II SIMPÓSIO DE ASSISTÊNCIA FARMACÊUTICA
Local: Centro Universitário São Camilo
Data:
24 de maio de 2014
INFUSÃO DE PADRÕES ANALÍTICOS EM SISTEMA MS/MS: OTIMIZAÇÃO DE
PARÂMETROS ELETRÔNICOS
1
PAIVA, Alexandre K. ; MASUNARI, Andrea
2
1
Discente do curso de Farmácia do Centro Universitário São Camilo. São Paulo, SP. - Bayer S.A.
(Laboratório de Segurança Alimentar)
2
Docente do curso de Farmácia do Centro Universitário São Camilo. São Paulo, SP.
e-mail: [email protected]
Palavras-Chave: ESPECTROMETRIA DE MASSAS. AGROTÓXICOS. QUÍMICA ANALÍTICA.
INTRODUÇÃO
Em 1798, Thomas Malthus apresentou a teoria de que o crescimento populacional exponencial
iria ultrapassar a capacidade de produção de alimentos, prevendo fome, doenças e altos níveis de
mortalidade. Entretanto, a hipótese de Malthus desconsiderou um fator importante: os avanços da
ciência e da tecnologia para otimizar a produtividade e superar os limites impostos pela quantidade
finita de áreas cultiváveis (POSTEL, 1998).
O desenvolvimento de compostos químicos utilizados para a manutenção de parcelas agrícolas
foi um dos fatores que levaram ao aumento da produção mundial de alimentos (POSTEL, 1998).
Apesar dos evidentes benefícios proporcionados pelos agrotóxicos à produção agrícola, o risco de
intoxicações preocupa seriamente as autoridades reguladoras. Frente ao exposto, foi determinado um
Limite Máximo de Resíduos, definido legalmente pela ANVISA (Agência Nacional de Vigilância
Sanitária) como a quantidade máxima de agrotóxico aceita no alimento, desde sua produção até o
consumo, sendo expresso em miligramas de resíduo por quilograma de alimento (PITELLA, 2009).
Como o monitoramento de contaminantes é indispensável, são necessárias técnicas analíticas
sensíveis que possam detectar níveis de agrotóxicos na escala de nanogramas e que permitam a
separação de diversos compostos, já que os extratos provenientes de alimentos são complexos e
possuem diversos interferentes que resultam em problemas durante a análise (PITELLA, 2009).
A descoberta da espectrometria de massas (MS) no final do século XIX resultou em uma
revolução na análise química e estrutural de compostos em diversas áreas da ciência. Atualmente, a
espectrometria de massas é uma das técnicas mais utilizadas em laboratórios devido à sua precisão
e por fornecer informações específicas das amostras, como a composição elementar, a estrutura
molecular e as composições qualitativa e quantitativa de misturas complexas (RODRIGUEZ, 2003).
Por meio do acoplamento de um sistema de HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
como injetor de amostras ao sistema de MS/MS, os laboratórios realizam análises de alta
especificidade analítica em modo de MRM (Multiple Reaction Monitoring). Esta técnica é amplamente
empregada na detecção de compostos orgânicos presentes em baixas concentrações em matrizes
complexas, como por exemplo a análise de resíduos agrotóxicos em matrizes vegetais. Citam-se
como vantagens desta técnica, um sensível aumento da sensibilidade de detecção e redução de
interferentes ao sinal do analito em função da melhor separação dos compostos em solução
(WENTZ, 2010; CHIARADIA, COLLINS e JARDIM, 2008).
OBJETIVOS
Realizar a infusão de soluções de Ethoxysulfuron e Fenamidone (padrões primários) em
sistema MS/MS de forma a otimizar os parâmetros eletrônicos especificados a seguir: DP
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(Declustering Potential), EP (Entrance Potential), CE (Collision Energy) e CXP (Collision Cell Exit
Potential).
METODOLOGIA
Utilizando-se um Espectrômetro de Massas API 4000 QTRAP® com sistema MS/MS e
ionização em ESI (Electronspray Ionization), procedeu-se conforme determinado no Manual do
Software Analyst ® 1.5.2 no capítulo “7. Modos de Varredura Triplo Quadrupolo”.
Preencheu-se uma seringa com 200 ng/mL dos agrotóxicos Ethoxysulfuron e Fenamidone em
uma solução de proporção 50:50 das fases móveis:
Fase Móvel A: Água tipo 1: Metanol (9:1; v/v) + 10mM de Formiato de Amônio + 120μL de Ácido
Fórmico;
Fase Móvel B: Água tipo 1: Metanol (1:9; v/v) + 10mM de Formiato de Amônio + 120μL de Ácido
Fórmico;
Realizou-se então a verificação da posição do spray, orientando-o manualmente na posição
vertical 10 e horizontal 5. Acoplou-se a seringa em um “pick” plástico ao sistema de canais para
infusão direta no sistema MS/MS e então posicionou-se a seringa em uma bomba de infusão com
fluxo de 10 μL/min.
Iniciou-se a infusão deixando o fluxo correr por 2 minutos, de forma a preencher os canais
com a solução e permitir a estabilização do fluxo. Selecionou-se o modo “Tune” no software e se
procedeu com o modo de varredura em Q1 MS Scan, selecionando a polaridade para modo positivo.
Realizou-se então o cálculo da massa molecular exata dos dois compostos na opção
“Calculators” do software, de forma a introduzir uma faixa de varredura de massas ao modo Q1 MS
Scan em 10 ciclos. O valor inicial de DP foi definido para 80 volts (default).
Após obtenção do espectro de Q1, selecionou-se o modo Q1 Multiple Ions (MI) Scan.
Realizou-se a rampa de DP e EP para os dois compostos, de forma a obter o valor ótimo para a
entrada no filtro de massas Q1. A seguir, mudou-se o modo para Product Ion (MS/MS) Scan e,
digitando no campo “Product Of” a massa do íon molecular precursor a ser fragmentado, foram
obtidas as rampas de CE e CXP e os dois principais fragmentos formados na célula de colisão Q2.
Com a otimização de todos os parâmetros de voltagem, realizou-se o “teste de paternidade”
dos compostos, para verificar se os fragmentos formados eram realmente oriundos do íon molecular
conhecido. Selecionou-se o modo Precursor Ion Scan e no campo “Precursor Of” digitou-se a massa
do fragmento.
Após confirmação de paternidade, encerrou-se o procedimento analítico pela realização do
Multiple Reaction Monitoring (MRM).
RESULTADOS
Os dados obtidos com a infusão em MS/MS foram compilados nas tabelas e gráficos
apresentados a seguir. A Tabela 1 apresenta as massas exatas calculadas pelo software Analyst®,
enquanto a Tabela 2 resume os resultados obtidos ao final da infusão: parâmetros eletrônicos
otimizados e os fragmentos e íons moleculares obtidos.
É representado também o espectro de compostos filtrados em Q1 (Figura 1) e o MRM obtido
ao final da infusão, com avaliação de intensidade após otimização individual dos parâmetros (Figura
2).
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Tabela 1 - Massas Exatas obtidas para Ethoxysulfuron e Fenamidone:
Molécula
Massa Exata (Da)
Ethoxysulfuron
398,0896
Fenamidone
311,1092
Figura 1 - Q1 MS Scan da Solução de Ethoxysulfuron e Fenamidone (200 ng/mL):
+
Ethoxysulfuron: [M+H] = 399.2
+
Fenamidone: [M+H] = 312.3
Tabela 2 – Parâmetros Eletrônicos otimizados para Ethoxysulfuron (399.2), Fenamidone (312.1) e
seus fragmentos obtidos em Q2:
Fragmento (Da)
DP (Volts)
EP (Volts)
CE (Volts)
CXP (Volts)
70
10
---
---
261.1
70
10
22
18
218.1
70
10
36
15
77
10
---
---
236.2
77
10
20
18
165.1
77
10
20
11
399.2 [M+H]
312.1[M+H]
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+
+
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Figura 2 – MRM de Ethoxysulfuron e Fenmidone:
DISCUSSÃO
Após a infusão das soluções dos padrões primários de Ethoxysulfuron e Fenamidone no
sistema MS/MS foi possível otimizar manualmente os parâmetros de voltagem (DP, EP, CE e CXP)
relacionados à entrada dos compostos no detector Q1, fragmentação em Q2, transição de Q2 para
Q3, respectivamente. As transições de fragmentação, nas voltagens definidas, são específicas para
cada composto.
Com o modo MRM ativo foi possível avaliar a intensidade detectada em Q3 para os 4
fragmentos simultaneamente. A realização de múltiplas reações em Q2 e detecção de diversos
fragmentos em Q3, confirma a formação dos íons filhos com as voltagens pré-determinadas e
possibilita a detecção mútua ao final do sistema MS/MS em intensidade adequada para quantificação
exata e precisa, mesmo na presença de inúmeras moléculas e fragmentos provenientes de matrizes
vegetais complexas.
CONCLUSÃO
Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a metodologia aplicada na otimização dos
parâmetros eletrônicos foi efetiva, já que o espectro de MRM apresentou intensidade suficiente para
todos os fragmentos e estes puderam ser identificados com alta seletividade em Q3.
Os dados serão armazenados e compilados com os dados de futuras infusões. As transições
de massa obtidas serão utilizadas em um próximo projeto, que abordará a validação do método
QuEChERS para diversas moléculas de agrotóxicos registrados no Brasil em cinco diferentes
matrizes vegetais.
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AB SCIEX (Canadá). Modos de Varredura Triplo Quadrupolo. In: AB SCIEX (Canadá). Analyst 1.5.2
User's Guide. Ontario: 2011. Cap. 7. p. 126-146.
CHIARADIA, Mariza C.; COLLINS, Carol H.; JARDIM, Isabel C. S. F.. O Estado da Arte da
Cromatografia Associada à Espectrometria de Massas Acoplada à Espectrometria de Massas na
Análise de Compostos Tóxicos em Alimentos. Química Nova, Campinas, v. 31, n. 3, p.623-636, fev.
2008.
PITTELLA, Carla Martins. Determinação de Resíduos de Pesticidas em Mel de Abelhas (Apis Sp)
por Cromatografia de Fase Gasosa Acoplada à Espectrometria de Massas. 2009. 118 f.
Dissertação (Mestrado) - Curso de Veterinária, Departamento de Escola de Veterinária, Universidade
Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2009.
POSTEL, Sandra L.. Water for Food Production: Will There Be Enough in 2025?. Bioscience,
Amherst, v. 48, n. 8, p.629-637, ago. 1998.
+
RODRIGUEZ, Rafael Martinez. Estudo da Emissão de Íons Estáveis e Metaestáveis (LiF)nLi
252
Induzida por Fragmentos de Fissão do Cf. 2003. 13 f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Física,
Departamento de Departamento de Física, Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro, Rio de
Janeiro, 2003. Cap. 2.
WENTZ, Gabriela Negruni. Validação do método analítico para determinação de cloranfenicol
em matriz camarão segundo a norma da Comunidade Europeia EC 657/2002, por cromatografia
líquida acoplada ao espectrômetro de massas (LC-MS/MS). 2010. 29 f. TCC (Graduação) - Curso
de Química, Departamento de Instituto de Química, Universidade Federal do Rio Grande do Sul,
Porto Alegre, 2010.
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