RESOLUÇÃO DO EXERCÍCIO 2 - Bioquímica Experimental QBQ 0316N – Vitor Medeiros Almeida
Exercício 2:
Calcule a concentração de atividade enzimática no lisado de cada uma das linhagens de
levedura. Calcule também a atividade obtida por grama de células. Calcule a concentração
de proteína em cada um dos lisados e a atividade específica de cada um dos materiais. Se o
próprio lisado for utilizado industrialmente como fonte de enzima, qual das linhagens é
melhor para produzir essa enzima em larga escala? Se for necessário purificar a enzima, qual
das linhagens é a melhor fonte? Justifique as respostas.
Primeiramente, para vermos a atividade enzimática de cada uma das linhagens, esqueceremos
as diluições (por enquanto). Focar somente na parte final da tabela.
A atividade da enzima é medida através da detecção do p-nitrofenolato que é liberado do
substrato quando a enzima o cliva da glicose. Então, quanto mais p-nitrofenolato
liberado/tempo, maior a atividade da enzima.
Fazendo gráficos com esses números teremos curvas de Abs x tempo, mas o que nos interessa
aqui é nmol p-nitrofenolato x tempo. Usaremos uma curva padrão de p-nitrofenolato da
apostila de prática para fazer essa conversão.
Utilizando esta equação da reta y= 0.0049x + 0,014, transformaremos os valores de absorção
da tabela, por valores de nmol de p-nitrofenolato, substituindo o y pelos valores de absorção
obtidos. Teremos então a seguinte tabela.
nmol pnitrofenolato
Linhagem
A
B
C
D
E
F
15min
7.35
13.47
48.16
17.55
-0.82
12.45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
30min
17.55
29.80
99.18
37.96
1.22
27.76
45min
27.76
46.12
150.2
58.37
3.27
43.06
60min
37.96
62.45
201.22
78.78
5.31
58.37
Linhagem A
y = 0.6802x - 2.86
R² = 1
0
10
20
30
40
50
60
70
Minutos
Se fizermos todos os gráficos no Excel (nmol x tempo), teremos as seguintes equações de reta:
A
B
C
D
E
F
y=0.6802x - 2.86
y= 1.0884x - 2.86
y= 3.4014x - 2.86
y= 1.3605x - 2.86
y= 0.1361x - 2.86
y=1.0204x -2.86
Nessas equações, o valor que multiplica x (y=ax + b), representa o quanto do eixo y muda, para
cada variação de 1 unidade no eixo x. No caso dessas retas, significa quanto de nmol de pnitrofenolato é liberado em cada minuto de reação.
Usando de exemplo a linhagem A { y=0,68x – 2,86}, em cada minuto, aumenta 0,68 nmol de pnitrofenolato, logo a atividade é 0.68nmol/minuto.
Outra forma de obter esse valor que multiplica o x (a) sem ter que usar o Excel, é através de
Δy/ΔX (a variação de y dividido pela variação de x).
Usando e exemplo a linhagem A
15}, resultando em 30,61/45 = 0.68.
Enquanto o eixo y varia { 37,95 - 7,34}, o eixo x varia {60 -
Faz-se a transformação para umol/min (x10-3) para calcular a atividade específica posteriormente.
Linhagem
A
B
C
D
E
F
nmol/min
0.68
1.08
3.4
1.36
0.14
1.02
umol/min
0.00068
0.00109
0.0034
0.00136
0.00014
0.00102
U
0.00068
0.00109
0.0034
0.00136
0.00014
0.00102
Agora que já temos as atividades de cada linhagem, devemos calcular a concentração da
atividade enzimática (“atividade” por ml), e a atividade por g de célula.
Usando a Linhagem B como exemplo para o cálculo de atividade/ml de lisado:
Nós calculamos que a linhagem B tem atividade de 0,00109 U. Porém, para chegar nesse valor,
foi usado somente 20 ul do lisado.
Então temos uma simples regra de 3
0,00108 --- 20 µl
z
--- 1000 µl
z = 0,054
Porém, para chegar nesses valores de Abs., também houve uma diluição prévia de 50 vezes,
então devemos multiplicar esse valor por 50
0,054*50 = 2,7. Então, a Linhagem B tem 2.7
U/ml.
Fazendo a mesma coisa para as outras linhagens, temos:
Linhagem
A
B
C
D
E
F
U
0.00068
0.00109
0.0034
0.00136
0.00013
0.00102
U/ml
0.68
2.7
0.54
0.49
0.33
1.02
Para calcular a atividade/g de célula, temos que nos atentar que esses valores obtidos estão
por ml de lisado, e o exercício nos deu as amostras com 1g para cada 10 ml do lisado. Logo, é
só multiplicar os valores encontrados por 10.
Linhagem
A
B
C
D
E
F
U/ml
0.68
2.7
0.54
0.49
0.33
1.02
U/ml/g
6.8
27
5.4
4.9
3.3
10.2
A atividade específica de uma enzima é a atividade por grama de proteína, então o próximo
passo é ver a quantidade de proteínas em cada linhagem.
A linhagem B é a linhagem que resulta em maior quantidade de atividade enzimática por
grama de material inicial. Portanto, ela é a melhor linhagem para se extrair enzimas.
CÁLCULO DE PROTEÍNA POR LINHAGEM
Primeiro passo é fazer a equação da reta da curva padrão de albumina.
mg
proteina
0
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.014
0.016
0.018
0.02
abs
0.01
0.08
0.16
0.24
0.32
0.4
0.48
0.56
0.64
0.72
0.8
0.9
0.8
y = 39.773x + 0.0032
R² = 0.9999
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
Substituindo o “y” por cada valor de absorbância obtido nas linhagens, temos:
Linhagem
A
B
C
D
E
F
abs
0.265
0.32
0.5
0.105
0.75
0.415
mg
proteína
0.0065824
0.0079652
0.0124909
0.0025595
0.0187766
0.0103538
Levando em consideração as diluições (fazendo o mesmo tipo de conta que foi feito nas
diluições para a atividade enzimática), temos, usando como exemplo a linhagem A:
0,0065 mg/100ul 0,065mg/1ml (1000ul). Multiplicando por 20 (o quanto foi diluído), temos
0,065*20=1,3mg/ml.
Fazendo o mesmo para todas as outras:
Linhagem
A
B
C
D
E
F
mg/ml
1.31
19.9
2.49
0.63
9.38
8.28
Notar que as atividades foram obtidas por ml, e a concentração de proteínas também está em
ml, então, para cálculo da atividade específica, deve-se somente dividir a atividade pela
[proteína]:
Linhagem
A
B
C
D
E
F
[proteína]
mg/ml
1.31
19.9
2.49
0.63
9.38
8.28
U/ml
0.68
2.7
0.54
0.49
0.33
1.02
Ativ. Espec.
(U/mg)
0.52
0.14
0.22
0.78
0.04
0.13
A linhagem D é a linhagem que resulta em maior atividade específica. Esta linhagem,
portanto, é a que deve ser utilizada para se obter a enzima mais pura (atividade enzimática
por mg de proteína).