UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE - UNESC
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO ESPECIALIZAÇÃO EM GESTÃO DE RECURSOS
NATURAIS
RAUL EMILIO LORENTZ
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS TÓXICOS E GENOTÓXICOS DO
INSETICIDA-NEMATICIDA CARBOFURANO EM Artemia salina e
Allium cepa L.
CRICIÚMA, JUNHO DE 2008
RAUL EMILIO LORENTZ
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS TÓXICOS E GENOTÓXICOS DO
INSETICIDA-NEMATICIDA CARBOFURANO EM Artemia salina e
Allium cepa L.
Monografia apresentada ao Setor de PósGraduação da Universidade do Extremo Sul
Catarinense- UNESC, para a obtenção do título
de especialista em Gestão de Recursos
Naturais.
Orientador: Prof. MSc. Claus Tröger Pich
CRICIÚMA, JUNHO DE 2008
Dedico esta monografia à minha família, a
meus antigos amigos e também aos novos
amigos que tive a oportunidade de fazer
durante a realização deste trabalho.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos que de forma direta ou indireta, ajudaram na
elaboração deste trabalho, em especial professor Claus Tröger Pich, pela sua
orientação e sua dedicação na realização deste trabalho que será se suma
importância para a minha formação profissional.
Ao amigo Tiago Bortolotto, pelo seu auxílio e companheirismo de valor
imensurável, sempre se mostrando muito prestativo. A todos os meus colegas do
curso de Pós-Graduação. Agradeço de forma muito especial a minha família pelo
amor dedicado a mim e pelo apoio que nunca me faltou durante a realização deste
trabalho. Muito obrigado a todos.
Nós
permitimos
que
esses
produtos
químicos fossem utilizados com pouca ou
nenhuma pesquisa prévia sobre seu efeito
no solo, na água, animais selvagens e sobre
o próprio homem.
Rachel Carsonr
6
RESUMO
Os agrotóxicos são amplamente utilizados nas diversas culturas de importância
econômica, proporcionando a produção de alimentos a um preço acessível, porém a
utilização indiscriminada destes produtos pode causar danos a saúde humana,
animal e ao meio ambiente, principalmente em países em desenvolvimento, como o
Brasil. A exposição de genótipos de seres humanos e animais a esses produtos de
origem sintética (agrotóxicos, fármacos entre outros), faz com que o surgimento de
lesões no DNA de organismos expostos a produtos dessa natureza, aumentasse de
forma relevante, causando muito prejuízos a esses organismo, tendo em vista o alto
potencial mutagênico, carcinogênico e teratogênico que muitos desses produtos
possuem.Dos produtos de origem sintética, os agrotóxicos são uns dos mais
importantes devido a sua larga utilização nas lavouras, principalmente dos países
tropicais. Um dos agrotóxicos de grande utilização é o Furandan da FMC Química
do Brasil LTDA, que um dos agrotóxicos de maior potencial toxicológico.O presente
trabalho tem por objetivo avaliar o potencial tóxico, e genotóxico do inseticidanematicida Carbofurano da através dos testes com Artemia sp e Allium cepa L.Para
a realização dos ensaios de toxicidade ambiental foram utilizados os testes de
toxicidade aguda com Artemia sp (n= 10, 5 replicatas), nas seguintes concentrações:
0,156; 0,313; 0,625; 1,250; 2,500; 5,000; 10,00 mg.L-1, sendo que a CL50 ficou
estimada em 1,44 mg.L-1 e no teste fitotoxicológico com Allium cepa, a solução de
carbofurano inibiu significantemente o crescimento de, com uma média de: 0,86 ±
0,22 (p<0,001***) bem como a perda da biomassa que apresentou média de: 6,93 ±
1,94 (p<0,001***). No teste genotóxico com raízes maceradas de Alliun cepa, não
houve a possibilidade de caracterização de potencial genotóxico. Portanto pode-se
concluir de imediato que, o inseticida-nematicida carbofurano se mostrou
extremamente eficiente em sua capacidade de causar toxicidade e fitotoxicidade aos
organismos utilizados como bioindicadores. Após a conclusão deste trabalho, e com
a analise dos resultados obtidos, pode se enfatizar a necessidade de testes
ecotoxicológicos para avaliar o potencial genotóxico das mais variadas substancias
que temos contato na rotina de nosso cotidiano, sempre com o objetivo de tentar
minimizar os prejuízos que essas substâncias provocam a saúde humana bem como
a meio ambiente.
Palavras-Chave: Agrotóxicos; Carbofurano; Ecotoxicologia; Teste Cometa.
7
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Transporte e transformação de agrotóxicos no meio ambiente .............. 19
Figura 2 - Consumo de agrotóxico por estado no Brasil ......................................... 21
Figura 3 - Imagem da estrutura química molecular do inseticida – nematicida
carbofurano ............................................................................................................. 24
Figura 4 - foto da embalagem da comercial do inseticida – nematicida carbofurabo
................................................................................................................................ 25
Figura
5
- Desenho
esquemático demonstrando os
níveis
de
avaliação
ecotoxicológicos ...................................................................................................... 27
Figura 6 - Desenho esquemático dos processos estudados pela ecotoxicologia.... 28
Figura 7 - Imagem do crustáceo Artemia salina ...................................................... 29
Figura 8 - Imagem do vegetal Alliun Cepa (cebola) ................................................ 30
Figura 9 - Modelo tridimencional do DNA................................................................ 32
Figura 10 - Bases nitrogenadas .............................................................................. 33
Figura 11 - TESTE COMETA: Núcleos celulares foram isolados e submetidos a uma
corrente elétrica (eletroforese). A partir dos resultados, esses núcleos receberam
uma pontuação de zero (sem dano) a quatro (dano máximo), baseado no tamanho
da "cauda do cometa", que corresponde à quantidade de fragmentos do DNA...... 36
Figura 12 - Esquema simplificado da preparação e execução do Teste de toxicidade
aguda com Artemia sp. ........................................................................................... 37
Figura 13 - Esquema simplificado da preparação e execução Teste de inibição do
crescimento de raízes em Allium cepa L................................................................. 38
Figura 14 - Esquema simplificado das etapas de preparação, lise, corrida
eletroforética, neutralização, e coloração das lâminas no Teste Cometa ............... 39
Figura 15 - Classificação de danos ao DNA através das Classes de Dano (Classes 0
a 4) .......................................................................................................................... 40
Figura 16 - Índice de mortalidade (%) obtido através do Teste de toxicidade aguda
utilizando Artemia salina em concentrações (%) seriadas da solução com o
Carbofurano. Índice de mortalidade expresso como média (%) das cinco replicatas
................................................................................................................................ 42
Figura 17 - Resultado do Teste de fitotoxicidade em Allium cepa, baseado no
crescimento de suas raízes quando expostas a solução de carbofurano. ** = p<
8
0,001 ....................................................................................................................... 43
Figura 18 - Resultado do teste de Fitotoxicidade com Allium cepa, baseado no ganho
de biomassa de suas raízes. * = p< 0,001 .............................................................. 44
Figura 19 - Índice de Dano (ID) e Freqüência de Dano (FD), obtidos através do Teste
Cometa em células meristemáticas das raízes de Allium cepa expostas a uma
concentração de carbofurano e água mineral comercial (controle negativo),
analisado por teste t. ............................................................................................... 45
9
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACHE - Acetilcolinesterase,
ANVISA – Angência Nacional de Vigilância Sanitária
CL50 - concentração letal
CONAMA - Conselho Nacional do Meio Ambiente
DL50 - Dose Letal
DNA – ácido desoxirribonucléico
DP – Desvio Padrão
FD – Freqüência de Dano
FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz
ID – Índice de Dano
MAPA - Ministério da agricultura, pesca e abastecimento
OMS – Organização Mundial da Saúde
PH – Potencial Hidrogeniônico
PISQ – Programa de Segurança Química
PND – Plano Nacional de Desenvolvimento
SINDAG - SINDICATO NACIONAL DE PRODUTOS PARA A DEFESA AGRÍCOLA
10
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 12
2 OBJETIVOS......................................................................................................... 15
2.1 Objetivo geral .................................................................................................. 15
2.2 Objetivos específicos...................................................................................... 15
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ........................................................................... 16
3.1 Agrotóxicos ..................................................................................................... 16
3.1.1 Classificação quanto ao público-alvo ........................................................ 17
3.1.2 Classificação toxicológica........................................................................... 17
3.2 Efeitos dos agrotóxicos ao meio ambiente................................................... 18
3.3 Agrotóxicos no Brasil ..................................................................................... 19
3.4 Principais grupos de agrotóxicos e seus mecanismos de ação................. 21
3.4.1 Organoclrorados .......................................................................................... 21
3.4.2 Organofosforados ........................................................................................ 22
3.4.3 Piretróides..................................................................................................... 22
3.4.4 Carbamatos................................................................................................... 23
3.4.4.1 Carbofurano............................................................................................... 24
3.5 Toxicidade........................................................................................................ 25
3.5.1 Toxicidade de agrotóxicos .......................................................................... 25
3.5.2 Ecotoxicologia.............................................................................................. 26
3.6 Artemia SP ....................................................................................................... 28
3.6.1 Allium cepa L ................................................................................................ 29
3.7 Genotoxicidade ............................................................................................... 30
3.8 DNA – Estrutura............................................................................................... 31
3.9 DNA - Danos e sistema de reparação............................................................ 33
4 MATERIAL E METODOS .................................................................................... 35
4.1 Teste ecotoxicologicos................................................................................... 35
4.1.2 Teste cometa ................................................................................................ 35
4.1.3 Teste de toxicidade aguda com Artemia sp............................................... 36
4.1.4 Teste de inibição do crescimento de raízes em Allium cepa L. ............... 37
4.2 Teste de genotoxicidade................................................................................. 38
4.2.1 Teste de fragmentação de DNA (Teste Cometa)........................................ 38
11
4.3 Análise estatística ........................................................................................... 40
5 RESULTADOS..................................................................................................... 42
5.1 Teste de toxicidade aguda co Artemia SP .................................................... 42
5.2 Teste de Fitotoxicidade em Allium cepa ....................................................... 43
5.3 Teste de genotoxicidade................................................................................. 44
5.3.1 Teste de fragmentação de DNA (Teste Cometa)........................................ 44
6 DISCUSSÃO ........................................................................................................ 46
7 CONCLUSÃO ...................................................................................................... 48
REFERÊNCIAS....................................................................................................... 49
12
1 INTRODUÇÃO
Todos os organismos vivos estão em interação com o meio ambiente,
assim, os seus genomas ficam expostos às interferências que esse meio sofre. A
interação entre o meio e o organismo resulta em modificações que, quando
positivas, refletem na adaptação do organismo quanto à melhor exploração desse
meio, o que decorre também na própria modificação do ambiente pelo organismo.
(MINISSI; LOMBI, 1997; PASCALICCHIO, 2002).
No século XVIII, Malthus fez a famosa relação sobre o crescimento
populacional com o aumento da produção de alimentos, atestando que a população
crescia em razão geométrica e a quantidade de alimentos em razão aritmética. Foi
baseado nessa relação, que surgiu o discurso sobre a necessidade do uso de
agrotóxicos, mesmo de forma indiscriminada. Mas, independente da criação dos
mais diferentes insumos, ainda não “existiram” colheitas para alimentar todo povo
brasileiro. (PINEHIRO; NASR; LUZ, 1988).
Devido a grande resistência das pestes e pragas aos químicos, se fez
necessário, a cada ano, o surgimento de grandes quantidades de novos compostos
como intuito de proteger e preservar as colheitas. No entanto, muitas vezes estes
causam efeitos indesejáveis ao cultivo e também acabam por aumentar o custo da
produção de alimentos. A utilização indiscriminada de pesticidas ainda hoje é uma
prática muito comum, principalmente em países tropicais onde a agricultura é uma
forte fonte de renda. (CARVALHO, 2006).
Os pesticidas são venenos intencionalmente dispersados para controlar
pestes, mas também atuam sobre outras espécies causando sérios efeitos paralelos
em espécies não-alvo. Resíduos de pesticidas podem persistir em solos, águas e
alimentos, contaminando humanos e animais. (CARVALHO, 2006).
Praguicidas são compostos químicos especialmente empregados pelo
homem para destruir, repelir ou mitigar pragas (insetos, ácaros, nematódeos,
roedores e outras formas de vida animal, fungos plantas daninhas terrestres e
aquáticas). Tem também função preventiva contra as pragas alem disso funcionam
como desfolhastes e dessecantes, ou ainda reguladores do crescimento vegetal.
(LARINI, 1999).
O carbofurano é um inseticida nematicida do grupo dos carbamatos, que
13
apresenta curta persistência no ambiente e pequeno deslocamento para regiões
adjacentes, sendo efetivo por contato, ingestão e por ação sistêmica. (KUHR;
DOROUGH, 1976; ILSI BRASIL, 1995). É um inseticida muito eficiente no controle
de uma ampla gama de pragas agrícolas e que atua por contato ou após ingestão.
(FMC, 1977). O comportamento ambiental de um agrotóxico pode ser estimado
pelas suas características físico-químicas e pelos seus metabólitos ou produtos de
degradação formados. (FMC, 1977).
De acordo com Soares (1991), a necessidade em monitorar os efeitos da
ação antrópica, levou a criação da Ecotoxicologia, ciência preocupada em estudar
os efeitos de agentes químicos tóxicos, em nível de indivíduo, e suas conseqüências
na estrutura e funcionamento das populações, comunidades e ecossistemas.
O uso de bioindicadores e biomarcadores na avaliação da toxicidade de
compostos químicos de origem antrópicas em áreas impactadas vem sendo
amplamente utilizado durante as décadas. (OLIVEIRA RIBEIRO et al., 2005).
Bioindicadores são definidos como uma espécies capaz de indicar os primeiros
sinais de estresse ambiental em diferentes níveis de organização biológica.
(ADAMS, 2002).
Um dos organismos mais utilizados como bioindicador de toxicidade
aguda são os microcrustáceos do gênero Artemia, sempre com o objetivo de
determinar a CL50 (concentração de substâncias que provoca a letalidade de metade
dos
organismos
testes)
e
o
efeito
do
produto
sobre
a
sobrevivência,
desenvolvimento do organismo em teste. Para mensurar o potencial fitotoxicológico
de substâncias químicas em geral, está sendo frequentemente utilizado o sistema
Allium cepa L. (cebola). A literatura tem descrito o uso de Allium cepa em ensaios de
toxicidade em que são avaliados diversos parâmetros, dentre os quais se encontra a
fitotoxicidade (inibição de crescimento de raízes e de germinação de sementes) e a
genotoxicidade (aberrações cromossômicas, micronúcleos e fragmentação de DNA)
quando expostas à ação de agroquímicos. (NAVARRETE, 1997).
Dentre as diversas técnicas utilizadas para detectar danos causados por
substâncias genotóxicas, a eletroforese em gel de células individualizadas, também
chamada de ensaio cometa vem sendo utilizada com sucesso em várias espécies de
organismos, inclusive em humanos. (ROJAS et al., 1999).
A escassez de trabalhos científicos, com o objetivo de avaliar o potencial
tóxico e genotóxico do carbofurano, e o dos agroquímicos em geral, é um dos
14
grandes propulsores para a realização de trabalhos como este, que pelo mesmo
motivo acaba por adquirir relevante importância para nossa sociedade.
15
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar a atividade tóxica e genotóxica do inseticida Carbofurano sobre
os organismos testes.
2.2 Objetivos específicos
Avaliar a toxidade aguda provocada pelo inseticida carbofurano no
microcrustáceo Artemia sp.
Avaliar a fitotoxicidade do inseticida carbofurano provocada em Allium
cepa, através do ensaio de inibição do crescimento e perda de biomassa de raízes.
Avaliar a genotoxicidade em células meristemáticas de Allium cepa,
expostas ao inseticida carbofurano.
16
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 Agrotóxicos
Segundo o Programa de Segurança Química – PISQ, oriundo da
Conferência Mundial das Nações Unidas em Estocolmo em 1972, existem mais de
750.000 substâncias conhecidas no meio ambiente, sendo de origem natural ou
antrópica. Cerca de 70.000 estão sendo utilizadas todos os dias, com
aproximadamente 40.000 em significantes quantidades comerciais. Calcula-se que
apenas 6.000 possuam avaliação considerada satisfatória sobre riscos a saúde do
homem e do meio ambiente, levando-se também em consideração que, a cada ano,
entre 1.000 e 2.000 novas substâncias são liberadas para o mercado. (FREITAS;
SÁ, 2003).
Entre as substancias químicas encontram-se os agrotóxicos. De acordo
com SINDAG - Sindicato Nacional de Produtos para a Defesa Agrícola, e 2001, o
Brasil consumiu 328.413 toneladas de agrotóxicos. (ANVISA, 2002). O uso de
agrotóxicos hoje representa um grave problema que envolve países com diferentes
graus de desenvolvimento. A OMS estima que 3 milhões de pessoas seja
contaminadas por agrotóxicos em todo mundo sendo 70% dos casos em países em
desenvolvimento. (PNGRQ, 2003). Sabe-se que grande parte dos agrotóxicos,
quando mal utilizados, podem atingir não só a espécie alvo, mas também destruir os
recursos naturais em áreas maiores, contaminar a fauna e a flora da região onde
são aplicados. (GUIVANT, 1992)
A Lei Federal nº. 7.802 de 11 de junho de 1989, antes regulamentada por
meio do Decreto 98.816. no seu artigo 2º, inciso I, define agrotóxico como produtos e
componentes de processo físicos, químicos e biológicos destinados ao uso dos
setores de produção, armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, nas
pastagens,na proteção de florestas nativas e ou implantadas e de outros
ecossistemas. Também, nos ambientes urbanos, hídricos e industriais, cuja
finalidade seja alterar a composição da flora e fauna, a fim de preservá-la da ação
danosa dos seres vivos considerados nocivos, bem como substâncias e produtos
empregados como desfolhastes, dessecantes, estimuladores e inibidores de
17
crescimento. (FIOCRUZ, 2001). Esta Lei é atualmente regulamentada pelo Decreto
4.074 de 4 de janeiro de 2002 Regulamenta a Lei nº 7.802, de 11 de julho de 1989,
que dispõe sobre a pesquisa, a experimentação, a produção, a embalagem e
rotulagem, o transporte, o armazenamento, a comercialização, a propaganda
comercial, a utilização, a importação, a exportação, o destino final dos resíduos e
embalagens, o registro, a classificação, o controle, a inspeção e a fiscalização de
agrotóxicos, seus componentes e afins, e dá outras providências. O recolhimento e
destinação adequados das embalagens vazias são previstos desde 6 de junho de
2000, quando da Lei Federal nº. 9.974.
3.1.1 Classificação quanto ao público-alvo
Para Peres e colaboradores (2003), os agrotóxicos podem ser
classificados segundo a sua função (praga que controlam), segunda a estrutura
química de suas substâncias ativas (grupo químico) e segundo os efeitos à saúde
humana e ao ambiente.
A) Inseticidas: Possuem ação de combate contra insetos, larvas e
formigas. Os inseticidas pertencem a grupos químicos distintos.
B) Fungicidas: Ação de combate específica a fungo.
C) Herbicidas: Combate a plantas invasoras. Nas ultimas duas décadas,
esse grupo tem tido uma utilização crescente na agricultura.
D) Raticidas: ação de combate contra ácaros diversos.
E) Nematicidas: ação de combate contra nematóides.
F) Molusquicidas: ação de combate a moluscos.
G) Furmigantes: Ação de combate contra insetos e bactérias.
3.1.2 Classificação toxicológica
No Brasil é o Ministério da Saúde que regula a classificação toxicológica
para os agrotóxicos. Estes são enquadrados dentro de quatro classes e os mesmos
18
devem apresentar uma faixa colorida no rótulo indicando a classe a qual pertence.
(BRASIL – MINISTÉRIO DA SAÚDE - ANVISA, 1992).
CLASE I – FAIXA VERMELHA (extremamente tóxico).
CLASE II – FAIXA AMARELA (altamente tóxico).
CLASE III – FAIXA AZUL (mediamente tóxico).
CLASE IV – FAIXA VERDE (pouco ou muito pouco tóxico).
Os estudos necessários a essa avaliação são: DL50 (Dose Letal) oral
aguda; DL50 dérmica aguda; irritabilidade ocular; irritabilidade dérmica; sensibilização
dérmica e CL50 (Concentração Letal) inalatória.
A classificação toxicológica diz respeito exclusivamente a quem manuseia
o produto havendo exposição única; é importante como medida de segurança para
quem trabalha na produção, na embalagem, no armazenamento, no transporte, no
preparo da calda e na sua aplicação. Esta classificação não está relacionada com
exposição a longo prazo e com a segurança do meio ambiente. (STÜTZER et al.,
2003).
3.2 Efeitos dos agrotóxicos ao meio ambiente
Impacto Ambiental, segundo a Resolução 001/86 do CONAMA, é
qualquer alteração das propriedades físicas, químicas e biológicas do meio
ambiente, causada por qualquer forma de matéria ou energia resultante das
atividades humanas que, direta ou indiretamente, afetem: a saúde, a segurança e o
bem-estar da população; as atividades sociais e econômicas; a biota; as condições
estéticas e sanitárias do meio ambiente e a qualidade dos recursos ambientais.
Os
agrotóxicos
são
classificados
como
micropoluentes
para
os
ecossistemas e a adulteração provocada por eles em solos, suprimentos aqüíferos e
alimentícios têm sido objeto de constantes estudos e discussões. (STRACHAN et al.
apud LUCHINI; ANDRÉA, 2000). Os impactos ambientais causados pelo uso dos
agrotóxicos podem ocorrer porque esses compostos podem permanecer por mais
tempo do que o necessário para exercer sua ação, afetando o ecossistema como
um todo. (LUCHINI; ANDRÉA, 2000).
19
Na natureza estes compostos estes compostos agrotóxicos, seus
metabólitos e impurezas seguem diferentes rotas. A Figura 01 representa estes
caminhos e os processos que podem ocorrer, a transformação (quebra) se dá
principalmente por degradação química, biodegradação e fotólise.
Figura 1 - Transporte e transformação de agrotóxicos no meio ambiente
Fonte: Adaptada de DORES; LAMONICA-FREIRE, 1999, p. 35.
3.3 Agrotóxicos no Brasil
A entrada dos agrotóxicos no Brasil a partir da década de 1960 colocouos definitivamente no cotidiano dos trabalhadores rurais, aumentando, assim, os
riscos de adoecer e morrer, aos quais já estavam expostos. Todavia, é a partir de
1975, com o Plano Nacional de Desenvolvimento (PND), que cuidou da abertura do
Brasil ao comércio internacional desses produtos, que ocorrerá um verdadeiro boom
na utilização de agrotóxicos no trabalho rural. Nos termos do PND, o agricultor
estava obrigado a comprar tais produtos para obter recursos do crédito rural. Em
cada financiamento requerido, era obrigatoriamente incluída uma cota definida de
agrotóxicos e essa obrigatoriedade, somada à propaganda dos fabricantes,
20
determinou o enorme incremento e disseminação da utilização dos agrotóxicos no
Brasil. (GARCIA, 1996; MEIRELLES, 1996; SAYAD, 1984).
Aquela política de crédito integrou o movimento conhecido como
Revolução Verde, iniciado nos Estados Unidos da América com o objetivo de
aumentar a produtividade agrícola a partir do incremento da utilização de
agroquímicos, da expansão das fronteiras agrícolas e do aumento da mecanização
da produção. (artigo agrotóxico e trabalho). No Brasil, a Revolução Verde se deu
através do aumento da importação de produtos químicos, da instalação de indústrias
produtoras e formuladoras de agrotóxicos e do estímulo do governo, através do
crédito rural, para o consumo de agrotóxicos e fertilizantes. (MEIRELLES, 1996).
As agências e programas de extensão rural (Abicar, depois Emater)
tiveram também um papel importante na introdução, disseminação e consolidação
destes novos modos de produção, de saberes e de tecnologias rurais, dentre estas o
uso de agrotóxicos. (PINHEIRO et al., 1985).
Atualmente existem no mundo cerca de 20 grandes indústrias com um
volume de vendas da ordem de 20 bilhões de dólares por ano e uma produção de
2,5 milhões de toneladas de agrotóxicos, sendo 39% de herbicidas, 33% de
inseticidas, 22% de fungicidas e 6% de outros grupos químicos. No Brasil, o volume
de vendas é de 2,5 bilhões de dólares por ano, com uma produção de 250 mil
toneladas de agrotóxicos. (SINDAG, 2005).
De acordo com o Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para a
Defesa Agrícola (Sindag), em 2001, o Brasil foi o oitavo país consumidor destes
produtos, com 3,2 kg/ha de agrotóxicos. À sua frente estavam a Holanda, Bélgica,
Itália, Grécia, Alemanha, França e Reino Unido. Ainda de acordo com o Sindag, em
2003, existiam no Brasil 648 produtos em linha de comercialização, sendo 34,4% de
inseticidas, 30,8% de herbicidas, 22,8% de fungicidas, 4,9% de acaricidas e 7,1% de
outros grupos químicos.
O pais é responsável pelo consumo de cerca de 50% da quantidade de
agrotóxicos utilizada na América Latina, o que um comercio estimado de US$ 2.56
bilhões em 1998. (SINDAG, 1999.) O consumo de agrotóxicos na região sudeste
está estimado, de acordo com a revisão de Moreira e colaboradores (2001), em 12
Kg de agrotóxico/trabalhador/ano.
Na Figura 2 temos o consumo de agrotóxico por estado brasileiro
segundo os dados do Sindicato da Industria de Produtos para Defesa Agrícola
21
(SINDAG) órgão que atualmente disponibiliza a maior parte dos dados estatísticos
do setor.
Figura 2 - Consumo de agrotóxico por estado no Brasil
Fonte: Do autor.
3.4 Principais grupos de agrotóxicos e seus mecanismos de ação
3.4.1 Organoclrorados
Os organoclorados foram os primeiros inseticidas a serem sintetizados,
são considerados os menos tóxicos sob o aspecto de contaminação aguda, embora
tenham um potencial de toxicidade crônica maior do que os organofosforados ou os
carbamatos. A grande estabilidade química dos organoclorados é responsável pelo
seu alto poder residual no ambiente. Os resíduos dos organoclorados se acumulam
mais no homem, que está no topo da cadeia alimentar e estão presentes,
22
predominantemente, no tecido adiposo do corpo humano e nas substâncias
lipídicas, isso devido a sua grande lipossolubilidade e lenta metabolização. Como
principais características, os organoclorados são: muito estáveis no meio ambiente,
sendo bioacumuláveis a cadeia trófica; praticamente insolúveis em água, são
altamente lipossolúveis, acumulando-se nos tecidos gordurosos. (RIBEIRO, 1991).
3.4.2 Organofosforados
Os compostos químicos organofosforados possuem ligações Fósforoitrogênio (P-N) e são fundamentais para a manutenção da vida, como, por exemplo,
os ácidos nucléicos.
O desenvolvimento dos Organofosforados trouxe um forte impacto para o
controle químico dos insetos. Eles são efetivos contra uma larga faixa de insetos e
não apresentam persistência no meio ambiente. O risco dos Organofosforados é que
alguns deles são extremamente tóxicos para os mamíferos. Os efeitos tóxicos
agudos são basicamente devidos à desativação da acetilcolinesterase (AChE),
localizada na sinapse do sistema nervoso.
Os Organofosforados são rapidamente absorvidos pela pele, pulmões e
pelo trato gastrointestinal. Seus sintomas de envenenamento agudo são: sudorese,
excesso de secreção bronquial, náuseas e vômitos, contrações musculares e
dormência das extremidades. Os efeitos crônicos são, principalmente, neuropatia,
mudanças psiquiátricas, necrose no músculo esquelético. (RIBEIRO, 1991).
3.4.3 Piretróides
São compostos sintéticos que apresentam estruturas semelhantes à
piretrina substância existente nas flores do Chrysanthemum cinerariacfodium. A alta
atividade inseticida dos piretróides possibilita seu emprego em pequenas dosagens,
que, associadas à sua seletividade, tem permitido o aparecimento de novos
produtos de origem sintética, inclusive mais estáveis à luz e menos voláteis que os
23
de origem natural, propiciando sua grande difusão como domissanitário ou para uso
na agropecuária.São facilmente absorvidos pelo trato digestivo, pela via respiratória
e pela via cutânea.
Sendo pouco tóxicos do ponto de vista agudo, são, porém, irritantes para
os olhos e mucosas, e principalmente hipersensibilizantes, causando tanto alergias
de pele como asma brônquica. Seu uso abusivo no ambiente doméstico vem
causando incremento dos casos de alergia, tanto em crianças como em adultos. Em
doses muito altas podem determinar europatias, por agirem na bainha de mielina,
desorganizando-a,
além
de
promover
ruptura
de
axônios.
(MANUAL
DE
VIGILÂNCIA DA SAÚDE DE POPULAÇÕES EXPOSTAS A AGROTÓXICOS, 1996).
3.4.4 Carbamatos
Carbamatos, ésteres do ácido carbâmico, que possuem como estrutura
em comum: R-O-C(O)-N-(CH3)-R’ OU R-S-C(O)-N-(CH3)-R’ onde R é um álcool,
oxina, ou fenol e R’ hidrogênio ou grupo metila (ex: aldicarbe, carbabril, carbofurano,
metomil, oxamil) (HAYES; LAWS, 1997). Não são estáveis na forma livre,
decompondo-se espontaneamente em amônia e gás carbônico têm ação
equivalente à dos inseticidas fosforados, inibidores da colinesterase. As aplicações
dos Carbamatos incluem anestésico veterinário, bactericida tópico e solubilizante
para pesticidas fumegantes e cosméticos, Em geral, os carbamatos sofrem hidrólise
com certa facilidade, principalmente em temperaturas elevadas. De modo similar aos
organofosforados, os carbamatos atuam na desativação da acetilcolinesterase. são
absorvidos pela pele, por ingestão ou por inalação. Sua ação se dá pela inibição de
enzimas colinesterases, especialmente a acetilcolinesterase, levando a um acúmulo
de acetilcolina nas sinapses nervosas, desencadeando uma série de efeitos
parassimpaticomiméticos.
(MANUAL
DE
VIGILÂNCIA
POPULAÇÕES EXPOSTAS A AGROTÓXICOS, 1996).
DA
SAÚDE
DE
24
3.4.4.1 Carbofurano
Chamado também de Furadan® da FMC Química do Brasil LTDA e
Curaterr (Figura 4), com nome oficial pela IUPAC de 2,3-diidro-2,2-dimetilbenzofuranil-metilcarbamato, cuja fórmula molecular pode ser representada por
C12H15NO3 (Figura 3), é um inseticida pertencente ao grupo dos carbamatos,
comumente utilizado na rizicultura (STEPHENSON; CHOI; OLMOS-JERVZ, 1984) e
que
possui
um
amplo
espectro
de
ação,
pois
apresenta
propriedades
inseticidas,acaricidas e nematicidas. No Brasil, o Carbofurano é comercialmente
encontrado pelo nome de Furadan, Carborano e Ralzer, vendidos em diferentes
formulações. O Carbofurano apresenta alta toxicidade para peixes e, menor
toxicidade para moluscos e crustáceos marinhos. (KENNISH, 1996). O Carbofurano
liga-se reversivelmente à enzima acetilcolinesterase, inibindo a ação desta sobre a
acetilcolina. A acetilcolina é uma substância neurotransmissora liberada no interior
das junções das células nervosas, rovocando a propagação do impulso nervoso de
uma célula para outra. Para que ocorra a transmissão de um novo impulso nervoso,
a acetilcolina é hidrolisada pela enzima acetilcolinesterase existente na junção. Esta
catálise enzimática ocorre devido à especificidade estrutural do substrato de ligação
da enzima que a acetilcolina apresenta. (LEHNINGER, 1991). Devido às
semelhanças na estrutura molecular com o substrato de ligação (acetilcolina), o
Carbofurano atua como um inibidor competitivo da enzima.
Figura 3 - Imagem da estrutura química molecular do inseticida – nematicida
carbofurano
Fonte: Disponível em: <http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/88/Carbofuran.png.
25
Figura 4 - Foto da embalagem da comercial do inseticida – nematicida
carbofurabo
Fonte: Disponível em:<http://www.agromanual.cz>.
3.5 Toxicidade
3.5.1 Toxicidade de agrotóxicos
A grande variedade de compostos produzidos pela atividade humana ao
longo de sua evolução e principalmente com o avanço tecnológico, onde os resíduos
dessas atividades passaram a ser prejudiciais ao meio ambiente e aos seres que o
habitam, criou-se a necessidade de uma ciência que estudasse os efeitos tóxicos
nos organismos expostos a essas substâncias. Essa ciência é denominada de
toxicologia e pode ser definida como: “a ciência que define os limites de segurança
dos agentes químicos, entendendo-se por segurança a probabilidade de uma
substância não produzir danos em uma situação específica” (SCHVARTSMAN,
1985, p. 20).
Com relação a toxicidade a sua definição diz que ela é uma propriedade
inerente do agente químico que produz efeitos danosos a um organismo quando
este é exposto, durante um certo tempo, a determinadas concentrações. (CETESB,
1992). Os chamados agentes tóxicos “são substâncias ou outros materiais, tais
como formulações, efluentes líquidos ou águas continentais, que podem causar
efeitos deletérios quando em contato com os organismos-teste”. (CETESB, 1987,
p.12).
26
A toxicidade de um composto químico depende da exposição, da
suscetibilidade do organismo, das características químicas do agente e de fatores
ambientais. (TOMITA; BEYRUTH, 2002). As espécies possuem suscetibilidades
diferentes de acordo com seu aparato metabólico, seus hábitos alimentares,
comportamento, fase de desenvolvimento, dentre outros aspectos, podendo estar
sujeitas às exposições aguda e/ou crônica.
Na exposição aguda, os organismos entram em contato com o composto
químico num evento único ou em eventos múltiplos que ocorrem num pequeno
período de tempo, geralmente variando de horas a dias. Os efeitos são imediatos,
embora seja possível a produção de efeitos retardados similares àqueles resultantes
de exposição crônica. (RAND; PETROCELLI, 1985).
Já na exposição crônica, normalmente os organismos são expostos a
baixas concentrações do agente tóxico que é liberado continuamente ou com
alguma periodicidade num longo período de tempo (semanas, meses ou anos), mas
pode também induzir a efeitos rápidos e imediatos, como os efeitos agudos, em
adição aos efeitos que se desenvolvem lentamente. (RAND; PETROCELLI, 1985).
3.5.2 Ecotoxicologia
A ecotoxicologia descreve a relação entre os poluentes químicos, o
ambiente em que são liberados e a biota naquele ambiente. Por isso, essas
substâncias devem ser bem estudadas, para que seus riscos potenciais possam ser
muito bem definidos, e medidas para atenuar seus prováveis impactos devem ser
muito bem determinadas por meio de ações regulatórias e técnicas. (STÜTZER et
al., 2003).
O estudo ecotoxicológico nos permite analisar o impacto potencialmente
deletério de substancias ou compostos químicos, que constituem poluentes
ambientais, sobre os organismos vivos, causados pelas atividades antrópicas
(Figura 5 e Figura 6). (HINTON, 2005).
27
Figura 5 - Desenho esquemático demonstrando os níveis de avaliação
ecotoxicológicos
Fonte: Do Autor.
Biodegradação é a decomposição de uma substancia orgânica, pela ação
dos organismos vivos, normalmente micororganismos e, em especial, as bactérias.
Algumas substancias de decompõem mais rapidamente e de forma mais completa
que outras. A biodegradação completa resulta em um composto em água e dióxido
de carbono. Algumas substancias podem se degradar em moléculas intermediárias
menores. Essa é a chamada degradação primária. Essas moléculas normalmente
são intermediarias no processo finas de biodegradação; porém, em alguns casos,
elas podem ser mais persistentes ou tóxicas que o poluente original. Este processo
pode ocorrer sob condições aeróbicas (com oxigênio) e anaeróbicas (sem oxigênio).
(HINTON, 2005).
O acumulo de qualquer produto químico nas células de um organismo
vivo, em concentrações mais elevadas do que as encontradas no seu meio é
chamado de bioacumulação, que pode ser de forma direta através de ambiente que
os
envolve
(bioconcentração)
e
indiretamente
a
partir
da
alimentação
(biomagnificação). O volume de bioacumulação depende do equilíbrio entra a taxa
pela qual a substância entra nas células do organismo e a velocidade a qual ela é
decomposta ou excretada. Se um uma pequena quantidade de poluente, ele pode
28
ser capaz de eliminá-lo sem acumulo significativo; entretanto, se o organismo for
incapaz de eliminar o contaminante de seu corpo, haverá bioacumulação. De fora
alternativa, quando um ambiente estiver severamente contaminado, um organismo
poderá absorver uma quantidade maior da substância que aquela que ele pode
excretar. Haverá bioacumulação a não ser que se reduza a concentração do
contaminante. À medida que se sobe o nível trófico maior será a quantidade de
químicos acumulados no ser vivo, verifica-se que nos animais predadores os valores
de concentração são mais elevados que nos animais que estes se alimentam.
(HILTON, 2005).
Figura 6 - Desenho esquemático dos processos estudados pela ecotoxicologia
Fonte: Do autor.
3.6 Artemia sp.
Artemia sp. (Crustacea, Anostraca) é um microcrustáceo de água salgada
(Figura 7), encontrado em muitos ambientes marinhos do planeta (NUNES et al.,
2006) o qual é utilizado como alimento vivo para peixes, sendo seus cistos
encontrados facilmente em lojas de aquaristas. O ciclo de vida da Artemia sp. tem
29
início pela eclosão de cistos dormentes, os quais são embriões encapsulados
metabolicamente inativos. Esses cistos podem permanecer no estado dormente por
muitos anos, desde que mantidos em lugar sem umidade. Quando esses cistos
entram em contato com água salgada, eles se tornam hidratados e reassumem o
seu desenvolvimento. (GOMES, 1986 apud BENASSI, 2004).
A utilização de Artemia sp. (Figura 7) como organismo bioindicador
remonta o início da década de 70. Vários trabalhos das mais variadas áreas do
conhecimento utilizam este microcrustáceos em testes de toxicidade aguda. Os
testes de toxicidade aguda têm como objetivo avaliar a sobrevida de indivíduos
expostos a um agente ou amostra a ser analisada, por um determinado período de
tempo. Preferencialmente, estudos utilizando Artemia sp. em testes de toxicidade
são voltados à análise de efluentes líquidos como efluentes de mineração de carvão
(BENASSI, 2004), efluentes de industrias têxteis (GRINEVICIUS, 2006; SOUZA;
FORGIARINI; SOUZA, 2007) e efluentes de aterros sanitários. (SILVA; SANTANNA
JR.; DEZOTTI, 2004). Possivelmente esse interesse se deva às facilidades que o
teste apresenta como baixo custo, rapidez e simplicidade. (BENASSI, 2004).
Figura 7 - Imagem do crustáceo Artemia salina
Fonte: Disponível em: <http://www.orni-ex.com/zoocultura/?Artemia>.
3.6.1 Allium cepa L.
A espécie Allium cepa L. (Figura 8), popularmente conhecida como
cebola, foi classificada anteriormente dentro da família Liliaceae e atualmente está
30
incluída na família Alliaceae, dentro da ordem Liliales (SOUZA; LORENZI, 2005).
Plantas do gênero Allium têm sido utilizadas na avaliação da toxicidade de efluentes
e muitos compostos tóxicos, sendo que o parâmetro empregado mais comumente
para estabelecer a relação entre a concentração e a toxicidade do efluente é a
inibição do crescimento de raiz (ARAMBASIC et al., 1995; SMAKA-KINCL et al.,
1996; JOS et al., 2003; JOS et al., 2005).
É um método simples, rápido, de fácil execução (ARAMBASIC et al.,
1995; SMAKA-KINCL et al., 1996), que consiste em expor a base dos bulbos de A.
cepa às substâncias poluentes ou aos efluentes que se deseja efetuar
biomonitoramento (CHANDRA et al., 2005; FISKESJO, 1985) durante um
determinado período de tempo. Ao final da exposição procura-se medir o
comprimento das raízes e realizar a comparação com um grupo controle. Pode-se
também realizar o cálculo da RC50, determinada como a concentração capaz de
reduzir o crescimento das raízes dos indivíduos expostos às amostras em 50%,
quando comparado ao controle negativo. (SAXENA; CHAUHAN; GUPTA, 2005;
BORTOLOTTO et al., 2006; TEIXEIRA et al., 2007).
Figura 8 - Imagem do vegetal Alliun Cepa (cebola)
Fonte: Disponível em: <http://www.steve.gb.com/images/plants/allium_cepa_%5Bbulbs%5D.jpg>.
3.7 Genotoxicidade
Por volta dos anos 50 e 60 a ecologia e a genética se uniram e a partir
daí, foram desenvolvidos os primeiros testes rápidos e eficientes que são
empregados em estudos de genotoxicidade. (VILLELA et al., 2003). Dentre os
31
principais testes, podemos citar os de avaliação da freqüência de aberrações
cromossômicas, troca de cromátides irmãs, formação de adutos de DNA, ensaio
cometa (que avalia quebras no DNA) e medição da freqüência de micronúcleo e
outras anomalias nucleares. (BOMBAIL; GORDON; BATTY, 2001). Genotoxicidade
é um termo geral que se refere as alterações na estrutura geral ou na disposição dos
cromossomos (clastogenicidade), ou seqüência de pares de bases do DNA
(mutagenicidade) por exposição a agentes tóxicos. (AL-SABTI;METCALFE, 1995).
Análises de genotoxicidade são executadas em bioindicadores de
toxicidade, ou de efeitos adversos, que podem ser definidos como: "qualquer
resposta biológica, ao nível do indivíduo ou a um nível inferior, a um ambiente
químico, que traduz a exposição a esse ambiente"; alterações bioquímicas,
fisiológicas e comportamentais incluem-se nesta. (W.H.O., 1993; CAPELA, 2001).
3.8 DNA – Estrutura
Há pouco mais de 50 anos os cientistas descobriram os genes, onde estão
contidas as informações hereditárias passadas de geração a geração, constituídos
pelo ácido desoxirribonucléico, o DNA (do inglês desoxirribonucleic acid), sendo
considerada a principal das macromoléculas biológicas, como um repositório das
informações genéticas. As seqüências de nucleotídeos do mesmo codificam
estruturas primárias de todos os RNAs e proteínas celulares e, por meio de enzimas,
pode afetar indiretamente a síntese de todos os constituintes celulares. (ALMEIDA,
2006). O DNA foi descoberto em meados do século XIX pelo cientista suíço Johann
Fridrich Miescher (1844 – 1895) em seus experimentos com leucócitos; mas
somente em 1953 um modelo tridimencional foi postulado pelo biólogo James D.
Watson e o físico Francis H. C. Crick para a molécula de DNA.
32
Figura 9 - Modelo tridimencional do DNA
Fonte: Proposto por WATSON; CRICK, 1953, p. 43.
Este consiste de duas cadeias helicoidais de DNA que se enrolam ao
redor do mesmo eixo formando uma dupla hélice que gira no sentido da mão direita
(DNA A e B), sendo o que DNA Z possui uma dupla hélice girando no sentido da
mão esquerda. As desoxirriboses ficam externas em relação às bases nitrogenadas,
expostas ao meio aquoso. As ligações fosfodiéster nas duas fitas estão em direções
opostas (uma na direção 5’ → 3’ → e a outra 3’→ 5’) sendo antiparalelas. Os anéis
aromáticos das bases nitrogenadas são hidrofóbicos e ficam orientados para o
interior, quase perpendiculares ao eixo da hélice (Figura 10). (NELSON; COX,
2002). O espaço entre uma fita e outra forma um sulco que é ligado por pareamento
das bases através de pontes de hidrogênio. (MARZZOCO, 1999). As bases
nitrogenadas derivadas das purinas são as adeninas (A) e as guaninas (G), e as
derivadas das pirimidinas são as citosinas (C) e as timinas (T). O pareamento das
bases da cada fita se dá de maneira específica, sempre uma purina com uma
piridimina, especificamente: adenina (A) com timina (T) e citosina (C) com guanina
(G). Com isso se mantém em uma seqüência de DNA, a mesma quantidade de
adeninas e timinas e a mesma quantidade de citosinas e guaninas. A dupla hélice de
DNA é, portanto mantida por duas forças: as pontes de hidrogênio formadas entre as
bases complementares e por interações hidrofóbicas. A complementariedade entre
as duas fitas, possibilita que uma sirva de molde para a síntese da outra, mantendo
a informação genética intacta quando passada de célula a célula. (SILVA;
ERDTMANN; HENRIQUES, 2003).
33
Figura 10 - Bases nitrogenadas
Fonte: ALMEIDA, 2006, p. 52.
3.9 DNA - Danos e sistema de reparação
Os organismos vivos estão freqüentemente expostos a agentes
ambientais que podem induzir modificações químicas no DNA. As lesões nesta
molécula podem ser induzidas por agentes químicos, provenientes do meio
ambiente ou resultantes de reações químicas que ocorrem nas próprias células; ou
ainda por radiações, tais como a luz ultravioleta (UV) e raios-X.
Estas modificações na estrutura do DNA são prejudiciais às células, uma
vez que podem prejudicar processos vitais, tais como a duplicação do DNA e a
transcrição
gênica.
Elas
também
podem
causar
mutações
e
aberrações
cromossômicas, fenômenos estes que podem levar ao desenvolvimento de
processos cancerosos e morte celular. A detecção destes produtos e seus prováveis
efeitos nos organismos é importante no estudo do impacto que eles podem trazer às
populações animal, vegetal e principalmente, humana. (COSTA; MENK, 2000).
Os sistemas de reparo do DNA são normalmente específicos para uma
determinada classe de danos: anormalidades estruturais ou de “mismatch” nas
forquilhas de replicação são separadas por reparo “mismatch”, quebras de fita dupla
são reparadas por processos de recombinação homologa, bases danificadas são
usualmente reparadas por reparo por oxidação de bases, e lesões que promovem
distorções no DNA são reparadas por reparo por excisão de nucleotídeos.
(DEMPLE; HARRISON, 1994).
As células vivas desenvolveram uma série de sistema enzimáticos que
reparam o dano ao DNA de uma variedade de modos. A baixa taxa de mutação
34
espontânea é indicativa da eficiência destes sistemas de reparo. Podemos pensar
na taxa de mutação espontânea como estando em ponto de equilíbrio entre a taxa
na qual surge um dano pré-mutacional e na taxa na qual os sistemas de reparo
reconhecem este dano e restauram a seqüência normal de bases. A falha nesses
sistemas pode levar uma taxa de mutação mais alta. (GRIFFITHS, 2006).
35
4 MATERIAL E METODOS
4.1 Teste ecotoxicologicos
4.1.2 Teste cometa
Dentre os mais versáteis métodos para quantificação de danos ao DNA,
encontra-se o teste cometa, pois apresenta baixo custo e boa reprodutibilidade.
(COLLINS, 2004). Este método foi introduzido por Singh e colaboradores em 1988,
adaptado de Ostling and Johanson de 1984. O método baseia-se na corrida
eletrorética dos fragmentos de DNA de indivíduos expostos a um agente tóxico,
seguido da quantificação dos danos provocados ao DNA em função do comprimento
ou arrasto da “cauda” formada pelos fragmentos (Figura 7). A partir desse princípio
criou-se o nome de Teste Cometa. (OLIVE; BANÁTH, 2006).
Há dois métodos amplamente conhecidos de teste cometa diferenciados
pelo pH a ser utilizado durante o processo de corrida. O método alcalino descrito por
Singh e colaboradores (1988) utiliza pH 13 a 13,5 enquanto o método neutro de
utiliza pH entre 7 e 7,5. A diferença de aplicação de ambos os métodos é quanto à
sensibilidade. O método alcalino é mais sensível (de uma a duas vezes), pois induz
ao desenovelamento do DNA, facilitando a corrida dos fragmentos. O método neutro
não induz ao desenovelamento do DNA, o que reduz a sensibilidade da corrida, mas
aumenta a especificidade, uma vez que apenas quebras simples são identificadas
neste procedimento. (ROJAS, LOPES, VALVERDE, 1999).
Segundo Møller (2006), o termo “comet assay” (Teste Cometa) foi citado
em mais de 2390 vezes desde a publicação do primeiro protocolo em 1984 até o ano
de 2005 no Medline Database, o que demonstra claramente como este método hoje
é um dos mais utilizados no meio científico.
O teste cometa é empregado para análise de vários agentes, sendo que a
versatilidade com a qual o teste pode ser aplicado aumenta mais ainda sua
reprodutibilidade, isso porque os organismos e tecidos utilizados para o teste são
inúmeros. Segundo Olive e Banáth (2006), virtualmente o teste cometa pode ser
36
aplicado a qualquer célula eucariótica existente.
A aplicação do Teste Cometa em células de organismos como Allium
cepa (NAVARRETE, 1997) tem sido utilizada no monitoramento de ambientes
contaminados por poluentes potencialmente genotóxicos (DEVAUX et al., 1998;
COLLINS, 2004), o que faz deste biomonitor um especial organismo teste, uma vez
que este é também utilizado em testes de toxicidade.
Figura 11 - TESTE COMETA: Núcleos celulares foram isolados e submetidos a
uma corrente elétrica (eletroforese). A partir dos resultados, esses núcleos
receberam uma pontuação de zero (sem dano) a quatro (dano máximo),
baseado no tamanho da "cauda do cometa", que corresponde à quantidade de
fragmentos do DNA.
Fonte: Disponível em: <http://www.clicrbs.com.br/zerohora/jsp/default2.jsp?>.
4.1.3 Teste de toxicidade aguda com Artemia sp.
Para a realização dos ensaios ecotoxicológicos foi utilizado o agroquímico
, inseticida – nematicida do grupo químico metilcarbamato de benzofuranila com
marca comercial de Furadan® 350 SC e registrado no MAPA (ministério da
agricultura, pesca e abastecimento sob o nº 0538591, adquirido comercialmente em
lojas especializadas do comercio local.
.Os teste de toxicidade aguda foram realizados conforme método de
Meyer e colaboradores (1982) com algumas modificações (Figura 8). Cistos de
Artemia salina foram incubados durante 24 horas em solução de sal marinho
37
sintético (30g/L), com aeração e iluminação constantes. Após a eclosão, indivíduos
(n=10) do microcrustáceo foram incubados em placas “multiwell” durante 24 horas a
25ºC, na ausência de luz ,nas concentrações de 0,156, 0,319, 0,625, 1,250, 2,500,
5,000, 10.00 e 20,00mg/L sendo o controle negativo (concentração 0%). Após as
24h de incubação, foi analisada a morte dos indivíduos e calculada a CL50 através
do método matemático Trimmed Spearman-Karber. (HAMILTON et al., 1977). A CL50
é definida como a concentração na qual ocorre a mortalidade em 50% dos
organismos
bioindicadores,
quando
expostos
aos
percolados
em
estudo.
(SVENSSON et al., 2005).
Figura 12 - Esquema simplificado da preparação e execução do Teste de
toxicidade aguda com Artemia sp.
Fonte: Do Autor.
4.1.4 Teste de inibição do crescimento de raízes em Allium cepa L.
A avaliação da toxicidade subaguda foi realizada através do teste de
inibição de crescimento de raízes de Allium cepa descrita por Fiskesjö (1985), com
modificações (Figura 9). Para tanto, indivíduos de A. cepa. (n=6) obtidos no
comércio local, foram expostos por sete dias de 20mg/L (concentração utilizada no
uso do carbofurano na agricultura) bem como à água mineral comercial (controle
negativo; concentração 0%), a 25oC e ao abrigo da luz, sendo as amostras
38
renovadas diariamente. Ao final da exposição, foi medido o comprimento das raízes
e foi removida com o auxílio de um bisturi a maior raiz e medida em uma balança de
precisão.
Figura 13 - Esquema simplificado da preparação e execução Teste de inibição
do crescimento de raízes em Allium cepa L.
Fonte: Do Autor.
4.2 Teste de genotoxicidade
4.2.1 Teste de fragmentação de DNA (Teste Cometa)
A fragmentação de DNA em Allium cepa (n=5), expostas nas mesmas
condições dos ensaios de inibição de crescimento de raízes, foi avaliada pelo Teste
Cometa proposto por Singh e colaboradores (1988), esquematizado na (Figura 10).
Após o período de exposição, a porção apical das raízes dos indivíduos de A. cepa
foram removidas com o auxílio de um bisturi e armazenadas em microtubos. As
raízes foram maceradas com solução de extração de núcleo até a formação de um
homogenato. Em seguida, o homogenato foi misturado em agarose de baixo ponto
de fusão (0,75%) e espalhado sobre lâminas de microscópio cobertas com agarose
1,5%. Após ficarem mergulhadas em solução de lise (2,5M NaCl; 100mM EDTA;
10mM TRIS; 1% de Triton X-100; 10mL DMSO) a 4ºC por 2 horas, as lâminas
39
passaram por eletroforese horizontal alcalina (10N NaOH; 200 mM EDTA; pH ≥13)
por 15minutos a 300mA e 25V. Após a eletroforese, as lâminas foram lavadas com
tampão de neutralização (0,4M TRIS; pH 7,4), fixadas com etanol, coradas com
nitrato de prata e observadas ao microscópio óptico.
Para cada indivíduo foram analisadas aleatoriamente imagens de 100
núcleos (50 núcleos por lâmina, em duplicata) e o tamanho dos cometas (região
nuclear + cauda) foi classificado visualmente dentro de 5 classes de dano (Figura
15), variando de 0 (cometas sem dano) a 4 (cometas com dano máximo), de acordo
com metodologia proposta por Collins e colaboradores (1997) (Figura 11).
Figura 14 - Esquema simplificado das etapas de preparação, lise, corrida
eletroforética, neutralização, e coloração das lâminas no Teste Cometa
Fonte: Adaptado de SILVA; ERDTMANN; HENRIQUES, 2003, p. 36.
40
Figura 15 - Classificação de danos ao DNA através das Classes de Dano
(Classes 0 a 4)
Fonte: Adaptado de SILVA; ERDTMANN; HENRIQUES, 2003, p. 39.
Para cada indivíduo foram calculados dois parâmetros de avaliação:
Índice de Dano (ID), definido como o dano total sofrido pelo indivíduo e a Freqüência
de Dano (FD), definida como o número de células que sofreram algum tipo de dano
expresso em forma de percentagem. Para o cálculo do Índice de Dano admite-se a
seguinte fórmula: ID = [(Nº de cometas classe 0 x 0) + (Nº de cometas classe 1 x 1)
+ (Nº de cometas classe 2 x 2) + (Nº de cometas classe 3 x 3) + (Nº de cometas
classe 4 x 4)]. Assim, o Índice de dano varia entre a pontuação 0 (sem dano) a 400
(dano máximo) por indivíduo. Para o cálculo da Freqüência de Dano admite-se o uso
da seguinte fórmula: FD = [(Nº de cometas classe 1) + (Nº de cometas classe 2) +
(Nº de cometas classe 3) + (Nº de cometas classe 4)]. Deste modo, a Freqüência de
Dano varia entre 0 (sem células lesionadas) a 100 (todas as células lesionadas) por
indivíduo.
4.3 Análise estatística
A CL50 foi calculada através do método matemático Trimmed SpearmanKarber (HAMILTON et al., 1977), usando o software Probitos®. As análises
estatísticas dos resultados foram realizados pelo t. Para tanto foi utilizado foi utlizado
o software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Inc. San Diego, CA, USA), admitindo-se
41
um nível de significância de *(p<0,05), **(p<0,01) e ***(p<0,001).
42
5 RESULTADOS
5.1 Teste de toxicidade aguda co Artemia SP.
A Figura 16 mostra os resultados obtidos (expressos em média das cinco
replicatas), referentes ao teste de toxicidade aguda com Artemia salina após 24
horas de exposição à solução de Carbofaran. A partir da mesma, pôde-se observar
que na concentração menor de 0,3mg/lL o teste demonstrou mortalidade de cerca
de 10% dos indivíduos contados.
A partir das concentrações de 1,25mg/L houve um aumento, gradativo na
mortalidade dos indivíduos de cerca de 40 a 50%. A partir das concentrações de
10,00 mg/L ocorreram 100% da mortalidade dos mesmos, mantendo-se assim até a
concentração de 20,00 mg/L. Deste modo a CL50 do Carbofuran foi estimada em
1,44 mg/L.
Figura 16 - Índice de mortalidade (%) obtido através do Teste de toxicidade
aguda utilizando Artemia salina em concentrações (%) seriadas da solução
com o Carbofurano. Índice de mortalidade expresso como média (%) das cinco
replicatas
Fonte: Do autor.
43
5.2 Teste de Fitotoxicidade em Allium cepa
Os resultados do teste de fitotoxicidade em Allium cepa expostos a
solução com carbofurano (20mg/L) por sete dias bem com água mineral comercial
(controle negativo) estão apresentados na Figura 17, expressos por média ± desvio
padrão (M ± DP).
Os indivíduos do grupo exposto ao carbofurano apontaram uma média de
crescimento de raiz de 0,86 ± 0,22cm que quando comparada ao crescimento de
raízes do grupo controle com 4,76 ± 1,43cm, demonstrou ser significantemente
menor (p<0,001) (Figura 13).
Figura 17 - Resultado do Teste de fitotoxicidade em Allium cepa, baseado no
crescimento de suas raízes quando expostas a solução de carbofurano. ** = p<
0,001
Fonte: Do Autor.
Quando avaliado o ganho de biomassa das raízes de Allium cepa do
grupo teste, o índice foi de: 6,93 ± 1,94.mg quando comparada ao grupo controle
com 30,50 ± 12,47mg, demonstrou ser significantemente menor com (p<0,001)
(Figura 18).