Elementos de Microscopia
e Microanálise
Docente: Profª Drª Maria Tercília V. A. Oliveira
Discente: Bruna Victorasso Jardim
CULTURA CELULAR
Definição

Conjunto de técnicas que permitem
cultivar células fora do organismo dadas
as condições apropriadas
Tecidos
Humanos
Animais
Vegetais
IN VITRO X IN VIVO
Histórico
Cultivou células de embrião de aves e,
solução salina aquecida
Wilhen Roux - 1885
Pioneiro no cultivo celular de animais
Ross Harrison - 1907

Hipótese Doutrina do neurônio
Origem do axônio - cada
fibra nervosa é o produto
de uma única célula
nervosa e não da fusão
de várias.
• fragmentos de tecido da medula espinhal de anfíbios
• linfas coaguladas como meio de cultura
• armazenadas em câmara úmida e morna
• microscópio – intervalos regulares de tempo
• células nervosas individuais com um axônio cada
Base para a cultura celular
1ª limitação
Desenvolvimento de meios nutritivos
Burrows – 1910
Plasma de aves  nutrir explantes de tec. embrionário
-Subculturas para prolongar a vida das células
- utilizando meio nutritivo
Plasma
Alexis Carrel

Extratos de embrião
Rous e Jones - 1916
Tripsina para dissociar células embrionárias
2ª Limitação
Contaminação
Desenvolvimento de condições assépticas
- Cultivou células de embrião de aves por + de 30 anos
Células dividiam indefinidamente  extrato de embrião de galinha
Alexis Carrel - 1913
1940 1940 - Surgimento dos antibióticos
Avanços com alguns destaques
1ª linha celular contínua
Células epiteliais humanas procedentes
de carcinoma cervical
células HeLa
George Gey - 1952
- Utilizou meios indefinidos e complexos
Plasma de aves
Extrato de embrião bovino
Cordão umbilical humano
Dificuldade para analisar a composição específica para cada tipo
celular se desenvolver e funcionar normalmente
Fator de crescimento nervoso estimula o crescimento
dos axónios em cultura de tecidos
Stanley Cohen - 1954
Harry Eagle – 1955
Investigou os requerimentos nutritivos das células em cultivo
Sais
Glicose
Aminoácidos
Vitaminas
+
Soro de
proteínas
Células cultivadas
em condições
experimentais
definidas
Meio Basal de Eagle (BME)  aa essencias
Meio Mínimo Essencial de Eagle (MEM)  + aa
Meio MEM modificado por Dulbecco (DMEM)  4x + aa
Soro fetal bovino
Células morrem após um número finito de
divisões em cultura
Leonard Hayflick e
Paul Moorhead - 1961
Fibroblastos jovens
Fibroblastos velhos
Ham -1965
1º meio livre de soro capaz de manter algumas células de mamíferos
em cultivo
quimicamente definido
Sais
Glicose
Vitaminas
Pequenas
moléculas
Proteínas
específicas
Aminoácidos
Possibilitou o estudo de moléculas
sinalizadoras extracelulares
Essenciais para sobrevivência,
desenvolvimento e proliferação de
tipos de células específicos
Sobreviver e proliferar
Transferrina
Fatores de
crescimento
Harris e Watkins - 1965
1º heterocário de células de mamíferos pela fusão
Humano Camundongo
Mitose  crs. no mesmo núcleo  células híbridas
Linhagens com composição cromossômica =
Localizar genes no genoma e banco de DNA de crs. específicos
+
=
Augusti- Tocco e Sato - 1969
1ª linhagem celular estável a partir de uma célula tumoral de
nefroblastoma de camumdongo  eletricamente excitáveis
1975
1ª linhagem celular produtora de anticorpos
monoclonais
hibridomas
Cesar Milstein
George Kohler
Linfócitos B do baço com
antígeno do anticorpo
desejado inoculado
+
Células de mieloma que
se reproduzem em cultura
indefinitamente
Células produzindo o anticorpo desejado
Hayashi e Sato – 1976
Trabalhos demonstrando: = linhagens celulares
= misturas de hormônios e fatores de crescimento
Células crescerem em meios livres de soro
1977
1º introduzir genes de cópias únicas de mamíferos in vitro
Michael Wigler
Richard Axel
Gene que codifica a enzima timidina quinase em
células com esse gene deficiente
Avanço na cultura celular pela
possibilidade de produzir proteínas
terapêuticas em grande escala
Martin Evans -1986
Isolou e cultivou células
totipotentes de ratos
James Thomson e John Gearhart – 1998
Isolaram e mantiveram vivas in vitro
células embrionárias humanas
Bactéria X
Cultivadas em
suspensão
Duplicação
em 30 min.
Células de tecido
Cultivadas em
superfície
sólida
Duplicação
em 18 - 24
hrs
Células
Componentes específicos da Matriz Extracelular
Colágeno
Laminina
Tipos de cultura celular

Cultura primária – preparada diretamente do tecido de um
organismo, com ou sem fracionamento inicial das células

Cultura secundária – a partir de células retiradas da placa de
cultura primária Subcultivos
Promove nova fonte de nutrientes e espaço para
o crescimento contínuo de linhagens celulares
Linhagem de células

Células morrem após um nº finito de divisões em cultura

Mutação  Células imortais – proliferam indefinidamente
linhagem de células
Podem ser armazenadas em N líquido e continuarem viáveis

Linhagem de células podem ser preparadas a
partir de células de câncer
Proliferam-se em altas
densidades
Crescem sem se fixarem
a uma superfície
• Linhagem de células normais transformadas
Vírus indutor
Substâncias
químicas
Linhagens celulares são importantes na pesquisa celular  alta quantidade
de células de um determinado tipo
Não são idênticas
Clonagem celular
• Uma célula isolada origina a cultura
• Células geneticamente idênticas
Importância = linhagens de células mutantes com defeito em um gene específico
Função da proteína em células normais
Aplicações

Reproduzir fenômenos que ocorrem in vivo mas que são
inacessíveis
adicionar ou remover moléculas específicas
Estudo da fisiologia e metabolismo de células específicas
 Estudar interações entre vários tipos de células – culturas mistas
 Estudo de neoplasias
 Testar drogas ou compostos químicos
 Possibilidade de gerar tecidos artificiais
 Produção de proteínas terapêuticas

Vantagens

Reprodutibilidade dos resultados
-Linhagem de células clonais
-Controle das condições ambientais


Possibilidade de selecionar uma população de células
específicas
Conhecimento do comportamento e função das células
selecionadas
Desvantagens




Perda das características – cultivo longo
Necessidade de marcadores
Confiabilidade dos resultados in vivo – ex: drogas
Contaminação
Cuidados







Biossegurança
Sala separada especial
Esterilizar todos os materiais e equipamentos com álcool 70
Luz UV
Usar: luvas estéreis, máscara...
Não reutilizar materiais
Material biológico  lixo separado
Protocolo para cultivo celular

Cultivo de celulas de câncer de mama
• Biopsia do tecido
• meio de congelamento  meio de cultura + DMSO + antibiótico
• 2 horas em geladeira
• 30 min a 5 cm do N liquido (p congelar aos poucos)
• armazenar em N Liquido
Protocolo para cultivo celular
Cultivo de células de câncer de mama

Biópsia do tecido
 Coletada e armazenada em meio de transporte
- 100 ml meio RPMI
- 1 ml de antibiótico

3 ml -Tubo falcon
Preparação inicial

limpeza com álcool e UV 20 min

Meio de cultura, PBS, tripsina – banho maria a 37ºC
Preparo do meio de cultura

20 ml soro fetal bovino

1 ml antibiótico/antimicótico

1 ml L-glutamina

100 ml de meio de cultura RPMI 1640

Processamento do fragmento tumoral




Lavar o tumor com PBS (4x – 2 min)
Tesoura ou bisturi
1 ml de meio RPMI 1640 no frasco T-25
Estufa 37ºC – 5% CO2


1 ou 2 dias depois adicionar 1ml de meio lentamente para não
soltar as células
Trocar o meio de cultura a cada 2 dias





Retirar o meio com a pipeta
4ml de meio – frasco T-25
8 ml de meio – frasco T-75
O meio deve ser descartado com hipoclororito
Subculturas








Retirar o meio de cultura
Lavar com PBS 1X
Retirar o PBS
Adicionar 2 ml de tripsina
Aguardar 4 –10 min o desprendimento das células
Passar todo conteúdo do frasco para outro frasco
Adicionar 2 ml de meio de cultura
Colocar na estufa 37ºC – 5% CO2
Capela de fluxo para
cultura celular
Placa six-wells
Congelamento de células








Tripsinizar
Colocar em tubo falcon
Centrifugar a 1600 rpm – 5 min
Desprezar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 900 ul
de meio e 100 ul de DMSO
Passar para criotubo
Geladeira por 30 min
Frezeer – 80ºC – 24 hrs
Nitrogênio líquido
Descongelamento das células







Retirar o criotubo do N líquido
Banho maria a 37ºC – 90 seg.
Transferir para tubo falcon 15ml contendo: 10 ml de meio
Centrifugar – 5min
Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet de células em
meio de cultura
Transferir para frasco T-25
Estufa
Invertoscópio
4x
10x
10
40x
Fungo
4x e 10x
Obrigada