WALKIRIA FERREIRA SILVA
Comparação da viabilidade das células mononucleares
totais da medula óssea de suínos em diferentes
protocolos de congelamento
São Paulo
2007
WALKIRIA FERREIRA SILVA
Comparação da viabilidade das células mononucleares totais da
medula óssea de suínos em diferentes protocolos de congelamento
Dissertação
apresentada
ao
Programa
de
Pós-
Graduação em Anatomia dos Animais Domésticos e
Silvestres da Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia da Universidade de São Paulo, para
obtenção do título de Mestre em Ciências
Departamento:
Cirurgia
Área de Concentração:
Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres
Orientadora:
Profª. Drª. Maria Angélica Miglino
São Paulo
2007
FOLHA DE AVALIAÇÃO
Nome: Silva, W. F.
Título: Comparação da viabilidade das células mononucleares totais da medula óssea de
suínos em diferentes protocolos de congelamento
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres da Faculdade
de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São
Paulo, para obtenção do título de Mestre em Ciências
Data:___/___/___
Banca Examinadora
Prof. Dr.______________________________Instituição:___________________________
Assinatura:_____________________________Julgamento:_________________________
Prof. Dr. _______________________________Instituição:__________________________
Assinatura:______________________________Julgamento:________________________
Prof. Dr. ________________________________Instituição:_________________________
Assinatura:_______________________________Julgamento:_______________________
Dedicatória e
Agradecimentos
Introdução
19
Silva, W.F.
1
INTRODUÇÃO
A terapia celular é tida como uma terapia muito promissora no que diz
respeito ao tratamento de diversas doenças, fundamentada principalmente na
provável
regeneração
dos
tecidos
lesados
promovida
pelas
células
transplantadas. A sua importância e aplicabilidade terapêutica torna-se ainda mais
evidenciável tendo-se em vista a incapacidade de proliferação de muitos tipos
celulares para a reposição do tecido injuriado (HIDEMASA et al., 2003). Uma das
fontes de células com provável capacidade de regeneração tecidual, no caso as
células-tronco, é a medula óssea. Verificam-se dois tipos distintos de fonte celular
componentes da medula óssea, sendo, 1) as células
hematopoiéticas
multipotentes – capazes de originar células sanguíneas (plaquetas, eritrócitos,
monócitos, granulócitos e linfócitos) e 2) as células multipotentes não
hematopoiéticas – capazes de originar células mesenquimais ou estromais
(PROCKOP, 1997; KRAUSE, 2002). Relata-se ainda que ambas as fontes
celulares
sejam
passíveis
de
obtenção
sem
a
instituição
de
terapia
imunossupressiva (SUSSMAN, 2001).
A quantificação do crescimento celular, incluindo proliferação e viabilidade,
tem se mostrado uma ferramenta essencial em muitos laboratórios que estudam
as células mononucleares totais. Muitos ensaios de viabilidade são baseados em
um ou dois parâmetros, tais como atividade metabólica e integridade da
membrana celular. Usualmente a atividade metabólica é mensurada em
populações celulares por meio de incubação com tetrazolium. Seguindo-se o
ensaio a exclusão por morte celular após-marcação com azul Tripan,
diferenciando-se então as células viáveis das não viáveis (CELL, 2003).
Ainda assim, muito a que ser pesquisado quanto à possível viabilidade
celular para utilização em transplantes, ou em bioengenharia de tecidos, uma vez
que, é ampla a variedade de fontes celulares e, não obstante, mais amplo ainda
pode ser a aplicação de técnicas de criopreservação e o período de estocagem
destas células.
18
Silva, W.F.
Objetivo
21
Silva, W.F.
2
OBJETIVO
Objetivamos testar diferentes protocolos de congelamento aplicados às
células mononucleares totais de origem medular com vista à determinação da
viabilidade celular pós-descongelamento (45 e 60), e conseqüente potencialidade
de expansão em cultura.
Revisão Bibliográfica
23
Silva, W.F.
3
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
As referências consultadas que embasaram a elaboração desta dissertação
foram separadas em capítulos como se segue.
3.1
REGENERAÇÃO TECIDUAL
Quanto às referências sobre regeneração tecidual dispomos:
3.1.1 Histórico
Em 1955, Barnes e Loutit detectaram que as células de baço
criopreservadas injetadas depois da irradiação letal podem produzir a recuperação
hematológica em ratos. Aproximadamente 40 anos depois, criopreservação de
medula óssea se tornou uma prática padrão na clínica para transplantes autológos
de medula óssea (AREMAN; AREMAN; SACHER; DEEG, 1990; SPUTTEK, 1991;
ROWLEY, 1992; HUBEL,1997; IKEHARA, 2002; SPUTTEK, 2004; HAIDER;
ASHRAF, 2005; FLEMING; HUBEL, 2006). A criopreservação também foi usada
com sucesso para transplantes alogênicos de medula óssea, embora o seu uso
não tenha se tornado comum (LASKY, 1989). O processamento de células-tronco
hematopoiéticas para transplantes modificou-se consideravelmente em 10 anos
passados. As células-tronco convenientes para transplantes podem ser obtidas de
várias fontes inclusive da medula óssea (AMOS; GORDON, 1995).
Na década de 60 foi descoberto que alguns tecidos adultos têm capacidade
de auto-regeneração como a pele, o epitélio intestinal e principalmente o sangue,
o qual tem suas células constantemente destruídas e reguladas por um complexo
24
Silva, W.F.
e fino processo de proliferação e diferenciação celular. Durante muitas décadas
estudou-se o processo de hematopoiese, processo de produção das células
sanguíneas, a partir de células-tronco multipotentes, localizadas no interior da
medula óssea, que são capazes de dar origem às células progressivamente mais
diferenciadas e com menor capacidade proliferativa. As células mesenquimais da
medula óssea, também têm capacidade de gerar as linhagens mielóide e linfóide,
que originam os tipos celulares presentes no sangue. O processo de renovação
celular é tão intenso que diariamente novas células sanguíneas entram na
circulação (SCORSIN, 1997).
3.1.2 Panorama Atual
A noção de que vários tecidos e órgãos do corpo humano como o fígado,
músculo esquelético, pâncreas e sistema nervoso têm um estoque de célulastronco, apresentando uma capacidade limitada de regeneração tecidual após
injúria, é recente. Ainda mais atual é a idéia de que as células-tronco presentes
nestes vários órgãos não sejam apenas multipotentes, ou seja, capazes de gerar
as células constitutivas daquele órgão específico, mas também pluripotentes, as
quais poderiam também gerar células de outros órgãos e tecidos (GOODELL,
2001; MALOUF, 2001). Obviamente, a possibilidade de se utilizar as próprias
células dos indivíduos adultos poderia contribuir para a resolução dos dois
principais problemas enfrentados pela bioengenharia: a rejeição imunológica de
transplantes heterólogos e as objeções ético-religiosas do uso de material fetal. O
primeiro relato incontestável desta propriedade das células-tronco adultas foi
publicado em 1998, por um grupo de cientistas italianos, os quais estudaram a
regeneração do músculo esquelético por células derivadas da medula óssea
(FERRARI, 1998).
25
Silva, W.F.
3.1.3 Células-tronco e criopreservação
O intuito da criopreservação é preservar a célula-tronco, obtida da medula
óssea, sangue periférico ou cordão umbilical, de maneira que a sua viabilidade e
integridade funcional sejam mantidas após o descongelamento (BITTENCOURT;
ROCHA, 2006). As células-tronco podem ser mantidas congeladas a -80ºC por até
dois anos ou por períodos significativamente mais longos (mais de 14 anos)
quando armazenados em tanque de nitrogênio líquido (AIRD, 1992; DE VRIES,
2004).
Na criobiologia, a formação de cristais de gelo durante o congelamento é a
causa primária de danos celulares. Cristais de gelo intracelulares podem ser
formados durante o congelamento rápido, resultando em uma ruptura mecânica
das estruturas celulares. Sob processo de congelamento lento, a formação de
cristais de gelo ocorre no espaço extracelular, resultando em um aumento da
osmolaridade extracelular à medida que a água livre é incorporada aos cristais de
gelo. Essa diminuição de água resulta na concentração de solutos extracelulares,
tais como os íons sódio, podendo causar uma hiperosmolaridade extracelular,
levando a uma desidratação celular. A desidratação progressiva da célula ocorrerá
durante o congelamento excessivamente lento, permitindo maior passagem de
água para o espaço extracelular, sendo incorporada aos cristais de gelo. Parece
que a permeabilidade celular à água seja o fator limitante no estabelecimetno do
processo de congelamento para qualquer célula em particular (MASSUMOTO,
2000).
Múltiplos mecanismos foram encontrados para garantir a sobrevivência das
células ao descongelamento. A resposta de uma célula ao ambiente congelado
pode ser mostrada esquematicamente na figura 1. Inicialmente, as células são
suspendidas em uma solução criopreservante em temperatura ambiente. Como a
amostra é esfriada, a formação do gelo é iniciada (espontaneamente ou
semeando). A formação do gelo na solução extracelular retira a água na forma do
gelo da solução. Esta retirada de água produz uma modificação abrupta na
26
Silva, W.F.
concentração da porção descongelada da solução extracelular. Quando exposto à
concentração extracelular crescente, a célula responde exprimindo água para
conseguir um novo estado de equilíbrio entre soluções intracelulares e
extracelulares. Em altas taxas de esfriamento, o equilíbrio não pode ser mantido
porque a taxa na qual o potencial químico na solução extracelular está sendo
diminuída é muito maior do que a taxa na qual a água pode difundir-se fora da
célula. O resultado deste desequilíbrio é a formação de gelo intracelular (IIF)
sendo letal à célula (TONER, 1993).
Figura 1 –
Esquema representativo do comportamento celular quando
submetida a protocolos de congelamento
27
Silva, W.F.
Os protocolos de criopreservação geralmente requerem o uso de
crioprotetores compostos para promover melhor sobrevivência das células e
tecidos sob congelamento (BATESON, 1994; KARLSSON, 1996; MULDREW,
1996; BIDAULT, 2000; LAKEY, 2003;), e para moderar os normalmente letais
efeitos da concentração extracelular de sal, do gelo intracelular e gelo na matriz
celular. Na criopreservação tradicional de células em suspensão, crioprotetores
são usados para manipular o ponto de congelamento intra e extracelular, assim
manipulando também a quantidade de gelo formado a dada temperatura. O
sucesso
de
um
protocolo
depende
normalmente
da
concentração
de
crioprotetores dentro das células ou tecidos. O crioprotetor entra nas células e
tecidos através de equilíbrio termodinâmico com o meio. No caso reverso,
equilíbrio termodinâmico também proporciona a remoção dos crioprotetores
internos através de uma solução de diluição usada no fim do processo quando as
células ou tecidos são preparadas para o uso (FATHY, 1984; FULLER, 1989;
TAYLOR, 1992; FULLER, 1994; WALCERZ, 1995; ISBELL, 1997; ZIGGER, 1997;
ELMOAZZEN, 2005;).
O crioprotetor mais frequentemente utilizado é o dimetilsulfóxido (DMSO). A
adição desse penetrante crioprotetor diminui o volume de água para formação de
cristais de gelo e consequentemente, o grau de desidratação da célula. Isso
resulta em adequada criopreservação das células(AIRD,1992;
MASSUMOTO,
1996; DE VRIES, 2004; ). Os crioprotetores foram criados com o propósito de
substituir a água nas células. Isso minimiza o dano criado pela formação de gelo e
propicia a formação de um estado amorfo nas células, em vez de cristais de gelo,
durante o ciclo resfriamento-crioarmazenamento-aquecimento. Os crioprotetores
podem ser separados em dois grupos principais, em relação a seus papéis, a
saber, agentes penetrantes e não-penetrantes de acordo com a tabela 1.
28
Silva, W.F.
Tabela 1 - Classificação de agentes criopreservadores segundo o peso molecular e outras
propriedades.
A. Crioprotetores penetrantes (PC)
B. Crioprotetores não penetrantes (NPC)
Baixa molecularidade:
Açúcares:
Alta molecularidade:
MW<100Da
180<MW<594Da
MW>1000Da
Poli alcoólicos (PVAs):
Ficoll
Dextran
Etileno glicol (EG)
Monossacarídeos
Polivinil
pirrolidona
(PVP)
Dimetilsulfóxido (DMSO)
Frutose, Glicose
Polietilglicol (PEG)
Propilenoglicol
Lactose, Maltose
Polvinil alcoólico (PVA)
Glicerol
Agente bloqueador de
formação de cristais de
gelo derivado de PVA
Amido
hidróxietílico
(HES)
Butandióis:
Dissacarídeos:
1,2-/2,3-butandiol
Sacarose
Trehalose
Acetamida, Metanamida
Polissacarídeos:
Rafinose
Fonte: Vitrification as a prospect for cryopreservation of tissue-engineered constructs.
KULESHOVA et al. 2006.
Um ponto importante a ser considerado no desenvolvimento dos processos
de criopreservação é o de evitar efeitos tóxicos das soluções criopreservantes. A
toxicidade dos crioprotetores penetrantes é objeto de árdua investigação, já que
todos os agentes de baixo peso molecular são potencialmente tóxicos às células.
Para a criobiologia, os procedimentos para estimar os efeitos de um crioprotetor
para a viabilidade celular são bem conhecidos. Essa estimativa é, em geral, feita
pela avaliação das variáveis nos seguintes parâmetros: tipo de crioprotetor,
concentração de crioprotetor e tempo de exposição ao crioprotetor (MUKAIDA,
1998; VALDEZ , 1998; KULESHOVA, 2006).
Os protocolos atuais de criopreservação de células-tronco hematopoiéticas,
são geralmente baseadas em concentrações de 10% de dimetilsulfóxido (DMSO)
como crioprotetor intracelular (ELLIOT, 1994), os efeitos tóxicos relacionados à
infusão de DMSO são, via de regra, relacionados à dosagem, e apesar de serem
geralmente inócuos ou leves, podem se tornar severos (DAVIS, 1990;
STRONCEK, 1991; ZAMBELLI, 1998). Geralmente para a criopreservação são
utilizados freezers programados seguido pelo armazenamento das células em
29
Silva, W.F.
nitrogênio líquido ou em fase de vapor, o que consome muito tempo e requer
equipamentos automatizados de valores exorbitantes (ELLIOT, 1994).
Há dez anos foi descrito um protocolo simplificado de criopreservação de
células-tronco hematopoiéticas a -80ºC que não dependia de congelamento
programado em freezer. Tal protocolo envolvia o armazenamento de soluções
contendo 5% e 10% de DMSO, sendo esse o único crioprotetor (GALMES, 1995;
GALMES, 1996; GALMES, 1999). A maioria dos estudos parece indicar que esse
procedimento simplificado está associado a uma redução na toxicidade e a custos
mais baixos, nenhuma diferença significativa foi observada em períodos médios
de armazenamento e viabilidade pós-descongelamento de células nucleadas entre
as células criopreservadas com 5% e 10% DMSO. Quando usada a
criopreservação a 5% DMSO, foi observada uma regeneração hematológica mais
lenta comparada à do grupo criopreservado a 10%DMSO, isso pode sugerir que a
concentração de DMSO 10% aumenta a proteção ou conservação das células,
permitindo a mesma dose de células no grupo DMSO10% induzir uma
recuperação hematológica mais veloz que uma dose similar aplicada ao grupo de
DMSO 5% (GALMES, 2007).
As células-tronco da medula óssea apresentam capacidade de se
transformar em diferentes tipos de células (FUKUDA, 2001), entretanto, para a
realização dos transplantes autólogos de células mononucleares totais da medula,
serão necessários alguns cuidados essenciais no processo de criopreservação e
armazenamento, cujos efeitos devido ao longo prazo de congelamento e
capacidade imunohematopoiética ainda são pouco conhecidos. A partir de então,
RE, 1998 estudaram células da medula óssea, criopreservadas e estocadas por
mais de cinco anos relatando a preservação de boa viabilidade com formação de
colônias in vitro, as quais registraram índices de contagem de granulócitos
maiores do que 500x106/L em 21 dias e de plaquetas maiores do que 20x109/L
após 30 dias de transplante. Ao término de 29 dias, o nível de hemoglobinas do
paciente era satisfatório, não havendo necessidade de transfusão.
Walter et al. (1999) reportaram que o armazenamento das células
criopreservadas deve obedecer a um padrão de baixas temperaturas entre -70 a –
30
Silva, W.F.
180Cº, acrescentando-se que, quando armazenadas a temperatura entre –80 a 90Cº, pode-se também obter resultados satisfatórios.
Liu et al. (1980) descreveram alta viabilidade das células hematopoiéticas
provenientes
da
medula
óssea
de
ratos
vivos
após
criopreservação,
demonstrando que as células precursoras granulocíticas tiveram média à
moderada viabilidade enquanto a capacidade proliferativa dos eritrócitos
demonstrou-se diminuindo após congelamento.
A tecnologia de preservação de células cultivadas tem progredido, e as
células mesenquimais criopreservadas tem apresentado alta capacidade de
reparação tecidual devido à facilidade de diferenciação (BRUDER, 1997; SPURR,
2002).
Uma etapa muito importante no transplante autólogo de medula óssea é a
criopreservação da mesma ou das células tronco-hematopoiéticas periféricas. A
criopreservação permite o estabelecimento de regimes de condicionamento por
vários dias, como também, o armazenamento profilático para pacientes a serem
transplantados meses ou anos mais tarde. O fato de que a célula-tronco
hematopoiética possa ser criopreservada com sucesso é evidenciado pela
capacidade da mesma em regenerar a função da medula após regimes com altas
doses de quimioterápicos. A falha na recuperação hematopoiética, geralmente,
não é atribuída à criopreservação de células pluripotentes, porém há relatos que
correlacionam a mau criopreservação de células pluripotentes como sendo
responsável pela demora na recuperação hematopoiética, após o transplante
(ROWLEY,
1992;
MASSUMOTO,
2000).
Existem
dois
métodos
de
criopreservação. Um dele é realizado pelo congelamento rápido das células,
quando a medula ou as células-tronco periféricas são colocadas diretamente em
um freezer a -80ºC e a concentração final da solução crioprotetora é de 5%
dimetilsulfóxido (DMSO), 6% de solução de amido hidroxietilamido e 4% de
albumina humana em solução salina. O outro método realiza o congelamento lento
e progressivo, quando a razão de decaimento da temperatura é controlada por
computador. Nele, a solução crioprotetora é constituída por 40% de meio de
cultura, 40% de plasma autólogo e 20% de DMSO. A técnica de congelamento
31
Silva, W.F.
lento e descongelamento rápido evita os danos mecânicos e a desidratação
causada pela formação e crescimento de cristais de gelo. O descongelamento das
células deve ser rápido para que os cristais de gelo, formados durante o
congelamento, não danifiquem a membrana celular (MASSUMOTO, 1996).
Pettengell et al. (1994) demostraram que células mononucleares de medula
óssea e de sangue periférico, criopreservadas em temperatura de 4ºC por 5 dias
apresentaram viabilidade diminuída com o passar das horas. As análises
realizadas 24 h após a criopreservação alcançaram índice de viabilidade de 90%,
passadas 48 horas a viabilidade reduziu-se a 68%, atingindo 47% após 72 h de
criopreservação.
Segundo
Weiner,
Tobias
e
Yankee
(1976)
células
mononucleares de medula óssea humana, foram coletadas e criopreservadas em
solução contendo 10% de dimetilsulfóxido (DMSO), atingindo uma viabilidade de
50% após descongelamento. De acordo com Galmes et al., (1995) foram usadas,
para transplantes em 11 pacientes, células-tronco criopreservadas a temperatura
de –80ºC por congelamento em freezer programado mecanicamente e
crioprotegidas por solução contendo 10% DMSO proporcionando uma viabilidade
de 90%.
Parker et al., (1981) relataram a criopreservação de medula óssea humana
por período de 42 meses em nitrogênio líquido, conferindo-se viabilidade de 79%
após o processo de descongelamento. Em estudo realizado por Donnenberg et al.
(2002) testou-se a viabilidade de células mononucleares de medula óssea
criopreservadas por um período de 9 a 14 anos, sendo verificado que 95% das
células estavam viáveis após descongelamento para transplante. Kawano et al.
(2004) testaram o método de criopreservação com temperatura a -80ºC, em
freezer programado com medula óssea humana coletada de pacientes por um
período de 7 anos e obtiveram resultados de viabilidade variando de 75% – 89%
quando as células foram descongeladas.
Materiais e Métados
33
Silva, W.F.
4
MATERIAis E MÉTODOS
O material utilizado e os métodos empregados nesta investigação são
descritos neste capítulo
4.1
MATERIAL PROPOSTO
Foram utilizados para a extração de medula óssea 8 suínos hígidos,
fêmeas, pesando aproximadamente 25 Kg, provenientes de granjas da Cidade de
São Paulo.
4.2
PROTOCOLO ANESTÉSICO
Os animais foram pré-medicados com associação anestésica de Cloridrato
de Ketamina (Dopalen£ - Vetbrand) na dose de 3 mg/Kg e Cloridriato de
Midazolan (Dormire£ - Cristália) na dose de 0,5 mg/Kg na mesma seringa,
aplicados via intramuscular (IM). Logo após, os animais foram encaminhados a
sala de cirurgia. Na sala cirúrgica foi realizado acesso venoso na orelha para a
infusão de fluidoterapia, com utilização de Ringer Lactato e o volume infundido foi
de aproximadamente 1 litro e 500 ml. A indução anestésica foi realizada com
emprego de Propofol (Propovan£ - Cristália), na dose de 5 mg/Kg intravenoso (IV).
Em seguida realizou-se a intubação orotraqueal (IOT), com sonda traqueal
adequada ao animal. A manutenção anestésica foi realizada pela aplicação de
anestesia geral inalatória utilizando-se Isofluorano (Isoforine£- Cristália) utilizando
aparelho de anestesia modelo Shoogun Evolution 2700£ (Takaoka) (Figura 2) e a
modalidade ventilatória escolhida foi Ventilação Controlada a Pressão (Pcv) com
34
Silva, W.F.
FR= 15 (freqüência respiratória) e PEEP = 5 cm H2O (pressão respiratória final
das vias aéreas).
Figura 2 – Fotografia do aparelho de anestesia
inalatória Shoogun Evolution 2700£
(Takaoka)
35
Silva, W.F.
4.3
Protocolo Cirúrigico
Com os animais em plano anestésico realizou-se a assepsia da pele na
região da crista ilíaca. Seguindo-se a analgesia da pele, tecido subcutâneo e
musculatura com utilização de Cloridrato de Lidocaína a 0,2% sem vaso constritor,
e aguardado sua ação procedeu-se a punção com agulha para punção óssea,
tamanho 11 x 10,2cm (HS MEDICAL) (Figura 3A), a qual apresentava-se envolta
por uma cânula sendo ambas perfuro-cortante, dispensando assim, uma incisão
local. A agulha foi introduzida na medula óssea e, por pressão negativa foram
aspirados aproximadamente 60ml de sangue de medula em seringas de 10mL
Luer-lock£ (BD) (Figura 3B) contendo anticoagulante (heparina sódica bergamoActiparin®) (CROW; WALSHAW, 2000). Após a coleta (Figura 4) as seringas
contendo
o
aspirado
medular
foram
suavemente
homogeneizadas
e
acondicionadas em isopor com gelo para transporte e conseqüente separação das
células mononucleares.
Figura 3 – Fotografia da cânula para punção de medula óssea (A) e seringa lower-lock (B)
36
Silva, W.F.
Figura 4 – Em A: Fotografia do procedimento de punção da
medula
óssea
da
crista
ilíaca
realizado
após
anti-sepsia
e
localização
óssea
através
de
palpação.
Em
B,
desenho
esquematizado
demonstrando
as
regiões
de
interesse
no
momento da coleta de material
37
Silva, W.F.
4.4
SEPARAÇÃO DAS CÉLULAS MONONUCLEARES TOTAIS DA MEDULA
ÓSSEA
A separação das células foi realizada por gradiente de densidade FicollPaqueTMPlus®1 (Amersham Bioscience) (STRAUER et al., 2001).
O material coletado foi separado em frações de 20ml e estes colocados em
tubos cônicos, adicionando-se aos mesmos, solução fisiológica 0,9% na proporção
de 1:1 o qual nos referimos como sendo solução final. Em outros tubos foram
colocados 15ml de Ficoll-PaqueTM Plus£ (Amsersham Pharmacia©) e com
emprego de pipeta de transferência alocada à parede do tubo, adicionando
suavemente a solução final preparada com a medula óssea (15ml de Ficoll-Paque
e 30ml de medula óssea).
EstatécnicaevitaqueocorramisturacomoFicollPaqueTM Plus£, (Amsersham Pharmacia©), pois
somente assim a separação celular por gradiente de
densidade pode ser realizada com sucesso.
Em
seguida,
estes
tubos
contendo
solução
mistacompostademedula, solução fisiológica e Ficoll
foram centrifugados por 20 minutos, a velocidade de
2000rpm e a temperatura de 20ºC. Após a
centrifugação pode-se observar a formação de um
halodecélulas mononucleares, sob o plasma (Fig. 4),
o qual foi coletado com auxílio de pipeta Pasteur e
acondicionado em outro tubo cônico, adicionando-se
então solução de soro fetalbovino(SBF),associado à
solução fisiológica (SF) 0,9% em uma proporção de
1:6 (5ml de soro fetal e 30ml de solução fisiológica).
Novamente o material foi centrifugado por sete
dmdmdmdmd
Figura 4 – Esquema
representativo
da
formação
e
localização
do
halo
de
células
(CMMO) no tubo
cônico
após
a
centrifugação
39
Silva, W.F.
4.4.1 Teste de Viabilidade
Os testes de viabilidade foram feitos a partir de contagem das células
coradas com azul Tripan com utilização de Câmara de Neubauer, imediatamente
após a coleta das amostras (Figura 5).
Figura 5 -
Fotografia demonstrando os materiais empregados na
estimativa da viabilidade celular – São Paulo, SP,
Brasil, 2007
Para a citometria, as amostras foram descongeladas em banho-maria a
uma temperatura de 37ºC e colocadas em tubos cônicos com volume de 15ml de
solução fisiológica 0,9% para centrifugação por 5 minutos a 2000rpm. Este
procedimento foi repetido por mais duas vezes. Seguidamente, as amostras foram
ressuspendidas em volume de 2ml de solução fisiológica para a marcação das
células viáveis e não viáveis com corante fluorescente para em seguida serem
avaliadas pelo citômetro.
Durante o processamento no citômetro de fluxo, há a passagem de células
individualmente por uma câmara de fluxo que gera um fluxo laminar de células,
onde incide um raio de luz (laser). A dispersão do mesmo (scatter) e dos corantes
40
Silva, W.F.
fluorescentes emite luzes de freqüências variadas que são captadas por filtros e
detectores fotomultiplicadores, os quais convertem a luz em pulsos eletrônicos e
que serão captados pelo software. A dispersão luminosa fornece os primeiros
dados sobre a caracterização de sua amostra celular. Ela permite investigar a
célula no que diz respeito ao seu tamanho (forward scatter) e à sua complexidade
e granularidade (side scatter). Em geral, esses critérios são utilizados para a
exclusão de debris celulares e células mortas. Por outro lado, os corantes
permitem a identificação do tipo celular, ou seja, do fenótipo celular. Deste modo o
conjunto dessas informações permite a quantificação das células e análise da
pureza celular. A citometria de fluxo apresenta outras aplicações nos estudos com
células-tronco, tais como a análise da viabilidade celular com o uso de corantes
fluorescentes (FONTES; ORELLANA; PRATA, 2006).
41
Silva, W.F.
4.5
CRIOPRESERVAÇÃO
Foram testados protocolos com meios de cultura composto principalmente
por DMSO. Após a coleta e separação as células mononucleares totais foram
congeladas em criotubos com capacidade de 1,8ml contendo os meios de
congelamento, determinados por oito protocolos distintos (Tabela 2):
1) meio de congelamento A foi composto por 20% dimetilsulfóxido (DMSO),
40% Dulbecco´s Modified Eagle´s Médium (DMEM) e 40% plasma autólogo.
2) meio de congelamento B continha 20% dimetilsulfóxido (DMSO), 40%
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) e 40% de plasma autólogo.
3) meio de congelamento C teve em sua composição 20% dimetilsulfóxido
(DMSO), 40% soro fetal bovino (SFB) e 40% plasma autólogo.
4) meio de congelamento D foi composto de 20% dimetilsulfóxido (DMSO),
80% de plasma autólogo.
5) meio E constituiu-se de 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de
Dulbecco´s Modified Eagle´s Médium (DMEM) e 47,5% de plasma autólogo.
6) meio F conteve 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de Roswell Park
Memorial Institute (RPMI) e 47,5% de plasma autólogo.
7) meio G conteve 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de soro fetal bovino
(SFB) e 47,5% de plasma autólogo.
8) meio H constituiu-se de 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 95% de plasma.
42
Silva, W.F.
Tabela 2 – Tabela representativa dos componentes dos meios de congelamento aplicados às
células mononucleares totais submetidas à criopreservação – São Paulo, SP, Brasil,
2007
Componentes do meio de congelamento
PLASMA
DMEM2
DMSO
RPMI3
AUTÓLOGO
5,0% 20,0% 40,0% 47,5% 40,0% 47,5% 40,0% 47,5%
1
Meio
A
X
X
B
X
X
C
X
X
D
X
2X
SORO FETAL
BOVINO
40% 47,50%
X
X
X
E
X
X
F
X
X
G
X
X
H
X
2X
X
X
X
1. DMSO – Dimetilsulfóxido
2X – Representam o dobro da concentração
2. DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle’s Médium
3. RPMI – Roswell Park Memorial Institute
O congelamento das células foi feito da seguinte forma: 30 minutos a -4ºC,
4 horas a uma temperatura de -20ºC, 12 horas em temperatura de -40ºC para
depois serem transferidas para o nitrogênio líquido a uma temperatura de -196ºC.
Resultados
44
Silva, W.F.
5
RESULTADOS
Os resultados encontrados nesta pesquisa são discorridos em tópicos.
5.1
RESUTADOS OBTIDOS EM CÂMARA DE NEUBAUER
Após um período de 45 dias de congelamento, as amostras foram
descongeladas em banho-maria a uma temperatura de 37ºC e colocadas em
tubos cônicos com volume de 15ml de solução fisiológica 0,9% para centrifugação
por 5 minutos a 2000rpm. Este procedimento foi repetido por mais duas vezes.
Seguidamente as amostras foram ressuspendidas em volume de 2ml de solução
fisiológica para a marcação das células não viáveis com Azul Tripan. Os
resultados dos meios A, B, C, D, E, F, G e H, estão descritos na tabela 3.
Tabela 3 – Tabela representativa dos resultados obtidos pela contagem de viabilidade
celular nos meios de congelamento aplicados às células mononucleares
totais submetidas à criopreservação realizados em câmara de Newbauer
após o descongelamento – São Paulo, SP, Brasil, 2007
Células Viáveis - Descongelamento com 45 dias
Contagem em Câmara de Neubauer [%]
[20%] DMSO
Animal
Média
Mínimo
Máximo
DP1
CV2
1
2
3
[5%] DMSO
A
B
C
D
E
F
G
H
43,0
83,0
72,0
66,0
43,0
83,0
20,7
3,2
20,0
73,0
69,0
54,0
20,0
73,0
29,5
1,9
87,0
70,0
73,3
76,8
70,0
87,0
9,0
8,5
78,0
30,0
62,5
56,8
30,0
78,0
24,5
2,3
68,0
85,0
41,8
64,9
41,8
85,0
21,8
3,0
75,0
60,0
50,0
61,7
50,0
75,0
12,6
4,9
72,0
84,0
70,0
75,3
70,0
84,0
7,6
9,9
43,0
82,0
41,9
55,6
41,9
82,0
22,8
2,4
1. DP – Desvio Padrão
2. CV – Coeficiente de Variação
45
Silva, W.F.
5.2
RESULTADOS OBTIDOS PELA TÉCNICA DE CITOMETRIA DE FLUXO
Após um período de 45 dias de congelamento, as amostras foram
submetidas à quantificação realizada em citômetro de fluxo. Os resultados dos
meios A, B, C, D, E, F, G e H, estão descritos na tabela 4 e gráficos 1, não
obstante, ainda representaram-se as viabilidades obtidas em montagens de dot
plots (Gráficos 2 a 9).
Tabela 4 - Tabela representativa dos resultados obtidos pela contagem de viabilidade
celular nos meios de congelamento aplicados às células mononucleares
totais submetidas à criopreservação realizados em citômetro de fluxo após o
descongelamento – São Paulo, SP, Brasil, 2007.
Células Viáveis – Descongelamento com 45 dias
Animal
Média
Mínimo
Máximo
DP1
CV2
1
2
3
4
5
6
7
8
Contagem em Citômetro de Fluxo [%]
Protocolos 20% DMSO
Protocolos 5% DMSO
A
B
C
D
E
F
G
19,48 21,77 2,31 54,24 6,49
3,79
3,05
15,54 15,40 40,24 80,00 8,78
22,82
9,74
16,40 25,36 24,68 70,00 5,70
13,85
6,88
14,36 7,08 10,33 84,20 25,80 10,28 10,41
30,28 11,11 38,33 23,55 25,41 27,13
8,77
70,23 72,47 73,35 66,98 20,54 26,40 28,64
28,14 18,54 24,90 24,80 15,35 11,36 11,45
18,90 9,56 25,22 10,27 14,66 13,89 12,08
26,67 22,66 29,92 51,76 15,34 16,19 11,38
14,36 7,08
2,31 10,27 5,70
3,79
3,05
70,23 72,47 73,35 84,20 25,80 27,13 28,64
18,54 21,07 21,66 28,45 8,04
8,37
7,54
1,44
1,08
1,38
1,82
1,91
1,93
1,51
1. DP – Desvio Padrão 2. CV – Coeficiente de Variação
H
5,87
18,16
38,74
30,74
30,86
59,31
26,22
17,44
28,42
5,87
59,13
16,09
1,77
46
Silva, W.F.
A
B
C
Protocolos [20%] DMSO
D
E
F
G
H
Protocolos [5%] DMSO
Contagem em Citômetro de Fluxo [%]
Células Viáveis - Descongelamento com 45 dias
Gráfico 1 – Histograma representativo das médias obtidas pela contagem de
viabilidade celular nos meios de congelamento aplicados às células
mononucleares totais submetidas à criopreservação realizadas em
citômetro de fluxo após o descongelamento em 45 dias – São Paulo, SP,
Brasil, 2007.
55
Silva, W.F.
Após um período de 60 dias de congelamento, as amostras foram
submetidas à quantificação realizada em citômetro de fluxo. Os resultados dos
meios A, B, C, D, E, F, G e H, estão descritos na tabela 5 e gráfico 10. As
viabilidades obtidas foram demonstradas em dot plots a seguir (Figs. 14 a 21).
Tabela 5 -
Tabela representativa dos resultados obtidos pela contagem de
viabilidade celular nos meios de congelamento aplicados às células
mononucleares totais submetidas à criopreservação realizados em
citômetro de fluxo após o descongelamento – São Paulo, SP, Brasil,
2007
Células Viáveis – Descongelamento com 60 dias
Animal
1
2
3
4
5
6
7
8
Média
Mínimo
Máximo
DP1
CV2
1. DP – Desvio Padrão
Contagem em Citômetro de Fluxo [%]
Protocolos 20% DMSO
Protocolos 5% DMSO
A
B
C
D
E
F
G
17,38 3,59 18,12 54,89 4,78
23,27 12,13
14,92 20,53 32,54 54,78 13,31 22,24 12,73
16,92 2,80 17,19 48,32 32,52 34,91 17,32
15,40 24,80 37,70 43,20 12,80 18,20 11,40
18,73 19,28 15,09 37,28 17,45 20,41 10,13
5,50 11,11 17,68 83,11 14,27 16,33 14,62
16,90 28,47 29,01 79,56 11,10 12,13
6,98
65,20 66,30 66,00 61,72 13,35 38,82 25,17
21,37 22,11 29,17 57,86 14,95 23,29 13,81
5,50
2,80 15,09 37,28 4,78
12,13
6,98
65,20 24,80 37,70 54,89 32,52 34,91 17,32
1,54 10,26 10,26 7,60 10,23
6,50
2,74
13,88 2,16
2,84
7,61
1,46
3,58
5,05
2. CV – Coeficiente de Variação
H
28,77
24,12
36,13
31,70
42,54
27,12
42,63
72,02
38,13
24,12
42,54
7,05
5,41
56
Silva, W.F.
A
B
C
D
E
Protocolos [20%] DMSO
F
G
H
Protocolos [5%] DMSO
Contagem em Citômetro de Fluxo [%]
Células Viáveis - 60 dias
Gráfico 10 –
Histograma representativo das médias obtidas pela contagem de viabilidade celular
nos meios de congelamento aplicados às células mononucleares totais submetidas à
criopreservação realizadas em citômetro de fluxo após o descongelamento em 60 dias
– São Paulo, SP, Brasil, 2007
65
Silva, W.F.
As amostras avaliadas com 45 dias de congelamento pertencentes aos
protocolos A, B, C e D contendo 20% DMSO (dimetilsulfóxido) como crioprotetor,
apresentaram
médias
descongelamento
dos
de
viabilidade
protocolos
E,
superiores
F,
G
e
H
as
apresentada
contendo
5%
no
DMSO
(dimetilsulfóxido), no mesmo período. O mesmo ocorreu quando fizemos o
descongelamento das amostras após o período de 60 dias, conforme tabelas 4 e 5
(acima). Os protocolos D e H individualmente apresentaram melhor viabilidade
tanto para o descongelamento no período de 45 dias quanto para o período de 60
dias.
Foram selecionados aleatoriamente três protocolos após 60 dias de
criopreservação e colocados em cultivo para observarmos se estas células
perderam sua capacidade de expansão. As amostras ficaram em cultivo por sete
dias. Durante este período notamos que nos primeiros dias as células
apresentaram boa viabilidade e intensa atividade metabólica e algumas células se
aderiram ao fundo das placas. A partir do quinto dia as células começaram a
morrer e no sétimo dia quase não observamos células viáveis nas placas.
Discussão
68
Silva, W.F.
6
DISCUSSÃO
6.1 MÉTODOS DE ESTIMATIVA DE VIABILIDADE CELULAR
A quantificação da porcentagem de viabilidade celular foi feita por campo
em câmara de Neubauer em microscópio óptico de luz, através da marcação com
Azul Tripan que penetra nas células mortas em função do aumento de
permeabilidade da membrana celular. Na dependência do tamanho celular, podese haver a indução de contagem de debris celulares como pequenas células, uma
vez que não há coloração específica para os mesmos.
Já pela técnica de citometria de fluxo, as células em apoptose ou mortas
tiveram seu núcleo corado em laranja com marcador Guava® PCATM -96
ViaCount® Flex Reagent. O núcleo das células viáveis foi corado em vermelho. A
especificidade do marcador não permite corar debris celulares, uma vez que estes
não apresentam núcleo. Não obstante, a quantificação realizada pelo citômetro de
fluxo baseia-se na avaliação individual de cada evento, ou seja, célula, através do
capilar submetido à irradiação laser, proporcionando uma quantificação mais
confiável uma vez que os valores obtidos sejam livres de víeis conferindo médias
grupais mais próximas da realidade.
Baseando-nos nas peculiaridades de cada método quantitativo para a
estimativa da porcentagem da viabilidade celular, acreditamos que o emprego de
técnicas de citometria de fluxo apresente resultados confiáveis em comparação à
câmara de Neubauer, hipótese que testamos comparando-se os resultados
obtidos por ambos métodos.
As análises dos resultados da quantificação tanto em câmara de Neubauer
quanto em citômetro de fluxo foram primariamente baseadas no índice do
coeficiente de variação (CV), convencionalmente adotando-se os valores próximos
a 1 que determina maior confiabilidade dos resultados obtidos pela metodologia
empregada. Deste modo, observamos melhores índices na quantificação realizada
69
Silva, W.F.
por citometria de fluxo em comparação à câmara de Neubauer, fato este que
embasa a nossa preferência e alteração do método de quantificação previamente
adotado conforme os objetivos iniciais da presente pesquisa.
6.2 MEIOS DE CONGELAMENTO
A análise dos meios de congelamento que empregamos, permite-nos
verificar alternância de dois aspectos inerentes a todos os protocolos: 1)
disponibilidade de nutrientes e 2) capacidade de criopreservação.
6.2.1 Disponibilidade de nutrientes
Quanto à disponibilidade de nutrientes utilizamos concentrações distintas
de 40% para DMEM, RPMI e SFB correspondente aos protocolos A, B e C
acrescidos com 40% de plasma e 20% de DMSO (criopreservante) cada. A
avaliação após 45 dias de congelamento revelou que o SFB proveu uma
viabilidade celular de 29,92% (C), seguido por DMEM com 26,67% (B) e por último
RPMI com 22,66% (A). De mesmo modo, as análises dos resultados apresentados
pelos meios A, B e C aos 60 dias de congelamento, demonstrou índices similares
aos 45 dias sendo SFB 29,17% (C), seguido de DMEM com 22,11% (B) e RPMI
com 21,37% (A).
O fato do soro fetal bovino (SFB) apresentar melhores índices de
viabilidade das células mononucleares totais de suínos aos 45 e 60 dias póscongelamento, leva-nos a supor que este fato possa estar relacionado ou à maior
acessibilidade dos nutrientes presentes no SFB ou que estes nutrientes devam
sofrer menor degradação durante o período. Deste modo, acreditamos poder
inferir que o SFB a 40% acrescidos a protocolos apresentando 20% de DMSO
70
Silva, W.F.
(crioprotetor) destaca-se dentre os demais meios de cultura utilizados nos meios
de congelamento.
Seguindo-se a análise dos meios contendo concentrações elevadas a
47,5% de DMEM, RPMI, e SFB em 40% de plasma e 5% DMSO (criopreservante)
referentes aos protocolos E, F, e G respectivamente, foi possível observar que aos
45 e 60 dias, os meios contendo RPMI apresentaram melhores índices de
viabilidade celular, 16,19% / 23,29% (F), seguido de DMEM co 15,34% / 14,95%
(E) e SFB com 11,38% / 13,81% (G). A alteração na posição do ranking de
viabilidade celular apresentada entre os meios enriquecidos com RPMI e SFB
deva relacionar-se tanto mais à concentração do criopreservante (DMSO) do que
ao enriquecimento do meio, conforme discutiremos no capitulo referente a
capacidade de criopreservação.
Após as análises dos resultados das amostras descongeladas com 45 dias
de criopreservação, compostas apenas por plasma autólogo e DMSO na
proporção 80% plasma e 20% DMSO para o protocolo D e 95% plasma e 5%
DMSO para protocolo H, observamos uma maior viabilidade das células no
protocolo D com índices de 62,40% e H com 24,87%.
Acreditamos que os melhores índices apresentados pelos protocolos
contendo apenas plasma autólogo (D e H) em comparação aos meios A, B, C, E,
F e G possam relacionar-se ao nível dos componentes nutritivos disponíveis no
plasma em superioridade aos demais meios comerciais (DMEM e RPMI) e soro
fetal bovino (meio heterólogo), uma vez que, seus níveis devam apresentar-se de
modo similar ao in situ para as células.
71
Silva, W.F.
6.2.2 Capacidade de criopreservação
Observamos que os protocolos contendo 20% DMSO (A, B, C e D) tiveram
maior média de viabilidade tanto para o período de 45 dias de congelamento
quanto para o período de 60 dias, quando comparados aos protocolos E, F, G e H
com concentração de 5% DMSO. Esta constatação deixa claro que o DMSO em
maior concentração também possa propiciar maior proteção ou conservação às
células de suínos, como ocorrido com células tronco hematopoiéticas humanas
em relatos de Galmes et al. (2007).
De acordo com a literatura, o DMSO em concentrações altas (30%) tornase tóxico para as células, preconiza-se o uso deste crioprotetor em concentrações
de 5%, 10% e 20%, sendo a última pouco utilizada (MASSUMOTO; MIZUKAMI
2000),
segundo
Galmes
et
al.
(2007)
células
tronco
hematopoiéticas
criopreservadas em solução contendo 5% de DMSO apresentaram regeneração
hematológica mais lenta quando comparadas ao grupo criopreservado a 10%
DMSO, sugerindo então que a concentração de 10% DMSO aumenta a proteção
ou conservação das células, o que pode ocorrer com células criopreservadas em
solução com 20% DMSO. Essa queda na viabilidade deve ser relacionada aos
danos celulares causados durante a criopreservação pela formação de cristais de
gelo e no descongelamento.
As células colocadas em cultivo demonstraram pouca capacidade de
adesão nas placas e se mantiveram viáveis por 7 dias, talvez seja necessário o
uso de um meio de cultura mais rico em nutrientes apropriado para células
criopreservadas
devido
aos danos
criopreservação e descongelamento.
causados
durante
os
processos
de
Considerações Finais
Silva, W.F.
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
73
Em função dos resultados obtidos achamos por bem elencar alguns pontos
importantes para que as viabilidades celulares não decaiam tanto durante e após
o processo de criopreservação. É importante testar concentrações maiores dos
meios responsáveis pela nutrição das células como também aferir o tempo de vida
útil que o meio terá quando exposto a temperaturas baixas por períodos
prolongados de congelamento. Outro fator importante é suplementar esses meios
e/ou fazer associações de soluções comumente usadas na nutrição de células
com intuito de oferecer maior quantidade de nutrientes em maior concentração por
longo períodos de criopreservação.
Os crioprotetores também são de extrema importância no processo de
congelamento e por isso sua toxicidade deve ser levada em consideração. Os
crioprotetores penetrantes são os mais utilizados e também são tóxicos para as
células quando usados em altas concentrações, para minimizar esse efeito
normalmente letal pode-se acrescentar a solução de congelamento um
crioprotetor não penetrante tais como: monossacarídeos, frutose, glicose, etc., e
com isso reduzir a concentração que será usada da solução penetrante.
Conclusões
75
Silva, W.F.
8 CONCLUSÕES
Baseando-se nos métodos aplicados e nos resultados obtidos podemos
concluir que:
1. Para a quantificação da viabilidade das células mononucleares totais de
medula óssea de suínos, o melhor método é a citometria de fluxo com o
auxílio de um marcador fluorescente para o núcleo das células que irá
diferenciar as vivas das células mortas com maior confiabilidade.
2. Os meios comumente usados na criopreservação (DMEM, RPMI e
SFB), devem ser suplementados para fornecer nutrientes em maior
quantidade e concentração.
3. O plasma autólogo pode ser usado em concentrações altas como meio
de nutrição para as células sem associação com um meio heterólogo.
4. O DMSO em concentração de 5% para células mononucleares de
suínos associado aos meios de cultivo não forneceu crioproteção
suficiente para evitar morte celular.
5. A
melhor
concentração
do
crioprotetor
DMSO
para
células
mononucleares de suínos foi de 20%.
6. Quando colocadas em cultivo pós-congelamento, mesmo por um
período curto, as células mononucleares de suínos necessitam de meios
mais suplementados para se expandirem.
7. Dos protocolos testados, os mais eficientes na criopreservação foram o
D seguido pelo H, já os protocolos menos eficientes foram: C, A, B, F, E,
G em ordem decrescente.
18
Silva, W.F.
Referências
Bibliográficas
77
Silva, W.F.
REFERÊNCIAS
AIRD, W.; LABOPIN, M.; GORIN, N. C. Long-term cryopreservation of human stem
cells. Bone Marrow Transplantation, v. 9, p.487-490, 1992.
AMOS, T.; GORDON, M. Sources of human hematopoietic stem cells for
transplantation. Cell Transplantation, v. 4, p. 547-569, 1995.
AREMAN, E.; SACHER, R.; DEEG, H. Processing and storage of human bone
marrow: A survey of current practices in North America. Bone Marrow
Transplantation, v. 6, p.203-209, 1990.
AREMAN, E. M.; SACHER, R. A.; DEEG, H. J. Cryopreservation and storage of
human bone marrow: A survey of current practices. Progress in Clinical and
Biological Research, v. 9, p. 333-523, 1990.
BARNES, D. W. H.; LOUTIT, J. F. The radiation recovery factor: preservation by the
polge-smith-parkes technique. Journal of the National Cancer Institute, v. 15, p.
90, 1955.
BATESON, E. A. J.; BUSZA, A. L.; PEGG, D. E.; TAYLOR, M. J. Permeation of
rabbit common carotid arteries with dimethyl-sulfoxide. Cryobiology, v. 31, p. 393397 (1994).
BIDAULT, N. P.; HAMMER, B. E.; HUBEL, A. Rapid MR image of cryoprotectant
permeation in an engineered dermal replacement. Cryobiology, v. 40, p. 13-26,
2000.
BITTENCOURT, H.; ROCHA, V. A célula-Tronco Hematopoiética e seu uso clínico.
In: ZAGO, M. A.; COVAS, D.T. Células-tronco a nova fronteira da medicina. São
Paulo: Editora Atheneu, 2006. p. 122.
BRUDER , S. P.; JAISWAL, E.; HAYNESWORTH, E. Growth kinetics, self-renew-al,
and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during
extensive sucultivation and following cryopreservation. Journal of cellular
Biochemistry,v. 64, p.278-294, 1997.
CELL proliferation and viability measurement. Biochemica, nº 3, 2003. Disponível
em: <www.roche-applied-science.com/apoptosis>. Acesso em: 20 set. 2005.
CROW, S. E. WALSHAW,S.O.Manual de procedimentos clínicos em cães, gatos
e coelhos. São Paulo: Artmed, 2000. p. 279.
;
78
Silva, W.F.
DAVIS, J. M. ROWLEY,S.D.;BRAINE,H.G.;PIANTADOSI,S.; SANTOS, G. W.
Clinical toxicity of cryopreserved bone marrow graft infusion. Blood, v. 75, p. 781786,1990.
;
DE VRIES, E. G.; VELLENGA, E.; KLUIN-NELEMANS, J. C. The happy destiny of
frozen haematopoietic stem cell: from immature stem cells to mature applications.
European journal of cancer care, v. 40, p. 1987-1992, 2004.
DONNENBERG, A. D.; KOCH, E. K.; GRIFFIN, D. L.; STANCZAK, H. M.; KISS, J.
E.; CARLOS, T. M.; BUCHBARKER, D. M.; YEAGER, A. M. Viability of
cryopreserved BM progenitor cells stored for more than a decade. Cytotherapy, v. 4,
n. 2, p. 157-163, 2002.
ELLIOT, C.; MCCARTHY, D. A Survey of methods of processing and storage of
bone marrow and blood stem cells in the EBMT. Bone Marrow Transplantation, v.
14, p. 419-423, 1994.
ELMOAZZEN, H. Y.; ELLIOT, J. A. W.; MCGANN, L. E. Cryoprotectant equilibration
in tissues. Cryobiology, v. 51, p. 85-91, 2005.
FATHY, G. M.; McFARLANE, D. R.; ANGELL, C. A.; MERYMAN, C. A. Vitrification
as an approach to cryopreservation. Cryobiololy, v.21, n. 4, p. 407-426,1984.
FERRARI, G.; CUSELLA-DE ANGELIS, G.; COLETTA, M. Muscle regeneration by
bone marrow derived myogenic progenitors. Science. v. 279, p. 1528-30,1998.
FLEMING, K. K.; HUBEL, A. Cryopreservation of hematopoietic and nonhematopoietic stem cells. Transfusion and Apheresis Science, v. 34, p. 309-315,
2006.
FONTES, A. M.; ORELLANA, M. D.; PRATA, K. L. Células-Tronco e seus Métodos
de Estudo.p. 100-101. In: ZAGO, M. A.; COVAS, D. T. Células-tronco a nova
fronteira da medicina. São Paulo: Editora Atheneu, 2006.
FULLER, B.J.; BUSZA, A.L.; PROCTOR, E. Studies on cryoprotectant equilibration
in the intact rat-liver using nuclear magnetic resonance spectroscopy-a noninvasive
method to assess distribution of dimethyl-sulfoxide in tissues. Cryobiology, v. 26, n.
2, p. 112-118,1989.
FULLER, B. J.; BUSZA, A. L. Proton NMR-studies on the permeation of tissue
fragments by dimethyl-sulfoxide – liver as a model for compact tissues.
Cryobiology, v. 15, p. 131-134,1995.
FUKUDA, K. Development od regenerative cardiomyocytes from mesenchymal stem
cells for cardiovascular tissue engineering. Journal of Artificial Organs, v. 25, p.
187-193, 2001.
79
Silva, W.F.
GALMES,A.;BESALDUCH,J.;BARGAY,J.;MATAMOROS,N. MOREY,M.;
NOVO,A.; SAMPOL, A. A simplified method for cryopreservation of hematopoietic
stem cells with -08º degrees C mechanical freezer with dimethyl sulfoxide as the sole
cryoprotectant. Leukemia & Lymphoma, v. 17, n. 1-2, p. 181-184,1995.
;
GALMES, A.; BESALDUCH, J.; BARGAY, J. MATAMOROS, N.; DURAN, M. A.;
MOREY, M. Cryopreservation of hematopoietic progenitor cells with 5-percent
dimethyl-sulfoxide at -80 degrees C without rate-controlled freezing. Transfusion, v.
36, p. 794-797, 1996.
GALMES, A.; BESALDUCH, J.; BARGAY, J.; MATAMOROS, N.; MOREY, M.;
NOVO, A.; GUERRA, J. M. Long-term storage at -80 degrees C of hematopoietic
progenitor cells with 5-percent dimethyl sulfoxide as the sole cryoprotectant.
Transfusion, v. 39, p. 70-73,1999.
GALMES, A.; GUTIÉRREZ, A.; SAMPOL, A.; CANARO, M.; MOREY, M.; IGLESIAS,
J.; MATAMOROS, N.; DURAN, M. A.; NOVO, A.; BEA, M. D.; GALÁN, P.;
BALANSAT, J.; MARTINÉZ, J.; BARGAY, J.; BESALDUCH, J. Long-term hemtologic
reconstitution and clinical evaluation of autologous peripheral blood stem cell
transplantation after cryopreservation of cells with 5% and 10% dimethilsulfoxide at 80ºC in a mechanical freezer. The Hematology Journal, v. 92, n. 7, p. 986-989,
2007.
GOODELL, M. A.; JACKSON, K. A.; MAJKA, S. M. Stem cell plasticity in muscle
and bone marrow. Annals of the New York Academy of Sciences, v. 938, p.
208-220, 2001.
HAIDER, H.; ASHRAF, M. Bone marrow stem cell transplantation for cardiac repair.
American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology, v. 288, n.
67, p. 2557-2567, 2005.
HIDEMASA, O.; BRADFUTE, S. B.; GALLARDO, T. D.; NAKAMURA, T.; GAUSSIN,
V.; MISHINA,Y.; POCIUS, J.; MICHAEL, L. H.; BEHRINGER, R. R.;GARRY, D. J.;
ESTMAN, M. L.; SCHNEIDER, M. D. Cardiac progenitor cells from adult
myocardium: Homing, differentiation, and fusion after infarction. PNAS online, v.
100, n. 21, p. 12313-12318, 2003.
HUBEL, A. Parameters of cell freezing: Implications for the cryopreservation of stem
cells. Transfusion Medicine Reviews, v. 11, n. 3, p. 224-233, 1997.
IKEHARA, S. Bone marrow transplantation: a new strategy for intractable diseases.
Drugs of today, v. 38, p. 103-111, 2002.
80
Silva, W.F.
ISBELL, S.A. Development of a protocol for the quantitative evaluation of
contrast in NMR images for cryoprotective solvents in intact tissues. Cryobiology,
v.34, p. 165-175, 1997.
ISBELL, S. A.; FYFE, C. A.; AMMONS, R. L .M.; PEARSON, B. Mensurement of
cryoprotective solvent penetration into intact organ tissues using high-field NMR
micromaging. Cryobiology, v. 35, p. 165-172, 1997.
KARLSSON, J. O. M.; TONER, M. Long-term storage of tissues by cryopreservation:
critical issues. Biomaterials, v. 17, p. 243-256, 1996.
KAWANO, Y.; LEE, C. L.; WATANABE, T.; ABE, T.; SUZUYA, H.; OKAMOTO, Y.;
MAKIMOTO, A.; NAKAGAWA, R.; WATANABE, H.; TAKAUE, Y. Cryopreservation of
mobilized blood stem cells at a higher cell concentration without the use of a
programad freezer. Annals of Hematology, v. 83, n. 1, p. 50-54, 2004.
KRAUSE, D. S. Plasticity of marrow derived stem cell. Human Gene Therapy, v. 9,
p. 754-758, 2002.
KULESHOVA, L. L.; GOUK, S. S.; HUTMACHER, D. W. Vitrification as a prospect
for cryopreservation of tissue-engineered constructs. Biomaterials, v. 28, p. 15851596, 2007.
LAKEY, J. R. T.; HELMS, L. M. H.; MOSER, G.; LIX, B. SLUPSKY, C. M.;
REBEYKA, I. M.; SYKES, B. D.; McGANN, L. E. Dynamics of cryoprotectant
permeation in porcine heart valve laflets. Cell Transplantation, v.12, p. 123-128,
2003.
LASKY, L. VANBUREN, N. WEISDORF, D. Successful allogeneic cryopreserved
marrow transplantation. Transfusion, v. 29, p. 182-189, 1989.
LAW, P.; MERYMAN, H. Cryopreservation of human bone marrow grafts. In gee A.
Bone marrow processing and purging. A pratical guide. 1 ed, Florida:
CRCPress, 1991. p. 332-40.
LIU, P. I.; POON, K. C.; CROOK, L.; LIU, S. S.; EGUCHI, M. In vitro and in vivo
assessment of the viability of cryopreserved postmortem murine bone marrow cells.
Annals of Clinical Laboratory Science, v. 10, n. 2, p. 165-168,1980.
MALOUF, N. N.; COLEMAN, W. B.; GRISHAM, J. W. Adult derived stem cells from
the liver become myocytes in the heart in vivo. The American Journal of
Pathology, v. 158, p. 1929-1935, 2001.
81
Silva, W.F.
MASSUMOTO, C. M.; MENDRONI, A.; CARBONELL, A. L.; MOTA, M. A.;
MIZUKAMI, S. Mobilização e coleta de células-tronco hematopoéticas de sangue
periférico. Revista de Hematologia e Hemoterapia, v. 2, p. 224-227, 1996.
MASSUMOTO, C.; MIZUKAMI, S. Autologus bone marrow transplantation and
postransplant immunotherapy. Medicina, Ribeirão Preto, v. 33, p. 405-414, 2000.
MUKAIDA, T.; WADA, S.; TAKAHASHI, K.; PEDRO, P. B.; AN, T. Z.; KASAI, M.
Vitrification of human embryos based on the assessment of suitable conditions for 8cell mouse embryos. Human Reprotuction, v. 13, n. 10, p. 2874-2879,1998.
MULDREW, K.; SYKES, B.; SCHACHAR, N.; MCGANN, L. E. Permeation kinetics of
dimethyl sulfoxide in articular cartilage.Cryobiology, v. 17, p. 331-340, 1996.
PARKER, L. M.; BINDER, N.; GEMAN, R.; RICHMAN, C. M.; WEINER, R. S.;
YANKEE, R. A. Prolonged cryopreservation of human bone marrow.
Transplantation, v. 31, n. 6, p. 454-457, 1981.
PETTENGELL, R.; WOLL, P. J.; CONNOR, D. A.; DEXTER, T. M.; TESTA, N. G.
Viability of haemopoietic progenitors from whole blood, bone marrow and
leukapheresis product: effects of storage media, temperature and time. Bone
Marrow Transplantation, v. 14, n. 5, p. 703-709, 1994.
PROCKOP, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues.
Science, v. 279, p. 71-74, 1997.
RE, A.; VIAJAYARAGHAVAN, K.; BASADE, M. M.; HE, S.; GULATI, S.C. Long-term
cryopreservation: successful trilineage engraftment after autololous bone marrow
transplantation with bone marrow cryopreserved for sevens years. Journal of
Hematotherapy, v. 7, n. 2, p. 185-188, 1998.
ROWLEY, S. D. Techniques of bone marrow and stem cell cryopeservation and
storage. In american association of blood banks. 1992. p. 105-127.
SCORSIN, M.; HAGEGE, A. A.; MAROTTE, F. Does transplantation of
cardiomyocytes improve function of infarcted myocardium? Circulation, v. 96, p.
188-193, 1997.
SPURR, E. E.; WIGGINS, N. E.; MARSDEN, K. A.; LOWENTHAL, R. M.; RAGG, S.
J. Cryopreserved human haematopoietic stem cells retain engraftment potential after
extended (5-14 years) cryostorage. Cryobiology, v. 44, p. 210-217, 2002.
SPUTTEK, A.; SPUTTEK, R. Cryopreservation in transfusion medicine and
hematology. In Life in the frozen state. Boca Raton, FL: CRC Press, p. 483-504,
2004.
82
Silva, W.F.
SPUTTEK, A. Cryopresevation of red blood cells platelets lymphocytes and
stem cells. In Clinical Applications of Cryobiology. Boca Raton, FL: CRC Press,
p. 95-147, 1991.
STRAUER, B. E.; BREHM, M.; ZEUS, T. Myocardial regeneration after intracoronay
transplantation of human autologous stem cells pollwing acute myocardial infartion.
Dtsch Méd Wochenschr, v. 126, n. 34-35, p. 932-938,2001.
STRONCEK, D. F.; FAUSTSCH, S. K.; LASKY, L. C.; HURD, D. D.; RAMSAY, N. K.;
McCULLOUGH, J. Adverse reactions in patients transfused with cryopreserved
marrow. Transfusion, v. 31, p. 521-526, 1991.
SUSSMAN, M. Cardiovascular biology. Hearts and Bones. Nature, n. 410, p.
410:640-641, 2001.
TAYLOR, N. J.; BUSZA, A. L. A convenient, noninvasive method for mensuring the
kinetics of permeation of dimethyl-sulfoxide indo isolated corneas using Nmrspectroscopy. Cryobiology, v. 13, p. 273-282, 1992.
TONER, M. Nucleation of ice crystals inside biological cells. In steponkus, P. (Ed.).
Low-temperature biology. London England: JAI Press, 1993. p. 1-51.
VALDEZ, C. A.; MAZNI, O. A.; TAKAHASHI, Y.; FUJIKAWA, S.; KANAGAWA, H.
Successful cryopreservation of mouse blastocysts using a new vitrification solution.
Journal of Reproduction and Fertility, v. 96, n. 2, p. 793-802, 1998.
WALCERZ, D. B.; TAYLOR, M. J.; BUSZA, A. L. Determination of the kinetics of
permeation of dimethyl-sulfoxide in isolated corneas. Cell Biophysics, v. 26, p. 79102, 1995.
WALTER, Z.; SZOSTEK, M.; WEGLARSKA, D.; RAGUSZEWSKA, D.; JABLONSKI,
M.; LORENZ, F.; SKOTNICKI, A. B. Methodes for freezing, thawing and viability
estimation of hemopoietic stem cells. Przegl Lek, v. 56, p. 35-39, 1999.
(Suplemento, 1).
WEINER, R. S.; TOBIAS, J. S.; YANKEE, R. A. The processing or human bone
marrow for cryopreservation and reinfusion. Biomedicine, v. 24, n. 4, p. 226-231,
1976.
ZAMBELLI, A.; POGGI, G.; DA PRADA, G.; PEDRAZZOLI, P.; CUOMO, A.;
MIOTTI,D. Clinical toxicity of cryopreserved circulating progenitor cells infusion.
Anticancer Research, v. 18, p. 4705-4708, 1998.
ZIGGER, M. A. J.; TREDGET, E. E.; SYKES, B. D.; McGANN, L. E. Injury and
protection in split-thickness skin after very rapid cooling and warning. Cryobiology,
v.35, p. 53-69, 1997.