UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
“ANÁLISE DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS EM
CULTURAS DE Pestalotiopsis sp E Aspergillus aculeatus”
LUIS HENRIQUE RODRIGUES*
Dissertação apresentada como parte dos
requisitos para a obtenção do título de
MESTRE EM QUÍMICA, na área de
concentração QUÍMICA.
Orientador: Prof. Dr. Edson Rodrigues Filho
*Bolsista CNPq
SÃO CARLOS – SP
2006
Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da
Biblioteca Comunitária da UFSCar
R696am
Rodrigues, Luis Henrique.
Análise de metabólitos secundários em culturas de
Pestalotiopsis sp e Aspergillus aculeatus / Luis Henrique
Rodrigues. -- São Carlos : UFSCar, 2007.
93 p.
Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São
Carlos, 2006.
1. Produtos naturais. 2. Fungos endofíticos. 3.
Cromatografia líquida de alta eficiência. 4. Espectrometria
de massas. 5. Metabólitos secundários de fungos. 6.
Cromatografia gasosa. I. Título.
CDD: 547.3 (20a)
“Aos meus pais Joaquim e Sonia por tudo que representam para mim”
“A toda minha família”
Dedico este trabalho a Ana Paula por estar sempre ao meu lado, independente
de tudo, sempre me apoiando em tudo àquilo que acreditei e acredito.
Agradecimentos
Primeiramente a Deus, simplesmente pela existência.
Ao professor Dr. Edson Rodrigues Filho pelos ensinamentos, apoio, amizade,
paciência e pela oportunidade de realizar este trabalho.
Aos professores Dr. João Batista Fernandes e Dra. Ângela Regina Araújo pela
participação na banca examinadora.
A todos os professores do Laboratório de Produtos Naturais (PN), CLAE, RMN e
Síntese Orgânica.
A todos os meus amigos do laboratório de Espectrometria de Massas (Rodrigo,
LF, Gezimar, Bianca, Lú, Renata, Thaís, Lívia,) e ao Afonso, Antónia e Francinete.
Agradeço a Taícia pela amizade e ajuda com a impressão.
Agradecimentos especiais ao Rodrigo pela participação direta no trabalho,
amizade e debates.
Aos meus amigos do PN pela colaboração e convívio diário.
A todos os amigos dos laboratórios CLAE, Síntese Orgânica e RMN.
Aos professores do DQ-UFSCar pelos ensinamentos.
Ao corpo técnico do DQ-UFSCar pela constante ajuda.
A todos que puderam contribuir para que este trabalho fosse realizado.
Ao CNPq pela bolsa concedida.
A Fapesp e Capes pelo suporte financeiro.
Resumo
Sesquiterpenos da classe dos cariofilenos são compostos
químicos já isolados de fungos do gênero Pestalotiopsis no nosso grupo de
estudos. No presente trabalho foram desenvolvidas metodologias de cultivo
e análise de espécies de Pestalotiopsis, isoladas das plantas Pinus taeda,
Swietenia macrophyla, e Khaya invorenses. Diferentes procedimentos de
extração e análise desses extratos, empregando LC/MS e GC/MS, foram
otimizados. Esses procedimentos visaram a detecção desses sesquiterpenos
sem a necessidade de isolamento. Posteriormente foi delineada uma curva
de produção desses compostos variando-se o tempo de cultivo, para
posterior quantificação. A produção de compostos voláteis produzidos
pelas diferentes espécies de Pestalotiopsis, foi avaliada usando a técnica de
extração por hidrodestilação (através do extrator de Clevenger). Um
sesquiterpeno cariofileno foi o principal composto identificado.
Um outro estudo dos metabólitos secundários produzidos pelo
fungo Aspergillus aculeatus, isolado da planta hospedeira Melia azedarach,
foi feito tendo como alvo pré-determinado os policetídeos aromáticos
diméricos como as Aurasperonas A e B, Fonsesinona A e B, Orlandina e
Kotanina. Uma curva de produção desses policetídeos mostrou que os
monômeros não são detectados nos tempos iniciais de cultivo, indicando
uma rápida dimerização no meio ou a sua biossíntese já na forma
dimerizada. Experimentos de biotransformação mostrou que o fungo possui
capacidade de modificar certos substratos, quando cultivado em meios
artificiais.
Abstract
Cariophylene sesquiterpenes are chemical compounds isolated
from fungi of the Pestalotiopis genus in early studies developed in our
research group. In the present work, a cultivation and analysis methodology
were developed for these compounds in Pestalotiopsis, isolated from plants
Pinus taeda, Swietenia macrophyla and Khaya invorenses. Different
procedures were optimized for the extraction and analysis of the extracts
employing liquid and gas chromatography coupled with mass spectrometry
techniques (LC/MS and GC/MS). These studies had the intention of to
detect the sesquiterpenes in fungal extracts without theys of isolation, and
to check their production profile during a fixed cultivation period. The
production of volatile organic compounds by the different species of
Pestalotiospsis was also evaluated using hydrodestillation in Clevenger
apparatus. The sesquiterpene cariophyllene was the main compound
identified.
Another study involving the secondary metabolites produced
by Aspergillus aculeatus, a fungus isolated from the host plant Melia
azedarach, was carried out. The target compounds in these studies were the
dimeric aromatic poliketides Aurasperones A and B, Fonsesinones A and
B, Orlandine and Kotanin. A poliketide production curve, obtained using
HPLC, showed that the monomers are not detected during the early stage of
development, indicating that probably the dimers are rapidly formed by the
fungus or they are biosynthesized in the form already dimeric. Experiments
of biotransformation showed that fungi possesss capacity to modify certain
substracts, when cultivated in artificial ways.
Principais abreviações
AcOEt
-
Acetato de Etila
CCD
-
Cromatografia em Camada Delgada
CG/EM
-
Cromatografia Gasosa acoplada ao Espectrômetro de Massas.
Dicl.
-
Diclorometano
GC/MS
-
Gas Chromatography/Mass Spectrometry
Hex
-
Hexano
MeOH
-
Metanol
Rf
-
Fator de Retenção
m/z
-
Relação massa/carga
UV-Vis
-
Ultravioleta-Visível
L
-
Comprimento
D
-
Diâmetro
Principais Símbolos
M+
-
Pico do íon molecular
λ
-
Comprimento de onda
Lista de Tabelas
TABELA 1 -
Comparação entre as exigências fisiológicas e
7
nutritivas de fungos e bactérias.
TABELA 2 -
Curva de produção de Policetídeos por Aspergillus
32
aculeatus.
TABELA 3 -
Composição do meio Czapek’s.
33
TABELA 4 -
Parâmetros obtidos para a Kotanina
72
TABELA 5 -
Parâmetros obtidos para a Fonsesinona A
73
TABELA 6 -
Parâmetros obtidos para a Fonsesinona B
74
TABELA 7 -
Concentrações dos Policetídeos (valores em µg/Kg
74
arroz)
Lista de Figuras
FIGURA 1
-
Fungos do gênero Pestalotiopsis numa interação com
4
espécie de planta. No detalhe os conídios do fungo.
FIGURA 2
-
Diferentes
microrganismos
que
podem
interagir
10
endofíticamente com plantas, comparação das dimensões
dos microrganismos com uma célula vegetal.
FIGURA 3
-
Estrutura Química do Taxol
12
FIGURA 4
-
Três sesquiterpenos cariofilenos.
13
FIGURA 5
-
Policetídeos produzidos por Aspergillus aculeatus.
19
FIGURA 6
-
Policetídeos produzidos por Aspergillus aculeatus (cont.)
20
FIGURA 7
-
Etapas para o isolamento de Pestalotiopsis sp do córtex
27
de Pinus taeda
FIGURA 8
-
Pestalotiopsis disseminata em BDA após 7 dias.
28
FIGURA 9
-
Aspergillus aculeatus em BDA após 10 dias
29
FIGURA 10 -
Extrator de Clevenger
31
FIGURA 11 -
1 - α Naftol, 2 - β Naftol, 3 - α Naftilamina e 4 –
33
Antraquinona.
FIGURA 12 -
Possível sesquiterpeno detectado
55
FIGURA 13 -
Curva de Calibração para a Kotanina
71
FIGURA 14 -
Curva de Calibração para a Fonsesinona A
72
FIGURA 15 -
Curva de Calibração para a Fonsesinona B
73
Lista de Esquemas
ESQUEMA 1 - Proposta biogenética para Aurasperona A.
18
ESQUEMA 2 - Extração para a detecção de terpenóides em culturas de
35
Pestalotiopsis disseminata.
ESQUEMA 3 - Esquema do procedimento de extração de Policetídeos
37
de Aspergillus aculeatus.
ESQUEMA 4 - Proposta de Fragmentação para a molécula de taedolidol.
48
Lista de Cromatogramas
CROMATOGRAMA 1
- Teste para o método com o Gradiente A
44
CROMATOGRAMA 2
- Teste para o método com o Gradiente B
45
CROMATOGRAMA 3
- Cromatograma de Íons Totais (TIC), íon
46
selecionado m/z 281 e m/z 263, do padrão
taedolidol,
de
baixo
para
cima,
respectivamente.
CROMATOGRAMA 4
- Cromatograma de Íons Totais (TIC), íon
49
selecionado m/z 281 e m/z 263, para o extrato
B535, de baixo para cima, respectivamente.
CROMATOGRAMA 5
- Extrato do fungo B53
51
CROMATOGRAMA 6
- Cromatograma GC/MS do controle e do
54
extrato, de cima para baixo, respectivamente.
CROMATOGRAMA 7
- Aurasperona A
57
CROMATOGRAMA 8
- Fonsecinona A
58
CROMATOGRAMA 9
- Aurasperona B
59
CROMATOGRAMA 10 - Fonsecinona B
60
CROMATOGRAMA 11 - Kotanina
61
CROMATOGRAMA 12 - Orlandina
62
CROMATOGRAMA 13 - Tempo T0, 1° dia de cultivo.
64
CROMATOGRAMA 14 - T12, 3° dia de cultivo.
64
CROMATOGRAMA 15 - Tempo T13, 4° dia de cultivo.
65
CROMATOGRAMA 16 - Tempo T14, 5° dia e sua ampliação, de cima
67
para baixo, respectivamente.
CROMATOGRAMA 17 - Extração
após
25
dias
de
cultivo.
O
69
cromatograma e a ampliação, de cima para
baixo, respectivamente.
CROMATOGRAMA 18 - Amostra controle
75
CROMATOGRAMA 19 - α Naftol
76
CROMATOGRAMA 20 - β Naftol
77
CROMATOGRAMA 21 - α Naftilamina
77
CROMATOGRAMA 22 - Antraquinona
78
CROMATOGRAMA 23 - Amostra – fungo + α naftol – extraído com
79
acetato de etila
CROMATOGRAMA 24 - Extrato β naftol + fungo
80
CROMATOGRAMA 25 - Extrato de α Naftilamina + Fungo
82
CROMATOGRAMA 26 - Extrato Antraquinona + Fungo
83
Lista de Espectros
ESPECTRO 1
-
Espectro de Massas Full Scan para o sesquiterpeno
47
taedolidol.
ESPECTRO 2
-
Espectro de Massas Full Scan para o extrato B535
50
ESPECTRO 3
-
Espectro do pico em 37.95 min.
51
ESPECTRO 4
-
Espectro do ergosterol padrão a 247 nm
52
ESPECTRO 5
-
Espectro de EI+ para o pico de maior intensidade
55
ESPECTRO 6
-
Aurasperona A
57
ESPECTRO 7
-
Fonsecinona A
58
ESPECTRO 8
-
Fonsecinona B
60
ESPECTRO 9
-
Kotanina
61
ESPECTRO 10 -
Orlandina
62
ESPECTRO 11 -
Principais espectros referentes ao Cromatograma 15
66
ESPECTRO 12 -
Espectros referentes ao Cromatograma 16
68
ESPECTRO 13 -
Espectros referentes ao Cromatograma 16
70
ESPECTRO 14 -
Extrato de α Naftol + Fungo
80
ESPECTRO 15 -
Extrato de β Naftol + Fungo.
81
ESPECTRO 16 -
Extrato de α Naftilamina + Fungo
82
ESPECTRO 17 -
Extrato Antraquinona + Fungo
83
SUMÁRIO
1 – INTRODUÇÃO
1
1.1. ASSOCIAÇÕES PLANTA-MICRORGANISMOS
2
1.2. FUNGOS
5
1.3. IMPORTÂNCIA DOS FUNGOS
7
1.4. FUNGOS ENDOFÍTICOS
8
1.5. PRODUÇÃO DE TERPENÓIDES POR Pestalotiopsis
11
1.6. DETECÇÃO DE TERPENÓIDES
14
1.7. O GÊNERO Aspergillus
16
1.8. POLICETÍDEOS PRODUZIDOS POR Aspergillus aculeatus
17
2 – OBJETIVOS
21
3 – PARTE EXPERIMENTAL
23
3.1. MATERIAIS
24
3.2. EQUIPAMENTOS UTILIZADOS
25
3.3. OBTENÇÃO E ISOLAMENTO DOS MICRORGANISMOS
27
3.3.1. Pestalotiopsis sp
27
3.3.2. Aspergillus aculeatus
29
3.4. CULTIVO DOS MICRORGANISMOS
30
3.4.1. Pestalotiopsis sp
30
3.4.1.1. Detecção de Terpenóides produzidos por Pestalotiopsis sp.
30
3.4.1.2. Análise de substâncias voláteis produzidos por Pestalotiopsis 30
sp.
3.4.2. Aspergillus aculeatus
31
3.4.2.1. Policetídeos produzidos por Aspergillus aculeatus
31
3.4.2.2. Biotransformação de fenóis e análogo por Aspergillus 32
aculeatus
3.5. PROCEDIMENTOS DE EXTRAÇÃO
34
3.5.1. Pestalotiopsis sp
34
3.5.1.1. Detecção de Terpenóides produzidos por Pestalotiopsis sp.
34
3.5.1.2. Análise de substâncias voláteis produzidos por Pestalotiopsis 36
sp.
3.5.2. Aspergillus aculeatus
36
3.5.2.1. Policetídeos produzidos por Aspergillus aculeatus
36
3.5.2.2. Biotransformação de fenóis e análogos por Aspergillus 38
aculeatus
3.6. CONDIÇÕES DE ANÁLISE
39
3.6.1. Detecção de terpenóides produzidos por Pestalotiopsis 39
disseminata
3.6.2. Análise de substâncias voláteis produzidos por Pestalotiopsis 41
disseminata
3.6.3. Análise de Policetídeos produzidos por Aspergillus aculeatus
42
3.6.4. Análise dos produtos de biotransformação por Aspergillus 42
aculeatus
4 – RESULTADOS E DISCUSSÕES
43
4.1. DETECÇÃO DE TERPENÓIDES EM CULTURAS DE 44
Pestalotiopsis disseminata
4.2. ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS PRODUZIDOS 53
POR Pestalotiopsis disseminata
4.3. PRODUÇÃO DE POLICETÍDEOS POR Aspergillus aculeatus
56
4.3.1. Análise dos padrões
57
4.3.2. Análise qualitativa dos extratos
63
4.3.3. Curva de Produção dos policetídeos
71
4.4. BIOTRANSFORMAÇÃO DE FENÓIS E ANÁLOGOS POR 75
Aspergillus aculeatus.
4.4.1. Análise do padrões
76
4.4.2. Análise do Extratos
78
5 – CONCLUSÕES
85
6 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
89
1 – INTRODUÇÃO
1
1.1. ASSOCIAÇÕES PLANTA-MICRORGANISMOS
As plantas e os microrganismos podem apresentar diferentes
tipos de associações. Essas associações podem ser neutras, positivas ou
ainda prejudiciais ou negativas. Nas associações baseadas no neutralismo,
não é observado nenhum efeito em ambos os indivíduos, pois eles
apresentam diferentes necessidades para o seu crescimento (PELCZAR, et
al., 1981; AGRIOS, et al., 1988).
Um tipo de associação onde ambos os organismos são
beneficiados com a interação é o mutualismo. Como exemplo de
mutualismo tem os liquens, que apresentam o aspecto de ser uma única
planta, mas são o resultado de uma associação simbiótica entre certas algas
com fungos. O fungo adquire das algas certas substâncias necessárias a sua
nutrição, como glicose e álcoois poliídricos e fornece para elas algumas
propriedades de suas paredes celulares, por exemplo, a capacidade de reter
água. Outro exemplo das associações mutualísticas são as associações
íntimas entre as raízes de plantas e certos fungos de solo, e são
caracterizados por crescimento das hifas dos fungos em raízes, formando as
micorrizas. Comensalismo é um tipo de interação onde apenas um dos
organismos se beneficia e o outro permanece sem ser afetado, como
exemplo é a melhor captação da luz solar, no caso das orquídeas que presas
nas árvores,captam melhor a luz do sol. (PELCZAR, et al., 1981).
Essas associações também podem ser prejudiciais, podendo
ser exemplificadas por quatro tipos de interações. A primeira é chamada de
antagonismo, onde um organismo atinge de maneira adversa o ambiente do
outro. Essas interações são importantes do ponto de vista metabólico pois
esses organismos podem produzir substâncias como os antibióticos que
inibem o desenvolvimento do outro. Esses metabólitos podem ser
utilizados para fins práticos.
2
Quando ambas as populações são afetadas de modo negativo
em relação ao crescimento e a sobrevivência, temos um tipo de relação
chamada competitismo (Figura 1). Essa competição ocorre principalmente
por espaço e nutrientes insuficientes para todas as populações envolvidas.
Também pode ocorrer um tipo de associação chamada parasitismo, onde
um organismo vive sobre ou dentro do outro e à custa desse organismo
hospedeiro, sendo esse último prejudicado no processo. Como exemplo
desse tipo de relação tem fungos parasitas que afetam plantas, como alguns
fungos do gênero Alternaria que podem causar grandes perdas em Citrus.
Quando esse tipo de relação pode levar um dos organismos a morte, temos
o predadismo, que pode ser prejudicial quando o ataque é descontrolado,
mas também pode ser um processo natural de controle biológico, o que
mantém o equilíbrio ecológico (AGRIOS, et al., 1988).
O conhecimento químico e bioquímico das relações entre
plantas e microrganismos apresenta grande importância prática, pois
através do conhecimento dos metabólitos envolvidos nessas interações
pode-se
compreender
os
processos
bioquímicos
da
associação,
possibilitando o controle da produtividade agrícola e também a otimização
da produção desses metabólitos que podem apresentar muitas utilidades
práticas, principalmente atividades biológicas, como anticâncer, antibiótica,
antifúngica entre outras.
3
FIGURA 1 – Fungos do gênero Pestalotiopsis numa interação com espécie
de planta. No detalhe os conídios do fungo (www.jp-akatsuka.co.jp).
4
1.2. FUNGOS
Os fungos são microrganismos eucarióticos e heterotróficos,
sendo a forma de nutrição mais comum a absorção (osmose ou difusão). A
maioria dos fungos são filamentosos (5 a 10 µm de dimensão transversal).
Cada filamento tubular recebe o nome de hifa e o conjunto destas compõe o
corpo do fungo, denominado micélio que pode ser uma rede frouxa ou um
tecido compacto como nos cogumelos. Mas nem todo fungo é formado por
micélios, as leveduras são organismos unicelulares (ALEXOPOULOS,
1996; PELCZAR, 1981).
Os fungos reproduzem-se naturalmente, com poucas exceções,
através de esporos. Cada fragmento de um fungo é potencialmente capaz de
formar um novo indivíduo. As estruturas reprodutivas são diferentes das
estruturas de crescimento (somáticas), poucos fungos podem ser
identificados se seus estágios reprodutivos não são disponíveis. Os fungos
desenvolvem-se numa ampla faixa de temperatura, com um ótimo
desenvolvimento entre 22 e 30 °C para a maioria das espécies. A grande
maioria dos fungos se reproduz através de esporos, os quais podem
apresentar diferentes formas e podem ser formados de duas maneiras:
sexuada e assexuada (PELCZAR, 1981).
Outra característica apresentada pelos fungos é que eles são
seres imóveis, mas alguns podem apresentar células reprodutivas móveis.
Os fungos apresentam a parede celular constituída por quitina, exceto os
fungos pertencentes ao reino Protozoa, que não apresentam parede celular e
Cromista, cuja composição da parede celular é de celulose, como nas
plantas.
A nutrição e crescimento dos fungos, como mencionado
anteriormente, é que todos eles, sem exceção, são heterotróficos, ou seja,
não produzem seu próprio alimento. Os fungos obtêm seu alimento
5
infectando organismos vivos, como parasitas ou simbióticos mutualistas,
ou decompondo a matéria orgânica morta, como saprófitos. Outra
característica importante dos fungos é que eles são capazes de se
desenvolver
e
reproduzir
em
meios
de
cultura
artificiais
(ALEXOPOULOS, 1996; PELCZAR, 1981).
A disponibilidade de uma fonte de carboidrato (glicose,
sacarose, maltose, etc.), permite que os fungos sintetizem suas próprias
proteínas utilizando fontes de Nitrogênio inorgânico ou orgânico e sais
minerais essenciais para seu crescimento. Pesquisas têm mostrado que os
elementos requeridos pela maioria dos fungos são C, O, H, N, P, K, Mg, S,
B, Mn, Cu, Mo, Fé e Zn.
Os fungos são capazes de decompor e utilizar uma grande
variedade de substratos, sendo extremamente eficientes na conversão dos
nutrientes em material celular. Se, contudo, houver excesso de material
nutritivo, diversos produtos de decomposição podem ser excretados no
meio ambiente, enquanto substâncias de reserva (carboidratos e lipídeos)
podem acumular-se no micélio.
Ao contrário das bactérias, os fungos preferem o meio ácido
para seu crescimento, sendo que o pH ótimo encontrado para a maioria das
espécies estudadas até o momento foi em torno de 5,6 como mostra a
Tabela 1 (ALEXOPOULOS, 1996).
6
TABELA 1 – Comparação entre as exigências fisiológicas e nutritivas de
fungos e bactérias.
EXIGÊNCIAS
pH
Limites
Ótimo
Temperatura
Limites
Ótimo
FUNGOS
BACTÉRIAS
2–9
5,6
4–9
6,5 – 7,5
0 – 62°C
22 – 30°C
0 – 79 °C
20 – 37 °C
Gases
Aeróbios estritos
Luz
% Carboidrato
Fonte de Carbono
Nenhuma
4%
Heterotrófico
Aeróbias – microaerófilas
Anaeróbias facultativas
Anaeróbias
Alguns grupos fotossintéticos
0,5 – 1%
Heterotrófico e autotrófico
1.3. IMPORTÂNCIA DOS FUNGOS
Os fungos apresentam grande valor econômico em processos
industriais, incluindo a produção de antibióticos e enzimas. Como exemplo
da produção de enzimas por fungos temos a produção de Xilanase, uma
enzima utilizada principalmente na indústria de papel, que é produzida por
Polyporus tricholoma.(DEY et al., 1994).
Também podem ser utilizados no controle de patógenos de
importância agrícola, no controle de ervas daninhas e algumas espécies são
comestíveis. Por outro lado eles são causadores de doenças em plantas e
animais, podendo causar perdas consideráveis na agricultura. Os fungos
associam-se com plantas em interações benéficas, como as micorrizas, que
correspondem às associações entre raízes de plantas e fungos. As
associações micorrízicas são importantes para a planta em termos de
obtenção de fósforo e outros nutrientes, através das hifas dos fungos. Essas
associações podem até proteger as raízes do ataque de patógenos. O fungo
7
se beneficia pelo fornecimento de carbono orgânico. Os fungos são
extremamente diversos podendo estar presentes em substratos orgânicos e
inorgânicos. Por isso eles possuem a habilidade de produzir uma variedade
de enzimas, toxinas e grandes e diversas classes de metabólitos secundários
(RAVEN, EVERT e EICHHORN, 1992). Os exemplos citados não
esgotam nem de longe o potencial que os fungos apresentam em
biotecnologia. A visão que se pretendeu dar por meio dos exemplos
selecionados foi de que a genética, o melhoramento genético e a
biotecnologia em fungos, embora já tenham produzido resultados realmente
assombrosos, como no caso do melhoramento para produção de
antibióticos, ainda têm muito mais a oferecer. É evidente que, no Brasil,
um número maior de micologistas, geneticistas de fungos e biologistas
moleculares tem que existir para conseguir estudar não só as espécies já
conhecidas como também toda a biodiversidade ainda inexplorada no
grande reino dos fungos (BINSFELD, 2000).
1.4. FUNGOS ENDOFÍTICOS
Fungos endofíticos são aqueles que habitam os tecidos
internos dos seus hospedeiros em pelo menos uma etapa de seu ciclo de
vida, sem lhes causar sintoma aparente (Figura 2).
Estas interações parecem ser benéficas para ambos os
organismos, pois na maioria das plantas habitam espécies endofíticas em
praticamente todos os seus órgãos. Nem endófitos, nem epifíticos
apresentam haustórios, estrutura comum em fungos patogênicos (PETRINI,
1992).
Em geral as infecções por fungos endofíticos não apresentam
sintomas aparentes, podendo estar latentes ou serem assintomáticos. A
infecção por endófitos ocorre através das raízes, estômatos ou através de
8
lesões. Esses fungos podem ser passados para as plantas filhas através da
infecção das sementes. Além de fungos, existem bactérias e leveduras
endofíticas (FERNANDES & PRICE, 1992, PRESZLER et al.,1996).
Fisiologicamente, assume-se que fungos endofíticos utilizam
as mesmas armas de um patógeno para penetrar no hospedeiro e que a
planta por sua vez responde a esta invasão com suas armas de defesa e de
reconhecimento, tornando as infecções endofíticas geralmente localizadas
ou seja, o fungo desenvolve-se no local da inoculação, atingindo raramente
outras partes da planta. No entanto, existem poucos estudos realizados
sobre a fisiologia de interações planta-endofíticos referentes a métodos de
penetração, produção de enzimas e fitoormônios (PETRINI, 1996; BACON
e HILL citados por SCHULZ et al., 1992).
Um outro aspecto extremamente importante dos fungos
endofíticos são os metabólitos secundários produzidos durante a
associação. Ultimamente têm se destacado muito as pesquisas com
microrganismos na área de produtos naturais, para se entender a fundo as
interações entre estes e as plantas e também na busca de novas fontes de
produtos naturais, pois esses microrganismos podem produzir uma grande
variedade de metabólitos de interesse na agricultura e industria
farmacêutica. Como exemplos desses metabólitos, temos sesquiterpenos,
meroterpenos, alcalóides, policetídeos, esteróides, cumarinas e outras
classes (PASCHOLATI et al., 1998).
9
FIGURA
2
–
endofíticamente
Diferentes
com
microrganismos
plantas,
comparação
que
das
podem
interagir
dimensões
microrganismos com uma célula vegetal (adaptado de AGRIOS, 1988).
10
dos
1.5 – PRODUÇÃO DE TERPENÓIDES POR Pestalotiopsis
Fungos do gênero Pestalotiopsis são comumente encontrados
como parasitas ou endofíticos de plantas, são pertencentes a classe dos
Ascomicetos e em geral a identificação das espécies é muito difícil, devido
a similaridade dos conídios. Fungos desse gênero têm sido alvo de estudo
nos últimos anos, por serem bons produtores de metabólitos secundários
com potencial atividade biológica, principalmente terpenóides, como
sesquiterpenos, e também compostos da classe do taxanos.
O Taxol, cujo nome comercial é paclitaxel, é um diterpeno
polifuncionalizado que apresenta atividade anticâncer (Figura 3).
Esse composto foi primeiramente isolado, há mais de 34 anos, da
planta Taxus brevifolia (WANI et al., 1971). Em 1993 STIERLE e
STROBEL verificaram a produção de Taxol por fungos da espécie
Taxomices andrenae, isolados de Taxus brevifolia. Em 1997 STROBEL et
al. também verificaram a produção de taxol por Pestalotiopsis guepinii,
isolados de Taxus wollemi uma araucária de ocorrência canadense. Como
essa espécie de pinho não produzia taxol, isso evidencia que o fungo pode
ter adquirido a habilidade de produzir o taxol habitando uma planta
produtora. Neste mesmo trabalho verificaram-se por microscopia eletrônica
que os esporos do fungo estavam presentes nas penas de uma espécie de
pássaro que vive na araucária, evidenciando que o fungo interage
fortemente com as superfícies hidrofóbicas da planta e também com os
pássaros que nela habitam.
11
O OH
AcO
O
NH
O
B
A
OH
O
OH
C
H
OBz
DO
FIGURA 3 - Estrutura Química do Taxol
A produção de taxol por microorganismos ainda é questionada
por
muitos
pesquisadores.
Um
dos
argumentos
usados
nesse
questionamento é que o taxol é o único diterpeno taxano obtido das
culturas dos microrganismos testados. Nos organismos vivos, as vias de
biossíntese de metabólitos secundários, em geral levam à produção de
vários membros de uma classe de substâncias e não a um único
representante de uma classe. Até o momento, só foram feitos estudos
visando a detecção específica de taxol em culturas de microorganismos,
sem a preocupação de analisar seus análogos biossintéticos.
O taxol possui um esqueleto terpênico. A produção de
determinados terpenoídes por espécies de Pestalotiopsis pode ser um
possível marcador das espécies produtoras de Taxol. Em 1997 PULIC et al.
estudaram os metabólitos secundários produzidos por espécies de
Pestalotiopsis sp. obtidos de Taxus brevifolia e verificaram a produção de
sesquiterpenos cariofilenos altamente funcionalizados. Esses cariofilenos
apresentaram atividade imunossupressora. Aparentemente, há uma
correlação entre presença dos sesquiterpenos cariofilenos e a ocorrência de
taxol em espécies de Pestalotiopsis.
12
Em 2003 MAGNANI et al. também verificaram a produção,
isolamento e identificação de três novos sesquiterpenos cariofilenos (ver
estrutura abaixo por espécies de Pestalotiopsis disseminata isolados de
Pinus taeda. Esses sesquiterpenos possuíam atividade imunossupressora e
sua
estrutura
bem
oxidada
e
os
compostos
foram
nomeados
Pestalotiopsolide A, Taedolidol e 6-epitaedolidol (Figura 4).
FIGURA 4 - Três sesquiterpenos cariofilenos isolados e identificados
(MAGNANI et al., 2003).
13
1.6 – DETECÇÃO DE TERPENÓIDES
Os métodos mais empregados atualmente para a análise de
terpenóides são Cromatografia Líquida (HPLC) e RMN. Porém, a
Cromatografia Gasosa (GC) também têm se destacado e é grande o número
de trabalhos que utilizam essa técnica na análise de sesquiterpenos,
diterpenos, monoterpenos. Também é grande o número de trabalhos que
utilizam GC/MS na análise de metabólitos secundários produzidos por
fungos. Neste trabalho será estudada a produção de sesquiterpenos por
espécies de Pestalotiopsis sp e sua detecção será feita por técnicas de
LC/MS (para os compostos fixos) e GC/MS (para os compostos voláteis).
As substâncias voláteis produzidas por fungos têm sido bastante
estudadas devido a grandes aplicações que essas substâncias apresentam,
como
marcadores
taxonômicos,
aromatizantes,
subprodutos
de
fermentação, como CO2 e etanol. Como exemplo temos a ampla fabricação
de bebidas etanólicas onde se utilizam leveduras e fungos para fermentação
(STROBEL et al., 2002).
A análise de substâncias voláteis é feita principalmente por
Cromatografia Gasosa, onde a amostra é volatilizada no injetor e separada
na coluna, sendo um pré-requisito justamente a volatilidade do analito, ou
seja os compostos devem apresentar baixo ponto de ebulição (SKOOG et.
al., 1992).
As técnicas acopladas de GC/MS hoje são amplamente utilizadas
para a detecção e elucidação estrutural de compostos voláteis, possuindo
amplas bibliotecas de espectros de massas onde os analitos podem ser
comparados e possivelmente identificados. Em GC/MS a fonte de
ionização mais utilizada é a de impacto eletrônico. Nesta técnica a amostra
proveniente do GC já se encontra vaporizada e é inserida na câmara de
ionização onde é bombardeada por um feixe de elétrons de alta energia que
14
quebram as ligações dos analitos, fragmentado-os e esses fragmentos são
focalizados para um setor de análise que separa-os de acordo com sua
relação m/z. (SKOOG et. al., 1992).
Os
estudos
envolvendo
metabólitos
voláteis
de
fungos
empregam-se, na maioria dos artigos verificados, as extrações por Micro
Extração em Fase Sólida (SPME), onde fibras recobertas por material
polimérico são colocadas em contato com os compostos voláteis e por
processos de adsorção, os analitos ficam aderidos na fibra e logo após são
dessorvidos no injetor do GC. Essa técnica apresenta a vantagem de ser
altamente seletiva. Outras técnicas de extração de voláteis também têm sido
empregadas, como a Hidrodestilação: nesta técnica, através de um extrator
de Clevenger acoplado a um condensador, os voláteis são separados e
posteriormente analisados por GC. Há também como técnicas de extração a
destilação a vapor e extração com fluido supercrítico. Neste trabalho serão
utilizadas as duas primeiras técnicas, visando a detecção e identificação de
terpenóides voláteis, principalmente cariofilenos e taxóides pouco
funcionalizados (STROBEL et al., 1995).
15
1.7 - O GÊNERO Aspergillus
Fungos do gênero Aspergillus ocorrem em uma variedade de
habitats, embora sejam comuns como saprófitos de solos, alimentos e
outros produtos estocados e vegetação em decomposição. No entanto
algumas espécies parasitam insetos, plantas e animais, inclusive o homem.
Algumas espécies também têm bastante utilidade na fabricação de
alimentos fermentados, como fonte de enzimas das quais a Alfa-Amilase e
a Alfa-Galactosidase. Por outro lado, algumas espécies produzem
poderosas toxinas que afetam e provocam grandes perdas na agricultura e
em alimentos (TEIXEIRA et al., 1994; BUCHI et al., 1971).
Uma grande variedade de micotoxinas tem sido isolada de
espécies de Aspergillus e essas micotoxinas apresentam uma grande
diversidade
estrutural
e
pertencem
a
grupos
químicos
bastante
diversificados bem como seus efeitos tóxicos. Mas nem todos os
metabólitos que os fungos desse gênero produzem são micotoxinas. Uma
grande parte dessas substâncias apresenta atividade antibiótica, antifúngica
e inseticida.
Dentre
identificados
os
metabólitos
destacam-se
produzidos
alcalóides
por
indólicos,
dicetopiperazinas, terpenos, meroterpenos, entre outros.
16
Aspegillus
já
policetídeos,
1.8. – POLICETÍDEOS PRODUZIDOS POR Aspergillus aculeatus
Através de estudos da interação de plantas da família
Meliaceae com microrganismos endofíticos, a espécie Aspergillus
aculeatus foi isolado das folhas de Melia azedarach e depositado na
Micoteca
do
Laboratório
de
Bioquímica
Micromolecular
de
Microorganismos do Departamento de Química da Universidade Federal de
São Carlos – UFSCar (SANTOS et al., 2003).
Essa espécie vem mostrando ser uma fonte muito rica de
metabólitos secundários. Através do estudo químico dessa espécie
cultivada em diferentes meio de cultura (arroz, trigo e meio líquido), foram
isolados policetídeos que se encontravam na forma de dímeros como a
Aurasperona A, Aurasperona B, Fonsecinona A, Fonsecinona B, Orlandina
e Kotanina (Figura 5 e 6) (CAMPOS et al., 2004). Os policetídeos
apresentam atividades antibiótica e anticâncer.
Uma curva de produção desses policetídeos versus tempo de
cultivo mostrou que os policetídeos diméricos atingem um máximo de
concentração aos c.a. 25 dias. No entanto, de maneira surpreendente, não
foram detectados os monômeros no meio de cultura na fase inicial de
crescimento do microorganismo. Conforme o esquema de origem
biossintética (Esquema 1) para esses compostos, os dímeros são formados
via acoplamento radicalar de duas unidades policetídicas menores. Em
algum momento, essas unidades deveriam estar presentes no meio de
cultura (CAMPOS et al., 2003).
Neste trabalho, o fungo foi cultivado em arroz e extraído em
intervalos de tempo menores que aqueles realizados em trabalhos anteriores
(CAMPOS et al., 2003).
17
O
O
O
O
O
O
O
reação de Claisen
O
-
SCoA
O
H
SCoA
O
O
O
HSCoA
CH3
O
O
O
OH
OO
O
CH3
H+
H+
O
O
O
O
H
H
- 2 H2O
H
O
O
CH3
O
OH
H H
OH
H
CH3
O
O
SAM
O
- 1e
CH3
OCH3 O
H
H3CO
O
O
H
CH3
H3CO
O
CH3
IIb
II
OCH3 OH
O
H
Ia e IIb
acoplamento
radicalar
H
H3CO
O
CH3
H
H3CO
OCH3
OH
H
O
H
O
CH3
ESQUEMA 1: Proposta biogenética para aurasperona A.
18
O
H
H3CO
O
Ia
OCH3 O
O
O
CH3
H
CH3
H
H3CO
O
O
I
H
O
H
HO
H
- 1e
OCH3 O
OH
H
enolização
CH3
OCH3 O
H
H3CO
OH
H
O
H
O
H
H
OCH3 OH
O
H
H
CH3
OH
H3CO
O
H
H3CO
O
OH
H3CO
H
O
H
H
CH3
H
H3CO
O
H
OH
CH3
H
H3CO
OCH3
H3CO
OCH3
OH
H
OH
H
O
H
O
H
O
O
H
CH3
H 3C
H
H
OH
Aurasperona B
Aurasperona A
OH
H3CO
O
H
H
H3CO
O
CH3
H
H3CO
OCH3
O
H
CH3
H
H
OH
O
Fonsecinona A
FIGURA 5 – Policetídeos produzidos por Aspergillus aculeatus
19
H3CO
OH
O
H
H
H
H3CO
O
H
CH3
CH3 OCH3
H
H
H3CO
OCH3
H
H3CO
O
O
OH
H
O
O
OCH3
O
H
H
H
O
H
H
OCH3 CH3
H
Kotanina
Fonsecinona B
CH3 OCH3
H
H
O
HO
O
O
O
OH
H
H
OCH3 CH3
Orlandina
FIGURA 6 – (CONTINUAÇÃO) Policetídeos produzidos por Aspergillus
aculeatus
20
2 – OBJETIVOS
21
Os objetivos deste trabalho foram estudar a produção de
terpenóides por espécies de Pestalotiopsis e analisar a produção de
policetídeos por Aspergillus aculeatus.
No caso dos terpenóides de
Pestalotiopsis, os compostos foram investigados em extratos de compostos
fixos apolares, visando encontrar terpenóides esterificados, esteróides e
compostos voláteis. Diferentes linhagens de Pestalotiopsis, isoladas de
diferentes plantas, sendo que as duas principais são o endofítico isolado de
Pinus taeda e outro de Khaya invorensis. A técnica de análise empregada
para os metabólitos mais polares foi Cromatografia Líquida de Alto
Desempenho acoplada a Espectrometria de Massas (HPLC/MS) com
Ionização a Pressão Atmosférica (APCI) e para análise dos compostos
voláteis empregou-se a Cromatografia Gasosa acoplada ao Espectrômetro
de Massas (GC/MS).
Para o estudo com Aspergillus aculeatus, cultivou-se o fungo
em arroz por diferentes tempos (curva de produção) para detectar e
quantificar a produção de policetídeos dímeros pelo fungo, bem como a
tentativa de detectar os monômeros produzidos na fase inicial do
desenvolvimento
do
microrganismo.
Também
foram
realizados
experimentos de biotransformação de fenóis e análogos pelo Aspergillus
aculeatus, para verificar a capacidade de trasformação de certas substâncias
pelo fungo, mostrando se o fungo pode ou não estar transformando os
monômeros em polímeros nas fases iniciais do seu desenvolvimento.
Nos experimentos com Aspergillus aculeatus utilizou-se como
técnica de análise a Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC).
22
3 – PARTE EXPERIMENTAL
23
3.1 – MATERIAIS
a) Suportes para cromatografia:
- Sílica gel 70 – 230 mesh (Sílica comum), para cromatografia em coluna
(Funil de placa Sinterizada).
b) Eluentes para cromatografia:
- Foram utilizados solventes comerciais, destilados no DQ-UFSCar.
- Em alguns casos foram usados solventes PA da Merck, Synth, Vetex,
Reagen e outros.
- Solventes de grau HPLC Merck, Aldrich, e outros foram utilizados nas
análises de HPLC, GC/MS e HPLC/MS.
c) Meios de cultura utilizados para o cultivo dos fungos Pestalotiopsis
disseminata e Aspergillus aculeatus:
Para o cultivo dos fungos, empregou-se Ágar, Batata,
Dextrose (BDA) e meio de cultura sólidos arroz parbolizado (Uncle ben’s).
24
3.2 – EQUIPAMENTOS UTILIZADOS
a) Rotoevaporadores
- Evaporador Rotativo TECNAL (TE 120)
- Rotavapor Büchi 461 – Water Bath (EL 131)
b) Cromatógrafo a gás:
- Fisons GC 8000 series
c) Coluna para GC:
- J & W Scientific DB 35MS L = 30 m, I.D = 0, 25 mm, Film = 0,15 µm
d) Cromatógrafo Líquido
- Bomba Shimadzu LC-10A, Auto injetor Shimadzu SIL-10AD, Detector
diode array (DAD) Shimadzu-M10A.
e) Coluna para HPLC
- Sinergi Fusion C18 250 x 4.6 mm e 4 µm
d) Espectrômetro de Massas
- VG Plataform II para os experimentos de IE, GC/MS
- MICROMASS Quattro LC para os experimentos de LC/MS
25
e) Estufa de secagem e esterilização
- FANEN – 315 SE
f) Balança analítica
- Mettler P163
g) Câmara de fluxo laminar
- Veco VL FS – 12M
h) Estufa incubadora
- FANEM 347 CD
i) Autoclave vertical
- Phoenix AV 75
26
3.3 – OBTENÇÃO E ISOLAMENTO DOS MICRORGANISMOS
3.3.1 – Pestalotiopsis sp
O fungo Pestalotiopsis sp foi isolado do córtex do tronco de
Pinus taeda. (MAGNANI et al., 2003). O córtex foi isolado das plantas
encontradas no Bosque do Departamento de Química da UFSCar. Em
seguida, esterilizado de acordo com os procedimentos descritos na
literatura (ISAAC, 1992; PETRINI, 1992 & SCHULZ, 1998).
Após isso o isolamento do fungo foi feito como descrito na
Figura 5 e cultivado em meio Batata, Agar e Dextrose (BDA). O fungo
também foi identificado por microscopia eletrônica como Pestalotiopsis
disseminata e codificado como B5-3 (FIGURAS 7 e 8).
Planta
sadia
Partes do tecido
da planta com
clorox 11%
em diferentes durações
Apenas os isolados
endofíticos
Remoção
do clorox
Repicagem
Obtenção de cultura
pura
FIGURA 7 – Etapas para o isolamento de Pestalotiopsis disseminata do
córtex de Pinus taeda (MAGNANI et al., 2003).
27
FIGURA 8 – Pestalotiopsis disseminata em BDA após 7 dias (acima e o
detalhe dos conídios abaixo).
28
3.3.2 – Aspergillus aculeatus
O fungo endofítico A. aculeatus foi obtido da micoteca do
Laboratório de Bioquímica de Microrganismos da UFSCar, onde se
encontra conservado sob o código LaBioMi 001 (SANTOS et al., 2003). O
fungo foi inoculado em BDA e cultivado por sete dias a 25°C (Figura 9).
FIGURA 9 – Aspergillus aculeatus em BDA após 10 dias
29
3.4 - CULTIVO DOS MICRORGANISMOS
3.4.1 – Pestalotiopsis disseminata
3.4.1.1 - Detecção de Terpenóides produzidos por Pestalotiopsis
disseminata.
Para os experimentos de detecção de terpenóides, o fungo foi
cultivado em arroz parbolizado (uncle ben’s) após sete dias de cultivo em
BDA. Utilizou-se 50 g de arroz e 42 mL de água destilada em frascos
erlenmeyers de 250 mL. Após esterilização do meio (autoclavagem a
120°C e 1 atm por duas vezes em um intervalo de 24 horas), foram
inoculados três fragmentos do BDA com o fungo e o sistema foi incubado
sob proteção da luz por 20 dias a 25°C.
Neste experimento empregou-se 10 frascos para cultivo, sendo
um deles sem a inoculação, para controle. Esta espécie foi identificada
como Pestalotiopsis disseminata e codificada como B5-3.
3.4.1.2 – Produção de compostos voláteis produzidos por Pestalotiopsis
disseminata.
Os experimentos de análise de voláteis foi feito utilizando-se
um balão de duas bocas, de 2000 mL e um extrator de Clevenger como
mostrado na Figura 10. Ao balão, adicionou-se 270 g de arroz parbolizado
(uncle ben’s) e 225 mL de água destilada. O sistema foi autoclavado a
120°C e 1 atm duas vezes em um intervalo de 24 horas. Após isso,
inoculou-se fragmentos de BDA contendo o fungo e incubou-se o sistema
sob abrigo da luz por 20 dias.
30
FIGURA 10 – Extrator de Clevenger (www.oleosessenciais.com.br).
3.4.2 – Aspergillus aculeatus
3.4.2.1 – Produção de Policetídeos produzidos por Aspergillus aculeatus
Neste caso o objetivo foi obter uma curva de produção dos
policetídeos produzidos, empregando-se tempos de extração diferentes
daqueles empregados em experimentos anteriores (CAMPOS et al., 2003).
Anteriormente empregaram-se tempos de extração que variavam de 5 a 20
dias, e neste experimento foi empregado tempos de extração que variou de
0 a 7 dias. O fungo Aspergillus aculeatus foi cultivado em arroz
parbolizado (uncle ben’s) contendo 50 g de arroz e 42 mL de água
destilada, O sistema foi autoclavado duas vezes a 120°C e 1 atm em
intervalo de 24 horas. Após isso, fragmentos do BDA contendo o fungo
foram inoculados no sistema e incubou-se. As extrações ocorriam nos
horários indicados na Tabela 2. O experimento foi realizado em triplicata.
31
TABELA 2– Curva de produção de Policetídeos por Aspergillus aculeatus.
1° dia
2° dia
3° dia
4° dia
5° dia
6° dia
7° dia
25° dia
8 : 30
8 : 30
8 : 30
8 : 30
8 : 30
8 : 30
8 : 30
8 : 30
11 : 30 14 : 30 18 : 30 18 : 30 18 : 30
14 : 30 20 : 30
18 : 30
22 : 30
3.4.2.2 – Biotransformação de fenóis e análogos por Aspergillus
aculeatus
Para o cultivo do fungo utilizou-se o meio Czapek’s contendo
2% de extrato de levedura. (TABELA 3). Todos os componentes foram
dissolvidos em 100 mL e distribuídos em 15 frascos de Erlenmeyers (250
mL). Adicionou-se os padrões α-Naftol, α-Naftilamina, β-Naftol e
Antraquinona (Figura 11) nos frascos e autoclavou-se todos os frascos a
120°C e 1 atm por 15 minutos. Após o sistema esfriar completamente,
inoculou-se 5 fragmentos do BDA contendo o fungo em cada frasco. Após
isso o sistema foi colocado sob agitação em mesa agitadora a 120 rpm por
18 dias.
32
TABELA 3 - Composição do meio Czapek’s
Componente
Quantidade (g)
Dextrose
15
NaNO3
3
MgSO4
0,75
KCl
0,75
K2HPO4
1,5
FeSO4
0,015
H2O
1,5 L
Extrato de Levedura
30
OH
OH
1
2
NH2
O
OH
OH
HO
3
FIGURA 11 – 1 - α Naftol
4
O
2 - β Naftol
Antraquinona
33
3 - α Naftilamina
4 -
3.5 – PROCEDIMENTOS DE EXTRAÇÃO
3.5.1 – Pestalotiopsis disseminata
3.5.1.1 - Produção de Terpenóides por Pestalotiopsis disseminata
Após interrupção do crescimento do fungo, adicionou-se 200 mL
de metanol aos frascos e extraiu-se por 3 horas. Após isso o sistema foi
moído no triturador e filtrado. Com o filtrado, foi feita concentração em
rotoevaporador.
Em seguida a amostra foi fracionada em funil de placa
sinterizada, empregando sílica comum como fase estacionária. As
características da coluna e do sistema sistema cromatográfico foram:
L = 60 cm
D = 5 cm
m (sílica) = 257,4 g
V total (eluente) = 1000 mL
Sistema de Eluentes empregado:
1 – Hexano 100%
2 – Dicloro/Hexano 1:1
3 – Dicloro/Hexano 7:3
4 – Dicloro/ Hexano 7:3 + 10% MeOH
5 – Dicloro/Hexano 7:3 + 15% de MeOH
6 – Metanol 100%
Após 20 dias de cultivo e 2 extrações de 200 mL com
Metanol, fracionou-se o sistema em Coluna com Funil de placa sinterizada
34
e volume de eluente de 1000 mL. O Esquema 2 simplifica as etapas de
extração e fracionamento.
Pestalotiopsis (B5-3) 20 dias de cultivo
2 x 200 mL
Extrato Bruto (62,5 g)
Funil de placa sinterizada (1000 mL)
Hex.100%
0,1 g
B5-31
D/H 1:1
0,2 g
B5-32
D/H7:3
D/H7:3
0,4 g
B5-33
D/H7:3
MeOH
10%MeOH
15%MeOH
100%
0,6 g
0,9 g
B5-34
B5-35
29,9 g
B5-36
ESQUEMA 2 – Extração para a detecção de terpenóides em culturas de
Pestalotiopsis disseminata
35
3.5.1.2 – Análise de substâncias voláteis produzidos por Pestalotiopsis
disseminata
Após o cultivo do fungo por 20 dias, adicionou-se 600 mL de
água ao sistema e acoplou-se o balão ao extrator de clevenger. O sistema
foi mantido a 100°C por 4 horas sob refluxo, e o óleo obtido foi extraído
com éter etílico. Após isso a amostra foi congelada a -10°C para posterior
injeção direta no sistema GC/MS.
3.5.2 – Aspergillus aculeatus
3.5.2.1 – Policetídeos produzidos por Aspergillus aculeatus
Após os tempos de cultivo estabelecidos na tabela 2,
adicionou-se 60 mL de metanol aos frascos e extraiu-se por 12 horas. Em
seguida o sistema foi basificado para pH 9 com NH4OH 5 % e filtrado.
Com o filtrado acidificou-se para pH 3 com HCl 5 % e efetuou-se partições
líquido/líquido com Acetato de Etila, empregando-se 3 x 40 mL para as
extrações.
Em seguida adicionou-se Sulfato de Sódio Anidro para secar e
filtrou-se o sistema. Com o filtrado, separou-se alíquotas de 5 e 15 mL que
após a evaporação total do solvente foram congeladas a -10°C. Para injeção
no HPLC as amostras foram re-suspendidas em 1 mL de Acetonitrila. Um
esquema simplificado das etapas de cultivo e extração encontra-se no
Esquema 3.
36
A
B
Partição
líquido/líquido
Filtração
Com o filtrado regular
60 mL de MeOH
O pH 3 com HCl 5 % e
Triturar por 3 min
Adicionar 40 mL de água
Regular o pH 9 com
NH4OH 5%
Separar
a fase
orgânica
3 X 40 mLAcetato de etila
C
D
Separar
alíquotas
de 5 mL.
Secar com
NaSO4 Anidro
Secar e
ressuspender
em 1 mL de
ACN para
análise
ESQUEMA 3 – Esquema do procedimento de extração de Policetídeos de
Aspergillus aculeatus.
37
3.5.2.2 – Biotransformação de fenóis e análogos por Aspergillus
aculeatus
Após o cultivo do fungo no meio Czapek’s, os frascos foram
filtrados e os semelhantes foram reunidos através de comparação por
Cromatografia em Camada Delgada. Realizou-se primeiramente uma
partição com acetato de etila. Em seguida com a fase aquosa remanescente
basificou-se a solução (pH 10) e extraiu-se com acetato de etila.
Novamente, com a solução aquosa inverteu-se o pH para 2 (HCl) e
realizou-se extração com acetato de etila.
38
3.6 – CONDIÇÕES DE ANÁLISE
3.6.1 – Detecção de terpenóides produzidos por Pestalotiopsis
disseminata
Para os experimentos de detecção de terpenóides em culturas
de Pestalotiopsis disseminata empregou-se dois métodos para HPLC,
denominados Gradiente A e Gradiente B. As condições para cada método
foram:
Gradiente A
Coluna: Sinergi Fusion C18 250 x 4.6 mm e 4 µm
Bomba A : Acetonitrila/ Água 9:1
Bomba B: Isopropanol
V injeção = 20 µL
Fluxo = 0,7 mL/min
Gradiente
t (min)
0
15
30
40
%B
5
10
60
85
39
Gradiente B
Coluna: Sinergi Fusion C18 250 x 4.6 mm e 4 µm
Bomba A : Acetonitrila/ Água 9:1
Bomba B: Isopropanol
V injeção = 20 µL
Fluxo = 0,7 mL/min
Gradiente
t (min)
0
15
30
40
%B
20
30
60
90
Para os experimentos de LC/MS, empregou-se o método B do
HPLC, com as seguintes condições do espectrômetro de massas:
Modo de ionização: APCI modo positivo
Corona: 330 kV
Cone: 48 V
T fonte: 130°C
T probe APCI = 300°C
40
3.6.2 – Análise de substâncias voláteis produzidos por Pestalotiopsis
disseminata
Para as análises dos compostos voláteis empregou-se um
sistema GC/MS Fisons GC 8000 Series acoplado a um VG PLATFORM,
as condições de análise empregadas foram:
Modo de inonização: EI+ 70 eV.
Coluna: DB 35MS L = 30 m, I.D = 0, 25 mm, Film = 0,15 µm
T injetor = 260°C
V injeção = 1 µ L
A Programação de temperatura foi a seguinte:
Iniciou-se em 85°C por 5 min e variou-se a temperatura em 8°C/min até
280°C ficando nessa temperatura por 4min. Em seguida variou-se a
temperatura a 5°C/min até 325°C.
t (min)
°C/min T (°C)
5
0
85
4
8
280
5
325
41
3.6.3 – Análise de Policetídeos produzidos por Aspergillus aculeatus
Para as análises em HPLC empregou-se as seguintes
condições:
Coluna: Sinergi Fusion C18 250 x 4.6 mm e 4 µm
Bomba A : Acetonitrila/ Água 9:1
Bomba B: Isopropanol
V injeção = 20 µL
Fluxo = 1 mL/min
Gradiente :
t (min)
0
50
%B
25
100
3.6.4 – Análise dos produtos de biotransformação por Aspergillus
aculeatus
Neste experimento, as condições de análise por HPLC foram
semelhantes ao experimento de análise de policetídeos.
Coluna: Sinergi Fusion C18 250 x 4.6 mm e 4 µm
Bomba A : Acetonitrila/ Água 9:1
Bomba B: Isopropanol
V injeção = 20 µL
Fluxo = 1 mL/min
Gradiente:
t (min)
0
50
%B
25
100
42
4 – RESULTADOS E DISCUSSÕES
43
4.1
– DETECÇÃO DE TERPENÓIDES EM CULTURAS DE
Pestalotiopsis disseminata
Dentre as frações obtidas, a fração B5-35 (p. 35) foi à
escolhida para as análises de HPLC. Essa escolha ocorreu através de
análises por Cromatografia em Camada Delgada (CCD), onde verificamos
que esta fração apresentava “manchas” muito parecidas com a do padrão
(Taedolidol), tanto na cor da mancha, como no seu Rf. O sesquiterpeno
Taedolidol foi o escolhido para as análises devido a sua disponibilidade no
laboratório e informações de espectro de massas obtidas em experimentos
anteriores (MAGNANI et al., 2003).
Os Cromatogramas 1 e 2 a seguir mostram as análises feitas
com o extrato para o desenvolvimento do melhor método: Gradiente A ou
Gradiente B. Os Cromatogramas foram obtidos em 254 nm pois este
comprimento de onda foi o mais adequado quanto a visualização dos picos
e intensidade das absorções.
B .C O N C
M1504b .m et
80
R e t e n t io n Tim e
150
60
100
40
50
20
0
0
5
10
15
20
25
30
35
M in u t e s
CROMATOGRAMA 1 – Teste para o método com o Gradiente A
44
40
45
Perc ent
m AU
200
D e te c to r A-2 5 4 n m
F a tL R
Lh3
D e te c to r A-2 5 4 n m
L H _ L C M0 2 2
L H _ L C M0 2 2
15 0 0
B .C ON C
M1 5 0 4 d . m e t
10 0
Retention Tim e
80
60
500
40
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Min u t e s
CROMATOGRAMA 2 – Teste para o método com o Gradiente B
Observando os dois cromatogramas podemos observar que o
Cromatograma 2 apresentou melhor resolução, tanto para os compostos
mais polares que eluem no começo da corrida como para os compostos
com polaridade menor que vão eluindo em tempos de retenção maiores.
Com isso, o gradiente B foi escolhido para ser utilizado nos experimentos
de LC/MS.
As injeções no HPLC do padrão Taedolidol não apresentaram
resultados favoráveis, o que já era de se esperar, pois esse sesquiterpeno
não possui uma boa absorbância no Uv, mesmo em 254 nm onde a
intensidade de todos os picos do cromatograma são maiores, não é
suficiente para uma boa detecção.
Para detectar esse sesquiterpeno, utilizamos os experimentos
de LC/MS que neste caso foram bastante favoráveis, pois foi possível
identificarmos a banda cromatográfica referente ao composto padrão, além
de boa resolução na análise dos extratos.
45
45
Perc ent
m AU
10 0 0
O Cromatograma 3 mostra os experimento de LC/MS para o
sesquiterpeno
padrão
Cromatograma
de
taedolidol,
Íons
Totais
onde
(TIC)
podemos
que
o
verificar
padrão
pelo
elui
em
aproximadamente 9.33 min.
LH_LCMSstandart Sm (Mn, 10x5)
100
9.35
Scan AP+
263
4.18e6
9.26
Scan AP+
281
1.24e5
%
5.45
0
LH_LCMSstandart Sb (2,10.00 ); Sm (Mn, 10x5)
100
0.60
%
16.75
10.99
3.32
5.09
14.14
12.26
23.10
15.16
27.73
29.35
0
LH_LCMSstandart Sb (2,10.00 ); Sm (Mn, 10x5)
Scan AP+
TIC
3.26e7
9.33
100
0.09
%
29.18
11.05
13.16
4.96
23.56
26.35
0
Time
2.00
4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
14.00
16.00
18.00
20.00
22.00
24.00
26.00
28.00
30.00
CROMATOGRAMA 3 – Cromatograma de Íons Totais (TIC), íon
selecionado m/z 281 e m/z 263, do padrão taedolidol, de baixo para cima,
respectivamente.
Através da seleção dos íons, m/z 281, podemos verificar que o
cromatograma apresenta também o tempo de retenção de aproximadamente
9.3 min, confirmando a presença desse íon e para o íon selecionado m/z
263, verificou-se
a banda cromatográfica com tempo de retenção
aproximadamente 9.3 min, também confirmando a presença desse íon.
46
Nestas análises de LC/MS foram feitos experimentos de Full
Scan e não experimentos de MS/MS, para que pudéssemos detectar os íons
filhos de um determinado íon, mas o composto apresentou uma
fragmentação na fonte e com isso foi possível obtermos o espectro de
massas para o padrão taedolidol. Com base em experimentos anteriores
(MAGNANI et al., 2003) confirmamos que os íons com m/z abaixo de 281
(íon pseudo molecular MH+) são fragmentos desse íon de m/z 281
(Espectro 1).
LH_LCMSstandart 433 (9.241) Cm (394:512-(248:366+554:690))
Scan AP+
2.09e5
213
100
213 213
263 263
231
231
231
232
203
%
245
245
214
232
265
205
0
200
m/z
205
210
215
220
225
230
235
240
245
250
255
260
265
270
275
280
ESPECTRO 1 – Espectro de Massas Full Scan para o sesquiterpeno
taedolidol.
47
285
Para confirmar a identidade de cada um desses picos do
espectro de massas, foi feito o estudo de fragmentação para a molécula de
taedolidol, para confirmar que o espectro de massas é referente ao
sesquiterpeno em questão, como mostra o Esquema 4.
H
a
OH
O
O
H
- H 2O
H
O
a
H
H
O
O
O
H
H
m/z 231
m/z 263
- CH 3 OH
m/z 281
- CH 3 OH
O
O
b
OH
O
O
H
m/z 249
H
OH
OH
O
OH
H
m/z 281
O
H
O
H
H
OH
H
H
H
OH
- H 2O
H
O
O
H
H
O
H
m/z 263
m/z 281
- H 2O
O
H
O
H
H
m/z 245
ESQUEMA 4 – Proposta de Fragmentação para a molécula de taedolidol.
Através dos resultados obtidos com o padrão, podemos fazer a
comparação com a injeção dos extratos, como mostrado no Cromatograma
4.
48
H
H
LH_LCMS022 Sb (2,10.00 ); Sm (Mn, 10x5)
Scan AP+
263
1.23e8
10.81
100
9.08
15.05
%
18.41
23.14
29.51
24.59
0
LH_LCMS022 Sb (2,10.00 ); Sm (Mn, 10x5)
100
Scan AP+
281
1.05e7
14.97
10.83
9.31
12.14
%
20.04
29.51
0
LH_LCMS022 Sb (2,10.00 ); Sm (Mn, 10x5)
Scan AP+
TIC
5.01e9
10.94
100
14.99
18.76
%
23.05
29.51
0
Time
2.00
4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
14.00
16.00
18.00
20.00
22.00
24.00
26.00
28.00
30.00
CROMATOGRAMA 4 – Cromatograma de Íons Totais (TIC), íon
selecionado m/z 281 e m/z 263, para o extrato B535, de baixo para cima,
respectivamente.
Observando os cromatogramas de LC/MS para o extratos e
comparando com o do padrão, podemos afirmar que o sesquiterpeno
taedolidol está presente no extrato obtido. Isso é confirmado pelo tempo de
retenção (9.5 min) obtido para o pico presente no cromatograma de HPLC
do extrato (Cromatograma 4) e também o tempo de retenção obtido para o
TIC do extrato. Também o cromatograma de íons selecionados para o
extrato mostrou a presença dos íons de m/z 281 e 263 o que está de acordo
com a mesma análise feita para o padrão.
Podemos observar pelo Cromatograma do extrato que além do
pico de tempo de retenção aproximadamente 9.5 min, também temos outros
49
picos presentes, mostrando que além do taedolidol outros compostos estão
presentes. Esses compostos certamente são outros sesquiterpenos
cariofilenos e também outras classes de compostos, isso pode ser verificado
tanto nos cromatogramas de HPLC quanto nos experimentos de LC/MS.
A confirmação da presença de taedolidol no extrato é feita na
análise do espectro de massas do extrato para o pico de 9.3 min. O Espectro
2 mostra a semelhança com o espectro 1, confirmando a identidade do
composto.
LH_LCMS022 504 (10.771) Cm (419:519)
Scan AP+
2.26e7
231231
100
232
213213
213
203203
204
201
%
249249
215
263
233
205
217 219
245
247
229
0
200
m/z
205
210
215
220
225
230
235
240
245
250
255
260
265
270
ESPECTRO 2 - Espectro de Massas Full Scan para o extrato B535
50
275
280
285
Através dos mesmos extratos obtidos para a identificação de
terpenóides, foi possível identificarmos esteróides presentes nos extratos,
nos quais o ergosterol foi identificado através da comparação com o padrão
(Cromatograma 5).
150
150
D etecto r A-234 n m
F atL R
Lh7
Retention Tim e
m AU
100
m AU
100
50
50
0
0
5
10
15
20
25
30
35
Minutes
CROMATOGRAMA 5 – Extrato do fungo B53
S pec trum at tim e 37.95 m in.
1000
1000
0
m AU
2000
2000
0
m AU
37.95 min
220
240
260
280
300
320
nm
ESPECTRO 3 – Espectro do pico em 37.95 min.
51
340
40
45
S pec trum at tim e 43.28 m in.
0
m AU
100
50
m AU
100
50
43.28 min
0
220
240
260
280
300
320
340
nm
ESPECTRO 4 – Espectro do ergosterol padrão
Observamos que o espectro do ergosterol consultado na
biblioteca de espectros é muito parecido com o espectro do pico em 37.95
min obtido do extrato do fungo Pestalotiopsis disseminata. Isso mostra a
capacidade do fungo em produzir esteróides, sendo que os picos que
aparecem próximos ao ergosterol podem ser outros esteróides, devido a
grande semelhança nos tempos de retenção. Apenas com a injeção de
padrões ou comparação com espectros de UV-vis pode ser confirmada a
identidade desses compostos O tempo de retenção obtido para o ergosterol
nos experimentos anteriores foi diferente do obtido neste experimento, pois
as condições cromatográficas foram diferentes. Mas como o espectro não
se altera, a comparação mostrou que nos extratos havia a presença de
ergosterol em concentração significativa, verificada pela alta absorbância.
52
4.2 –ANÁLISE DE SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS PRODUZIDAS POR
Pestalotiopsis disseminata
A pesquisa bibliográfica para a análise de substâncias voláteis
produzidas por Pestralotiopsis disseminata não apresentou nenhum
trabalho e todas as condições e métodos tiveram que ser testados sem
nenhuma referência para este fungo. As análises por GC/MS dos extratos
obtidos com os experimentos de clevenger mostrou que o fungo
Pestalotiopsis disseminata produz uma quantidade grande de compostos
voláteis.
A comparação do extrato com o controle (apenas o meio de
cultura) mostra que a maior parte dos compostos voláteis detectados são
produzidos pelo fungo, pois o cormatograma do extrato apresenta uma série
de picos enquanto o do controle não apresenta esses picos (Cromatograma
6).
Podemos observar pelo cromatograma do extrato que na faixa
de tempo de retenção de 20 min até 30 min, alguns picos bem intensos
aparecem no cromatograma o que não ocorre com o cromatograma do
controle.
Esses picos certamente são compostos voláteis produzidos
pelo fungo e a identidade desses compostos deve ser feita com a injeção de
padrões para comparação dos tempos de retenção, cálculos de Index de
Kovat’s, análise do espectro de massas para estudos de fragmentação e
comparação com bibliotecas padrões, como a NIST, que fornece uma
comparação com um banco de dados e fornece a semelhança do espectro
adquirido com o de padrões catalogados.
53
CROMATOGRAMA 6 – Cromatograma GC/MS do controle e do extrato,
de cima para baixo, respectivamente.
Neste trabalho só foi possível ainda a comparação com a
biblioteca NIST que nas condições empregadas no experimento nos
forneceu um sesquiterpeno como possível volátil presente na cultura de
Pestalotiopsis disseminata, extraído com o extrator de clevenger.
O espectro de massas EI+ (Espectro 5) foi obtido do pico que
apresentou maior intensidade no cromatograma.
54
volateis b53
VB533 953 (22.087) Cm (945:960)
Scan EI+
4.20e5
207
100
91
133
105
%
93
77
119
147
81
95
131
208
83
159
281
189 204 209
161
177
282
210
267
327
0
Da/e
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
ESPECTRO 5 – Espectro de EI+ para o pico de maior intensidade
A comparação do Espectro 5 com a biblioteca de dados NIST
forneceu através da comparação com o banco de dados, o sesquiterpeno de
MM = 204 e estrutura mostrado na Figura 15.
FIGURA 12 – Possível sesquiterpeno detectado
55
4.3 – PRODUÇÃO DE POLICETÍDEOS POR Aspergillus aculeatus
Neste experimento nosso objetivo é identificar os possíveis
monômeros dos policetídeos que são produzidos por Aspergillus aculeatus
mas para isso faz se necessário que tenhamos uma metodologia para os
dímeros. Os resultados de HPLC da injeção dos padrões dímeros para os
seis policetídeos, nomeados de P1, P2, P3, P4, P5 e P6 estão indicados nos
cromatogramas de 7 a 12 e seus respectivos espectros de Uv – Vis
mostrados nos espectros de 6 a 10.
Através da injeção dos padrões e comparação de seus tempos
de retenção e espectros de Uv-Vis com o dos extratos, foi possível detectar
5 policetídeos nos extratos. Foram os policetídeos Aurasperona (P1),
Fonsesinona A (P3), Fonsesinona B (P4), Kotanina (P5) e Orlandina (P6).
Apenas a Aurasperona B não foi possível ser detectada, pois o
cromatograma do padrão apresentou muitos contaminantes. Ainda na
análise qualitativa, a identificação dos dímeros só ocorreu a partir do 4°
dia, pois os cromatogramas em tempos menores que o 4° dia não
apresentava os picos referentes ao dímeros.
A curva de produção dos policetídeos só foi possível ser
construída para 3 deles, a Fonsesinona A, Fonsesinona B e Kotanina, pois
os outros policetídeos apresentaram desvios na curva de calibração e
portanto não puderam ser quantificados.
56
4.3.1 - Análise dos padrões
2000
2000
D etecto r A-281 n m
Po li1
Po li1
H3CO
OH
Retention Tim e
A rea
H
H3CO
1500
P1
O
H
O
1500
CH3
OCH3
1000
1000
OH
H
O
H
O
500
500
H
CH3
Aurasperona A
0
0
10
20
30
40
Minutes
CROMATOGRAMA 7 – Aurasperona A
Spectrum at tim e 34.61 m in.
34.61 m in
Lam bda m ax : 275
Lam bda m in : 201
224
238
191
318
324
349
2000
1000
0
220
240
260
280
nm
ESPECTRO 6 – Aurasperona A
57
300
320
340
50
m AU
H3CO
m AU
m AU
H
400
300
400
D etecto r A-281 n m
Po li2
Po li2
Retention Tim e
A rea
P2
OH
H3CO
O
H
H
300
H3CO
O
CH3
H3CO
200
OCH3
O
H
200
CH3
H
H
100
OH
100
O
Fonsecinona A
0
0
10
20
30
40
50
Minutes
CROMATOGRAMA 8 – Fonsecinona A
S pectrum at tim e 32.32 m in.
32.32 m in
Lam bda m ax : 277
Lam bda m in : 246
191
207
228
348
m AU
400
200
0
220
240
260
280
nm
ESPECTRO 7 – Foncecinona A
58
300
320
340
m AU
m AU
H
D etecto r A-281 n m
Po lic3
Po lic3
m AU
40
m AU
40
Retention Tim e
A rea
20
20
0
0
10
20
30
40
50
Minutes
CROMATOGRAMA 9 – Aurasperona B
Podemos observar pelo Cromatograma 9 que o padrão não
encontra-se puro, cada um desses picos apresentavam um espectro
diferente. Isto pode ser conseqüência de contaminações, degradação do
padrão, irregularidades na estocagem, purificação irregular e outra série de
fatores visto que este e os outros policetídeos foram isolados em
experimentos anteriores (CAMPOS et al., 2003).
Por causa disso, a Aurasperona B não pode ser identificada e
tampouco quantificada, necessitando uma verificação mais cuidadosa da
natureza dos picos presentes no cromatograma dessa substância, para que
se tenha uma certificação de qual desses picos trata-se deste policetídeo.
59
D etecto r A-281 n m
Po lic4
H3CO
Po lic4
600
OH
600
P4
O
H
H
H
Retention Tim e
A rea
H3CO
H
CH3
O
H
400
400
OCH3
m AU
m AU
H3CO
OH
H
O
H
H
H
O
200
200
H
Fonsecinona B
0
0
10
20
30
40
Minutes
CROMATOGRAMA 10 – Fonsecinona B
S pec trum at tim e 30.88 m in.
30.88 m in
750
Lam bda m ax : 281
Lam bda m in : 242
191
209
228
309
323
354
m AU
500
250
0
220
240
260
280
nm
ESPECTRO 8 – Fonsecinona B
60
300
320
340
50
D etecto r A-281 n m
Po lic5
Po lic5
Retention Tim e
A rea
1500
CH3 OCH3
m AU
H
H
H3CO
1000
O
500
O
O
O
1000
OCH3
H
500
H
OCH3 CH3
Kotanina
0
0
10
20
30
40
50
Minutes
CROMATOGRAMA 11 – Kotanina
S pectrum at tim e 26.28 m in.
26.28 m in
Lam bda m ax : 209
Lam bda m in : 195
194
192
306
258
355
354
363
362
m AU
2000
1000
0
220
240
260
280
nm
ESPECTRO 9 – Kotanina
61
300
320
340
m AU
1500
P5
D etecto r A-281 n m
Po li6
Po li6
P6
CH3 OCH3
Retention Tim e
A rea
H
H
2000
2000
O
O
O
m AU
m AU
HO
OH
O
1000
1000
H
H
OCH3 CH3
Orlandina
0
0
10
20
30
40
Minutes
CROMATOGRAMA 12 – Orlandina
S pec trum at tim e 16.33 m in.
16.33 m in
m AU
100
Lam bda m ax : 208
Lam bda m in : 200
307
259
355
354
361
360
364
362
50
0
220
240
260
280
nm
ESPECTRO 10 - Orlandina
62
300
320
340
50
4.3.2 – Análise qualitativa dos extratos
Através da comparação dos tempos de retenção e dos
espectros verificamos a presença dos policetídeos nos extratos. Do 1° dia
até o 4° dia não pudemos detectar os policetídeos, pois verificamos nos
Cromatogramas 13 e 14 substâncias com tempos de retenção diferentes
daqueles apresentado pelos padrões, além do espectro de Uv-Vis não ser
igual. Os picos que aparecem nos cromatogramas do 1° dia até o 4° dia não
foram identificados, pois apenas o tempo de retenção e o espectro não foi
suficiente para identificarmos as substâncias. Esses picos podem ser os
monômeros, mas essa confirmação só poderia ser feita através de
experimentos de LC/MS onde verificaríamos uma massa molecular com a
metade daquela apresentada pelos dímeros e aí confirmaríamos a presença
dos monômeros. Outra alternativa seria a injeção de padrões com estrutura
muito parecida com os monômeros e posterior comparação de seus tempos
de retenção e espectros de Uv-Vis. Também a utilização de experimentos
de RMN poderia contribuir para a confirmação da presença de monômeros
ou não. Até o momento não pudemos realizar esses experimentos e apenas
sabemos que existem outros compostos nos extratos, além dos dímeros. Os
Cromatogramas 15 e 16 mostram que a detecção dos dímeros apenas ocorre
a partir do o 4° dia de cultivo.
63
D etecto r A-281 n m
T01
T01
60
Retention Tim e
A rea
60
20
20
m AU
40
m AU
40
0
0
10
20
30
40
50
Minutes
CROMATOGRAMA 13 – Tempo T0, 1° dia de cultivo
100
D etecto r A-281 n m
T112
T112
100
Retention Tim e
A rea
50
50
25
25
m AU
75
m AU
75
0
0
10
20
30
Minutes
CROMATOGRAMA 14 – T12, 3° dia de cultivo.
64
40
50
Os cromatogramas referentes ao tempos T1 ao T11 ou seja do
1° ao 3° dia apresentaram muita semelhança, com uma quantidade pequena
de picos na região dos tempos de retenção do dímeros, apenas uma pico em
aproximadamente 26 min, mas o espectro de Uv-Vis não apresentou boa
resolução e não podemos afirmar que este pico refere-se a Kotanina.
A partir do 4° dia os picos que aparecem mostram espectros idênticos
aqueles dos padrões, além dos tempos de retenção também serem
semelhantes. O cromatogramas referem-se ao tempos do 4° ao 7° dia
acompanhados dos respectivos espectros do principais picos.
150
150
D etecto r A-281 n m
T131
T131
Retention Tim e
A rea
m AU
100
m AU
100
50
50
0
0
10
20
30
Minutes
CROMATOGRAMA 15 – Tempo T13, 4° dia de cultivo
65
40
50
S pec trum at tim e 16.48 m in.
S pec trum at tim e 22.93 m in.
16.48 m i n
150
22.93 m i n
Lam bda m ax : 208
Lam bda m in : 198
307
259
368
367
Lam bda m ax : 282
Lam bda m in : 219
233
250
321 327
325 330
332
310
20
m AU
m AU
100
10
50
0
0
220
240
260
280
300
320
220
240
260
nm
S pec trum at tim e 29.60 m in.
75
320
340
S pec trum at tim e 35.03 m in.
S pec trum at tim e 29.47 m in.
29. 60 mi n
35. 03 mi n
Lam bda m ax : 280 227 317 327 355
26.65 m i n
Lam bda m in : 211 243 311 325 356
Lam bda m ax : 281 233 319 331
Lam bda m in : 215 249 329 310 357
20
40
Lam bda m ax : 221 279 255 241 327
L a m b29.47
d a mmi ni n : 2 2 0 2 5 6 2 4 0 2 4 3 3 1 1
Lam bda m ax : 280 226 217 316 319
Lam bda m in : 216 219 245 318 314
20
50
m AU m AU
m AUm AU
300
nm
S pec trum at tim e 26.65 m in.
60
280
20
10
10
25
0
0
0
0
220
220
240
240
260
260
280
280
nm
300
300
320
320
340
220
340
220
nm
240
240
260
260
280
nm
280
300
320
nm
ESPECTRO 11 – Principais espectros referentes ao Cromatograma 15
A partir do 5° dia, os cromatogramas apresentaram uma resolução
muito boa como mostra o Cromatograma 16 e os espectros, os policetídeos
estão indicados pelos seus respectivos números.
66
300
340
D etecto r A-281 n m
T141
T141
Retention Tim e
A rea
400
400
200
200
100
100
m AU
300
m AU
300
0
0
10
20
30
40
50
Minutes
D etecto r A-281 n m
T141
T141
400
P5
Retention Tim e
A rea
400
P4
200
300
m AU
m AU
300
P6
200
P2
100
P1
0
15. 0
100
0
17.5
20.0
22.5
25.0
27.5
30. 0
32.5
35.0
Minut es
CROMATOGRAMA 16 – Tempo T14, 5° dia e sua ampliação, de cima
para baixo, respectivamente.
67
S pec trum at tim e 26.70 m in.
S pec trum at tim e 16.61 m in.
26.70 min
600
Lam bda m ax : 280
Lam bda m in : 211
16.61 min
600
Lam bda m ax : 209
Lam bda m in : 195
307
258
359
360
356
355
234
201
209
248
319
327
332
308
357
400
m AU
m AU
400
200
200
0
0
220
220
240
260
280
300
320
240
260
340
280
300
320
340
nm
nm
S pectrum at tim e 29.67 m in.
S pec trum at tim e 32.81 m in.
29.67 m in
Lam bda m ax : 280
Lam bda m in : 242
228
206
205
204
317
311
40
353
32.81 m in
Lam bda m ax : 277
Lam bda m in : 213
m AU
m AU
400
200
228 369 365
247 366 360
359
356
20
0
0
220
240
260
280
300
320
340
220
240
nm
35.04 m in
60
223
238
323
325
326
318
354
355
m AU
40
20
0
220
240
260
280
280
nm
S pec trum at tim e 35.04 m in.
Lam bda m ax : 279
Lam bda m in : 211
260
300
320
340
nm
ESPECTRO 12 – Espectros referentes ao Cromatograma 16
68
300
320
340
Também foi realizado um experimento com extração após 25
dias de cultivo, e o resultado encontra-se no Cromatograma 17 e os
espectros no Espectro 10.
D etecto r A-281 n m
ext13
ext13
Retention Tim e
A rea
800
800
400
400
200
200
m AU
600
m AU
600
0
0
10
20
30
40
50
Minutes
D etecto r A-281 n m
ext13
ext13
800
Retention Tim e
A rea
800
400
400
200
200
m AU
600
m AU
600
0
0
15
20
25
30
35
Minutes
CROMATOGRAMA 17 – Extração após 25 dias de cultivo. O
cromatograma e a ampliação, de cima para baixo, respectivamente.
69
S pec trum at tim e 15.94 m in.
600
S pec trum at tim e 26.39 m in.
15.94 m in
26.39 min
Lam bda m ax : 209
Lam bda m in : 196
307
259
351
350
Lam bda m ax : 281
Lam bda m in : 217
369
233
197
209
249
191
303
318
311
1000
m AU
m AU
400
500
200
0
0
220
240
260
280
300
320
220
340
240
260
280
300
320
340
nm
nm
S pectrum at tim e 29.39 m in.
S pec trum at tim e 32.46 m in.
29. 39 mi n
600
Lam bda m ax : 280
Lam bda m in : 242
191
203
228
311
32.46 m in
317
353
Lam bda m ax : 191
Lam bda m in : 246
277
209
227
368
367
352
100
m AU
m AU
400
50
200
0
0
220
240
260
280
300
320
340
220
240
260
nm
280
300
320
nm
S pec trum at tim e 34.61 m in.
150
34.61 m in
Lam bda m ax : 191
Lam bda m in : 208
280
238
224
318
324
368
367
352
m AU
100
50
0
220
240
260
280
300
320
340
nm
ESPECTRO 13 – Espectros referentes ao Cromatograma 16
Através da comparação feita dos tempos de retenção e dos
espectros de UV-Vis dos padrões com os extratos, foi possível detectar nos
extratos a Aurasperona A, Fonsesinona A, Fonsesinona B, Kotanina e
Orlandina.
70
340
Por apresentar irregularidades na linearidade, bem como na
curva de calibração, apenas a Fonsesinona A e B e Kotanina puderam ser
quantificadas.
4.3.3 – Curva de Produção dos policetídeos
Através da construção das curvas de calibração dos padrões,
foi possível estimarmos as concentrações dos três policetídeos nos
diferentes tempos de cultivo, do 4° ao 25°dia.
As curvas de calibração para os policetídeos Fonsesinona A e
B e Kotanina encontram-se a seguir:
B
Linear Fit of Data1_B
140000
120000
Área
100000
80000
60000
40000
20000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
0,040
C (mg/mL)
FIGURA 13 – Curva de Calibração para a Kotanina
71
0,045
Os parâmetros obtidos para a Kotanina estão na Tabela 4
TABELA 4 – Parâmetros obtidos para a Kotanina
A
B
R
-3301,4611
4,97565E7
0,99576
B
Linear Fit of Data1_B
60000
50000
Área
40000
30000
20000
10000
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
C mg/mL
FIGURA 14 – Curva de Calibração para a Fonsesinona A
72
0,06
Os parâmetros obtidos para a Fonsesinona A estão na Tabela 4
TABELA 5 – Parâmetros obtidos para a Fonsesinona A
A
B
R
-852,42941
941272,95601
0,99969
240000
B
Linear Fit of Data1_B
220000
200000
Área
180000
160000
140000
120000
100000
80000
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
C (mg/mL)
FIGURA 15 – Curva de Calibração para a Fonsesinona B
73
0,06
Os parâmetros obtidos para a Fonsesinona B estão na Tabela 5
TABELA 6 – Parâmetros obtidos para a Fonsesinona B
A
B
R
64985,62771 2,75394E6
0,99352
Depois de estabelecidos esses parâmetros foi feita à estimativa
da concentração dos policetídeos nos diferentes tempos. Considera-se como
uma estimativa, pois não foram feitos ainda os ensaios para a validação do
método, ou seja: Ensaios de recuperação, robustez, limite de detecção,
limite de quantificação e todos os parâmetros para validar a metodologia,
com isso poderíamos calcular a concentração exata dos policetídeos nos
extratos. como mostrado na Tabela 6.
TABELA 7 - Concentrações dos Policetídeos (valores em µg/Kg arroz)
Τ 12
Fonsecinona A
Τ 13
Τ 14
Ext 25
130,89
40,32
565,77
Fonsecinona B
5,28
195,79
185,13
800,88
Kotanina
163,39
1466
3003,64
2985,64
Analisando a tabela podemos verificar oscilações nas
concentrações para os três policetídeos, de aumento e queda na
concentração com o tempo, apenas a Kotanina que apresentou aumento
linear na concentração com o tempo. Isso pode ser considerado como um
processo metabólico do fungo, que pode estar utilizando esse policetídeo
em seus processos catabólicos, ou seja, após produzir a substância no
processo metabólico, o fungo atinge o estágio anabólico onde a
concentração da substância tende a ficar constante. Quando se atinge o
processo catabólito o fungo pode estar utlizando o metabólito em outras
74
reações e depois passa a produzi-lo novamente. Isso certamente provoca as
oscilações nas concentrações com o passar do tempo.
4.3 – BIOTRANSFORMAÇÃO DE FENÓIS E ANÁLOGOS POR
Aspergillus aculeatus
Os resultados verificados para a análise de policetídeos por
Aspergillus aculeatus mostrou a capacidade desse fungo em polimerizar
substâncias, pois nas condições empregas só conseguimos detectar e
quantificar os dímeros, não sendo possível encontrar os monômeros.
Experimentos de biotransformação com esse fungo mostraram que esse
fungo foi capaz de modificar a estrutura de alguns fenóis e análogos. Os
principal parâmetro verificado para a trasformação foi o tempo de retenção
apresentado pela substância padrão, comparado ao tempo de retenção
quando a substância fica em contado com o fungo durante seu crescimento.
A seguir temos o cromatograma controle, apenas o fungo no meio de
cultura, sem as substâncias adicionadas.
D etecto r A-298 n m
co n t_A
co n t_A
Retention Tim e
A rea
80
Kotanina
60
60
40
40
20
20
0
0
5
10
15
20
25
30
Minutes
CROMATOGRAMA 18 – Amostra controle
75
35
40
45
50
m AU
m AU
80
Podemos observar no cromatograma que o fungo produz
muitas substâncias, evidenciados pelo número de picos que aparecem no
cromatograma. Pode-se verificar a presença de Kotanina, o policetídeo
também identificado e quantificado no experimento anterior, mas cultivado
em meio arroz. Isto mostra que o Aspergillus pode produzir policetídeos
tanto em meio sólido como em meio líquido. Para as análises separamos o
experimento em análise dos padrões e análise do extratos.
4.3.1 – Análise do padrões
Os padrões empregados nas análise foram Antraquinona, α e β
Naftol e Naftilamina. Essas substâncias apresentaram os seguintes perfis
cromatográficos:
D etecto r A-320 n m
an afto l_p ad
an afto l_p ad
22.67 m in
Lam bda m ax : 302
Lam bda m in : 296
Retention Tim e
A rea
299
300
295
290
292
287
286
293
1500
1000
1000
220
240
260
280
300
320
340
nm
500
500
0
0
5
10
15
20
25
Minutes
CROMATOGRAMA 19 - α Naftol
76
30
35
40
45
50
m AU
m AU
1500
S pec trum at tim e 22.67 m in.
D etecto r A-304 n m
b n afto l_p ad
b n afto l_p ad
400
S pec trum at tim e 21.26 m in.
21. 26 m i n
Lam bda m ax : 221
Lam bda m in : 222
Retention Tim e
A rea
223
216
217
226
215
219
400
227
212
220
240
260
280
200
300
320
m AU
300
m AU
300
340
200
nm
100
100
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Minutes
CROMATOGRAMA 20 - β Naftol
D etecto r A-334 n m
an afti_p ad
an afti_p ad
1000
S pec trum at tim e 21.05 m in.
1000
21. 05 m i n
Lam bda m ax : 223
Lam bda m in : 222
Retention Tim e
A rea
221
226
216
231
227
217
233
213
750
220
240
500
260
280
300
320
340
500
nm
250
250
0
0
5
10
15
20
25
Minutes
CROMATOGRAMA 21 - α Naftilamina
77
30
35
40
45
50
m AU
m AU
750
D etecto r A-270 n m
an tr a_p ad
an tr a_p ad
100
Retention Tim e
A rea
S pec trum at tim e 35.30 m in.
35. 30 m in
m AU
Lam bda m ax : 224
Lam bda m in : 208
257
235
278
274
287
283
307
75
75
50
50
220
240
260
280
300
320
340
nm
25
25
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Minutes
CROMATOGRAMA 22 – Antraquinona
O método cromatográfico mostrou-se bastante adequado para a
análise desses padrões, destacando a diferença nos espectros de UV-Vis
apresentado pelo α Naftol e o β Naftol, que embora sejam isômeros, seus
espectros são completamente diferentes e seus tempos de retenção são
bastante próximos.
4.3.2 – Análise do Extratos
Os cromatogramas dos extratos contendo o fungo + substância
foram comparados com os padrões através dos tempos de retenção e
espectros de Uv-Vis.
Através das análises dos Cromatogramas, podemos ver pelo
Cromatograma 23 que o α-naftol não foi detectado no extrato através do
espectro de Uv-Vis, mas no cromatograma do extrato temos um pico com
tempo de retenção igual ao do α-naftol , isso mostra que o substrato pode
78
m AU
100
estar sendo modificado pelo fungo. Com relação ao β-naftol e αnaftilamina, os picos dos extratos que apresentavam tempos de retenção
próximos aos desses compostos, mostrou espectros de UV bastante
diferentes daqueles dos padrões (ver Cromatogramas 24 e 25). Isso
certamente pode significar que os compostos sofreram biotransformações,
pois os mesmos não foram detectados no cromatograma do controle, que
apresenta uma quantidade menor de picos.
A substância antraquinona foi detectada nos extratos, e
apresentou o mesmo tempo de retenção e espectro de UV do padrão,
mostrando que
certamente não houve a transformação pelo fungo
(Cromatograma 26).
100
75
100
D etecto r A-237 n m
an afto l_A
an afto l_A
B C
Retention Tim e
A rea
75
50
50
25
25
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Minutes
CROMATOGRAMA 23 - Amostra – fungo + α naftol – extraído com
acetato de etila
79
m AU
m AU
A
S pec trum at tim e 19.93 m in.
S pectrum
pec trum at tim e 12.42 m in.
19. 93 m in
12.42 m in
Lam bda m ax : 212
Lam bda m in : 203
220
240
263
251
260
Lam bda m ax : 255
Lam bda m in : 197
A
289
280
280
300
320
220
340
240
212
235
283
277
260
292
287
280
B
314
300
320
340
nm
nm
S pec trum at tim e 22.77 m in.
22. 77 m in
Lam bda m ax : 210
Lam bda m in : 225
220
240
231
197
260
295
307
308
262
280
323
319
300
C
320
340
nm
ESPECTRO 14 – Extrato de α Naftol + Fungo
D etecto r A-345 n m
b n afto l_A
b n afto l_A
200
A
Retention Tim e
A rea
200
150
150
B
100
m AU
m AU
D
C
100
E
50
50
0
0
5
10
15
20
25
30
Minutes
CROMATOGRAMA 24 - Extrato β naftol + fungo
80
35
40
45
50
S pec trum at tim e 20.36 m in.
S pec trum at tim e 20.93 m in.
20.36 m in
20.93 min
Lam bda m ax : 221
Lam bda m in : 212
220
240
211
235
260
238
195
314
336
280
362
278
300
Lam bda m ax : 218
Lam bda m in : 192
A
320
220
340
240
240
329
325
280
B
300
S pec trum at tim e 30.01 m in.
S pec trum at tim e 21.62 m in.
221
212
260
217
215
211
201
280
200
268
300
C
320
340
320
340
S pectrum at tim e 34.99 m in.
30.01 m i n
21.62 m i n
220
260
276
248
nm
nm
Lam bda m ax : 213
Lam bda m in : 219
286
280
Lam bda m ax : 221
Lam bda m in : 219
220
240
34. 99 m in
213
212
260
217
215
280
211
201
200
287
300
D
320
340
Lam bda m ax : 231
Lam bda m in : 201
220
240
292
298
260
323
285
280
nm
nm
nm
ESPECTRO 15 – Extrato de β Naftol + Fungo.
81
281
306
299
261
300
E
320
340
D etecto r A-327 n m
an afti_A
an afti_A
60
60
C
Retention Tim e
A
A rea
D
40
40
m AU
m AU
B
20
20
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Minutes
CROMATOGRAMA 25 – Extrato de α Naftilamina + Fungo
S pec trum at tim e 9.77 m in.
S pec trum at tim e 10.88 m in.
9.77 m in
10.88 m in
Lam bda m ax : 194
Lam bda m in : 203
220
240
213
239
260
241
289
320
267
280
A
286
300
320
Lam bda m ax : 208
Lam bda m in : 198
340
220
nm
240
324
326
280
B
327
272
300
320
340
nm
S pec trum at tim e 14.42 m in.
220
260
266
263
S pec trum at tim e 21.17 m in.
21.17 m i n
14.42 m in
Lam bda m ax : 219
Lam bda m in : 217
240
248
242
216
212
260
211
203
201
199
280
C
281
248
300
320
340
Lam bda m ax : 211
Lam bda m in : 230
220
240
240
196
260
317
264
280
nm
nm
ESPECTRO 16 – Extrato de α Naftilamina + Fungo
82
D
300
320
340
50
D etecto r A-293 n m
an tr a_A
an tr a_A
E
Retention Tim e
A rea
200
C
m AU
m AU
200
D
100
100
A
B
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Minut es
CROMATOGRAMA 26 – Extrato Antraquinona + Fungo
S pec trum at tim e 9.35 m in.
S pec trum at tim e 10.91 m in.
9.35 m in
10.91 m in
Lam bda m ax : 219
Lam bda m in : 195
260
230
350
296
A
Lam bda m ax : 206
Lam bda m in : 197
220
220
240
260
280
300
320
240
254
263
260
266
272
325
236
280
B
273
284
300
320
340
340
nm
nm
S pec trum at tim e 12.36 m in.
S pec trum at tim e 35.33 m in.
S pec trum at tim e 21.71 m in.
12.36 m in
Lam bda m ax : 207
Lam bda m in : 195
220
240
243
252
260
296
229
280
35.33 m in
21.71 mi n
259
274
C
300
320
340
Lam bda m ax : 209
Lam bda m in : 196
324
263
268
273
259
236
D
274
285
Lam bda m ax : 225
Lam bda m in : 208
220
220
240
260
280
300
320
240
192
235
260
257
274
280
340
nm
nm
nm
ESPECTRO 17 - Extrato Antraquinona + Fungo
83
277
283
287
306
300
E
320
340
Esses experimentos de biotrasformação mostraram que os
espectros de Uv-Vis e a Absorbância de alguns dos compostos padrões,
sofreram modificações, consequentemente a estrutura química dos
compostos também se modificou. Essas mudanças mostram a capacidade
do fungo Aspergillus aculeatus em modificar a estrutura de certas
substâncias para ser utilizado em alguma etapa de seu metabolismo.
Para que a biotrasformação possa ser entendida em detalhes,
experimentos de RMN e Espectrometria de Masssas poderia nos mostrar
como as substâncias se modificaram, que funções químicas foram
transformadas e quais as características dos compostos formados.
Entretanto essas análises cromatográficas servem como uma ferramenta
muito útil para verificarmos quais compostos podem ser transformados e
também para otimizar as condições de cultivo e posteriormente detectarmos
e
elucidarmos
a
estrutura
dos
biotransformação.
84
novos
compostos
formados
na
5 – CONCLUSÕES
85
Através dos experimentos para a detecção de terpenóides por
Pestalotiopsis disseminata, foi possível detectarmos a presença do
sesquiterpeno Taedolidol nos extratos do microrganismo cultivado em
arroz, o que já é um diferencial de experimentos anteriores onde o
composto foi isolado de meio líquido enriquecido com açucares e sais. O
interesse nessa classe de compostos se dá no sentido deles apresentarem
grande atividade imunossupressora e ser possíveis marcadores de espécies
de Pestalotiopsis capazes de produzir Taxol.
A metodologia de análise utilizando HPLC não se mostrou
muito eficiente devido a baixa absorção do composto no UV, mas através
de experimentos de LC/MS foi possível detectarmos o composto, através
de seu espectro de massas, pois mesmo realizando experimentos de Full
Scan, o taedolidol se fragmenta na fonte de APCI e assim obtemos seu
espectro de massas, e a comparação dos espectros de massas do padrão
com o dos extratos nos fornece a informação de que o Taedolidol está
presente no extrato.
O estudo das fragmentações do composto nos forneceu uma
comprovação da maioria dos picos apresentados no espectro de massas,
com isso podemos confirmar a presença do composto no extrato através do
estudo da fragmentação, que confirma a presença de cada um dos íons
formados durante a análise do HPLC/MS.
Esse método de detecção de terpenóides pode ser uma grande
ferramenta de análise para detectarmos outros sesquiterpenos e até taxanos,
como o taxol, sem a necessidade de isolamento, apenas com etapas simples
de extração e análise. Isso pode contribuir muito para o estudo de
metabólitos de fungos, pois pode servir como ferramenta para marcar
espécies de Pestalotiopsis produtoras de terpenóides e com isso chegar às
espécies possíveis produtoras de taxol.
86
O estudo de outras espécies de Pestalotiopsis servirá para que
possamos aplicar o método para diferenciar espécies produtoras de
determinados sesquiterpenos e classificar a espécie como possível
produtora de taxol.
Os experimentos de detecção de substâncias voláteis
produzidos por Pestalotiopsis disseminata mostrou que o fungo é potencial
produtor de substâncias voláteis, evidenciado pelos picos apresentados nos
cromatogramas do extratos comparado com o controle, onde não ficou
evidenciado a presença de compostos voláteis, nas condições de análise
empregadas. Mas a identificação das substâncias ainda precisa ser feita,
através de injeção de padrões e Index de Kovats, além de estudos de
fragmentação. Na literatura não há nenhum relato do estudo de voláteis de
Pestalotiopsis, portanto estes experimentos servem de ponto de partida para
outros experimentos, inclusive com outras técnicas de extração, além do
extrator de clevenger, a Aeração e a Micro Extração em Fase Sólida
(SPME) podem ser testadas para a detecção rápida de substâncias voláteis.
O estudo com Aspergillus aculeatus mostrou mais uma vez
que o fungo produz policetídeos, mas conseguimos detectar e quantificar os
policetídeos em tempos de cultivo menor que aquele apresentado em
experimentos anteriores. Os monômeros não foram detectados, embora os
cromatogramas apresentassem picos não identificados, podendo ser os
monômeros. Experimentos de LC/MS poderia confirmar a presença ou não
dos monômeros. A curva de produção comprovou as fases de crescimento
do fungo através da quantificação dos policetídeos nas diferentes fases. No
metabolismo, as substâncias são produzidas, no anabolismo, ocorre uma
estabilização da produção dos metabólitos e a fase de catabolismo, quando
o fungo começa a consumir esses metabólitos para outros processos, isto
justifica a oscilação nas concetrações dos policetídeos ao longo do tempo.
87
Os experimentos de biotrasnformação com Aspergillus
aculeatus mostrou que esse fungo possuí a capacidade de trasformar
substratos, mostradas pelas modificações nos tempos de retenção e
espectros de alguns fenóis e análogos, isso pode justificar o processo de
polimerização dos policetídeos em determinada fase do metabolismo do
fungo.
Finalmente todos esses estudos com metabólitos secundários
de fungos endofíticos contribui para um melhor entendimentos das relações
ecológicas desses fungos com as plantas de onde foram isolados como
endofíticos, pois verificamos que o fungo quando encontra-se em
associação com a planta produz um determinado metabólito ou transforma
um determinado metabólito e isso continua a ocorrer quando o fungo é
isolado e cultivado em meios artificiais, isso pode mostrar que o fungo
adquiriu a capacidade de produzir aquelas substâncias e a carga genética da
planta foi transferida para o fungo e vice versa, a chamada transferência
genética horizontal pode estar ocorrendo.
Todas essas afirmações necessitam de estudos mais detalhados
para que essas relações possam ser entendidas de uma maneira mais
específica, através de uma comparação de diversos experimentos já
realizados e novos experimentos possam ser confrontados para que o
conhecimento dos microrganismos endofíticos possa crescer e contribuir
muito para as pesquisas visando melhorar a qualidade de vida e também
para a contribuição científica
88
6 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
89
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93
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