Injetar e deixar 20 horas
• Células injetadas e reveladas para ativação de lacZ 20
horas depois da injeção
• Todavia, a idade da célula no momento da injeção era
calculada sabendo a posição dela na placa (grid) e
acompanhando o ciclo de divisão
Outros promotores, tecidoespecíficos, tb funcionam mais se
injetados no início da fase S
Mas elas passam por +1 ciclo nessas
20 horas!
• O fato sugere que a competência foi adquirida logo na hora
da injeção e não foi recuperada pelo ciclo
• Vamos esperar só 3 horas?
– Injetar depois da div.
– Tem que usar PCR
controle
– Deu igual!
controle
Duas injetadas na mesma célula
• O repórter pode ser LacZ ou EGFP
• Células injetadas, espera-se algumas horas de acordo com
protocolo
• Early S sempre mais ativa (na mesma célula)
Preparar nucleossomo e fazer PCR
• A detecção de lacZ (injetado) ou de actina (celular) foi
igual, logo o DNA injetado virou nucleossomal!
Injeção de dois plasmídios com
genes de tamanho diferente
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•
•
Um injetado no início e outro no final da fase S
Preparação nucleossomal
Precipitação de cromatina com anti - H4 acetilada
PCR quantitativo do precipitado: early tem mais acetilação
Input
ml
Bound
Controles
• Gene ativo: actina
• Gene Inativo: Ig-kappa
ml
early late
TSA inibe desacetilase
• Early: não adianta inibir desacetilase
• Late:
– Tratamento simultâneo reverte
– Tratamento tardio não
– Já empacotou! Estável!
RT-PCR
Plasmídio que replica
(origem BPV, célula com E1/E2)
• Qdo replica, plasmídio perde padrão de metilação
bacteriana e fica resistente a Dpn I
• Em 3 horas eles replicam (30-40%)
• Imunoprecipitação do plasmídio com anti – H4 acetilada
• Elimina-se quem não replica com Dpn I
H4 desacetilada é comum no X tardio e bandas G
• Inseriram pUC por transfecção (ops, esse DNA agora é cromossômico)
– Deve ter inserido em diferentes tipos de bandas
• Marcaram Early e Late replication com Budr
• Precipitaram com anti – H4 acetilada
• O ppt era enriquecido de cópias de pUC marcadas com BUdr early
(mas não com BUdr late) – early = desacetilado
Onde fica a HDAC2?
• Em bandas G, de replicação tardia
• Competência transcricional é dependente da fase S
• Replicação precoce é montada em estrutura de cromatina
mais acessível
• Replicação tardia em regiões inativas
• Eixo ao longo do tempo do ciclo celular que permite a
manutenção de efeitos epigenéticos