do rio Madeira (Anexo 16.17)
• Relatório Preliminar 1 do Estudo do impacto da construção da barragem de Santo Antônio nas
populações naturais de grandes bagres e Characiformes migradores do rio Madeira (Anexo 16.18)
16.8.3. Atividades desenvolvidas
16.8.3.1. Coleta e Análise dos Dados
16.8.3.1.1. Coleta das amostras, extração e quantificação do DNA
Para as análises genéticas, estão sendo coletadas amostras de tecido de três espécies de grandes
bagres (Siluriformes): Brachyplatystoma rousseauxii (dourada), Brachyplatystoma vaillantii (piramutaba)
e Brachyplatystoma platynemum (babão); e de três espécies de peixes de escamas (Characiformes):
Prochilodus nigricans (curimatã), Semaprochilodus insignis (jaraqui) e Potamorhina latior (branquinha).
As espécies escolhidas são representativas das espécies de couro (bagres) e escamas (demais peixes)
que utilizam o rio Madeira como habitat de ocupação e reprodução. Foram amostrados sítios acima e
abaixo da área de construção da UHE Santo Antônio.
No Quadro 16.8.1, a seguir, são apresentados os dados sobre a localização e número de amostras
coletadas por espécie.
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QUADRO 16.8.1 - NÚMERO DE AMOSTRAS COLETADAS, POR ESPÉCIE, PARA ANÁLISE GENÉTICA
ESPÉCIE
NOME POPULAR
Nº DE AMOSTRAS
Brachyplatystoma filamentosum
B. platynemum
B. rosseauxi
B. vaillantii
Potamorhina latior
Prochilodus nigricans
Semaprochilodus insignis
Filhote/piraiba
Babão
Dourada
Piramutaba
Branquinha
Curimata
Jaraqui
99
158
122
56
89
65
22
Para o estudo da existência ou não de homing entre os bagres serão também obtidas amostras de
exemplares em outros pontos de coleta na bacia Amazônia (rios Purus, Juruá, Solimões, Branco e
Amazonas).
As amostras serão coletadas por pesquisadores ou obtidas diretamente a partir de pescadores
artesanais. Os tecidos musculares dos espécimes será preservado em etanol 95% e mantido
refrigerado até ser enviado ao laboratório, onde serão armazenados em freezer comum.
16.8.3.1.2. Extração, amplificação e sequenciamento de DNA
Segundo Aljanabi e Martinez (1997), o DNA total será extraído a partir de amostras de tecidos
preservados em etanol 96% mais EDTA (Sambrook et et al., 1989) ou outro método alternativo como o
uso de kits comerciais (Qiagen). O DNA total será preservado em água ultra pura autoclavada e
quantificado por espectrofotometria para o ajustamento de concentração.
Na reação de amplificação da região controle do DNA mitocondrial das espécies de bagres
migradores, serão utilizados o primer forward Cytb P-L (5´ CAC CTG AATCGG AGG CAT GCC CGT 3´) e o
primer reverso DLR1 (5` - GGA TAC TTG CATGTA TAA ATT GG -3´) (Batista, 2009). Para o estudo de
Characiformes. serão utilizados os primers F-TTF (5’- GCC TAA GAG CAT CGG TCT TGT AA -3’) e F-12R
(5’- GTC AGG ACC ATG CCT TTG TG -3’) (Sivasundar et al., 2001). Serão obtidos fragmentos em torno de
1200pb, contendo toda a região controle. A amplificação do fragmento será realizada em 25uL de
volume final, com os seguintes reagentes e respectivas concentrações finais: Tampão 1X, 0,2mM de
DNTp (Sinapse), 0,2μM de cada primer (IDT), 0,04U/μL da enzima Taq DNA polimerase (Promega) e de
0,4 a 4,0ng/uL do DNA genômico. A reação será realizada em termociclador (Mastercycle thermocycler
Eppendorf), programado para realizar 30 ciclos. O tamanho e a qualidade do produto amplificado
serão verificados em gel de agarose 1 % com marcador molecular de peso conhecido de 1kb. O
produto de PCR será purificado como kit comercial GFX (GE Healthcare) de acordo com protocolo
estabelecido pelo fabricante, ou com o sistema enzimático EXOSAP e usados como substrato para o
sequenciamento de DNA.
O sequenciamento nucleotídico seguirá o protocolo acompanhante do kit de sequenciamento Big
Dye terminatorv 3.1 (Perkin Elmer, Applied Biosystems). Duas reações de sequenciamento serão
realizadas com o produto de PCR purificado de cada indivíduo pertencente às seis espécies de peixe,
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Subprograma de Genética de Populações
sendo cada uma no sentido 5’- 3’ das fitas L e H. Em uma das reações será utilizado o primer foward e
na outra reação, o primer reverso utilizado previamente na reação de amplificação. A reação será
realizada em um volume final de 10 uL, utilizando entre 100 a 150 ng do produto de PCR purificado, o
pré-mix do kit de sequenciamento (4 uL) e um dos primers (F ou R). Após a reação em termociclador
(em 30 ciclos, sendo cada um 95ºC, por 15 s, 50ºC por 30 s e 60ºC por1 min e 20 s), o produto será
submetido a uma precipitação com Isopropanol para a eliminação de primers, dNTPs e ddNTPs não
incorporados durante a reação de sequenciamento. A eletroinjeção e leitura dos fragmentos serão
realizadas em analisador automático de DNA ABI PRISM® 3130 automated Genetic Analyzer (Perkin
Elmer, Applied Biosystems) nas condições de injeção e corrida recomendadas pelo fabricante. A
sequência de DNA final será resultante da compilação das duas sequências obtidas.
16.8.3.1.3. Análise das sequências de D-Loop
As sequências nucleotídicas serão conferidas, editadas e compiladas com auxílio dos programas
CHROMAS 2.13 (Technelysium Pty Ltd) e BIOEDIT 7.0.5 (Hall, 1999) e alinhadas ao programa CLUSTAL
W 1.4 (Thompson et al., 1994) implementado no programa BIOEDIT 7.0.5 (Hall, 1999). Para cada
espécie será construída uma matriz final contendo em torno de 1000pb (pares de bases) de cada
individuo amostrado.
Serão estimados os seguintes índices de diversidade molecular: número de haplótipos (H), número de
haplótipos únicos (Hu, haplótipo que ocorre somente em um indivíduo), número total de mutações
(ETA), número de sítios polimórficos (S), diversidade haplotípica (HD, probabilidade de cada duas
sequências serem diferentes em uma população), média das diferenças nucleotídicas par a par (K) e
diversidade nucleotídica (Pi indica o número médio de diferenças nucleotídicas por sítio entre duas
sequênciasde DNA).
Para verificar a existência de populações geneticamente diferenciadas para cada espécie e a avaliação
do grau de significância da variabilidade genética entre e dentro das localidades amostradas, será
utilizada a análise de variância molecular (AMOVA) (Excoffier et al.,1992), implementada no programa
ARLEQUIN 3.11 (Excoffier et al., 2005). As estimativas de fluxo gênico (taxas de migração), no que se
refere ao número de migrantes por geração (Nm), serão estimadas entre as populações de forma
linear, a partir dos valores de FST, com o auxílio do programa ARLEQUIN 3.11 (Excoffier et al.,2005),
onde Nm= Y=(1- FST)/(2 FST).
16.8.3.3. Resultados/etapas cumpridas/produtos entregues
Como etapa cumprida, tem-se a coleta do primeiro grupo de amostras no trecho de estudos do rio
Madeira e amostras coletadas em outros locais da Amazônia Legal com vistas à verificação da
existência da ocorrência de homing. Os estudos estão sendo desenvolvidos pelo Laboratório de
biologia e Genética de Peixes da Unesp-Botucatu-SP e Laboratório Temático de Biologia Molecular do
INPA.
As análises genéticas estão sendo feitas através do sequenciamento do gene mitocondrial D-loop e
foram iniciadas pela espécie B. platynemum (babão). Neste sentido, foram extraídas amostras de DNA
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total de 223 exemplares, nas quais foram feitas reações de PCR para amplificação do gene D-loop de
130 exemplares sendo obtidas sequências de DNA de 121 exemplares (Quadro 16.8.2).
QUADRO 16.8.2 - DADOS RELATIVOS À ESPÉCIE BRACHYPLATYSTOMA PLATYNEMUM (BABÃO). N= NÚMERO DE
AMOSTRAS DISPONÍVEIS, DNA = NÚMERO DE AMOSTRAS COM DNA EXTRAÍDO, PCR = NÚMERO DE AMOSTRAS
COM O GENE D-LOOP JÁ AMPLIFICADO, SEQUÊNCIA = NÚMERO DE AMOSTRAS COM O GENE D-LOOP JÁ
SEQUENCIADO.
LOCALIDADE
N
DNA
PCR
SEQUÊNCIAS
Belém
Iquitos, Peru
Jusante de Teotônio
Teotônio
Montante da
Cachoeira de Jirau
Rio Madeira
Manaus
Santarém
Totais
11
30
17
33
11
30
16
30
11
30
10
16
2
30
10
16
18
16
9
9
40
40
23
249
32
28
23
223
18
18
7
130
18
18
7
121
Como etapa cumprida, tem-se a finalização do primeiro grupo de amostras no trecho de estudos do
rio Madeira. Na segunda etapa de obtenção dos dados, serão realizadas coletas nas seguintes
localidades: rio Amazonas em Belém (PA), rio Branco (RO), rio Purus (AC), rio Juruá (AC), rio Solimões
(AM).
16.8.4. Considerações Finais
Até o momento foi coletado e deu-se inicio a análise do primeiro grupo de amostras para subsidiar as
respostas aos objetivos do presente programa. A investigação sobre as distâncias genéticas entre as
espécies em questão e a determinação se as populações dos grandes bagres possuem
comportamento de homing serão realizadas a posteriori.
16.6.5. Ações subsequentes
O cronograma contendo as ações a serem realizadas é apresentado no TOMO III - Seção 1 deste
documento.
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