UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PÓS GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS E BIOLOGIA CELULAR
ANÁLISE DE ANEUPLOIDIAS DOS CROMOSSOMOS 17 E 22 E DE DELEÇÕES
DO GENE TP53 EM METÁSTASES CEREBRAIS DE MAMA
DOUGLAS SERRA VASCONCELOS
BELÉM
2009
ii
DOUGLAS SERRA VASCONCELOS
ANÁLISE DE ANEUPLOIDIAS DOS CROMOSSOMOS 17 E 22 E DE DELEÇÕES
DO GENE TP53 EM METÁSTASES CEREBRAIS DE MAMA
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de PósGraduação em Neurociências e Biologia Celular, Instituto de
Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará, como
requisito para a obtenção do título de Mestre.
Área de Concentração: Biologia Celular
Orientador: Prof. Dr. Edivaldo H. C. de Oliveira
BELÉM
2009
iii
DOUGLAS SERRA VASCONCELOS
ANÁLISE DE ANEUPLOIDIAS DOS CROMOSSOMOS 17 E 22 E DE DELEÇÕES
DO GENE TP53 EM METÁSTASES CEREBRAIS DE MAMA
Dissertação apresentada como requisito para a obtenção do grau de Mestre em
Neurociências e Biologia celular da Universidade Federal do Pará. Área de Concentração:
Biologia celular.
Data de aprovação:___/___/___
Banca Examinadora:
_____________________________ - Orientador
Prof. Dr. Edivaldo H. C. de Oliveira - UFPA
_____________________________
Profa. Dra. Cleusa Y. Nagamachi - UFPA
_____________________________
Profa. Dra. Margarida M. C. de Lima - UFPA
_____________________________
Prof. Dr. Nilson Praia Anselmo - UFPA
iv
À Equipe “de Câncer” do Laboratório de
Citogenética, pelo apoio e confiança.
v
AGRADECIMENTOS
Agradeço sinceramente ao grupo do laboratório de Citogenética da UFPA,
principalmente ao Prof. Dr. Edivaldo de Oliveira, que teve uma paciência imensa em
orientar esta dissertação e de modo especial ao Fábio da Silva e a Luciana Quintana por
terem dado uma enorme contribuição na elaboração e análise dos resultados. Agradeço
ainda aos Professores Doutores Júlio e Cleusa por terem apoiado a execução deste projeto,
com orientações e comentários importantes. Ao grupo de Neurocirurgia do Hospital Ofir
Loyola, onde este trabalho foi concebido e onde as amostras foram colhidas. Aos pacientes
que aceitaram participar da pesquisa espontaneamente. De modo especial, agradeço ao Dr.
Reginaldo Brito e ao Prof. Dr. Nilson Praia Anselmo,que iniciaram e incentivaram este
importante projeto. Agradeço a minha família, Andréa, Matheus, Caio, Rodrigo, Yan e a
pequena Beatriz, que suportaram as horas que tive que ficar ausente. Descupem! Ciência às
vezes exige isso de nós. Finalmente, agradeço a Deus por ter me dado esta oportunidade.
vi
RESUMO
As metástases de mama representam 10% dos tumores metastáticos para o cérebro. A via
de disseminação metastática para o cérebro em geral é hematogênica. Poucos são os
trabalhos publicados até o momento que enfatizam o perfil citogenético de metástases de
mama. Nesses, os principais rearranjos cromossômicos recorrentes envolvem os
cromossomos 17 e 22, sugerindo que essas aneuploidias possam estar relacionadas com um
maior poder de metastatização dos tumores primários. Dessa forma, com o objetivo de
verificar o comportamento desses dois cromossomos em metástases cerebrais de mama,
foram analisadas cinco amostras desse tipo tumoral através da aplicação de FISH
interfásico em dois experimentos distintos, com sondas dos cromossomos 17 (centrômero e
TP53) e com sondas do 22 (BCR, com a sonda de 9q11 como controle). Os experimentos
com o cromossomo 17 demonstraram um número significativo de núcleos com a deleção
do gene TP53, além da polissomia do cromossomo 17 como segundo evento mais
freqüente. Em relação ao cromossomo 22, o evento mais observado foi a perda de uma de
suas cópias. Deleções do TP53 estão relacionadas com um aumento da malignidade
tumoral, visto que esse gene está envolvido em várias vias do controle do ciclo celular. Da
mesma forma, a polissomia do cromossomo 17 também seria indicativa de um mau
prognóstico, já que esse rearranjo apresenta-se relacionado com aumento de expressão da
proteína HER-2, fato também associado a um mau prognóstico. Vários estudos relacionam
aneuploidias do cromossomo 22, principalmente a monossomia, como um passo importante
na gênese de neoplasias, provavelmente devido à inativação de genes supressores de tumor
situados nesse cromossomo, como o NF2. Esses indicativos de mau prognóstico concordam
com os dados de anamnese das pacientes, que tiveram metástases cerebrais após a
ressecção dos tumores primários de mama, e posteriormente apresentaram uma média de
aproximadamente 17 meses de sobrevida após a ressecção das metástases cerebrais, com
reincidência de metástases múltiplas. Assim, concluímos que a análise do comportamento
desses dois cromossomos em tumores de mama poderia ser um dado importante na
definição de seu poder de metastatização e malignidade.
vii
ABSTRACT
Breast cancer metastases represent 10% of metastatic tumors in brain. The metastatic
dissemination to the brain is in general hematogenic. Few reports concerning the
cytogenetic profile of breast metastases have been published so far. In these, the main
recurrent chromosomal rearrangements involve pairs 17 and 22, suggesting that primary
tumors with these aneuploidies could present a higher metastatic risk. Hence, the aim of
this report was the verification of the behavior of chromosomes 17 and 22 in five samples
of breast metastases in brain, applying interphasic FISH in two distinct experiments, using
probes of chromosome 17 (centromere and TP53) in one of them, and a probe of
chromosome 22 (BCR, and 9q11 as a control) in the other experiment. Chromosome 17
probes showed a highly significative proportion of nuclei with deletion of one or both
copies of gene TP53, and the polysomy of 17 as the second event more frequently
observed. In relation to chromosome 22, the most observed event was the loss of one of the
copies. TP53 deletion is related to an increase of the malignancy of tumors, because this
gene is involved in several paths of control of cell cycle. In the same way, polysomy of
chromosome 17 is also an indicative of a poor prognosis, because it causes a superexpression of protein HER-2, which is also related to poor prognosis. Several reports
related aneuploidy of chromosome 22, especially monossomy, as an important step in the
genesis of neoplasies, probably caused by the inactivation of tumor suppressor genes
situated in this chromosome, such as NF2. These indicators of poor prognosis agreed with
the anamnesis of the patients, with brain metastases after resection of breast primary tumor,
and a survival-rate of approximately 17 months after resection of brain metastases, with
recurrent multiple metastases afterwards. Hence, we conclude that the analysis of the
behavior of these two chromosomes in breast primary tumors could be used as an important
indicator of their metastatic power and malignancy.
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
APC
BRCA1
C-erbB2
CT
DNA
DPC4
FISH
GST
HER2/NEU
L-myc
NF2
P16
RB
RNA
RM
SNC
TP53
WT1
gene Adenomatosis Polyposis Coli
gene Breast Cancer 1, early onset
gene Erythroblastic Leukemia Viral Oncogene Homolog 2
Tomografia Computadorizada
Ácido Desoxirribonucleico (Desoxiribonucleic Acid)
Membro 4 da família de genes SMAD
Hibridização in situ fluorescente (Fluorescence in situ Hybridization)
Gene Supressor de Tumor
gene Receptor de Fator de Crescimento Epidermal Humano 2
gene v-Myc Myelocytomatosis Viral Oncogene Homolog 1
gene neurofibromina 2 (merlin)
gene inibidor da cinase ciclina-dependente 2A
gene Retinoblastoma
Ácido Ribonucleico (Ribonucleic Acid)
Ressonância Magnética
Sistema Nervoso Central
gene da protein tumoral p53
gene tumor de Wilms 1
ix
SUMÁRIO
I
INTRODUÇÃO
1
1
ASPECTOS GERAIS: CÂNCER E CÂNCER DE MAMA
1
2
METÁSTASES CEREBRAIS
2
3
METÁSTASES DE MAMA NO CÉREBRO
6
4
TRATAMENTO DAS METASTASES CEREBRAIS
7
5
ASPECTOS GENÉTICOS DO CÂNCER
8
5.1
Instabilidade Genômica
8
5.2
Oncogenes e Genes Supressores Tumorais
10
6
CITOGENÉTICA E CÂNCER
12
6.1
Considerações Gerais
12
6.2
Relação entre Rearranjos Cromossômicos e Genes Supressores Tumorais e
Proto-oncogenes
15
6.3
Dados Citogenéticos de Tumores de Mama
16
6.4
Aneuploidias em Metástases de Mama
17
7
OBJETIVOS
20
7.1
Objetivo Geral
20
7.2
Objetivos Específicos
20
II
MATERIAL E MÉTODOS
21
1
AMOSTRAS
21
2
COLETA DAS AMOSTRAS
22
3
OBTENÇÃO DE NÚCLEOS INTERFÁSICOS
22
4
PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS
23
5
PRÉ-HIBRIDIZAÇÃO
23
6
HIBRIDIZAÇÃO IN SITU
23
6.1
Sondas
23
6.2
Hibridização
24
6.3
Lavagem de Estringência
25
7
ANÁLISE E CAPTURA DAS IMAGENS
25
8
ANAMNESE
25
III
RESULTADOS
26
1
EXPERIMENTOS DE HIBRIDIZAÇÃO IN SITU
27
IV
DISCUSSÃO
31
1
SOBRE A IMPORTÂNCIA DOS RESULTADOS OBTIDOS A PARTIR
DA APLICAÇÃO DA TÉCNICA DE I-FISH: UMA VISÃO GLOBAL
31
2
OCORRÊNCIA DE ANEUPLOIDIAS DO CROMOSSOMO 17
33
3
DELEÇÕES DO GENE TP53
35
4.
ANEUPLOIDIAS DO CROMOSSOMO 22
37
x
5
VALOR PROGNÓSTICO DOS RESULTADOS OBTIDOS
38
V
CONCLUSÕES
41
VI
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
42
ANEXO I
51
ANEXO II
52
ANEXO III
54
ANEXO IV
55
1
I. INTRODUÇÃO
1. ASPECTOS GERAIS: CÂNCER E CÂNCER DE MAMA.
O termo câncer refere-se a uma variedade de patologias nas quais
crescimento e proliferação celular estão desregulados, levando à formação de uma
massa tumoral capaz de invadir, destruir tecidos vizinhos e disseminar-se para outros
órgãos do corpo por metástases. Embora fatores ambientais e dietéticos contribuam
para sua gênese, o câncer resulta de mudanças genéticas múltiplas em uma população
de células, as quais o tornam a doença genética mais freqüente (BORGES-OSÓRIO &
ROBSON, 2001; SNUSTAD & SIMMONS, 2001; NUSSBAUM et al., 2002).
Segundo a Organização Mundial de Saúde (WHO) ( KLEIHUES et al., 2002), mais de
11 milhões de pessoas são diagnosticadas com câncer todos os anos, sendo esta doença
responsável por 12,5% das mortes anuais no mundo. Estima-se que no Brasil mais de
120.000 pessoas morreram desta doença em 2002 (INCA, 2002). Considerando que o
total de tumores passíveis de prevenção pode alcançar mais de 50% de todos os casos
em países desenvolvidos e reconhecendo a importância da citogenética e da biologia
molecular no diagnóstico e prognóstico de pacientes com câncer, vários estudos dessa
natureza têm sido realizados visando a prevenção, detecção precoce e tratamento
dessas doenças malignas (CAI et al., 2001, DIAZ jr, 2005).
No caso das mulheres, o câncer de mama é a doença maligna mais comum e
a segunda causa de morte, atrás apenas do câncer de pulmão em mortes femininas nos
Estados Unidos (QIN, 2002). Estimou-se que aproximadamente 178.480 mulheres
foram diagnosticadas com câncer invasivo de mama em 2007, representando 12,67% da
população feminina americana e 26% de todos os casos de câncer nos Estados Unidos
(CHENG & HUNG, 2007).
2
Hitologicamente os carcinomas de mama podem ser divididos em ductal
(89%), lobular (5%), e forma combinada (6%), dependendo de seu sítio no tecido
mamário. Tanto o ductal como o lobular podem ser total ou parcialmente contidos na
membrana basal, nestes casos são denominados “in situ” e suas chances de cura
chegam a 100% somente com terapia local. (MARTINS, 2007).
Como em outras formas de carcinomas, o câncer de mama é caracterizado
pela instabilidade genômica, frequentemente envolvendo casos de aneuploidia dos
cromossomos 8, 17, 19, 20 e 22. Foram observadas também perdas gênicas, como a do
TP53 no braço curto do cromossomo 17, entre as alterações mais comumente vistas
(PROSSER et al., 1991; HEIM & MITELMAN, 1995; PANDIS et al., 1998;
LARRAMENDY et al., 2000; WATTERS et al., 2003). Além disso, PANDIS et al.
(1998) sugeriram que perdas dos cromossomos 17 e 22 em casos de câncer de mama
estão associados a uma maior predisposição a metástase.
2. METÁSTASES CEREBRAIS.
Conceitualmente, metástase representa um implante neoplásico sem
continuidade com o tumor primitivo. Todo
o
processo
metastático,
desde
o
desprendimento do estroma celular do órgão primariamente afetado, passagem pela
membrana basal do endotélio, transporte na corrente sanguínea, passagem pela
membrana endotelial do órgão alvo e colonização da nova área é complexo (REY,
1999). Devido à progressiva incapacidade neurológica causada pelas metástases
cerebrais e a falta de tratamento efetivo como nas metástases viscerais e ósseas, esta
doença ainda representa um grande desafio a ser vencido (CHENG & HUNG, 2007).
A incidência crescente de metástases para o cérebro se deve a vários fatores.
Um deles é o aumento da sobrevida de pacientes com câncer sistêmico, em
3
conseqüência da melhora das estratégias de seu tratamento clínico e ou cirúrgicos.
Outro fator importante é a maior capacidade de diagnóstico de tumores do SNC, devido
à disponibilidade de tomografia computadorizada (CT) e ressonância magnética (RM)
(QUEIROZ & TÉDDE, 2007). Além disso, muitos agentes quimioterápicos não
atravessam a barreira hemoencefálica, oferecendo um verdadeiro “santuário” para o
desenvolvimento de metástases, ainda porque alguns destes agentes quimioterápicos
podem “enfraquecer” esta barreira e facilitar a disseminação de metástases para o SNC
(BREM & PANATTIL, 2005).
As metástases cerebrais são de um modo geral os tumores mais comumente
vistos clinicamente, compreendendo um pouco mais de 50% de todos os tumores
cerebrais (GRENBERG, 2005). As metástases intracranianas podem envolver o
parênquima cerebral, os nervos cranianos, vasos sanguíneos cerebrais, seios durais, a
duramater, as leptomeninges e a tábua craniana (ADAM, 2005). Nos Estados Unidos a
incidência anual de novos casos de metástases cerebrais é maior que 100.000,
comparando com apenas 17.000 tumores primários do cérebro (MAMELACK et al.
2005). Entre 15%-30% dos pacientes com câncer desenvolvem metástases cerebrais
(INCA, 2005). Em 15% dos pacientes sem histórias de câncer, uma metástase cerebral é
a primeira manifestação clínica (MAMELACK et al., 2005). Em 9% dos casos, uma
metástase é o único local detectável de disseminação. As metástases ocorrem em apenas
6% dos casos pediátricos (YUMANS, 2004), sendo o tumor de Wilms e os
osteosarcomas os mais freqüentes nesta faixa etária (GRENBERG, 2005).
Em tese, todos os tipos de tumores malignos podem originar metástases,
entretanto apenas alguns tipos o fazem mais freqüentemente, a saber: câncer de pulmão
44%, mama 10%, rim 7%, tubo gastrointestinal 6%, melanoma 3% e fonte incerta 10%.
4
Os tumores de pulmão e mama juntos somam mais de 50% das metástases
(YUOMANS, 2003; SILLS, 2005)
Quanto
à
localização
das
metástases
cerebrais
elas
podem
ser
parenquimatosas em 75% dos casos e meníngea no restante (25%) determinando uma
meningite carcinomatosa. A localização de 80% das metástases solitárias está nos
hemisférios cerebrais. (YOUNG, 2005). A maior incidência de metástases cerebrais é
posterior à fissura silviana, próximo à junção dos lobos temporal, parietal e occipital
(presumivelmente devido à disseminação embólica pelos ramos terminais da artéria
cerebral média, onde o fluxo sanguíneo é maior). Muitas tendem a se localizar entre as
substâncias brancas e cinzentas (MAMELACK et al. 2005). O cerebelo é o local mais
comum de metástases intracranianas e é a localização em 16% dos casos de metástases
solitária (YOUNG, 2005).
Assim como na maioria dos tumores cerebrais, os sinais e sintomas das
metástases tendem a ter um curso de instalação lenta quando comparado com sintomas
típicos de doenças cérebro-vasculares que tendem a ter início súbito e se resolver
lentamente. Ainda podem manifestar fenômenos elétricos como as crises convulsivas de
inicio súbito e resolução rápida. Não há achado clínico que permita a diferenciação de
um tumor metastático de uma neoplasia primária do SNC (BREM & PANATTIL,
2005).
Segundo BRAGA (2002), os sinais e sintomas incluem:
1. Aqueles devido à pressão intracraniana elevada por efeito de massa ou
bloqueio de liquor (hidrocefalia), cefaléia (50%) dos casos, náusea e
vômitos e depressão do nível de consciência;
2. Déficit focal, por compressão do parênquima cerebral e ou a formação de
edema perilesional, ou compressão de nervos cranianos;
5
3. Convulsões que ocorrem em 15% dos casos;
4. Alteração do estado mental - depressão, letargia, apatia e coma;
5. Sintomas sugestivos de fenômenos vasculares AIT (ataque isquêmicos
transitórios, chamados AITs de tumores) ou acidentes vasculares
estabelecidos por oclusões vasculares tumorais, ou hemorragias
intratumorais, como nos melanomas e tumores de células renais;
A avaliação clínica radiológica de tumores metastáticos para o SNC se faz
por estudos envolvendo tomografia computadorizada (CT) e ressonância magnética
(RM) do encéfalo (MAMELACK et al., 2005, McCCHEON, 2005).
As metástases aparecem como massa não complicada à tomografia
(redondas, bem circunscritas), se originando nos limites entre substância branca e
cinzenta, em áreas ditas watershed, fronteiras de territórios vasculares de lobos
diferentes. Caracteristicamente, um edema profundo da substância branca penetra no
cérebro a partir do tumor de forma mais pronunciada que aqueles vistos em tumores
primários (chamados “dedos de edema”). Quando lesões múltiplas estão presentes (na
CT e ou RM) a regra de Chambers se aplica: “quem contar a maior quantidade de
metástase está correto”. As metástases se impregnam por meio de contraste radiológico
e devem ser consideradas sempre no diagnóstico diferencial de uma lesão em anel
(McCCHEON, 2005).
A RM de encéfalo é mais sensível que a CT, especialmente na fossa
posterior, incluindo o tronco cerebral, detectando metástases múltiplas em
aproximadamente 20% das metástases diagnosticadas como únicas na CT. As múltiplas
projeções na RM de encéfalo para metástases são úteis no planejamento cirúrgico
(McCUTHEON 2005, YOUNG ,2005).
6
3. METÁSTASES DE MAMA NO CÉREBRO
A incidência total de metástase cerebral de tumores de mama é cerca de
30% (SWENSEN, 2007). A sobrevida média em cinco anos é de 98.1% em tumores
com invasão local e caem para 26% nos pacientes com metástases para sítios distantes,
sendo pulmão, fígado, ossos e cérebro os órgãos mais freqüentemente afetados.
(EWEND et al. 2005). As metástases de mama representam 10% dos tumores
metastáticos para o cérebro. A via de disseminação metastática para o cérebro em geral
é hematogênica. O processo pelo quais as metástases ocorrem é chamado cascata
metastática e é na verdade o grande processo biológico responsável pelo seu
desenvolvimento (YUOMANS, 2003).
O prognóstico dos pacientes com metástases cerebrais de câncer de mama
no geral é pobre, uma vez que na maioria dos casos o envolvimento pulmonar, hepático
e ósseo já ocorreu no momento de seu diagnóstico.
A sobrevida média após o
diagnóstico de metástase cerebral varia de 2 a 16 meses, sendo de 1 ano em apenas 20%
dos casos ( CHENG & HUNG, 2007). Um índice prognóstico para metástases cerebrais,
incluindo a de mama, foi formulado pelo Radiation Terapy Oncology Group (RTOG),
baseados na análise de 1200 casos com uma variedade de tumores sólidos. Pacientes
com idade menor que 65 anos, os quais têm seus tumores primários controlados, sem
outros focos de metástase conhecidos e um índice de Karnofsk maior que 75,
usualmente têm melhores resultados, com média de sobrevida de 7.1 meses. Entretanto
pacientes acima de 65 e com índice de Karnofsk abaixo de 70, têm pior prognóstico
com média de sobrevida de 2.3 meses, em ambos os casos considerando nenhuma forma
de tratamento aplicada. Um fator favorável de sobrevida inclui metástase cerebral única
e longo período de tempo livre da doença primária. Com o controle da doença sistêmica,
a incidência de envolvimento do sistema nervoso central tem aumentado, e a maioria
7
destes pacientes com metástases de mama está morrendo devido à progressão da doença
no cérebro (McDERMOTT, 2005).
4. TRATAMENTO DAS METASTASES CEREBRAIS
Mesmo com tratamento ideal a sobrevida dos pacientes com metástases
cerebrais ainda é de 26 a 32 semanas, portanto, o seu manejo é paliativo (McCCHEON,
2005). Deve-se ter cuidado com a confirmação diagnóstica de tumores cerebrais
metastático, pois em 11% dos pacientes com alterações na CT e ou RM de crânio e com
história de câncer nos últimos cinco anos, podem não ser metástases, sendo fundamental
o diagnóstico diferencial com glioblastoma multiforme, astrocitomas, abscessos e
reações inflamatórias inespecíficas, pois quando se contempla o tratamento não
cirúrgico (radio ou quimioterapia) é fundamental a confirmação por biopsia (EWEND,
2005)
O tratamento das metástases cerebrais de mama inclui: corticosteróide,
radioterapia de cérebro total, ressecção cirúrgica, radiocirurgia e quimioterapia.
(YOUNG & PATCHELL, 2004). Os corticosteróides são usados para aliviar os
sintomas por diminuição do edema em torno da lesão cerebral (SWENSEN & KIRSCH,
2002). A radioterapia de cérebro total é considerada a forma de tratamento de escolha
para metástases cerebrais múltiplas, assim como pacientes com metástases solitárias que
não são qualificados para cirurgia ou radiocirurgia estereotáxica (CHENG & HUNG,
2007). Esta forma de tratamento é capaz de controlar os sintomas neurológicos e
melhorar a qualidade de vida em aproximadamente 75% a 85% dos pacientes, sendo
ainda capaz de prolongar o tempo de sobrevida quando comparada com corticosteróide
somente (YOUNG & PATCHELL, 2004).
8
A ressecção cirúrgica das metástases cerebrais de mama permite o
diagnóstico da doença intracraniana, além disso, pode melhorar os sintomas
neurológicos e melhorar a qualidade de vida por imediata descompressão cerebral por
remoção do efeito de massa do tumor (MAMELACK, 2005). A ressecção cirúrgica
também melhora o período de sobrevida quando comparada com outros modos de
tratamento isolados (SWENSEN & KIRSCH, 2002) Em pacientes com uma única
metástase acessível, bom desempenho de Karnofsk e doença extra-craniana estável, há
uma boa vantagem para o tratamento cirúrgico, principalmente quando combinado com
radioterapia de cérebro total somente. Entretanto a ressecção cirúrgica é considerada
limitada em pacientes com metástases múltiplas, a menos que haja entre elas uma lesão
muito sintomática, causando intenso déficit motor ou redução do nível de consciência
por efeito de massa do tumor (CHENG & HUNG,2007).
Geralmente a quimioterapia não tem sido considerada uma boa estratégia
para o tratamento das metástases do sistema nervoso central, devido à constituição da
barreira hematoencefálica, principalmente pelas Tight-Junction nas células endoteliais e
as junções tipo Gap dos pericitos dos astrócitos: estas estruturas celulares dificultam ou
não permitem a passagem de moléculas com alto peso molecular, típicas dos
quimioterápicos (PEEREBOOM, 2005).
5. ASPECTOS GENÉTICOS DO CÂNCER
5.1 Instabilidade Genômica
No curso da carcinogênese, as células experimentam várias alterações
genéticas (incluindo ganhos e deleções de genes e cromossomos) que estão associadas
com a transição de uma lesão pré-neoplásica a um tumor invasivo e daí sua metástase.
Uma alta freqüência de deleções cromossômicas, relacionadas com perda de
9
heterozigose, é considerada um marco em instabilidade genômica em câncer, hoje alvo
de estudos através de várias ferramentas de citogenética molecular (QIN, 2002).
Instabilidade do genoma tem sido considerada como importante fator na
formação e progressão da neoplasia. A célula deve sofrer uma, ou mais de uma,
alteração no seu genoma, usualmente na forma de mutações nos genes envolvidos no
ciclo celular, o que leva a um relaxamento dos mecanismos de controle do crescimento
e divisão (WARD, 2002). Células nas quais os mecanismos de controle foram alterados
têm maior chance de desenvolver novas anormalidades genéticas, isto é, se tornam
instáveis (BREIVIK, 2005). Quando a célula sofre grandes danos, que sobrepujam a sua
capacidade de reparação, se torna sujeita a sofrer alterações cromossômicas, como
translocações, deleções, amplificações, duplicações ou inversões de genes. Inserções,
deleções, duplicações e inversões geralmente resultam na produção de produtos gênicos
truncados, ou encurtados, enquanto que as trocas de bases alteram a seqüência de
aminoácidos do produto gênico ou também resultam em produto truncado. Mutações
externas à região codificadora podem afetar a transcrição, a tradução e o splicing do
RNA mensageiro e seu processamento. Assim, existe uma relação entre o agente
causador deste dano e o grau de heterogeneidade do clone celular que se desenvolverá,
o que, por sua vez, guarda estreita relação com a capacidade de algumas destas células
adquirirem resistência terapêutica e, portanto, definirem pior prognóstico ao tumor.
Muitos genes supressores tumorais foram identificados a partir da análise de mutações,
como o TP53, APC, DPC4 e o P16, envolvidos no processo carcinogênico em diversos
tecidos (FAGIN, 2002).
10
5.2 Oncogenes e Genes Supressores Tumorais
O tumor progride através do acúmulo de mutações genéticas e epigenéticas
que possibilitam sua liberação dos processos de controle celular e ambiental. Essas
mutações podem envolver genes que agem no ciclo celular, apoptose, angiogênese,
adesão celular, e reparo do DNA. Um grande número de tais genes, como oncogenes e
genes supressores tumorais (GST), já foi identificado (GRAY & COLLINS, 2000).
Durante a década de 90, uma terceira categoria de genes envolvida com o
câncer foi definida: aqueles que controlam o reparo do DNA (FISHEL et al., 1993). A
princípio, há dois tipos de genes que previnem o câncer quando em funcionamento
normal: os genes caretakers, que mantêm a integridade do genoma, tanto ao nível dos
nucleotídeos como dos cromossomos, e os genes gatekeepers, que mantêm um
crescimento celular funcional, incluindo os proto-oncogenes e genes supressores de
tumor (KINZLER et al., 1997; BREIVIK, 2005). Conjuntamente, alterações nesses
genes conduzem à instabilidade genômica, criando um ambiente em que o acúmulo de
mutações podem levar ao fenótipo câncer (GRETARSDOTTIR, 1998).
Os oncogenes, alelos mutantes ativados de uma classe de genes celulares
normais conhecidos como proto-oncogenes, facilitam a transformação maligna por
mecanismos tais como o estimulo à proliferação do clone mutado, o aumento do
suprimento sanguíneo ao tumor, e a inibição da apoptose (CONCIN et al., 2003). Os
oncogenes têm efeito dominante, uma vez que um único alelo mutado é suficiente para
alterar o fenótipo celular de normal para neoplásico. Essas mutações podem ser nos
próprios oncogenes, em seus elementos reguladores ou no número de cópias no
genoma, levando à desregularão ou hiperexpressão de seu produto oncogênico
(BREIVIK, 2005).
11
Genes protetores ou caretakers são verdadeiros supressores tumorais,
estando envolvidos no reparo de danos ao DNA e na manutenção da integridade do
genoma. Já os genes de manutenção, ou gatekeepers,estão envolvidos na regulação ou
inibição da proliferação celular. Para essas duas classes de genes, a perda ou inativação
de ambos os alelos pode levar ao câncer agora pelo acúmulo de mutações secundárias
em proto-oncogenes ou em genes supressores de tumor (GOODISON et al., 2005).
Um exemplo de gene supressor de tumor é o TP53, que está localizado no
braço curto do cromossomo 17, e desempenha importante papel no controle do ciclo
celular, reparo do DNA, e ativação da apoptose (WATTERS et al, 2003). O TP53
codifica uma fosfoproteina nuclear que funciona como um regulador transcricional, se
ligando em seqüencias específicas na fita de DNA (CONCIN et al., 2003). A evidência
inicial de que este gene estaria inativado em cânceres humanos foi dada por estudos
demonstrando que a perda de heterozigosidade para alelos situados no cromossomo 17
(17p13.1) era comum em muitos tipos tumorais (FEARON et al., 1987; VOLGESTEIN
et al., 1988; BAKER et al., 1990). Além disso, o gene TP53 está mutado em grande
parte dos indivíduos com síndrome de Li-Fraumeni, uma desordem hereditária
caracterizada por uma ampla variedade de sarcomas (MALKIN et al., 1992).
Em respostas ao dano na molécula de DNA, células com tipos selvagens de
TP53 exibem uma rápida resposta no aumento do nível celular da proteína p53, o que se
correlaciona muito bem com a parada do ciclo celular em G1. Esta parada em G1 é o
tempo necessário para que o processo de reparo ocorra antes que haja duplicação na fase
S do DNA danificado. Em caso de não ser possível o reparo do DNA, a p53 ativa a via
de capazes que levam a célula a apoptose (CONCIN et al., 2003).
Mutações no TP53 estão entre as anormalidades genéticas mais comuns
entre os cânceres humanos em geral e no câncer de mama em particular. Sua
12
participação na carcinogênese deriva do fato que alteram o ciclo celular, resultando em
um aumento da instabilidade genética. Adicionalmente, uma perda de ação da via
apoptótica dependente da p53 conduz ao aumento de resistência aos agentes
danificadores de DNA usados clinicamente como a rádio e a quimioterapia
(GERSTNER & FINE, 2007).
Mutações em proto-oncogenes e genes supressores tumorais podem ocorrer
em diferentes momentos e seqüencias particulares na via de progressão dos diferentes
tumores, e podem contribuir parcialmente para a aquisição de uma única alteração ou
totalmente para a aquisição simultânea de várias alterações distintas. Como
conseqüência dessa manifestação variável, os diferentes tipos tumorais podem
apresentar fenótipos diversos; entretanto, independente do caminho genético percorrido,
alterações nesses genes são comuns a todos os tipos de tumores, e o reconhecimento de
suas relações com a progressão da malignidade tem importante valor prognóstico e pode
facilitar o desenvolvimento de novas terapias (HANAHN & WEIBERG, 2000).
6. CITOGENÉTICA E CÂNCER.
6.1 Considerações Gerais
A instabilidade cromossômica é uma característica comum das células
cancerígenas. Muitos mecanismos celulares levam à instabilidade cromossômica,
envolvendo rearranjos numéricos e estruturais nessas células, incluindo problemas de
segregação, de pontos de checagem do ciclo, de estabilidade telomérica e de reparo de
DNA. O número de diferentes mecanismos relacionados à instabilidade cromossômica
vem aumentando rapidamente com novas descobertas. Considerando-se que a
instabilidade cromossômica é uma das maiores causas de resistência de tumores a certos
tratamentos, o entendimento dos mecanismos que levam a essa instabilidade tem uma
13
grande importância prática (GOLLIN, 2005). Estima-se que desequilíbrios no número
de cromossomos seja a modificação genética mais comumente encontrada nos tumores
sólidos analisados até o momento (HEIM & MITELMAN, 1995).
As aberrações cromossômicas numéricas são comumente observadas em câncer
humano. Três linhas de evidência nos levam a crer que essas aneuplodias são eventos
discretos de mutações cromossômicas que contribuem para o processo de transformação
maligna: primeiro, a análise de aneuplodias por técnicas de citogenética molecular
revelaram que aneuploidias cromossômicas específicas são relacionadas com tipos
tumorais distintos; segundo, linhagens de células tumorais aneuplóides apresentaram
uma elevada taxa de instabilidade cromossômica; e terceiro e mais importante, vários
genes que controlam a segregação cromossômica foram encontrados mutados em
células tumorais humanas, associando essas mutações à indução de aneuplodiais em
tumores (SAN, 2000; GOODISON et al. 2005).
Há um aumento crescente de estudos de anormalidades cromossômicas em
humanos, principalmente por estarem relacionadas etiologicamente a neoplasias,
envolvendo oncogenes e genes supressores de tumor, como produtos da instabilidade
genética (GISSELSSON, 2005). De acordo com SORENSEN e TRICHE (2000), esses
rearranjos podem levar a conseqüências como:
- Ativação de genes chaves no controle da proliferação e diferenciação celular que
codificam fatores de transcrição que se ligam ao DNA em seqüências definidas,
influenciando decisões celulares para entrar e sair do ciclo celular ou para expressar
genes associados à diferenciação.
- Quebras em um cromossomo ou em cromossomos diferentes, com fusões diversas,
inversões, translocações, em recombinações mitóticas de genes homólogos ou não
homólogos, levando a formação de gene quimérico.
14
Entretanto, informações acerca de aberrações recorrentes em tumores
sólidos e alguns hematopoiéticos são limitados devido à dificuldade de se obter material
de cultura primária destas células e por terem baixo índice mitótico (HEIM &
MITELMAN, 1995). Além disso, tumores sólidos têm freqüentemente cariótipos com
rearranjos complexos, tornando difícil a identificação de alteração genética envolvida na
patogênese do câncer (PATEL et al., 2000).
Uma divisão desigual dos cromossomos origina as aneuploidias. As
aneuploidias (perdas ou ganho de um ou mais cromossomos) vêm sendo observadas em
vários tipos diferentes de neoplasias, e apesar disso, não se sabe exatamente seu papel
na carcinogênese (DEY, 2004). Como esses rearranjos numéricos são consistentemente
observados em todos os cânceres, muitos trabalhos apóiam a hipótese de que as
aneuploidias são freqüentemente causadas por um tipo particular de instabilidade
genética, chamada instabilidade cromossômica, a qual pode refletir defeitos na
segregação mitótica (RAJAGOPALAN & LENGAUER, 2004)
Um princípio fundamental na compreensão de tumorigenese é que o câncer
surge a partir das aquisições seqüenciais de alterações cromossômicas em genes
específicos (GISSELSON, 2008). Estas mudanças (mutações e amplificações) ocorrem
em células individuais, e cada mudança atinge uma onda de expansão clonal, sendo
necessárias de 6 a 10 eventos clonais para se atingir maturação neoplásica. Ao contrário
das células normais, que contém um número regular de 46 cromossomos, as células
neoplásicas freqüentemente apresentam um número maior de cromossomos, cerca de 60
a 90, e podem diferir em número e estruturas em células de um mesmo tumor (HARITI,
2005)
As bases genéticas de todo processo de aneuploidias precisam de mais
investigações. Entretanto, tetraploidizações vistas em lesões pré-neoplásicas como o
15
esôfago de Barret, e colite ulcerativa, translocações balanceadas e telômeros curtos
vistos em células telomerase-negativas imortalizadas, e anormalidades em números
(dobrados) de centrômeros e mutações em genes responsáveis por pontos de checagem
de fusos mitóticos podem ser as bases genéticas para as aneuploidias ou instabilidade
cromossômicas (DEY, 2004; HARITI, 2005).
6.2
Relação entre Rearranjos Cromossômicos e Genes Supressores Tumorais e
Proto-oncogenes
As modificações cromossômicas que atuam na tumorigênese são
diretamente relacionadas com muitos proto-oncogenes, genes supressores tumorais e
outros genes de controle de ciclo celular (GUNTER, 2001, PEÑA & CASTRO, 2002).
No caso de deleções, o funcionamento normal desses genes e dos
mecanismos que eles controlam sofre modificações devido a uma haplo-insuficiência
ou desequilíbrio da expressão gênica; por essa via pode-se ativar os mecanismos
iniciais da gênese tumoral. Os exemplos incluem a deleção intersticial de 11p13, que
contém o gene supressor de tumor WT1 no tumor de Wilms; a deleção da banda
13q14, na qual se localiza o gene RB, responsável pelo retinoblastoma em crianças; e a
deleção do 17p13, no qual encontramos o gene TP53, relacionado com os carcinomas
gástrico, de mama, melanoma, de pulmão, de ovário e de cólon (HEIM &
MITELMAN, 1995; BERTRAM, 2000; GUNTER, 2001; PEÑA & CASTRO, 2002).
O gene TP53 está bem reconhecido como guardião do genoma humano: é importante
notar que as deleções que comprometem os locos dos genes TP53 e do RB
desencadeiam o surgimento de diferentes tipos de tumores em mais de 50% dos casos
(SANDBERG, 1994; HOLLSTEIN et al., 1991; LOPES et al., 2002).
16
Por outro lado, as translocações podem conduzir à trasativação gênica
anormal desses genes, como ocorre com o L-myc (1p32) em carcinoma de pulmão, o
N-ras (1p11) em neuroblastomas, APC (5q21) em polipose de cólon, BRCA1 (1p36 e
17q21) em câncer de mama e de ovário, e a super-expressão do oncogene HER2/NEU
em carcinoma de mama (MITELMAN, 2000; RABBITS, 1994; SCWAB, 1999;
OBARA et al., 2001). As translocações também afetam a estrutura e função de outros
genes, como aqueles que codificam fatores de crescimento (SHAEKNEV &
SHAEKNEV, 1997). Da mesma forma, esse tipo de rearranjo pode originar genes
híbridos (genes fusionados) cujos produtos, proteínas quiméricas, aumentam
notoriamente a proliferação celular e ativam mecanismos de gênese tumoral e
posterior metástase (AMAN, 1999; MITELMAN, 2000).
Conclui-se, dessa forma, que quaisquer modificações no número ou
estrutura dos cromossomos humanos que comprometam os locos de proto-oncogenes e
genes supressores tumorais ativam os mecanismos de surgimento de neoplasisas em
humanos.
6.3 Dados Citogenéticos de Tumores de Mama
As análises citogenéticas em câncer de mama já revelaram que esse tipo de
tumor apresenta-se bastante heterogêneo nesse aspecto (HEIM & MITELMAN, 1995;
MITELMAN, 1994; SLOVAK, 1996). A interpretação e identificação das aberrações
clonais tornam-se difíceis pela sua complexidade. O exato número e distribuição de
genes
envolvidos
na
maioria
desses
rearranjos
ainda
são
desconhecidos
(LARRAMENDY et al., 2002). Os primeiros estudos em tumores de mama revelaram
ganhos de 1q, 8q, 11q13, 17q22-24 e 20q13, e perdas de 17p e do cromossomo 22 como
17
as aberrações mais freqüentes (COURJAL & THEILLET, 1997; KNUUTILA et al.,
1998; KUUKASJAVIN et al., 1998).
Outra aneuplodia recorrente em tumores de mama envolve o
cromossomo 8: o ganho desse cromossomo foi observado em 100% dos casos de
tumores primários analisados por ROKA et al. (1998). Esse cromossomo pode ter
grande importância no carcinoma de mama, visto que vários genes que estão envolvidos
em sua gênese estão situados nesse cromossomo. Além disso, a aneuploidia do
cromossomo 8 parece ocorrer no início do processo neoplásico (DEVILEE &
CORNELISSE, 1994).
6.4 Aneuploidias em Metástases de Mama
O acúmulo de anormalidades cromossômicas, tais como rearranjos,
amplificações e deleções afetando diretamente genes envolvidos no controle da
proliferação, diferenciação e sobrevivência celular podem levar a um processo de passos
múltiplos para o desenvolvimento e progressão do câncer. A identificação de tipos
comuns de rearranjos genômicos é um dos grandes objetivos na pesquisa de câncer,
porque pode trazer informações sobre os mecanismos moleculares que levam à
transformação celular (GOODISON et al., 2005).
Segundo PANDIS et al.(1998), ao se analisar citogeneticamente células
obtidas a partir de metástases, as principais perguntas referem-se à sua estrutura
cromossômica: o cariótipo de células de metástases mantém o mesmo perfil
cromossômico dos tumores primários? Os rearranjos encontrados são semelhantes
àqueles dos tumores primários? Os rearranjos observados nos tumores primários podem
estar relacionados com o seu poder de se metastatizar? Os resultados ainda são
18
controversos, principalmente devidos às dificuldades técnicas em se obter boas
preparações para análises citogenética.
Poucos são os casos de estudos citogenéticos envolvendo tanto o tumor
primário como as suas eventuais metástases. Em estudos de metástases de mama em
linfonodos vários rearranjos também característicos do tumor primário foram
encontrados nas metástases, além de novos. Assim as metástases apresentam um maior
número de rearranjos por clone, mas um menor número de populações clonais,
selecionadas da massa tumoral após adquirirem capacidade para metastatizar (PANDIS,
1998, TEIXEIRA et al. 1996).
De todos os casos de metástases analisados por PANDIS et al. (1998), a
aneuploidia mais observada foi a monossomia do cromossomo 17 (70%) e perda no
cromossomo 22 (70%). Essas duas aberrações cromossômicas também são comuns em
tumores primários, indicando que eles podem ter um papel importante no
estabelecimento de metástases. Genes supressores de tumor como TP53, BRCA1 e
oncogenes como HER2/neu situados no cromossomo 17 podem ter suas dosagens
alteradas quando este demonstra anormalidade estrutural e numérica, o que tem sido
relacionado a pobre prognóstico (WATTERS et al., 2003). TSUDA et al. (1998)
também obervaram concordância entre perda de heterozigosidade tanto de 17p como
17q e graus de malignidade em um estudo envolvendo 150 tumores primários de mama
com metástases nos linfonodos axilares, e a combinação entre mutações do TP53 e
amplificações do c-erbB2 foi significante como prognóstico de recorrência e morte.
Já aneuploidias envolvendo o cromossomo 22 foram observadas
principalmente em tumores primários de SNC, como meningiomas, ependimomas e
schwanomas ( EVANS et al., 2000; WEINBERG, 2008). Entretanto, outros tumores
também foram caracterizados pela monossomia desse cromossomo como alguns
19
tumores intestinais (MARCI et al., 1998) e do ovário (CAUGHRON et al., 2005). O
gene NF2, situado no cromossomo 22, parece ser uma das possíveis causas da
associação de aneuploidias do par 22 e alguns tipos de neoplasias. De fato, dados da
literatura indicam que modificações do gene NF2 estão associados a 30% dos casos de
tumores cerebrais. Esse gene promove a produção de uma proteína denominada merlin,
que possui importante papel em muitas vias de sinalização relacionadas ao crescimento,
divisão e comunicação celular (BEGNAMI et al., 2007).
20
7. OBJETIVOS
7.1 Objetivo Geral
- Analisar a ocorrência de aneuploidias dos cromossomos 17 e 22 e deleções do gene
TP53 em metástases cerebrais de mama, através da aplicação de sondas centroméricas e
gene-específicas, comparando os resultados obtidos com os dados previamente
publicados.
7.2 Objetivos Específicos
- Analisar a ploidia de células obtidas de metástases cerebrais de mama.
- Observar a ocorrência de aneuplodiais envolvendo os cromossomos 17 e 22 em
metástases cerebrais de mama.
- Analisar a ocorrência de deleções do gene TP53 em metástases cerebrais de mama.
- Comparar os resultados com dados previamente publicados
- Comparar os dados com o histórico dos pacientes, procurando traçar relações entre as
mutações encontradas e o quadro clínico dos pacientes.
21
II. MATERIAL E MÉTODOS
1. AMOSTRAS
O presente trabalho faz parte de um projeto maior intitulado “Estudos
Citogenéticos e Moleculares em Tumores do Sistema Nervoso Humano na População
Paraense”, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Centro de Saúde da
Universidade Federal do Pará (025/06 CEP-CCS/UFPA) (Anexo I). Os pacientes ou
seus parentes próximos foram informados sobre o estudo a ser realizado e, em caso de
concordância em participar do mesmo, solicitou-se a assinatura de um termo de livre
consentimento (Anexo II). As análises foram realizadas em cinco amostras de
metástases cerebrais de mama. A caracterização das amostras e dos pacientes encontrase na tabela I. Para controle da técnica de FISH, foi analisada uma amostra de
preparação obtida a partir de cultura de linfócitos de um indivíduo hígido que não foi
exposto a radiações ou medicamentos que pudessem interferir no resultado do estudo,
em período próximo à coleta.
Tabela I: Caracterização das Amostras Utilizadas nas Análises
Protocolo Data de Coleta
Sexo
Idade
Exame Histopatológico
CONT01 05/05/2008
F
22
---------CSN037
28/07/2005
F
23
Adenocarcinoma metastático
CSN099
06/06/2006
F
54
Adenocarcinoma metastático
CSN133
30/03/2007
F
45
Adenocarcinoma metastático
CSN134
10/04/2007
F
46
Adenocarcinoma metastático
CSN155
18/01/2008
F
50
Adenocarcinoma metastático
22
2. COLETA DAS AMOSTRAS
Amostras de tecido tumoral foram coletadas durante o procedimento cirúrgico
pela equipe de Neurocirurgia do Hospital Ophir Loyola. O material foi colocado em
meio de cultura RPMI, contendo antibióticos, para prevenção de possível contaminação.
Imediatamente após sua coleta, o material foi encaminhado ao Laboratório de
Citogenética da Universidade Federal do Pará, para processamento.
3. OBTENÇÃO DE NÚCLEOS INTERFÁSICOS
Para obtenção de suspensão de núcleos interfásicos e eventuais metáfases,
seguiu-se a técnica de FORD e HAMERTON (1956) com modificações. O material
tumoral foi desagregado com o uso de bisturi, tesoura e colagenase em uma placa de
Petri. Depois da dissociação completa do tecido, acrescentaram-se cerca de 0,2 mL de
colchicina e 5 mL de meio RPMI enriquecido com 10% de soro bovino fetal, e o
material foi macerado. Posteriormente, centrifugou-se por 10 minutos a 1000 rpm. O
sobrenadante foi desprezado, e adicionaram-se 5 mL de solução hipotônica (KCl 0,075
M). O material foi então ressuspendido e incubado por 15 minutos a 37°C. Depois de
transcorrido esse tempo, acrescentou-se fixador Carnoy (3 metanol : 1 ácido acético) e
ressuspendeu-se. Após centrifugar-se o material por 10 minutos a aproximadamente
1000 rpm, descartou-se o sobrenadante com o uso de uma pipeta Pasteur,
acrescentando-se novo fixador (5 mL). Após ressuspensão, o material foi novamente
centrifugado. Esse procedimento foi repetido por três vezes. Após a última etapa,
acrescentaram-se apenas 2mL de fixador. O material foi então mantido em freezer.
23
4. PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS
As lâminas para uso foram primeiramente lavadas, deixando-as por alguns
minutos em solução de álcool / éter (50%). Após esse procedimento:
1. Enxugou-se a lâmina com ajuda de um papel absorvente ou tecido.
2. Após a última centrifugação, retirou-se o sobrenadante e adicionou-se cerca de 1 ml
de fixador novo ao material. Ressuspendeu-se com ajuda de uma pipeta Pasteur.
3. Com a ajuda de uma micropipeta, 10 µl da suspensão foram adicionados à lâmina.
4. A lâmina seguiu para o processo de pepsinização e desidratação.
5. PRÉ-HIBRIDIZAÇÃO
Após a evaporação do fixador, as lâminas foram pepsinizadas para a retirada de
excessos de material citoplasmático ou qualquer outro material que pudesse
comprometer os resultados da hibridização in situ. Para isso, as lâminas foram
mergulhadas em solução de pepsina (500 µl de pepsina a 1% em 50 ml de HCl) por 3
minutos. Após a incubação, as lâminas foram incubadas três vezes em 2xSSC, por 3
minutos cada vez.
Depois do processo de pepsinização, as lâminas foram desidratadas em bateria
de alcoóis (etanol 70%, 70%, 90%, 90%, dois minutos em cada, e 100%, quatro
minutos. Em seguida, após a evaporação total do álcool, as lâminas foram envelhecidas
em estufa a 37oC, por 12-24 horas.
6. HIBRIDIZAÇÃO IN SITU
6.1 Sondas
Foram utilizadas sondas comerciais da marca Abbott Molecular (Illinois, EUA).
As sondas foram utilizadas em experimentos dual-colors, utilizando-se dois fluoróforos
24
distintos: SpectroRed e SpectroGreen. No experimento para detecção de aneuploidias
envolvendo o cromossomo 22, a sonda específica para o locus 22q11.2 (Vysis LSI BCR)
foi utilizada juntamente com o controle 9q34 (Vysis LSI ASS-ABL), visto que ambas as
sondas estavam disponíveis em um coquetel de duas cores. Já para a análise de
aneuplodias do cromossomo 17 e rearranjos envolvendo o gene tp53, utilizamos as
sondas específicas para o centrômero do 17 (Vysis CEP 17 17p11.1-q11.1 Alpha
Satellite) e para 17p13.1 (Vysis LSI TP53), respectivamente.
6.2 Hibridização
Foram seguidas as instruções do fabricante (Abbott Molecular):
1. Em um eppendorf, as sondas foram misturadas ao tampão de hibridização: 7
µl de tampão, 1 µl de sonda e 2 µl de água deionizada.
2. O material foi misturado no vortex por 5 segundos e centrifugado.
3. As sondas foram desnaturadas em banho-maria a 73oC por 10 minutos.
4. Após sua desnaturação (5 minutos em formamida a 70% a 73oC), as lâminas
foram desidratadas em bateria de alcoóis (etanol 70% gelado, 4 minutos,
70%, 90% e 90%, temperatura ambiente, 2 minutos cada, e 100%
temperatura ambiente, 4 minutos).
5. Depois da evaporação total do álcool, as lâminas foram colocadas em placa
quente a 50oC, e despejou-se 10 µl de solução de hibridização (tampão e
sondas).
6. Após dois minutos, as lâminas foram retiradas da placa quente. Uma
lamínula foi colocada sobre o material e as lâminas foram incubadas em
recipiente fechado a 42oC por 45 minutos.
25
6.3 Lavagem de Estringência
Após a incubação e retirada das lamínulas, as lâminas foram incubadas em
0.4xSSC/0.3% Tween a 73oC por dois minutos. Em seguida, as lâminas permaneceram
por ums minuto em 2xSSC/0,1% Tween. As lâminas foram então coradas em DAPI e
cerca de 10 µl de antifade foram aplicados em cada lâmina. Uma lamínula de
24mmx24mm foi colocada sobre o material. As lâminas foram mantidas em geladeira
até a análise ao microscópio.
7. ANÁLISE E CAPTURA DAS IMAGENS
A análise dos experimentos de FISH foi feita com objetiva de imersão em
microscópio de fluorescência AXIOPHOT acoplado a uma câmera digital. A captura de
imagens foi feita com o auxílio do programa AXIOVISION instalado em um
computador Pentiun IV. Usando os critérios de HOPMAN et al. (1994) apud
CARLSON et al. (2000), foram analisados 40 núcleos intactos de 3 a 5 áreas separadas
(120 a 200 núcleos no total). Regiões com background ou que não exibiam pelo menos
um sinal de hibridização não foram consideradas.
As diferentes combinações de números de sinais em cada núcleo e experimento
foram agrupadas em nove classes diferentes, sendo considerados normais os núcleos
que apresentaram dois sinais de cada uma das sondas utilizadas. A ausência de um sinal
foi considerada como deleção do segmento ou cromossomo em questão. A presença de
mais de dois sinais foi considerada como trissomia ou amplificação do segmento em
questão. Para se avaliar a ploidia média dos núcleos analisados, foi feita a comparação
da freqüência de marcações extras do centrômero do cromossomo 17 e do segmento do
cromossomo 22 com aquelas do cromossomo 9, normalmente não envolvido
diretamente com a tumorigênese em câncer de mama ou matástases. Dessa forma, a
26
freqüência de três sinais do cromossomo 9 em cada amostra foi considerada a
freqüência média de núcleos triplóides nessa determinada amostra, e sua comparação
com a freqüência de três sinais do centrômero do cromossomo 17 foi indicativo do
número de vezes que esses sinais representavam trissomia, e o número de vezes que
surgiam devido a triploidização do núcleo. O mesmo procedimento foi aplicado para a
interpretação dos dados do cromossomo 22. O número de núcleos analisados por caso
variou de 110 a 200, de acordo com o estado de cada uma das lâminas empregadas nos
experimentos de hibridização in situ.
8. ANAMNESE
Os dados clínicos dos pacientes que cederam as amostras para análise estão
contidos no Anexo III.
27
III. RESULTADOS
1. EXPERIMENTOS DE HIBRIDIZAÇÃO IN SITU
As sondas utilizadas produziram sinais claramente detectáveis e de fácil
interpretação. Todas as sondas foram aplicadas nas seis amostras, somando dois
experimentos de duas cores para cada uma delas. A utilização de experimentos
empregando-se duas sondas simultaneamente permitiu um melhor controle acerca do
comportamento de cada um dos cromossomos ou segmentos marcados. Além disso, a
análise em conjunto dos resultados permitiu uma interpretação mais segura em relação à
ploidia de cada um dos núcleos visualizados. No anexo IV apresentamos imagens
representativas das diferentes combinações entre os sinais nos dois experimentos
distintos.
As sondas gênicas nos cromossomos 9, 17 e 22 foram analisadas isoladamente e
em conjunto. A presença de um número de sinais diferente de dois simultaneamente nas
sondas do 9 e do 22 foi interpretado como indício de euploidias, enquanto as alterações
no número de sinais em apenas uma das sondas foram interpretadas como aneuploidias.
Foi utilizado um controle com núcleos obtidos a partir de cultura de linfócitos
para determinar a sensibilidade e a especificidade da técnica de FISH, através do qual
foi verificada uma baixa incidência de núcleos alterados (0-2,5%) para os genes e
cromossomos estudados na cultura de linfócitos.
Os resultados referentes ao gene TP53 e à sonda do centrômero do cromossomo
17 indicaram uma pequena variação de marcações entre os casos analisados. Os núcleos
normais foram a marcação com maior porcentagem para ambas as sondas em três dos
cinco casos, variando de 26,3% a 50%. Como segundo evento, destaca-se a deleção do
TP53, variando de 18,9% a 34,6%. O CSN 99 manteve-se divergente tanto em relação a
normalidade de núcleos quanto a deleção de TP53, destoando do padrão de atuação
28
deste gene nos demais casos. Estatisticamente, o CSN 99 encontra-se significante em
relação a todos os outros casos. De qualquer forma, considerando as classes com
núcleos com menos que dois sinais do TP53 como deleções permite considerar esse
rearranjo como o mais observado em todas as amostras, seguido de ganho do
cromossomo 17 (presença de mais de dois sinais da sonda centromérica (Tabela 2).
A análise dos cromossomos 9 e 22 nos tecidos tumorais revelou um padrão de
perda do cromossomo 22 em todos os casos (13% a 51% dos núcleos), exceto o CSN
99, com apenas 8,5% dos casos com perda desse cromossomo. Em três (CSNs 155, 134
e 37) dos cinco casos analisados, a normalidade dos núcleos prevaleceu em mais de
50% de núcleos examinados, seguido em um caso (CSN 155) por um evento de ganho
do cromossomo 9 - interpretado aqui por hiperploidia - e em dois casos (CSNs 134 e
37) por perda do cromossomo 22. A análise do CSN 133 apresentou 51% de núcleos
com perda do cromossomo 22, seguido com 19% de núcleos normais. Já o CSN 99
divergiu do padrão dos demais casos, demonstrando o ganho do cromossomo 9 - e
possível hiperploidia - em 30, 5%. A soma das classes com menos de dois sinais do
cromossomo 22, que são indicativos de perda desse cromossomo, fazem deste rearranjo
o mais comumente observado depois dos núcelos normais (Tabela 3).
29
Tabela 2 – Análise estatística dos experimentos de i-FISH do gene TP53 e o centrômero
do cromossomo 17.
Número de
Sinais
Número de Núcleos
Cen
17
TP53
CL*
CSN 155
CSN 134
CSN 133
CSN 99
CSN 37
2
2
196 98%
32 16,8%
50 26,3%
100 50%
68 34%
54 36%
30
6
4
0
0
60
30,5%
Conclusões Possíveis
Núcleo Normal
Ganho do cromossomo 17,
com perda do TP53 nas
cópias adicionais
Amplificação do TP53
>2
2
2
>2
0
0
0
0
0
0
>2
>2
4
16
16
1
4
5
Hiperploidia
0
3
3
0
2
0
Perda do cromossomo 17,
presença de cópia extra do
TP53
Deleção de TP53
<2
2
2
<2
0
37 19,4%
36 18,9%
68 34%
98 49%
62 41,3%
<2
<2
0
12
13
19
20
25
Hipoploidia
0
0
0
0
0
6
0
30 16,8%
42 23,6%
6
4 14%
8
Perda do cromossomo 17 e
TP53 amplificado
Ganho do cromossomo 17 e
TP53 deletado em mais de
um deles
<2
>2
>2
<2
*CL – Controle de Linfócitos.
30
Tabela 3: Análise estatística dos resultados de i-FISH dos cromossomos 9 e 22.
Número de
Sinais
CL*
CSN 155
CSN 134
CSN 133
CSN 99
CSN 37
194 97%
96 51,6%
115 57,5%
38 19%
11 5,5%
55 50%
Núcleo Normal
8
Ganho do cromossomo 9
30, 5%
2
61
5
3
1
4
3
Ganho do cromossomo 22
11
6
2
22
14
Hiperploidia
0
4
4
3
5
0
Perda do cromossomo 9
0
26 13%
45 22,5%
102 51%
17 8,5%
25 22,7%
Perda do cromossomo 22
<2
4
1
18
34
12
2
Hipoploidia
>2
0
0
0
0
2
0
Perda do 9, ganho do 22
<2
0
5
2
18
28 14%
3
Ganho do 9, perda do 22
0
40
2
>2
0
>2
>2
2
<2
2
2
<2
<2
<2
>2
21,5%
7
2
>2
Conclusões
Possíveis
Número de Núcleos
* CL – Controle de Linfócitos
31
IV. DISCUSSÃO
1. SOBRE A IMPORTÂNCIA DOS RESULTADOS OBTIDOS A PARTIR
DA APLICAÇÃO DA TÉCNICA DE I-FISH: UMA VISÃO GLOBAL
Técnicas de citogenética molecular vêm trazendo um grande progresso na
análise cariotípica de células tumorais, permitindo uma análise global das aberrações
cromossômicas, como no caso da CGH ou do M-FISH, ou do comportamento de
cromossomos ou segmentos cromossômicos individuais, como no caso do uso de
sondas gene-específicas derivadas de BACs e que podem ser utilizadas em núcleos
interfásicos. Os dados das diferentes técnicas se somam para que haja um melhor
entendimento do papel de certas modificações cromossômicas na tumorigênese ou na
análise prognóstica de diferentes casos de neoplasias. De fato, muitos estudos mostram
que há uma associação clara entre diferentes características cariotípicas de tumores e o
tipo de tratamento que melhores resultados trarão e mesmo a sobrevivência dos
pacientes (BARDI et al., 2004).
A citogenética interfásica é uma alternativa valiosa para casos nos quais não foi
possível a obtenção de um número de metáfases satisfatório para a caracterização
citogenética de um caso. Entretanto, limita-se a quantidade de informações que podem
ser obtidas de cada experimento, visto que, como não se pode fazer uma análise
cariotípica global dos núcleos, é necessária a escolha de um número pequeno de sondas,
já baseada em uma seleção de acordo com os objetivos do experimento, como por
exemplo, sondas centroméricas dos pares cromossômicos envolvidos nas principais
aneuplodiais de humanos no caso de exames pré-natais (STUMM et al., 2006).
Por outro lado, uma grande vantagem do i-FISH é a utilização de células que não
precisam ser colocadas em cultura, podendo ser obtidas diretamente do tecido, como no
32
presente trabalho, o que diminui o tempo necessário para a obtenção dos resultados, ou
mesmo de material parafinado de lâminas histológicas (COWELL et al., 2004).
Considera-se que a transição metastática na maioria dos tumores humanos é
acompanhada por uma série de anomalias cromossômicas complexas recorrentes e
estocásticas. Essas mudanças refletem a pressão evolutiva pela qual as células
cancerígenas precisam passar para continuarem seu crescimento em ambientes
histopatologicamente diversos daquele no qual o tumor se originou (GAGOS &
IRMINGER-FINGER, 2005). Para este trabalho, dados referentes aos tumores
primários não estavam disponíveis para uma comparação genômica completa.
Entretanto, resultados de trabalhos anteriores envolvendo o mesmo tipo de tumor
primário – de mama –, porém com metástases em um tecido diferente – linfonodos –,
mostraram que aneuploidias envolvendo os cromossomos 17 e 22 estariam entre os
rearranjos mais observados tanto nos tumores primários como metastáticos, sugerindo
que essas aneuploidias possam estar relacionadas com um maior poder de
metastatização dos tumores primários (PANDIS et al., 1998, TSUDA et al., 1998). Em
adição, monossomias envolvendo esses cromossomos só foram obervadas em 10% de
tumores primários que não metastatizaram (PANDIS et al., 1995).
As amostras que analisamos foram classificadas histologicamente como
metástases cerebrais de mama. Apesar da incidência total de metástase cerebral de
tumores de mama ser de cerca de 30% (SUENSEN, 2007), pouco se sabe sobre sua
constituição cariotípica ou comparações com tumores primários de mama. Assim,
baseados nos dados já expostos de comparações cariotípicas entre tumores primários de
mamas e suas metástases, decidimos analisar a ocorrência dos rearranjos mais
significativos encontrados em comum entre esses dois tipos distintos de neoplasias. A
utilização de sondas que indicassem a ocorrência de aneuploidias envolvendo os
33
cromossomos 17 e 22 foi a metodologia escolhida e trouxe dados interessantes que irão
se somar a outros previamente publicados e poderão num futuro próximo, com o
aumento do número de amostras analisadas, definir a importância desses rearranjos nos
riscos de metastatização de tumores primários de mama.
2.
OCORRÊNCIA DE ANEUPLOIDIAS DO CROMOSSOMO 17
A perda do cromossomo 17 foi um dos resultados mais comuns encontrados por
PANDIS et al. (1998), e o resultado mais comum na análise de TSUDA et al. (1998),
ambos em metástases de mama em linfonodos. Entretanto, um resultado comum a todas
as nossas amostras foi um baixo número de núcleos com monossomia do cromossomo
17. Um número um pouco mais significativo estatisticamente de núcleos mostrou,
todavia, um ganho de cópias desse cromossomo. A maioria desses ganhos representou
trissomias e, em menor número, tetrassomias. A presença de mais de quatro cópias do
cromossomo 17 foi observado em um número muito pequeno de núcleos, no caso 134,
com núcleos com 5 ou 6 cópias.
É importante ressaltar que a presença de mais de dois sinais do centrômero do
cromossomo 17 pode indicar, também, células hiperplóides, já que não foi utilizada
nenhuma outra sonda como controle de ploidia nos experimentos do cromossomo 17.
Porém, se considerarmos os resultados obtidos com as sondas dos cromossomos 9 e 22
nas mesmas amostras como indicadores da ocorrência de hiperploidia (a presença de
três cromossomos 9 ou três cromossomos 9 e três cromossomos 22 indicariam o grau de
hiperploidização na amostra), ainda teremos um número significativamente maior de
núcleos com ganho do 17 do que a parcela que seria considerada poliplóide.
A polissomia do cromossomo 17 já havia sido descrita em tumores de mama.
HYUN et al. (2008) detectaram a presença de ganho desse cromossomo em 32% do
34
total de casos analisados, o que corresponde a um resultado similar a outros estudos
(TANNER et al., 2000, ZHAO et al., 2002, DOWNS-KELLY et al., 2005, MEROLA et
al., 2006). Alguns autores sugerem que há uma relação direta entre o aumento de cópias
do cromossomo 17 e os níveis de expressão do gene HER-2 (Receptor de Fator de
Crescimento Epidermal Humano 2, do inglês Human Epidermal Growth Factor
Receptor-2). Apesar dos efeitos da polissomia desse cromossomo na expressão da
proteína HER-2 ainda não estarem bem estabelecidos, foi observada uma superexpressão dessa proteína em associação com a presença de cópias extras do
cromossomo 17 (BOSE et al., 2002, WANG et al., 2002, DOWNS-KELLY et al., 2005,
MEROLA et al., 2006). A super-expressão do HER-2 está associada a um diagnóstico
pobre, tanto em cânceres de mama nódulo-negativos como em nódulos positivos
(SLAMON et al., 1987, TANDON et al., 1989, PRESS et al., 1993). Desde a
introdução do tratamento com trastuzumab, um anticorpo monoclonal contra a porção
extracelular da HER-2, pesquisas voltadas ao status dessa proteína vem sendo realizadas
em mulheres com câncer de mama, com o intuito de se identificar pacientes que serão
mais provavelmente beneficiadas com o uso de trastuzumab (VOGEL et al., 2002,
ROMOND et al., 2005).
Ganhos do cromossomo 17 e envolvimento do gene HER-2 no processo
metastático foram observados em adenocarcinoma de Barrets primários metastásticos e
em suas metástases em linfonodos (WALCH et al.,2000).
Nos casos de metástases analisados, observamos a ocorrência de polissomias do
17 de aproximadamente 9% (CSN099) a 36,7% (CSN155). Talvez o prognóstico pobre
relacionado com a polissomia do cromossomo 17 em tumores primários de mama, com
a associação da super-expressão da HER-2, seja também o motivo da observação desse
35
rearranjo em metástases cerebrais de mama, e indicaria um rearranjo clonal
possivelmente herdado das células que iniciaram o processo de metastatização.
3. DELEÇÕES DO GENE TP53
A proteína p53 tem um papel central na modulação de respostas celulares a
estresses citotóxicos, contribuindo para a parada do ciclo celular para o reparo do DNA
ou para a apoptose. A perda de sua função durante a tumorigênese pode levar ao
crescimento celular impróprio, sobrevivência celular aumentada e instabilidade genética
(KIRSCH & KASTAN, 1998). Foi sugerido que a ausência da p53 funcional em
tumores tem influência sobre a eficácia da quimioterapia e radioterapia (CHEENE,
2001). Quando os tipos mais frequentes de tumores são considerados, o gene TP53 está
mutado numa frequência média de 40 a 45% de todos os pacientes, sendo que essas
mutações normalmente correspondem a mutações de ponto ou deleções no cromossomo
17 (17p13) (MOLL et al., 2001, VOGELSTEIN et al., 2001).
Em todos os casos analisados, a deleção do gene TP53 foi a modificação mais
observada, e em quatro deles sobrepujando inclusive o número de núcleos com dois
cromossomos 17 e duas cópias do TP53, considerados como normais. Assim, a maioria
dos núcleos analisados apresentou uma deleção parcial do cromossomo 17 – perda do
segmento 17p13, no qual o TP53 está localizado. Caso seja considerada a hipótese dessa
deleção ter sido herdada do tumor primário, poderíamos argumentar que a deleção do
TP53 estaria relacionada com o prognóstico pobre dos casos em questão, visto que
todos sofreram metastatização após a retirada do tumor primário. Assim, a análise do
cromossomo 17 em tumores primários seria imprescindível para a definição do possível
prognóstico, tanto se considerando o aumento de expressão da proteína HER-2 no caso
de polissomias, como perda de controle do ciclo celular pela deleção do TP53.
36
A relação entre mutações no TP53 e clínica adversa já está bem estabelecida, o
que reflete a importância de sua proteína na regulação e crescimento das células
tumorais. Por exemplo, em estudos citogenéticos moleculares de tumores de baixa
malignidade, como neurocitomas centrais, não foi verificada a ocorrência de deleções
do gene TP53, enquanto em astrocitomas malignos resistentes a diversas terapias são
caracterizados pela inativação da p53 em um estágio precoce de sua evolução (ZHU et
al., 2005; QUINTANA, 2008). Em LMC (leucemia mielóide crônica), embora o início
da doença dependa da junção BCR/ABL, a progressão envolve alterações no TP53
(MITANI, 2001). Em pacientes com LMC, alterações em TP53 são encontradas em
cerca de 30% dos casos, especialmente em crise blástica e os estudos moleculares têm
indicado que em cerca de 25% dos casos em progressão, há inativação do TP53
provocada por rearranjos ou mutações em ponto (GOLONI, 2000, apud FETT-CONTE
& SALLES, 2002). Inclusive, o gene p51/p63, um novo membro da família do TP53,
mapeado em 3q27-9, quando mutado, pode atuar similarmente ao TP53 e ser
potencialmente responsável pela progressão da LMC (YAMAGUCHI et al., 2001). De
acordo com FETT-CONTE & SALLES (2002), a importância médica deste gene é
inegável, primeiro porque a detecção de mutações pode ser indicadora do diagnóstico e
do prognóstico, segundo porque é um alvo perfeito para prevenção, o que estimula as
abordagens de terapia gênica.
Apesar das deleções do TP53 não serem exclusivas de cânceres de mama, e sim
de muitos tipos tumorais, sua detecção pode ser utilizada como indicativo de um
prognóstico pobre e alto risco de metastatização. De fato, o acompanhamento da
anamnese dos pacientes mostra que a sobrevida após a retirada do tumor metastático
variou de somente 12 a 30 meses (apenas uma paciente ainda sobrevive, somando 12
meses após a retirada do tumor metastático, caso CSN155).A presença dessa deleção
37
como a anomalia mais observada em todos os casos de metástase analisados reforça
essa afirmação. Uma importante metodologia que poderia ser utilizada para a
confirmação dessa colocação seria a análise da deleção do TP53 em pacientes com
tumores primários e acompanhamento após a retirada deste.
4. ANEUPLOIDIAS DO CROMOSSOMO 22
Vários estudos relacionam aneuploidias do cromossomo 22, principalmente a
monossomia, como um passo importante na gênese de neoplasias, provavelmente
devido à inativação de genes supressores de tumor situados nesse cromossomo. Pelo
menos utações em um desses genes, NF2, vem sendo citadas como importantes na
gênese da doença genética neurofibromatose tipo 2, além de diversas neoplasias quando
mutado, principalmente em tumores do sistema nervoso, como meningiomas e
schwannomas, mas também em tumores ovarianos, melanomas e tumores de mama
(TROFATTER et al., 1993, LEKANNE et al., 1994, RUTTLEDGE et al., 1994, PAPI
et al., 1995, LINDGREN et al., 1996) . Mutações no NF2 não parecem ter um papel
essencial no surgimento de tumores em mama, fígado ou colo-retais, que normalmente
mostram perda de heterozigosidade nos alelos do cromossomo 22, sugerindo a
existência de um segundo gene supressor de tumor importante nesse cromossomo
(BIANCHI et al., 1994, AKAGI et al., 1995, KANAI et al., 1995). De fato, em um
estudo de 140 tumores primários de mama foi demonstrada a perda de heterozigosidade
(LOH) em 16 locos polimórficos de 22q em 56 amostras (40%). Desses, 11 retiveram a
heterozigosidade para marcadores próximos do NF2, mas apresentaram LOH para
marcadores mais distantes desse gene, reforçando a possibilidade de um segundo gene
supressor de tumor, associado ao câncer de mama. Além disso, comparações desses
38
resultados com dados clínico-histológicos indicaram que a perda alélica de 22q tende a
ocorrer mais frequentemente em tumores de alta malignidade (IIDA et al. 1998).
A deleção do cromossomo 22 foi o rearranjo mais observado nos experimentos
envolvendo sondas dos cromossomos 9/22, em todas as amostras analisadas. Como a
sonda utilizada nas análises deste trabalho correspondia a um gene situado em 22q, as
deleções do cromossomo 22 observadas podem indicar, na verdade, perda de 22q. Além
disso, caso este rearranjo tenha sido herdado clonalmente dos respectivos tumores
primários, estaríamos confirmando os achados de IIDA et al. (1998), que sugerem uma
associação entre essa deleção e tumores de alta malignidade: a ocorrência de metástase
e sobrevida curta dos pacientes dos quais foram coletadas as amostras seriam evidências
dessa alta malignidade.
5. VALOR PROGNÓSTICO DOS RESULTADOS OBTIDOS
Poucos estudos envolvendo tanto tumores primários de mama como suas
metástases foram publicados até o momento. Mesmo assim, podemos concluir que a
LOH de alelos do cromossomo 17 parece ser um fato comum entre os estudos
realizados (PANDIS et al., 1998, TSUDA et al., 1998). Essa perda de heterozigosidade
estaria relacionada principalmente ao 17p, e mais precisamente com o TP53. Apesar de
ainda precisarmos analisar um número amostral maior para confirmarmos esse fato, a
deleção do TP53, presente em todas as amostras de tumores analisadas, é um forte
indício que esse rearranjo poderia estar associado a uma maior malignidade e
consequentemente maior poder de metastatização dos tumores primários que os
originaram, assim como indicador de um prognóstico pobre, visto que a sobrevida de
quatro das cinco pacientes ficou com uma média de 17,4 meses (excluindo-se o caso
39
CSN 155), com a recorrência de metástases cerebrais após a primeira cirurgia de
ressecção das metástases cerebrais.
Entretanto, considerar apenas o gene TP53 como indicador prognóstico do
cromossomo 17 corresponderia a um dado incompleto, já que a confirmação de
polissomias desse cromossomo poderia também influenciar o gene HER-2, que está
também relacionado com a gênese e malignidade de tumores de mama. Dessa forma, o
cromossomo 17 deve ser analisado não só em relação à perda do TP53, mas também em
relação ao ganho de cópias dele, para se ter uma idéia melhor do real prognóstico desse
tumor, e até mesmo de terapias alternativas, considerando-se que os tumores com o
envolvimento do gene HER-2 são sensíveis ao tratamento com trastuzumab (VOGEL et
al., 2002, ROMOND et al., 2005).
Monossomias do cromossomo 22 ainda não são uma constante em estudos de
tumores metastáticos de mama. Entretanto, os estudos vem demonstrando que esse
cromossomo pode ter um papel importante na gênese e evolução tumoral, e que pode
mesmo existir um segundo gene supressor de tumor além do NF2 nesse cromossomo
(IIDA et al. 1998). Talvez a seleção das sondas utilizadas em estudos anteriores tenha
obscurecido a presença de monossomias do cromossomo 22, já que há inúmeros estudos
com sondas loco-específicas e centroméricas do cromossomo 17, porém um número
muito menor de estudo envolvem sondas do cromossomo 22. Dessa forma, tendo em
vista a observação de uma possível relação entre perdas de 22q e aumento de
malignidade em tumores de mama, sugerimos que essa sonda também deva ser utilizada
em análises do grau de malignidade desse tipo de tumor, especialmente em combinação
com as sondas do cromossomo 17, como realizadas no presente trabalho.
Nossos dados enfatizam a importância de rearranjos envolvendo esses
cromossomos, e da análise citogenética de tumores primários como indicador de
40
malignidade e de risco de metastatização em pacientes submetidos a ressecção desses
tumores primários. Um maior número de amostras e a inclusão de dados de tumores
primários poderiam corroborar nossa posição, que, entretanto, já encontra uma grande
concordância e soma seus resultados a estudos anteriores.
41
V. CONCLUSÕES
1. Apesar da contradição com alguns resultados anteriores, que demonstram perdas
de cromossomos 17 como um evento comum em metástases de mama, nossos
resultados foram bastante homogêneos entre as amostras, revelando ganhos de
cromossomo 17. O ganho de cromossomos 17, também já observada em tumores
metastáticos de mama, é relacionada à super-expressão do gene HER-2, fato
envolvido com o aumento da malignidade dos tumores de mama. Sendo assim, a
análise da aneuploidia deste cromossomo pode ser um importante indicador de
malignidade.
2. A deleção do gene TP53 foi a alteração mais observadas nos casos analisados,
demonstrando sua já conhecida importância em processos neoplásicos em geral,
já que está envolvido em várias vias de controle do ciclo celular e da via
apoptótica. Nossos resultados indicam que sua deleção pode ser um indicativo
de diagnóstico pobre, com aumento da malignidade e do poder de
metastatização.
3. Nulissomias ou monossomias do cromossomo 22 representam importantes
alterações citogenéticas na formação de alguns tumores, e tudo indica que as
perdas deste cromossomo apresentam um papel crucial na progressão e
formação de metástases, provavelmente devido à inativação de genes
supressores tumorais nele localizados. Um maior número amostral poderia
confirmar sua participação direta nas vias de progressão metastática.
4. A ocorrência simultânea dos eventos acima citados podem ser os responsáveis
pela manifestação clínica agressiva destes tumores, visto que os pacientes
apresentaram uma baixa sobrevida e reincidência de metástases antes do óbito.
42
IV. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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51
ANEXO I: APROVAÇÃO PELO COMITÊ DE ÉTICA
52
ANEXO II: TERMO DE LIVRE CONSENTIMENTO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
A Universidade Federal do Pará, em colaboração com o Hospital Universitário João de Barros Barreto HUJBB, está desenvolvendo uma pesquisa que permitirá conhecer melhor os mecanismos que ocasionam o
desenvolvimento de tumores do sistema nervoso, através da identificação das alterações genéticas associadas ao
quadro clínico do paciente e exame histopatológico. Estes estudos são realizados em pequenos fragmentos de
tecido estomacal removido por cirurgia ou por exame endoscópico e oferecem novas possibilidades de diagnóstico.
Você está sendo admitido (a) neste Hospital, para estabelecimento de diagnóstico e/ou tratamento de
algum tumor de sistema nervoso e há a necessidade da remoção de material biológico relacionado à esta
enfermidade. Parte do material retirado será encaminhado para exames laboratoriais, necessários para o
diagnóstico definitivo. O restante do material não utilizado é armazenado para novos exames, se necessário.
A obtenção do fragmento de tecido tumoral para pesquisa não implicará em riscos adicionais no seu
tratamento ou na sua cirurgia, nem em aumento no tempo do exame ou cirurgia. O fragmento de material biológico
será identificado no laboratório por um código formado por números e letras, preservando sua privacidade e
identidade. A eventual inclusão dos resultados em publicação científica será feita de modo a garantir o anonimato do
paciente.
É necessário esclarecê-lo (a) que não existem benefícios ou direitos financeiros a receber sobre os
eventuais resultados decorrentes da pesquisa. Se você não concordar em doar o material para pesquisa, sua
decisão não influenciará, de nenhum modo, no seu atendimento ou tratamento.
Caso você tenha alguma dúvida sobre este documento ou em relação a pesquisa, por gentileza, entre
em contato com o Prof. Dr. Edivaldo H.C. de Oliveira ou com o Prof. Dr. Nilson P. Anselmo, através dos telefones
3183-1568 ou 3183-1558.
Uma cópia deste documento será arquivada em seu prontuário e, se desejar, uma cópia lhe será
fornecida.
Declaro estar ciente das informações prestadas, tendo lido atentamente e concordado com o teor, e
autorizo a utilização de amostras de tecido retiradas de meu organismo.
Belém, ............ de .............................................. de ....................
---------------------------------------------------------------------------Assinatura do Paciente ou Responsável
Nome: ........................................................................................................................
RG: ...........................................................
53
ANEXO III: DADOS CLÍNICOS – ANAMNESE
GOVERNO DO ESTADO DO PARÁ
SECRETARIA DE ESTADO DE SAÚDE PÚBLICA
HOSPITAL OPHIR LOYOLA
CSN 037 (Iniciais: HSBD, 23 anos). Adenocarcinoma metastático (mama), cirurgia dia
: 28/07/2005, Reg.59.339. Dr. Douglas Vasconcelos.
Paciente foi submetida a ressecção de adenocarcinoma de mama esquerda há 5 meses,
há 3 semanas, vem evoluindo com cefaléia persistente a direita e teve dois episódios de
crises convulsivas. Realizou CT e RM de encéfalo que demonstrou processo expansivo
temporal direito. Foi operada em 28 de julho 2005 através de craniotomia aos moldes
clássicos e ressecado o tumor completamente. Foi encaminhada a radioterapia de
cérebro total. Não houve recidiva até dezembro de 2007. Em fevereiro de 2008,
reinternou com múltiplos focos de metástases cerebrais, indo a óbito 3 semanas após.
CSN 099 (Iniciais: FCL, 54 anos). Adenocarcinoma metastático (mama), cirurgia dia :
06/06/2006, Reg.80.883. Dr. Douglas Vasconcelos.
Paciente procurou o serviço ambulatorial de neurocirurgia, encaminhada do serviço de
mastologia, com cefaléia de forte intensidade, e hemiparesia esquerda de moderada
intensidade, realizou CT e RM de encefálo as quais demonstraram grande processo
expansivo parietoocciptal direito único, subcortical, grande edema vasogênico e
hipercaptante do meio de contraste. Foi submetida a craniotomia parietooccital direita,
com remoção do tumor, sendo seu exame histológico revelando adenocacinoma ductal.
Assim foi encaminhada à radioterapia de cérebro total. A paciente obteve total melhora,
logo após a cirurgia e manteve-se também até o termino da radioterapia. Um ano e meio
após, retornou com crises convulsivas. Durante a investigação com RM de encéfalo, foi
diagnosticada a presença de metástases múltiplas. Um RX de tórax demonstrou focos
pulmonares. A paciente recebeu corticóide e faleceu 3 semanas depois.
CSN 133 (Iniciais: MAS, 45 anos). Metástase de Adenocarcinoma ductal, Cirurgia dia;
30/03/2007, Reg. 129.726, Dr. Douglas Vasconcelos.
Paciente apresentando cefaléia holocraniana persistente de moderada intensidade, e
hemeparesia esquerda grau IV. Foi investigada com CT e RM de Encéfalo, as quais
demonstraram tumor intraaxial frontoparietal em hemisfério cerebral Direito. Foi
operada com ressecção total havendo grande melhora clínica, a seguir encaminhada para
a radioterapia de cérebro total. A paciente retornou à consulta, três meses após sem
sinais de recidiva. Em 02/2008 retornou com um episódio de crise convulsiva e na RM
constataram-se múltiplos focos de metástases. Sua família optou por levá-la ao interior.
Até agora não temos notícia.
CSN 134 (Iniciais: RSP, 46 anos). Metástase de Adenocarcinoma de mama, cirurgia
dia: 10/04/2007, Reg. 79575, Dr. Douglas Vasconcelos.
Paciente apresentando cefaléia de forte intensidade, há 3 meses, com piora rapidamente
progressiva há 2 semanas. Evoluiu com rebaixamento do nível de consciência. CT e RM
de encéfalo: tumor cerebral intraaxial temporoparietal direito, com edema perilesional e
efeito de massa. Foi operada com boa evolução. Encaminhada à radioterapia, realizou
54
doze sessões de 45 CG, de cérebro total. Houve grande melhora clínica. Retornou 2
meses em consulta assintomática. Em agosto de 2008 retornou com hemeparesia
esquerda, CT e RM de encéfalo grande tumor, com efeito de massa. Família optou por
não reoperar. Foi a óbito 3 semanas depois.
CSN 155 (Iniciais LSC, 50 anos). Metástases de adenocarcinoma de mama ductal
invasivo. RG: 1180053, operada em 18/01/2008, Dr Douglas Vasconcelos.
Cefaléia freqüente, de moderada intensidade há um mês, vem evoluindo com piora
clínica, crises convulsivas e hemiparesia direita. Realizou CT e RM que demonstraram
processo expansivo parietotempopral esquerdo com efeito de massa. Foi operada com
boa evolução, com remissão dos sinais e sintomas. Foi encaminhada à radioterapia de
cérebro total. Retornou 4 semanas, após a radioterapia, sem sintomas. Até o momento
não retornou mais.
55
ANEXO IV: IMAGENS REPRESENTATIVOS DOS EXPERIMENTOS DE IFISH E SUA INTERPRETAÇÃO.
A
B
C
D
Figura 1: Hibridização in situ fluorescente dual color em núcleos interfásicos (9q37vermelho/22q11-verde). A) núcleo normal com duas marcações de cada sonda; B) duas
marcações do 9 e uma do 22; C) cinco marcações do 9 e três do 22; D) duas marcações
do 9 e nenhuma do 22.
A
B
C
D
Figura 2. Hibridização in situ fluorescente dual color em núcleos interfásicos (TP53
vermelho/ CEP17 verde.): A) núcleo normal com duas marcações de cada sonda; B)
uma marcação do cen17 e uma do TP53; C) duas marcações do centrômero, nenhuma
do TP53; D) duas marcações do cen17 e uma do TP53.
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