UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
FACULDADE DE BIOMEDICINA
LUANA FERREIRA BARBOSA
DISTRIBUIÇÃO DOS FENÓTIPOS DE GRUPOS SANGUÍNEOS ABH E
LEWIS NA INFECÇÃO PELA HELICOBACTER PYLORI.
BELÉM
2011
LUANA FERREIRA BARBOSA
DISTRIBUIÇÃO DOS FENÓTIPOS DE GRUPOS SANGUÍNEOS ABH E
LEWIS NA INFECÇÃO PELA HELICOBACTER PYLORI.
Trabalho de conclusão de curso
apresentado
à
Faculdade
de
Biomedicina
da
Universidade
Federal do Pará, como requisito
parcial para a obtenção do grau de
Bacharelado em Biomedicina.
Orientadora: Profª. Drª. Tereza Cristina de Oliveira
Corvelo
BELÉM
2001
LUANA FERREIRA BARBOSA
DISTRIBUIÇÃO DOS FENÓTIPOS DE GRUPOS SANGUÍNEOS ABH E
LEWIS NA INFECÇÃO PELA HELICOBACTER PYLORI.
Trabalho de conclusão de curso
apresentado à Faculdade de Biomedicina
da Universidade Federal do Pará, como
requisito parcial para a obtenção do grau
de
Bacharelado
em
Biomedicina,
aprovado
com
o
conceito
9,75
(EXCELENTE).
Belém (PA), 14 de dezembro de 2011.
Banca Examinadora:
Profª. Drª. Tereza Cristina de Oliveira Corvelo
ICB - UFPA
(orientadora)
Profª. Drª. Délia Cristina Figueira Aguiar
(UFPA)
Profª. Msc. Rosane do Socorro Pompeu de Loiola
(LACEN-PARÁ)
Profª. Drª. Rita de Cassia Mousinho Ribeiro - Suplente
(ICB- UFPA)
BELÉM
2011
i
A Maria de Nazaré Ferreira Barbosa
ii
AGRADECIMENTOS
Agradeço, primeiramente, a Deus por tornar tudo possível.
Agradeço a minha mãe, Maria de Nazaré Ferreira Barbosa, por toda a dedicação
esforço que sempre fez para que eu pudesse chegar até aqui.
A minha orientadora Doutora Tereza Cristina de Oliveira Corvelo pela grande
contribuição para o desenvolvimento deste trabalho.
Ao laboratório de Imunogenética e a toda a equipe, pelos conhecimentos adquiridos.
Aos meus professores pelos conhecimentos repassados e pela dedicação.
A minha família pelo apoio, em especial a minha avó, Sabina Ferreira Barbosa.
Aos meus colegas de classe pelo companheirismo e momentos descontraídos.
Ao meu namorado, Mizael Trindade Barros, por toda ajuda prestada e pela ótima
companhia.
Muito Obrigada!
iii
RESUMO
Introdução:Helicobacter pylori é uma bactéria gram-negativas, curva-espiralada,
microaerófila, especializada na colonização do estômago humano, que infecta mais
da metade da população mundial. Embora a maioria dos indivíduos infectados não
mostrem sintomas clínicos, a infecção persistente pode causar úlcera gástrica,
gastrite crônica atrófica com desenvolvimento de metaplasia intestinal, displasia e
carcinoma gástrico. Objetivos: Investigar em pacientes com patologias gástricas da
região Amazônica os antígenos de grupo sanguíneos ABO e Lewis com relação à
soroprevalência da infecção pela H. pylori. Material e métodos: Foram colhidas 65
amostras de sangue de indivíduos com patologias gástricas provenientes de uma
população triíbrida do Estado do Pará e uma amostra de saliva de cada indivíduo,
para a fenotipagem ABO e Lewis aos níveis eritrocitário, pelo método de
hemaglutinação, e salivar, por dot-Elisa. Para a detecção de anticorpos anti-H. Pylori
específicos foi utilizado um ensaio quantitativo imunoenzimático (ELISA)
Resultados: Entre os pacientes testados, 92% (60/65) apresentaram IgG anti-H.
pylori específico. Quando comparamos o fenótipo O Le (a-b+) e os outros fenótipos
do sistema ABO e Lewis com a presença da infecção pelo H.pylori nos pacientes
estudados não encontramos uma associação estatisticamente significantiva (p >
0,05). A distribuição dos fenótipos de grupos sanguíneos ABO e Lewis de pacientes
com doenças gástricas foram consistentes com a prevalencia descrita na população
de Belém. Conclusão: A taxa de soroprevalência da infecção por Helicobacter pylori
foi de 92% na amostra de pacientes estudada. Neste estudo não encontramos
associação significativa entre o fenótipo de grupo sanguíneo O Leb e a infecção por
H. pylori.Nos pacientes com patologias gástrica, observou-se uma discrepância em
relação aos fenótipos Lewis entre o nível salivar e eritrocitário, sugerindo que esta
alteração seja reflexo da perda desses antígenos na mucosa gástrica.
Palavras-chave: Helicobacter pylori, ABO, Lewis.
iv
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO
1
1.1.
HISTÓRICO
1
1.2.
CARACTERÍSTICAS DA BACTÉRIA HELICOBACTER
PYLORI
2
1.2.1. Morfologia
2
1.2.2. Constituição genética
2
1.2.3. Fatores de virulência
3
1.2.3.1. Citotoxina associada ao gene A (cagA)
3
1.2.3.2. Citotoxina vacuolizante (VacA)
3
1.2.3.3. Adesina ligante de antígenos de grupo
sanguíneo (BabA)
4
1.2.3.4. Urease
4
1.3.
EPIDEMIOLOGIA
6
1.4.
PATOLOGIAS ASSOCIADAS À INFECÇÃO
7
1.5.
GRUPOS SANGUÍNEOS ABO E LEWIS
8
1.6.
ASSOCIAÇÃO DOS ANTÍGENOS DE GRUPOS
SANGUÍNEOS ABH E LEWIS E A INFECÇÃO
PELA H. PYLORI.
10
1.7.
RESPOSTA IMUNE À INFECÇÃO
10
1.8.
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS
12
2.
OBJETIVOS
13
2.1.
GERAL
13
2.2.
ESPECÍFICOS
13
3.
MATERIAL E MÉTODOS
14
3.1.
MARERIAL
14
3.2.
MÉTODOS
15
3.2.1. Coletado sangue
15
3.2.2. Coleta da saliva
15
3.2.3. Determinação dos fenótipos ABO e Lewis no sangue
15
3.2.4. Determinação dos fenótipos Lewis e ABO ao nível
salivar.
3.2.5. Detecção de anticorpos anti-H. Pylori específicos.
16
16
v
3.3.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
17
4.
RESULTADOS
18
5.
DISCUSSÃO
25
6.
CONCLUSÃO
28
7.
REERÊNCIAS
29
1
1.
INTRODUÇÃO
1.1.
HISTÓRICO
Helicobacter pylori é uma bactéria que infecta mais da metade da
população mundial (Atherton et al, 2006). Essa bactéria foi, primeiramente
observada na mucosa gástrica de cachorro em 1890 (Bizzozero et al, 1892), sendo
que muitas espécies apresentam variedades do gênero Helicobacter em seus
estômagos.
Em 1982 a bactéria foi descrita pela primeira vez em humanos. Em seus
estudos, os pesquisadores Marshall (1983) e Warren (1983) observaram uma
grande quantidade de bactéria no muco gástrico de pacientes com gastrite crônica e
úlcera duodenal, que acreditavam ser do gênero Compylobacter.
Estudos posteriores, principalmente ao nível genético, resultaram na
criação de um novo gênero, Helicobacter no qual a bactéria previamente descrita por
Marshall e Warren passou a pertencer como espécie denominada Helicobacter
pylori. (Goodwin et al, 1989).
Antes do primeiro isolamento da bactéria e sua documentação,
acreditava-se que o estômago fosse um ambiente estéril, devido a sua acidez,
impossibilitando que este fosse nicho ecológico de qualquer organismo (Cothi et al,
1989; Morris et al, 1989). No entanto, a H. pylori é totalmente adaptada ao estômago
humano, seu principal reservatório (Lambert et al, 1995).
Embora a maioria dos indivíduos infectados por essa bactéria não
mostrem sintomas clínicos, a infecção persistente pode causar úlcera gástrica,
gastrite crônica atrófica com desenvolvimento de metaplasia intestinal, displasia e
carcinoma gástrico (Correa & Houghton, 2007).
2
1.2.
CARACTERÍSTICAS DA BACTÉRIA HELICOBACTER PYLORI
1.2.1. Morfologia
A Helicobacter pylori é uma bactéria de forma curva espiralada, mede
aproximadamente 0,5 µm de diâmetros e 3 a 5 µm de comprimento. Ela é um
organismo de características gram negativas que apresenta de 4 a 6 flagelos
unipolares embainhados que possibilitam que a bactéria se mova livremente em
ambientes viscosos como o muco gástrico. (Marshall et al, 1984)
A H. pylori apresenta-se também na forma rredondada, conhecida como
forma
cocóide
(Catrenich
&
Makin,
1991).
Essa
é
uma
forma
viável
domicrorganismo, que ocorre quando a bactéria encontra-se em ambientes hostis
fora da mucosa gástrica. (Cellini et al, 1994).
A H. pylori é nutricionalmente exigente. Em cultivo seu crescimento
preferencial ocorre a 37°C em meio como o ágar sang ue em condição microaerófila
em uma atmosfera que pode variar de 5 a 10% de dióxido de carbono.
Bioquimicamente ela é uease, catalase e oxidase positiva. (Eaton et al, 1991)
1.2.2. Constituição genética
Em 1997 foi sequenciado o genoma completo da cepa 26695 da H. pylori.
Essa bactéria consiste de um cromossomo circular de 1.667.867 pares e base e
média de 39% de conteúdo de G + C. Cinco regiões do genoma têm composição
diferente de G + C. Uma delas é a ilha de patogenicidade (PAI) cag, Cag - PAI.
(Tomb et al, 1997) cepas com está proteína estão associadas ao desenvolvimento
mais severo de doenças gástircas (Xiang et al, 1997).
3
1.2.3. Fatores de virulência
A infecção pela H. pylori é extremamente comum e assintomática na
maioria dos casos. A infecção crônica, tipicamente adquirida na infância, está
relacionada a uma variedade de doenças severas como úlcera gástrica (Graham et
al, 1992), úlcera duodenal (Hentschel et al, 1993; Marshall et al, 1988) e carcinoma
gástrico (Nomura et al, 1991; Parsonnet et al, 1991). A razão para um indivíduo
desenvolver doenças gástricas pode estar relacionado com a presença de certos
fatores de virulência da H. pylori tais como CagA e VacA e BabA2 em linhagens
bacterianas, que favorecem a colonização bacteriana a partir de interações com
marcadores genéticos do hospedeiro, como os antígenos de grupos sanguíneos
ABH e Lewis.
1.2.3.1. Citotoxina associada ao gene A (cagA)
As formas mais severas das doenças gastrointestinais estão relacionadas
a presença ou ausência da ilha de patogenicidade cagA (cag – PAI) de 40-kb que
contém 31 genes (Marshall et al. 1989). Supõe-se que esta ilha derive de outras
espécies de bactérias devido ao conteúdo GC desta região ser diferente do resto do
genoma da H. pylori. (Finlay & Falkow, 1998). A cag – PAI induz a secreção do
mediador de inflamação, interleucina 8 (IL -8) pelas células epiteliais do hospedeiro,
causando, assim, o aumento da inflamação gástrica e um maior risco do
desenvolvimento de úlcera e câncer gástrico (Censini et al, 1996; Crabtree et al,
1991; 1994). Em humanos há uma grande correlação entre a infecção por H. pylori
positivas para o gene cag e a ocorrência de úlcera e câncer gástrico ( Covacci et al,
1999) .
1.2.3.2.
Citotoxicina vacuolizante (VacA)
O gene vacA está presente em todas as cepas de H. pylori, porém é
expressa em metade delas (Tummum et al, 1993). A expressão da proteína VacA é
responsável pela erosão observada nas células hospedeiras infectadas (Cover,
1996). O gene vacA apresenta duas regiões diferentes: a região sinal (região - s) e a
região média (região - m) (Atherton et al, 1995). A região s apresenta duas formas
4
alélicas, a s1 (que pode ser distinguido como s1a, s1b ou s1c) ou a s2. A região m
apresenta as formas m1 ou m2.
A produção da citotoxina vacuolizante VacA depende da combinação
entre os alelos das regiões s e m: s1/m1, s1/m2. Cepas portadoras da combinação
s1/m1 produzem maior quantidade de toxina do que as cepas com outras
combinações, sendo assim são mais patogênicas.
1.2.3.3.
Adesina ligante de antígenos de grupo sanguíneo (BabA)
O gene babA codifica a proteína BabA (Das & Paul, 2007) que se liga ao
antígeno de grupo sanguíneo Lewis b nas células gástricas. A aderência da bactéria
ao epitélio gástrico favorece a colonização e contribui para sua patogenicidade
(Prinz et al, 2001). O babA permite o contato entre a bactéria e o epitélio e facilita a
liberação de fatores de virulência como o cagA e o vacA. Cepas que expressam
babA, aderem mais firmemente às células epiteliais gástricas, o que evidencia a
influencia deste gene à severidade da doença.
Cepas que possuem BabA, CagA e VacA apresenta elevado risco de
câncer gástrico (Lauren, 1965). O gene babA possui dois alelos distintos, o babA1 e
o babA2. O produto do babA1 é idêntico ao do babA2, entretanto não produz um
transcrito. Cepas H. pylori babA2 positivas são associadas ao aumento do risco de
úlcera péptica, enquanto cepas babA2 negativas são associadas com formas de
gastrite sem complicações (Das & Paul, 2007). Em seu estudo, Gerhard et al.
(Gerhard et al, 1999) demonstraram associação entre o alelo babA2 e a presença de
úlcera péptica e de adenocarcinoma gástrico.
1.2.3.4.
Urease
A adesão da H. pylori a mucosa gástrica humana é essencial para o
sucesso da infecção. Porém o estômago apresenta um meio ácido hostil à
colonização bacteriana. A H. pylori expressa altos níveis de uma enzima potente, a
uréase, que catalisa a hidrólise da ureia resultando na produção de amônia. A
amônia, por sua vez, forma uma nuvem neutralizante que protege a H. pylori da
acidez. Dessa forma, a urease tem se demonstrado essencial para a colonização da
5
bactéria a mucosa gástrica, visto que em experimentos usando animais de
laboratório, bactérias mutantes, ou seja, urease negativa, não foram capazes de
realizar a colonização (Eaton et al, 1991; Tsuda et al, 1994).
Além de necessária para a colonização bacteriana, a urease ativa uma
resposta imune do hospedeiro que causa dano a ele. Essa resposta inclui ativação
de fagócitos e a liberação de citocinas como IL-1, IL-2, IL-8 e TNF-α.b (Makristathis
et al, 1998; Harris et al, 1996). O excesso de amônia pode ser tóxica a mucosa
gástrica.
Nijevitch (1998) reportou uma correlação do grau de gastrite, com a
colonização do microrganismo e resposta IgG – anti-H. pylori com a concentração de
amônia no suco gástrico. A partir de seus resultados pôde sugerir que a atividade da
urease é um indicador do sucesso da infecção e do papel patogênico da H. pylori em
crianças.
6
1.3. EPIDEMIOLOGIA
A Helicobacter pylori é uma bactéria de distribuição cosmopolita
considerada a causa de infecção crônica mais comum em humanos que acomete
mais da metade da população universal (Cave, 1996; 1997).
Há um consenso de que a transmissão da bactéria ocorra por via
interpessoal,l pelas rotas oral-oral (Goodman et al, 1996; Albenque et al, 1990;
Clemens et al, 1996) e/ou fecal-oral (Thomas et al, 1992; Kelly et al, 1994). Infecção
iatrogênica por meio de endoscópios contaminados também pode ocorrer (Axon,
1991; Fantry et al, 1995). Águas contaminadas são vistas como reservatórios
ambientais de H. pylori (Goodman et al, 1996; Sasaki et al, 1999). A infecção pela H.
pylori está presente tanto em países em desenvolvimento quanto em países
desenvolvidos, no entanto a taxa de prevalência nos países em desenvolvimento é
maior em todas as faixas etárias (Patel et al, 1994; Rocha et al, 1993).
Na infância a taxa de prevalência é maior, principalmente nos cinco
primeiros anos de vida (Kodaira et al, 2002) em que o risco para a aquisição da
infecção é mais elevado, já que neste período há um contato mais próximo da
criança com a mãe devido aos cuidados que necessita. (Albenque et al, 1990;
Clemens et al, 1996). A partir do 15 anos o aumento da prevalência passa a ser
lento e constante. Em idosos acima de 60 anos ocorre um lento declínio de
prevalência, explicado pelo fato da mucosa gástrica atrofiar com a evolução da
gastrite causada pelo agente e pelo envelhecimento, o que leva a bactéria a perder
seu nicho ecológico no estômago (Kodaira et al, 2002).
O principal fator de risco para a aquisição da infecção pela bactéria está
relacionado às precárias condições socioeconômicas na infância. Assim, baixa
renda familiar (Graham et al, 1991; Fiedorek et al 1991), baixo nível de escolaridade
dos pais (The Gastrointestinal Phisiology Working Group, 1990), más condições de
higiene e moradia (Goodman et al, 1996), ausência de saneamento básico e água
encanada, dieta e moradia com aglomeração em que há mais de uma pessoa por
quarto (Mendall et al, 1992) são fetores de risco para a aquisição da infecção.
7
Bòren et al (1993), relataram que indivíduos dos grupos sanguíneos O
Lewis b são mais susceptíveis a infecção pela H. pylori, evidenciado, dessa forma a
predisposição genética como fator de risco para a infecção.
1.4. PATOLOGIAS ASSOCIADAS À INFECÇÃO
Um dos maiores fatores para o desenvolvimento de várias doenças
gastrointestinais como gastrite crônica, gastrite atrófica úlceras pépticas, carcinoma
gástrico e linfoma gástrico é a infecção pela H. pylori (Covacci et al, 1999).
Apesar de metade da população humana estar infectada pela bactéria,
80% dos indivíduos permanecem assintomáticos por toda a vida, sem manifestação
clínica. Uma pequena porcentagem dos infectados pela H. pylori desenvolve
neoplasias, o que indica o envolvimento de outros fatores no desenvolvimento de
patologias gastrointestinais (HANSSON et al, 1993; WATANABE et al, 1997). Dessa
forma, fatores bacterianos e do hospedeiro estão diretamente ligados à evolução de
patologia gastrointestinal.
A associação entre a infecção pela H. pylori com o desenvolvimento de
úlcera péptica foi bem estabelecido pela NHI Consensus Conference (1994). Que
estabeleceu que a bactéria está presente em 90% a 100% dos pacientes com úlcera
duodenal e em 70% a 90% dos pacientes com úlcera gástrica. (Marsshal et al, 1994;
Martins et al, 2002)
Pelo fato de estar possivelmente associada ao adenocarcinoma gástrico,
em 1994 a International Agency for Research on Cancer (órgão subordinado a
Organização Mundial de Saúde – OMS) classificou a bactéria como carcinógeno do
tipo 1 para câncer de estômago. Essa classificação foi baseada em estudos
epidemiológicos, que demonstraram uma prevalência mais alta da infecção pela H.
pylori entre pacientes com câncer gástrico que em pacientes de grupo controle
(Williams et al, 1999)
8
Assim como na úlcera péptica, nem todos os indivíduos com câncer
gástrico estão infectados pela H. pylori. Além disso, nem todos os indivíduos
infectados desenvolvem câncer gástrico. Portanto, a etiologia do carcinoma gástrico
é multifatorial e a infecção pela H. pylori é apenas um dos fatores que contribuem
para o desenvolvimento de patologias gástricas (Friedman & Peterson, 1998).
1.5. GRUPOS SANGUÍNEOS ABO E LEWIS
O sistema de grupo sanguíneo ABO foi descoberto em 1990 pelo cientista
Landsteiner, através da comprovação de reações de aglutinação em hemácias
humanas por isoaglutininas (Landsteiner, 1900.). Landsteiner identificou a presença
de antígenos na membrana das hemácias o que mais tarde caracterizou os tipos A,
B, AB e o grupo O, quando não há presença desses antígenos (von Descastello &
Sturli, 1902.)
Estes antígenos, porém, não são expressos apenas nas hemácias mas,
também, nos tecidos e secreções corporais. O gene secretor Se determina a
capacidade de secreção dessas substâncias nos fluidos corporais. Os indivíduos
que manifestam o gene secretor são considerados secretores (genótipos Se/Se ou
Se/se), e os indivíduos que não o secretam são considerados não-secretores
(genótipo se/se) (Henry et al, 1996; Oriol et al, 1986; Watkins, 1980).
Em 1946, Mourant descreveu, pela primeira vez, o sistema Lewis através
da identificação de um antígeno sanguíneo de natureza carboidrática denominado
de Lewis a ou Lea. Em 1948, Andersen descreveu um segundo antígeno para este
sistema denominado Lewis b ou Leb. A descoberta desses antígenos permitiu
determinar a existência de quatro fenótipos: Lewis a, Lewis ab, Lewis negativo e o
fenótipo Lewis b, predominante na maioria das populações humanas (Henry et al,
1995).
Devido o seu grande polimorfismo, os grupos sanguíneos ABO e Lewis
constituem excelentes marcadores populacionais, resultado da ação de genes do
sistema ABO, Secretor e Lewis que codificam glicosiltransferases específicas que
9
atuam no processo de síntese destes antígenos transferindo açucares específicos
para substâncias precursoras, implicando na ocorrência de fenótipos variantes
distintos e geneticamente determinados dentro da mesma população (Le Pendu,
1985).
Os
antígenos
ABO
e
Lewis
são
oligossacarídeos
relacionados
bioquimicamente, produzidos a partir das mesmas substâncias precursoras. As
substâncias A e B são originadas pela ação dos genes A e B, a partir da síntese da
substância H, sob controle de pelo menos dois sistemas genéticos polimórficos H/h
e Se/se. Os genes Se e H dirigem a produção de distintas α-fucosiltransferases, que
trabalham em diferentes cadeias precursoras. O gene Se atua na substância do tipo
1 e o gene H sobre a substância tipo2 (Clausen & Hakomori, 1989).
Em indivíduos secretores, o gene dominante (Se) é a forma ativa no
epitélio glandular, responsável por determinar a produção de antígenos H pelo
tecido, já o gene recessivo (se) é incapaz de produzir antígeno H (Le Pendu, 1985).
10
1.6. ASSOCIAÇÃO DOS ANTÍGENOS DE GRUPOS SANGUÍNEOS ABO E LEWIS
E A INFECÇÃO PELA H. PYLORI.
Alguns indivíduos de fenótipos sanguíneos específicos têm pré-disposição
a diversos agentes patológicos. Assim, certos antígenos nas superfícies das células
poderiam servir como pré-requisito para a aquisição de microrganismos (Schonitzer,
1997).
Em 1953, Aird observou um aumento na frequência de pessoas do grupo
A entre os pacientes com câncer gástrico Além disso, há uma associação ainda
maior entre úlcera péptica e o grupo O (Ilver et al, 1998).
Desde 1994, vêm sendo realizados estudos para mostrar a associação
entre os grupos sanguíneos ABO e Lewis, mais especificamente o grupo O Lewis b.
Bóren et al (1993), relataram que indivíduos do grupo O apresentavam mais
receptores para a H. pylori em relação aos indivíduos dos outros grupos, sendo,
então, mais susceptíveis a infecção pela bactéria. Além disso, mostrou em seu
estudo que o antígeno Lewis b medeia a ligação da H. pylori a mucosa gástrica,
verificando em sua análise que a bactéria se liga ao epitélio gástrico que expressa
Lewis b. Esse achado é confirmado pela demonstração bioquímica da ligação da
adesina BabA da H. pylori ao antígeno Lewis b (Ilver et al, 1998).
1.7. RESPOSTA IMUNE À INFECÇÃO
A resposta imune do hospedeiro à infecção pela H. pylori é caracterizada
por intenso infiltrado de células inflamatórias (células plasmáticas, linfócitos,
neutrófilos, monócitos) na lâmina própria da mucosa gástrica que gera a erosão do
epitélio gástrico (Telford et al, 1997; Aguilar et al, 2001).
O epitélio gástrico atua como uma barreira que impede que a H. pylori
invada a lâmina própria, representando, assim, a primeira linha de defesa ativa
contra a infecção. As células epiteliais da mucosa gástrica, quando na presença de
antígenos da bactéria, secretam mediadores inflamatórios que iniciam a resposta
imune contra ela (Shimoyama & Crabtree, 1998; Suerbaum & Michetti, 2002).
11
A infecção induz as células epiteliais a secretarem citocinas préinflamatórias como a IL8, potente mediador inflamatório, que recruta e ativa
neutrófilos. (Shimoyama & Crabtree, 1998; Suerbaum & Michetti, 2002) Induz,
também, a secreção de outras quimiocinas que atraem neutrófilos (Aguilar et al,
2001).
Os neutrófilos são o componente inicial da resposta inflamatória ao
patógeno. No entanto, quando cronicamente ativados, apresentam propriedades que
contribuem para aumentar a lesão tecidual, pois além de atuarem na fagocitose e na
digestão da bactéria, liberam seus grânulos e substâncias tóxicas (Shimoyama &
Crabtree, 1998; Aguilar et al, 2001; Suerbaum & Michetti, 2002). Apesar de
persistente, a ação dos neutrófilos é ineficaz para a eliminação da H.pylori, devido a
ação de enzimas bacterianas como a catalase e a superóxido desmutase que
protegem a bactéria. (Shimoyama & Crabtree, 1998).
A continua exposição ao patógeno resulta na ativação da resposta imune
celular (Blaser, 1992; Shimoyama & Crabtree, 1998), com estimulação dos linfócitos
T auxiliares. A resposta humoral ocorre na infecção pela H. pylori. Existem
anticorpos, predominantemente do tipo IgG, contra vários antígenos da bactéria,
entretanto eles não conferem proteção nem evitam nova infecção (Goto et al, 1999;
Kato & Ohara, 2000).
12
1.8. MÉTODOS DIAGNÓSTICOS
O diagnóstico da H. pylori pode ser realizado por testes endoscópicos e
não endoscópicos. Os de natureza endoscópicos podem ser examinados por
técnicas de histopatologia, teste da uréase e cultura do material da biópsia gástrica
(Wilcox et al, 1996).
Pelo fato de serem relativamente simples, as provas sorológicas
destacam-se entre os testes não endoscópicos. Existem kits de ensaios
imunoenzimáticos (ELISA) comerciais que demonstram boas sensibilidade e
especificidade, em torno de 95% e 98%, respectivamente.
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é bastante utilizada, podendose detectar a bactéria em diferentes amostras biológicas como biopsia de mucosa
gástrica, fezes, saliva e placa dental (Dunn et al, 1997; Torres et al, 2000; Oderba et
al, 2001)
13
2. OBJETIVOS
2.1. GERAL
Investigar em pacientes com patologias gástricas da região Amazônica os
antígenos de grupo sanguíneos ABH e Lewis com relação à soroprevalência da
infecção pela H. pylori.
2.2. ESPECÍFICOS
- Estimar a soroprevalência da infecção pelo H. pylori entre os indivíduos
com patologias gástricas da população de Belém;
- Estabelecer as freqüências dos fenótipos ABH e Lewis ao nível salivar e
eritrocitário na população alvo.
- Verificar a associação entre os fenótipos sanguíneos ABO e Lewis e a
infecção pela H. pylori.
14
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. MATERIAL
Foram colhidas 65 amostras de sangue de indivíduos com patologias
gástricas provenientes de uma população triíbrida do Estado do Pará, atendidas no
serviço de endoscopia do Hospital Universitário João de Barros Barreto (HUJBB) e
no Hospital Ofir Loyola (HOL), que se manifestaram de acordo em participar do
estudo. Adicionalmente, uma amostra de saliva de cada indivíduo foi colhida em um
pote descartável, para caracterizar o estado secretor de substância ABH e Lewis.
Além disso, um questionário sócio-demográfico foi respondido pelos sujeitos da
pesquisa.
Todos os indivíduos que participaram do estudo apresentavam doença
gástrica (câncer ou úlcera) e eram maiores de 18 anos de idade. Além disso, todos
os indivíduos foram informados sobre a pesquisa, de maneira acessível, e
assinaram um Termo de Esclarecimento e Consentimento Livre, conforme rege a
resolução 196/96, do Conselho Nacional de Saúde.
Este trabalho foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
do Núcleo de Medicina Tropical (NMT) da Universidade Federal do Pará (UFPA).
15
3.2. MÉTODOS
3.2.1. Coleta do sangue
O sangue foi coletado utilizando-se material estéreo, de uso individual
descartado imediatamente, segundo as normas de biossegurança. Foram utilizados
aproximadamente 3 ml de sangue de cada indivíduo, sendo distribuído em dois
tubos de ensaio, um com anticoagulante (Heparina) e outro sem anticoagulante. O
sangue total foi centrifugado a 3.000 rpm durante 20 minutos e o soro separado e
stocado à -20oC. As hemácias foram mantidas à 4oC e testadas no prazo de três
dias. Não foram utilizados soros hemolíticos, lipêmicos, ou ictéricos.
3.2.2. Coleta da saliva
Aos indivíduos participantes deste estudo foi dado um copo descartável
para depositar saliva. O material foi transferido para tubos de ensaio e no intervalo
de 2 horas, as amostras de saliva foram fervidas em banho-maria por 10 minutos e
mantidas a -30°C. Antes da estocagem, todas as amos tras foram centrifugadas e o
sobrenadante separado para os testes das substâncias ABH e Lewis.
3.2.3. Determinação dos fenótipos ABO e ewis no sangue
Nos eritrócitos, os fenótipos ABO e Lewis foram tipificados pelos testes de
hemaglutinação. As hemácias foram lavadas e resuspendidas a 3% com solução
salina a 0,09%. O teste de hemaglutinação foi realizado misturando-se um volume
de 25µl da suspensão de hemácias com igual volume de cada anticorpo com as
respectivas especificidades a serem analisadas (anti-A, anti-B, anti-H, anti-Lewis a e
anti-Lewis b).
16
3.2.4. Determinação dos fenótipos Lewis e ABO ao nível salivar.
A caracterização dos fenótipos ABH e Lewis, na saliva, foi realizada pela
técnica de dot-ELISA. modificada de Pflug et al (1989). Brevemente, um volume de
2µl de cada amostra foi gotejado com uma micropipeta em 5 pedaços de uma
membrana de nitrocelulose, de dimensão aproximada de 4 x 7 cm, em seguida
deixando secar por 60 minutos a 37°C. As áreas livr es da membrana de
nitrocelulose foram bloqueadas com um tampão bloqueador (0,01M Tris-HCI Salina,
pH 7.4; 1% Triton X-100; 3% BSA) por 45 minutos à temperatura ambiente e com
agitação mecânica constante.
Cada pedaço da membrana de nitrocelulose foi incubado em solução
tampão contendo o anticorpo secundário (anti-IgM de rato) conjugado à enzima
fosfatase alcalina, diluído 1/1000, e o anticorpo monoclonal primário em diluição
apropriada (anti-A 1/50; anti-B 1/100; anti-H 1/10; anti-Lea 1/1000 e anti-Leb 1/2000)
por 45 minutos à temperatura ambiente. Os pedaços da membrana de nitrocelulose
foram lavados 6 vezes com o tampão de lavagem (0,01M Tris-HCI Salina pH 7.4;
0,05% Triton X-100) durante 5 minutos cada, excluindo Triton X-100 do tampão nas
duas últimas lavagens. A reação antígeno anticorpo foi revelada usando um tampão
substrato (25ml 0,25M Glicina/NaOH pH 10.4; 500µl 0,1M MgCl2; 500µl 0,1M ZnCl2);
100µl da solução do estoque (50mg 5-bromo-4-cloro-3-indolfosfato dissolvido em
1ml dimetilformamida) a 37°C até a visualização de pontos azuis brilhantes no local
da reação; posteriormente as membranas foram lavadas em água corrente e secas
para serem analisadas.
3.2.5. Detecção de anticorpos anti-H. Pylori específicos.
Amostra de soro de cada paciente foi testada para a presença de
anticorpos tipo IgG com especificidade anti-H. pylori, através de um ensaio
quantitativo imunoenzimático (ELISA) em microplaca, usando o kit comercial HIK
anti-H. pylori EIA (Monobind, Inc-USA) de acordo com as instruções do fabricante.
17
3.3. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Foram empregados testes estatísticos adequados como o teste do x2 e
teste G para detectar ou não a diferença entre os grupos objeto de estudo. O
programa de computador utilizado foi o BioEstat 5.0 (Ayres et al, 2000). A significância
estatística foi aceita ao nível de 0.05.
18
4. RESULTADOS
O estudo constitui-se de 65 indivíduos, dos quais 50 eram do sexo
masculino e 15 do feminino. A amostra foi composta por 28 indivíduos com úlcera
gástrica (22 homens e 6 mulheres) e 37 com câncer gástrico (28 homens e 9
mulheres) com idade variando de 28 a 80 anos e média de 57 anos de idade. Entre
os pacientes com câncer gástrico 21 foram diagnosticados com câncer do tipo difuso
e 16 com o tipo intestinal.
Entre os pacientes testados, 92% (60/65) apresentaram IgG anti-H. pylori
específico, sendo que entre estes indivíduos observou-se taxas de soroprevalência
de 93% (26/28) nos pacientes com úlcera e de 92% (34/37) nos pacientes com
câncer, não sendo estas diferenças de soroprevalência entre estes tipos de doenças
gástricas estatisticamente significativa (Tabela 1). Foi realizada a distribuição da
infecção pelo sexo, contudo não foram evidenciadas diferenças estatisticamente
significativas (Tabela 02).
Tabela 1. Comparação do resultado sorológico para infecção por H. pylori entre
pacientes com as patologias gástricas.
Diagnóstico
Úlcera
Câncer
sorológico
Gástrica
gástrico
Hp+
26
34
60
Hp-
02
03
05
28
37
65
Total
GYates= 0,1049; p= 0,7460
Total
19
Tabela 2. Distribuição da infecção pela Helicobacter pylori entre pacientes com
doenças gástricas de acordo com o sexo.
Infecção pela Helicobacter pylori
Doença
Úlcera
Câncer
Sexo
Positivo ( + )
Negativo ( - )
Masculino
21
01
Feminino
05
01
Masculino
25
03
Feminino
09
00
60
05
Total
Teste G = 0,0318; p = 0,8586
Quanto ao sistema de grupo sanguíneo ABO e estado secretor ABH foi
observado que todos os indivíduos eram secretores da substância ABH em
conformidade com o fenótipo sanguíneo ABO eritrocitário (Tabela 3). O grupo O
apresentou a maior prevalencia, de 56,92% (37/65), entre os indivíduos analisados
em relação aos outros grupos que mostraram as seguintes frequências: A 29,23%
(19/65), B 7,70% (5/65) e AB 6,15% (4/65), conforme a Tabela 3. A diferença entre
os fenótipos ABO observados e os esperados não é estatisticamente significativa (p
= 0,0563), revelando-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg (A = 0,1940; B = 0,0710; O
= 0,7350).
No que concerne o sistema de grupo sanguíneo Lewis, foram detectadas
as seguintes distribuições fenotipicas: ao nível eritrocitário, 15,93% eram Le (a+b-),
27,69% eram Le (a-b+) e 56,92% eram (a-b-); e ao nível salivar, 3,08% eram Le
(a+b-), 86,15% eram (a-b+) e 10,77% eram Le (a-b-) (Tabela 4). Observou-se
diferença significativa
eritrocitário (Tabela 4).
entre as frequências fenotípicas Lewis ao nível salivar e
20
Tabela 3. Distribuição dos Estados secretores ABH e dos fenótipos Lewis ao nível
eritrocitário e salivar na população alvo.
Fenótipo
Eritrocitário
Lewis
Lewis a
Substância Salivar
Lewis
Lewis a
Lewis b
Estado Secretor ABH
N
A
B
AB
O
+
-
0
-
-
+
+
10
3
-
3
4
Lewis b
+
+
18
4
-
1
13
Lewis (a-b-)
-
-
7
4
-
-
3
+
-
2
-
1
-
1
-
+
3
-
-
-
3
+
+
25
8
4
-
13
65
19
(29,23)
5 (7,70)
Total (%)
-
4 (6,15)
37
(56,92)
A distribuição dos antígenos de grupo sanguíneos Lewis ao nível
eritrocitário e salivar (Tabela 4), permitiu classificar as amostras dos pacientes em
dois grupos fenotípicos: Lewis concordantes e Lewis discordantes (Tabela 5). Os
fenótipos concordantes apresentavam antígenos Lewis idênticos e compatíveis no
sangue e na saliva, enquanto que nos discordantes, os antígenos detectados nos
eritrócitos eram diferentes das especificidades da saliva.
21
Verificou-se que a presença de discordância entre sangue e saliva, nos
fenótipos Lewis, representa 61,54% (40/65) do total da amostra dos pacientes
investigados (Tabela
5). E pelos dados listados na tabela 4, o maior número
observado de discrepâncias eritrocito/saliva concentrou-se no grupo classificado nos
eritrócitos como Le (a-b-) envolvendo 30 discordantes e 7 concordantes dos 37
pacientes com este fenótipo eritrocitário. Essa discordancia caracteriza-se pela
expressão de antígenos Lewis na saliva sem detecção nas hemácias.
Tabela 4. Frequência dos Fenótipos Lewis ao nível eritrocitário e salivar na
população estudada.
Fenótipo Lewis
Sangue
Lewis a
Saliva
Lewis b
Lewis (a-b-)
Total
N
Lewis a
-
10
-
10
%
15,39
Lewis b
-
18
-
18
27,69
Lewis (a-b-)
2
28
7
37
56,92
Total (%)
2 (3,08)
56 (86,15)
7 (10,77)
65
100
T-G (Willians) = 73,6370; (p) < 0,0001
No entanto, em relação a distribuição dos antigenos no sangue e saliva,
classificados em concordantes e discordantes, obtivemos uma associação
estatisticamente significativa, indicando uma maior ocorrência de discordancia entre
os pacientes com doenças gástricas e infectados pela H. pylori do que nos
indivíduos em geral da população (Tabela 5).
22
Tabela 5. Comparação dos fenótipos Lewis concordantes e discordantes
(sangue/saliva) entre pacientes estudados com úlcera ou câncer e os indivíduos da
população de Belém.
Fenótipo Lewis
Pacientes gástricos
População de Belém
Concordante
25
102
Discordante
40
48
Total
65
150
X2 (YATES) = 15,167; P < 0,0001
Quando comparamos o fenótipo O Le (a-b+) e dos outros fenótipos do
sistema ABO e Lewis com a presença da infecção pelo H.pylori nos pacientes
estudados
(Tabela 6),
não encontramos
uma associação estatisticamente
significantiva (p > 0,05). Do mesmo modo, na analise dos testes estatísticos de
dependência dos fenótipos do grupo sanguíneo ABO com o tipo de doença gástrica
apresentada pelos pacientes não foi observada uma significância estatística. (Tabela
7).
23
Tabela 6. Distribuição dos fenótipos Lewis salivar e ABO em relação a infecção por
H. pylori na população analisada.
Fenótipos
Infecção
ABO e Lewis
Total
Hp+
Hp-
O Lewis b
29
4
33
Outros
31
1
32
60
5
65
Total
P = 0,0868
Tabela 7. Distribuição dos fenótipo de grupos sanguíneo ABO em pacientes com
úlcera, câncer gástrico e controle.
Fenótipo ABO
Úlcera
Câncer
Controle
O
14
23
85
A
10
9
46
B/AB
4
5
19
28
37
150
G - teste Williams = 1,1677; p = 0,8834
Adicionalmente, os resultados do presente estudo envolvendo pacientes
com úlcera e câncer gástrico foram comparados com as frequências dos grupos
sanguíneos ABH e Lewis, anteriormente descritos (Corvelo et al, Comunicação Oral,
2011) para uma amostra de indivíduos adultos da mesma população de Belém do
Pará, conforme discriminados na tabela 8. A distribuição dos fenótipos de grupos
sanguíneos ABO e Lewis de pacientes gástricos são consistentes com a prevalencia
descrita na população de Belém (Corvelo et al, Comunicação Oral, 2011).
24
Tabela 8. Distribuição do Sistema ABO nos pacientes analisados e na população de
Belém.
Sistema ABO
Pacientes Gástricos
Fenótipo Salivar Lewis
Lewis (a-b-) Lewis a Lewis b
População de Belém
Fenótipo Salivar Lewis
Lewis (a-b-) Lewis a Lewis b
A
4
-
15
2
7
37
B
-
-
5
2
1
14
AB
-
-
4
0
1
1
O
3
1
33
6
14
65
Total
7
1
57
10
23
117
25
5. DISCUSSÃO
A infecção por Helicobacter pylori atinge mais de 50% da população
mundial (Wang et al, 2000). Entre os indivíduos infectados, a maioria permanece
assintomática por toda a vida, no entanto cerca de 10% desenvolvem úlcera péptica
e 1 a 2% desenvolvem câncer gástrico (Cover et al, 2001).
No presente estudo, a taxa de infecção entre os indivíduos analisados foi
de 92%, não diferindo entre os tipos de doença gástrica, com ambas apresentando
altas freqüências de infecção: 93% dos casos de úlcera e 92% nos casos de câncer.
E apesar da maior prevalência de homens com doenças gástricas, não observamos
diferença significativa entre o gênero e o tipo de doença. Essa alta prevalência de
homens acometidos pode ser explicada pelo fato dos homens estarem mais
expostos aos fatores de risco e pelo seu estilo de vida como não freqüentar o
médico regularmente.
A H. pylori é bem conhecida pela sua habilidade em colonizar o estômago
humano e por adaptar-se às alterações sofridas pela sua persistência no meio,
podendo levar ao aparecimento de severas doenças gástricas. Durante este
processo inflamatório estão envolvidos vários fatores de virulência. Entre estes, a
aderência bacteriana é imprescindível para o estabelecimento subsequente dos
demais mecanismos de patogenicidade (Guruge et al, 1998).
Primariamente, esta aderência ocorre pela ligação da adesina bactériana
babA ao antígeno de grupo sanguíneo ABO/Lewis b (Ilver et al, 1998).
Em nosso estudo, as frequências dos grupos sanguíneos ABO estão de
acordo com o equilíbrio de Hardy-Weinberg, e não diferem das frequências da
população de Belém encontradas por Corvelo et al (Comunicação Oral, 2011).Neste
estudo, todos os 65 pacientes com doenças gástricas analisados são secretores
ABH.
Observamos diferenças entre as frequências dos fenótipos Lewis ao nível
salivar e eritrocitário dos pacientes, o que nos permitiu dividi-los em dois grupos:
26
concordantes e discordantes. A razão dessas discrepâncias sangue/saliva podem
ser explicadas por observações previas (Corvelo et al, Comunicação Oral, 2011) que
tem relação com a presença da mutação 59T > A. Do mesmo modo, quando
analisamos as frequências destes grupos estudados com outra amostra (controle
sadio) da população de Belém (Corvelo et al, Comunicação Oral, 2011) verificamos
que o número de concordantes é maior que o de discordantes, contrário ao
observado na amostra dos pacientes estudos, cujo número de indivíduos
discordantes sangue/saliva foi a maior. De fato, tem sido relatada a ocorrência de
fenótipos eritrocitários Le(a-b-) em indivíduos previamente tipados como Lewis
positivo em associação com mudanças nas condições de saúde, a exemplo de
vários carcinomas (Hirano et al, 1987). Portanto, nossos achados corroboram estes
estudos, e nos levam a inferir que a presença de doença gástrica, particularmente o
adenocarcinoma gástrico, altera a substância Lewis ao nível eritrocitário (p <
0,0001), sugerindo que esta alteração seja reflexo da perda dos antígenos Lewis na
mucosa gástrica
Em 1993 Bóren et al relataram que indivíduos do grupo sanguíneo O
possuem mais receptores para a H. pylori em contraste com os indivíduos dos outros
grupos, sendo, por esse motivo, mais susceptíveis a infecção pela bactéria. Além
disso, mostrou em seu estudo que o antígeno Lewis b medeia a ligação da H. pylori
a mucosa gástrica, verificando em sua análise que a bactéria só se vinculou ao
epitélio gástrico que expressava Lewis b.
No presente estudo, não encontramos uma maior frequência do grupo A
em pacientes com câncer gástrico nem um aumento do grupo O em pacientes com
úlcera. Contudo, é importante ressaltar que o pequeno tamanho amostral do
presente estudo pode ter interferido na significância estatística dos resultados.
O grupo sanguíneo O tem sido associado à úlcera (Smith et al, 1994;
Clark et al, 1956; Mentis et al, 1991) e o câncer gástrico ao grupo A (Hajj et al,
2007). Kambay et al (2005) mostraram que pacientes dos grupos A e O foram mais
propensos a infecção por H. pylori que os pacientes dos outros grupos, levando a
conclusão de que a infecção pela bactéria está intimamente associada a esses dois
grupos sanguíneos.
27
Por outro lado, Keller et al (2002) não demonstraram associação entre o
grupo sanguíneo ABO e a infecção pela H. pylori assim como, não encontraram
relação entre o fenótipo Lewis b e a infecção pela bactéria. Seus resultados também
não confirmaram a hipótese de que o estado secretor ABH e o grupo sanguíneo O
tenham influencia na infecção por H. pylori.
Deste modo, outros estudos são necessários para evidenciar a
associação dos antígenos de grupos sanguíneos ABO e Lewis com a infecção por
Helicobacter pylori.
28
6. CONCLUSÃO
A taxa de soroprevalência da infecção por Helicobacter pylori foi de 92%
atingindo 93% nos pacientes com úlcera gástrica e 92% dos indivíduos com câncer.
Neste estudo não encontramos associação significativa entre o fenótipo
de grupo sanguíneo O Leb e a infecção por H. pylori, o que pode ser justificado pelo
pequeno tamanho amostral.
Nos pacientes com patologias gástrica, observou-se uma discrepância em
relação aos fenótipos Lewis entre o nível salivar e eritrocitário, sugerindo que esta
alteração seja reflexo da perda desse antígenos na mucosa gástrica.
29
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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