Metabolismo do Nitrogênio Introdução À medida que crescem, as plantas aumentam em biomassa e energia. O carbono a energia são obtidos a partir da fotossíntese, enquanto que os nutrientes minerais são absorvidos a partir da solução do solo. Os nutrientes minerais acumulam‐se nos diferentes compartimentos celulares podendo atuar como reguladores do metabolismo. Podem ainda ser armazenados até o momento de serem incorporados ao metabolismo celular, quando potencialmente podem vir a integrar cerca de 105 tipos de moléculas orgânicas O nitrogênio representa o elemento mineral exigido em maiores quantidades, sendo a sua disponibilidade freqüentemente limitante ao crescimento de plantas cultivadas e nativas. Este elemento faz parte da estrutura de um grande número de moléculas importantes para as células. Exemplos importantes são os aminoácidos, as proteínas estruturais e enzimáticas, ácidos nucléicos (DNA, RNA) e clorofilas. O próprio processo fotossintético é significativamente afetado pela deficiência de N uma vez que o seu funcionamento depende de proteínas como a Rubisco, proteínas dos fotossistemas complexos antenas e de grande quantidade de clorofilas. O ciclo do Nitrogênio A maior parte do Nitrogênio existente na biosfera não se encontra diretamente acessível às plantas. O nitrogênio molecular (N2), apesar de ser o gás mais abundante da atmosfera (78%), não pode ser utilizado pelas plantas para a construção de suas biomoléculas por ser uma molécula estável e pouco reativa. Por outro lado, os compostos nitrogenados existentes na natureza sofrem interconversões formando o ciclo do nitrogênio. As principais fontes de N do solo são: os materiais de origem vegetal e animal (matéria orgânica), fertilizantes industriais, sais de amônio e nitrato trazidos da atmosfera pelas chuvas e a fixação biológica de N2. A disponibilidade de microorganismos, principalmente fungos e bactérias. A seqüência de transformações entre compostos nitrogenados no solo, a partir da matéria orgânica. O processo de transformação de N orgânico em nitrato é chamado de mineralização, sendo integrado pelos processos de amonificação (1) e nitrificação (3 e 4). A imobilização (2) é representada pela utilização de N mineral disponível durante o metabolismo microbiano, ocorrendo simultaneamente à mineralização. A desnitrificação (5 e 6) resulta da respiração anaeróbia de alguns microorganismos conduzidos a perdas gasosas na forma de óxidos de nitrogênio e N2. A amônia (NH3), liberada da matéria orgânica pela ação de bactérias heterotróficas do solo, pode ser prontamente transformada em NH4+ (NH3 + H2O ® NH4+ + OH‐). As bactérias nitrificantes são capazes de retirar a energia necessária ao seu crescimento da oxidação do NH4+ e do NO2‐. Sob boas condições de aeração, o NH4+ é rapidamente oxidado pelas bactérias nitrificadoras, de ampla distribuição (gêneros Nitrosomonas e Nitrobacter), o que torna o NO3‐ a forma de N dominante no solo. O NH4+, por outro lado, acumula‐se em solos alagados, pouco aerados, em solos com alto conteúdo de Al+3 e pH baixo (<5) devido à inibição do processo microbiano de nitrificação. OU seja, quando as taxas de nitrificação são lentas, o NH4+ tende a ser a fonte de N mais abundante. Em alguns hábitat, como solos da tundra ártica, o processo global de mineralização pode ser fortemente inibido, fazendo com que os aminoácidos tronem‐se as principais fontes de N para as plantas. Em solos cultivados, as concentrações de NO3‐ podem variar entre 0,5 e 10mM, enquanto que as concentrações de NH4+, freqüentemente são 10 a 1000 vezes menores, atingido a faixa de milimolar apenas excepcionalmente, após a adição de fertilizantes amoniacais. Assim, a forma de N disponível para as plantas dependentes dos fatores ambientais que controlam a atividade dos diferentes grupos de bactérias do solo. A fixação biológica de N2, realizada exclusivamente por organismos procariontes de vida livre ou associados com fungos e plantas, também representa uma fonte de nitrogênio importante para os vegetais, principalmente nos solos pobres em nitrogênio. Apesar da relevância da fixação biológica de N2, em escala global, estima‐se que a assimilação de nitrato produza uma quantidade de N‐orgânico aproximadamente 100 vezes maior do que a fixação biológica (15 trilhões de toneladas por ano). Absorção do Nitrogênio A absorção de NH4+ é geralmente mais rápida que a absorção de NO3‐, numa ampla faixa de condições ambientais. AS taxas de Absorção de NH4+ e de NO3‐, são afetadas pelo pH. Enquanto a absorção de NH4+ é normalmente favorecida pela elevação do pH, a absorção de NO3‐ é favorecida pelo aumento da acidez do meio. No solo a mobilidade destes dois íons é muito diferente. Os íons NH4+ movimentam‐se apenas por difusão, podendo ficar ligados às argilas do solo, negativamente carregadas. Já os íons NO3‐ apresentam grande mobilidade na solução do solo, sendo transportados por difusão e por fluxo de massa. talvez isto explique a expressão preferencial dos genes para carreadores de alta afinidade para o NH4+ e de carreadores de baixa afinidade para o NO3‐ em pêlos radiculares de tomateiros. Estes carreadores seriam do tipo constitutivo. A absorção de NO3‐ e NH4+ também é medida por carreadores induzidos pela concentração externa do substrato. Carreadores de alta afinidade para o NO3‐ não se expressam na ausência do íon, sendo induzidos pela presença de NO3‐. A absorção de NO3‐ é um processo ativo que ocorre contra um potencial eletroquímico, depende de carreadores que funcionam em simporte com H+ numa proporção estequiométrica de duas ou mais moléculas de H+ por molécula de NO3‐ absorvida. O influxo de NO3‐ encontra‐se, assim, energeticamente acoplado ao gradiente de pH existente através da plasmalema. As diferenças de potencial elétrico e de pH que se estabelecem através da plasmalema e do tonoplasto das células vegetais são continuamente geradas por ATPases das membranas que operam como bombas de prótons (H+‐ATPases). Outra característica importante da absorção de NO3‐ é o seu controle rigoroso pelo estado energético (disponibilidade de fotoassimilados) e nutricional das plantas. Plantas deficientes em N absorvem NO3‐ mais rapidamente do que plantas bem supridas com nitrogênio. Isto indica que demanda de N pela planta também controla as suas taxas de absorção. Associações com micorrizas podem ser importantes para a absorção de nutrientes pelas plantas. Em condições naturais a infecção micorrízica é essencial para o sucesso da germinação de desenvolvimento de muitas espécies de orquídeas, foi verificado que na orquídea Goodyera repens, crescida em associação com a micorriza endófita Rhizoctonia goodyerae‐repentis, as concentrações endógenas de P e N eram superiores às das plantas não infectadas. Os fungos micorrízicos não só aumentam a absorção de nutrientes como também estimulam o crescimento das plantas. Que forma de N as plantas usam preferencialmente? De modo geral, as plantas são capazes de utilizar diversas formas de N. A utilização depende da fonte de N disponível. Entretanto, diferentes espécies ou até mesmo genótipos de uma espécie podem apresentar preferências por NO3‐ ou NH4+ ou mesmo N‐orgânico, dependendo das pressões seletivas e adaptações fisiológicas desenvolvidas em seus ecossistemas naturais. O arroz é um exemplo de planta cultivada que utiliza preferencialmente NH4+ por ser adaptada a solos alagados (anaeróbios). No outro extremo, encontram‐se as espécies denominadas "nitrofílicas" que acumulam grandes quantidades de NO3‐ em vacúolos. Nestas espécies, além de ser fonte de N, o NO3‐ desempenha um importante papel na osmorregulação. A acumulação de NO3‐ é comum em certas famílias como, por exemplo, Cruciferae, Chenopodiaceae, Compositae, Gramineae e Solanaceae. Assimilação do NO3‐ O processo de incorporação do nitrogênio proveniente do NO3‐ em moléculas orgânicas é conhecido como assimilação. A assimilação do N só pode ocorrer quando o elemento encontra‐se reduzido na forma de NH4+ (estado redox c ‐3). Conseqüentemente, o nitrogênio oxidado presente no NO3‐ (+5) precisa ser reduzido a NH4+ (‐3) no interior das células vegetais antes de ser incorporado em moléculas orgânicas. A assimilação de NO3‐ ocorre em bactérias, fungos, algas e em todas as plantas clorofiladas. Nas raízes, o NO3‐ transportado para dentro das células epidérmicas e do córtex pode ter quatro destinos: •
Sofre refluxo para o apoplasto ou para o ambiente; •
Entrar no vacúolo e ser armazenado; •
Ser reduzido a NH4+ pela ação seqüencial das enzimas nitrato redutase (NR) e nitrito redutase (NiR); •
Ser translocado via simplasto para o xilema da raiz atingindo a parte aérea das plantas, neste caso, a redução do NO3‐ se dá nas folhas. A destinação do NO3‐ depende da espécie de planta, o estágio do desenvolvimento, do conteúdo de carboidratos, da adaptação ecológica da planta e da concentração externa de NO3‐. A redução do NO3‐ é um processo que ocorre em suas etapas. Na primeira delas, catalisada pela nitrato redutase (NR), o NO3‐ é reduzido a NO2‐ com o consumo de elétrons. A fonte de poder redutor para a NR pode ser o NADH ou NAD(P)H, dependendo da isoenzima. Na seqüência 2, a nitrito redutase (NiR) catalisa a redução NO2‐ a NH4+ com um gasto de 6 elétrons fornecidos pela ferredoxina. 1) NO3‐ + 2H+ + 2é ® NO2‐ + H2O (Enzima NR) 2) NO2‐ + 8H+ + 6é ® NH4+ + 2H2O (Enzima NiR) A NR é uma enzima citoplasmática enquanto que a NiR localiza‐se nos cloroplastos de tecidos clorofilados e nos plastídios de tecidos aclorofilados. A redução de NO3‐ em células fotossintéticas pode ser considerada um processo genuinamente fotossintético por consumir poder redutor diretamente do fluxo fotoquímico de elétrons, através de ferredoxina. Em tecidos fotossintéticos no escuro ou aclorofilados como as raízes, o poder redutor necessário para a redução do NO3‐ e do NO2‐ é gerado pela oxidação de carboidratos na via glicolítica e na respiração aeróbia. Uma das características mais interessantes da assimilação do NO3‐ é a sua regulação. Além do próprio NO3‐, outros fatores como luz, citocianinas, níveis de CO2, ritmo circadiano, compostos de carbono e nitrogenados como a sacarose e a glutamina desempenham um papel regulador. O NO3‐ representa um sinal primário na indução da expressão dos genes de seus carreadores específicos na plasmalema, da NR e NiR. A Nitrato Redutase A NR é uma enzima complexa formada pela associação de duas subunidades idênticas. Cada subunidade contém 3 grupos protéticos redox: ‐ FAD, heme (citocromo b) e um cofator de molibdênio ‐ que nesta ordem transferem cataliticamente dois elétrons do NAD(P)H para o nitrato. A expressão da NR podes ser regulada na transcrição, pós‐transcrição e pós‐tradução por sinais externos e endógenos que atuam ajustando a atividade da enzima a variações ambientais e metabólicas. Do ponto de vista fisiológico, esta regulação é fundamental para evitar desperdício de poder redutor, esqueletos de carbono ou o acúmulo de níveis tóxicos de NO2‐ ou NH4++. O NO3‐ desencadeia a expressão do gene da NR, mas a luz modula a quantidade de RNAm transcrita. Quanto maior a intensidade luminosa, maior a expressão quantitativa dos genes que codificam a NR e NiR em tecidos foliares. O processo de regulação pós‐tradução envolve a fosforilação da NR que é um mecanismo rápido e reversível. A atividade da NR é rapidamente reduzida 3 a 10 vezes quando as plantas são transferidas da luz para o escuro ou para ambientes com baixa concentração de CO2. Ao serem retornadas para a luz ou para níveis normais de CO2 a atividade da NR é restaurada. Estudos bioquímicos sugerem que a ativação da NR pela luz envolve a desfosforilação através da ação de fosfatases. A ativação e desativação através da fosforilação parecem envolver, além das fosfatases, a atividade de quimases e também a participação de uma proteína inibidora, ocorrendo em intervalos de tempo compreendidos entre 2 a 15 minutos. Várias enzimas do metabolismo do carbono e do nitrogênio são controladas através de fosforilação reversível, processo que por sua vez envolve a regulação de quinases e fosfatases. O controle neste nível parece ser fundamental para o balanço global de C/N na planta e nas interações fonte/dreno. Assimilação de NH4+ O NH4+, gerado pela redução do NO3‐ absorvido diretamente pelas raízes ou gerado endogenamente por diversas reações metabólicas, não pode ser acumulado nos tecidos. O NH4+ é tóxico para as células vegetais por atuar como desacoplador entre o fluxo de elétrons e a fosforilação oxidativa ou fotofosforilação. Logo após ser formado ou absorvido, o NH4+ é imediatamente incorporado em esqueletos de carbono, gerando os aminoácidos glutamina e glutamato, através de duas reações seqüenciais e interdependentes [equações (3) e (4)]. Estas duas reações são catalisadas pelas enzimas glutamina sintetase (GS) e glutamato sintase (GOGAT, glutamina 2‐oxoglutarato aminotransferase), respectivamente. Deve‐se observar que a formação de uma molécula de glutamina exige o gasto de 1 ATP e a de glutamato requer poder redutor na forma de NADH ou derredoxina, dependendo da isoenzima. Estes dois aminoácidos atuam como importantes doadores de N para numerosas reações celulares incluindo a biossíntese de aspartato e asparagina. 3) glutamato + NH4+ + ATP ® glutamina + ADP +Pi (Enzima GS) 4) gluamina + oxoglutarato + NADH ou ferredoxina reduzida ® 2 glutamatos (Enzima GOGAT) As enzimas GS/GOGAT desempenham um papel fundamental no metabolismo das plantas, pois além de representarem a principal via de entrada de nitrogênio orgânico novo, proveniente do ambiente (assimilação primária), também participam da reciclagem do NH4+ gerado em diversos processos metabólicos tais como a fotorrespiração, o "turnoyer" de proteínas, o catabolismo de aminoácidos carreadores de N, reações de biossíntese envolvendo aminoácidos e a biossintese de lignina ‐ conversão de fenilalanina em cianamato catalisada pela enzima fenilalanina amônia liase. A moléculas de nitrogênio incorporadas à glutamina e ao glutamato no ciclo GS/GOGAT são inicialmente distribuídas através do metabolismo por reações de transaminação, formando novos aminoácidos. Normalmente reações de transaminação ocorrem entre um ceto‐ácido e um aminoácido, sendo catalisadas por enzimas genericamente denominadas aminotransferases. Todas as aminotransferases necessitam de piridoxal fosfato (vitamina B1) como grupo prostético, razão pela qual a esta vitamina é essencial para a vida. Um exemplo importante de transaminação ocorre entre o glutamato e o oxaloacetato, produzindo a ‐cetoglutarato (ou oxoglutarato) e aspartato, numa reação catalisada pela aspartato aminotransferase (5). Os grupamentos amida da glutamina e amina do glutamato são intensamente transferidos para o ácido oxaloacético formando o aminoácido aspartato (5) ou para o próprio aspartato formando asparagina, reação catalisada pela asparagina sintetase (6). 5) glutamato + oxaloacetato « 2‐oxoglutarato + aspartato (aspartato aminotransferase) 6) aspartato + glutamina « glutamato + asparagina (asparagina sintetase) Antes das descobertas das enzimas GS/GOGAT acreditava‐se que a enzima glutamato Desidrogenase (GDH) era a principal responsável pela incorporação do NH3 em moléculas orgânicas (7). A enzima glutamato desidrogenase catalisa aminação do oxoglutarato a glutamato (NADH‐GDH) e a desaminação do glutamato a oxo glutarato. Entretanto, o elevado Km desta enzima em relação ao NH3 (baixa afinidade) conduziu à hipótese de que esta enzima teria apenas um papel secundário na assimilação do NH3 . A GDH seria importante na assimilação de NH3 apenas em situações de emergência, caracterizadas por elevadas concentrações de NH3 nos tecidos vegetais. 7) 2‐oxoglutarato + NH3 + NADH « glutamato + NAD + H2O (glutamato desidrogenase) A GDH está presente em quase todos os organismos vivos, tendo sido detectada em todos os tecidos de plantas superiores examinados. A distribuição generalizada desta enzima e a atividade relativamente elevada encontrada em alguns tecidos, principamente nas raízes e órgãos em senescência sugerem um papel específico para a GDH nos tecidos vegetais. Acredita‐se que a GDH tenha um papel duplo: a GDH‐NADH (aminativa) atuaria na presença de altas concentrações de NH4+ de origem endógena e exógena enquanto que e a GDH‐NAD+ (desaminação oxidativa) funcionaria fornecendo energia e esqueletos de carbono. Evidências experimentais sugerem que a GS e a GDH apresentam uma regulação inversa. A luz exerce um efeito positivo sobre a expressão dos genes que codificam as enzimas da assimilação de NH4+ (GS2 e Fd‐GOGAT) e negativo sobe os genes que codificam a GDH e a AS. Glutamina, glutamato, asparagina e aspartato servem como importantes carreadores de N, tendo um papel fundamental na exportação e distribuição de nitrogênio nas plantas. Estes aminoácidos são também precursores não só das principais famílias de aminoácidos protéicos, como também de outros compostos nitrogenados fundamentais como a clorofila, os ácidos nucléicos e as poliaminas. Juntamente com a GS/GOGAT, as enzimas glutamato desidrogenase (GDH), asparato aminotransferase (AspAT) e asparagina sintetase (AS) são responsáveis pela síntese destes aminoácidos. Estes quatro aminoácidos podem corresponder a 60‐64% do conteúdo total de aminoácidos livres existentes nas folhas de Arabidopsis . Estudos bioquímicos e moleculares têm revelado a existência de múltiplas isoenzimas para cada uma das enzimas envolvidas na assimilação e distribuição de N. Análises moleculares evidenc iaram que cada uma destas enzimas é codificada por uma família gênica na qual cada membro codifica uma iso enzima distinta. Cada isoenzima é regulada de modo diferenciado por estímulos ambientais, metabólicos, do desenvolvimento e pela especificidade do tipo de célula ou tecido. Um número crescente de trabalhos vêm demonstrando que a disponibilidade de carbono celular exerce efeito regulador sobre os genes da assimilação de N. Este fenômeno é reflexo da estreita inter‐relação entre os metabolismos de carbono e de nitrogênio nas plantas, até 55% do carbono das plantas pode estar comprometido com o metabolismo e assimilação de N em alguns tecidos. A sacarose, por exemplo, pode substituir o efeito da luz no controle da expressão dos genes da NR, NiR, GS2, Fd‐GOGAT, GDH e AS. Os genes que codificam as enzimas NR, NiR, GS2, Fd‐GOGAT são normalmente estimulados pela luz, enquanto que os genes responsáveis pela GDH e AS são inibidos pela luz. A sacarose atua do mesmo modo no controle da expressão destes genes. De modo mais amplo, os genes regulados por açúcares possibilitam não só a interação entre as respostas celulares e o transporte de carboidratos (veiculando informações sobre a disponibilidade de carboidratos na planta como um todo), como também coordena a utilização e alocação de recursos nas células. O genes regulados por carboidratos também contribuem para a otimização do investimento de C, N e P entre diferentes processos e partes da planta. Interação entre o metabolismo do carbono e do nitrogênio Conforme já mencionamos anteriormente, as vias metabólicas do carbono e do nitrogênio estão interligadas de várias maneiras. Ambas as vias utilizam a energia, os esqueletos de carbono e o poder redutor disponíveis no metabolismo celular. Estudos recentes têm demonstrado que o metabolismo do carbono e do nitrogênio são modulados de forma paralela e coordenada nas plantas superiores. Fatores ambientais tais como a disponibilidade de luz e CO2 assim como o estado nutricional têm um impacto profundo sobre o suprimento de energia, esqueletos de carbono e outros substratos que suportam a assimilação de carbono e de nitrogênio. Dinâmica do Nitrogênio ao longo do desenvolvimento da planta Nas sementes germinando, o desenvolvimento do embrião é suprido pelo catabolismo das substâncias de reserva. Nos tecidos de reserva, as proteínas são hidrolisadas por proteases e pepteases gerando aminoácidos e amidas que são transportados até o eixo embrionário. Tais substâncias serão a base de construção das proteínas do embrião em desenvolvimento. À medida que a plântula desenvolve‐se, atinge a autotrofia de carbono e passa a absorver NO3‐ e NH4+ através do sistema radicular em expansão. Durante a fase de crescimento vegetativo mais intensa, grande parte das moléculas orgânicas nitrogenadas é incorporada à estrutura e ao metabolismo da planta. Os cloroplastos contêm cerca de 75% do nitrogênio foliar; metade da proteína foliar encontra‐se nos cloroplastos, principalmente como parte da Rubisco. Quando inicia a fase reprodutiva, grande parte do nitrogênio integrante dos tecidos vegetativos é transferido para os frutos em desenvolvimento, num processo denominado de remobilização. Em muitas plantas, a sustentação dos frutos depende da degradação e senescência da partes vegetativas. Moléculas como a Rubisco e clorofilas passam a ser hidrolisadas e transportadas, na forma de glutamina, asparagina, glutamato e aspartato, para os tecidos reprodutivos. A formação dos frutos dependerá da remobilização de N‐orgânico da planta e da assimilação corrente da NO3‐ ou NH4++. No caso de plantas associadas a organismos fixadores de N2, como as leguminosas noduladas, uma parte do N‐orgânico é suprimida pela fixação de N2 em curso. Síntese das principais reações de assimilação de N nas plantas: Enzima Nitrato Reação Redutase (NR) Nitrito Redutase (NiR) Glutamina Sintetase (GS) NADH NO3‐ ® NO2‐ Glutamato Desidrogenase (GDH) (AS) reduzida Glutamato + NH4+® glutamina ‐ glutamatos ‐ ‐ ATP Ferredoxina reduzida ‐ NADH/NADPH a‐cetoglutarato NH4+ «
aspartato ®
+ glutamato asparagina / Ferredoxina NO2‐ ® NH4+ Asparagina Sintetase Glutamina energia NADPH Glutamato Sintetase a‐cetoglutarato + glutamina ® 2 (GOGAT) Fonte Redutor + NADH ‐ ‐ ATP de