USO DA BIOINFORMÁTICA PARA DETERMINAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS
CANDIDATAS A FÁRMACOS PARA SCHISTOSOMA MANSONI
Rosângela Silqueira Hickson 1
Abstract. A relational database is being created in order to integrate the information
on proteins deposited at SwissProt and at PDB, and the drugs listed in DrugBank,
KEGG, TTD and
PharmGKB among others. Based on this information we are
calculating a Druggability Index(DI). This index will be used to calculate the DI of the
Schistosoma mansoni protein sequences. All S. mansoni therapeutic targets
identified will be analysed for identification and mapping of the probable active sites.
After that, automatic docking of all the molecules of database will be performed. This
database will have information on the known drugs against all potential targets
selected.
Resumo. Um banco de Dados relacional está sendo criado para armazenar as
informações das proteínas depositadas no SwissProt e no PDB, e as drogas
armazenadas no DrugBank, KEEG, TTD e PharmGKB e outros. Com base nestas
informações, estamos calculando o Índice de Drogabilidade. Este índice será usado
para calcular o Índice de Drogabilidade das seqüências das proteínas do
Schistosoma mansoni. Todos os alvos terapêuticos potenciais do Schistosoma
mansoni identificados serão analisados para identificação e mapeamento dos sítios
ativos prováveis. Em seguida será
realizado o docking automático de todas as
moléculas do banco de dados, que contém informações sobre os fármacos
conhecidos, contra todos os alvos potenciais selecionados.
Palavra-chave: docking molecular; genoma; schistosoma mansoni; drogabilidade;
proteína-alvo; ligantes.
1
Doutora em Bioinformática, Mestre em Ciência da Computação, Engenheira Mecânica,
Coordenadora de Projeto da Faculdade Infórium de Tecnologia, Professora do Centro Universitário
Metodista Izabela Hendrix, Avaliadora Institucional e de curso do INEP/MEC.
Introdução
O sequenciamento genômico veio trazer grandes esperanças no campo das
Ciências Biomédicas. A seqüência do genoma humano e do genoma de diversos
seres vivos constituem uma importante base de informação para a elucidação do
genoma completo [Venter, Adans, Myers and al. 2001], [Lander Linton Birren and al.
2001]. Desafio maior, entretanto, será a elucidação estrutural de novos alvos
moleculares, principalmente proteínas, enzimas e receptores, e as novas drogas que
certamente emergirão dos dados provenientes do genoma humano e de outros
genomas em estudo. Estas estruturas serão a base da revolução da “medicina do
futuro”.[Maggio and Ramnarayan 2001], em que a compreensão dos fenômenos
biológicos a nível molecular terá papel cada vez mais relevante.
A esquistossomose é endêmica em 74 países e causada por três diferentes
espécies (S. mansoni, S. haematobium e S. japonicum). É uma doença que atinge
200
milhões
de
pessoas
e
provoca
mais
de
20.000
mortes
por
ano
(http://www.who.int/vaccine_research/diseases/soa_parasitic/en/index5.html).
O genoma do parasito já foi seqüenciado e existe um projeto no Laboratório
de Parasitologia Celular e Molecular da FIOCRUZ-MG, coordenado pelo Prof. Dr.
Guilherme Oliveira, coordenador da Rede Genoma de Minas Gerais, que desenvolve
o banco de dados para armazenar o genoma usando o esquema GUS (The
Genomics Unified Schema). Além disto, também foram produzidos 169 modelos
(www.schistosomaonline.com.br ) usando modelagem por homologia de todas as
seqüências possíveis e existem também 16 estruturas de geradas de forma
experimental.
O controle da esquistossomose é realizado hoje principalmente com o uso do
praziquantel (PZQ), uma droga segura que é usada em dose única. A sua utilização
resultou em uma marcante diminuição da morbidade das populações de áreas
endêmicas [Chitsulo Engels Montresor and
Savioli 2000], [Kheir Baraka Tom
Mukhtar, and Homieda 2000], [Kloetze 1990]. Porém, a erradicação da transmissão
ainda não foi obtida e novas drogas são necessárias para uma estratégia efetiva de
longo prazo de combate à esquistossomose. Além disso, já existem relatos de
resistência/tolerância ao PZQ em zonas endêmicas [Fallon, Mubarak Fookes. Niang.
Butterworth Sturrock, and Doenhoff 1997] e a sua eficácia depende do sexo e do
estágio de desenvolvimento do parasito, já que as formas imaturas e os vermes
fêmeas são menos sensíveis a medicação [Pica-Mattoccia and Cioli 2004].
O processo de descobrimento e desenvolvimento de um novo fármaco
consiste de uma série de etapas que leva cerca de 14 anos para ser concluída e
exige um investimento financeiro extremamente elevado, podendo ultrapassar 1
bilhão de dólares atualmente [Hollmer Katsnelson Lawrence Shaffer Vastag Vermij
2007]. O processo pode ser dividido em etapas e cada etapa deve ser bem
planejada de modo a prover que os casos de insucesso sejam interrompidos o
quanto antes. Ou seja, se um dado alvo, não tiver condições de fornecer bons
resultados, que ele seja descartado o quanto antes no processo para minimizar os
custos [Caitlin 2003].
A modelagem por homologia baseia-se na observação de que a estrutura
tridimensional de proteínas homólogas é mais conservada do que suas seqüências
[Wieman. Tondel Anderssen Drablos 2004]. Em nossa proposta, a estrutura
tridimensional de cada alvo foi armazenada no banco de dados e, quando não
disponível, um modelo por homologia foi gerado e armazenado.
A obtenção de amostras em quantidade suficiente para os ensaios de
cristalografia necessários é, em muitos casos, difícil, e os cristais obtidos nem
sempre têm a qualidade necessária para o trabalho experimental (somente uma em
cada vinte proteínas, aproximadamente, produz cristais adequados [Maggio and
Ramnarayan 2001] ). Além disto, em certas classes de proteínas, como por exemplo,
as proteínas de membrana celular, a determinação estrutural é um desafio. Estas
proteínas raramente cristalizam e dificilmente podem ser tratadas de modo
satisfatório pela Ressonância Magnética Nuclear (RMN). Por outro lado, a
elucidação de aminoácidos (estruturas primárias) é uma tarefa relativamente
simples. Por isto, nota-se hoje um grande hiato entre o número de estruturas
primárias e secundárias disponíveis. Para se ter uma idéia desta diferença, o SwissProt [Gasteiger, Jung and Bairoch 2001], [Bairoch and Apweiler 2000], [Bairoch and
Apweiler 1997] , o mais importante banco de dados de estruturas primárias, incluía
em 21 de fevereiro de 2008, 349.480 seqüências e, no mesmo período, apenas
49.0480 estruturas de proteínas estavam definidas no PDB [Berman Westbrook
Feng Gilliland Bhat Weissig Shindyalov and Bourne 2000], o principal banco de
dados de estruturas terciárias de proteínas.
Desenho de Drogas Assistido por Computador
Devido ao avanço da biologia molecular e o advento das técnicas de simulação por
computador, o planejamento de medicamentos passou a ser feito de forma mais
lógica, o que é chamado de Desenho Racional de Drogas [Drews 1996]. O processo
do Desenho Racional de Drogas se inicia, geralmente, pelo isolamento de um alvo
específico, por exemplo, uma proteína. A estrutura da molécula alvo é determinada
por cristalografia por difração de raios-X ou ressonância magnética nuclear [Oshiro
and Kuntz 1995]. Conhecendo-se a estrutura 3D de uma proteína, uma análise
computacional pode apontar prováveis regiões de ligação. Com isso é possível
determinar um conjunto de candidatos (compostos líderes) que possa ligar-se a essa
região da proteína alvo. [Lybrand 1995].
Após esta triagem os compostos são sintetizados e testados
experimentalmente. Com base nos testes é gerado o medicamento ou é reavaliada a
estrutura do receptor e do ligante, reiniciando o ciclo.
Docking Molecular
O docking molecular é uma técnica utilizada para predizer se uma molécula se ligará
a outra, geralmente uma proteína à outra ou uma proteína a uma substância ligante.
O docking proteína-ligante é feito modelando-se a interação entre a proteína e o
ligante através de diversos critérios: se a geometria do par for complementar e
envolver interações bioquímicas favoráveis in silico, a substância ligante ligará
potencialmente a proteína in vitro ou in vivo.
Conforme Lengauer e Rarey [Lengauer and Rarey 1996], o docking molecular
constitui a base do desenho racional de drogas assistido por computador. Isto se
deve ao fato de que estas interações entre moléculas são fundamentais para alguns
processos biológicos, tais como a transcrição de genes e funções enzimáticas
[Lybrand 1995].
O docking molecular pode ser aplicado a macromoléculas, entre proteínas ou
proteína-DNA, ou então a pequenas moléculas (ligantes) e moléculas maiores
(receptores) [Lengauer and Rarey 1996]. As interações ligante-receptor são
processos de grande importância no desenvolvimento de um fármaco, considerando
que várias proteínas regulam funções biológicas por intermédio destas ligações.
Para avaliar o docking entre um ligante e um receptor são utilizadas funções
que avaliam a quantidade de energia despendida nesta interação [Lybrand 1995].
Tais funções levam em conta algumas variáveis tais como a polaridade da superfície
de cada molécula e as suas formas geométricas.
Figura 1: Representação esquemática do processo de docking em duas
dimensões.
Portanto, não basta um ligante ter a geometria necessária para se ligar a um
local do receptor se as energias não são compatíveis. Ou seja, devemos levar em
consideração os locais de ligação do receptor (binding sites ou pockets) e as
energias destes, conforme ilustrado na Figura 1.
Considerando o bloco maior, Receptor, e o bloco menor, Ligante, como
moléculas de tamanho diferenciado, podemos observar que há o processo de
translação e rotação para tentar atracar as moléculas. Porém, estas somente se
ligarão em locais onde possam se encaixar devidamente e onde as suas energias de
interação sejam compatíveis. No caso da reentrância localizada na parte inferior há
uma energia propícia, no entanto o Ligante está impedido por um bloqueio físico de
interagir com o Receptor naquele local. Por outro lado, no lado direito o encaixe
(geometria) é propício, mas as energias se repelem. Já no lado esquerdo, as
moléculas podem se encaixar e as energias são favoráveis para que a ligação ou
atracamento ocorra.
Figura 2: Representação esquemática do processo de docking em três
dimensões.
O processo apresentado em três dimensões na Figura 2 pode ser simulado
por alguns programas, tais como o AutoDock 3.0 [Goodsell Morris and Olson 1996],
LigandFit [Venkatachalam and al 2002] e DOCK [Oshiro and Kuntz 1995].
Objetivo geral
Realização de docking molecular para avaliar potenciais ligantes que possam ser
usados para desenvolvimento de novas drogas contra o S. mansoni. Este docking
será feito usando as estruturas que se encontram no Protein Data Bank
(http://www.pdb.org/pdb/home/home.do), os modelos de proteínas desenvolvidas
através de modelagem por homologia (www.schistosomaonline.com.br ), o banco de
dados contendo 10.000.000 componentes da Quantum Pharmaceuticals (http://qpharm.com/), e o banco de dados drugbank (http://drugbank.ca/). Os ligantes que se
mostrarem mais promissores serão testados em animais.
Metodologia
Etapa 1: Modelagem molecular por homologia estrutural
A estratégia baseia-se no conhecimento de que a conformação estrutural de uma
proteína é mais conservada que sua seqüência de aminoácidos durante o processo
evolutivo, e que pequenas mudanças na seqüência, em geral, resultam em, apenas,
sutis modificações na estrutura tridimensional [Nayeem, Sitkoff and Junior 2006]. Se
pelo menos uma seqüência homóloga para qual a estrutura tridimensional resolvida
for encontrada, o método de escolha para predição da estrutura tridimensional de
uma proteína-alvo é a própria modelagem comparativa ou por homologia [Höltje
Sippl Rognan, and Folkers 2003].
Geralmente, o processo de obtenção de um modelo protéico virtual através da
execução da estratégia da modelagem molecular por homologia estrutural envolve
quatro etapas principais: busca de proteínas homólogas, alinhamento das
seqüências, construção e otimização dos modelos, e a validação dos mesmos
[Hillisch Pineda and Hilgenfeld 2004].
O primeiro passo na modelagem comparativa é a identificação de estruturas
tridimensionais resolvidas, que possam atuar como um template para a modelagem
da seqüência-alvo (proteína-alvo). Esta identificação pode ser realizada levando-se
em consideração vários aspectos, como: conhecimento estrutural, similaridade de
função, expressão pelo mesmo grupo de genes, similaridade seqüencial ou até
correlação evolutiva [Deane and Blundell 2003]. Uma das maneiras mais eficientes
para se realizar uma busca de proteínas homólogas é através de similaridade
seqüencial, lançando-se mão de técnicas de bioinformática, uma vez que
seqüências de aminoácidos de proteínas com estruturas não-resolvidas podem ser
obtidas com certa facilidade. Nesse caso, o grau de identidade seqüencial, obtido
pelo alinhamento com relação a uma ou várias seqüências de estruturas conhecidas
tridimensionalmente, e a predição das estruturas secundárias que os aminoácidos
da seqüência-alvo assumirão são aspectos primordiais na construção do modelo
molecular da proteína-alvo [Muniz 2003].
A etapa de busca de proteínas homólogas tem como objetivo promover a
identificação de proteínas com estruturas tridimensionais resolvidas que se
correlacionam com a proteína-alvo, e que possam funcionar como molde para a
modelagem dessa proteína com estrutura tridimensional desconhecida [Hillisch
Pineda and Hilgenfeld 2004]. Há alguns programas disponíveis que podem ser
utilizados para a busca de seqüências homólogas em bancos de dados, como por
exemplo, o “ Basic Local Alignment Search Tool” (BLAST) [Altschul Gish Miller
Meyers and Lipman 1990]. Nessa busca, que funciona como um processo de
triagem, são utilizadas ferramentas para a avaliação do grau de similaridade entre
fragmentos das seqüências (alinhamento local), com o objetivo de distinguir entre
similaridades importantes do ponto de vista biológico ou estrutural de similaridades
ao acaso e que não apresentam importância significativa. A busca é realizada em
um banco de dados com estruturas resolvidas, como o PDB. Com a introdução da
seqüência da proteína-alvo, um algoritmo de busca de similaridade de seqüências é,
então, aplicado.
A partir da identificação de uma correlação entre a proteína-alvo e a(s)
proteína(s)-molde com estrutura resolvida selecionada(s) na busca, é necessário
obter um alinhamento seqüencial entre a proteína-alvo e a(s) proteína(s)-molde. O
objetivo é identificar a melhor correlação entre os resíduos de aminoácidos de cada
seqüência [Hillisch Pineda and Hilgenfeld 2004]. Quando apenas uma seqüênciamolde é identificada, é realizado apenas um alinhamento simples com a seqüênciaalvo. Quando várias seqüências-molde são identificadas, é necessária a obtenção
de um alinhamento múltiplo, em que estarão dispostas todas as seqüências-molde
selecionadas na busca, bem como a seqüência alvo.
Para gerar um alinhamento final entre as seqüências-molde selecionadas na
busca e a seqüência-alvo a ser modelada, foi usado o pacote computacional
“Alignment of Multiple Protein Sequences” (AMPS) [Barton and Sternberg 1997].
A comparação entre a precisão de modelos de proteínas de interesse
farmacêutico gerados por vários “softwares” disponíveis comercialmente ou de
domínio público, verificaram que quando a identidade seqüencial é maior do que
40%, os modelos gerados através da estratégia de modelagem por homologia
possuem um mesmo nível de exatidão, não havendo diferenças significativas
quando comparados às estruturas cristalográficas [Nayeem, Sitkoff and Junior 2006].
Quando a identidade seqüencial é menor, os resultados tendem a variar, com alguns
programas apresentando resultados muito mais precisos que outros.
Com respeito à faixa de identidade seqüencial para a execução da
modelagem molecular por homologia, foi usado um valor maior ou igual a 40% de
identidade seqüencial entre a(s) proteína(s)-molde e a proteína-alvo neste trabalho.
Etapa 2: Construção dos modelos virtuais
O método mais utilizado na atualidade para a construção automatizada de modelos
por homologia estrutural emprega técnicas de otimização de distâncias geométricas
a fim de satisfazer as restrições espaciais, abstraídas de uma estrutura homóloga
resolvida, com relação ao alinhamento da(s) seqüência(s)-molde com a da
seqüência a ser modelada [Muniz 2003]. Essa abordagem automatizada para
modelagem por homologia, baseada em restrições espaciais, foi implementada no
Modeller [Sali and Blundell 1993].
O alinhamento entre a seqüência-molde e a seqüência-alvo funciona como o
“input” de programas para modelagem comparativa por homologia. O “output” é um
conjunto de coordenadas atômicas para n modelos 3D para a proteína-alvo,
contendo os átomos da cadeia principal e lateral dos seus resíduos de aminoácidos.
A partir do alinhamento com as seqüências das estruturas-moldes, o programa
calcula várias restrições de distâncias e de ângulos torsionais na seqüência-alvo.
Etapa 3: Otimização dos modelos virtuais
Quando o modelo virtual gerado não apresentou geometria ideal, foi feito um
processo de otimização de geometria, que envolve minimização de energia. Nesse
contexto, a estrutura molecular é submetida a um processo de relaxamento, para
que o estado de energia mínima seja alcançado. A otimização das estruturas dos
modelos virtuais se dá basicamente por campo de força (mecânica molecular). Nos
cálculos de mecânica molecular a energia total é minimizada em relação às
coordenadas atômicas, de acordo com parâmetros pré-definidos pelo campo de
força.
Etapa 4: Validação dos modelos virtuais
Uma importante etapa no processo de modelagem por homologia é a avaliação da
qualidade dos modelos, principalmente se diferentes orientações referentes aos
resíduos do sítio ligante forem encontradas para os diferentes modelos gerados
[Schafferhans and Klebe 2001]. A partir do momento em que um modelo molecular
protéico é gerado através da utilização dessa abordagem e, subseqüentemente,
otimizado se torna importante e relevante a avaliação dos níveis de qualidade e
confiabilidade do mesmo. Esta é uma tarefa árdua, pois o nível de qualidade de um
modelo molecular depende de um grande número de propriedades de diferentes
graus de organização estrutural, como exatidão estereoquímica, qualidade do
empacotamento de resíduos e confiabilidade do enovelamento de acordo com os
ambientes químicos dos resíduos [Höltje Sippl Rognan Folkers 2003].
Foram usados três programas: Prochek, What If e Verify3D.
O programa Procheck [Schafferhansand
Klebe 1993] avalia diversos
parâmetros estereoquímicos, tais como ângulos torsionais da cadeia principal (Φ e
Ψ), ângulos torsionais das cadeias laterais, maus contatos (ou impedimentos
estéricos), energias das ligações de hidrogênio, planaridade das ligações peptídicas,
desvios em relação à geometria tetraédrica dos carbonos, dentre outros. O programa
serve para verificar a qualidade estereoquímica das estruturas dos modelos
construídos: foram avaliados a exatidão de parâmetros como comprimento das
ligações, ângulos entre ligações, ângulos torsionais e quiralidade dos aminoácidos
[Höltje Sippl Rognan and Folkers 2003].
Uma média da qualidade relativa à maioria dos parâmetros avaliados é
representada pelo Fator G e os cálculos baseiam-se em um banco de dados de
proteínas que contém estruturas resolvidas a diferentes graus de resolução. A rigor,
o Fator G é sempre referido nos resultados a uma determinada resolução estrutural,
na qual existe um valor médio de cada parâmetro associado às proteínas envolvidas
na avaliação.
O interior de proteínas globulares contém cadeias laterais que se encaixam
com certa complementaridade. As altas densidades de empacotamento observadas
em proteínas é conseqüência desse fato, o que resulta em segmentos de estrutura
secundária muito próximos: α-hélices contra α-hélices, α-hélices contra Folhas β
e/ou Folhas β contra Folhas β. O empacotamento do interior das proteínas
globulares é a maior contribuição para a estabilidade de toda a estrutura protéica.
Assim, a qualidade do empacotamento pode ser usada para estimar a confiabilidade
do modelo protéico [Höltje Sippl Rognan and Folkers 2003].
Existe uma variedade de métodos que usam uma grande quantidade de
informação derivada de estruturas de proteínas resolvidas para estimar a qualidade
do empacotamento de modelos de proteínas. Partindo da premissa de que as
interações átomo-átomo são as principais determinantes da conformação protéica,
Vriend & Sander , [Vriend and Sander. 1993] desenvolveram um método, contido no
módulo “Fine Packing Quality Control” do programa What If, que checa a qualidade
do empacotamento de modelos de proteínas através de cálculos do chamado índice
da qualidade de contato. Este índice é a medida da correlação entre a distribuição
dos átomos ao redor de uma cadeia lateral de um aminoácido e as distribuições
equivalentes observadas em proteínas com estruturas já resolvidas. Para isto, foi
gerado um banco de dados que contém uma distribuição de probabilidade de
contato atômico para todas as cadeias laterais dos aminoácidos. Neste banco de
dados é descrita a probabilidade de certo átomo estar em uma região particular ao
redor da cadeia lateral. Os valores de probabilidade são usados para avaliar a
qualidade dos contatos atômicos em um modelo protéico. Quanto maior for a
correlação entre as distribuições no modelo e as estruturas cristalizadas maior será
a qualidade do índice.
O programa Verify3D [Luthy Bowie and Eisenberg 1992], foi usado, e
determina os ambientes químicos de cada resíduo do modelo e atribui scores com
referência a uma matriz construída a partir de uma análise estatística envolvendo
estruturas de proteínas do PDB. Nessa matriz estão contidas três propriedades que
cada resíduo apresenta dentro de cada um dos 18 ambientes químicos definidos.
Finalmente, o programa realiza uma promediação na janela com o objetivo de
detectar regiões de baixa qualidade. A soma dos scores obtidos é comparada ao
valor ideal esperado para uma proteína de igual comprimento. O resultado da soma
deve ser maior do que 45% do valor esperado (ideal), que é a faixa encontrada para
estruturas de boa qualidade.
Recursos computacionais – Hardware
Nas etapas 1 a 4 foram usados os seguintes recursos computacionais:
Dois servidores com Processador Core 2 Duo, com 2,13 GHz, 4GB de RAM,
HD de 250 GB Sata, 84 estações com Processador Core 2 Duo, com 1,66 GHz, 1GB
de RAM, HD de 80 GB Sata, 26 estações com Processador Core 2 Duo, com 1,8
GHz, 2GB de RAM, HD de 80 GB Sata.
Etapa 5: Descoberta e Desenvolvimento de Fármacos com base nas estruturas
3D
A chave para o desenho de fármacos com base na estrutura é a estrutura
tridimensional de uma proteína alvo, preferencialmente com um ligante para a
identificação do sítio receptor. Uma vez definida, a estrutura do sítio receptor pode
ser usada para definir um farmacóforo para a triagem (“screening”) virtual de
bibliotecas de compostos e em estudos de ancoragem (“docking”) que podem ser
usados para aprimorar a estrutura dos compostos líderes. Alternativamente pode-se
utilizar algoritmos para identificar os possíveis sítios ativos baseados nas superfícies
acessíveis ao solvente ou bolsos de proteínas, a hidrofilicidade e a lipofilicidade
[Willis 2002].
A triagem virtual de biblioteca de compostos é uma abordagem complementar
ao “high througput screening” no processo de identificação de compostos líderes. A
definição do farmacóforo, ou seja, as características estéricas e eletrostáticas e o
respectivo arranjo espacial que é necessário para uma ligação de alta afinidade, é
um elemento chave para a triagem virtual ou in silico de um grande número de
compostos. O farmacóforo é usado como um modelo para a busca virtual em
bibliotecas de compostos, usando sucessivos filtros para uma redução do número de
compostos que realmente serão usados no “high througput screening”.[Gruneberg
Stubbs and Klebe 2002]
Etapa 6: Docking automático utilizando banco de dados de moléculas
As várias metodologias de screening virtual podem ser classificadas em duas
categorias, dependendo das informações disponíveis, se dos ligantes ou dos
receptores. Quando a estrutura do alvo é conhecida, métodos de docking molecular
podem ser usados para prever o modo de ligação dos compostos e medir a
qualidade do ajuste no sitio de ligação. Nesta abordagem a estrutura do alvo é
fundamental para explicar as atividades biológicas de um composto no metabolismo,
quer seja benéfica ou não. A atividade biológica é o resultado da interação do
composto com estruturas moleculares, a maioria delas proteínas. Assim, para prever
a atividade biológica, é necessário prever a afinidade de um composto com o
receptor alvo. O docking realiza essa predição usando a estrutura do alvo e um
método de posicionamento do ligante no sito de ligação. [Frimurer Peters Iversen
Andersen. Møller and Olsenjj 2003], [ Zavodszky and Kuhn 2005], [Cavasotto and
Abagyan 2004], [Wei. Weaver Ferrari Matthews and Shoichet 2004], [ Ferrari Wei
Constantino and Shoichet 2004], [Yoon and Welsh 2004].
O docking automático se opõe aos métodos interativos, pois esses são
baseados em um processo de seleção manual e subjetivo que pode ser usado para
a análise dos resultados individuais das interações conhecidas a fim de, por
exemplo, otimizar a interação. O objetivo dos métodos automáticos é realizar
screening de grandes bibliotecas de ligantes. Durante o docking o ligante é
posicionado dentro do sito de ligação do alvo. Este problema é particularmente
complexo, considerando o grande numero de graus de liberdade envolvidos: 3 de
translação, 3 de rotação, mais a flexibilidade conformacional das duas estruturas.
Assim, algumas aproximações são necessárias para realizar os cálculos em um
tempo de computação razoável, sem perder a exaustividade da exploração.
Geralmente, conceitos de fixação são simplificados e regras heurísticas ou
estocásticas são aplicadas.
Etapa 7: Montagem de banco de dados relacional de alvos biológicos de
interesse terapêutico
Os alvos terapêuticos reconhecidos (proteínas e ácidos nucléicos), com importância
clínica, são menos do que 500, no total. No entanto, existem inúmeros alvos sendo
pesquisados e com o advento da genômica a expectativa é que esse número
aumente muito. O genoma drogável é o resultado de pesquisas envolvendo o
genoma humano e cita cerca de 3000 proteínas que podem ter aplicação
terapêutica.[ Hopkins and Groom, 2002]
Um banco de dados relacional está sendo criado para integrar as informações
sobre as proteínas depositadas no SwissProt (http://ca.expasy.org/sprot/ ) e no PDB
(http://www.rcsb.org/pdb/),
e
os
fármacos
listados
(http://redpoll.pharmacy.ualberta.ca/drugbank/)
(http://www.genome.jp/kegg/),
TTD
(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/ttd.asp),
(Therapeutical
no
,
Target
DrugBank
KEGG
Database)
PharmGKB (http://www.pharmgkb.org/)
dentre outros. Com essas informações estamos calculando um índice de
drogabilidade, denominado DI (Druggability Index), que estima a drogabilidade de
novas proteínas a partir da similaridade com os alvos terapêuticos conhecidos, isto
é, a chance de uma dada seqüência protéica ser um alvo terapêutico potencial ou se
pertence à mesma família ou apresenta um domínio protéico de um alvo terapêutico
conhecido. O banco de dados ainda inclui informações sobre a estrutura
tridimensional para cada alvo. Aqueles sem estrutura tridimensional depositada no
PDB, serão modelados utilizando técnicas como homologia comparativa e
reconhecimento de folding. Assim pretende-se que o banco de dados inclua as
estruturas 3D do maior número possível de alvos terapêuticos.
Etapa 8: Construção do índice de drogabilidade de seqüências protéicas
Considerando o custo e o tempo para o desenvolvimento de um novo fármaco, é
essencial investigar as proteínas que são alvos de fármacos analisando suas
características comuns, que incluem o metabolismo, as características estruturais e
funcionais, e a drogabilidade. O termo drogabilidade é usado para expressar as
proteínas que são capazes de se ligar a moléculas pequenas com características e
fármacos.
A partir das seqüências dos alvos terapêuticos conhecidos e de informações
sobre as suas funções e processos biológicos (http://www.geneontology.org/), e das
famílias e domínios (http://www.ebi.ac.uk/interpro/) é possível identificar as
características associadas aos alvos terapêuticos conhecidos.
Para cada seqüência no Swiss-Prot e no PDB, será calculado um índice de
drogabilidade para se estimar se uma dada proteína é um alvo terapêutico, pertence
a uma família que contem algum alvo terapêutico, ou ainda se compartilha algum
domínio com um alvo terapêutico. Esse índice será usado para calcular o DI das
seqüências protéicas do S. mansoni, utilizando métodos de alinhamento de
seqüências.
Etapa 9: Docking automático dos alvos potenciais do S. mansoni contra as
moléculas dos fármacos conhecidos
Todos os alvos terapêuticos potenciais do Shistosoma mansoni identificados serão
analisados para identificação e mapeamento dos sítios ativos prováveis. Em seguida
realizar-se-á o docking automático de todas as moléculas do banco de dados, que
contém informações sobre os fármacos conhecidos, contra todos os alvos potenciais
selecionados. Este docking será feito usando as estruturas que se encontram no
Protein Data Bank (http://www.pdb.org/pdb/home/home.do), dos modelos de
proteínas
desenvolvidas
através
de
modelagem
por
homologia
(www.schistosomaonline.com.br ), o banco de dados contendo 10.000.000
componentes da Quantum Pharmaceuticals (http://q-pharm.com/), e o banco de
dados ZINC (http://zinc.docking.org/ ).
Para
isto,
será
usado
o
WCG
–
World
Community
Grid
(https://secure.worldcommunitygrid.org/index.jsp ) que usa os recursos disponíveis
em computadores do mundo inteiro para efetuar o processamento.
Referências
Altschul, S. F.; Gish, W.; Miller, W.; Meyers, E. W.; Lipman, D. J.(1990) Basic
local
alignment search tool. Journal of Molecular Biology. v. 215, pages
403-410.
Bairoch, A and Apweiler R.; (1997) J. Mol. Med. 75, page 312.
Bairoch, A and Apweiler R.; (2000) Nucleic Acids Res., 28, page 45.
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