Diversidade genética e diferenciação das
raças portuguesas de ovinos com base em
marcadores de DNA − microssatélites:
uma perspectiva de conservação
Paulo António Russo Almeida
Orientadora
Prof. Maria Teresa Rangel de Figueiredo
Departamento de Zootecnia
Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
Este trabalho foi expressamente elaborado como
dissertação original para efeito de obtenção do grau
de Doutor em Ciência Animal, de acordo com o
disposto no Decreto-Lei 216/92 de 13 de Outubro.
Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
Vila Real, 2007
Tese de doutoramento financiada pela Fundação para a
Ciência e a Tecnologia (projecto PRAXIS XXI
3/3.2/CA/2005/95 e bolsa PRAXIS XXI BD/5516/95).
iii
De acordo com o nº. 2 do Artigo 8º do Decreto-Lei nº. 388/70
utilizaram-se para esta tese resultados dos seguintes
trabalhos:
1. RUSSO-ALMEIDA, P. A., MARTINS, A., RAMOS, A. M.; RANGEL-FIGUEIREDO, T.;
CRAWFORD, A. M., 1998. Microsatellite DNA variation within and among
Portuguese ovine breeds: Case of Serra da Estrela breed. Abstrats, BIOTEC98 IV Iberian Congress on Biotechnology, I Ibero-American Meeting on
Biotechnology. Guimarães, Portugal, 12-15 de Julho de 1998, pp. 122 (Poster).
2. RUSSO-ALMEIDA, P. A., MARTINS, A., RAMOS, A. M.; CORREIA, T. M., RANGELFIGUEIREDO, T.; CRAWFORD, A. M., 1998. Microsatellite DNA variation within
and among Portuguese ovine breeds: Case of Churra Algarvia breed. II
Congreso SERGA. Palma de Maiorca, 15-17 de Dezembro de 1998.
(Comunicação Oral).
3.
RUSSO-ALMEIDA, P. A., RAMOS, M., MARTINS, A. M., CORREIA, T. M., RANGELFIGUEIREDO, T., CRAWFORD, A. M., 1999. Microsatellite DNA variation within
and among Portuguese ovine breeds: Case of Merino breeds. Proceedings of 7º
Congress of Mediterranian Federation for Health and Production of Ruminants.
Santarém, Portugal 22 a 24 de Abril de 1999 (Comunicação Oral).
4. DIEZ-TASCON, C., LITTLEJOHN, R. P, ALMEIDA, P. A. R., CRAWFORD, A. M.,
2000. Genetic variation within the Merino sheep breed: analysis of closely
related populations using microsatellite. Animal Genetics Volume 31, Issue 4,
243 –251.
5. RUSSO-ALMEIDA, P. A., MARTINS, A. M. F., RANGEL-FIGUEIREDO, M. T.,
CRAWFORD, A. M. (2004). Contribution of Portuguese sheep breeds to genetic
diversity in conservation programs. IV Congresso Ibérico sobre Recursos
Genéticos Animais. Ponte de Lima, 15 a 17 de Setembro 2004. (Comunicação
Oral).
Para cumprimento do disposto naquele Decreto-Lei, esclarece-se ser da nossa
responsabilidade a ordenação da metodologia, a execução das experiências que
permitiram a obtenção dos resultados apresentados, a sua interpretação, discussão e
redacção, com a excepção do número 4 cuja aquisiçao de resultados e respectiva
redacção foi conjunta.
v
AGRADECIMENTOS
Ao concluirmos esta Tese de Doutoramento, queremos deixar expresso o nosso
reconhecimento a pessoas e instituições pelo auxílio que nos prestaram e que, de uma
forma decisiva, contribuíram para a sua realização. Que todos, sem excepção,
encontrem nestas palavras a expressão dos nossos mais sinceros agradecimentos.
Ao Magnífico Reitor da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Professor
Doutor ARMANDO MASCARENHAS, pela confiança em nós depositada e por ter
proporcionado os meios necessários à nossa promoção académica e valorização
profissional.
À Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) pelo financiamento deste estudo
via Projecto PRAXIS XXI 3/3.2/CA/2005/95 e PRAXIS XXI BD/5516/95 e pelo apoio
à impressão desta tese.
À Professora Doutora MARIA TERESA RANGEL DE FIGUEIREDO estamos gratos
por ter aceite ser nossa orientadora científica, pela amizade que sempre manifestou ao
longo destes anos, pela disponibilidade dispensada; bem como, pela indicação do tema,
das sugestões, da revisão crítica do manuscrito e do rigor científico transmitido ao longo
da elaboração desta dissertação.
Ao Doutor ALLAN CRAWFORD, e sua equipa, o nosso profundo reconhecimento
por todos os ensinamentos na tecnologia dos microssatélites e pela simpatia com que
nos receberam na Unidade de Biologia Molecular do Departamento de Bioquímica da
Universidade de Otago (Nova Zelândia).
Ao Doutor LOUNÈS CHIKHI, por nos ter recebido no “Laboratoire Evolution &
Diversité Biologique” da Universidade Paul Sabatier em Toulouse (França) e pelos
ensinamentos que nos transmitiu.
Ao Doutor JOSÉ ANTÓNIO MATOS e sua esposa Doutora FERNANDA SIMÕES,
membros da equipa do projecto que suportou este trabalho, pela leitura do manuscrito,
assim como, pela forma carinhosa com que nos receberam em sua casa. Agradecemos
também à equipa do Laboratório de Genética Molecular do Departamento de
Biotecnologia do INETI (Instituto Nacional de Engenharia, Tecnologia e Inovação), por
si liderada, que de forma desinteressada ajudou na extração do DNA.
vii
Às instituições que entusiasticamente nos orientaram e acompanharam na recolha
das amostras de sangue, designadamente:
− Associação de Criadores de Gado do Algarve (ASCAL);
− Associação de Criadores de Gado do Algarve (ASCAL);
− Associação de Criadores de Ovinos do Sul (ACOS);
− Associação de Criadores e Reprodutores de Gado do Oeste (ACRO);
− Associação de Produtores de Ovinos do Sul da Beira (OVIBEIRA);
− Associação de Produtores de Pequenos Ruminantes da Bacia Hidrográfica do
Côa (COVICÔA);
− Associação Nacional de Criadores de Ovinos da Raça Churra Badana;
− Associação Nacional de Criadores de Ovinos da Raça Churra da Terra Quente
(ANCOTEQ);
− Associação Nacional de Criadores de Ovinos da Raça Churra Galega Mirandesa
(ACOM) ;
− Associação Nacional de Criadores de Ovinos da Raça Merina (ANCORME);
− Associação Nacional de Criadores de Ovinos da Raça Merina (ANCORME);
− Associação Nacional de Criadores de Ovinos Serra da Estrela (ANCOSE);
− Associação Nacional dos Criadores da Raça Churra Galega Bragançana
(ACOB);
− Direcção Regional de Agricultura de Entre Douro e Minho;
− Direcção Regional de Agricultura do Alentejo;
Aos amigos e colegas de equipa ÂNGELA MARTINS, JOÃO MATEUS e MARCOS
RAMOS pelo empenhamento na amostragem e extração de DNA.
À Dra. FILOMENA AFONSO pela gentileza na cedência dos dados do efectivo ovino
entre 1999 e 2006
Aos funcionários do Laboratório de Fisologia Animal, designadamente às
Senhoras D. IDALINA ABOBELEIRA, CARLA TOMÁS, CÁRMEN ABREU e ao HENRIQUE
viii
AUGUSTO queremos deixar o nosso agradecimento pela ajuda prestada na preparação de
material de laboratorio.
Ao Professor Doutor JORGE MANUEL TEIXEIRA
DE
AZEVEDO e pela leitura do
manuscrito e pela bibliografia que nos facultou.
Aos Professores Doutores VICTOR PINHEIRO e JÚLIO MARTINS, e NORBERTO
GONÇALVES pela leitura do manuscrito e pelas sugestões dadas.
Aos Professores Doutores JOSÉ CARLOS ALMEIDA, SEVERIANO SILVA pela
bibliografia que nos facultaram.
Aos autores dos programas estatísticos utilizados nesta tese que de forma altruísta
os disponibilizaram na internet.
A todos os colegas e amigos que, com as suas críticas e sugestões nos ajudaram na
concretização deste trabalho, aceitem a expressão do nosso reconhecimento.
À minha mulher HELENA MARIA e aos meus filhos HELENA RAQUEL, PAULO
ANDRÉ e TIAGO GABRIEL expresso o meu reconhecimento pelo incentivo transmitido e
por terem permitido que muito do tempo que lhes era devido fosse usado na elaboração
deste trabalho.
ix
RESUMO
Nas últimas décadas tem crescido a consciencialização de quanto é urgente tomar
medidas que visem travar o crescente desaparecimento de raças de animais domésticos,
de forma a evitar a erosão dos recursos genéticos disponíveis e com ela a redução de
opções futuras em termos de adaptabilidade e diversidade de produtos.
Neste estudo foram usados microssatélites (marcadores de DNA recomendados
pela FAO) para investigar a variabilidade genética dentro e entre raças portuguesas de
ovinos, nomeadamente das raças Bordaleira de Entre Douro e Minho - BEDM, Churra
Algarvia - CA, Churra Badana - CB, Churra do Campo - CC, Churra Galega
Bragançana - CGB, Churra Galega Mirandesa - CGM, Campaniça - CMP, Churra
Mondegueira - CM, Churra da Terra Quente - CTQ, Merino Branco - MB, Merino da
Beira Baixa - MBB, Merino Preto - MP, Serra da Estrela – SL e Saloia – SL,
procurando dar um contributo para o seu conhecimento de base e, consequentemente
para a sua preservação. Para o efeito foram amostrados um total de 717 animais
originários das referidas 14 raças ovinas e determinados os genótipos relativos a 20
microssatélites. A informação obtida foi usada para estimar a riqueza alélica e a
heterozigotia em cada raça, analisar a estrutura e relação de similaridade entre raças
através de diversas distâncias genéticas e da representação das raças no espaço
Euclidiano recorrendo à análise factorial de correspondência. Adicionalmente, foi
estudada a hierarquia de prioridade de conservação com base exclusivamente no critério
de similaridade genética, recorrendo a duas abordagens diferentes. Procurou-se também
avaliar os microssatélites quanto ao poder informativo e à capacidade discriminante na
determinação da origem racial dos indivíduos amostrados ou dos simulados de acordo
com as frequências alélicas de cada população.
Apesar da redução drástica do efectivo a que as raças portuguesas têm sido
sujeitas, os resultados alcançados revelaram a presença de uma elevada diversidade no
interior de cada raça, patente nos valores médios de 9 alelos/locus e de 0,762 para a
riqueza alélica e heterozigotia esperada, respectivamente, valores esses que se situaram
ligeiramente acima do que foi apontado para outras raças europeias de ovinos,
submetidas a estudos semelhantes. A Churra Algarvia e a Churra Galega Mirandesa
foram aquelas que apresentaram o menor e o maior valor de riqueza alélica, 6,9 e 9,1
xi
alelos/locus, respectivamente. Para a heterozigotia esperada, o valor mínimo de 0,729
foi observado na Churra Badana e o máximo de 0,782 na Churra Galega Bragançana.
O desvio significativo do equilíbrio de Hardy-Weinberg, observado para o
microssatélite McM357, em 13 raças levou a que este fosse excluído das análises em
que tal equilíbrio era um requisito. Este desvio sugere a presença de alelos nulos nesse
microssatélite, razão pela qual recomendamos que não seja utilizado neste tipo de
estudos.
A análise da estrutura populacional apontou no sentido de uma diferenciação
significativa (P<0,01) entre todos os pares possíveis das 14 raças. Contudo, da
diversidade genética total, apenas 2,6% foram devidos a diferenças entre raças,
enquanto os restantes 97,4% corresponderam a diferenças entre indivíduos dentro das
raças.
O cálculo de distâncias genéticas e a construção de fenogramas, bem como a
análise factorial de correspondência, permitiram estabelecer uma relação de
similaridade entre as 14 raças, verificando-se que as raças CA e MB foram as mais
dissemelhantes, enquanto que as raças CM e CTQ foram as mais próximas.
A posição que cada raça ocupou na hierarquia de prioridade de conservação que
ensaiamos foi muito influenciada pela metodologia utilizada, pondo em evidência a
dificuldade da tomada de uma decisão relativa a esta temática, uma vez que apenas
esteve em análise um de entre vários critérios a ter em consideração.
O método Bayesiano de atribuição foi aquele que originou melhores resultados,
apesar disso, com excepção da raça CA, os 19 microssatélites mostraram-se
insuficientes para discriminar com segurança as 14 raças de ovinas portuguesas. Os
resultados sugeriram que os microssatélites com maior valor médio de riqueza alélica e
de heterozigotia esperada no conjunto das populações devem ser os preferidos para este
tipo de análise.
Por último, a integração do conhecimento que já se detinha sobre as raças e os
resultados agora obtidos permitiram-nos evidenciar a fiabilidade do uso de
microssatélites neste tipo de estudos e em particular para as raças portuguesas de
ovinos.
xii
ABSTRACT
In this study microsatellites (DNA markers recommended by FAO) were used to
evaluate the genetic variability within and among Portuguese sheep breeds, namely of
the Bordaleira de Entre Douro e Minho - BEDM, Churra Algarvia - CA, Churra Badana
- CB, Churro do Campo - CC, Churra Galega Bragançana - CGB, Churra Galega
Mirandesa - CGM, Campaniça - CMP, Churra Mondegueira - CM, Churra da Terra
Quente - CTQ, Merino Branco - MB, Merino da Beira Baixa - MBB, Merino Preto MP, Serra da Estrela – SL and Saloia – SL, as a attemp to contribute to their
preservation. For the aim a total of 717 animals of those 14 sheep breeds were sampled
and the genotypes to 20 microsatellites were determined. Data was used to estimate the
allele richness and the heterozigosity in each breed, to analyze the structure and
similarity relationship among breeds using several genetic distances and the
representation of the breeds in the Euclidean space based on correspondence factorial
analysis. Additionally the hierarchy of conservation priority was studied exclusively
based on genetic similarity criteria, using two different approaches. Microsatellites were
also evaluated for the informative power and discrimination capacity to recognize the
breed origin of the sampled individuals or simulated ones according to the allelic
frequencies of each population.
Despite the drastic reduction of the sheep number that has occurred in Portuguese
breeds, results have shown the presence of high diversity within each breed, expressed
in the mean values of 9 alleles/locus and 0.762 for the allelic richness and expected
heterozigosity, respectively, which are slightly higher than those observed in other
studies previously published concerning different sheep breeds. Churra Algarvia and
Churra Galega Mirandesa were the ones presenting the smallest and the largest value of
allelic richness, 6.9 and 9.1 aleles/locus, respectively. For the expected heterozigosity,
the minimum value of 0.729 was observed in Churra Badana and the maximum of 0.782
in Churra Galega Bragançana.
The significant deviation of the Hardy-Weinberg equilibrium observed in 13
breeds for microsatellite McM357, has determined its exclusion from the analysis where
such equilibrium was a mandatory requirement. This deviation suggests the presence of
null alleles in that microsatellite, for which we recommended that it should be in this
type of studies.
xiii
The analysis of the population structure pointed towards a significant
differentiation (P<0.01) among all the possible pairs of the 14 breeds. However, from
total genetic diversity, only 2.6% were due to differentiation among breeds, while the
remaining 97.4% corresponded to differences among individuals within each breed.
The calculation of genetic distances and phenograms construction, as well as the
correspondence factorial analysis, allowed to establish a similarity relationship among
the 14 races, were CA and MB breeds were the more dissimilar while CM and CTQ
breeds were the closest.
The position that each breed occupied in the hierarchy of conservation priority
was very influenced by the methodology used, enhancing the inherent difficulty for
taken decision in this field, since only one out of several criteria were taken into
consideration.
The Bayesian assignation method has produced better results, however, with
exception of the CA breed, the 19 microsatellites have proven insufficient to
discriminate with high confidence the 14 Portuguese sheep breeds. The results
suggested that microsatellites with larger allelic richness and expected heterozigoty
mean values in the group of the populations should be selected for this type of analysis.
Lastly, the integration of the background knowledge and the present data has
allowed to confirm the reability of microsatellite analysis on this type of studies,
particularly concerning Portuguese sheep breeds.
xiv
“A melhor maneira de prever o que está para vir, é lembrar o que já passou.”
George Savile
xv
ÍNDICE GERAL
AGRADECIMENTOS ...........................................................................................................................VII
RESUMO ................................................................................................................................................. XI
CAPÍTULO 1 – RAÇAS PORTUGUESAS DE OVINOS E MARCADORES DE DNA.....................1
1.1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................................................1
1.2. ORIGEM DOS OVINOS DOMÉSTICOS ........................................................................................3
ALTERAÇÕES DECORRENTES DA DOMESTICAÇÃO ......................................................................................7
1.3. ORIGEM DAS RAÇAS PORTUGUESAS DE OVINOS ................................................................8
1.4. MARCADORES MOLECULARES NO ESTUDO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DAS
RAÇAS DE ANIMAIS DOMÉSTICOS .................................................................................................27
1.4.1. MÉTODOS PROTEICOS ...................................................................................................................27
1.4.2. MÉTODOS DE DNA........................................................................................................................28
1.4.3. MARCADORES MOLECULARES .......................................................................................................34
1.4.3.1. Métodos pré-PCR ..................................................................................................................35
1.4.3.2. Métodos Pós-PCR..................................................................................................................38
1.4.3.2.1. RAPDs (Polimorfismos de amplificação aleatória de DNA) .......................................................... 38
1.4.3.2.2. AFLPs (Polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado) ............................................... 40
1.4.3.2.3. SNPs (Polimorfismo de um único nucleótido) ................................................................................ 43
1.4.3.2.4. Microssatélites ................................................................................................................................ 47
1.4.3.3. Comparação entre os vários marcadores..............................................................................57
CAPÍTULO 2 - METODOLOGIA PARA A OBTENÇÃO DA INFORMAÇÃO ALÉLICA DE
MICROSSATÉLITES NAS RAÇAS OVINAS PORTUGUESAS.......................................................61
2.1. MATERIAL BIOLÓGICO ..............................................................................................................62
2.2. EXTRACÇÃO DE DNA ...................................................................................................................64
2.3. ESTUDO DO POLIMORFISMO DOS MICROSSATÉLITES....................................................65
CAPÍTULO 3 - CARACTERIZAÇÃO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DAS RAÇAS OVINAS
PORTUGUESAS ......................................................................................................................................69
3.1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................................69
3.2. OBJECTIVOS ...................................................................................................................................69
xvii
3.3. DIVERSIDADE DENTRO DAS RAÇAS PORTUGUESAS DE OVINOS..................................70
3.3.1 METODOLOGIA ...............................................................................................................................73
3.3.2 RESULTADOS ..................................................................................................................................75
3.3.3 DISCUSSÃO .....................................................................................................................................79
3.4. DIVERSIDADE ENTRE RAÇAS PORTUGUESAS DE OVINOS..............................................84
3.4.1. ASPECTOS A TER EM CONSIDERAÇÃO NA ESCOLHA DOS MÉTODOS ESTATÍSTICOS ..........................85
3.4.1.1.ANÁLISE DE PRESSUPOSTOS ........................................................................................................85
3.4.1.2 ESTRUTURAÇÃO DA POPULAÇÃO .................................................................................................87
3.4.1.3. DISTÂNCIAS GENÉTICAS E CONSTRUÇÃO DE FENOGRAMAS ........................................................91
3.4.1.4. ANÁLISE MULTIVARIADA ...........................................................................................................95
3.4.2. METODOLOGIA ..............................................................................................................................97
3.4.2.1 ANÁLISE DE PRESSUPOSTOS .........................................................................................................97
3.4.2.2 ESTRUTURAÇÃO DA POPULAÇÃO .................................................................................................98
3.4.2.3 DISTÂNCIAS GENÉTICAS E CONSTRUÇÃO DE FENOGRAMAS .......................................................100
3.4.2.4 ANÁLISE MULTIVARIADA ..........................................................................................................103
3.4.3. RESULTADOS ...............................................................................................................................104
3.4.3.1. ANÁLISE DE PRESSUPOSTOS ......................................................................................................104
3.4.3.1.1. EQUILÍBRIO DE HARDY-WEINBERG .......................................................................................104
3.4.3.1.2. DESEQUILÍBRIO DE LIGAÇÃO (DL).........................................................................................105
3.4.3.2 ESTRUTURAÇÃO DA POPULAÇÃO ...............................................................................................106
3.4.3.3 DISTÂNCIAS GENÉTICAS E CONSTRUÇÃO DE FENOGRAMAS .......................................................108
3.4.3.4 ANÁLISE MULTIVARIADA ..........................................................................................................116
3.4.4. DISCUSSÃO ..................................................................................................................................121
3.5. CONCLUSÕES ...............................................................................................................................131
CAPÍTULO 4 - HIERARQUIA DE PRIORIDADE DE CONSERVAÇÃO DAS RAÇAS
PORTUGUESAS DE OVINOS.............................................................................................................133
4.1. INTRODUÇÃO ...............................................................................................................................133
4.1.1. SINGULARIDADE GENÉTICA .........................................................................................................134
4.2 OBJECTIVOS ..................................................................................................................................140
4.3 METODOLOGIA ............................................................................................................................140
4.3.1 ABORDAGEM DE WEITZMAN ........................................................................................................140
4.3.2 ABORDAGEM DO CORE SET ...........................................................................................................141
4.4 RESULTADOS.................................................................................................................................143
4.4.1 ABORDAGEM DE WEITZMAN ........................................................................................................143
4.4.2 ABORDAGEM DO CORE SET ...........................................................................................................147
xviii
4.5. DISCUSSÃO ....................................................................................................................................154
4.6. CONCLUSÕES ...............................................................................................................................157
CAPÍTULO 5 - DISCRIMINAÇÃO RACIAL DOS OVINOS PORTUGUESES COM BASE EM
INFORMAÇÃO MOLECULAR ..........................................................................................................159
5.1. INTRODUÇÃO ...............................................................................................................................159
5.1.1 MÉTODOS DE ATRIBUIÇÃO............................................................................................................161
5.1.1.1 Distâncias genéticas como critério ......................................................................................161
5.1.1.2 Máxima verosimilhança como critério .................................................................................163
5.1.2 MÉTODOS DE SIMULAÇÃO/EXCLUSÃO ..........................................................................................167
5.1.3 MÉTODOS BASEADOS EM MODELOS ..............................................................................................168
5.1.4. FACTORES QUE INFLUENCIAM OS TESTES DE ATRIBUIÇÃO E SIMULAÇÃO/EXCLUSÃO...................170
5.2. OBJECTIVOS .................................................................................................................................172
5.3. METODOLOGIA............................................................................................................................172
5.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.....................................................................................................175
5.5. CONCLUSÕES ...............................................................................................................................185
CAPÍTULO 6 - CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS...............................187
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................................193
ANEXOS .................................................................................................................................................235
xix
ÍNDICE DE FIGURAS E TABELAS
Lista de Tabelas
Tabela 1. Evolução do efectivo das raças ovinas portuguesas entre 1999 e
2006
26
Tabela 2. Sumário da informação relativa ao processo de amostragem.
63
Tabela 3. Informação sobre os microssatélites utilizados.
65
Tabela 4. Valores de frequência dos alelos únicos, por raça e por
microssatélite.
75
Tabela 5. Características genéticas das 14 raças com base nos 20 loci
estudados: Riqueza alélica observada (RAO), Riqueza alélica
ajustada (RAA), Heterozigotia Observada (HO), Heterozigotia
Esperada (HNB) e PIC.
Tabela 6. Características genéticas dos 20 microssatélites com base nas 14
raças ovinas estudados: Riqueza Alélica observada (RAO), Riqueza
Alélica ajustada (RAA), Heterozigotia Observada (HO),
Heterozigotia Esperada (HNB).
Tabela 7. Valores de heterozigotia em raças europeias de ovinos.
76
78
82
Tabela 8. Valores médios de FIS por raça e microssatélites com desvio
significativo ao HWE.
103
Tabela 9. Pares de microssatélites com desequilíbrio de ligação significativo
por raça.
105
Tabela 10. Valores de θWC por pares de raças, calculados de acordo com
WEIR e COCKERHAM (1984) considerando os 19 microssatélites.
105
Tabela 11. Estimadores da subdivisão genética da população ovina
portuguesa para os 19 microssatélites.
106
Tabela 12. Valores das distâncias genéticas DRey (acima da diagonal) e de DL
(abaixo da diagonal).
108
Tabela 13. Valores das distâncias genéticas DA (acima da diagonal) e de DC
(abaixo da diagonal).
108
Tabela 14. Valores da distância genética DS (acima da diagonal) e do tempo
de divergência em gerações (abaixo da diagonal).
109
Tabela 15. Matriz de coeficientes de correlação de Pearson entre distâncias
genéticas.
109
Tabela 16. Contribuições médias (absolutas e relativas) de cada raça para
cada factor da AFC.
119
Tabela 17. Contribuições médias (absolutas e relativas) de cada
microssatélite para cada factor da AFC.
120
Tabela 18. Ordenadas dos nós do dendograma de Weitzman baseadas nas
distâncias DRey e DE.
143
xxi
Tabela 19. Valores da diversidade marginal e ordem de prioridade de
conservação, calculados a partir das distâncias DRey e DE.
Tabela 20. Valores da diversidade marginal e ordem de prioridade de
conservação, considerando um grupo seguro constituído pelas
raças CTQ, MB e SE, com base nas distâncias DRey e DE.
144
145
Tabela 21. Matriz de coeficientes de coancestralidade estimados segundo o
modelo WLM.
146
Tabela 22. Matriz de coeficientes de coancestralidade estimados segundo o
modelo WLMM.
146
Tabela 23. Matriz de distâncias d(i,j).
148
Tabela 24. Valores da contribuição relativa de cada raça para o core set,
calculadas segundo as estimativas de f pelos modelos WLM e
WLMM.
Tabela 25. Estimativa da perda de diversidade associada ao desaparecimento
eventual de cada raça, considerando à partida um subconjunto
seguro de raças (CTQ, MB, SE).
150
152
Tabela 26. Variação da eficácia da atribuição com o método, o procedimento
("as is" e "leave one out") e o número de raças consideradas.
174
Tabela 27. Eficácia de Atribuição (EA) para cada raça, obtida com os vários
métodos estudados segundo o procedimento "leave one out".
176
Tabela 28. Erro tipo II (percentagem média de indivíduos que são atribuídos
erroneamente a cada uma das raças) para os vários métodos de
atribuição e procedimento "leave one out".
Tabela 29. Percentagens de animais com origem em cada raça (linha) que
não puderam ser excluídos de outras raças (coluna), quando foi
utilizado o método de simulação/exclusão Bayesiano, com o
procedimento "leave on out" e nível de significância α=0,01.
Tabela 30. Parâmetros de eficácia para o método de simulação/exclusão
Bayesiano, com o procedimento "leave on out" e nível de
significância α=0,01.
Tabela 31. Número de vezes (igual ao número de raças) para a posição
relativa que cada microssatélite obteve quando estes foram
ordenados de acordo com o poder de atribuição em cada uma das
14 raças de ovinos estudadas, utilizando o programa WICHLOCI.
xxii
177
178
178
180
Lista de Figuras
Figura 1. Relações filogenéticas entre as formas selvagens e domésticas do
género Ovis (adaptado de HIENDLEDER et al., 2002).
5
Figura 2. Esquema representativo da constituição e da organização da
molécula de DNA (adaptado de SALADIM, 2004).
29
Figura 3. Curva de renaturação do DNA (adaptado de STUDER e EPPLEN,
1990).
30
Figura 4. Divisão sequencial do genoma humano em componentes de DNA
tipo (adaptado de BENNET, 2000).
30
Figura 5. Separação dos satélites e da banda principal de DNA na cobaia, em
gradiente de densidade de Ag2+/Cs2SO4 (adaptado de CORNEO et
al., 1970).
32
Figura 6. Etapas do método de obtenção de RFLPs pela técnica Southern blot
(adaptado de CAMPBELL et al., 1999).
35
Figura 7. Métodos utilizados na genotipagem dos SNPs (adapatado de
SYVANEN, 2001).
47
Figura 8. Exemplo de imagem de um gel para o microssatélite OarFCB128,
obtida pela técnica de primers marcados com P33 radioactivo. (C1
e C2 são controlos com tamanho conhecido).
Figura 9. Exemplo de imagem de um gel para o microssatélite OarFCB128,
obtida pela técnica de primers não marcados e revelação com
nitrato de prata. (C1 e C2 são controlos com tamanho conhecido).
6
67
Figura 10. Relação entre a heterozigotia esperada não enviesada (HNB) e o
Polymorphism Information Content (PIC).
77
Figura 11. Comparação dos valores médios de heterozigotia por
microssatélite em raças europeias de ovinos.
83
Figura 12. Relação entre os valores de θ e os respectivos valores de θRH e
GST'.
107
Figura 13. Fenograma construído a partir das distâncias genéticas DRey (A) e
de DL (B) pelo método Neighbour-Joining.
110
Figura 14. Fenograma construído a partir das distâncias genéticas DA (C) e de
DC (D) pelo método Neighbour-Joining.
112
Figura 15. Fenograma construído a partir da distância genética D2 pelo
método Neighbour-Joining.
114
Figura 16. Fenograma construído a partir da distância genética DRey pelo
método Neighbour-Joining.
114
Figura 17. Análise Factorial de Correspondência realizada a partir dos
genótipos individuais das 14 raças ovinas.
115
Figura 18. Análise Factorial de Correspondência realizada a partir dos
genótipos individuais das raças CB, CM e CTQ.
116
xxiii
Figura 19. Análise Factorial de Correspondência para as 14 raças ovinas. No
centro - vista a três dimensões; em cima, esquerda e em baixo as
respectivas projecções em duas dimensões.
117
Figura 20. Percentagem de inércia e valores próprios de cada factor da AFC.
118
Figura 21. Árvores UPGMA e NJ de distâncias individuais (DL) para a raça
BEDM.
121
Figura 22. Fenograma construído a partir da distância genética DS (E) pelo
método Neighbour-Joining.
124
Figura 23. Exemplares do "Ovino Algarvio" na Exposição Pecuária Nacional
em 1888.
126
Figura 24. Fenograma construído a partir da distância genética DRey pelo
método Neighbour-Joining, excluindo a raça CMP.
127
Figura 25. Dendograma de Weitzman entre as 14 raças portuguesas de ovinos
baseado na distância DRey.
143
Figura 26. Dendograma de Weitzman entre as 14 raças portuguesas de ovinos
baseado na distância DE.
144
Figura 27. Gráfico de superfície representativo da matriz dos coeficientes de
coascendência estimados pelo modelo WLM.
147
Figura 28. Dendograma da relação entre as 14 populações de ovinos,
construído segundo o método Neighbour-Joining.
149
Figura 29. Relação entre a média da heterozigotia esperada não enviesada das
14 raças, para cada microssatélite e o respectivo score de
atribuição.
180
Figura 30. Relação entre a heterozigotia esperada não enviesada (HNB) das 14
raças, para cada microssatélite e o respectivo score de atribuição.
181
Figura 31. Relação entre o Desvio Padrão (DP) da HNB para cada
microssatélite nas 14 raças e o respectivo score de atribuição.
182
Figura 32. Relação entre a Riqueza Alélica (RAO) média nas 14 raças para
cada microssatélite e o respectivo score.
183
Figura 33. Relação entre o θWC nas 14 raças para cada microssatélite e o
respectivo score de atribuição.
183
xxiv
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS UTILIZADOS NO TEXTO
A - Adenina
A260 - Absorvência a 260 nanómetros
A280 - Absorvência a 280 nanómetros
ACM - Análise de Correspondência Múltipla
ACP - Análise de Componentes Principais
AFC - Análise Factorial de Correspondência
AFLPs - Polimorfismos de Comprimento dos Fragmentos Amplificados
B - Método Bayesiano
BEDM - Bordaleira Entre Douro e Minho
C - Citosina
c - Contribuições relativas de cada uma das raças
CA - Churra Algarvia
CB - Churra Badana
CC - Churra do Campo
CGB – Churra Galega Bragançana
CGM - Churra Galega Mirandesa
cm - Centímetro
cM - Centimorgan
CM - Churra Mondegueira
CMP - Campaniça
CR - Cromossoma
CTQ - Churra da Terra Quente
DA - Distância de Nei (NEI et al., 1983)
DAD-IS - Domestic Animal Diversity – Information System
DAS - Shared allele distance (CHAKRABORTY e JIN, 1993)
dATP - 5’- Desoxiadenosina Trifosfato
Dc - Distância de corda (cord distance) (CAVALLI-SFORZA e EDWARDS, 1967)
dCTP - 5’- Desoxicitosina Trifosfato
DE - Distância de Eding (EDING et al., 2002)
dGTP - 5’- Desoxiguanosina Trifosfato
Div(M) - Parâmetro de diversidade
DL - Desequilíbrio de ligação (Linkage Disequilibrium),
xxv
DL - Distância de Latter (LATTER, 1972)
Dm - Distância mínima de Nei NEI et al., 1983
DNA - Ácido desoxirribonucleico (Deoxyribonucleic acid)
dNTPs - Trifosfato de desoxirribonucleótidos (Deoxynucleotide triphosphate)
DP - Desvio padrão
DRey - Distância de Reynolds (REYNOLDS et al., 1983)
DS - Distância padrão de Nei (NEI, 1978),
Dsw - Stepwise weighted genetic distance (SHRIVER et al., 1995)
dTTP - 5’- Desoxitimidina Trifosfato
EA - Eficácia de atribuição
EDTA - Ácido etilenodiamino-tetracético (Ethylenediamine-tetraacetic acid)
EMBL - Laboratório Europeu de Biologia Molecular (European Molecular Biology
Laboratory)
EtBr - Brometo de etídio
EP - Erro padrão
ƒ - Coeficiente de coancestralidade
F - Método frequentista
FAO - Organização para a Agricultura e Alimentação (Food and Agriculture
Organization)
fcs - Média da estimativa do coeficiente de coancestralidade em cada core set
FIS - Correlação entre alelos dentro dos indivíduos relativamente aos da subpopulação
FIT - Correlação entre alelos dentro dos indivíduos relativamente aos alelos da
metapopulação
fRH - Estimador de FIS segundo ROBERTSON e HILL (1984)
FST - Correlação entre alelos dentro das subpopulações relativamente aos alelos da
metapopulação
fWC - Estimador de FIS segundo WEIR e COCKERHAM (1984)
G - Guanina
G - Grama
GST - estimador FST segundo NEI, 1977 (1977)
GST' - GST não enviesado segundo NEI e CHESSER (1983)
He - Heterozigotia esperada ou diversidade génica
HNB - Estimativa não enviesada da heterozigotia esperada
HO - Heterozigotia observada
xxvi
HWE - Equilíbrio de HARDY-WEINBERG
IAM - Modelo de Alelos Infinitos –(Infinite Allele Model)
INETI - Instituto Nacional de Engenharia, Tecnologia e Inovação
kb - Quilobase
LE - Equilíbrio de Ligação (Linkage equilibrium)
M - Molar
MB - Merina Branca
MBB - Merina da Beira Baixa
mg - Miligrama
min - Minuto
ml - Mililitro
mm - Milímetro
mM - Milimolar
MP - Merina Preta
mtDNA - DNA mitocondrial
NCBI - Centro Nacional de Informação Biotecnológica (National Centre for
Biotechnology Information)
ng - Nanograma
Nge - Número de equivalentes de genoma
NJ - Neighbor Joining
nm - Nanómetro
ºC - Graus Celsius
OTU - Operational Taxonomic Unit
P - Fósforo
pb - Par(es) de bases (base pair(s))
PCR - Reacção em Cadeia pela Polimerase (Polymerase Chain Reaction )
pH - Simétrico do logaritmo decimal da concentração hidrogeniónica.
PIC - Conteúdo de informação polimórfico (Polimorphic Information Content),
QTL - Loci associados a características quantitativas (Quantitative trait loci)
RA - Riqueza Alélica
RAA - Riqueza alélica ajustada
RAO - Riqueza alélica observada
RAPDs - Amplificação aleatória de polimorfismos de DNA (Random Amplified
Polymorphic DNA)
xxvii
RFLPs - Polimorfismos de comprimento dos fragmentos de restrição (Restriction
Fragment Lenght Polymorphis)
RNA - Ácido ribonucleico (Ribonucleic acid)
rpm - Rotações por minuto
s - Segundo
SDS - Sódio dodecil sulfato (Sodium dodecyl sulfate)
SE - Serra da Estrela
SL - Saloia
SMM - Stepwise Mutation Model
SNPs - Polimorfismos de Nucleótido Único (Single Nucleotide Polymorphisms)
T - Timina
TBE - Tampão Tris-Borato-EDTA
TE - Tampão Tris-EDTA
UPGMA - Unweighted Pair-Group Method With Arithmetic Mean
UTAD - Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
UV - Ultra-Violeta
V - Volts
VNTRs - Repetições em série (tandem) de número variável (Variable Number of
Tandem Repeat)
vs - versus
WLM - Weigthed Log Linear Model
WLMM - Weigthed Log Linear Mixed Model
ƒ - Coeficiente de coancestralidade médio
ƒ̂ - Estimativa do coeficiente de coancestralidade
% - Percentagem
μg - Micrograma
μl - Microlitro
μM - Micromolar
(δµ)2 - Distância de Goldstein (GOLDSTEIN et al., 1995a, b)
θ = θWC - Estimador de FST segundo WEIR e COCKERHAM (1984)
θRH - Estimador de FST segundo ROBERTSON e HILL (1984)
α - Nível de significância
xxviii
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
CAPÍTULO 1 – RAÇAS PORTUGUESAS DE OVINOS E
MARCADORES DE DNA
1.1. INTRODUÇÃO
Basta um simples olhar em volta para constatar a presença de numerosas formas
de vida que povoam o nosso planeta. O desaparecimento de algumas destas e o
surgimento de outras, são um fenómeno natural na história evolutiva da Terra. No
entanto, nos últimos dois séculos, tem-se assistido não só a uma redução acelerada da
população e do território de várias espécies selvagens, como ao desaparecimento de
algumas delas, fruto da acção directa ou indirecta do Homem.
No que concerne aos animais domésticos, assunto de interesse particular neste
estudo, o cenário é idêntico. Como é óbvio, neste caso trata-se essencialmente do
desaparecimento acelerado de raças das várias espécies de animais domésticos cujas
causas são de ordem diversa (ANDERSON, 2003; MENDELSOHN, 2003; REGE e GIBSON,
2003; ROOSEN et al., 2003; TISDELL, 2003). No entanto, o aumento da população
humana e consequente incremento das necessidades alimentares, foi sem dúvida, um
factor determinante. Em resposta a esta demanda intensificou-se, entre outras, a
produção animal, em resultado dos avanços conseguidos em vários domínios da ciência
e da tecnologia, de entre os quais interessa aqui destacar os do melhoramento genético.
Mas, se por um lado aumentou de forma espantosa o potencial produtivo de algumas
raças de animais domésticos e, por conseguinte, a sua dispersão por todo o mundo, por
outro lado, provocou-se, ainda que indirectamente, uma progressiva e acentuada erosão
da variabilidade genética das raças regionais, causada pela diminuição drástica do
número de raças utilizadas devido ao efeito de substituição por raças mais produtivas. O
exemplo mais conhecido é o da raça bovina Holstein-Frisia, actualmente a raça
produtora de leite por excelência em quase todo o mundo, e responsável por cerca de
80% da produção de leite nos países desenvolvidos (BARKER, 1994a). Por outro lado,
assistimos também a uma redução da variabilidade em termos globais devido à
implementação de critérios de selecção mais ou menos uniformes, cuja intensidade foi
favorecida pela diminuição do intervalo entre gerações, resultante da aplicação de
tecnologias reprodutivas, como a inseminação artificial, a ovulação múltipla, a
transferência de embriões, a fertilização in vitro, e outras. Quando a utilização de raças
1
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
selectas enfrentou dificuldades por razões de adaptabilidade, procedeu-se ao cruzamento
destas com as raças locais, com consequente descaracterização racial das segundas.
A tomada de consciência desta tendência levou à promoção de um grande número
de iniciativas com vista a sensibilizar o público e os governantes dos vários países para
o problema. O primeiro alerta sobre a importância da conservação da diversidade
genética foi dado num encontro do “Standing Advisory Committee on Agriculture
Organization” em Copenhaga (1946), no qual a FAO (Food and Agriculture
Organization of the United Nations) surgiu como a entidade indicada para desenvolver
esforços no sentido de inverter tal tendência. Desde então, a FAO tem levado a cabo um
conjunto de acções que incluem, entre outras, a realização de trabalhos de
caracterização de raças de animais de várias partes do mundo, a promoção de vários
encontros científicos e a criação de grupos de trabalho para a elaboração de publicações
que motivem e orientem a implementação de medidas com vista à conservação dos
recursos genéticos.
Paralelamente e com intuitos semelhantes, surgiram também várias organizações
não governamentais de que são exemplos a "Rare Breed Survival Trust" e a “American
Livestock Breeds Conservancy” fundadas em 1973 e 1977, respectivamente.
Em 1992, a segunda Conferência das Nações Unidas sobre o ambiente foi um
marco decisivo para a promoção da conservação dos recursos genéticos. Nela, mais
concretamente na Convenção para a Diversidade Biológica (Convention on Biological
Diversity) e na Agenda 21, foi confirmada a importância dos recursos genéticos dos
animais domésticos como uma componente da diversidade biológica global; assim
como, reconhecida a soberania de cada país sobre os seus recursos genéticos e a
obrigação de os conservar.
Tendo a FAO uma longa história de envolvimento na gestão global dos recursos
animais, esta aceitou a responsabilidade de elaborar e coordenar uma "Estratégia Global
para a Gestão dos Recursos Genéticos dos Animais Domésticos", tarefa que
implementou em 1995 (FAO, 1999) e cujo objectivo consistiu em fornecer um
mecanismo de comunicação e cooperação internacional para a gestão dos recursos
genéticos. Para o efeito, em Abril de 1996, foi instalado um sistema de informação
2
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
“Domestic Animals Diversity – Information System" (DAD-IS) acessível pela internet1,
onde vem sendo disponibilizada informação sobre as linhas orientadoras do programa.
A componente técnica desta estratégia global envolveu os seguintes objectivos: a
identificação, a descrição, o desenvolvimento, a utilização e a monitorização dos
recursos genéticos; bem como o treino e o envolvimento de pessoas na sua gestão e a
conservação de raças únicas ou em perigo de extinção. Destes, interessou-nos em
particular a descrição da variação genética nas raças de animais domésticos,
concretizada no projecto MoDAD (FAO Global Project for the Measurement of
Domestic Animal Diversity), no qual se recomenda a utilização de marcadores
moleculares altamente polimórficos, denominados microssatélites, e o cálculo de
distâncias genéticas entre as várias raças (FAO, 1998b). Com a informação assim obtida
pretende-se fornecer uma indicação, tão clara quanto possível, sobre a singularidade
genética (“genetic uniqueness”) de cada raça, como base de apoio a uma gestão racional
dos recursos financeiros a aplicar na conservação da diversidade genética.
O nosso estudo foi enquadrado neste âmbito, tendo tido, por isso, em
consideração os procedimentos recomendados nesse projecto global. Com ele
pretendemos dar um contributo fiável, à luz dos conhecimentos actuais, à caracterização
da diversidade genética, dentro e entre as raças portuguesas de ovinos, à sua
hierarquização segundo a prioridade de conservação; adicionalmente, avaliar e ordenar
os microssatélites utilizados quanto à capacidade de discriminação racial, utilizando
para o efeito, a informação alélica relativa a 20 microssatélites em 717 animais. As
raças envolvidas neste estudo foram a Churra Algarvia (CA), a Churra Badana (CB), a
Churra do Campo (CC), a Churra Galega Bragançana (CGB), a Churra Galega
Mirandesa (CGM), a Bordaleira de Entre Douro e Minho (BEDM), a Churra
Mondegueira (CM), a Campaniça (CMP), a Churra da Terra Quente (CTQ), a Merina
Branca (MB), a Merina da Beira Baixa (MBB), a Merina Preta (MP), a Serra da Estrela
(SE) e a Saloia (SL).
1.2. ORIGEM DOS OVINOS DOMÉSTICOS
A domesticação de animais teve um papel preponderante no desenvolvimento e
expansão da civilização humana. A adaptação aos mais diversos meios (desertos,
1
http://www.fao.org/dad-is
3
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
montanha, pântanos, etc.) permitiu ao homem a sua exploração para fins muito diversos
como a obtenção de alimentos (carne leite, ovos, etc.), a força de tracção, o vestuário
(peles e fibras), a fertilização dos solos (estrume), a indústria farmacêutica, as
actividades recreativas e religiosas, entre outras.
Os ovinos foram dos primeiros animais a serem domesticados, acto que terá
ocorrido há cerca de 11000 anos, a avaliar pela informação arqueológica proveniente de
ossadas encontradas no Sudoeste Asiático, nas áreas dos actuais países Iraque e Irão
(RYDER, 1984). O ovino doméstico (Ovis aries) terá, assim, tido origem nos ovinos
selvagens que habitavam aquela região, onde ainda estão presentes os três principais
grupos de ovinos selvagens Euroasiáticos: o muflão asiático (O. orientalis ), o "urial"
(O. vignei ) e o "argali" (O. ammon ), cuja semelhança morfológica fez com que fossem
apontados como eventuais ancestrais do ovino doméstico, ou que de alguma forma para
ele teriam contribuído (MAIJALA, 1997). O muflão asiático terá também sido o ancestral
do muflão europeu (O. musimon) (CLUTTON-BROCK, 1987). Com base na informação
sobre o número de cromossomas, alguns autores consideraram que o muflão asiático foi
o único ancestral do ovino doméstico, pois detém igual número de cromossomas
(2n=54). No entanto, o facto de as fêmeas híbridas, resultantes do cruzamento de
muflão e "argali", apresentarem um número intermédio de cromossomas (2n=55), mas
produzirem óvulos com 27 cromossomas, deixou em aberto a hipótese de os ovinos
domésticos também terem surgido, ou tido influência, de outros ovinos selvagens,
nomeadamente do "argali" (MAIJALA, 1997). Com efeito, SCHWAIGER et al. (1994),
utilizando informação de sequências de locus MHC-DRB haviam sugerido uma maior
proximidade entre o ovino doméstico e o "argali" do que com o muflão. Pelo contrário,
JUGO e VICARIO (2000), ao estudarem a variabilidade do mesmo locus em duas raças
espanholas de ovinos (Latxa e Karrantzar) observaram uma maior semelhança com o
muflão europeu, tendo aventado a hipótese de a maior ou menor semelhança com o
muflão europeu, ou com o "argali", parecer depender das raças de ovinos domésticos
em estudo.
A análise filogenética da informação proveniente de RFLP’s (Polimorfismos de
comprimento dos fragmentos de restrição) de DNA mitocondrial (mtDNA) de raças
Euroasiáticas (HIENDLEDER et al., 1998) e da sequência da região controlo de mtDNA
de ovinos da Nova Zelândia (WOOD e PHUA, 1996; HIENDLEDER et al., 1999)
demonstrou a existência de duas linhagens maternas na origem do ovino doméstico. Os
4
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
resultados obtidos nestes estudos, além de apontarem para uma maior relação de
proximidade entre alguns ovinos domésticos e o muflão europeu (O. musimon),
sugeriram também uma exclusão do "urial" (O. vignei) e do "argali" (O. ammon) como
ancestrais do ovino doméstico (HIENDLEDER et al., 1998). Posteriormente, HIENDLEDER
et al. (2002) ao analisarem 63 sequências da região controlo do mtDNA de grupos de
ovinos selvagens, tais como as duas espécies de muflão (O. musimon), o “urial” (O.
vignei), o “argali” (O. ammon), o “bighorn” (O. canadensis), e de ovinos domésticos
oriundos da Ásia, Europa e Nova Zelândia, confirmaram a existência de duas linhagens
maternas (A e B), deduzidas pela distribuição dos ovinos domésticos em dois dos quatro
principais ramos da árvore filogenética obtida. A relação de proximidade entre o ovino
doméstico e as duas espécies de muflão num dos ramos, aponta-as como uma das
linhagens, enquanto que a outra linhagem não apresenta relação com nenhum dos
ovinos selvagens em estudo, permanecendo até ao momento o seu ancestral materno
desconhecido (Figura 1).
Grupo A
Grupo B
Grupo A
(ampliado)
Grupo B
(ampliado)
substituições por sítio
substituições por sítio
Figura 1. Relações filogenéticas entre as formas selvagens e domésticas do género Ovis. (adaptado
de HIENDLEDER et al., 2002).
Estudos posteriores vieram mostrar que, a par da grande variabilidade da região
controlo do mtDNA do “argali” (WU et al., 2003), esta espécie encontrava-se dispersa
por áreas não sobreponíveis, facto que poderá, de alguma forma, ter limitado as
conclusões de HIENDLEDER et al. (1998; 2002) sobre a exclusão da contribuição do
argali, uma vez que se pode admitir que a linhagem que eventualmente tenha
5
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
contribuído para o ovino doméstico não tivesse sido amostrada naqueles trabalhos, o
que deixa esta questão ainda em aberto. Recentemente, foi identificado um terceiro
halogrupo (C) em raças ovinas chinesas (GUO et al., 2005; CHEN et al., 2006), turcas
(PEDROSA et al., 2005) e portuguesas (PEREIRA et al., 2006), e um quarto haplotipo (D)
num único ovino de raça Karachai oriundo do Cáucaso (TAPIO et al., 2006). A
distribuição dos haplotipos de mtDNA sugere uma elevada taxa de dispersão
intercontinental e uma fraca estrutura populacional quando se consideram raças de uma
mesma região geográfica (MEADOWS et al., 2005).
Com base na dominância da linhagem B e na evidência arqueológica, tem sido
apontado o muflão europeu como ancestral do ovino doméstico e o Oriente Próximo
como a região mais provável da ocorrência da domesticação; contudo, ainda não foi
possível estabelecer uma relação entre as referidas linhagens A, C e D com os ovinos
selvagens, eventualmente devido a uma insuficiente amostragem em diversas regiões
geográficas. No entanto, tudo indica que, à semelhança do que foi apontado para os
bovinos (LOFTUS et al., 1994; MACHUGH, 1996; TROY et al., 2001), caprinos (LUIKART
et al., 2001) e suínos (GIUFFRA et al., 2000; LARSON et al., 2005), a domesticação de
ovinos terá ocorrido mais do que uma vez. A ser assim, ter-se-á dado em locais
consideravelmente distantes, de forma isolada e independente, fenómeno designado de
“domesticação vicária” (GEPTS e PAPA, 2002). Contudo, como não se pôde excluir a
possibilidade de que a população selvagem fosse ela mesma polimórfica quanto ao
mtDNA, nem eventuais ocorrências de introgressões posteriores de diferentes
populações selvagens na população entretanto já domesticada, o número de linhagens
maternas identificadas ao nível molecular não pôde ser interpretada como actos de
domesticação independentes (ZEDER et al., 2006).
A informação relativa à linhagem paterna é ainda bastante reduzida, devido ao
pequeno número de genes conhecidos no cromossoma Y, e, por consequência, à
ausência da sequência de DNA respectiva nas bases de dados, assim como ao baixo
polimorfismo encontrado naqueles que são conhecidos (MEADOWS et al., 2004;
LENSTRA e ECONOGENE, 2005; TAPIO et al., 2006).
Há, no entanto, ainda muito por esclarecer sobre o processo complexo de
domesticação dos animais domésticos e sua irradiação para os vários continentes,
aspecto para o qual a informação genética e arqueológica continuará a dar o seu
contributo valioso (RYDER, 1959; CLUTTON-BROCK, 1987; BRUFORD et al., 2003).
6
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
Alterações decorrentes da domesticação
A domesticação provocou um conjunto de alterações nos animais sendo as mais
facilmente perceptíveis relacionadas com a retenção de características juvenis, como
sejam a submissão e a tolerância ao cativeiro (GEPTS e PAPA, 2002), a diminuição ou
perda da sazonalidade reprodutiva (o que permitiu um aumento do número de crias); a
selecção para a produção de lã (sem perda de velo), a redução do tamanho e a alteração
da forma dos chifres, o aumento da cauda, etc. A selecção da lã para a cor branca apenas
teve início no príncipio do século XX em resultado da sua maior adequação à indústria
tintureira, sendo até aí a preta ou castanha e a cinzenta as mais comuns.
Verificaram-se também várias oscilações de tamanho, tendo inicialmente sido
seleccionados os animais de menor estatura, mas no período do império Romano
assistiu-se a uma inversão desta preferência com um acréscimo significativo da altura,
tendência que posteriormente se voltou a inverter (LALLEMAND, 2002).
Uma das principais consequências da domesticação, ao contrário do que à
primeira vista seria de esperar, foi o aumento da variabilidade morfológica e da
subjacente diversidade molecular do ovino doméstico, relativamente aos seus
congéneres selvagens (FORBES et al., 1995). Este facto explica-se pela manutenção de
variantes (mutações não deletérias) que na natureza seriam normalmente eliminadas,
mas cuja permanência foi favorecida pela elevada consanguinidade dos rebanhos
iniciais (RYDER, 1984) e pelos efeitos de uma selecção artificial, mais ou menos
inconsciente, associada a condições naturais e sócio-culturais. A posse de animais com
características raras era, frequentemente, motivo de admiração e até de estatuto.
Assim, numa primeira fase, o isolamento geográfico das diferentes tribos terá
produzido uma elevada consanguinidade nos rebanhos, com a consequente fixação de
características desejadas, determinando o surgimento de várias raças dispersas
geograficamente. As migrações de povos e o desenvolvimento dos meios de transporte e
do comércio, de que são exemplo histórico as do povo Fenício (1400-800 a.C.), as
expedições militares de Alexandre o Grande, a expansão do Império Romano, a
incursão dos Hunos na Europa, as Cruzadas, os Descobrimentos, etc., favoreceram o
cruzamento das várias raças, aumentando quer o número destas quer a sua diversidade
(MAIJALA, 1997). Como exemplo mais recente, podemos referir o caso da exportação da
7
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
raça merina espanhola nos últimos séculos, a qual esteve na origem de, pelo menos, 45
linhas de Merino ou raças resultantes do cruzamento com o merino, em pelo menos 27
países de todo o mundo (MAIJALA, 1997). O resultado final desta epopeia da
domesticação foi o aparecimento de mais de 800 a 1000 raças de ovinos domésticos
dispersas por todo mundo (MASON, 1996). No entanto, nas últimas décadas, tem-se
assistido ao fenómeno inverso, com o decréscimo importante deste número em ritmo
acelerado, o que suscitou várias iniciativas no sentido de inverter esta tendência, das
quais se realçam as promovidas pela FAO (FAO, 1995; FAO e UNEP, 2000). Neste
contexto, o conceito de raça aparece com especial relevo uma vez que constitui a
unidade de estudo e conservação. Contudo, tal conceito tem estado envolto em alguma
controvérsia, tendo sido sugeridas várias definições (RODERO e HERRERA, 2000; SIERRA
ALFRANCA, 2001), algumas enfatizando mais os aspectos culturais associados à sua
formação, outras destacando os aspectos biológicos ou científicos inerentes e outras,
ainda, expressando um enorme pragmatismo ao referirem raça como ”tudo aquilo que
um governo diz que é“ (LERNER e DONALD, 1966).
De acordo com a FAO, uma raça consiste num “grupo sub-específico de animais
domésticos com características externas identificadoras e definidoras que permitem
separá-lo, por avaliação visual, de outros grupos semelhantes, definidos dentro da
mesma espécie ou como um grupo, para o qual a separação geográfica e/ou cultural a
partir de grupos fenotipicamente semelhantes, levou à aceitação da sua identidade
separada” (FAO, 1999). No entender de SIERRA ALFRANCA (2001), esta definição
encontra-se incompleta, uma vez que faltaria incluir a transmissão à descendência dos
referidos caracteres, e outras características, não estimáveis por simples observações,
mas muito definidores de uma raça como sejam o crescimento, a produção leiteira, e
outros aspectos produtivos.
1.3. ORIGEM DAS RAÇAS PORTUGUESAS DE OVINOS
As espécies domesticadas foram dispersas um pouco por todo o mundo em
consequência de vagas migratórias de vários povos, da acção mercantil, dos
conquistadores e conquistados, tão frequentes na história da humanidade. A concepção
das raças portuguesas de ovinos não diverge, nos seus aspectos gerais, do percurso que
levou à criação das outras raças no mundo. Considerámos, contudo, que algumas
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Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
particularidades da sua história, descrita e vários textos da época e transcritos, alguns
excertos na integra para não desvirtuarmos o seu sentido, é útil para contextualizarmos e
aferirmos os nossos resultados.
No que concerne à Península Ibérica, a chegada de ovinos terá sido efectuada,
pelo menos, por quatro vias: a Mediterrânica, a Africana, a Pirenaica e a Levantiva
(SIERRA ALFRANCA, 1992). Não considerando o caso particular do muflão, algo
controverso (uma vez que da sua presença referida como muito antiga, não restam
registos fósseis), os primeiros ovinos primitivos já semi-domesticados terão chegado à
Península Ibérica por volta do V milénio a.C., oriundos da Ásia Menor, seguindo a via
mediterrânea, tendo sido designados de "ovinos das turfas" (Ovis aries palustris de
Rutimeyer), e caracterizados por possuirem uma cauda com 20 vértebras, ou seja, de
tamanho intermédio (RYDER, 1983). De facto, e no que diz apenas respeito a Portugal,
nos últimos anos têm vindo a ser encontrados vários vestígios ósseos da presença de
ovinos datados do período neolítico, concretamente entre o VI e o V milénio a.C. Uma
vez que as ovelhas selvagens são desconhecidas no registo fóssil ibérico, o seu
aparecimento em contextos neolíticos sugere a sua introdução como animal já
domesticado (MORENO-GARCÍA et al., 2003). Estes vestígios distribuem-se um pouco
por todo o país, dos quais se pode referir, a título de exemplo, as escavações na
Cabranosa (Sagres) (CARVALHO e CARDOSO, 2003), no Abrigo da Pena d’Água –
Torres Novas (VALENTE, 1998; CARVALHO, 2003), em São Pedro de Canaferrim – Serra
de Sintra (SIMÕES, 2003) e na Fraga d’Aia – S. João da Pesqueira (SANCHES, 2003).
Durante os finais do segundo e todo o primeiro milénio a.C., chegaram à
Península Ibérica, pela via Pirenaica, vários povos Indo-europeus o que, segundo
SIERRA ALFRANCA (1992), terá implicado uma entrada maciça de ovinos na península e
estado na base da génese de algumas das raças de lã média branca como a Aragonesa, a
Manchega e a Segureña em Espanha. Ainda para o mesmo autor, a chegada dos
Fenícios, entre os séculos XI e IX a.C., povo conhecido pela sua vocação comercial,
terá determinado um grande avanço nas técnicas agrárias praticadas na Península bem
como a introdução de vários animais domésticos de entre os quais os ovinos, oriundos
da bacia mediterrânea e de diferentes partes do norte de África, o que representaria uma
hipótese plausível para a origem da raça merina. A Ibéria já era famosa pela sua lã fina
neste período de comércio com os Fenícios (BELDA e TRUJILLANO, 1986).
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Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
Aos Fenícios, seguiram-se os Gregos (século VII a.C.), os Celtas (século V a.C.),
os Cartagineses (século III a.C.), os Romanos (meados de século II a.C. até ano 25 D.C.
conquista), os Bárbaros (Alanos, Visigodos, Vândalos e Suevos) (século V D.C.) e os
Muçulmanos (711 D.C.- 1249, Portugal, 1492, Espanha). Apesar da alternância de
povos e de culturas, parece que os ovinos tiveram sempre um papel importante, como
sugere o estudo de 18 níveis arqueológicos em Alcáçova de Santarém, datados do
período que vai desde a idade do ferro até ao período muçulmano, onde foram
encontrados com elevada frequência ossos de ovino (DAVIS, 2006). É de destacar o
facto de se ter observado um aumento significativo do tamanho dos ovinos no período
muçulmano, facto esse que pôde ser interpretado como resultado da selecção ou da
introdução de novas raças (DAVIS, 2006).
FRAZÃO (1982), citando Políbio, Plínio e Estrabão, escritores romanos dedicados
às “coisas agrícolas”, refere que a Bética (província ao sul da Península Ibérica) era
povoada, e largamente, por ovinos do tipo burdo, de que terá derivado o termo
Bordaleiro, cuja lã e tecidos do seu fabrico eram muito afamados.
Durante o período da reconquista e nos vários reinados que se seguiram, foram
elaboradas várias disposições régias que visaram regulamentar a actividade da
pastorícia, umas concedendo direitos aos pastores, caso dos reinados de D. Dinis e de D.
Afonso IV, outras restringindo essa mesma actividade e favorecendo a agricultura, caso
do reinado de D. Pedro I, o que terá determinado grandes oscilações no efectivo desta
espécie. Contudo, não constam referências às características dos ovinos que povoaram
então o reino de Portugal.
A origem dos ovinos merinos portugueses está intimamente ligada ao merino
espanhol, cuja história foi exaustivamente estudada por KLEIN (1979) no seu trabalho
intitulado “La Mesta”. Este autor sugeriu que foi a tribo Beni Merin Berbers, oriunda do
Norte de África, que introduziu os ovinos merinos em Espanha, durante o período dos
Almohades, em meados do século XII. Em 1273, o rei Afonso X criou o “Honrado
Consejo de la Mesta de Pastores”, que viria a personificar um dos grandes monopólios
de então e seria responsável pela selecção, multiplicação e conservação de carneiros
Merinos, promovendo uma indústria lanar famosa em todo o mundo. Atendendo à
proximidade geográfica, à transumância, iniciada entre 1500 e 1570, na qual os
rebanhos aproveitavam, no Inverno, as pastagens das terras quentes do sul de Espanha,
seguindo no Verão para Norte, em direcção à meseta central (Ávila, Segóvia, Leão),
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Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
passando algumas das rotas por terras de Portugal, assim como o comércio com
Espanha, favorecido no “período dos Filipes” (entre 1580 e 1640), facilmente se explica
que a raça Merina tenha cedo exercido influência nas raças ovinas portuguesas.
Todavia, o primeiro recenseamento pecuário só foi levado a cabo em 1870 e
publicado em 1873, no qual BERNARDO LIMA realizou uma breve descrição dos ovinos
portugueses com base na classificação usada na época para as raças europeias, e que
assentava na qualidade dos seus velos, dividindo-as em três “tipos”: o Merino, o
Estambrino e o Bordaleiro, subdividindo este último, considerado o mais abundante em
Portugal, em três “variedades” o Bordaleiro Churro, o Bordaleiro Feltroso e o
Bordaleiro Comum. Apesar dos limites inerentes a esta classificação, foi possível
destrinçar algumas referências particulares a grupos de animais passíveis de se
relacionarem com as raças actuais. Assim, dentro do “tipo Merino” fez referência ao
“gado lanar alemtejano, dito raça dos barros, que apparece nas terras de Elvas,
Campo Maior, vindo até Mourão” a qual, na opinião do autor “tem bastante similhança
com a do merino estante ou sedentário das terras de barro da Extremadura
hespanhola, da qual por sem duvida ella deriva”; ao “gado lanar branco das cercanias
de Lisboa, dito raça fina saloia, e também bruscos finos, o qual tem por seus caracteres
muita similhança com o gado dos barros do Alemtejo, sendo o de mais similhança o
gado do concelho de Oeiras, onde se deparam rezes que se podem considerar até de
merinos finos”; ao “gado lanar branco da terra quente do distrito de Bragança, dito
gado badano, que estanceia de entre Torre de Dona Chama à Torre de Moncorvo”,
considerando o autor, como provável, tratar-se de “uma raça mestiça do bordaleiro
commum transmontano com o merino hespanhol”, donde se deduz estramos perante os
antecessores das actuais raças Merina Branca, Saloia e Churra Badana, respectivamente.
Não se pode, contudo, deixar de estranhar que os antecessores da Churra Badana
pudessem ter sido classificados como pertencentes ao tipo merino. Mas este assunto
será discutido mais adiante neste capítulo.
Relativamente ao “tipo Bordaleiro”, foi também possível relacionar as raças
actuais Churra Galega Mirandesa e a Serra da Estrela, uma vez que o referido autor as
particulariza ao referir-se aos “carneiros de toda a bréa ou plan’alto de Miranda em
Traz- os- Montes” e os “transhumantes da Serra da Estrella”. Além destas, parece
evidente que se trata dos antecessores das actuais raças Merino da Beira Baixa e Merino
Preto, uma vez que há concordância quanto à descrição dos animais e à sua localização
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Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
geográfica, quando refere “... deve observar-se que há entre os bordaleiros alguns,
tanto pretos como brancos, que se aproximam pela disposição e forma da lã e pela
fórma da cabeça, do typo merino, talvez por effeito da intervenção do sangue d’esta
raça no bordaleiro de que se trata. É o que se nota nos carneiros brancos ditos das
areias do distrito de Portalegre, e nos pretos de Serpa e Moura, do districto de Beja, os
melhores carneiros pretos de todos do paíz pela qualidade da lã.” Ainda dentro do
“tipo Bordaleiro”, concretamente nas variedades “Feltroso” e “Churro”, faz-se menção
a um grupo de ovinos que se particulariza por possuir as pernas e a cara deslanadas,
designado de “caréos, gado da serra, charnequeiro e gallego” conforme a região,
presentes “em todos os distritos do reino, com especial incidência nas serras e
charnecas dos distritos de Viana do Castelo, Braga, Viseu, Coimbra, Leiria, Santarém e
Lisboa” que sugere tratar-se dos antecessores da actual raça Bordaleira de Entre Douro
e Minho.
No que concerne ao “tipo estambrino”, o referido autor considerou não haver
animais que pudessem ser incluídos neste grupo. Contudo, referiu que “há bastantes
carneiros, cujo vello puxa ao estambrino; e uns não são, a nosso juízo, senão a
exageração do bordaleiro feltroso churro no predomínio de pellos cabrios, e churros se
dizem vulgarmente, e apparecem tanto brancos como pretos por vários pontos do reino,
sobretudo nos lugares serranos do districto de Viana. Outros não são senão a
exageração de bordaleiros comuns, de lã altosa, aproximando-se dos lachas
hespanhoes, e aparecem mais pelos districtos de Castelo Branco, Guarda, Vizeu e
Bragança.” A localização geográfica mencionada e a conformidade de descrição
sugerem tratar-se dos antecessores das actuais raças Churra Mondegueira e Churra do
Campo.
Em 1900, COSTA e CASTRO no trabalho intitulado “Le Portugal au point de vue
agricole”, fizeram referência aos mesmos grupos particulares de animais de forma
semelhante à de BERNARDO LIMA, mas usando uma terminologia diferente. Em vez de
“typos” optaram pelo termo “raça” e consideraram a população ovina portuguesa
constituída pelas raças Merina (com as variedades dos barros e saloia), Bordaleira (com
as sub-raças Comum, Feltrosa e Churra) e pelas mestiças destas duas raças, nas quais
incluiram o “gado das areias no norte do Alemtejo, o gado preto de Serpa e Moura e o
gado badano de Trás-os-Montes”. Dessa descrição destaca-se os seguintes extractos,
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Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
por região, dos quais transparecem os primórdios da individualização das raças ovinas
actuais:
- “Na região do Minho, a maior parte dos carneiros pertencem à raça bordaleira
e, nesta raça, são os animais churros e os feltrosos que dominam. Estes animais sãos os
menos valiosos da sua espécie. Dá-se-lhe o nome de galegos para o qual se pretende
significar a sua inferioridade. Também lhes é dado o nome de caréos, para exprimir
que a suas cabeças estão desprovidas de lã. E como estes animais vivem
ordinariamente nas pastagens mais magras das serras e nas charnecas, são também
chamados de serranos e charnequeiros. Os carneiros mais típicos da raça churra
encontram-se na província do Minho, onde se mantêm quase todo o ano nas serras do
Suajo e Geres. Estes animais, muito rústicos, produzem um velo jarroso (− tradução
livre de “jarreuse”), formado de pelos duros e longos, quer brancos, quer pretos. Esta
lã é utilizada na região para o fabrico de tecidos grosseiros destinados aos
camponeses. ... Os carneiros feltrosos são preferidos pelo seu velo mais lanoso; as
fábricas da cidade de Braga utilizam muito esta lã para a confecção de feltros. Estes
animais, menos rústicos, permanecem nas pastagens durante o dia e são recolhidos
para um abrigo durante a noite. A raça merina tem também alguns representantes, mas
não os melhores, no Minho. São chamados meirinhos, e normalmente acompanham os
bovinos na pastagem e no estábulo.” − Esta descrição do gado ovino da região de Entre
Douro e Minho realça a heterogeneidade que ainda hoje persiste e caracteriza a raça
Bordaleira de Entre Douro e Minho, pondo já em evidência aquilo que hoje é designado
de variedades do “campo “ e da “montanha” (PACHECO, 2002).
- “Em Trás-os-Montes o gado ovino é formado pela raça bordaleira, com
predomínio de churros, e pela excelente raça mestiça denominada badana, resultante
do cruzamento dos bordaleiros com a merina. ... O distrito de Bragança é o mais rico
em gado lanar. Na parte montanhosa e fria do Nordeste, denominada Terra Fria, vivem
os carneiros churros, cuja lã, embora jarroso, é apreciada pelos camponeses devido à
sua cor negra. Na região do sul ou Terra Quente, formada pelos vales férteis do Sabor
e do Douro, onde o clima é suave, habita um gado mestiço badano, bastante
corpulento, cujo velo branco, com mechas longas e frisadas, pesando de 4 a 6 kg. As
ovelhas desta raça são excelentes leiteiras, e o seu leite destina-se ao fabrico de queijo
do Freixo, muito apreciado no norte de Portugal.” − Diferencia-se, portanto, a raça
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Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
badana de outra (do tipo churro) localizada a norte, provavelmente a Churra Galega
Bragançana;
- “Os raros criadores que, na região do Douro, se preocupam em melhorar os
seus ovinos, escolhem os carneiros provenientes do gado da Serra da Estrela e
pretencente à sub-raça Bordaleira comum. Nas províncias da Beira os gados ovinos
têm um papel considerável na economia agrícola destas regiões muito acidentadas
onde se situam as duas serras mais altas de Portugal – as serras da Estrela e de
Montemuro. Nestas montanhas encontram-se todos os anos no Verão numerosos
rebanhos transumantes que, tendo hibernado nos vales férteis e quentes das bacias do
Douro, do Vouga, do Mondego, do Zezere e de seus afluentes, assim como sobre os
vastos campos do Alentejo ou nas regiões planas de Idanha-a-Nova no distrito de
Castelo Branco, vão estivar sobre as vertentes e sobre os planaltos de Montemuro e da
Estrela, folheando nestas pastagens, situadas até aos 1900 metros de altitude, a erva
abundante e fina que lhes é recusada então nas planícies inferiores queimadas pelo sol.
... Cada rebanho, quase exclusivamente constituído por ovelhas da raça bordaleira
pertence a vários pequenos produtores...” − A referência à transumância e a
classificação dos animais como pertencentes à raça Bordaleira Comum sugere tratar-se
dos antecessores da actual raça Serra da Estrela;
- “O gado da variedade saloia, de velo branco, dos arredores da capital (Lisboa),
provêm de merinos importados de Espanha, por volta de meados do século passado,
pelo famoso ministro, o marquês de Pombal. Estes merinos permaneceram inicialmente
em Oeiras; donde expandiram, para o Norte e Nordeste, até Torres Vedras e à Póvoa
de Santa Iria” − Constitui uma referência clara à raça Saloia;
- “Passando à vasta província do Alentejo, onde prevalece a cultura extensiva dos
cereais com os pousios, podemos observar os melhores carneiros portugueses da raça
merina pura, e outros da raça mestiça bordaleira-mestiça. Os primeiros habitam a
região fronteiriça de l'este, depois Campo Maior e Elvas no distrito de Portalegre, até
Mourão no de Évora, estendendo-se ainda a Montemór e Arroios, no centro deste
último distrito. São chamados, em Portugal como em Espanha, merinos barros, nome
português e espanhol que designa a qualidade argilosa do solo onde se encontra esta
variedade de gado ovino, remarcável pelo velo amarelado...” − refere-se claramente à
raça Merina Branca. “Os melhores rebanhos de mestiços encontram-se sobretudo no
norte do distrito de Portalegre, a Niza, Gavião e Castelo de Vide, onde eles constituem
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Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
a variedade branca dita das areias, e ao Norte-Este do distrito de Beja, nos concelhos
de Moura e Serpa, onde eles formam a variedade preta, que fornece a melhor e mais
fina lã de Portugal.” − As actuais raças Merina da Beira Baixa e Merino Preto
enquadram-se bem na descrição e localização geográfica apontada.
- “Na região do Algarve, o gado ovino, bastante medíocre, é formado pela raça
bordaleira e por alguns raros rebanhos de merinos habitando os concelhos ribeirinhos
do Guadiana. O regime alimentar de todos estes animais é a pastagem sobre as
montanhas e os pousios. Na primavera eles engordam bem e dão uma carne muito
saborosa. A lã pouco abundante, serve para fabricar os tecidos destinados às
vestimentas da população rural da região. Do leite das ovelhas, uma parte é consumido
em fresco, e a outra é transformada em queijo quase tão bom como o do Alentejo. Os
carneiros são em número bastante restrito no Algarve. Alguns concelhos interditam
mesmo a sua passagem nos seus territórios, por causa dos danos que provocam por
vezes nos campos cultivados.” − Apesar desta descrição não permitir estabelecer
qualquer relação com as raças actuais, eventualmente tratar-se-ia de ovinos antecessores
da raça Campaniça; é de realçar que este autor, à semelhança de BERNARDO LIMA
(1873), não referiu a existência de ovinos com características morfológicas peculiares
como as do Churro Algarvio, o que sugere que a sua eventual presença não era
relevante.
Os trabalhos de MIRANDA DO VALE (1905; 1907) pouco mais vieram acrescentar
ao descrito por BERNARDO LIMA (1873) e por COSTA e CASTRO (1900) do que apontar
uma eventual origem ancestral e destacar a heterogeneidade do gado ovino português.
Assim, segundo MIRANDA DO VALE “a população arietina portugueza fórma-se á custa
de dois troncos, o Ovis aries africana, e o Ovis aries iberica, dos quaes só o primeiro se
encontra no estado de pureza, constituindo os merinos portuguezes, que, na sua quasi
totalidade, descendem de recentes importações de hespanha; o resto da população
arietina, bastante heteroclita, é constituida por produtos mestiços dos dois troncos e em
que predominam ora uns ora outros característicos, é a chamada raça bordaleira.” −
Ainda sobre o ovino Bordaleiro, que à semelhança de BERNARDO
DE
LIMA, dividiu-o
nas variedades Comum, Feltrosa e Churra, refere − “a fraca fixidez de caracteres não
permite a sua classificação como raça”...“é tão dificil determinar a area de dispersão
dos mestiços, quão difícil é destrinçar o habitat de cada uma das variedades. Os
bordaleiros estendem-se por todo o continente, em todos os districtos têm
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Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
representantes e talvez até nenhum concelho esteja deshabitado d’estes animaes. Fixar
limites á irradiação das variedades é tarefa, não só difficil, mas talvez impossível, não
só escasseiam elementos para esta delimitação, mas o mesmo rebanho póde no
decorrer de poucos annos, de commum passar a feltroso e a churro, bastando para isso
a negligência na selecção, porque o pello cabrio irá, como diz Cornevin, invadindo o
vello como a ruim erva inça o campo cultivado”.
Na mesma linha de ideias, MANUEL
DE
BRAGANÇA (1913) realçou também a
dificuldade em diferenciar racialmente os ovinos portugueses ao referir “A maior parte
dos nossos rebanhos, senão a quasi totalidade, ainda não possue, ao que nos parece,
individuos d’um typo definido, embora variavel com as regiões. Encontram-se no
mesmo rebanho individuos de todo o tamanho, variáveis na côr, de diferentes typos e
raças, fornecendo carne e lã variavel de individuo para individuo, faltando uma certa
uniformidade, tão necessaria n’um bom rebanho. Impõe-se, portanto, o melhoramento
da nossa população ovina, e é pela fórma como teem procedido esses notaveis
criadores que apontámos, que nós temos de proceder, se quizermos vêr desapparecer
«o astroso, gafento e maltrapilho caréo»”
Curiosamente, este autor, ao contrário dos anteriormente citados, não considerou a
raça fina saloia e os bruscos como designações sinónimas mas antes variedades distintas
de ovinos uma vez que referiu: “A variedade denominada raça fina saloia, dos
arredores de Lisboa, cujos melhores exemplares povoam o concelho de Oeiras, parece
ser descendente d’um rebanho que o Marquez de Pombal importou de Hespanha pelos
annos de 1756 ou 1757. Este rebanho tem-se conservado bastante puro, de modo que,
ainda hoje, se encontram n’aquelle concelho e nos limitrophes, carneiros corpulentos,
de hastes retrocidas em coluta, cabeça arqueada e abundante gravata, cujos vellos, de
finissima lã branca, dão em churdo 3 a 4 kilogrammas, quebrando na lavagem 60 a 70
por cento”. ...“Tambem nos arredores de Lisboa, para o lado de Olivais, Sacavem,
existe um typo característico de carneiros denominados bruscos, porque apezar de
brancos, têem a superfície de vello escura, o que é devido ao muito sugo da lã, a que se
prende facilmente a poeira e outros corpos extranhos, que a sujam.”
Ainda sobre o gado ovino da região de Lisboa, SILVESTRE
DA
SILVA (1935)
escreveu “No distrito de Lisboa são exploradas as seguintes variedades de gado ovino:
o caréu, o merino, o brusco fino (também denominado gado fino) e o saragoçano (gado
ovino preto procedente do Alentejo). O brusco fino, nome clássico do gado ovelhum
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Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
saloio especializado na função leiteira, é também um grupo de gado lanar inicialmente
oriundo do cruzamento do ovino africano com o dos Pirineus, mas cujas características
se acham mais ou menos fixadas. ... Há ainda agricultores da região saloia que
adquirem rebanhos de ovelhas desta variedade (saragoçano), lançando-os a
reprodutores bruscos finos para, por meio do cruzamento contínuo, obterem ovelhas
desta última variedade. Êste modo de proceder é de uso corrente porque os donos dos
rebanhos bruscos finos só criam os indivíduos indispensáveis ao renovamento do
rebanho; o grosso das crias vai para o talho ao atingir um mês de idade para se
aproveitar a maior quantidade possível de leite, que obtém preço avultado no fabrico
de queijo.” No entanto, MIRANDA DO VALE (1949) mostrou-se crítico quanto à eventual
diferenciação, atrás apresentada, do gado ovino das proximidades de Lisboa, escrevendo
sobre o assunto “dentro do grupo bordaleiro das proximidades de Lisboa, isolou-se um
grupo, no qual por selecção, ginástica funcional da mama, melhores condições de
alimentação e residência num clima favorável à produção de leite, se conseguiu uma
exaltação das suas qualidades leiteiras. Este armentio tomou o nome de raça saloia. ...”
− de que fez referência à sua distribuição geográfica e sistema de produção, para de
seguida concluir − “há denominações aplicadas ao gado arietino, como sejam: careu, o
brusco fino e o saragoçano, que se citam apenas para afirmar que pouco ou nada
representam, e muito aflito se veria quem se metesse a estabelecer o mais pequeno
caracter diferencial entre estes arietinos assim apelidados e os outros bordaleiros”.
Este autor, citando um trabalho do Dr. BARREIROS NUNES, referiu que os merinos da
Fonte Boa resultaram do cruzamento entre o merino espanhol importado de Sevilha com
o merino Rambouillet e merino precoce. Alguns destes animais terão sido
posteriormente disponibilizados para a reprodução aos criadores locais.
O arrolamento de 1940, apesar de algumas deficiências que se prenderam com a
distribuição e preenchimento das declarações, foi mais pormenorizado do que os
anteriores, classificando os ovinos em churros e não churros. Nos respectivos relatórios
elaborados pelos intendentes de cada distrito, publicados em 1945, foi feita uma breve
caracterização dos ovinos de cada região, da qual foi extraída aquela informação que de
alguma forma permitiu inferir uma trajectória histórica das raças ovinas. No que
concerne à região do Minho, FERRAZ (1945), intendente de Braga, referiu que os
arietinos “pertencem à sub-raça bordaleira e estão presentes nas três variedades comum, feltrosa e churra. Impossível fixar, mesmo aproximadamente, o número de
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Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
cabeças que cabem a cada variedade, por se encontrarem por vezes no mesmo rebanho
animais pertencentes a mais de uma. A exploração arietina tem dois aspectos; a
creatopoese toma lugar de função predominante nas zonas serranas, enquanto a
eriopoese é o fim principal da ovinicultura na região mais baixa do distrito. ... Segundo
a sua conformação e aspecto da lã, o vulgo designa os arietinos da região por
meirinhos, campinos e galegos ou bravos. Os primeiros são os mais apreciados
bordaleiros comuns, amerinados; nos restantes, feltrosos e churros, distinguem-se entre
êles os campinos por maior desenvolvimento e melhor velo em virtude de pastarem nos
campos, daí a sua designação, onde geralmente acompanham os bovinos”.
Relativamente ao termo meirinhos, CORREIA
DA
COSTA (1945) é de opinião que o
mesmo resultou da “deturpação bastante antiga do vocábulo merino”. Mais a Norte,
para a intendência de Viana do Castelo, MACHADO
DA
SILVA DIAS (1945) referiu: “A
espécie ovina é representada pelo bordaleiro churro nas zonas de altitude criado num
regime pastoril e pelo bordaleiro amerinado nas baixas úberes do Minho e Lima
cohabitando com o gado bovino, submetido como êste ao regime misto”. Tendo em
conta a semelhança com a descrição realizada por COSTA e CASTRO (1900), podemos
concluir que pouco ou nada mudou na realidade da produção ovina desta região desde
1900.
Para a região de Trás-os-Montes, FELGUEIRAS JÚNIOR (1945), intendente de
Bragança, referiu "... Os animais desta espécie pertencem à raça bordaleira, variedade
churra, mas dentro da variedade encontram-se dois tipos bem diferenciados. O
primeiro, galego ou bragancês, é constituido por indivíduos de maior estatura e o velo
não excede dois quilogramas, em média. O segundo, o badano, é formado por animais
mais ananicados, mas de melhor lã”. Ainda para a região de Trás-os-Montes, foi feita a
seguinte referência peculiar ao gado ovino de Miranda: “de entre a grei ovina da
região, a que produz melhor lã, é a de Miranda do Douro. O velo, mais tochado e com
fêveras mais finas, é por vezes frisado, o que o faz assemelhar ao bordaleiro comum”.
Este trabalho, foi o primeiro, por um lado, a utilizar a designação “bragancês” para os
ovinos da Terra Fria e, por outro, a classificar, com base na lã, o ovino badano como
pertencente ao tipo bordaleiro churro, bem diferente do que previamente acontecera,
quer por BERNARDO LIMA (1873), que o classificara como pertencente ao tipo merino,
quer por COSTA e CASTRO (1900) que referiram “As lãs dos carneiros do Alentejo não
encontram rival senão no gado badano de Trás-os-Montes. A feira de São João,
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Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
realizada em Évora no 24 de Junho, é célebre pela transação que aí se realizam sobre
este produto muito procurado pelas fábricas de lanifícios de Portugal e estrangeiro”.
XAVIER e RODRIGUES (1955) no trabalho intitulado “O gado ovino badano do distrito
de Bragança”, interrogaram-se sobre as razões que estiveram na base desta alteração da
qualidade da lã na referida raça, tendo apontado as seguintes hipóteses explicativas:
- A própria natureza do “substrato étnico do badano”, considerado como
resultante do cruzamento do bordaleiro com o merino de que terá resultado uma
inevitável “dissociação de caracteres” segundo as leis de Mendel favorecida pela
limitação do comércio com Espanha em 1913 e portanto da importação do merino;
- Alteração do critério de selecção para o peso do velo, em vez da qualidade, com
consequente escolha de reprodutores que apresentavam lã sugosa à qual aderiam mais
facilmente poeiras “responsáveis pela cor castanha” típica desta raça;
- Abandono da raça por parte das entidades pecuárias e em matéria de alimentação
e alojamento por parte dos criadores, em contraste com o que acontecera no mesmo
período com a raça merina no sul do País.
Relativamente à intendência de Castelo Branco, MAGRO (1945) fez referência a
uma população arietina constituída por churros e bordaleiros, situando-se a área dos
primeiros desde o limite das freguesias do concelho de Idanha-a-Nova a todo o de
Penamacor, Belmonte, Fundão e Covilhã; enquanto a dos segundos estendendo-se “por
tôda a área dos concelhos de Castelo Branco, Vila Velha de Ródão, Vila de Rei,
Proença-a-Nova, sertã e Oleiros e metade do de Idanha-a-Nova; há ainda no da
Covilhã uma pequena mancha entre Tortozendo, Unhais da Serrea, Cebola e Barco,
onde êstes animais prevalecem sôbre os churros." Este autor apontou por um lado, uma
tendência para a expansão dos bordaleiros e, por outro, uma influência crescente dos
merinos, no bordaleiro. “Tendem os bordaleiros a expandir-se pouco a pouco,
ocupando já no concelho de Idanha-a-Nova, área do ovino por excelência, as
freguesias do Rosmaninhal, Zebreira, Ladoeiro, Idanha-a-Nova, Oledo e S. Miguel de
Acha, e não tardará muito tempo a embrenharem-se pelos do Fundão e Penamacor. No
limite norte da freguesia de Penha-Garcia, que confina com o segundo dos dois citados
concelhos, uma sociedade agrícola ali existente tem já os seus rebanhos compostos
exclusivamente de merinos e bordaleiros. Grande número de rebanhos bordaleiros dos
concelhos de Idanha-a-Nova e Castelo Branco sofreram a infiltração do merino,
sobretudo os da freguesia do Rosmaninhal, para onde foram levados alguns carneiros
19
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
espanhóis. Este gado não é corpulento e os terrenos são pouco calcários, mas
produzem boa lã, da melhor do País, que tem franco consumo nas inúmeras fábricas da
Covilhã, Tortozendo e Cebolais. A sua aptidão galactófora é de certo modo importante
e uma das mais apreciadas na exploração da ovelha nas regiões de sudeste e noroeste.
Com o leite desta fêmea, estreme ou misturado com o de cabra, se fabricam os
afamados queijo da Serra e queijo de Castelo Branco”. Esta descrição constituiu um
forte contributo sobre a origem da raça Merina da Beira Baixa. MAGRO descreveu ainda
um grupo de ovinos churros das margens do Zêzere como “… muito semelhante ao
mondegueiro, mais corpulento e melhor produtor de leite que o da restante área, mas
sem dúvida bem mais inferior de lã”, que não fomos capazes de identficar, mas que ao
compará-lo com o “mondegueiro” poderá constituir a primeira referência explicita a
esta raça.
Para o Alentejo, os intendentes de Beja e de Serpa, BETTENCOURT e PEREIRA,
respectivamente, descreveram transformações importantes nas raças ovinas desta região.
Concretamente referiram que “este gado, há cerca de 20 anos composto na sua maioria
por bordaleiros, pretos na região dos barros e brancos na do campo, tem na última
década sofrido completa transformação. (…) todos os rebanhos brancos da região dos
barros são próximos descendentes do prêto cruzado com merinos de Andaluzia, com
merinos da Fonte Boa (Estação Zootécnica Nacional) ou vindos do Ribatejo e ainda
dêstes com o precoce francês (de Soissons e do Chatillon) (…) Nesta espécie (ovina)
vem-se a notar nos últimos anos acentuada melhoria na corpulência dos indivíduos e
na qualidade da lã. Muitos lavradores tẽem adquirido reprodutores merinos nos
rebanhos mais conceituados dos criadores desta região, alguns tẽem-nos obtido nas
mais acreditadas criações do Ribatejo, outros mandaram-nos vir de Espanha e dois
proprietários do concelho de Serpa importaram merinos precoces franceses. (…) De
1937 para cá têem entrado no concelho de Serpa cêrca de 250 reprodutores
procedentes do Ribatejo, entre machos e fêmeas, todos descendentes de merinos
precoces franceses... em 1936 vieram 100 ovelhas merinas dos arredores de
Sevilha...”(BETTENCOURT, 1945). Relativamente ao concelho de Odemira este mesmo
autor refere “os arietinos são os de menos categoria do distrito de Beja, com
predomínio do campaniço, muito inselecto e de fraco rendimento”. A designação dos
ovinos desta região, como “campaniços”, foi avançada pela primeira vez neste
arrolamento. Sobre estes ovinos, acrescenta ainda “Os ovinos brancos campaniços, até
20
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
há poucos anos do tipo bordaleiro fino, têem sido também ultimamente muito
influenciados pelo merino da região dos barros e pelo da Andaluzia. Quanto a nós, esta
orientação parece errada porque o merino é sem dúvida mais exigente e a diferença
que porventura se venha a obter no preço da lã não compensa, de forma alguma as
maiores despesas para o manter, isto sem considerar ainda a menor quantidade de leite
que a ovelha produz …” (BETTENCOURT, 1945). Por sua vez, quanto à intendência de
Elvas PEREIRA referiu “o gado lanígero da área desta Intendência de Pecuária pertence
á raça chamada merina dos barros, (…) cuja melhor representação nestas paragens se
encontra nos concelhos de Elvas e Campo Maior, são uns brancos e outros pretos (…)
Pelo geral, os ovinos prêtos são mais corpulentos que os brancos e o melhoramento de
uns e outros tem-se feito pelo emprêgo de sementais merinos transumantes espanhóis e
com merinos da região de Santarém.”
Também para a intendência de Setúbal, BARROS (1945) relatou a ocorrência de
cruzamentos, neste caso, entre ovino saloio e alentejano na zona de Azeitão.
Na região do Algarve, os ovinos pertenciam, na sua maioria, ao tipo bordaleiro
nas suas três variedades e alguns do tipo merino (GOMES CALADO, 1945). Segundo este
autor, “enquanto no Barlavento e na zona central até Tavira os ovinos são do tronco
ibérico, variedade churra, no Sotavento há já infiltração do tronco africano”,
acrescentando mais adiante “Dentre todos os ovinos algarvios, os de maior corpo e
mais acentuada aptidão creatopoética são os dos concelhos de Silves, Loulé, Faro e
parte de Tavira onde as fêmeas atingem 45 a 50 quilogramas de pêso vivo e os machos
80 a 90...”. O facto de se referir a animais churros com tão elevado peso vivo, deduz-se
que se tratava dos antecessores da actual raça Churra Algarvia.
Foi apenas nas decadas 50 e 60 que se realizaram, pela então Direcção dos
Serviços Veterinários, vários trabalhos com o intuito de proceder à caracterização de
algumas raças ovinas, quanto ao sistema de produção, ao efectivo e às variáveis
morfométricas: produções de leite, carne e lã e sua qualidade. Estes trabalhos, viriam a
constituir o alicerce para as designações raciais dos ovinos Portugueses.
Em 1952, com base num trabalho de caracterização, em que foram utilizados 549
animais, recrutados de rebanhos dos concelhos de Mogadouro, Miranda do Douro,
Vimioso e Bragança depois de medidos o peso vivo, o peso do velo e o diâmetro dos
fios lanosos da espádua, PEREIRA e RODRIGUES chegaram à conclusão da existência de
duas raças ovinas distintas na Terra Fria do distrito de Bragança, designadamente o
21
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
“ovino Galego Mirandês” e o “ovino Galego Bragançano”.
Em 1954, PAIVA e GLÓRIA fizeram a caracterização de três variedades de ovinos
no distrito da Guarda: o ovino Churro Mondegueiro, localizado nos concelhos de
Celorico da Beira, Fornos de Algodres, Guarda e Trancoso; o Churro Marialveiro no da
Meda, onde se situa a povoação de Marialva que lhe deu o nome e nos de Vila Nova de
Foz Côa, Figueira de Castelo Rodrigo, Almeida e Sabugal e o Bordaleiro Comum nos
de Seia, Gouveia e Manteigas de onde é a variedade dominante e em parte dos de
Celorico da Beira, Fornos de Algodres, Aguiar da Beira, Almeida, Pinhel, Guarda e
Sabugal. A variedade de Bordaleiro Comum descrita corresponde à actual raça Serra da
Estrela. Relativamente ao Churro Marialveiro, aqueles autores referiram “que em nada
se distingue da ovelha Badana da Terra Quente do distrito de Bragança”, bem como a
eventual existência de cruzamentos entre o Marialveiro e o Churro dito “do Campo”, no
concelho de Sabugal. Esta constituiu a primeira referência explícita à designação
“Churro do Campo”. Já quanto ao Mondegueiro, apontaram que “A sua expansão é
devida à fama de excelente produtor de leite, razão porque tem sido cruzado com as
outras variedades, principalmente com o Marialveiro. (...) A fama da acentuada
vocação galactófora do Mondegueiro ultrapassou mesmo os limites do distrito, pelo
que se exportaram para a Terra Quente do distrito de Bragança em tempos animais
deste tipo.” Este aspecto tem especial relevância para o estudo da origem da raça
Churra da Terra Quente, mencionada adiante.
Em 1959, TEÓFILO FRAZÃO procedeu à caracterização dos ovinos de raça
Campaniça do Campo Branco Alentejano, tendo o seu trabalho sido publicado apenas
em 1982 (FRAZÃO, 1982). Este autor contestou a ideia, prevalecente até à época, de que
a raça Campaniça teria resultado do cruzamento entre o tronco Africano e o Ibérico e
defendeu tratar-se de um terceiro tronco distinto, que designou de “bordaleiro fino”,
argumentando que “se se trata-se dum produto heterozigoto, como se tem suposto, não
deixaria o atavismo de se manifestar, e haviam de aparecer semelhanças com os
progenitores, que nunca vimos”. Acrescenta ainda “Também não se compreende que
dum perfil recto e outro côncavo tivesse saído uma convexidade tão acentuada como é
esta do «Bordaleiro comum», no qual está incluído o «Campaniço»”. Assim, o ovino
campaniço seria na opinião deste autor “um dos abencerragens do ovino burdo mais
fino que povoava intensamente a nossa península” que estaria na base da afamada lã da
Bética e da Turdetânia referida por autores romanos.
22
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
Em 1963, foi publicado o trabalho de PEREIRA intitulado “O Churro Algarvio”
que realizara em 1959. Este trabalho compreendeu, além da caracterização morfológica
e produtiva, a origem e a evolução histórica da referida raça. Segundo este autor, a
primeira referência conhecida sobre uma raça ovina com as características do Churro
Algarvio datava de 1934 e nela FRANÇA
E
SILVA relativamente à região algarvia,
referiram que “a raça predominante é o carneiro churro de lã longal, que fornece
excelente matéria prima para a indústria local de mantas e colchões. As suas peles são
muito apreciadas para tapetes. O churro algarvio é notável pela sua corpulência e
decidida aptidão cevatriz, atingindo pesos excepcionais em carne”. As características
morfológicas peculiares do Churro Algarvio foram corroboradas, posteriormente, por
LUCAS (1941), no seu relatório “Acerca do Arrolamento Geral de Gados” de 1940, ao
descrever que “devemos aqui destacar o Algarve como única região onde mercê de
condições particulares, e de ausência de cruzamentos com outros tipos, o arietino
churro reproduz, com vincada fidelidade, as características do Tronco Ibérico, de que
deriva”. Esta singularidade ter-se-á mantido, uma vez que PEREIRA (1963) refere que
“nada consta dos princípios, fundamentos e esquemas sobre o seu melhoramento, o que
nos leva a concluir que praticamente, nunca foi feita qualquer tentativa atinente a
valorizar este efectivo...”. Por outro lado, o mesmo autor menciona que “de entre as
características morfológicas a que mais interessa aos pastores, embora pareça incrível,
é a forma e disposição dos chifres que regionalmente se designa chapéu, a qual exigem
bem aberta de espiral larga e horizontal (...) e relegam para plano absolutamente
secundário, a extensão do velo, a corpulência, a conformação, etc.” Quanto à origem
desta raça, o referido autor escreveu “Demais, sendo o churro Algarvio étnica e
morfologicamente semelhante ao da Andaluzia, acantonado em Lebrija, Los Palacios
Villafranca, Cadiz, Huelva, etc, tudo leva a crer que desde há muito habitasse também
o Algarve, e que dadas as relações comerciais e de trocas de gado com o País vizinho,
se tivessem importado em larga escala de Huelva, com vista a um melhor
aproveitamento dos recursos pascigosos que ao tempo, eram dominantemente
constituídos por matos, que os bordaleiros comuns e os merinos não seriam capazes de
convenientemente aproveitar”.
Num trabalho de colaboração, com o objectivo de caracterizar as raças ovinas
mediterrânicas, RAMOS
DA
COSTA (1964) reuniu informação acerca de 13 raças
portuguesas que classificou, de acordo com a lã, em três grupos:
23
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
- O Merino, de lã fina, de que faziam parte as raças Merina Branca, Merina Preta e
Merina da Beira Baixa;
- O Churro, de lã grosseira, que incluía as raças Galega Bragançana, Galega
Mirandesa, Badana (ou Marialveira), Mondegueira, Churro do Campo e Churra
Algarvia
- O Bordaleiro, de lã intermédia, constituído pelas raças Entre Minho e Douro,
Serra da Estrela, Saloia e Campaniça.
Deste estudo, destaca-se o estabelecimento das designações raciais das populações
ovinas portuguesas, que ainda hoje permanecem, a elaboração de um mapa da sua
distribuição e a reclassificação de algumas delas quanto ao tipo de lã, caso da Saloia e
da Badana, consideradas previamente como tipo merino. Na opinião de RAMOS
DA
COSTA, a raça Churra Algarvia terá derivado da importação do Churro Lebrijano ou
Merismeño, por volta de 1870-90.
A classificação proposta por RAMOS
DA
COSTA foi posteriormente usada por
diversos autores em trabalhos de caracterização da ovinicultura portuguesa,
designadamente por SOBRAL (1978) e por BORREGO (1985a; 1985b).
A influência de raças estrangeiras, nomeadamente do Merino Precoce e do Merino
Espanhol no Merino da Beira Baixa, foi apontado por TROPA et al. (1967) que
mencionaram ”há que considerar que a população Merina das Areias está hoje
fortemente influenciada por Merino Precoce e também por Merino Espanhol, tendo
sido desviada em grande parte do tipo leiteiro que em tempos a caracterizava. A
valorização das lãs que teve lugar na década 1940-1950 – enquanto se manteve
estacionário o preço do leite – levou à introdução daquelas raças em extensão
apreciável”.
Em 1987, a Direcção Geral de Pecuária publicou um trabalho intitulado "Recursos
Genéticos" onde reuniu informação relativa à caracterização morfológica, produtiva e
reprodutiva de catorze raças ovinas e cinco raças caprinas portuguesas (SOBRAL et al.,
1987). Neste trabalho foi individualizada uma nova raça ovina, a Churra da Terra
Quente que, segundo os autores, derivou “do encontro da Mondegueira com a Badana e
que ocupa toda a área da terra quente e alguns concelhos do distritos de Vila Real e
Guarda”.
24
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
Todavia, formalmente, uma raça é reconhecida como tal quando uma associação
de criadores é instituída para a promover ou é publicado um livro genealógico (MASON,
1996). Em Portugal, a Associação Nacional de Criadores de Ovinos Serra da Estrela
(ANCOSE) foi a primeira a ser criada em 1981 e o livro geneológico correspondente em
1984. Da análise da Tabela 1 pode-se concluir que os anos noventa foram profícuos na
criação de associações de criadores de raças ovinas, tendo sem dúvida os fundos
comunitários constituído um incentivo importante.
No que respeita à raça Churra do Campo, não se chegou a constituir nenhuma
associação de criadores, o que em muito terá contribuído para que, apesar do seu
efectivo rondar os 35 mil animais em 1987 (SOBRAL et al., 1987) e se terem passado
menos de duas décadas, esta raça fosse dada como extinta em 2004 (TELO DA GAMA et
al., 2004), constituindo assim um exemplo de como o papel das associações de
criadores é fundamental na sustentabilidade das raças e na conservação do seu
património genético.
25
Associação de criadores
26
1994
1991
1991
1994
1987
1987
1992
1987
1986
1991
1984
1995
1987
1991
1993
1996
1987
1983
1990
1989
1984
1989
1981
1987
Em risco
Em risco
Em risco
Em risco
Em risco
Em risco
Em risco
Em risco
Em risco
2000
2500
2705
8164
4680
4500
4650
50023
23000
4517
5700
13187
4500
1999
3000
2705
8164
4680
4500
4700
52253
23000
4517
5700
11106
4729
5822
13018
6500
3977
23000
43719
4952
4950
4976
8856
1926
2500
-
2001
6887
13323
8500
3792
23000
34377
4939
4850
6125
9524
1924
2500
4500
2002
Efectivo
7764
13288
8500
5481
23000
27903
4939
3212
6895
9555
2039
1353
4990
2003
7150
13288
9000
6214
23000
33026
5000
2863
7352
9555
2039
1353
4288
2004
7281
15303
9000
7515
23000
31100
5849
3500
7823
9585
2039
2220
8614
2005
7281
21300
9000
7515
23000
29299
6440
3500
7823
9585
2691
2220
8924
2006
Informação obtida junto das associações de criadores e da Dra. Filomena Afonso da Direcção Geral de Veterinária; BEDM – Bordaleira de Entre Douro e Minho, CA - Churra
Algarvia, CMP - Campaniça, CB – Churra Badana, CGB – Churra Galega Bragançana, CGM – Churra Galega Mirandesa, CM – Churra Mondegueira, CTQ – Churra da
Terra Quente, MB Merino Branco, MP – Merino Preto, MBB – Merino da Beira Baixa, SL – Saloia, SE – Serra da Estrela.
BEDM Associação de Criadores de Bovinos da Raça Barrosã
(AMIBA)
CA
Associação de Criadores de Gado do Algarve (ASCAL)
CB
Associação Nacional de Criadores de Ovinos da Raça
Churra Badana
CGB Associação Nacional dos Criadores da Raça Churra Galega
Bragançana (ACOB)
CGM Associação Nacional de Criadores de Ovinos da Raça
Churra Galega Mirandesa (ACOM)
CM
Associação de Produtores de Pequenos Ruminantes da Bacia
Hidrográfica do Côa (COVICÔA)
CMP Associação de Criadores de Ovinos do Sul (ACOS)
CTQ
Associação Nacional de Criadores de Ovinos da Raça
Churra da Terra Quente (ANCOTEQ)
MB
Associação Nacional de Criadores de Ovinos da Raça
Merina (ANCORME)
MBB Associação de Produtores de Ovinos do Sul da Beira
(OVIBEIRA)
MP
Associação Nacional de Criadores de Ovinos da Raça
Merina (ANCORME)
SE
Associação Nacional de Criadores de Ovinos Serra da
Estrela (ANCOSE)
SL
Associação de Criadores e Reprodutores de Gado do Oeste
(ACRO)
Raça
Início do Estado
Ano de registo
de
criação zootécnico
risco
1990
2000
Em risco
Tabela 1. Evolução do efectivo das raças ovinas portuguesas entre 1999 e 2006.
Capítulo 1 – As raças portuguesas de ovinos e os marcadores de DNA
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
1.4. MARCADORES MOLECULARES NO ESTUDO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DAS
RAÇAS DE ANIMAIS DOMÉSTICOS
Durante as últimas décadas, o desenvolvimento de técnicas bioquímicas e
moleculares permitiu grandes progressos no estudo da estrutura populacional e na
compreensão da história evolutiva dos seres vivos em geral. A aplicação destes métodos
às populações de animais domésticos abriu novos campos de investigação. O objectivo
deste sub-capítulo é fazer uma breve resenha das principais ferramentas moleculares
disponíveis para caracterizar a diversidade e as relações filogenéticas entre as
populações de animais domésticos. A abordagem incidirá essencialmente nos princípios
sobre os quais assentam, nas vantagens e desvantagens de cada uma delas, procurando
justificar a escolha dos microssatélites como marcadores, assim como a referência a
alguns exemplos do seu uso no âmbito das populações domésticas.
1.4.1. Métodos Proteicos
A primeira descrição da variabilidade ao nível bioquímico realizou-se no princípio
do século XX em humanos, após a descoberta dos grupos sanguíneos A, B e O. Não
obstante, foi necessário esperar pela década de sessenta para surgirem os primeiros
estudos que abordam os processos evolutivos com base em técnicas moleculares de
proteínas (LEWONTIN e HUBBY, 1966), trabalhos estes revistos por LEWONTIN (1991).
Graças à técnica de electroforese em gel foi possível revelar as variantes proteicas
ou alozimas (diferentes formas de uma mesma proteína). Esta técnica é baseada numa
migração diferencial das proteínas através de um gel sob o efeito de um campo
eléctrico. A migração é então uma função da carga eléctrica total, da conformação e do
peso molecular das proteínas.
Os estudos de variantes proteicas rapidamente se transformaram numa ferramenta
de referência para a investigação da variação bioquímica e forneceram os primeiros
meios para estimar a variabilidade do genoma. Estes marcadores foram, e são ainda,
largamente usados para estudos de genética de populações, quer com o objectivo de
caracterizar a diversidade das raças humanas (NEI e ROYCHOUDHURY, 1974a), de ovinos
(ORDÁS e PRIMITIVO, 1986; ORDÁS e SAN PRIMITIVO, 1986; TUÑÓN et al., 1989;
ZANOTTI CASATI et al., 1990; MISSOHOU et al., 1999), de bovinos (BLOTT et al., 1998;
27
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
CERIOTTI et al., 2003), de caprinos (SELVARAJ et al., 1991a), de búfalos (SELVARAJ
et al., 1991b) e de equinos (BUIS, 1976), quer para estabelecer as relações evolutivas
entre diferentes espécies (NGUYEN e BUNCH, 1980).
O estudo das alozimas constituiu um grande avanço pois até então os métodos
disponíveis consistiam apenas na observação de caracteres morfológicos e quando estes
tinham carácter dominante, em estudos de segregação mendeliana por cruzamentos
orientados. No entanto, apresentam algumas limitações como marcadores genéticos,
nomeadamente um polimorfismo relativamente baixo e a exigência de métodos de
purificação e sequenciação muito laboriosos e caros, determinando, assim, que o
polimorfismo proteico seja, na prática, identificado pela técnica de electroforese em gel.
A separação das variantes proteicas nesta técnica assenta na diferente carga eléctrica
que os aminoácidos constituintes das proteínas possuem, e cuja substituição, em caso de
mutação, implicaria alteração da carga e portanto da mobilidade. Contudo, estima-se
que apenas um quarto de todas as substituições aleatórias de códãos que levam à
substituição de um aminoácido por um outro, resultará numa mudança de carga eléctrica
(LEWONTIN, 1991). Além disso, diferentes códãos codificam para um mesmo
aminoácido, subestimando, portanto, a variabilidade genética em caso de “substituições
silenciosas”. Os factores que influenciam a capacidade da electroforese para detectar a
variação proteica foram estudados por RAMSHAW et al. (1979).
1.4.2. Métodos de DNA
A molécula de cadeia simples do ácido desoxirribonucleico (DNA) é um
polinucleótido constituído por quatro nucleótidos: Adenina (A), Timina (T), Citosina
(C) e Guanina (G), cujo ordenamento define uma sequência. A cadeia dupla de DNA
consiste em dois desses polímeros unidos por pontes de hidrogénio através de pares
específicos de nucleótidos de tal forma que a sequência de uma cadeia define a
sequência da cadeia homóloga (SALADIN, 2004). A dupla cadeia é torcida em hélice e
estruturalmente estabilizada e empacotada à volta de proteínas nucleares, as histonas
(Figura 2). Este complexo, designado por cromatina, pode ser empacotado e condensado
em grau variável, conforme a fase do ciclo celular, tornando possível a visualização
individualizada dos cromossomas (que no caso concreto dos ovinos domésticos são em
número de 54) quando este processo atinge o seu valor máximo.
28
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
Ponte de
Hidrogénio
Figura 2. Esquema representativo da constituição e da organização da molécula de DNA (adaptado
de SALADIN, 2004).
Por detrás desta simplicidade de constituição, o DNA encerra uma enorme
complexidade estrutural e funcional que tem vindo a ser desvendada nas últimas
décadas e que consta de várias obras tais, como as de USSERY (2002) e LEWIN (1994).
Para o âmbito deste trabalho importa destacar apenas uma breve descrição orientada na
perspectiva de clarificação da natureza dos diferentes marcadores moleculares de DNA
mais correntemente utilizados no estudo da diversidade genética de populações de seres
vivos. O facto de se ter constatado que a quantidade de DNA do genoma dos
eucariontes em geral não estava correlacionada com a complexidade dos organismos
respectivos, aspecto que ficou designado de “paradoxo do valor C” (GREGORY, 2002),
deixou, durante algum tempo, intrigada a comunidade científica. O estudo da taxa de
renaturação do DNA veio trazer alguma luz na resolução deste paradoxo, uma vez que
permitiu identificar três fracções (Figura 3) que diferiam nesse parâmetro e que se
apresentavam muito variáveis entre espécies. A primeira, com uma taxa de renaturação
mais elevada, associada à presença de sequências muito repetidas; uma segunda, com
uma taxa intermédia, associada à presença de sequências medianamente repetidas e a
terceira, com renaturação mais lenta associada a sequências únicas (STUDER e EPPLEN,
1990). O desenvolvimento da técnica de sequenciação do DNA permitiu, por um lado,
confirmar os resultados desses estudos prévios e, por outro, constatar uma ordem linear
29
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
de unidades funcionais – os genes - semelhante entre espécies próximas, reflectindo um
ancestral comum.
Altamente
repetitivo
% de DNA de Cadeia Simples
100
Medianamente
repetitivo
50
Cópia
única
0
0,1
1
10
100
Log Cot
Figura 3. Curva de renaturação do DNA (adaptado de STUDER e EPPLEN, 1990).
Por outro lado, o DNA eucariótico pode também ser dividido em sequências
codificantes e não codificantes (Figura 4). As primeiras, que podem representar na
espécie humana apenas 1,5% do genoma, sendo, normalmente, de cópia única,
codificam genes, ou seja, transcrevem para proteínas, enquanto que as segundas são
candidatas a uma função estrutural ou de regulação.
Figura 4. Divisão sequencial do genoma humano em componentes de DNA tipo (adaptado de
BENNET, 2000).
30
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
No conjunto, as sequências de cópia única representam cerca de 50 a 60% do
genoma dos mamíferos (LODISH et al., 1995).
As regiões medianamente repetitivas, geralmente não codificantes e bastante
heterogéneas, são constituídas por sequências com maior ou menor repetição, são
dispersas no genoma, ou seja, alternadas com sequências de DNA não repetitivo e
constituem cerca de 25 a 40% do genoma dos mamíferos (LODISH et al., 1995). Entre
elas há dois tipos particularmente conhecidos e que são diferenciados apenas pelo
tamanho, os LINE (Long Interspersed Elements) com mais de 500 pares de bases (pb)
de comprimento e os SINE (Short Interpersed Elements) com comprimento menor do
que esse valor. Algumas sequências dos dois tipos têm a capacidade de se transpor para
novos locais na molécula do DNA celular, sendo por isso designadas como elementos
transponíveis (transposable elements). As repetições Alu, assim nomeadas por conterem
um sítio de corte da enzima de restrição Alu I, são específicas dos primatas e são
provavelmente os SINE mais conhecidos. Estes consistem em sequências de DNA de
aproximadamente 280 pb, imperfeitamente repetidas cerca de 750 milhares de vezes,
constituindo 5% do genoma humano (BENNETT, 2000). Nos animais domésticos foram
também identificados vários SINE’s e LINES’s (BUCHANAN et al., 1993; KOSTIA, 2000;
NIJMAN et al., 2002b; STRATIL et al., 2003).
O DNA altamente repetitivo, cerca de 10 a 15% nos mamíferos (LODISH et al.,
1995), é composto por pequenas sequências (unidades) dispostas em rosário (tandem),
de forma adjacente e podendo, de acordo com o tamanho dessa unidade e do número de
vezes que ela se repete, constituir-se como satélites, minissatélites e microssatélites.
Os mecanismos geradores deste tipo de DNA repetitivo incluem a amplificação
génica através de processos como a replicação deslizante (replication slippage)
(LEVINSON e GUTMAN, 1987b; SCHLOTTERER e TAUTZ, 1992), a amplificação em
círculo rolante (rolling circle amplification), o sobrecruzamento (crossing-over)
desigual e a mutação por substituição de bases (CHARLESWORTH et al., 1994;
SCHOFIELD e HSIEH, 2003). A importância de cada um destes processos depende do tipo
de DNA repetitivo em causa.
Os satélites foram o primeiro tipo de DNA repetitivo em rosário a ser descoberto,
devendo-se a sua designação ao facto de ter sido primeiramente identificado como um
31
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
pico de absorção secundário que se separava do grosso do DNA, quando este era
submetido a uma ultra-centrifugação em gradiente de densidade (Figura 5).
Banda
principal
de DNA
Satélites
ricos em
A+T
Absorvência
Satélite
rico em
G+C
Gradiente de densidade
Figura 5. Separação dos satélites e da banda principal de DNA na cobaia, em gradiente de
densidade de Ag2+/Cs2SO4 (adaptado de CORNEO et al., 1970).
Posteriormente, na espécie humana, e de acordo com a mesma técnica, foram
identificados vários picos de absorção e designados por satélites I, II, III, IV e alfóide
(SINGER, 1982).
Nos satélites, os motivos repetem-se centenas de milhares de vezes, sendo
sobretudo o resultado de fenómenos de duplicação/amplificação. Estes localizam-se
preferencialmente nas regiões de heterocromatina dos centrómeros dos cromossomas e
parecem exercer funções de alinhamento cromossomal durante a meiose e a mitose. São
em regra característicos de cada espécie ou de espécies relacionadas.
Nos minissatélites, as unidades de repetição têm um tamanho de 6 a 100 pb
(VERGNAUD e DENOEUD, 2000) ou 10 a 50 (JOBLING et al., 1998) e o seu comprimento
total atinge aproximadamente 100 pb a 20 kb. Os minissatélites também são designados
de VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) (SHRIVER et al., 1993; VERGNAUD e
DENOEUD, 2000). De acordo com BENNETT (2000), os minissatélites podem ser
subdivididos em teloméricos e hipervariáveis. Os primeiros consistem em repetições de
hexanucleotídos (principalmente TTAGGG) com cerca de 10 a 15 kb de comprimento
que são adicionados aos telómeros pela telomerase. Atribui-se a este tipo de DNA uma
função protectora que se opõe à erosão das terminações cromossómicas e fornecedora
de um meio para a replicação completa das sequências teloméricas. Pensa-se também
que possa desempenhar um papel no emparelhamento e orientação dos cromossomas
32
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
durante a divisão celular (BENNETT, 2000). O segundo tipo, ou seja os minissatélites
hipervariáveis, não se limitam às regiões teloméricas e consistem em repetições de um
motivo formado por 6 a 50 nucleótidos e um tamanho total muito variável com o
indivíduo num mesmo locus. Esta característica valeu-lhes a designação de VNTR
(Variable Number of Tandem Repeat), estando na origem de um tipo de marcador
molecular conhecido por fingerprints que será descrito mais adiante.
Os minissatélites fazem parte do genoma praticamente de todos os mamíferos,
estimando-se para o caso da espécie humana uma frequência média de 9,1 minissatélites
por cada mega base (Mb) de DNA genómico (NASLUND et al., 2005). A percentagem de
minissatélites que se localizam nas regiões sub-teloméricas é cerca de 90% em
humanos, 66% em suínos e 30% em ratos (AMARGER et al., 1998). A evolução do
número de cópias dos motivos que constituem os minissatélites é relativamente rápida e
julgando-se ser originada por sobrecruzamento desigual durante a meiose (BENNETT,
2000).
Os microssatélites são uma classe específica de sequências de DNA repetitivo em
rosário (tandem) na qual o motivo repetido contém 1 a 5 pb, podendo repetir-se até
cerca de 100 vezes (TAUTZ e SCHLÖTTERER, 1994). Na literatura encontram-se também
outras designações tais como: STRs (Simple Tandem Repeats), muito comum na ciência
forense (BUTLER et al., 2001), mas que outros autores utilizam especificamente para os
tri e tetranucleótidos (EVETT et al., 1996; HAHNER et al., 2000); SSR (Simple Sequence
Repeats) (LI et al., 2002b); VNDR (Variable Number of Dinucleotide Repeats)
(DUFOUR et al., 2004); VSSM (Variable Simple Sequence Motifs) (NANBA et al., 1996);
SSLP (Simple Sequence Length Polimorfism) (FARBER e MEDRANO, 2003); STMS
(Sequence Tagged Microsatellite Sites) (LAGODA et al., 1998). O polimorfismo dos
microssatélites parece ser devido à variação no número de repetições (WEBER e MAY,
1989).
Os microssatélites foram encontrados no genoma de quase todos os organismos
até agora estudados (TÓTH et al., 2000). Em média, estas sequências repetitivas ocorrem
uma em cada 10 kb de sequência de DNA sendo tal frequência mais elevada do que a
que seria de esperar com base na distribuição aleatória das bases que compõem o
genoma (TAUTZ, 1989; COX e MIRKIN, 1997; PUPKO e GRAUR, 1999). A frequência de
cada motivo de repetição é variável com a espécie e normalmente apresenta uma relação
inversa com o seu tamanho. A título de exemplo, podemos referir que os
33
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
mononucleótidos “A” e “T” estão presentes no genoma humano, num número
aproximado de 500 mil loci, enquanto que os pentanucleótidos são estimados apenas em
alguns milhares (BENNETT, 2000). Em drosófilas e na maioria dos mamíferos, o motivo
“CA” é o dímero mais frequente, tendo sido obtido para os ovinos uma frequência
média de um microssatélite “CA” em cada 65 kb (BUCHANAN et al., 1993), semelhante
ao encontrado para os humanos nos quais o intervalo médio foi de 60 kb (LUTY et al.,
1990), mas muito diferente do obtido em ratos e cobaias, onde as repetições de “CA”
foram encontradas, em média, a cada 18 e 21 kb respectivamente (STALLINGS et al.,
1991). O motivo “TA” é o mais abundante em Arabidopsis thaliana e em fungos
enquanto o motivo “CT” predomina em Caenorhabditis elegans. Os microssatélites são
cinco vezes menos abundantes nos genomas de plantas do que nos de mamíferos. O
motivo de repetição mais comum nas plantas é o dinucleótido “AA” seguido do “AT” e
“CT” (LAGERCRANTZ et al., 1993).
De acordo com as características e disposição do motivo repetido podemos
classificar os microssatélites em:
Microssatélites perfeitos – constituídos apenas por um motivo de repetição
(ex. CACACACACACACACA);
Microssatélites compostos – constituídos por mais do que um motivo de repetição
(ex. CACACACAGCGCGCGCGC);
Microssatélites imperfeitos – quando uma ou mais unidades do motivo de
repetição sofreu uma mutação (ex. CACACACTCACACACA;
Microssatélites interrompidos – aqueles que contêm uma inserção de um ou mais
nucleótidos separando os motivos de repetição (ex. CACACACAGTAACACACACA).
Esta classificação, contudo, nem sempre é fácil, uma vez que os microssatélites
propriamente ditos são frequentemente flanqueados por sequências de nucleótidos
muito mais parecidas com eles do que com o restante DNA envolvente, o que dificulta o
estabelecimento rigoroso de fronteiras (HRABCOVA e KYPR, 2003).
1.4.3. Marcadores moleculares
A observação de que a composição sequencial do DNA é específica (única) de
cada indivíduo, apenas igual entre gémeos verdadeiros e a constatação do carácter
34
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
altamente polimórfico de grande parte do DNA repetitivo em rosário, permitiu que esta
última característica fosse utilizada para marcar ou mapear o genoma de várias espécies,
particularmente de animais domésticos. Os métodos aplicados na detecção desse
polimorfismo sofreram uma evolução ao longo dos anos e variaram de acordo com o
tipo de sequência em causa. Atendendo à importância que constituiu a descoberta da
técnica da Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR - Polymerase Chain Reaction),
objecto do prémio Nobel em 1993, optou-se por descrever os métodos de detecção de
polimorfismo em dois períodos: antes e após a PCR.
1.4.3.1. Métodos pré-PCR
A metodologia com base na análise de RFLPs (Restriction Fragment Length
Polymorphism) consiste na digestão de DNA genómico alvo, utilizando endonucleases
bacterianas purificadas que cortam o DNA em sequências específicas dando origem a
fragmentos de tamanho diferente. O produto de digestão é depois separado por
electroforese em gel e posteriormente transferido para uma membrana de nylon,
processo denominado de Southern blotting. De seguida, procede-se a uma hibridação à
temperatura adequada, com sondas de DNA de sequência específica marcadas
radioactivamente ou com fluorescência. Finalmente, a exposição a um película
adequado ao método de marcação torna possível visualizar, na forma de bandas, os
fragmentos do DNA correspondentes com os quais a sonda hibridou por
complementaridade (Figura 6).
Blotting
DNA +Enzima de restrição
Fragmentos
de restrição
Electroforese
Papel de
nitrocelulose
Papel de
filtro
Gel
Hibridação com
sonda radioactiva
Autoradiografia
Retirar papel
Retirar papel blot
de filtro
Filme
Lavagem da sonda não
hibridada
Sonda de DNA em
solução em tubo de
plástico
Figura 6. Etapas do método de obtenção de RFLPs pela técnica Southern blot (adaptado de
CAMPBELL et al., 1999).
35
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
O polimorfismo resulta quer das alterações de sequência no local de corte da
enzima de restrição, quer de eventuais inserções ou delecções na região de hibridação.
A natureza dos marcadores produzidos é codominante, uma vez que é possível
distinguir heterozigotos de homozigotos.
Esta técnica apresenta grande versatilidade, uma vez que é enorme a possibilidade
de combinação entre enzimas de restrição e sondas sendo a sequência destas últimas que
determina a especificidade dos resultados. Portanto, permite detectar a variabilidade de
qualquer tipo de DNA atrás descrito, bastando para tal desenhar a sonda adequada ao
que se pretende. Em contrapartida, é um método que tem a desvantagem de ser muito
trabalhoso, quer na fase de desenvolvimento (é necessário testar muitas enzimas para
descobrir o polimorfismo), quer na fase de execução devido à grande quantidade de
passos envolvidos. Além disso, requer grandes quantidades de DNA em cada reacção
(DODGSON et al., 1997).
Na bibliografia encontram-se vários exemplos da aplicação desta técnica no
estudo do polimorfismo do DNA codificante, nomeadamente: em ovinos, dos genes da
hormona de crescimento (VALINSKY et al., 1990), do lactogénio placentário (YOSSEFI e
GOOTWINE, 1996), da queratina da lã, de diversas hormonas e imunoglobulinas
(PARSONS et al., 1996), de proteínas do leite (DI GREGORIO et al., 1991; LEVÉZIEL et al.,
1991); em bovinos, dos genes da hormona de crescimento e da prolactina (COWAN et
al., 1989) e da calpastatina (LONERGAN et al., 1995); em suínos, do gene do factor de
transcrição hipofisário − PIT 1 (YU et al., 1995), etc. A designação de RFLP ficou mais
associada ao polimorfismo do DNA codificante, enquanto que o DNA repetitivo tomou
a designação do tipo em causa. Assim, da aplicação desta técnica ao DNA repetitivo
resultaram os marcadores moleculares designados como satélites e minissatélites, estes
também apelidados de fingerprinting e cujas sondas marcadas são curtas sequências
isoladas de clones que contêm o motivo da repetição alvo. As sequências isoladas numa
espécie podem ser utilizadas noutras espécies (KASHI et al., 1990).
No tocante ao polimorfismo do DNA satélite, devido ao seu tamanho enorme e à
sua localização mais ou menos restrita, não teve grande uso no estabelecimento de
perfis individuais, nos estudos de ligação genética, limitando-se apenas a alguns estudos
evolutivos. Nos animais domésticos foi também esta última abordagem que prevaleceu,
nomeadamente em bovinos (BUCKLAND, 1985; NIJMAN e LENSTRA, 2001) e em ovinos
e caprinos (BUCKLAND, 1983, 1985; NIJMAN et al., 2002a). Já quanto aos minissatélites,
36
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
por serem abundantes no genoma, muitos possuem o mesmo motivo de repetição e são,
portanto, passíveis de hibridar com uma mesma sonda o que, aliado à sua natureza
altamente polimórfica, resulta num padrão complexo de dezenas de bandas
(fingerprintings), com uma probabilidade elevada do perfil obtido ser único para cada
indivíduo. Este facto está na origem da sua ampla utilização na identificação individual
em ciência forense e em testes de paternidade (JEFFREYS et al., 1988; JEFFREYS et al.,
1990).
Embora este tipo de marcador tenha sido aplicado na elaboração de mapas
genéticos, o facto da sua distribuição não ser ubíqua, à semelhança dos satélites, mas
preferencialmente nas regiões teloméricas (AMARGER et al., 1998), restringe muito a sua
utilidade ainda mais condicionada por outras limitações como a incapacidade de poder
atribuir um determinado locus às bandas observadas, o que impossibilita o cálculo de
frequências alélicas e a sua natureza dominante que reduz a informação genotípica
(DODGSON et al., 1997). Quando comparados com os microssatélites, carecem de muito
mais famílias de referência para a construção do mapa genético (VIGNAL et al., 2002).
A sua utilização nos estudos de animais domésticos centrou-se sobretudo na
análise da variabilidade de alguns minissatélites (KASHI et al., 1990; NAVE et al., 1997),
na relação evolutiva de populações (SIGNER et al., 2000), na proposta de uso como
forma de identificar paternidades em Bovídeos (TROMMELEN et al., 1993) e em
equídeos (ANUNCIAÇÃO e ASTOLFI-FILHO, 2000), ou por fim, ainda em alguns trabalhos
de detecção de QTL (Quantitative Trait Loci) (DODGSON et al., 1997). Para, de alguma
forma, obviar alguns destes problemas, as sondas curtas multilocus utilizadas no início,
foram substituídas por sondas de locus único (LAMBERT et al., 1994); isto é, com a
sequência homóloga de um dado minissatélite. No entanto, o problema da incapacidade
de interpretar as bandas como alelos permaneceu, em especial, quando se comparavam
resultados de diferentes laboratórios (BENNETT, 2000), aspecto que só foi solucionado
com a aplicação da técnica da PCR a minissatélite específicos (SIGNER e JEFFREYS,
1997; JOBLING et al., 1998). Embora a detecção das bandas pudesse ser realizada na
mesma por southern blotting, o facto de apenas a sequência alvo ser amplificada
permitia a identificação do polimorfismo de forma directa através da submissão do gel
de agarose, previamente corado com brometo de etídeo, à luz ultravioleta. A
possibilidade de cortar o produto da PCR com enzimas de restrição deu origem a uma
nova metodologia de identificação de polimorfismo, designada por PCR-RFLP, muito
37
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
usada na análise do DNA codificante (MEYER et al., 1995; UDINA et al., 1995;
PRINZENBERG et al., 1996; SOUMILLION et al., 1997).
1.4.3.2. Métodos Pós-PCR
A técnica da PCR foi publicada em 19862 por MULLIS et al. e decisivamente
melhorada em 1988 por SAIKI et al., através da introdução de uma polimerase termoestável extraída do Thermus aquaticus, que assim ultrapassou a exigência de se
acrescentar nova polimerase em cada ciclo de temperaturas.
Para iniciar o processo do replicação do DNA, ou amplificação, são necessários
dois oligonucleótidos iniciadores (primers) complementares das extremidades do
fragmento do DNA a ser amplificado, os quatro nucleótidos (dNTP), a polimerase, um
meio tamponizado e com iões de magnésio e DNA genómico. Este "cocktail" é então
submetido a uma repetição de ciclos de temperatura, cerca de 30 ºC, que inclui três
fases: uma desnaturação do DNA a 96 ºC, uma hibridação específica dos
oligonucleótidos iniciadores cuja temperatura depende da sua composição e uma
extensão (síntese) do DNA a 72 ºC. Este processo é, teoricamente, exponencial e
permite obter milhões de cópias de um fragmento do DNA alvo. A complementaridade
dos primers com as extremidades do fragmento alvo assegura a especificidade da
amplificação confinada ao fragmento em causa. Esta descoberta revolucionou a biologia
molecular uma vez que abriu as portas a muitos métodos de investigação do DNA.
As vantagens que esta técnica encerra centram-se no facto de exigir apenas uma
pequeníssima quantidade de DNA e de dispensar o uso da técnica de southern blotting
para a detecção das bandas, além de permitir trabalhar exclusivamente os fragmentos
alvo do estudo e não a totalidade do DNA genómico.
1.4.3.2.1. RAPDs (Polimorfismos de amplificação aleatória de DNA)
A metodologia dos RAPDs foi publicada de forma independente por WILLIAMS et
al. (1990) e por WELSH e MCCLELLAND (1990). Como o seu nome indica, consiste na
amplificação aleatória de fragmentos de DNA, utilizando para o efeito apenas um
iniciador (primer) de pequeno tamanho (cerca de 10 pb) com sequência arbitrária e
condições de temperaturas da PCR com baixa “estringência” (tradução livre de
38
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
stringency), permitindo que aqueles se liguem em vários locais, por vezes, mesmo que a
sequência alvo não seja exactamente a mesma. Quando dois desses locais estão
suficientemente próximos e um deles se apresenta com orientação invertida, ocorre
ampliação.
Nesta metodologia, a sequência e tamanho do primer usado é determinante do
polimorfismo obtido sendo necessário testar previamente vários primers para avaliar o
seu polimorfismo e proceder à selecção dos mesmos antes da utilização pretendida
(AMBADY et al., 1996; PAREJO et al., 1997). O produto de amplificação é, normalmente,
separado por electroforese em gel de agarose, corado com brometo de etídio e
visualizado sob luz ultravioleta, o que representa uma grande vantagem quando
comparada com a técnica de southern blotting utilizada nos RFLPs.
Para um dado primer, o polimorfismo obtido resulta das alterações de sequência
no local de ligação do mesmo e da eventual inserção ou deleção na região amplificada
(WILLIAMS et al., 1990). Na maior parte dos casos, a metodologia dos RAPD origina
marcadores dominantes, ou seja, não é possível distinguir os indivíduos homozigóticos
dos heterozigóticos, o que determina um baixo poder informativo para este tipo de
marcador. Em contrapartida, esta característica torna os RAPDs especialmente
aplicáveis ao mapeamento de cromossomas sexuais (DODGSON et al., 1997).
A maior limitação que é apontada aos RAPDs relaciona-se com a existência de
alguns problemas de reprodutibilidade, em virtude da sua enorme dependência das
condições exactas de PCR utilizadas e da qualidade de DNA, quer quando se considera
os resultados num mesmo laboratório quer entre vários laboratórios (DODGSON et al.,
1997; JONES et al., 1997; RAJPUT et al., 2006). Têm também sido apontadas outras
causas, como a formação de cadeias heteroduplex em sequências homólogas e a
competição entre diferentes fragmentos de amplificação (HANSEN et al., 1998). Assim,
para minimizar estes erros eventuais tem sido sugerido que se proceda sempre à
repetição da genotipagem (PILLAY e KENNY, 1996). Além destes aspectos foi apontada
também a possibilidade de ocorrência de bandas co-migrantes não homólogas, o que
introduz distorção na interpretação dos resultados obtidos (HURME e SAVOLAINEN,
1999). Todavia, segundo ADAMS e RIESEBERG (1998), este tipo de erro é aleatório e no
caso concreto a que se referiu o presente estudo não é susceptível de afectar a
similaridade das populações em análise, mas apenas os valores absolutos.
2
A evolução da técnica da PCR está disponível em: http://www.molecularstation.com/pcr/history-of-pcr/
39
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
Apesar das limitações apontadas, este método tem a vantagem de permitir uma
avaliação rápida e barata da variação genómica, uma vez que não requer um
conhecimento prévio das sequências de DNA que vão ser amplificadas. Por isso, é
especialmente recomendado nas espécies cujo conhecimento do genoma é escasso e em
laboratórios com recursos modestos em equipamento. Os RAPDs foram aplicados
principalmente no mapeamento genético de plantas mas também em animais (HUNT e
PAGE, 1995; SHIUE et al., 1999). No que concerne a estudos de variabilidade genética
em animais domésticos, este tipo de marcador foi usado com pouca expressividade,
embora, se encontrem publicados alguns trabalhos realizados em bovinos e ovinos
(KANTANEN et al., 1995; PAREJO et al., 1998; RINCÓN et al., 2000), em caprinos (DE
OLIVEIRA et al., 2005; LI et al., 2006), em equinos (APOSTOLIDIS et al., 2001), em
suínos (YEN et al., 2001), em aves (SMITH et al., 2005), no estudo da relação genética
entre espécies da família Bovidae (RAO et al., 1996) e na capacidade de distinção entre
espécies animais (HUANG et al., 2003).
1.4.3.2.2. AFLPs (Polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado)
A metodologia dos AFLPs (VOS et al., 1995) consiste basicamente numa
amplificação selectiva de fragmentos de restrição obtidos pela digestão de DNA
genómico e originando, como no caso dos RAPDs, perfis com múltiplas bandas. Na
prática, a metodologia assenta em três fases sucessivas: uma digestão-ligação, uma
amplificação pré-selectiva e uma amplificação selectiva.
Inicialmente, uma quantidade pequena de DNA genómico é digerida usando um
par de enzimas de restrição, uma que corta a molécula de DNA com elevada frequência
(caso das EcoRI, PstI, HindII e ApaI) e outra que a corta mais raramente (caso das MseI
e TaqI). Como exemplo, podemos referir o uso do par MseI e EcoRI em pinheiros
(LERCETEAU e SZMIDT, 1999; MARIETTE et al., 2001) e do par TaqI e EcoRI em bovinos
(AJMONE-MARSAN et al., 1997).
Às extremidades coesivas do DNA, resultantes da acção destas enzimas, são
acoplados dois adaptadores de dupla cadeia específicos, desenhados para lhes serem
complementares e sem restaurar o sítio de corte, servindo para o efeito uma ligase de
DNA. A utilização de duas enzimas reduz o número de fragmentos amplificáveis, uma
40
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
vez que apenas os que resultaram da acção simultânea das mesmas serão potencialmente
amplificáveis.
Mesmo assim, para reduzir mais o número de fragmentos amplificados, a reacção
da PCR que se segue, denominada de amplificação pré-selectiva, é efectuada utilizando
um par de primers complementares a cada um dos dois adaptadores referidos, aos quais
foi adicionada em 3' um nucleótido adicional arbitrário para exercer um efeito selectivo.
O produto de amplificação pré-selectiva pode ser outra vez amplificado
(amplificação selectiva) utilizando um par de primers com a mesma sequência dos
usados na fase precedente, mas contendo mais duas bases selectivas adicionais (ou seja,
três no total).
Esta segunda amplificação reduz ainda mais o número dos fragmentos
amplificados e tem como objectivos tornar exequível a individualização das bandas e
maximizar a obtenção da informação. A electroforese é levada a cabo em géis de
acrilamida desnaturantes e a detecção, normalmente efectuada com recurso à marcação
de um dos primers na extremidade 5,' com um fluorocromo ou com fósforo radioactivo,
conforme se destina a um sequenciador automático ou a uma película de radiografia,
respectivamente. A marcação de um dos primers evita a ocorrência de “doublets” nos
géis, provocados pela mobilidade diferencial das duas cadeias dos fragmentos
amplificados. À semelhança dos RAPDs, o polimorfismo dos AFLPs resulta de
alterações na sequência dos locais de restrição e de ligação dos primers além das
eventuais inserções ou delecções no segmento amplificado (AJMONE-MARSAN et al.,
1997; KNORR et al., 1999; SAVELKOUL et al., 1999).
Esta técnica é daquelas que permite obter mais informação de uma só vez, além
do enorme potencial que representa a possibilidade de executar as várias combinações
possíveis dos nucleótidos selectivos dos dois primers conjuntamente com a combinação
de enzimas de restrição que se podem utilizar. Devido à quantidade enorme de bandas
produzidas num mesmo gel (na ordem das centenas), nem todas são passíveis de se
distinguir, apenas uma fracção delas apresenta polimorfismo e é difícil dissociar as que
têm origem num mesmo locus. Por isso é frequente realizar-se apenas uma análise de
presença ou ausência, para cada banda polimórfica produzida, sendo por isso,
marcadores de natureza dominante. Apesar de VOS et al. (1995) referirem que a técnica
dos AFLPs não era sensível à concentração de DNA molde, AJMONE-MARSAN et al.
(1997) afirmaram que as bandas notadas com diferente intensidade, por si detectadas
41
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
entre indivíduos numa proporção de 65% das bandas, podem ser lidas como marcadores
de natureza codominante, uma vez que se verificou uma correlação significativa entre a
zigotia e a intensidade de banda.
Ao contrário dos RAPDs, os AFLP apresentam uma reprodutibilidade elevada,
sendo a amplificação por PCR realizada em condições de grande estringência (AJMONEMARSAN et al., 1997; JONES et al., 1997). Apesar disso, pode ser observada alguma
inconsistência na intensidade de algumas bandas, a ocorrência de justaposição de
bandas polimórficas com monomórficas e a migração conjunta de produtos de
amplificação de loci independentes, o que origina alguma arbitrariedade na leitura
(AJMONE-MARSAN et al., 1997). Na análise das imagens produzidas por esta técnica, é
assumido que as bandas co-migrantes são homólogas, o que não é obrigatoriamente
verdade (ROUPPE
VAN DER
VOORT et al., 1997). Pode acontecer que uma banda
particular seja o resultado da amplificação de dois fragmentos de igual tamanho mas de
diferentes regiões do genoma, não sendo possível aferir a sua homologia. Neste caso, a
ausência de banda seria observada apenas quando presentes as duas mutações
independentes. Alguns destes aspectos levam a que um determinado locus possa ser
genotipado mais do que uma vez, pondo em causa o princípio da independência de loci
subjacente aos métodos de reconstrução filogenética.
Por outro lado, esta técnica requer uma optimização das condições de acção das
enzimas de restrição, ligação dos respectivos adaptadores e das reacções de PCR, por
forma a que o polimorfismo obtido seja adequado, isto é, seja suficientemente elevado
para rentabilizar os reagentes utilizados, mas que não seja excessivo a ponto de impedir
a sua leitura devido à complexidade de bandas produzidas. A degradação do DNA, ou a
sua digestão parcial pelas enzimas de restrição devido a metilação ou má purificação do
DNA, pode resultar em interpretações erradas (AJMONE-MARSAN et al., 1997).
À semelhança dos RAPDs, os AFLPs não requerem nenhum conhecimento
preliminar do genoma a estudar, uma vez que tanto os adaptadores como os primers são
função das enzimas de restrição usadas, cuja acção é conhecida. Por esta razão, os
AFLPs encontraram especial aplicação em organismos vegetais e microrganismos, onde
o conhecimento do genoma era escasso e, por consequência, se tinham identificado e
caracterizado poucos microssatélites (LERCETEAU e SZMIDT, 1999; SAVELKOUL et al.,
1999; ROLDAN-RUIZ et al., 2001; PAFUNDO et al., 2005). No entanto, o número elevado
de bandas produzidas de uma só vez torna esta técnica atractiva, tendo por isso sido
42
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
amplamente usada nos mais diversos estudos, quer em plantas quer em animais. No que
respeita aos animais domésticos foram aplicados, entre outros, em estudos de
diversidade de suínos (ÓVILO et al., 2000; PLASTOW et al., 2003), bovinos (AJMONEMARSAN et al., 1997; NIJMAN et al., 1999; AJMONE-MARSAN et al., 2002; BUNTJER et
al., 2002) e caprinos (AJMONE-MARSAN et al., 2001), e no mapeamento genético
principalmente em aves (HERBERGS et al., 1999; KNORR et al., 1999; FUMIERE et al.,
2003).
1.4.3.2.3. SNPs (Polimorfismo de um único nucleótido)
Os SNPs, também designados de "Single Nucleotide Substitution" (CARLSON et
al., 2001) e comummente apelidados de “snips”, consistem em diferenças pontuais de
um nucleótido nas sequências homólogas de DNA, cuja frequência na população tenha
um valor mínimo de 0,01. Este tipo de variação é a mais comum no genoma humano,
em média uma por cada 1000 a 2000 pb, localizando-se tanto no DNA codificante como
no não codificante (SACHIDANANDAM et al., 2001). Até à data, e no que diz respeito ao
genoma humano, cerca de 11 milhões de SNPs estão disponíveis em bases de dados
públicas3. Nos animais domésticos são poucos e limitados na extensão os estudos
efectuados com vista a estimarem a frequência com que ocorrem os SNPs, mas os
resultados obtidos em algumas espécies, nomeadamente em bovinos (KONFORTOV et
al., 1999; HEATON et al., 2001) e suínos (GRAPES et al., 2006), sugerem uma ordem de
grandeza idêntica à registada em humanos. A abundância e a ubiquidade destas
diferenças pontuais estão na base da enorme expectativa que recai sobre elas, uma vez
que se espera poder utilizá-las, como marcadores na identificação de genes responsáveis
pela predisposição de certos indivíduos a determinadas doenças, recorrendo, para o
efeito, ao mapeamento por desequilíbrio de ligação (GORDON e OTT, 2001; SYVANEN,
2001). Por outro lado, o facto de nas regiões codificantes também surgirem SNPs, torna
possível a sua associação directa com uma eventual alteração da função da respectiva
proteína, o que, conjuntamente com um conhecimento do padrão de herança, os tornaria
adequados para uma estratégia de diagnóstico (JI e MANAK, 2002). Nos animais
domésticos é grande a expectativa gerada em torno da possibilidade de estabelecer uma
associação de genótipos (ou de haplótipos) de SNPs ao fenótipo produtivo, o que
3
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP
43
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
permitiria a sua utilização numa estratégia de selecção assistida por marcadores com
elevada eficiência (SCHENKEL et al., 2005; SCHENKEL et al., 2006).
Conceptualmente, os SNPs não são propriamente marcadores novos, uma vez que
a existência deste tipo de polimorfismo está desde há muito descrita, principalmente no
que toca a regiões codificantes que se relacionam com doenças humanas. As
metodologias clássicas usadas para detectar estas mutações requerem uma separação
dos diferentes alelos por electroforese em gel, o que torna o processo demorado. Estas
metodologias podem ser divididas em dois tipos: as que detectam variação em
sequências não caracterizadas, ditas de varrimento (scanning) e as que identificam
variações de sequências específicas previamente caracterizadas, designadas por
específicas (NATARAJ et al., 1999). As primeiras incluem, entre outras, o polimorfismo
de conformação monocatenária (SSCP - Single-Strand Conformation Polymorphism)
(ORITA et al., 1989; SUNNUCKS et al., 2000), a análise heteroduplex (HA - Heteroduplex
Analysis) (NATARAJ et al., 1999), a electroforese em gel de gradiente desnaturante
(DGGE - Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) (NOLL e COLLINS, 1987), e a
electroforese em gel de gradiente de temperatura (TGGE- Temperature Gradient Gel
Electrophoresis) (THEISSEN et al., 1993). Do segundo tipo fazem parte os métodos de
extensão de iniciadores ou minisequenciação (primer extension or minisequencing), a
amplificação
alelo-específica
(allele-specific
amplification),
a
hibridação
oligonucleotídica alelo-específica (allele-specific oligonucleotide hybridization) e o
ensaio de ligação oligonucleotídico (oligonucleotide ligation assay). As versões
originais destas metodologias analisavam normalmente apenas um SNP de cada vez,
num reduzido número de indivíduos, o que, aliado ao facto de possuírem uma natureza
bi-alélica, os tornava pouco atractivos como marcadores genéticos. Nos últimos 10 anos
tem-se assistido ao aparecimento de um grande número de variantes das metodologias
atrás referidas, principalmente das do segundo tipo, muito mais expeditas, em resultado
de uma conjugação inteligente dos avanços na microelectrónica, na bioquímica, na
análise de imagem e na bioinformática, os quais tornaram possível a análise de um
grande número de SNPs em simultâneo. Estas variantes foram recentemente alvo de
revisão (NOLLAU e WAGENER, 1997; CARLSON et al., 2001; KWOK, 2001; SYVANEN,
2001; LIBERLES, 2002; VIGNAL et al., 2002; STOUGHTON, 2005; SYVANEN, 2005). Não
estando a descrição individualizada destas metodologias no âmbito desta tese, pode-se
referir que em termos globais, elas comportam várias etapas que conjugam três
aspectos: o princípio de reacção, o formato do ensaio ou fase de separação e o método
44
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
de detecção. A Figura 7 mostra como cada um dos onze métodos, apontados como
exemplo, resulta da combinação de cada um desses três aspectos. Cada método
apresenta vantagens e limitações e nenhum deles é ideal para todas as aplicações
(KWOK, 2001; SYVANEN, 2001).
Figura 7. Métodos utilizados na genotipagem dos SNPs (adapatado de SYVANEN, 2001).
Apesar destes avanços, na prática, para que o uso dos SNPs se imponha como
alternativa aos microssatélites, é necessário aumentar ainda mais a eficiência de
genotipagem dos SNPs e, principalmente, reduzir o seu custo. Por outro lado, é também
preciso aumentar o número de SNPs caracterizados e alargar o leque de espécies com
informação nas bases de dados (SHERRY et al., 1999). Os projectos mundiais de
sequenciação de genomas têm tido um impacto significativo, mas o número de espécies
é ainda muito restrito, pelo que têm vindo a ser desenvolvidas novas abordagens com
vista a tirar partido da informação desses projectos, com base na constatação da
existência de um certo grau de conservação na sequência de DNA, sobretudo entre
45
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
espécies próximas (PRIMMER et al., 2002; AITKEN et al., 2004; GRAPES et al., 2006;
KIJAS et al., 2006).
Recentemente, foram publicados alguns trabalhos que apontam no sentido em que
o uso dos SNPs não só era adequado ao estudo da história evolutiva e demográfica de
populações, como também apresentava algumas vantagens no que se refere aos
microssatélites, donde se destaca o facto de apresentarem uma taxa de mutação inferior
relativamente aos segundos, facto que resultaria numa menor probabilidade de
ocorrência de homoplasia (KUHNER et al., 2000; BRUMFIELD et al., 2003; NIELSEN e
SIGNOROVITCH, 2003; MORIN et al., 2004). Em contrapartida, e uma vez que, na maior
parte das espécies, incluindo as de animais domésticos, o número de SNPs
caracterizados era ainda limitado, esses autores alertaram também para o risco de ser
introduzida alguma distorção (ascertainment bias) nos resultados obtidos, em virtude de
no processo prévio de identificação dos SNPs serem detectados, preferencialmente, os
mais polimórficos, devido ao número reduzido de indivíduos envolvidos na pesquisa
inicial. Contudo, esta limitação será facilmente superada mediante a progressiva
caracterização de mais SNPs.
Assim, à medida que forem ultrapassadas as limitações de índole económica, pelo
custo elevado do equipamento necessário à genotipagem dos SNPs e for alargado o
leque de informação disponível sobre estes marcadores, será de esperar que eles venham
a ter um papel de relevo nas várias áreas de estudo onde o uso de marcadores
moleculares seja justificável.
Relativamente às espécies de animais domésticos, nos últimos anos tem-se
assistido a um incremento significativo na disponibilidade de informação molecular em
várias bases de dados (FRIES e DURSTEWITZ, 2001; WHEELER et al., 2005; BENSON et
al., 2006). No entanto, devido ao elevado investimento financeiro e à necessidade de
optimização de protocolos que os novos métodos de genotipagem de SNPs implicam, o
número de trabalhos publicados envolvendo estas espécies é ainda muito restrito,
incidindo numa perspectiva de associação dos SNPs a características produtivas
(SCHENKEL et al., 2005; SCHENKEL et al., 2006), na análise de paternidade (HEATON et
al., 2002; WERNER et al., 2004), no mapeamento genético (CALVO et al., 2006) e
poucos têm sido os que aportam como objectivo o estudo da diversidade e da história
evolutiva dos animais domésticos (HERRAEZA et al., 2005). Contudo, parece unânime
que, num futuro próximo, as limitações associadas à genotipagem massiva de SNPs nos
46
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
animais domésticos serão ultrapassadas tornando possível produzir mais uma
perspectiva sobre a história evolutiva dos mesmos.
1.4.3.2.4. Microssatélites
Os microssatélites como sequências de DNA repetidas eram conhecidas desde os
anos 70, mas só em finais da década de oitenta surgiram os primeiros trabalhos de
isolamento e caracterização pela PCR, abrindo caminho à sua utilização como
marcadores moleculares num vasto leque de aplicações (TAUTZ, 1989; WEBER e MAY,
1989). O facto deste tipo de DNA repetitivo ser muito abundante no genoma de
praticamente todas as espécies (COX e MIRKIN, 1997; PUPKO e GRAUR, 1999) fez com
que se tivessem usado num número elevado de trabalhos que visaram numa primeira
fase a sua identificação e caracterização e, posteriormente, a sua aplicação a estudos que
vão desde a cartografia genómica à genética de populações. Informação sobre diversos
milhares destes marcadores nas raças domésticas está disponível na base de dados
Arkdb4.
O processo de identificação e caracterização pode ser levado a cabo através da
construção de bibliotecas genómicas, que envolvem o screening, o isolamento e a
sequenciação dos microssatélites, ou pesquisando em bases de dados obtidas
recentemente através dos programas de sequenciação do genoma de várias espécies (por
exemplo EMBL, GeneBank, etc.). Ao contrário da região repetitiva que é bastante
instável (variável no número de repetições do motivo), as regiões flanqueadoras são
muito conservadas e únicas para cada microssatélite, facto que permite desenhar
iniciadores (primers) para a sua amplificação pela PCR. No caso de espécies diplóides,
a amplificação pela PCR gerará ou um produto simples, se o indivíduo for
homozigótico, ou dois produtos de tamanho diferente, se for heterozigótico. As
pequenas diferenças no tamanho dos microssatélite, normalmente devidas à variação no
número de unidades do motivo de repetição (LEVINSON e GUTMAN, 1987a; VALDES et
al., 1993; KRUGLYAK et al., 1998), são separadas por electroforese em géis de
poliacrilamida desnaturante, idênticos aos utilizados na sequenciação. Hoje em dia está
disponível uma gama variada de técnicas para detecção dos alelos dos microssatélites,
4
Endereço na internet: http://www.thearkdb.org/
47
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
cuja escolha depende principalmente dos recursos económicos a investir (HEYER et al.,
1994; IDURY e CARDON, 1997; CHRISTENSEN et al., 1999; KRISTENSEN et al., 2001).
Das características que fazem dos microssatélites marcadores moleculares de
eleição para uma vasta gama de aplicações destacamos:
-
A sua natureza abundante, dispersa por todo o genoma, em geral muito
polimórfica, apresentando uma gama de alelos que vai do simples bi-alélico
até a algumas dezenas de alelos, e codominante, que torna possível a distinção
entre homozigotos e heterozigotos;
-
A obtenção fácil, podendo ser caracterizados directamente, isolando-os na
espécie alvo, através da construção de uma biblioteca genómica (OSTRANDER
et al., 1992; BUITKAMP et al., 2000), ou usando microssatélites previamente
isolados em espécies relacionadas (MOORE et al., 1991; VAIMAN et al., 1994;
BEAUMONT e BRUFORD, 1999; LUIKART et al., 1999). Mesmo entre espécies
tão afastada como os humanos e os roedores foi possível encontrar uma
elevada conservação nas sequências que flanqueiam os microsatélites
(STALLINGS, 1995).
-
O processamento passível de automatização, através de novos equipamentos e
combinando as características dos microssatélites e as cores dos fluorocromos
disponíveis, sendo possível numa só reacção multiplex de PCR amplificar
mais de uma dezena de loci para 96 indivíduos, de uma só vez, e cujos alelos
podem ser separados e detectados num único gel ou num sistema de capilares.
A maioria dos modelos de equipamento automático possui software de análise
de imagem que permite a leitura e armazenamento automático dos dados
resultantes (BEAUMONT e BRUFORD, 1999).
Apesar das vantagens apontadas, os microssatélites apresentam também algumas
limitações, para as quais se deve estar atento, de forma a ultrapassá-las e que incluem:
- A possibilidade de ocorrência de alelos nulos resultantes da não amplificação de
um ou mais alelos, devido a mutações (substituição, inserção e deleção) dentro da
sequência dos iniciadores (PAETKAU e STROBECK, 1995; PEMBERTON et al.,
1995). Este problema, quando identificado, tem uma resolução fácil que consiste
em desenhar novos iniciadores fora da sequência com a referida alteração,
48
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
contudo, se não for detectado, como em caso da frequência do alelo nulo ser
baixa, pode criar distorção nos resultados obtidos;
- A possibilidade de ocorrência de homoplasia, ou seja, existência de alelos com o
mesmo tamanho mas sequência ligeiramente diferente, logo com uma
ancestralidade diferente, que não será detectada em resultado da forma de
identificação dos alelos assentar na técnica de electroforese e por conseguinte
apenas no tamanho, o que poderá influenciar a interpretação dos resultados
(ESTOUP et al., 2002). Esta possibilidade é mais frequente quando comparamos
subespécies diferentes, ou utilizamos iniciadores numa espécie diferente da qual
foram desenhados (ESTOUP et al., 1995b). Os electromorfos mais longos parecem
conter mais homoplasia do que os menores (PRIMMER et al., 1996).
- A possibilidade de ocorrência de dificuldade na identificação dos alelos devido a
artefactos produzidos pela Taq polimerase utilizada na PCR em resultado de
deslizamento (slippage), quer na produção de bandas sombra (stutter bands), as
quais são mais frequente em microssatélites com motivos mono e dinucleotídeos,
quer pela tendência para incorporar a mais um dATP nos produtos de PCR
(GINOT et al., 1996);
- A dificuldade de comparação de dados obtidos em laboratórios diferentes.
Embora a automatização tenha sido um grande avanço em termos de
genotipagem, ao contrário do que era de supor não eliminou o problema da
comparação de dados, antes pelo contrário, parece ter dificultado essa mesma
comparação, principalmente quando são utilizados equipamentos e químicos
diferentes;
- A possibilidade de ocorrência de alguns problemas quando o DNA utilizado for
de baixa qualidade e quantidade (TABERLET et al., 1996);
- A grande dificuldade no estabelecimento de um modelo evolutivo para os
microssatélites que possa ser aplicado universalmente, tornando difícil a
inferência baseada na distribuição das frequências alélicas, quando o espaço
temporal de divergência entre populações é grande. No entanto, na opinião de
BEAUMONT e BRUFORD (1999), nos estudos que tenham como objectivo analisar a
estrutura populacional com fins de conservação, no qual o presente estudo se
insere, tal problema não é relevante, pois na maioria das situações verificadas a
49
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
divergência genética entre populações próximas estava associada ao efeito de
deriva genética, de bottlenecks ou à de consanguinidade, em oposição à mutação.
Apesar do esforço enorme, espelhado na quantidade de artigos publicados sobre o
assunto, não foi ainda possível estabelecer um modelo consensual relativo ao processo
evolutivo dos microssatélites, uma vez que a detecção de mutações é de rara ocorrência.
Para o efeito, o método mais directo e conclusivo consiste na detecção das mutações
pela sequenciação dos microssatélites num grande número de indivíduos pertencentes a
uma mesma árvore genealógica (YUE et al., 2002). Uma outra abordagem baseia-se
numa análise de comparação entre a distribuição alélica obtida nas populações e uma
outra, teórica, gerada computacionalmente pressupondo um dado modelo evolutivo
(SHRIVER et al., 1993; VALDES et al., 1993; DI RIENZO et al., 1994).
Ao contrário das sequências de DNA não repetitivo que evoluem principalmente
através da acumulação de substituições de nucleótidos, os microssatélites parecem
evoluir através de dois mecanismos principais:
- O deslizamento da Taq polimerase (DNA polymerase slippage) também
designada de "DNA slippage", e "slipped strand misparing" (TAUTZ e RENZ,
1984; LEVINSON e GUTMAN, 1987b; VIGUERA et al., 2001 ; ELLEGREN, 2002),
ou da ineficiência dos mecanismos de reparação (WIERDL et al., 1997);
- A recombinação, podendo esta última afectar o tamanho do microssatélite por
crossing-over desigual (YUE et al., 2002). Sobre este mecanismo há evidências
que apontam em sentido contrário. Em humanos este parece ser pouco
significativo (PAYSEUR e NACHMAN, 2000), enquanto que no género Drosophila
poderá justificar 55% da variância do tamanho dos alelos (SCHUG et al., 1998a).
Destes dois mecanismos, considera-se que o deslizamento da polimerase seja o
predominante pois a instabilidade dos microssatélites é pouco afectada por defeitos em
genes envolvidos na recombinação, mas muito por defeitos em genes envolvidos no
sistema de reparação do DNA (LEVINSON e GUTMAN, 1987b; HENDERSON e PETES,
1992).
A "polymerase slippage" consiste no deslizamento do complexo de proteínas que
realizam a replicação, resultando no acréscimo ou deleção de uma ou mais repetições do
motivo do microssatélite. Durante a síntese de DNA, as duas cadeias podem deslizar
50
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
entre elas e reemparelhar fora do lugar, resultando na formação de uma ansa (loop) não
alinhada, na cadeia DNA nascente, ou na cadeia molde.
Se a replicação terminar sem a reparação destas ansas, o número de repetições na
cadeia nascente será maior (se a ansa for nesta cadeia) ou menor (se a ansa se formar na
cadeia molde) do que a original. A maioria destas ansas é corrigida pelo sistema de
reparação e, portanto, apenas uma pequena fracção escapará e resultará no ganho ou
perda de uma unidade de repetição (EISEN, 1999). Assim, o maior ou menor número de
mutações observadas pode resultar de uma maior ou menor frequência de ocorrência ou
de uma menor ou maior eficácia de reparação.
A taxa de mutação de cada microssatélite é obviamente difícil de determinar, no
entanto, têm sido publicados alguns trabalhos que apontam para valores médios de
mutações/locus/geração da ordem de 1,8x10-3 em tetranucleótidos de humanos (XU et
al., 2000), 9,3 x 10-6 em dinucleótidos em drosofilas (SCHUG et al., 1998b), 1,1 x 10-4
em dinucleótidos de ovinos (CRAWFORD e CUTHBERTSON, 1996) e 7.52×10-5 em
dinucleótidos de suínos (YUE et al., 2002).
A grande maioria das mutações nos microssatélites consiste num ganho ou perda
de um ou, menos frequentemente, de dois motivos de repetição (SHRIVER et al., 1993;
VALDES et al., 1993; DI RIENZO et al., 1994; PRIMMER et al., 1996; XU et al., 2000) são
mais raras e mais difíceis de inferir, porque as mutações mesmo para os microssatélites
são raras. No entanto, pela distribuição alélica dos microssatélites verificou-se que nem
sempre o tamanho dos alelos difere de um número inteiro de unidades de repetição,
sugerindo outras formas de ocorrência de mutação. A sequenciação dos alelos revelou a
ocorrência de inserções e delecções nas regiões próximas do microssatélite
propriamente dito, especialmente nas bases adjacentes (GRIMALDI e CROUAU-ROY,
1997), quando se comparou espécies diferentes (FITZSIMMONS et al., 1995; GARZA et
al., 1995; ANGERS e BERNATCHEZ, 1997) e mais raramente dentro da mesma espécie
(GRIMALDI e CROUAU-ROY, 1997).
A análise da distribuição das frequências alélicas nas populações mostrou uma
distorção em favor dos alelos de maior tamanho (FARRALL e WEEKS, 1998). Por sua
vez, no estudo da distribuição das mutações em termos de frequência de ganhos ou
perdas de motivos de repetição, alguns autores encontraram, em eucariontes, um
enviesamento a favor da expansão (AMOS et al., 1996; PRIMMER et al., 1996; YUE et al.,
51
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
2002), enquanto, em bactérias, tal enviesamento apontava em sentido oposto, ou seja,
para a contracção de tamanho (METZGAR et al., 2002). Por seu lado, XU et al. (2000)
num estudo em tetranucleótidos, verificaram que o enviesamento num sentido ou no
outro dependia do tamanho do alelo. Para microssatélites “jovens” que evoluiram a
partir de alelos curtos e não atingiram o equilíbrio, observaram um enviesamento para a
expansão. Para descrição dos resultados formularam um conjunto de postulados que se
compatibilizavam com os seus resultados:
- A taxa de expansão é constante para todos os alelos;
- A taxa de contracção aumenta exponencialmente com o número de repetições do
motivo do microssatélite;
- O resultado global da taxa de expansão e contracção é igual. As mutações nos
alelos mais curtos do que o tamanho crítico, são enviesadas para a expansão, enquanto
que as mutações nos alelos longos favorecem a contracção, resultando numa
distribuição dos alelos em equilíbrio em forma de sino, com a moda igual ao tamanho
crítico.
Estes postulados explicariam o facto de parecer haver um constrangimento de
tamanho, ou seja, de existir um tamanho de microssatélite que não vai para além de 3 ou
4 dezenas de motivos de repetição.
Com efeito, foram encontradas diferenças significativas no tamanho dos alelos de
loci homólogos entre humanos e chimpanzés (RUBINSZTEIN et al., 1995), todavia
GORTARI et al. (1997) não descobriram tais diferenças na comparação entre ovinos e
bovinos. Por seu lado, ELLEGREN et al. (1997) ao efectuarem uma comparação recíproca
de loci homólogos entre ovinos e caprinos, verificaram que o comprimento dos alelos
era maior para a espécie onde o microssatélite tinha sido isolado, concluindo que era o
processo de clonagem e caracterização dos microssatélites que determinava a distorção
num sentido ou noutro. No entanto, KRUGLYAK et al. (1998) estimaram taxas de
deslizamento da polimerase diferentes entre espécies, com valores maiores nos ratos,
seguidos dos humanos e, por último, leveduras e drosófilas.
WEBER e WONG (1993), por seu turno, observaram que microssatélites
tetranucleótidos em humanos apresentaram uma taxa de mutação superior aos di e
trinucleótidos, mas trabalhos mais recentes sugerem o oposto; isto é, que a taxa de
52
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
mutação está inversamente correlacionada com o tamanho do motivo de repetição
(CHAKRABORTY et al., 1997; KRUGLYAK et al., 1998; SCHUG et al., 1998b).
Por outro lado, a presença de interrupções e/ou a existência de mais do que um
motivo de repetição parecem estabilizar o microssatélite independentemente do motivo
de repetição base (GOLDSTEIN e CLARK, 1995), talvez devido à redução da
probabilidade de maus alinhamentos (SIA et al., 2001). PALSBOLL et al. (1999)
referiram que a riqueza alélica e a heterozigotia eram maiores nos microssatélites
imperfeitos relativamente aos perfeitos. Por sua vez, YUE et al. (2002) descobriram que
a taxa de mutação dos microssatélites compostos era cerca de 4 vezes maior do que a
dos perfeitos, apesar de estes serem ligeiramente maiores do que os primeiros e portanto
este aspecto poder também ter influenciado o resultado obtido.
Alguns trabalhos apontam para que a taxa de recombinação da região onde se
localiza o microssatélite possa influenciar a sua taxa de mutação, uma vez que foi
observada uma correlação significativa entre este factor e o polimorfismo de
microssatélites dinucleótidos (SCHUG et al., 1998a). No entanto, outros autores não
encontraram tal relação (YUE et al., 2002). Indicações contraditórias foram também
obtidas quanto à possível influência da composição nucleotídica da região flanqueadora.
GLENN et al. (1996) referem uma correlação significativa negativa entre o conteúdo em
GC da região flanqueadora enquanto outros autores não observaram tal correspondência
(BALLOUX et al., 1998; BACHTROG et al., 1999).
Alguns autores referiram que a taxa de mutação dos mesmos microssatélites
diferia com o sexo, sendo maior nos homens do que nas mulheres (WEBER e WONG,
1993; BRINKMANN et al., 1998; XU et al., 2000) enquanto outros não observaram tal
diferença (DEKA et al., 1999), tendo apenas detectado diferenças no tipo de mutação,
com predominância nos homens para a contracção de tamanho e nas mulheres para a
expansão.
Assim, parece que o processo evolutivo dos microssatélites é extremamente
complexo e específico, passível de ser influenciado por numerosos factores como: o
tamanho e composição do motivo do microssatélite; o número de repetições do motivo
do microssatélite; o tipo ou a estrutura da repetição (perfeita, composta ou
interrompida); a natureza da região flanqueadora, a condição dos alelos (heterozigótico,
53
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
homozigótico); a taxa de recombinação da região onde se localiza o microssatélite, e os
grupos taxonómicos (ELLEGREN, 2000b; SCHLOTTERER, 2000).
Modelos para o processo mutacional dos microssatélites
Como se depreende, a complexidade do processo de mutação dos microssatélites
atrás exposto e o fenómeno de homoplasia (ESTOUP et al., 1995b), não detectável na
prática, originam desvios à relação de linearidade com o tempo e à sub-estimativa no
cálculo de distâncias genéticas, respectivamente, aquando do estudo da diferenciação
das populações (GOLDSTEIN et al., 1995a, b; LINARES, 1999). Assim, perante a
necessidade de ter em conta este tipo de problema durante a realização de estudos
evolutivos, foram sugeridos vários modelos para descrever o processo mutacional dos
microssatélites de forma a incorporar a informação disponível (JARNE e LAGODA, 1996).
Os modelos mais divulgados são os quatro que de seguida se descrevem
resumidamente:
O Infinite Allele Model - IAM, (KIMURA e CROW, 1964), assume que cada
mutação gera sempre, pela perda ou por ganho de qualquer número de unidades de
repetição, um alelo que não existe na população, implicando que alelos idênticos
partilhem a mesma ascendência, designando-os como alelos idênticos por ascendência.
Neste modelo, uma maior proximidade de tamanho entre dois alelos não significa maior
proximidade evolutiva.
O K-Allele Model – KAM (CROW e KIMURA, 1970), preconiza a existência de
exactamente k alelos possíveis, cada um tendo uma probabilidade constante [μ/(k-1)] de
mutar para os restantes k-1 alelos. Este modelo tem em conta a possibilidade de
ocorrência de homoplasia, ou seja, alelos que são idênticos em estado mas que não o são
por ascendência (BALLOUX e LUGON-MOULIN, 2002). No entanto, pode ocorrer
homoplasia na própria técnica de identificação dos alelos já que estes podem ter o
mesmo tamanho mas não serem constituídos pela mesma sequência e, portanto, não
serem idênticos por ascendência. Quando k é infinito transforma-se no modelo IAM.
O Step Mutation Model – SMM (OHTA e KIMURA, 1973; KIMURA e OHTA, 1975;
KIMURA e OHTA, 1978), assume que cada mutação gera um alelo, pela perda ou pelo
ganho de uma única unidade de repetição, podendo dar origem a alelos já existentes na
população, considerando também a possibilidade de eventuais fenómenos de
54
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
homoplasia. Consequentemente, admite-se que alelos de tamanho muito diferente estão
menos relacionados do que os que têm um tamanho próximo (BALLOUX e LUGONMOULIN, 2002).
O Two Phase Model – TPM (DI RIENZO et al., 1994), é uma extensão do SMM e
parte do princípio segundo o qual os alelos dos microssatélites são gerados pela perda
ou ganho de uma ou mais unidades de repetição.
Além destes, outros modelos incorporaram os constrangimentos do tamanho dos
alelos estabelecendo que alelos grandes tendem a mutar por encurtamento e os pequenos
por alongamento do número de repetições (GARZA et al., 1995); consideraram, também,
limites no tamanho dos alelos e descreveram a dinâmica esperada num locus com
mutação do tipo SMM e com um número restrito de alelos (NAUTA e WEISSING, 1996;
FELDMAN et al., 1997); incluíram, ainda, a possibilidade de alterações do tamanho do
alelo por multi-etapas e por distorção direccional (KIMMEL e CHAKRABORTY, 1996;
KIMMEL et al., 1996), etc.
Apesar de, teoricamente, ser possível conceber modelos mais realísticos, eles
seriam na prática intratáveis analiticamente, além de ser questionável a sua utilidade
devido à variação do processo mutacional entre loci e entre espécies (BALLOUX e
LUGON-MOULIN, 2002). Na verdade, os vários estudos sobre a adequação de cada um
destes modelos têm apresentado resultados díspares, quer os que assentam na detecção
directa de mutações, quer os que usam a comparação entre as distribuições alélicas de
microssatélites observadas e as esperadas, reflectindo, mais uma vez, a complexidade do
processo mutacional dos microssatélites (VALDES et al., 1993; WIERDL et al., 1997; DI
RIENZO et al., 1998).
Esta dificuldade de modelação do processo mutacional dos microssatélites parece,
contudo, não ter constrangido o uso dos mesmos. Enquanto a sua utilização para mapear
genes não apresenta qualquer limitação, o seu uso em estudos filogenéticos deve ser
cuidadoso, principalmente quando o tempo de divergência entre as populações em causa
for muito grande (TAKEZAKI e NEI, 1996; LINARES, 1999). Todavia, os microssatélites
têm fornecido numa vasta gama de aplicações como marcadores moleculares,
nomeadamente: em mapeamento genético (GALLOWAY et al., 1996; IHARA et al., 2004),
em ecologia e em conservação de populações em risco (MAUDET et al., 2004), em
hibridação e estruturação populacional (JORDE et al., 1997; MACHUGH et al., 1997;
55
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
ANGERS e BERNATCHEZ, 1998) e em identificação individual − rastreabilidade e
paternidade (BEAUMONT e BRUFORD, 1999), etc.
Papel funcional dos microssatélites
Os microssatélites fazem parte do que então se designou como DNA lixo (junk
DNA) (JURKA, 1998), ou DNA neutro não codificador; no entanto, a prova da sua
abundância e localização no genoma de forma não aleatória, por vezes perto de regiões
codificadoras e até dentro destas, fez com que se colocasse a hipótese de os mesmos
desempenharem algum papel funcional, aspecto bem patente nas revisões de SHAPIRO e
VON
STERNBERG (2005) e KASHI e SOLLER (1999). Já em 1997, SAWYER et al. haviam
apontado um exemplo de associação directa de uma sequência de microssatélite com a
habilidade de drosófilas manterem um período circadiano em temperaturas diferentes.
BRINKMANN et al. (1998) também sugeriram que algumas bactérias, nomeadamente a
Neiseria gonorrhoeae, usam os microssatélites contidos num determinado tipo de genes
denominados "genes de contingência" para alterarem o seu perfil de antigénios de
membrana e assim iludirem o sistema imunitário do hospedeiro. Trabalhos recentes
também têm vindo a associar a variação alélica do tamanho de alguns microssatélites,
concretamente a expansão de trímeros e tetrameros, à susceptibilidade a determinadas
doenças tais como as doenças de Huntington's e de Steiner (distrofia miotónica), certos
tipos de ataxia espinocerebelosa e outras (SUBRAMANIAN et al., 2003; ZHANG et al.,
2004).
Com base na informação disponível, e numa tentativa de sistematizar
conhecimentos, podemos classificar o papel funcional atribuído a alguns microssatélites
em:
-
Função codificante, se o polimorfismo do microssatélite no exão determina
variação do tamanho de homopolímeros de aminoácidos (caso dos tripletos)
da proteína, com alteração da sua funcionalidade ou simplesmente a supressão
versus produção de uma determinada proteína. Como exemplo do primeiro
caso é de assinalar o número anormalmente elevado de glutamina na proteína
huntingtinana determinante da doença de Huntington's e, para o segundo, os
denominados “genes de contingência” em procariotas (LIU et al., 1999;
ESCHER et al., 2000).
56
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
-
Função reguladora, uma vez que foi detectada a capacidade, variável com o
número de repetições, de alguns microssatélites aumentarem ou diminuirem a
transcrição dos genes, deduzida pela ligação destes a proteínas, como é
característico das sequências activadoras upstream ou da actuação de
elementos cis-reguladores que controlam a expressão génica através da ligação
de factores de transcrição, ou pela formação de estrutura secundária de DNA
(nomeadamente Z-DNA) (HAMADA et al., 1984; LI et al., 2002b; HAMMOCK e
YOUNG, 2004; LI et al., 2004; NIKITINA e NAZARENKO, 2004), (ROTHENBURG
et al., 2001; IGLESIAS et al., 2004). Um maior número de repetições também
foi correlacionado com uma maior activação da transcrição pela proteína p53
relacionada com a supressão de tumores (CONTENTE et al., 2002).
-
Função estrutural, pelo papel no alinhamento dos cromossomas homólogos
durante a meiose (PARDUE et al., 1987), no arranjo e empacotamento do DNA
nos cromossomas eucarióticos (GROSS e GARRARD, 1986), na recombinação
(WAHLS et al., 1990) e na criação de sinais de posição nos nucleossomas
(WANG e GRIFFITH, 1995).
Por último, a combinação da taxa de mutação elevada e as funções
reguladora/codificadora levantam a possibilidade de os microssatélites serem a maior
fonte de variação genética eucariótica (KASHI et al., 1997; IGLESIAS et al., 2004;
SHAPIRO e VON STERNBERG, 2005).
1.4.3.3. Comparação entre os vários marcadores
Na escolha dos marcadores moleculares devem ser ponderados por um lado, o
procedimento ou a técnica de genotipagem (o mais simples possível e de baixo custo) e
por outro, de acordo com o objectivo do trabalho e portanto do tipo de análise estatística
a efectuar, as características intrínsecas de cada marcador, como a relação de
dominância, o conteúdo informativo, a neutralidade selectiva, a posição no mapa
genético ou independência genética do marcador e a fiabilidade da informação, entre
outras (VIGNAL et al., 2002).
Atendendo a que as vantagens e os inconvenientes de cada técnica de
genotipagem foram já discutidos na descrição individual dos marcadores, interessa
agora confrontar as características intrínsecas de cada um deles, aspecto que tem sido
57
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
alvo de vários estudos recentes (XIONG e JIN, 1999; GERBER et al., 2000; LOUGHEED et
al., 2000; CAMPBELL et al., 2003; OHASHI e TOKUNAGA, 2003; HERRAEZA et al., 2005)
(LEAL, 2003).
A comparação do desempenho de vários marcadores em diversas aplicações,
mostrou que os microssatélites revelaram:
-
Um poder de exclusão em testes de paternidade superior ao dos AFLPs
(GERBER et al., 2000) e dos SNPs (HERRAEZA et al., 2005);
-
Um poder informativo em estudos de desequilíbrio de ligação e mapeamento
genético superior ao dos SNPs (LEAL, 2003; OHASHI e TOKUNAGA, 2003);
-
Uma eficiência na detecção de estruturação de populações muito próximas,
superior à dos RAPDs (LOUGHEED et al., 2000);
-
Um poder informativo maior, na inferência da ancestralidade de indivíduos,
quando se confrontou uma amostra aleatória de microssatélites com uma de
SNPs (ROSENBERG e KUMAR, 2003; THALAMUTHU et al., 2005)
Num estudo baseado na informação de 328 microssatélites e 15840 SNPs em 236
indivíduos de diferentes etnias humanas não aparentados, LIU et al. (2005) verificaram
que os microssatélites apresentavam um conteúdo informativo, em média, 4 a12 vezes
maior do que os SNPs amostrados aleatoriamente. No entanto, quando era fixado um
mesmo número dos marcadores dos dois tipos mais informativos, os SNPs foram mais
eficientes na atribuição dos indivíduos às etnias, utilizando o programa “Structure”
(PRITCHARD et al., 2000).
VIGNAL et al. (2002) referem mesmo que, em resultado dos progressos que se têm
vindo a observar nas metodologias de caracterização e genotipagem de SNPs, num
futuro próximo será possível gerar uma quantidade de informação igual à obtida com os
microssatélites. Contudo, tal afirmação ao não assentar em características intrínsecas
dos SNPs, e pressupondo que as técnicas de genotipagem apenas evoluirão para os
SNPs, o que não faz sentido uma vez que a tecnologia de microarrays também é
aplicável aos microssatélites (RADTKEY et al., 2000), em nosso entender não desvaloriza
os microssatélites como marcadores genéticos.
Por último, embora o estudo de BAUMUNG et al. (2004) não tenha utilizado uma
amostragem aleatória, podendo, por isso, sofrer de algum enviesamento, revelou
58
Capítulo 1 – Raças portuguesas de ovinos e marcadores de DNA
claramente que, em 90% dos projectos com vista à caracterização da diversidade
genética de raças de animais domésticos, foram usados os microssatélites como
marcadores genéticos, contra 29% para marcadores bioquímicos tais como proteínas,
17% para os RFLPs e apenas 12% para os SNPs.
59
Capítulo 2 - Metodologia para a obtenção da informação alélica de microssatélites nas raças ovinas Portuguesas
CAPÍTULO 2 - METODOLOGIA PARA A OBTENÇÃO
DA INFORMAÇÃO ALÉLICA DE MICROSSATÉLITES
NAS RAÇAS OVINAS PORTUGUESAS
O delineamento experimental deste trabalho teve em consideração as
recomendações da FAO, a fim de permitir o enquadramento dos nossos resultados no
âmbito de um projecto mais vasto, o “Projecto Global para a Conservação da
Diversidade Genética dos Animais Domésticos” (FAO, 1995, 1998a, b), coordenado por
aquela instituição. O detalhe de tal projecto encontra-se disponível na Internet num
sistema informativo designado de DAD-IS5 (Domestic Animal Diversity – Information
System).
A metodologia adoptada consistiu basicamente nos seguintes pontos:
1) Recolha criteriosa de amostras de material biológico – preferencialmente sangue –
provenientes de cerca de 50 animais, não aparentados, em número equivalente para
ambos os sexos, pertencentes a diferentes populações (raças) e dispersos
geograficamente. Procurou-se que estes animais abrangessem a variabilidade da
raça, mas tendo o cuidado de minimizar a probabilidade da inclusão de animais que
se afastavam do padrão de raça “pura”. Animais que se soubesse terem resultado de
um cruzamento deliberado entre raças foram excluídos. Igual procedimento foi
tomado para os animais que apresentassem sintomas óbvios de doença ou infecção.
A amostra não devia exceder 10% dos indivíduos de cada um dos rebanhos ou dos
animais existentes numa localidade;
2) Extracção de DNA a partir das amostras obtidas – realizando uma lise das hemácias
com um tampão contendo NH4Cl, KHCO3, EDTA, isolando os leucócitos por
centrifugação subsequente, seguida pela lise e digestão com proteinase K numa
solução contendo Trizma base, EDTA e SDS. O procedimento seguinte constou de
duas extracções, uma por fenol em tampão Tris saturado com fenol e outra por
clorofórmio. Por último, o DNA foi isolado através da adição de etanol a 95%,
sendo o precipitado resultante removido com uma ansa e dissolvido num tampão.
Em alternativa à extracção com fenol/clorofórmio (solventes orgânicos tóxicos), a
precipitação da proteína foi realizada com NaCl, opção que tem sido seguida
5
Endereço de internet: http://www.fao.org/dad-is.
61
Capítulo 2 - Metodologia para a obtenção da informação alélica de microssatélites nas raças ovinas Portuguesas
noutros estudos. Não se recomendou o usos de kits comerciais de extracção, por a
quantidade e a qualidade do DNA obtido não ser adequada para os estudos a realizar
e, normalmente envolverem custos elevados.
3) Caracterização da diversidade genética das populações com recurso a marcadores
genéticos, especificamente os microssatélites. De entre estes, foram preferidos os
que apresentassem um número de alelos entre 4 a 10 identificáveis sem
ambiguidade, amplificassem pela PCR de forma robusta e em espécies relacionadas,
mostrassem potencialidade para serem amplificados simultaneamente com outros
microssatélites (reacção multiplex), não se encontrassem ligados entre si, sobre os
quais existisse informação prévia relevante e não fossem patenteados, ou seja,
permitissem o livre acesso.
4) Análise estatística dos dados – tarefa que envolveu o cálculo de frequências alélicas
e valores de heterozigotia, a análise do desvio do Equilíbrio de Hardy-Weinberg, o
cálculo de várias distâncias genéticas e a construção de dendogramas respectivos,
assim como uma análise multivariada.
2.1. MATERIAL BIOLÓGICO
No presente estudo foram amostrados cerca de 50 animais de cada uma das raças
portuguesas de ovinos, número referido como o melhor compromisso entre a necessária
precisão estatística e a boa gestão dos recursos financeiros (MACHUGH, 1996; FAO,
1998a). As raças em causa foram a Churra Algarvia (CA), Churra Badana (CB), Churra
do Campo (CC), Churra Galega Bragançana (CGB), Churra Galega Mirandesa (CGM),
Bordaleira Entre Douro e Minho (BEDM), Churra Mondegueira (CM), Campaniça
(CMP), Churra da Terra Quente (CTQ), Merina Branca (MB), Merina da Beira Baixa
(MBB), Merina Preta (MP), Serra da Estrela (SE) e Saloia (SL).
Para o efeito, contou-se com o auxílio das Associações de Criadores das
respectivas raças, quando existentes, ou com o dos Técnicos de Direcções Regionais de
Agricultura, como foi o caso das raças BEDM e CC. Após a explanação dos objectivos
deste estudo e dos critérios de amostragem recomendados, aqueles acompanharam-nos
junto dos produtores por eles seleccionados, estabelecendo uma interface com a nossa
equipa e orientando conjuntamente a escolha dos animais a amostrar. Sempre que se
62
Capítulo 2 - Metodologia para a obtenção da informação alélica de microssatélites nas raças ovinas Portuguesas
verificou a existência de livro genealógico da raça, procedeu-se à escolha de animais
registados; na sua ausência, contámos com a experiência dos técnicos referidos para a
selecção dos animais mais representativos da raça. Foram escolhidos, no máximo, 4
animais por rebanho (dois machos e duas fêmeas), com excepção das raças CC, CMP e
MBB pois foram poucos os rebanhos disponíveis para amostrar nestas últimas.
Contudo, os rebanhos da CMP e MBB tinham o efectivo muito elevado pelo que o
número de animais em cada rebanho se situou sempre muito abaixo dos 10%. No caso
da CC, e devido à sua raridade, amostrámos todos os animais que no entender dos
técnicos reuniam as características da raça, não havendo qualquer garantia quanto ao
seu parentesco nem sobre eventuais cruzamentos anteriores. Nas raças em que a
genealogia dos animais era conhecida, estes foram escolhidos minimizando o seu
parentesco, caso contrário foram seleccionados aleatoriamente machos mais novos do
que as fêmeas, pois é frequente os pastores escolherem as mães dos futuros carneiros,
tentando evitar, assim, a possibilidade de escolher mãe e filho. Devido ao reduzido uso
da inseminação artificial nas raças ovinas portuguesas, a paternidade dos animais é um
dado pouco fiável, pelo que não foi possível garantir a ausência de parentesco entre
alguns dos animais.
No momento da recolha das amostras, e para a maioria dos animais, procedeu-se à
fotografia face a uma escala métrica de referência e à recolha de informação relativa aos
mesmos e ao rebanho de origem. A dispersão e o número dos animais estudados por
raça constam da Tabela 2.
As amostras de sangue dos animais foram recolhidas por punção venosa da
jugular, em tubos de vácuo estéreis de 9 ml (VACUETTE®) heparinizados, após o que
se procedeu a uma ligeira agitação, etiquetagem, acondicionamento em malas térmicas
com placas de gelo para transporte e posterior armazenamento a 4 ºC até à extracção do
DNA, processo realizado, normalmente, nas 24 horas seguintes à recolha.
63
Capítulo 2 - Metodologia para a obtenção da informação alélica de microssatélites nas raças ovinas Portuguesas
Tabela 2. Resumo do processo de amostragem.
Dispersão geográfica aa
amostragem
Associações
de criadores
Raças
e Dir. Reg. de
Agricultura
Distritos
Concelhos
BEDM
DRAEDM
1
3
11
16
CA
ASCAL
1
4
10
CB
DRATM
1
3
CC
DRABI
1
CGB
ACOB
CGM
Animais amostrados
Freguesias Lugares Explorações
Machos
Fêmeas
23
13
32
13
14
16
38
7
7
10
23
27
2
3
4
4
2
29
1
3
12
13
26
23
27
ACCGM
1
2
9
12
20
20
31
CM
COVICÔA
1
7
14
15
17
21
29
CMP
ACOS
2
4
6
6
6
22
32
CTQ
ANCOTEQ
2
7
21
24
26
32
30
MB
ANCORME
3
11
16
20
20
32
30
MBB
OVIBEIRA
1
2
6
7
7
27
26
MP
ANCORME
3
8
8
10
10
23
29
SE
ANCOSE
3
3
10
13
17
31
22
SL
ARCOLSA
2
4
7
13
13
23
27
23
63
140
173
213
308
409
e ACORO
SOMA
2.2. EXTRACÇÃO DE DNA
Por questões de ordem prática, as amostras recolhidas no Norte e Centro do país
foram processadas no laboratório de Fisiologia Animal na UTAD, enquanto que as
obtidas na zona Sul foram no Laboratório de Genética Molecular do Departamento de
Biotecnologia do INETI (instituição integrante do projecto de investigação que
financiou este estudo).
A extracção de DNA foi baseada no método salino de MONTGOMERY e SISE
(1990) (Anexo 1) o qual, ao contrário dos protocolos clássicos, tem a vantagem de não
fazer uso de fenol, uma substância tóxica e corrosiva.
A concentração e a qualidade do DNA foram determinadas pela metodologia
clássica de espectrofotometria, com base na leitura da absorvência a 260 nm (A260) e
280 nm (A280) de uma solução constituída por 5 μl da solução base de DNA a medir e
995 μl de tampão TE, utilizando como “branco” 1 ml de tampão TE. O valor de A260 foi
64
Capítulo 2 - Metodologia para a obtenção da informação alélica de microssatélites nas raças ovinas Portuguesas
multiplicado por 50 para se obter a concentração de DNA em μg/ml e o valor do rácio
A260/A280 usado como indicativo da qualidade.
Posteriormente, a solução base de DNA foi dividida em duas alíquotas, uma
destinada a estabelecer um banco de DNA congelado a –20 ºC e a outra mantida a 5 ºC,
para ser utilizada no decurso do estudo. A partir desta última foram elaboradas as
soluções de trabalho, à concentração de 50 μg/ml, destinadas às reacções de PCR.
2.3. ESTUDO DO POLIMORFISMO DOS MICROSSATÉLITES
Esta fase do trabalho foi iniciada na Unidade de Biologia Molecular do
Departamento de Bioquímica da Universidade de Otago (Nova Zelândia) onde, sob
orientação do Doutor Allan M. Crawford (consultor da FAO), permanecemos no
período compreendido entre 15 de Setembro e 12 de Dezembro de 1997, e
posteriormente continuada no Laboratório de Fisiologia Animal (UTAD), com as
necessárias adaptações dos métodos aos meios aqui disponíveis.
A informação relativa aos 20 microssatélites que utilizámos é apresentada na
Tabela 3. A escolha de tais microssatélites baseou-se na optimização de condições de
análise obtida no laboratório neozelandês, sendo cerca de metade coincidentes com os
recomendados pela FAO (FAO, 1998c) uma vez que a prioridade dada aos marcadores
já implementados em determinados laboratórios é uma prática corrente neste tipo de
estudos, como foi revelado pelo recente relatório da FAO (FAO, 2004). Os primeiros 6
microssatélites foram isolados em bovinos (BM1824, BM4621, BM6444, BM6506 e
ETH225) e os restantes em ovinos.
Na Nova Zelândia, a visualização das bandas alélicas foi realizada em radiografias
utilizando um método radioactivo, pelo qual um dos primers foi marcado previamente
numa reacção envolvendo [℘-33P]ATP radioactivo e a enzima T4 polinucleótido
cinase (Anexo 1). Na reacção de PCR, para cada amostra, foram utilizados como molde
cerca de 100 ng de DNA, num volume de reacção final de 12 μl. Os constituintes de
reacção (concentração final aproximada indicada entre parênteses) foram: dNTPs (20
μM), Tris pH 8,80 (45 mM), (NH4)2SO4 (11 mM), MgCl2 (4,5 mM), 2´β-
Mercaptoetanol (6,7 mM), EDTA (4,5 mM), Espermidina (0,25 mM), Seroalbumina
Bovina (2 μg/μl) e Red Hot DNA Polimerase (0,25 U/μl).
65
Capítulo 2 - Metodologia para a obtenção da informação alélica de microssatélites nas raças ovinas Portuguesas
Tabela 3. Informação sobre os microssatélites utilizados.
Loci
Primers (5’-3’)
CR T. (°C) Acesso *
BM1824
GAGCAAGGTGTTTTTCCAATC
1
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54
G18455
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M80358
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(1992)
3
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SWARBRICK et al. (1990)
6
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L38982
HULME et al. (1995)
4
--
L39828
HULME et al. (1996)
1
60
L34279
HULME et al. (1994)
21
63
U15695
EDE et al. (1995)
3
63
U15699
EDE et al. (1995)
17
63
U15702
EDE et al. (1995)
2
63
L01531
BUCHANAN e CRAWFORD
(1993)
2
60
L01532
BUCHANAN e CRAWFORD
(1993)
2
55
L20004
BUCHANAN et al. (1994b)
19
63
L01535
BUCHANAN e CRAWFORD
(1993)
17
55
M82875
BUCHANAN et al. (1994b)
4
55
L12558
HENRY et al. (1993)
Referência
CATTCTCCAACTGCTTCCTTG
BM4621
CAAATTGACTTATCCTTGGCTG
TGTAACATATGGGCTGCATC
BM6444
CTCTGGGTACAACACTGAGTCC
TAGAGAGTTTCCCTGTCCATCC
BM6506
GCACGTGGTAAAGAGATGGC
AGCAACTTGAGCATGGCAC
BM757
TGGAAACAATGTAAACCTGGG
TTGAGCCACCAAGGAACC
ETH225
GATCACCTTGCCACTATTTCCT
ACATGACAGCCAGCTGCTACT
MAF209
TCATGCACTTAAGTATGTAGGATGCTG
GATCACAAAAAGTTGGATACAACCGTGG
MAF23
GTGGAGGAATCTTGACTTGTGATAG
GGCTATAGTCCATGGAGTCGCAG
MCM214
AAGCGACTCAGGAGCAGCAG
AATGCTTGCATTTATCAAAAGCC
MCM218
GATCCTAGCATCAGTCTCCAGATG
CACTAAAAGCTTATGAAAGTTCCAGC
MCM357
ATCTCTTTGCTCACCAATTAAGCA
CCTGAGAAAACATTGAGTGTGCG
OarCP20
GATCCCCTGGAGGAGGAAACGG
GGCATTTCATGGCTTTAGCAGG
OarCP34
GCTGAACAATGTGATATGTTCAGG
GGGACAATACTGTCTTAGATGCTGC
OarCP49
CAGACACGGCTTAGCAACTAAACGC
GTGGGGATGAATAATCCTTCATAAGG
OarFCB11
GGCCTGAACTCACAGTTGATATATCTATCAC
GCAAGCAGGTTCTTTACCACTAGCACC
OarFCB128
CAGCTGAGCAACTAAGACATACATGCG
ATTAAAGCATCTTCTCTTTATTTCCTCGC
OarFCB20
AAATGTGTTTAAGATTCCATACAGTG
GGAAAACCCCCATATATACCTATAC
OarFCB304
CCCTAGGAGCTTTCAATAAAGAATCGG
CGCTGCTGTCAACTGGGTCAGGG
OarFCB48
GAGTTAGTACAAGGATGACAAGAGGCAC
OarHH64
CGTTCCCTCACTATGGAAAGTTATATATGC
GACTCTAGAGGATCGCAAAGAACCAG
CACTCTATTGTAAGAATTTGAATGAGAGC
* – Número de acesso para o GenBank
CR- Cromossoma
Mais informações em http://www1.angis.org.au/jmaddox/cgi-bin/marker.pl
O DNA e o "cocktail" de PCR foram acondicionados em placas apropriadas com
96 poços e cobertos com uma gota de parafina líquida para prevenir uma possível
evaporação. Foram também incluídos, como referência e nas extremidades, duas
amostras de DNA provenientes de animais com genótipo conhecido.
66
Capítulo 2 - Metodologia para a obtenção da informação alélica de microssatélites nas raças ovinas Portuguesas
Apesar da temperatura de ligação ser variável com o microssatélite (Tabela 3), a
PCR foi realizada num termociclador, utilizando o mesmo programa térmico de
amplificação para todos eles, o que constituiu uma vantagem prática. Tal programa
térmico consistiu em:
3 ciclos
95 ºC durante 45 s
60 ºC durante 1min
3 ciclos
95 ºC durante 45 s
57 ºC durante 1min
3 ciclos
95 ºC durante 45 s
54 ºC durante 1min
3 ciclos
95 ºC durante 45 s
51 ºC durante 1min
20 ciclos
95 ºC durante 45 s
48 ºC durante 1min
Ao produto de PCR obtido foram adicionados 10 µl de corante contendo
formamida, procedendo-se de seguida à sua desnaturação a 95 ºC, durante 3 minutos
num termociclador.
A electroforese foi realizada em gel de poliacrilamida (6%) desnaturante (ureia
8M), sob voltagem constante de 1000 V e durante um período variável consoante o
microssatélite. As amostras dos dois animais de referência foram sempre colocadas nas
extremidades do gel. O detalhe do procedimento relativo à electroforese consta do
Anexo1.
Terminada a electroforese, a etapa seguinte consistiu na transferência do gel para
uma folha de papel de filtro, seco em secador próprio para o efeito e em local escuro
colocado dentro de uma caixa adequada, juntamente com uma película de radiografia,
onde permanecia cerca de 18h para que o mesmo fosse impregnado.
Após a revelação da película, as bandas de DNA foram identificadas visualmente
tendo como referência o tamanho das bandas da primeira e da última amostra com
genótipo previamente conhecido (Figura 8).
OarFCB128
C1
C2
127 pb
113 pb
113 pb
Figura 8. Exemplo de imagem de um gel para o microssatélite OarFCB128, obtida pela técnica de
primers marcados com P33 radioactivo. (C1 e C2 são controlos com tamanho conhecido).
Esta fase do trabalho, ainda iniciada no laboratório neozelandês, foi completada
no Laboratório de Fisiologia da UTAD. A adaptação metodológica mais relevante
consistiu na utilização de primers não marcados e na detecção das bandas de DNA pela
67
Capítulo 2 - Metodologia para a obtenção da informação alélica de microssatélites nas raças ovinas Portuguesas
revelação com nitrato de prata (Anexo1), decorrente da impossibilidade de uso de
marcação radioactiva por carência de instalações próprias. Esta técnica de revelação
apresentou os resultados melhores com a utilização do Kit Silver SequenceTM
(Promega).
As imagens obtidas após revelação dos géis foram captadas pelo sistema de
análise de géis BioCapture da Vilber Lourmat e guardadas em formato digital, sendo de
realçar a semelhança na qualidade da discriminação das bandas com a obtida pela
técnica de marcação radioactiva (Figura 9).
OarFCB128
C1
C2
127 pb
123 pb
125 pb
123 pb
Figura 9. Exemplo de imagem de um gel para o microssatélite OarFCB128, obtida pela técnica de
primers não marcados e revelação com nitrato de prata. (C1 e C2 são controlos com tamanho
conhecido).
À semelhança do método radioactivo, procedeu-se de seguida à leitura visual do
gel tendo como referência o tamanho das bandas dos animais controlo. Em qualquer dos
casos, os dados obtidos foram organizados numa folha de cálculo do programa Excel,
resultando numa matriz de genótipos (2 alelos) constituída por 717 linhas (animais) e
por 20 colunas (microssatélites), com o objectivo de tornar fácil a conversão em formato
de ficheiro de entrada compatível com os diversos programas estatísticos utilizados
neste estudo e que, para uma maior clareza de exposição, optámos por descrever no
capítulo respectivo.
68
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
CAPÍTULO 3 - CARACTERIZAÇÃO DA DIVERSIDADE
GENÉTICA DAS RAÇAS OVINAS PORTUGUESAS
3.1. INTRODUÇÃO
A variabilidade fenotípica que se observa nos animais domésticos resulta de uma
história evolutiva mais ou menos complexa, influenciada pelo meio envolvente, e na
qual o homem teve um papel preponderante. Avaliar o peso da componente genética
dessa diversidade reveste-se de grande importância, designadamete para estabelecer
programas de conservação. No entanto, a escolha de metodologias e critérios de
avaliação da mesma não é uma tarefa fácil nem consensual. É sabido que duas
populações podem apresentar semelhanças morfológicas evidentes e ser geneticamente
distantes, assim como, podem parecer distintas mas resultar apenas de um processo de
selecção centrado num número reduzido de genes responsáveis pelas diferenças
morfológicas em questão, apesar de muito semelhantes na globalidade do genoma.
Hoje em dia, é possível estudar a diversidade genética de uma dada espécie
quantificando-a directamente ao nível do DNA. Todavia sequenciar a totalidade do
genoma é ainda uma tarefa difícil e onerosa, pelo que a investigação tem sido
direccionada no sentido das metodologias no âmbito da biologia molecular já referidas,
capazes de gerar informação útil para estimar diversos parâmetros estatísticos, definidos
para os vários níveis de estruturação populacional (locus, indivíduo, raça, espécie, etc.).
3.2. OBJECTIVOS
Com recurso à informação alélica anteriormente obtida para os 20 microssatélites
de DNA procurou-se estimar parâmetros reveladores da diversidade genética dentro e
entre as raças portuguesas de ovinos. Por outro lado, foi também incluído o propósito de
analisar a distribuição da diversidade dentro e entre loci utilizados, tentando identificar
os mais informativos e disponibilizando esta informação para futuros trabalhos,
nomeadamente, aqueles que visarem a elaboração de protocolos metodológicos de
69
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
testagem de parentesco e de rastreabilidade de produtos animais nas raças portuguesas
de ovinos.
3.3. DIVERSIDADE DENTRO DAS RAÇAS PORTUGUESAS DE OVINOS
A percentagem de loci polimórficos, a riqueza alélica ou número de alelos (RA)
presentes e sua frequência, a heterozigotia observada (HO), a diversidade génica ou
heterozigotia esperada (He) e o conteúdo de informação polimórfico (PIC - Polimorphic
Information Content) são os parâmetros normalmente utilizados para descrever a
diversidade dentro das raças.
Apesar da percentagem de loci polimórficos ser uma medida clássica para avaliar
a diversidade, no presente estudo ela revestia-se de pouca utilidade, uma vez que no
processo prévio de obtenção dos microssatélites foram seleccionados apenas os que
tinham natureza polimórfica.
O número médio de alelos por locus, ou seja a riqueza alélica, pelo contrário, tem
um elevado poder informativo sobre a diversidade genética, sendo mesmo indicada a
sua utilização, como critério no estabelecimento de prioridade, em programas de
conservação (PETIT et al., 1998). De facto, NEI et al. (1975) e (LEBERG) (1992)
demonstraram que o número de alelos neutros é mais sensível à história demográfica,
nomeadamente a fenómenos de bottleneck, consanguinidade e efeito fundador, do que
outras medidas de diversidade assentes nos alelos mais frequentes, de que é exemplo a
heterozigotia média. Além disso, a riqueza alélica está também muito dependente do
tamanho efectivo da população (PETIT et al., 1998), aspecto relevante na gestão da
diversidade. Apesar das vantagens referidas, este parâmetro apresenta uma grande
dependência face aos loci considerados e principalmente ao tamanho da amostra
utilizada na sua estimativa. O primeiro aspecto impede apenas a sua adopção como
valor absoluto; o segundo restringe a sua comparação com populações cujo tamanho da
amostra foi sensivelmente idêntico, limitação ultrapassável se os resultados forem
padronizados para igual tamanho de amostra nas várias populações estudadas. Para o
efeito, existem entre outras (LEBERG, 2002), as seguintes alternativas disponíveis:
-
Estimar o número de alelos esperados numa sub-amostra de 2n genes, dados
2N genes amostrados de acordo com uma adaptação do conceito de índice de
rarefacção, sugerida por ELMOUSADIK e PETIT (1996);
70
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
-
Calcular o número de alelos em sub-amostras aleatórias de tamanho igual ao
número de indivíduos da menor das amostras;
-
Estimar o número total de alelos para a população com base no número
observado numa amostra (HUANG e WEIR, 2001).
Por outro lado, a variância amostral da RA é demasiado grande, devido à presença
de alelos raros, o que dá à estimativa baseada numa amostra um valor limitado
(CAMPBELL, 1995). Por isso, deve ter-se algum cuidado na interpretação das diferenças
encontradas entre populações, pois podem, eventualmente, resultar da presença de
alelos raros com baixa frequência, cuja detecção na amostra pode ter sido apenas
ocasional. Além disso, a importância atribuída a estes alelos é normalmente reduzida
pois têm tendência a perder-se pela acção da deriva genética (HARTL e CLARK, 1997).
Outro aspecto com este relacionado é o caso dos alelos denominados de "únicos",
ou seja, ditos exclusivos de uma população. Estes, pelas mesmas razões, só terão
interesse caso a sua frequência seja considerável, além de que não há a garantia quanto
ao facto de serem únicos, ou apenas resultado de ausência de amostragem noutras
populações.
O número efectivo de alelos ( Ne =1/ ∑xi2 ) definido por KIMURA e OHTA (1975) é
independente do tamanho da amostra mas, ao contrário do que pode sugerir a sua
denominação, mede a igualdade da frequência alélica, não a riqueza alélica
propriamente dita, além de ser um parâmetro que do ponto de vista estatístico, não se
comporta adequadamente (NEI, 1987).
A medida mais usada para descrever a diversidade genética de uma população é a
heterozigotia, podendo ser expressa de duas formas. A heterozigotia individual, que
descreve a proporção de loci heterozigóticos num indivíduo (MITTON e PIERCE, 1980) e
a heterozigotia média, que reflete a proporção de indivíduos heterozigóticos numa
população medida por vários loci (HARTL e CLARK, 1997). Esta última é normalmente
referida de dois modos:
- A heterozigotia observada (HO), definida e calculada como a proporção de
heterozigotos detectados numa amostra da população;
- A heterozigotia esperada (He), também designada por NEI (1987) como
diversidade génica (gene diversity) e definida como a probabilidade de dois
71
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
alelos aleatoriamente amostrados numa população serem diferentes. Esta
probabilidade é equivalente à proporção de heterozigotos esperados numa
população diplóide em equilíbrio de Hardy e Weinberg (HWE).
A heterozigotia esperada para um dado locus numa população é definida
matematicamente por:
m
H e = 1 − ∑ xi2
(NEI, 1987)
i =1
onde m é o número de alelos e xi é a frequência do alelo i. A He de uma população é a
média dos valores da He de todos os seus loci.
Ao contrário da riqueza alélica, a heterozigotia é apenas ligeiramente afectada
pelo tamanho da amostra, pois a contribuição dos alelos com baixa frequência é muito
pequena (NEI, 1987). A relação de vantagem entre a RA e a He depende do tipo de
distribuição e do número de descendentes, sendo semelhante se seguir uma distribuição
de Poisson (CAMPBELL, 1995). A RA avalia mais o potencial de evolução enquanto que
a He avalia a taxa de evolução.
Embora as distribuições das frequências alélicas e genotípicas contenham mais
informação do que a RA e a He em conjunto, são difíceis de analisar teoricamente, razão
pela qual os motivos da utilização da He serem mais de ordem prática do que teórica.
Por outro lado, a He de uma amostra fornece uma boa estimativa da heterozigotia da
população, para além da facilidade da sua aplicação em muitas fórmulas matemáticas
(CAMPBELL, 1995).
Definido inicialmente por BOTSTEIN et al. (1980) para marcadores dominantes e
mais tarde generalizado a qualquer tipo de herança por GUO e ELSTON (1999), o PIC
(Polymorphism Information Content) é uma medida de avaliação do poder informativo
de um marcador, particularmente útil em estudos de desequilíbrio de ligação (Linkage
Desiquilibrium). O PIC mede a probabilidade do genótipo de um dado descendente,
para um dado locus, permitindo a dedução, na ausência de crossing - over, sobre qual
dos alelos foi recebido de um dado progenitor (GUO e ELSTON, 1999), sendo a sua
expressão matemática dada por:
m
m −1
PIC = 1 − ∑ xi − ∑
i =1
2
m
∑x x
i =1 j = i +1
2
2
i
j
(GUO e ELSTON, 1999)
72
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
onde m é o número de alelos e xi é a frequência do alelo i. SHETE et al. (2000)
apresentaram posteriormente desenvolvimentos sobre a estimativa do PIC e da
respectiva variância.
Tal como se observa para a He, o PIC aumenta com o acréscimo do número de
alelos, mas ao contrário da primeira, tem em conta o facto de, quando dois progenitores
são identicamente heterozigóticos, a sua descendência heterozigótica não ser
informativa, pois a origem parental de cada alelo não pode identificar-se
inequivocamente. O máximo do PIC é atingido quando todos os alelos têm igual
frequência na população (NSENGIMANA, 2003).
3.3.1 Metodologia
A riqueza alélica observada (RAO) e a frequência alélica para cada locus, em cada
população, foram determinados por contagem directa, enquanto o cálculo da riqueza
alélica ajustada (RAA) à amostra de menor tamanho (31 indivíduos da raça CC) foi
realizado de acordo com ELMOUSADIK e PETIT (1996). Todos estes cálculos foram
efectuados recorrendo ao programa FSTAT (GOUDET, 2001). Os valores das frequências
alélicas foram posteriormente transferidos para uma folha de cálculo para a construção
dos histogramas respectivos.
A contabilização do número de alelos únicos (private alleles) em cada raça foi
obtida através do programa GDA (LEWIS e ZAYKIN, 2001).
Os valores da heterozigotia observada (HO) em cada amostra e para cada locus
foram calculados pela contagem directa dos heterozigotos. Por seu lado, as estimativas
não enviesadas da heterozigotia esperada (HNB) em cada amostra e para cada locus,
assim como a respectiva média, foram obtidas pelas seguintes fórmulas:
m
H NB = 2n(1 − ∑ xi ) /( 2n − 1)
2
(NEI, 1978)
i =1
r
H NB =
∑H
NBj
j =1
r
onde n é o número de animais e xi é a frequência do alelo i do locus j em cada amostra e
r é o número de loci. A diferença entre HNB e He torna-se negligenciável para amostra
73
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
de tamanho superior a 50. Tanto o cálculo da HO como o da HNB foram efectuados
recorrendo ao programa Genetix (BELKHIR et al., 2003).
Na estimativa da variância das heterozigotias para cada população foi considerada
a variância total (V), a variância associada ao processo de amostragem de indivíduos na
população (Vs) e a variância associada à amostragem de locus no genoma (Vl). Os
valores respectivos foram calculados utilizando as frequências alélicas obtidas no
programa FSTAT (GOUDET, 2001) e aplicando as fórmulas que se seguem numa folha de
cálculo:
r
V (Ho ) =
∑ (H
o
−H o ) 2
j =1
r −1
V (H o ) =
V (Ho )
r
Vs ( H o ) =
H o (1 − H o )
n
Vs ( H o ) =
H o (1 − H o )
nr
(HEDRICK, 1983)
Vl ( H o ) = V ( H o ) − Vs ( H o )
r
∑ (H
−H NB ) 2
j =1
V ( H NB ) =
(NEI, 1978)
r −1
V ( H NB ) =
V s ( H NB ) =
NB
V ( H NB )
r
(NEI, 1978)
{
[
]
2
3
2
2
2
2(2n − 2) ∑ xi − (∑ xi ) 2 + ∑ xi − (∑ xi ) 2
2n(2n − 1)
}
(NEI e ROYCHOUDHURY, 1974b)
Vs ( H NB ) =
1 r
∑Vs ( H NBi )
r j =1
(NEI, 1978)
Vl ( H NB ) = V ( H NB ) − Vs ( H NB )
(NEI, 1978)
74
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
onde n, r e xi são o tamanho da amostra, o número de loci e a frequência de cada alelo i
em cada locus j numa população, respectivamente. O valor do erro padrão para cada
caso foi obtido pelo cálculo da raiz quadrada do valor da variância da média, respectivo.
Para testar a diferença, entre raças, de valores de RA e de HNB, utilizámos o teste
não paramétrico de “Wilcoxon sign ranks test” (SNEDECOR e COCHRAM, 1976),
recorrendo ao programa SYSTAT (SYSTAT, 1990-1992), uma vez que a distribuição
destes parâmetros não é normal quando são analisados um número pequeno de loci e as
heterozigotias de populações interligadas evolutivamente estão correlacionadas (NEI,
1987).
Por último, o cálculo dos valores de PIC foi efectuado com recurso ao programa
CERVUS 2.0 (MARSHALL et al., 1998).
3.3.2 Resultados
Neste estudo foram determinados os genótipos de 717 indivíduos pertencentes a
14 raças portuguesas de ovinos, relativamente a 20 microssatélites o que perfez um total
de, cerca de 14340 genótipos individuais.
As distribuições das frequências alélicas para cada microssatélite por raça são
apresentadas nas Figuras do Anexo 2. A análise das mesmas não permitiu constatar a
ausência de relação entre o tamanho dos alelos dos microssatélites (por isso do número
de repetições do motivo que o compõe) e a respectiva frequência. Com efeito, para os
microssatélites McM218 e OarHH64, os alelos mais frequentes foram os de maior
tamanho, ao contrário do que ocorreu com os microssatélites MAF23 e McM214, para
os quais os alelos com menor tamanho foram os mais frequentes, enquanto que alguns
microssatélites como o McM357, o BM4621 e o ETH225 apresentaram,
essencialmente, alelos de tamanho intermédio. Da mesma forma, o perfil de repartição
das frequências alélicas foi também muito diferente para microssatélites com um
número idêntico de alelos. Assim, a maior parte dos alelos do microssatélite BM1824
foram detectados em todas as raças com pequenas variações, ao passo que para o
BM6506 dois alelos foram preponderantes, tendo-se verificado mesmo a ausência de
alguns alelos em certas raças. Um outro aspecto que pode ser considerado é o que se
prende com a presença/ausência de simetria da distribuição alélica, assim como a sua
75
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
classificação em unimodal ou em multimodal. A maior simetria de distribuição para o
tipo unimodal foi revelada pelo microssatélite McM357, enquanto que para o tipo
bimodal foi o OarFCB11. No entanto, na maior parte dos casos não foi possível
estabelecer um tipo de perfil, tal como vem sendo mostrado noutros trabalhos. Com
efeito, a irregularidade da distribuição de frequência dos alelos nos microssatélites tem
sido objecto de vários estudos, embora permaneça pouco compreendida (BROHEDE,
2003; LAI e SUN, 2003; NIKITINA e NAZARENKO, 2004).
Nas Tabela 1 e 2 do Anexo 3 são apresentados os valores da RA por microssatélite
e por raça. Para o conjunto das raças foram observados 280 alelos, tendo o número total
de alelos por locus e por raça variado entre 5 para o microssatélite BM1824 e 26 para o
OarCP49, com um valor médio por locus de 14 alelos. Estes valores justificam-se pela
taxa de mutação elevada que é característica deste tipo de marcador.
Em 15 dos loci estudados (à excepção de BM1824, MAF23, McM218, OarCP34,
OarFCB20) foi detectada a presença de alelos únicos (Tabela 4).
Tabela 4. Valores de frequência dos alelos únicos, por raça e por microssatélite.
Raça
BEDM
BEDM
BEDM
CA
CA
CC
CC
CC
CC
CGM
CM
CM
CM
CTQ
CTQ
MB
MB
MB
MBB
MP
MP
SE
SL
SL
SL
SL
bp- pares de bases
Locus
BM757
MAF209
OarFCB304
BM6444
McM214
ETH225
McM357
OarCP20
OarFCB128
McM214
BM4621
OarCP20
OarFCB11
BM4621
OarFCB48
OarCP49
OarFCB128
OarHH64
ETH225
BM757
OarFCB128
OarFCB11
BM6506
McM357
OarFCB304
OarFCB304
Alelo (bp)
199
115
154
127
112
159
118
95
129
68
173
93
141
139
140
125
115
135
143
185
101
117
205
98
192
184
76
Frequência
0,033
0,011
0,011
0,019
0,019
0,048
0,032
0,016
0,016
0,010
0,040
0,010
0,020
0,008
0,024
0,008
0,008
0,016
0,009
0,010
0,010
0,010
0,010
0,090
0,010
0,060
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
No que concerne às raças, com excepção da CB, CGB e CMP, todas as restantes
apresentaram alelos únicos em pelo menos um locus. Os 26 alelos únicos representaram
apenas cerca de 9% do número total de alelos detectados e, na sua maior parte
caracterizaram-se por possuir um tamanho extremo e uma frequência inferior a 5%.
Os valores individuais de RAA, de HO, de HNB e de PIC, por raça e locus,
encontram-se nas Tabelas 3, 4 e 5 do Anexo 3. A análise dos valores individuais da RAA
por raça e por locus, indicou um valor mínimo de 3,6 na CMP para o microssatélite
MAF 23 e um valor máximo de 17,4 na CGM para o microssatélite OarCP49. Por seu
lado, os valores individuais da HO variaram entre 0,196 na CGM e no microssatélite
OarHH64 e 0,940 na CB e no microssatélite OarFCB20. Os valores individuais de HNB
apresentaram um intervalo de variação mais estreito, entre 0,919 na BEDM e no
microssatélite BM6444 e 0,386 na CMP e no microssatélite ETH225.
Na Tabela 5 são apresentados os valores médios de RAO e RAA, da HO, da HNB e
do PIC.
Tabela 5. Características genéticas das 14 raças com base nos 20 loci estudados: Riqueza alélica
observada (RAO), Riqueza alélica ajustada (RAA), Heterozigotia Observada (HO), Heterozigotia
Esperada (HNB) e PIC.
Raça
BEDM
CA
CB
CC
CGB
CGM
CM
CMP
CTQ
MB
MBB
MP
SE
SL
Média
N
45
54
50
31
50
51
50
54
62
62
53
52
53
50
51,2
RAO
9,5
7,4
8,5
8,3
9,4
9,9
8,6
9,2
9,8
9,6
8,9
9,6
8,8
8,3
9,0
RAA
8,9ad
6,9b
7,7bc
8,3acg
8,6adf
9,1d
7,8ceg
8,3acg
8,6adef
8,3ac
8,1cfg
8,6adf
8,0ceg
7,6bg
8,2
Ho
0,666a
0,677ace
0,685acd
0,710ab
0,747b
0,711bc
0,663ace
0,693acd
0,698acd
0,729bd
0,678ace
0,670ac
0,716bde
0,720abc
0,697
Hnb
0,774acd
0,733ab
0,729bc
0,773cde
0,782d
0,774cd
0,748abe
0,751abcf
0,774df
0,772df
0,767dce
0,766bcd
0,764bcd
0,763bcd
0,762
PIC
0,736
0,689
0,687
0,728
0,745
0,734
0,705
0,709
0,737
0,731
0,728
0,728
0,722
0,723
0,722
Os valores médios para cada raça com presença de, pelo menos, uma letra igual não diferem significativamente
(P=0,05) – Wilcoxon signed ranks test (Systat).
A riqueza alélica média observada em cada raça, ajustada para 31 indivíduos
(menor das amostras), diferiu significativamente (P<0,05) entre raças, tendo variado
77
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
entre 6,9 registado na raça CA e 9,1 verificado na raça CGM, com um valor médio de
8,2 para o conjunto de raças e microssatélites.
Os valores elevados obtidos para a HO e a HNB estão de acordo com o esperado
para este tipo de loci e em particular para os ovinos. A primeira variou entre 0,663 (CM)
e 0,747 (CGB) e a segunda entre 0,729 (CB) e 0,782 (CGB). Tanto a heterozigotia
média observada (HO) como a esperada (HNB) foram significativamente diferentes entre
raças (P<0,05). A média da HO foi inferior à da HNB em todas as raças, o que sugere um
défice de heterozigotos nas populações, cujo significado será discutido mais adiante,
neste capítulo.
O valor médio do PIC dentro de cada raça variou entre 0,682 (CB) e 0,745
(CGB). A grande maioria dos loci estudados apresentaram valores elevados de PIC para
todas as raças, com um valor médio de 0,722, tendo variado entre 0,338 para o ETH225
registado na CMP e 0,902 para o BM644 observado na BEDM. O microssatélite
ETH225 exibiu também a maior variação entre raças.
Como pode ser observado na Figura 10 verifica-se uma correlação altamente
significativa entre o PIC e a HNB, razão pela qual o valor de PIC nem sempre consta em
estudos desta natureza.
1,0
0,9
0,8
0,7
H nb
0,6
y = 0,8711x + 0,1335
R2 = 0,9859
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
PIC
Figura 10. Relação entre a heterozigotia esperada não enviesada (HNB) e o Polymorphism
Information Content (PIC).
Do ponto de vista de uma análise de diversidade por microssatélite, verificámos
que nos 20 microssatélites foram observados um total de 280 alelos o que perfaz uma
78
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
média de 14,0±5,3 alelos por locus, tendo o seu valor variado entre 5 para o
microssatélite BM1824 e 26 para o OarCP49 (Tabela 6). No caso da HO, o valor
mínimo (0,422) da média das populações foi obtido para o microssatélite McM357 e o
máximo (0,847) para o BM4621. Relativamente à HNB, o valor mínimo (0,568) da
média das populações correspondeu ao microssatélite ETH225 e o máximo (0,867) ao
BM6444. Este microssatélite (BM6444) obteve também o valor maior de PIC (0,844). É
de notar que o BM6444 é um microssatélite que foi isolado em bovinos. Por outro lado,
se considerarmos o conjunto das 14 raças como uma única população, os valores
médios da HO e da HNB, para os 20 microssatélites foi de 0,698 e 0,781,
respectivamente.
Tabela 6. Características genéticas dos 20 microssatélites com base nas 14 raças ovinas estudados:
Riqueza Alélica observada (RAO), Riqueza Alélica ajustada (RAA), Heterozigotia Observada (HO),
Heterozigotia Esperada (HNB).
Locus
BM1824
BM4621
BM6444
BM6506
BM757
ETH225
MAF209
MAF23
McM214
McM218
McM357
OarCP20
OarCP34
OarCP49
OarFCB11
OarFCB128
OarFCB20
OarFCB304
OarFCB48
OarHH64
Média
RAO
5,0
13,5
14,6
6,1
5,7
5,6
9,8
5,6
10,3
8,5
8,8
8,1
6,2
14,8
8,5
7,5
11,1
10,7
10,3
8,4
9,0
RAA
5,0
12,4
13,3
5,6
5,4
5,2
9,0
5,0
9,3
7,9
8,4
7,3
6,0
13,3
8,0
7,2
10,1
9,4
9,5
8,0
8,3
Ho
0,703
0,847
0,711
0,669
0,706
0,459
0,776
0,610
0,751
0,732
0,422
0,721
0,719
0,797
0,741
0,740
0,773
0,752
0,764
0,557
0,698
Hnb
0,745
0,866
0,867
0,677
0,734
0,568
0,782
0,638
0,793
0,760
0,797
0,763
0,752
0,859
0,787
0,770
0,828
0,749
0,771
0,734
0,762
PIC
0,699
0,842
0,844
0,614
0,682
0,507
0,747
0,564
0,758
0,720
0,762
0,720
0,708
0,836
0,751
0,729
0,800
0,708
0,740
0,700
0,722
3.3.3 Discussão
A utilização de técnicas modernas, como a inseminação artificial associada a
programas de melhoramento, tem tido pouca expressão na exploração das raças ovinas
portuguesas. Se por um lado este aspecto deixou em desvantagem as raças autóctones
face a raças exóticas que pouco a pouco têm vindo a ocupar o seu lugar, caso da raça
Castelhana proveniente de Espanha, por outro lado contribuiu para que tivessem
79
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
mantido a diversidade genética que foi possível revelar neste estudo com recurso aos
microssatélites. A caracterização da diversidade dentro e entre raças constitui um passo
imprescindível para um planeamento eficaz das estratégias a estabelecer nesse sentido.
Os microssatélites têm-se mostrado úteis, como ferramentas reveladoras da diversidade
de populações de animais domésticos, podendo a informação obtida ser expressa de
variadas formas já mencionadas neste trabalho.
Da análise das distribuições alélicas depreendeu-se que para a maior parte dos
microssatélites, o alelo mais frequente foi variável com a raça, embora em alguns,
nomeadamente para os ETH225, McM218, e OarFCB48, o alelo mais frequente tenha
sido o mesmo, qualquer que fosse a raça em causa. De acordo com CHAKRABORTY
(1991), quando esta última situação se observa, é provável que o alelo mais frequente
seja o mais antigo, sendo os outros resultantes de processos de mutação através de
mecanismos de inserção e deleção.
Os resultados deste estudo relativos à distribuição das frequências alélicas estão
em consonância com os referidos por outros autores (FORBES et al., 1995; ARRANZ et
al., 2001a), confirmando mais uma vez a existência de uma grande diversidade de
situações, seja entre marcadores, seja entre raças, que tornam empírica a escolha de um
marcador de tipo microssatélite para o estudo de populações, ao contrário do que
acontece em cartografia genética, na qual a determinação do PIC é, com frequência,
suficiente para estimar a qualidade do marcador.
Apesar da distribuição dos alelos ser uma forma útil de expressar a diversidade
genética, ela carece de alguma objectividade quando se pretende quantificar este
parâmetro ou realizar comparações entre marcadores ou entre populações, pelo que tem
sido pouco utilizada para estes fins.
Por outro lado, no que concerne à presença de alelos únicos, a sua identificação
tem-se revelado útil na detecção de introgressões, designadamente entre as espécies
bovinas Bos taurus e Bos indicus (MACHUGH et al., 1997; LOFTUS et al., 1999). Diz-se
que um alelo é único se apenas for detectado em uma de um conjunto de populações em
estudo, o que dita a sua relatividade a essas mesmas populações. Além disso, a sua
presença pode resultar de uma mutação endógena recente, caso mais relevante, ou de
uma ancestralidade distinta, de um cruzamento com raças exóticas, ou simplesmente por
não ter sido amostrado em resultado do tamanho de amostra sempre limitado. A
referência à presença de alelos únicos não é rara, como o demonstram vários estudos
80
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
envolvendo diversas raças de ovinos (BUCHANAN et al., 1994; FORBES et al., 1995;
ARRANZ et al., 2001a; GRIGALIUNAITÈ et al., 2003); no entanto, o seu montante depende
do número de loci e de populações em análise, bem como da proximidade genética ou
geográfica destas. No presente trabalho, foram detectados alelos únicos em 11 das 14
raças estudadas. Uma vez que a raça CC teve o menor tamanho de amostra, pode ser
considerada como a raça com maior número de alelos únicos (4), seguida da SL com
igual valor. Contudo, a relevância e o significado da presença destes alelos únicos são
dificeis de avaliar, principalmente porque estão em causa loci considerados neutros e a
frequência com que surgiram nas populações foi baixa. Alguns autores estabeleceram
um valor de frequência de 0,1 como critério mínimo de relevância (GRIGALIUNAITÈ et
al., 2003), mas o significado em termos de adaptabilidade ou sobrevivência parece
depender sempre do conhecimento concreto sobre a história evolutiva das populações
em causa. Se atendermos a este critério, apenas o alelo 98 pb do microssatélite McM357
se aproximou do referido valor, contabilizando uma frequência de 0,09, o que pode
comprometer a utilidade da presença desses alelos. Contudo, não deixa de ser relevante
que em 14 raças, 11 delas tenham apresentado pelo menos um alelo único, o que
conjuntamente com os elevados valores de riqueza alélica e heterozigotia, realça a
importância de implementação de programas que visem conservar as raças portuguesas
de ovinos.
A comparação relativa dos vários índices de diversidade permite inferir sobre a
história das populações. Assim, as causas associadas com mais frequência a uma
redução da riqueza alélica são o isolamento genético, o efeito de bottleneck
populacional e o efeito fundador. A raça CA foi a que apresentou menor valor de RA
alélica, embora não fosse a detentora do menor valor da heterozigotia observada,
aspectos que estão de acordo como a hipótese desta raça ter tido uma presença recente
em Portugal. De facto, SOBRAL et al. (1987) indicam como provável origem recente da
CA, o Churro espanhol do tipo Lebrijano ou Marismeño da província de Huelva,
enquanto que FRAZÃO (1982) aponta também Marrocos como proveniência possível. No
arrolamento de 1870, a população ovina do Algarve foi referida como pertencente ao
grupo bordaleiro comum ou amerinado, não sendo descrito nenhum tipo tão
característico e inconfundível como a CA. A confirmar-se a hipótese de uma introdução
recente em Portugal desta raça, e visto que normalmente é concretizada através da
aquisição de um número reduzido de indivíduos, preferencialmente machos, equivalerá
81
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
a ter sofrido um efeito do tipo bottleneck. O efeito fundador e a deriva genética
associados a um efectivo reduzido deverão ter contribuído para uma diminuição dos
alelos com menor frequência, contudo exercendo um menor efeito sobre a HNB (o
cálculo deste parâmetro é pouco afectado por alelos de baixa frequência). O facto desta
raça apresentar também valores de HO relativamente elevados, sugere a ocorrência de
um posterior incremento rápido da população, tal como foi demonstrado por NEI et al.
(1975). Por outro lado, se assumirmos uma importação e, por conseguinte, uma maior
distância com as raças restantes, seria de esperar encontrarmos na CA alelos únicos com
frequência relevante, o que não se verificou, embora o facto possa ser explicado por
cruzamentos com outras raças, ou por o número de animais importados ter sido muito
reduzido. Esta raça apresenta características morfológicas muito distintas da raça com a
qual ficou em contacto, a CMP, pelo que a presença de animais cruzados seria, por
ventura, de fácil detecção. Sobre este assunto, LUCAS no relatório acerca do
Arrolamento Geral de Gados de 1940 refere que “... devemos aqui destacar o Algarve
como única região onde mercê de condições particulares, e de ausência de cruzamentos
com outros tipos, o arietino churro reproduz, com vincada fidelidade, as características
do Tronco Ibérico, de que deriva...". Acresce o facto de o número de alelos únicos na
CA não ter aumentado quando na análise excluímos a raça CMP, de forma a evitarmos
que este parâmetro fosse mascarado por eventual fluxo génico entre estas raças. O
mesmo se passou quando na análise excluímos a CGB (raça que, na nossa opinião,
apresenta a maior semelhança morfológica) ou, simultaneamente, as duas raças (CGB e
CMP). Num estudo envolvendo a sequenciação da região controlo do mtDNA de 7
raças portuguesas de ovinos, PEREIRA et al. (2006) também verificaram que a CA era a
raça que apresentava menor valor de diversidade de haplotipos de mtDNA. Assim,
parece-nos reforçada a hipótese de importação de um número reduzido de animais desta
raça.
A CB foi outra população que apresentou um baixo valor de RA. É de notar que
esta raça sofreu uma grande diminuição do efectivo no século XX em resultado da sua
substituição pela CTQ (SOBRAL et al., 1987).
No caso da raça CC seria de esperar também um efeito bottleneck devido à
drástica redução do efectivo, passando de valores da ordem de 30 a 40 mil animais, em
1987 (SOBRAL et al., 1987), para algumas dezenas de animais na altura em que foi
realizada a amostragem do presente estudo (1997), tendo sido sujeita a substituição
82
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
progressiva por outras de maior rendimento ao ponto de ter sido dado como extinta em
2004 (TELO
DA
GAMA et al., 2004). No entanto, nesta raça, não foram observados os
efeitos depressivos esperados na RA e HNB. Pelo contrário, aos valores elevados de RA e
HNB associou-se a presença de alelos únicos, o que pode ter resultado do facto de alguns
animais amostrados terem sofrido alguma influência de raças vizinhas, o que teria
restaurado, em parte, a diversidade perdida por acção do bottleneck, mas sem
comprometer a sua identidade uma vez que, como veremos adiante, a raça mais próxima
da CC é a CB, e não a MBB, raça cujo solar é contíguo. TEIXEIRA (1991), através da
análise de dados morfométricos, também conclui que a raça mais próxima da CC era a
CB.
Embora se torne difícil estabelecer uma comparação rigorosa com os dados recolhidos
na bibliografia, pois normalmente apenas são apresentados valores médios por raça ou
por microssatélite e apenas alguns destes são comuns aos que foram utilizados neste
estudo, parece evidente que, com excepção das raças espanholas, as raças portuguesas
de ovinos foram as que apresentaram maiores valores de HO e HNB (Tabela 7). As razões
prendem-se com a predominância dos sistemas tradicionais de exploração, onde a
selecção artificial tem pouca relevância.
Tabela 7. Valores de heterozigotia em raças europeias de ovinos.
Raça (1)
Churra
HO
0,734±0,031
Raça (2)
HNB
0,779±0,017 Awassi
HO
0,75
Latxa
0,713±0,039
0,773±0,027 Mouflão
0,59
Manchega
0,753±0,030
0,783±0,019 Bizet
0,62
Aragonesa
0,723±0,029
0,769±0,019 Icelandic
0,67
Merino
0,771±0,032
0,814±0,013 Skudde
0,60
Awassi
0,750±0,043
0,656±0,031 Soya
0,45
Merino
0,61
Churro
0,66
HNB Raça (3)
0,77 Latvian
Darkheaded
0,64 Lithuanian
Coarsewooled
0,67 Lithuanian
Blackface
0,72 Estonian
Ruhnu
0,67 Estonian
Whitehead
0,55 Estonian
Blackhead
0,71 Estonian
Saaremaa
0,67
Racka
0,65
0,74
Chios
0,58
0,68
HO
0,698±0,173
0,733±0,124
0,718±0,169
0,600±0,212
0,727±0,098
0,710±0,186
0,625±0,128
Média
0,741
0,762
0,62 0,68
0,687
1- Arranz et al. (1998), 2- Byrne et al. (s/d), 3- Grigaliunaitè et al. (2003), 4- Tapio et al. (2003).
Raça (4)
HNB
0,712±0,143 White
Finnsheep
0,743±0,113 Black
Finnsheep
0,718±0,165 Brown
Finnsheep
0,574±0,194 Grey
Finnsheep
0,760±0,088 Åland
sheep
0,714±0,159 Viena
sheep
0,760±0,081 Vepsia
sheep
Romanov
Egito
Romanov
Lituania
Oxford
Down
0,712
HNB
0,72±0,08
0,73±0,09
0,70±0,10
0,67±0,09
0,70±0,08
0,70±0,12
0,74±0,11
0,69±0,18
0,69±0,13
0,64±0,15
0,698
Contudo, quando a comparação é realizada apenas com os valores médios de HNB
para o conjunto de raças em cada microssatélite comum, a diferença não parece tão
evidente (Figura 11).
83
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
1,00
0,90
0,80
0,70
Raças Portuguesas
H nb
0,60
Byrne et al. (s/d)
0,50
Grigaliunaitè et al. (2003)
0,40
Arranz et al. (1998)
0,30
Tapio et al. (2003)
0,20
0,10
OarFCB48
OarFCB304
OarFCB20
OarFCB128
OarFCB11
OarCP34
OarCP20
McM214
MAF209
BM757
BM6506
BM6444
BM4621
BM1824
0,00
Microssatélite
Figura 11. Comparação dos valores médios de heterozigotia por microssatélite em raças europeias
de ovinos.
3.4. DIVERSIDADE ENTRE RAÇAS PORTUGUESAS DE OVINOS
O estudo da diversidade entre populações pode ser analisado por vários métodos,
ou seja, através da estimativa de "Índices de Fixação" (HARTL e CLARK, 1997) que
evidenciam o grau de diferenciação ou estruturação da população, de diversas distâncias
genéticas e respectiva representação em dendogramas, pela análise multivariada (de que
a análise factorial de correspondência é exemplo) representando as populações num
espaço métrico bi ou tridimensional e, mais recentemente, da análise de networks
(MORRISON, 2005), etc. Alguns destes métodos estatísticos assentam em pressupostos
cuja verificação é necessário testar nos dados das populações em análise, encontrandose, para o efeito, publicados vários testes estatísticos. Assim, proceder-se-á de seguida a
uma breve revisão de alguns métodos de uso mais frequente, procurando salientar as
vantagens e desvantagens dos mesmos.
84
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
3.4.1. Aspectos a ter em consideração na escolha dos métodos estatísticos
3.4.1.1.Análise de pressupostos
Em estudos como este, que visam avaliar a diversidade entre populações, os três
pressupostos que devem ser testados são:
-
Neutralidade selectiva de cada locus;
-
Ausência de alelos nulos (alelos não detectáveis pela PCR);
-
Segregação independente de alelos dos loci
Embora tenham sido desenvolvidos métodos específicos para testar os dois
primeiros pressupostos (MANASTER et al., 1999; FU, 2001; FORD, 2002; BONHOMME et
al., 2005), é comum utilizar o teste de Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) como
forma de os verificar.
Em condições ideais definidas como em HWE, as frequências genotípicas
esperadas são obtidas pela expansão da expressão (x1+x2+...+xn)2, com a frequência dos
homozigotos X ii = xi2 e dos heterozigóticos X = 2 x x (HARTL e CLARK, 1997).
ij
i j
Este equilíbrio pode ser perturbado por vários factores:
-
Acasalamento não aleatório;
-
Subestruturação da população (efeito de Wahlund);
-
Coancestralidade (amostra com indivíduos muito aparentados)
-
Fluxo génico de uma população divergente;
-
Selecção de loci (p.e. vantagem dos heterozigóticos);
-
Presença de alelos nulos;
-
Diferença na frequência alélica entre sexos;
-
Factores cronológicos na amostragem (em anos diferentes).
Assim, a identificação de loci que se desviam significativamente do HWE, pode
trazer informação importante para a reconstrução da história, para a compreensão da
situação actual da população e para a avaliação dos marcadores moleculares analisados.
Quando um determinado locus não está em HWE, apresentando por exemplo um défice
85
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
de heterozigotos, pode revelar que o mesmo está sob acção de selecção ou apresenta
alelos nulos. As hipóteses explicativas devem ser aferidas com informação adicional
sobre a demografia, o sistema reprodutivo, etc. A presença de alelos nulos é pouco
provável se o défice de heterozigóticos, para um dado locus, se verificar apenas num
reduzido número de populações. Por outro lado, no caso de uma população apresentarse subestruturada, sujeita a migração ou com reprodução não aleatória, o mais provável
é observar-se desvio do HWE para a globalidade de loci estudados (MACHUGH, 1996).
Pelo contrário, se for observado um excesso de heterozigotos, a justificação mais
provável é a presença de selecção sobredominante, ou a existência de cruzamentos com
outras raças afastadas.
Com a análise do equilíbrio de HWE pretende-se quantificar até que ponto as
frequências genotípicas observadas estão suficientemente próximas das esperadas
segundo esse modelo. O índice de fixação FIS proposto inicialmente por WRIGHT (1921;
1952; 1965), é uma medida utilizada para expressar o grau do afastamento desse
equilíbrio (HARTL e CLARK, 1997), tomando valores próximos de zero em caso de
equilíbrio. Para o caso concreto de loci com elevado número de alelos, alguns dos quais
com baixa frequência, foram desenvolvidos estimadores mais precisos (ROBERTSON e
HILL, 1984; WEIR e COCKERHAM, 1984).
Para testar a significância do desvio ao HWE estão disponíveis vários métodos,
tendo ROUSSET e RAYMOND (1995) concluído que os testes exactos eram mais
poderosos do que os testes baseados na máxima verosimilhança (HILL et al., 1995), na
variância mínima (ROBERTSON e HILL, 1984), ou nos estimados por componentes de
variância de FIS (COCKERHAM, 1973).
No que diz respeito à verificação do pressuposto de segregação independente de
loci estudados, a estratégia utilizada consiste na análise do desequilíbrio gamético.
A existência de um desequilíbrio gamético significa uma associação não aleatória
dos alelos dos diferentes loci na formação dos gâmetas. A proximidade da localização
física de loci num mesmo cromossoma tem um grande efeito neste desequilíbrio, o que
explica o facto da designação mais utilizada ser de desequilíbrio de ligação (DL)
(Linkage Disequilibrium), a qual também adoptaremos. Quando este ocorre entre loci
situados em diferentes cromossomas, portanto sem ligação física, pode contribuir para a
identificação de outros factores que igualmente o podem originar, tais como, a
estruturação da população, a selecção, a deriva genética, a coancestralidade e a
86
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
migração (LEWONTIN, 1988; HENRY e GOUYON, 2003). A importância do DL é realçada
pelo facto de fornecer informação sobre perturbações que decorreram há muito tempo,
como é exemplo a detecção de um cruzamento longínquo entre Bos taurus e Bos indicus
(MACHUGH et al., 1997) pois, ao contrário do que acontece com HWE, que pode ser
restabelecido numa geração de panmixia, o equilíbrio gamético necessita de muitas
gerações para ser recuperado.
HEDRICK (1987) descreveu vários métodos para estimar a extensão do DL. Mais
recentemente, foram desenvolvidos novos métodos utilizando uma abordagem
Bayesiana (AYRES e BALDING, 2001) ou a máxima verosimilhança (SLATKIN e
EXCOFFIER, 1996; KALINOWSKI e HEDRICK, 2001). A análise do DL de ligação encontra
também grande aplicação no mapeamento genético e em protocolos de selecção
assistida por marcadores para a melhoria de caracteres quantitativos, nomeadamente, de
várias espécies de animais domésticos (MADDOX et al., 2001; FARNIR et al., 2002).
3.4.1.2 Estruturação da população
O conhecimento da estrutura populacional é de grande importância porque pode
afectar a interpretação da diversidade genética observada (EXCOFFIER, 2001; BALLOUX
e LUGON-MOULIN, 2002). Uma subdivisão oculta pode mimetizar o efeito da selecção,
induzir um excesso aparente de homozigóticos (efeito de Wahlund) ou um desequilíbrio
de ligação entre loci, mesmo que estes se encontrem em cromossomas diferentes
(OHTA, 1982). Assim, a obtenção de estimativas da diferenciação populacional fiáveis é
fundamental para compreender as relações entre populações e representa uma
ferramenta importante para desenvolver estratégias de conservação.
Em termos estatísticos, a estrutura populacional introduz uma correlação ou
covariância entre genes tomados de níveis diferentes de uma subdivisão. Este efeito foi
inicialmente identificado por WRIGHT (1921) que desenvolveu, para o descrever, os
índices de fixação clássicos, também designados por Estatísticas-F, tendo sido
posteriormente objecto de diferentes formulações por outros investigadores (NEI, 1977;
NEI e CHESSER, 1983; WEIR e COCKERHAM, 1984; WEIR e HILL, 2002). Basicamente,
estes índices consistem na estimativa da correlação entre genes homólogos tomados de
um nível de subdivisão relativamente a qualquer outro hierarquicamente superior. A
correlação será tanto maior quanto maior for a subestrutura da população e portanto
87
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
mais se afastar da situação ideal de panmixia. Embora esta abordagem possa ser
aplicada a qualquer número de níveis, são normalmente considerados três: correlação
entre alelos dentro dos indivíduos relativamente aos alelos da metapopulação (FIT),
correlação entre alelos dentro das subpopulações relativamente aos alelos da
metapopulação (FST) e correlação entre alelos dentro dos indivíduos relativamente aos
da subpopulação (FIS).
Estes três índices relacionam-se entre si pela equação:
(1 − FIT ) = (1 − FIS )(1 − FST )
sendo o FST o parâmetro de interesse na análise da diferenciação genética das
subpopulações.
Uma certa ambiguidade na definição proposta por WRIGTH, no que se refere às
probabilidades subjacentes a cada correlação, levou a diferentes interpretações e ao
surgimento consequente de escolas com diversos métodos de estimação (BALDING,
2003).
Uma destas escolas, optou por uma abordagem inteiramente descritiva em termos
de frequências alélicas e genotípicas da situação actual da população e pela expressão
dos índices de fixação em termos de rácios de heterozigotias, sem referência aos
processos genéticos que levaram a esta condição, interpretando as correlações como
sendo geradas por uma assumida selecção aleatória dos gâmetas em cada subpopulação,
relativamente à totalidade da população actual (NEI, 1973, 1977; NEI e CHESSER, 1983).
Posteriormente, foram introduzidas modificações para corrigir a sensibilidade desta
formulação ao número de subpopulações amostradas (NEI, 1986; NEI, 1987), e mais
tarde revista e estendida por NAGYLAKI (1998). Este tratamento é sob o ponto de vista
biológico o mais directo e não requer nenhuma restrição nas acções das forças
evolutivas, podendo ser aplicado em qualquer situação.
Uma outra, define os parâmetros em termos de expectâncias e probabilidades,
utilizando modelos de evolução dos genótipos dentro das subpopulações. Sendo a mais
adequada quando o objectivo é tirar conclusões acerca do processo biológico
subjacente, levanta contudo a questão de preferência do modelo de evolução a
considerar. Um dos aspectos fundamentais neste tipo de abordagem é a escolha do
modelo de mutação de que já fizemos referência no capítulo 1. Das metodologias que
assentam no modelo IAM (Infinite Allele Model), a mais utilizada é a de WEIR e
88
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
COCKERHAM (1984), generalizada a qualquer número de níveis hierárquicos por WEIR,
1996 e YANG, 1998. Em concreto, consiste na análise da diferenciação com base na
decomposição da variância total das frequências alélicas em componentes de variação
associados com os diferentes níveis de subdivisão entre populações, entre indivíduos
dentro das subpopulações e entre gâmetas dentro dos indivíduos. Os parâmetros
analisados por estes autores relacionam-se com as estatísticas de Wrigth da forma
seguinte F=FIT; θ=FST;ƒ=FIS. Os estimadores de WEIR e COCKERHAM (1984), apesar de
serem não enviesados, apresentam elevada variância (LI, 1996). RAUFASTE e
BONHOMME (2000) recomendaram o estimador de ROBERTSON e HILL (1984) quando se
tratar de populações com baixa diferenciação, em resultado deste apresentar menor
variância, sugerindo ainda uma correcção para o caso de estarem envolvidas um número
elevado de populações. Por outro lado, quando as subpopulações apresentam uma
grande diferença de tamanho, os estimadores GST e FST são preferíveis ao θ (EXCOFFIER,
2001). Apesar destas e outras alternativas entretanto surgidas, o estimador θ (WEIR e
COCKERHAM, 1984) continua a ser dos mais utilizados na análise de raças de animais
domésticos. Outros trabalhos apontam ainda no sentido dos resultados dos vários
estimadores serem muito próximos, desde que o tamanho da amostra e o número de
subpopulações envolvidos sejam elevados (WEIR e COCKERHAM, 1984; SLATKIN e
BARTON, 1989). Uma discussão mais aprofundada sobre as vantagens e inconvenientes
dos vários estimadores pode ser encontrada nos trabalhos de WEIR e HILL (2002) e
EXCOFFIER (2001).
Devido ao facto da taxa de mutação nos microssatélites ser normalmente elevada,
na ordem de 10-5 a 10-2 (CRAWFORD e CUTHBERTSON, 1996; JARNE e LAGODA, 1996),
pode acontecer que dois alelos possam ser idênticos na forma mas não o sejam por
descendência, fenómeno designado de homoplasia. Se este fenómeno estiver presente, a
utilização do modelo IAM poderá provocar uma distorção na estimativa da
diferenciação populacional, quando esta for estimada a partir da informação alélica
proveniente deste tipo de marcador (HARDY et al., 2003). Por este motivo foram
derivados estimadores que incorporam o tamanho dos alelos, sendo o processo
mutacional respectivo apontado como mais consensual (SMM) para, eventualmente,
reflectir melhor a realidade. São exemplos os estimadores RST (SLATKIN, 1995), o ФST
(MICHALAKIS e EXCOFFIER, 1996) e o (δμ)2 (GOLDSTEIN et al., 1995b). A sua utilização,
contudo, tem sido limitada pela constatação de que o processo mutacional dos
89
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
microssatélites não é idêntico para todos os loci desviando-se mais ou menos de um
ideal SMM (ESTOUP e CORNUET, 1999; ELLEGREN, 2000a; XU et al., 2000) (HARDY et
al., 2003) e pelo facto das estatísticas baseadas no tamanho dos alelos apresentarem
uma elevada variância amostral quando comparadas com as suas homólogas do modelo
IAM (SLATKIN, 1995; TAKEZAKI e NEI, 1996; PAETKAU et al., 1997; PEREZ-LEZAUN et
al., 1997; BALLOUX e GOUDET, 2002; BALLOUX e LUGON-MOULIN, 2002; HARDY et al.,
2003).
Apesar da ausência de consenso quanto à precisão relativa destes dois tipos de
estimadores (BALLOUX e LUGON-MOULIN, 2002), parece claro que ela depende da
contribuição relativa da mutação e da deriva envolvidas na diferenciação populacional
(HARDY et al., 2003). No caso particular de populações próximas, a deriva genética
parece ter mais relevância do que a mutação no que se refere à distribuição da
variabilidade dos microssatélites. As conclusões apresentadas por FORBES et al. (1995),
que referem o RST como o melhor para predizer divergência interespecífica (Ovis aries
versus O. canadensis), o FST como o mais sensível na detecção da diferenciação
intraespecífica (entre raças de O. aries e entre rebanhos de O. canadensis) são disso
exemplo. Conclusões idênticas foram também obtidas por LUGON-MOULIN et al. (1999)
em populações de musaranhos.
Além dos já referidos, foram ainda desenvolvidos métodos que contam com as
forças actuantes nas populações (deriva, migração e selecção), a ploidia e o tipo de
reprodução dos organismos em estudo (WANG, 1997b, a), o número e a natureza de loci
(WANG, 1999) e, mais recentemente, outros que utilizam diferentes abordagens como a
máxima verosimilhança (BALDING, 2003) e a Bayesiana (HOLSINGER et al., 2002;
CORANDER et al., 2003). Esta multiplicidade de metodologias torna evidente a
complexidade na escolha do método mais adequado a cada caso.
Há que ter em conta ainda a existência de vários métodos para testar a
diferenciação de populações, que incluem os que utilizam estimativas de variância, os
que utilizam técnicas de reamostragem como bootstrap, jackknife ou permutação para
aferir significância de uma estatística, no caso concreto o FST, e os que comparam
tabelas de contingência como os testes exactos ou de probabilidade (EXCOFFIER, 2001).
A diferenciação de populações pode ser testada quanto à diferenciação alélica ou quanto
à diferenciação genotípica. Os testes aplicados ao primeiro caso são normalmente mais
poderosos (RAYMOND e ROUSSET, 1995a; GOUDET et al., 1996), no entanto, requerem o
90
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
pressuposto de independência de alelos nos indivíduos. Quando não se verifique esse
pressuposto, é preferível testar a diferenciação genotípica (GOUDET et al., 1996).
3.4.1.3. Distâncias genéticas e construção de fenogramas
Uma distância genética é uma extensão de diferença génica (alélica) entre
populações ou espécies que é medida por alguma quantidade numérica (NEI, 1987).
Foram publicadas um grande número de distâncias genéticas, que atendem à natureza de
informação a analisar (quantitativa, génica, etc.), às forças evolutivas e ao período de
tempo em estudo (longo ou curto). No que concerne à informação génica, o estudo das
sequências de proteínas e, mais recentemente, de DNA é preferido quando estão em
causa grandes períodos de tempo, como é o caso da evolução entre espécies muito
afastadas. O estudo de frequências alélicas é, muitas vezes, utilizado quando se analisa
intervalos de tempo menores, como o caso da evolução intraespecífica.
As distâncias calculadas a partir de frequências alélicas podem ser classificadas
em distâncias geométricas (Euclideanas e angulares) e distâncias baseadas na
distribuição do tamanho dos alelos, estas últimas desenvolvidas particularmente para os
microssatélites (NEI, 1987; NEI e TAKEZAKI, 1994; NEI e KUMAR, 2000; LAVAL et al.,
2002). Do ponto de vista genético, podem ainda ser referidas como as que se relacionam
directamente com o coeficiente de coascendência e as que medem o número de
mutações (VIENNE e DAMERVAL, 1985).
A adequação das distâncias para o estudo das relações filogenéticas de um
conjunto de subpopulações depende da contribuição relativa de quatro factores que
determinam a sua diferenciação: a migração, a selecção, a mutação e a deriva. Embora
na prática seja improvável saber com exactidão o historial das populações em estudo, e
por isso impossível conhecer, com certeza, qual a contribuição de cada um deles, é
sempre possível fazer algumas simplificações ou testar a realidade com os resultados
obtidos assumindo um dado modelo ideal.
As primeiras concepções dos métodos filogenéticos foram originalmente
desenvolvidas para o estudo da evolução de espécies, pressupondo, portanto, que após a
divergência das populações não ocorre migração entre elas (por definição, duas espécies
diferentes não se reproduzem). Este pressuposto não é obviamente aceitável para o caso
91
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
das raças de animais domésticos, cuja representação mais adequada seria em redes
complexas. Apesar disso, o efeito da migração é reflectido na estimativa da distância
genética, uma vez que, quando ocorre, leva duas raças distantes em termos de tempo de
divergência, a apresentarem uma distância genética pequena, devido à troca de alelos e
a serem representadas próximas uma da outra, numa árvore filogenética (EDING e
LAVAL, 1999; LAVAL, 2001). Devido ao efeito de distorção que a migração provoca têm
vindo a ser desenvolvidos métodos para a sua detecção (NORDBORG, 1999; KUMAR et
al., 2003; WANG, 2003; ALVAREZ et al., 2004). Assim, na prática, quando a migração
está presente, os resultados devem ser interpretados com algum cuidado.
No que concerne ao factor selecção, os microssatélites são considerados
marcadores neutros, ou seja, é assumido que aquela não tem efeito na alteração das
frequências alélicas que acompanham a evolução das populações, embora em algumas
circunstâncias, nomeadamente quando se localizam perto de um locus sujeito a
selecção, eles possam indirectamente sofrer processo idêntico, fenómeno designado de
boleia (hitchhiking) (SCHLOTTERER, 2003).
Para o factor mutação, o tempo de divergência entre populações é um aspecto
importante. Devido à taxa de mutação relativamente elevada dos microssatélites,
quando estão em estudo espécies diferentes, mesmo que muito próximas, como são os
casos entre o ovino selvagem e o ovino doméstico (O. aries) ou entre B. taurus e B.
indicos, o efeito da mutação parece ser relevante (FORBES et al., 1995) (MACHUGH,
1996). O contrário é de esperar quando se pretende estabelecer a relação entre raças de
animais domésticos, especialmente entre as que estão confinadas a uma área geográfica
restrita, como a Europa e quanto à qual se crê que o período de divergência tenha sido
relativamente curto, cerca de 200 anos (EDING e LAVAL, 1999), considerando-se,
portanto, desprezável o efeito da mutação (WEIR, 2002). Alguns etnólogos, contudo,
consideram o período de tempo envolvido na divergência das raças de animais
domésticos muito superior (SIERRA ALFRANCA, 2001).
Por último, a deriva genética, isto é, a flutuação das frequências alélicas resultante
do processo amostral aleatório em populações finitas, parece ser o principal factor
presente na diferenciação das raças de animais domésticos (LAVAL et al., 2002).
Com o intuito de analisar o desempenho das várias distâncias, nos diversos
modelos evolutivos, foram realizados vários estudos por simulação (TAKEZAKI e NEI,
1996; NAGAMINE e HIGUCHI, 2001; KALINOWSKI, 2002; LAVAL et al., 2002). Quando
92
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
foi assumido um equilíbrio entre mutação e deriva nas populações e que todas as
mutações resultavam em novos alelos (modelo de mutação IAM), a distância mais
adequada pareceu ser a distância padrão DS (NEI, 1978), devido à sua relação linear com
o tempo de divergência. No entanto, quando aplicada à informação alélica de
microssatélites, esta distância deixa de ser linear com o tempo devido à elevada taxa de
mutação deste tipo de marcador e ao facto do modelo de mutação mais aceite para estes
ser o modelo SMM. Com o objectivo de restabelecer a linearidade com o tempo, foram
desenvolvidas outras distâncias tais como as (δμ)2, D1 ou ASD (Average Squared
Difference), DSW e DR (GOLDSTEIN et al., 1995a, b; SHRIVER et al., 1995;
ZHIVOTOVSKY, 1999). Por outro lado, TAKEZAKI e NEI (1996) e LAVAL et al. (2002)
referiram que estas distâncias, apesar de serem lineares com o tempo de divergência,
apresentavam uma variância elevada, devido à taxa e processo mutacional dos
microssatélites, implícitos na definição destas distâncias. Além disso, revelaram
também grande variabilidade entre loci e entre espécies (NEI e KUMAR, 2000).
TAKEZAKI e NEI (1996) observaram ainda que as distâncias com melhores resultados em
termos de probabilidade de topologia verdadeira da árvore filogenética e de menor
variância, quando usadas com informação alélica de microssatélites, foram as distâncias
DA (NEI et al., 1983) e Dc (CAVALLI-SFORZA e EDWARDS, 1967). Apesar da distância
DA não ser linear com o tempo, apresenta uma boa aproximação à linearidade quando os
valores de DA são pequenos (NEI et al., 1983). Ela apresenta também menor variância
que DS, pelo que foi recomendada quando estivessem em causa períodos de tempo
relativamente curtos. Aparentemente, é preferível sacrificar um pouco a linearidade
temporal a diminuir a precisão. Contudo, não é obrigatório que a distância mais
adequada para estimar a topologia seja a mesma para estimar o tempo de divergência,
ou seja, o tamanho dos ramos das árvores filogenéticas (NEI et al., 1983; NEI e
TAKEZAKI, 1994). Quando são usados microssatélites, as distâncias genéticas (δµ)2
(GOLDSTEIN et al., 1995a, b) e Dsw (SHRIVER et al., 1995) fornecem as melhores
estimativas do tamanho dos ramos (TAKEZAKI e NEI, 1996; NEI e KUMAR, 2000). O
trabalho de RITZ et al. (2000) sobre a tribo Bovini parece suportar com dados reais as
conclusões de TAKEZAKI e NEI (1996) obtidas por simulação, ao concluirem que as
árvores construídas com a distância Dc apresentavam maiores valores de bootstrap que
as construídas com a distância (δμ)2.
93
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
De acordo com LAVAL (2001), para o caso das raças domésticas faz todo o sentido
considerar um modelo de equilíbrio deriva-migração, mas estes dois factores
dificilmente podem ser dissociados no mesmo modelo. Assim, segundo aqueles autores,
o cenário que melhor se adapta ao caso das raças de animais domésticos é a
diferenciação pela deriva genética. Neste contexto, está implícito que a diversidade
genética dentro das populações tende a diminuir, enquanto a diversidade genética entre
populações aumenta pela perda diferencial de alelos. Para o efeito, estudaram o
comportamento de diversas distâncias genéticas pressupondo um modelo de
diferenciação com base exclusivamente na deriva genética. Nesta circunstância, parece
ser preferível utilizar as distâncias genéticas passíveis de serem expressas em função da
perda de diversidade intra-racial, ou seja baseadas no coeficiente de coancestralidade
(REYNOLDS et al., 1983; LAVAL et al., 2002). As distâncias deste tipo mais
recomendadas são as distâncias DRey (REYNOLDS et al., 1983) e DL (LATTER, 1972).
No entanto, assumindo um modelo de deriva puro, as estimativas de distância só
reflectem a filogenia das populações em estudo se ambas tiverem um tamanho efectivo
idêntico (FELSENSTEIN, 1985b; EDING e LAVAL, 1999; LAVAL et al., 2002). No caso
concreto da distância DRey, a expectância é aproximadamente proporcional a t/2Ne, onde
t é o tempo em número de gerações e Ne a média harmónica do tamanho efectivo das
duas populações em causa. Como este pressuposto é pouco realista, no caso das raças de
animais domésticos, a interpretação da árvore não deve ser encarada numa perspectiva
filogenética, mas apenas como uma relação de similaridade.
Um outro aspecto que dificulta o estudo de populações com divergência recente é
o facto de, nestas circunstâncias, a estimativa da distância genética ser mais sensível ao
tamanho da amostra, enquanto que, à medida que a divergência aumenta se torna mais
dependente do número de loci e seu polimorfismo, característica que realça a utilidade
dos microssatélites neste tipo de estudo (LAVAL et al., 2002).
Para a construção de árvores a partir de distâncias genéticas, foram desenvolvidos
vários métodos, cada um com vantagens e desvantagens (NEI et al., 1983; SAITOU e
NEI, 1987; NEI, 1991; LI, 1997; NEI e KUMAR, 2000). Os mais utilizados são o método
Unweighted Pair-Group Method With Arithmetic Mean (UPGMA) (NEI e KUMAR,
2000) e o Neighbor Joining (NJ) (SAITOU e NEI, 1987; NEI e KUMAR, 2000). Com
excepção da situação em que se admite um tamanho efectivo da população constante e,
94
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
portanto, uma taxa de evolução igual entre as diferentes linhagens, o método NJ tem,
normalmente, um desempenho superior ao UPGMA (TAKEZAKI e NEI, 1996).
A estimativa da robustez das bifurcações (nós) das árvores pode ser estabelecida
por vários métodos (SITNIKOVA, 1996), sendo o mais utilizado o método bootstrap
(FELSENSTEIN, 1985a). Este assenta na re-amostragem, com reposição, de uma cifra prédefinida de replicações, com número de loci (ou indivíduos) igual ao tamanho original
da amostra e construída para cada replicação a respectiva árvore, representando a
percentagem de vezes que um mesmo nó aparece nestas árvores um indicador de
robustez. Assim sendo, é recomendável algum cuidado na interpretação dos valores de
bootstrap a fim de não se lhes ser atribuído um significado de indicador da
probabilidade da topologia da árvore obtida estar correcta. Assim, esta técnica apenas
optimiza a informação disponível, não a incrementa, estando portanto limitada pela
qualidade da informação usada (EDING e LAVAL, 1999). O factor que mais parece
afectar a robustez das árvores é o número de loci utilizados e o número de alelos
presentes em cada locus (TAKEZAKI e NEI, 1996; KALINOWSKI, 2002; KOSKINEN et al.,
2004).
Assim, mais que estabelecer as relações filogenéticas (relação evolutiva) entre as
raças de ovinos portuguesas, o presente estudo procurou usar o cálculo de distâncias
genéticas e a respectiva construção de árvores para analisar a relação de similaridade
entre aquelas.
3.4.1.4. Análise multivariada
Existem vários métodos de análise multivariada, adaptados aos diferentes tipos e
complexidade da tabela de dados (ESCOFIER e PAGÉS, 1998). Os utilizados com mais
frequência, no mesmo género do presente estudo, são a Análise de Componentes
Principais (ACP), a Análise de Factorial de Correspondência (AFC) e a Análise de
correspondência Múltipla (ACM). Contudo, o princípio destes métodos é comum e
consiste na representação de pontos (populações, indivíduos, ou loci) num espaço
métrico, cujos eixos principais, ortogonais, são calculados de forma a maximizar a
inércia da sua projecção (ESCOFIER e PAGÉS, 1998; CAÑON et al., 2001; LI et al.,
2002a).
95
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
O primeiro (ACP) adequa-se a variáveis quantitativas, podendo, no entanto,
utilizar-se os valores das frequências alélicas observadas em cada população, para as
representar num hiper-espaço que terá tantas dimensões quantos os alelos em análise. A
informação organiza-se numa tabela de contingência, recomendando CAVALLI-SFORZA
et al. (1994) que o valor de frequência de cada alelo seja normalizado, isto é, subtraído
o valor da média da frequência do alelo em causa no conjunto das populações e dividido
pelo valor do desvio padrão da frequência média, respectiva, a fim de evitar a obtenção
de um resultado distorcido.
O método AFC adequa-se a variáveis categóricas organizadas em tabelas de
contingência, mas utiliza um conceito diferente de similaridade entre linhas ou entre
colunas, a distância χ2 (uma variante da distância Euclideana) em vez do coeficiente de
correlação utilizado na ACP (ESCOFIER e PAGÉS, 1998).
Assim, quer a ACP quer a AFC apenas permitem visualizar os pontos médios das
populações em estudo, não representando nem considerando a variabilidade intrapopulação. Uma vez que em populações relativamente próximas, como é o caso de
raças de animais domésticos, aquela representa frequentemente a maior parte da
variabilidade encontrada, torna-se necessário ter alguma precaução na interpretação da
representação obtida.
Por último, o método ACM adequa-se a variáveis categóricas organizadas numa
tabela disjuntiva, no caso concreto “indivíduo x alelo”. Assim, o genótipo individual é
codificado para cada alelo anotando a sua ausência como 0, a presença na forma
heterozigótica como 1 e a presença na forma homozigótica como 2 (BELKHIR et al.,
2003). Ao contrário dos anteriores, este método torna possível a representação de todos
os indivíduos que constituem cada população, no espaço Euclideano, o que o torna mais
informativo.
Em qualquer destes métodos são determinados, para cada eixo, coeficientes
representativos da contribuição absoluta e relativa de cada variável (indivíduo,
população ou alelo). Os primeiros coeficientes exprimem a porção da inércia explicada
por cada variável em relação a cada eixo principal, enquanto que os segundos indicam a
parte da inércia de uma variável explicada pelo eixo principal.
Estes métodos são ferramentas puramente descritivas, têm a vantagem de não
assentarem em qualquer modelo evolutivo, e portanto, adequarem-se particularmente a
96
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
situações nas quais é admissível a ocorrência de um fluxo génico entre as populações
em estudo (MOAZAMI-GOUDARZI e LALOE, 2002). O facto de alguns trabalhos terem
relacionado parâmetros clássicos da genética de populações como o θRH de (ROBERTSON
e HILL, 1984) com o traço da AFC, ou a diversidade genética com o valor da inércia,
tem também contribuído para o aumento do seu uso em estudos deste âmbito (BELKHIR
et al., 2003).
3.4.2. Metodologia
3.4.2.1 Análise de pressupostos
O cálculo dos valores de FIS relativos a cada locus e raça, para expressar o desvio
ao HWE, foi efectuado segundo ROBERTSON e HILL (1984) e WEIR e COCKERHAM
(1984) e designados por fRH e fWC, respectivamente, utilizando para o efeito o programa
GENETIX (BELKHIR et al., 2003).
Dos métodos disponíveis para testar a significância dos desvios ao HWE foi
seleccionado o teste exacto de Fisher ou teste de probabilidade, por ser o mais
adequado a amostras de pequena dimensão e a loci com alelos raros de frequência
reduzida (WEIR, 1996). Este teste consiste em determinar uma probabilidade para todas
as amostras possíveis, com tamanho igual à amostra a testar, assumindo que a hipótese
nula (união de gâmetas aleatória) é verdadeira. Assim, desde que as amostras tenham
sido ordenadas de acordo com a sua probabilidade, o valor desta para a nossa amostra
será igual à soma das probabilidades de todas as amostras com menor probabilidade,
rejeitando-se a hipótese nula se esta for inferior a um determinado nível de significância
α (WEIR, 1996). O teste exacto foi realizado utilizando o programa informático
GENEPOP (RAYMOND e ROUSSET, 1995b). Como todos os microssatélites utilizados
apresentaram mais de 4 alelos, este programa seguiu o procedimento em cadeia de
Marchov para estimar o valor exacto de P sem distorção e respectivo erro padrão. Para o
efeito, foram definidas 1000 desmemorizações, 2000 lotes (batchs) e 2000 iterações por
lote. Na decisão de rejeição da hipótese nula considerámos um valor de α =0,05, o qual
após atender à correcção de Bonferroni foi transformado num valor nominal indicativo
ajustado de 0,00018 calculado por [0,05/(20*14)] (GOUDET, 2001).
97
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
Na análise do desequilíbrio de ligação genotípico para testar a significância da
associação entre genótipos em pares de loci, em cada população e para o conjunto das
populações, foi utilizado o teste log-likelihood ratio G-statistic, disponível no programa
FSTAT (GOUDET, 2001) e cujo valor de P foi calculado com base em 266000
permutações.
À semelhança do procedimento adoptado para testar o HWE, na decisão de
rejeição da hipótese nula, considerámos um valor de α =0,05, o qual após atender a
correcção de Bonferroni, foi transformado no valor nominal indicativo ajustado de
0,000019. A vantagem deste teste relativamente ao de FISHER reside no facto de cada
amostra ser ponderada pelo seu conteúdo informativo (GOUDET, 2001).
3.4.2.2 Estruturação da população
Tendo em conta as conclusões dos estudos mencionados atrás, bem como a
dificuldade em contabilizar o número de repetições presentes em cada microssatélite
quando este é do tipo imperfeito (o que acontece com grande parte dos que foram
utilizados neste estudo) e o facto do objecto deste estudo, serem raças de animais
domésticos cujo tempo de divergência se pressupõe relativamente limitado, optámos
pelos estimadores de FST clássicos que assentam no modelo IAM. Para o efeito,
determinámos os estimadores GST (NEI, 1987) e θ (WEIR e COCKERHAM, 1984)
recorrendo ao programa FSTAT (GOUDET, 2001), enquanto θRH (ROBERTSON e HILL,
1984) foi calculado com base no programa GENETIX (BELKHIR et al., 2003). Os valores
para os três estimadores foram por um lado, calculados quer para cada locus
individualmente quer para o conjunto de loci, considerando o conjunto das 14 raças; por
outro, para todas as combinações de pares de populações considerando o conjunto dos
19 loci.
O formulário utilizado pelos programas para estimar GST, θ e θRH é o seguinte:
G ST =
DST
HT
(NEI, 1973, 1977)
DST = Hˆ T − Hˆ S
Hˆ
Hˆ
1
Hˆ T = 1 − ∑ xk2 + ~ S − ~o , com x k2 = ∑ xik
i
s k
n s 2n
98
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
Hˆ ⎤
1
n~ ⎡
Hˆ S = ~ ⎢1 − ∑k xk2 − ~o ⎥ , com x k2 = ∑ xik2
n −1 ⎣
2n ⎦
s k
1
Hˆ o = 1 − ∑ ∑ X kii
s k i
onde DST é a média da diversidade genética intersubpopulacional, incluindo a
comparação das subpopulações com elas próprias; Ĥ S é a média aritmética de Ĥ Si
sobre o conjunto de loci sendo por sua vez Ĥ Si a média, sobre o conjunto de
subpopulações, da diversidade genética em cada locus por subpopulação; Ĥ T é a média
de Ĥ Ti sobre o conjunto de loci; xik e X kii são a frequência do alelo Ai e do genótipo
AiAi, respectivamente, na amostra da subpopulação k; s é o número de subpopulações;
n~ é a média harmónica do tamanho das amostras. Como DST depende do número de
subpopulações consideradas, GST é um estimador enviesado pelo que os autores
recomendam o cálculo de GST ' , principalmente, quando o tamanho da amostra é inferior
a 50.
GST ' =
s
Dm
, com D m =
DST
HT
( s − 1)
(NEI e CHESSER, 1983)
∑ σ ai
2
θ =
(
i
2
2
∑ σ + σ bi + σ wi
i
2
ai
)
(WEIR e COCKERHAM, 1984)
onde σ ai2 , σ bi2 , σ wi2 são os componentes de variância entre amostras, entre indivíduos
dentro de uma amostra e dentro dos indivíduos, respectivamente, para cada alelo e
locus, cujas fórmulas complexas de cálculo são descritas por WEIR e COCKERHAM, 1984
(1984).
θ RH = ∑
σ ai2 (1 − xi )
1
2
2
2
(σ ai + σ bi + σ wi ) n − 1
(ROBERTSON e HILL, 1984),
99
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
onde xi é a frequência observada do alelo i, k é o número de alelos no locus e σ ai2 , σ bi2 ,
σ wi2 têm o mesmo significado referido atrás.
Quando todas as amostras das subpopulações têm o mesmo tamanho, θ é igual ao
GST', afastando-se em valor quanto maior for a diferença entre o tamanho das amostras.
Como foi observado que alguns dos microssatélites utilizados não se encontravam
em HWE em certas raças, optámos por seguir o teste exacto de diferenciação baseado
na hipótese de amostragem independente de genótipos em vez de amostragem
independente de alelos (GOUDET et al., 1996). Assim, testámos a diferenciação
genotípica e não a diferenciação alélica das raças ovinas. Para o caso, utilizámos o
programa GENEPOP realizando dois testes exactos (GOUDET et al., 1996), um que
analisou a diferenciação genotípica do conjunto de todas as raças para cada
microssatélite e para o seu conjunto (opção 3, sub-opção 3) e outro que analisou cada
par de raças para cada marcador e para o conjunto de marcadores (opção 3, sub-opção
4). Ambos foram realizados com 5000 dememorizações, 2000 lotes (batches) e 1000
iterações por lote.
3.4.2.3 Distâncias genéticas e construção de fenogramas
Pelas razões invocadas na introdução, principalmente no que se refere às
conclusões obtidas por LAVAL et al. (2002), optámos por considerar as distâncias
genéticas DRey (REYNOLDS et al., 1983) e DL (LATTER, 1972) como as mais adequadas
ao nosso estudo e portanto a utilizar como referência. No entanto, atendendo ao facto de
ser impossível saber, com precisão, a contribuição relativa de cada um dos factores
responsáveis pela diferenciação das raças de animais domésticos, calculámos também
outras distâncias como a DA (NEI et al., 1983) e DC (CAVALLI-SFORZA e EDWARDS,
1967), por terem sido as que apresentaram maiores valores de probabilidade de
obtenção da topologia correcta das árvores filogenéticas, sob o modelo evolutivo de
equilíbrio mutação-deriva em estudos de simulação (TAKEZAKI e NEI, 1996) e a clássica
distância DS (NEI, 1972) como elemento de comparação.
Pelo contrário, as distâncias ditas específicas para os microssatélites não foram
consideradas, pelas razões apontadas por TAKEZAKI e NEI (1996) que obtiveram baixos
valores de probabilidade de obtenção da topologia correcta das árvores filogenéticas
100
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
envolvendo populações com divergência recente, como considerámos ser o caso de
raças portuguesas de ovinos. Além disso, estas distâncias requerem que a informação
alélica seja expressa em número de unidade de repetição do microssatélite, em vez do
tamanho absoluto do fragmento amplificado, informação que nem sempre é fácil de
obter, porque raramente os microssatélites são do tipo perfeito.
Da mesma forma, o método de referência que utilizámos para a construção das
árvores foi o NJ, embora tenhamos construído também as árvores pelo método UPGMA
para comparação.
Para estimar a confiança dos nós (ramificações) das árvores utilizámos o método
bootstrap (FELSENSTEIN, 1985a) considerando 1000 replicações sobre os loci.
Todos estes cálculos foram realizados recorrendo ao programa POPULATIONS
1.2.28 (LANGELLA, 2002). A computação das distâncias genéticas neste programa
assenta no seguinte formulário:
r
DRey =
∑aj
j
r
∑ (a j + b j )
(REYNOLDS et al., 1983)6
j
onde aj e bj são os componentes de variância dentro e entre o par de populações,
respectivamente, e cujo detalhe das fórmulas de cada componente remetemos para
REYNOLDS et al. (1983);
Dc =
2 r
⎛ mj
⎞
∑ 2⎜1 − ∑ yij xij ⎟
i
rπ j ⎝
⎠
DA = 1 −
1 r mj
∑∑ xij yij
r j i
(CAVALLI-SFORZA e EDWARDS, 1967);
(NEI et al., 1983; TAKEZAKI e NEI, 1996);
Em rigor, REYNOLDS et al., (1983) definiram como distância o valor D=–ln(1-θw), enquanto o valor
calculado para esta distância pelo programa "Populations" corresponde apenas a θw aqui designado de
DRey. No entanto, quer em termos numéricos quer em topografia da árvore obtida a diferença observada é
insignificante para as duas formas de expressar a distância.
6
101
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
⎛ 1 r mj 2 1 r mj 2 ⎞
⎜ ∑ ∑ xij − ∑ ∑ yij ⎟
r mj
r j i
⎜r j i
⎟ − 1 ∑ ∑ xij yij
⎜
⎟ r j i
2
⎜
⎟
⎠
DL = ⎝
1 r mj
1 − ∑ ∑ xij yij
r j i
⎛
1 r mj
⎜
∑ ∑ xij yij
⎜
r j i
DS = − ln⎜
1 r mj 2 1 r mj 2
⎜⎜
∑ ∑ xij * ∑ ∑ yij
r j i
⎝ r j i
⎞
⎟
⎟
⎟
⎟⎟
⎠
(TAKEZAKI e NEI, 1996);
(NEI, 1972; TAKEZAKI e NEI, 1996)
onde xij e yij são as frequências alélicas na população x e y para o locus j, r o número de
locus e mj o número de alelos para o locus j.
Para representar as relações de similaridade entre populações optámos pelo tipo de
árvore sem raiz ou fenograma (unrooted tree), pois neste caso não são necessários
pressupostos sobre as populações, nem conhecimento sobre antepassados comuns (LI,
1997). Um outro aspecto que contribuiu para a opção tomada foi o facto de não termos
disponível informação alélica de uma população muito distante das que estão em estudo
para ser utilizada como outgroup. A topologia das árvores foi desenhada utilizando o
programa TREEVIEW 1.6.6 (PAGE, 1996).
A fim de obter uma estimativa do tempo de divergência entre as raças de ovinos
portuguesas, utilizámos a expressão t=DS/2α (NEI, 1987), onde t é o tempo em número
de gerações, DS é a distância genética padrão de NEI atrás definida e α é a taxa de
mutação dos microssatélites a qual, no caso concreto, considerámos ter o valor médio de
1,1*10-4 mutações/geração/locus (CRAWFORD e CUTHBERTSON, 1996).
Com o propósito de estabelecermos, de alguma forma, uma base de comparação
com os resultados de TEIXEIRA (1991), foi utilizada uma matriz de distâncias D de
MAHALANOBIS obtida por aquele com dados morfométricos e uma outra com a distância
DRey obtida no presente estudo com informação alélica de microssatélites para construir
duas árvores pelo método NJ, envolvendo apenas as 7 raças portuguesas do tipo churro.
Para determinar a existência de correlação significativa entre as matrizes das
várias distâncias genéticas calculadas, foi realizado o teste de Mantel, uma vez que a
forma clássica de aferição do grau de significância pelo coeficiente de correlação de
102
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
PEARSON (r) não pôde ser utilizada pois os elementos de cada matriz não eram
independentes. A base deste teste consiste na determinação de r entre as duas matrizes
originais sendo posteriormente comparado com uma distribuição desse mesmo
coeficiente, obtida pela permutação aleatória da ordem das populações numa das duas
matrizes de distâncias. O valor de probabilidade de erro (P) na rejeição da hipótese nula
de independência das duas matrizes foi calculado por P=(n+1)/(N+1), onde n
representou o número de vezes em que o valor de r obtido por permutação foi superior
ou igual ao valor desse coeficiente calculado pelos dados reais e N foi o número de
permutações efectuadas. Para o efeito utilizámos o programa GENETIX (BELKHIR et al.,
2003) definindo 10000 permutações.
3.4.2.4 Análise multivariada
A informação genotípica individual para os 19 loci foi também utilizada para
realizar uma AFC7 com recurso ao programa GENETIX (BELKHIR et al., 2003) na rotina
“AFC sobre populações”, o que permitiu representar no espaço euclidiano quer os 717
animais das 14 raças de ovinos, quer os seus “baricentros” e analisar a sua
dissemelhança com base na distância χ2. Foi também realizada uma análise idêntica à
anterior mas com apenas 3 raças (CB, CTQ e CM) para avaliar o efeito do número de
populações em análise no desempenho deste método. Foram calculados coeficientes
indicadores da contribuição absoluta e relativa de cada indivíduo ou alelo (variáveis)
para cada eixo (factor). Os primeiros (contribuição absoluta) exprimem a porção da
inércia explicada por cada variável em relação a cada eixo principal, enquanto que os
segundos (contribuição relativa) indicam a parte da inércia de uma variável explicada
por cada eixo principal.
7
Em rigor no caso da análise multivariada que envolve a representação dos indíviduos a designação mais
correcta seria a de Análise de Correspondência Múltipla conforme foi já explicitado no ponto 3.4.1.4.,
contudo tal diferenciação não consta no menu do programa Genetix, razão pela qual também não será
feita aqui.
103
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
3.4.3. Resultados
3.4.3.1. Análise de pressupostos
3.4.3.1.1. Equilíbrio de Hardy-Weinberg
Os valores de FIS para cada locus e raça, estimados segundo ROBERTSON e HILL
(1984) e WEIR e COCKERHAM (1984), encontram-se em anexo nas Tabelas 6 e 7 do
Anexo 3, respectivamente. Tendo-se verificado uma correlação altamente significativa
(r=0,91) entre as duas estimativas, foram analisados apenas os valores obtidos pelo
segundo método por ser o de aplicação mais corrente, facilitando assim a comparação
de resultados. Na sua grande maioria, os valores de FIS foram positivos indicando, por
isso, um défice de heterozigotos. Os microssatélites McM357, OarHH64, ETH225 e
BM6444 registaram os valores médios mais elevados e os microssatélites MAF23,
OarFCB48, BM6506 e BM4621 os menores. Por seu lado, as raças BEDM e MB foram
as que apresentaram o maior (0,141) e o menor (0,045) valor de FIS, respectivamente.
Quando foi considerado o conjunto das 14 raças como uma população única, os
desvios ao HWE apresentaram-se significativos para todos os loci estudados, o que
concorda com a existência de uma estruturação em raças.
Na análise parcelar, foram realizados 280 testes (14 populações x 20 loci) tendo
sido observado que apenas 23 apresentavam um défice significativo (P<0,05) de
heterozigotos, correspondendo a 6 microssatélites em pelo menos uma raça (Tabela 8).
Tabela 8. Valores médios de FIS por raça e microssatélites com desvio significativo ao HWE.
Raça
BEDM
CA
CB
CC
CGB
CGM
CM
CMP
CTQ
MB
MBB
MP
SE
SL
Média
Microssatélite§
BM6444, McM357
BM6444, McM357
McM357
McM357, OarFCB20
McM357
McM357, OarHH64
McM357, OarFCB11, OarHH64
McM357
McM357, OarHH64
McM357
McM357
BM6444, ETH225, McM357, OarHH64
McM357
fRH
0,114
0,071
0,065
0,069
0,038
0,081
0,094
0,051
0,079
0,032
0,089
0,084
0,045
0,055
0,069
fWC
0,141
0,075
0,061
0,083
0,046
0,082
0,120
0,076
0,106
0,050
0,111
0,127
0,063
0,057
0,086
IC(95%)*
(0,089-0,171)
(0,028-0,101)
(0,008-0,093)
(0,023-0,112)
(0,003-0,068)
(0,040-0,104)
(0,070-0,149)
(0,032-0,101)
(0,067-0,130)
(0,009-0,074)
(0,063-0,138)
(0,089-0,144)
(0,014-0,092)
(0,012-0,082)
§- Microssatélites com desvio significativo (P<0,05) ao HWE; *Intervalo de confiança de fWC a 95% obtido com 10000 Bootstrap's
104
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
O microssatélite McM357 apresentou um défice de heterozigotos significativo
para todas as raças estudadas, com excepção da SE, o que sugere a presença de alelos
nulos neste microssatélite, hipótese também aventada por outros autores (DIEZ-TASCON
et al., 2000). Por tal motivo, este locus foi excluído nas análises estatísticas destinadas a
avaliar a diversidade entre raças do presente capítulo, na avaliação das raças a conservar
e na discriminação racial dos dois capítulos seguintes. Os restantes 5 microssatélites
apenas apresentaram desvio significativo para entre uma a quatro raças. Apesar de no
microssatélite ETH225 ter sido apontada, como provável, a presença de alelos nulos
(DIEZ-TASCON et al., 2000), apenas foi registado um desvio significativo na raça MP.
Quanto aos outros 4 loci, não foram referidos, na literatura, desvios sistemáticos do
HWE em outras raças de ovinos, tornando a hipótese da presença de alelos nulos pouco
provável. Por outro lado, tratando-se de marcadores anónimos, e desconhecendo-se a
composição génica na sua vizinhança, a hipótese de selecção contra heterozigotos não
pode ser excluída.
Quando foi considerada a análise por raça, verificámos que, após exclusão do
microssatélite McM357, a raça MP apresentou um défice significativo de heterozigotos
para três loci (BM6444, ETH225 e OarHH64), a CM para dois (OarFCB11 e OarHH64)
e as raças BEDM, CA, CC, CGM e CTQ apenas para um.
3.4.3.1.2. Desequilíbrio de ligação (DL)
A análise do desequilíbrio de ligação quando foi realizada em cada raça
separadamente, revelou três associações significativas que são apresentadas na Tabela 9.
Destas, só uma - entre MAF209 e OarFCB48 - se refere aos loci situados no mesmo
cromossoma (17), e por isso os únicos passíveis de uma eventual ligação física. No
entanto, como não foi observado nenhum desequilíbrio de ligação significativo
(P<0,001) entre loci quando a análise foi realizada considerando simultaneamente a
globalidade dos animais, o mais provável é tratar-se do efeito da subestruturação
(OHTA, 1982) da população ovina em raças. De facto, basta que dois loci num mesmo
cromossoma se encontrem a mais de 10 cM de distância para que a taxa de
recombinação torne imperceptível a segregação alélica (GEORGES et al., 1995).
105
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
Tabela 9. Pares de microssatélites com desequílíbrio de ligação significativo por raça.
Microssatélites
Raça
OarFCB20 (2)
—
OarCP20 (21)
CMP
MAF209 (17)
—
OarFCB48 (17)
CC
BM6444 (2)
—
OarFCB48 (17)
MP
() - Números entre parênteses referem-se à localização cromossómica dos microssatélites
Assim, na análise do HWE e do DL, com excepção do microssatélite McM357,
não foram detectados desvios significativos dos pressupostos necessários para a
aplicação dos métodos estatísticos subsequentes, pelo que foram utilizados os restantes
19 microssatélites. Contudo, de acordo com MAUDET et al. (2002a) o cumprimento
estrito de todos os pressupostos não parece ser muito relevante uma vez que não foram
observadas diferenças nas suas conclusões, quando a análise de dados em raças bovinas
e caprinas francesas foi realizada, excluindo ou incluindo os microssatélites que não
cumpriam os referidos pressupostos.
3.4.3.2 Estruturação da população
Na Tabela 10 são apresentados os valores de θ para cada par de raças o qual
variou entre 0,005 para o par CM/CTQ e 0,060 para o par CA/MB. De uma forma geral,
tanto a CA como o MB são as raças que maiores valores de θ partilham com as restantes
raças. Apesar de praticamente todos os valores de θ sereminferiores a 0,05, sugerindo
uma fraca diferenciação genética (HARTL e CLARK, 1997), todos eles foram
significativamente (P<0,01) diferentes de zero, demonstrando o elevado poder do teste
Tabela 10. Valores de θWC por pares de raças, calculados de acordo com WEIR e COCKERHAM
(1984) considerando os 19 microssatélites.
BEDM
CA
CB
CC
CGB
CGM
CM
CMP
CTQ
MB
MBB
MP
SE
CA
CB
CC CGB
0,044 0,022 0,014 0,012
0,059 0,048 0,034
0,027 0,022
0,017
CGM
0,016
0,040
0,026
0,013
0,009
CM
0,017
0,047
0,027
0,018
0,018
0,014
CMP
0,028
0,031
0,035
0,031
0,018
0,024
0,020
106
CTQ
0,015
0,037
0,024
0,017
0,011
0,012
0,005
0,014
MB
0,039
0,060
0,056
0,036
0,031
0,028
0,044
0,039
0,031
MBB
0,017
0,038
0,032
0,021
0,017
0,014
0,021
0,018
0,010
0,027
MP
0,016
0,040
0,027
0,019
0,013
0,012
0,021
0,022
0,017
0,021
0,017
SE
0,022
0,042
0,033
0,024
0,021
0,016
0,027
0,023
0,016
0,035
0,017
0,020
SL
0,028
0,044
0,036
0,030
0,022
0,022
0,027
0,022
0,019
0,039
0,022
0,025
0,020
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
estatístico aplicado, associado ao elevado polimorfismo deste tipo de marcadores.
No que se refere ao teste de diferenciação genética, o resultado foi significativo
(P<0,01) para todos os microssatélites quando se analisou o conjunto das raças ou a
diferenciação entre pares de raças, considerando simultaneamente os 19 microssatélites,
mesmo para aquelas que se esperaria estarem mais proximamente relacionados (caso da
CTQ/CM, CGB/CGM e dos merinos). No entanto, nenhum par de raças foi
significativamente diferente em simultâneo para todos os 19 microssatélites, ou seja,
houve alguns microssatélites cuja distribuição genotípica não diferiu entre alguns pares
de raças. Contudo, uma diferença genética entre populações estatisticamente
significativa não implica, obrigatoriamente, diferenças evolutivas ou biológicas
(HEDRICK, 1999; KALINOWSKI, 2002).
Na Tabela 11 são apresentados os valores de θWC, θRH, GST e GST', para cada
microssatélite e para a totalidade dos 19 microssatélites quando considerámos o
conjunto das 14 raças. Os valores obtidos para os três estimadores foram muito
semelhantes como pode ser verificado na Figura 12. Esta semelhança entre estimadores
foi também referida por outros autores, nomeadamente ARRANZ et al. (2001b). Por este
motivo e pelo facto do estimador θWC, que designámos apenas de θ, ser o mais
frequentemente utilizado, optámos por considerar apenas este na discussão.
Tabela 11. Estimadores da subdivisão genética da população ovina portuguesa para os 19
microssatélites.
Locus
BM1824
BM4621
BM6444
BM6506
BM757
ETH225
MAF209
MAF23
McM214
McM218
OarCP20
OarCP34
OarCP49
OarFCB11
OarFCB128
OarFCB20
OarFCB304
OarFCB48
OarHH64
Média (Global)
θ WC
0,031
0,018
0,028
0,012
0,019
0,036
0,030
0,033
0,021
0,034
0,029
0,037
0,022
0,035
0,036
0,024
0,010
0,022
0,025
0,026
θ RH
0,024
0,017
0,021
0,010
0,015
0,026
0,022
0,015
0,015
0,035
0,016
0,028
0,017
0,021
0,024
0,011
0,013
0,018
0,023
0,019
107
G ST
0,027
0,017
0,027
0,011
0,018
0,032
0,029
0,031
0,018
0,031
0,024
0,033
0,021
0,030
0,032
0,022
0,008
0,021
0,023
0,024
G ST'
0,029
0,018
0,029
0,012
0,019
0,034
0,031
0,033
0,019
0,033
0,026
0,035
0,022
0,033
0,034
0,023
0,009
0,022
0,025
0,026
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
Figura 12. Relação entre os valores de θ e os respectivos valores de θRH e GST'.
Os valores de θ variaram entre 0,010 e 0,037 para os microssatélites OarFCB304 e
OarCP34, respectivamente, com um valor global de 0,026±0,002, indicando que cerca
de 2,6% da variação genética total corresponde a diferenças entre raças; enquanto os
restantes 97,4% correspondem a diferenças entre indivíduos (HARTL e CLARK, 1997).
Este valor é superior ao apresentado por NYAMSAMBA et al. (2002) para 7 raças de
cabras da Mongólia (θ=0,17) e é relativamente próximo do obtido por IRIONDO et al.
(2002) para quatro raças ovinas Bascas (θ=0,031±0.004) e por IVANKOVIC et al., (2002)
para 3 raças croatas de asininos (θ=0,024), mas menos de metade do valor apontado por
(ARRANZ et al., 2001b) para 5 raças espanholas de ovinos (θ=0,073).
3.4.3.3 Distâncias genéticas e construção de fenogramas
Os valores obtidos no cálculo das distâncias DRey e DL para cada par de raças,
admitindo um hipotético contexto evolutivo assente na deriva genética, são
apresentados na Tabela 12. Os valores da distância DRey variaram entre 0,006 para o par
CTQ/CM e 0,062 para o par CA/MB, ou seja, o último cerca de dez vezes mais do que o
primeiro valor. Se considerarmos que o intervalo de variação possível desta distância é
entre zero e um [0,1], os valores obtidos são relativamente pequenos. Os valores
registados para a distância DL foram semelhantes, tendo variado entre 0,015 para o par
108
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
CTQ/CM e 0,068 para o par CA/MB. Devido à natureza da definição destas distâncias,
os seus valores são também próximos dos obtidos na análise da diferenciação pelo FST.
Tabela 12. Valores das distâncias genéticas DRey (acima da diagonal) e de DL (abaixo da diagonal).
BEDM
CA
CB
CC
CGB
CGM
CM
CMP
CTQ
MB
MBB
MP
SE
SL
BEDM
0
0,055
0,033
0,029
0,023
0,027
0,029
0,039
0,025
0,049
0,029
0,027
0,033
0,039
CA
0,046
0
0,069
0,060
0,043
0,050
0,057
0,041
0,046
0,068
0,048
0,050
0,052
0,054
CB
0,023
0,061
0
0,040
0,032
0,036
0,038
0,044
0,034
0,065
0,042
0,038
0,042
0,046
CC
0,016
0,050
0,028
0
0,030
0,027
0,032
0,044
0,030
0,048
0,035
0,033
0,037
0,043
CGB
0,013
0,035
0,023
0,017
0
0,019
0,029
0,027
0,020
0,039
0,028
0,023
0,031
0,032
CGM
0,017
0,041
0,027
0,014
0,009
0
0,025
0,034
0,021
0,037
0,024
0,022
0,026
0,032
CM
0,019
0,049
0,029
0,020
0,019
0,015
0
0,030
0,015
0,053
0,031
0,032
0,037
0,038
CMP
0,029
0,032
0,036
0,032
0,018
0,025
0,021
0
0,024
0,048
0,028
0,032
0,033
0,032
CTQ
0,016
0,038
0,025
0,018
0,011
0,012
0,006
0,015
0
0,040
0,020
0,026
0,025
0,028
MB
0,041
0,062
0,058
0,037
0,031
0,029
0,045
0,040
0,032
0
0,036
0,030
0,043
0,048
MBB
0,019
0,040
0,033
0,022
0,018
0,015
0,022
0,019
0,011
0,028
0
0,028
0,027
0,032
MP
0,017
0,042
0,029
0,020
0,014
0,013
0,023
0,023
0,018
0,022
0,018
0
0,030
0,035
SE
0,023
0,044
0,034
0,025
0,022
0,017
0,028
0,024
0,016
0,036
0,018
0,021
0
0,030
SL
0,029
0,046
0,037
0,031
0,023
0,023
0,028
0,023
0,019
0,040
0,023
0,026
0,021
0
Na Tabela 13 são apresentados os resultados obtidos para as distâncias Dc e DA e
na Tabela 14 para a distância DS e para o tempo de divergência entre raças. Estas três
distâncias são mais adequadas a um contexto de diferenciação baseado num equilíbrio
mutação-deriva. Os valores da distância DC variaram entre 0,197 para o par CTQ/CM e
0,331 para o par CA/MB, enquanto que os das distâncias DA e DS variaram entre 0,053 e
0,147 e entre 0,045 e 0,235, para os mesmos pares de populações. O tempo de
divergência (em gerações) variou entre 205 para o par CTQ/CM e 1068 para o par
CA/MB. Para converter o tempo de divergência para anos podemos considerar um valor
médio de 1,5 anos entre gerações.
Tabela 13. Valores das distâncias genéticas DA (acima da diagonal) e de DC (abaixo da diagonal).
BEDM
CA
CB
CC
CGB
CGM
CM
CMP
CTQ
MB
MBB
MP
SE
SL
BEDM
0
0,314
0,264
0,284
0,241
0,247
0,262
0,253
0,242
0,279
0,250
0,251
0,252
0,275
CA
0,132
0
0,317
0,327
0,289
0,314
0,325
0,283
0,286
0,331
0,291
0,306
0,309
0,311
CB
0,094
0,138
0
0,273
0,242
0,258
0,267
0,267
0,240
0,290
0,276
0,262
0,263
0,297
CC
0,109
0,142
0,099
0
0,281
0,260
0,278
0,283
0,258
0,288
0,269
0,283
0,271
0,293
CGB
0,082
0,116
0,083
0,106
0
0,222
0,261
0,241
0,216
0,274
0,262
0,237
0,251
0,264
CGM
0,083
0,131
0,090
0,090
0,069
0
0,252
0,241
0,227
0,265
0,252
0,241
0,234
0,269
CM
0,094
0,142
0,096
0,102
0,094
0,088
0
0,259
0,197
0,287
0,249
0,264
0,267
0,274
109
CMP
0,084
0,109
0,097
0,105
0,079
0,078
0,088
0
0,219
0,266
0,237
0,247
0,231
0,261
CTQ
0,080
0,109
0,076
0,089
0,069
0,072
0,053
0,064
0
0,247
0,210
0,230
0,223
0,241
MB
0,102
0,147
0,112
0,112
0,100
0,094
0,108
0,093
0,080
0
0,250
0,222
0,269
0,283
MBB
0,082
0,122
0,102
0,096
0,096
0,087
0,082
0,076
0,059
0,083
0
0,240
0,234
0,247
MP
0,083
0,127
0,091
0,106
0,077
0,078
0,092
0,080
0,070
0,064
0,079
0
0,244
0,269
SE
0,084
0,127
0,093
0,097
0,085
0,077
0,094
0,070
0,067
0,096
0,074
0,080
0
0,261
SL
0,100
0,128
0,118
0,116
0,097
0,099
0,099
0,091
0,077
0,108
0,083
0,095
0,092
0
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
Tabela 14 Valores da distância genética DS (acima da diagonal) e do tempo de divergência em
gerações (abaixo da diagonal).
BEDM
CA
CB
CC
CGB
CGM
CM
CMP
CTQ
MB
MBB
MP
SE
SL
BEDM
CA
CB
CC
814
450
459
368
423
409
582
400
827
445
423
509
609
0,179
968
914
632
732
805
555
677
1068
700
732
755
791
0,099
0,213
568
450
505
505
609
473
1000
591
527
600
655
0,101
0,201
0,125
491
423
468
673
486
809
550
514
591
700
CGB CGM
0,081
0,139
0,099
0,108
300
418
405
327
668
441
364
505
514
0,093
0,161
0,111
0,093
0,066
355
505
332
600
373
341
405
500
CM
CMP
CTQ
MB
MBB
MP
SE
SL
0,090
0,177
0,111
0,103
0,092
0,078
418
205
823
455
459
541
545
0,128
0,122
0,134
0,148
0,089
0,111
0,092
341
741
405
473
482
459
0,088
0,149
0,104
0,107
0,072
0,073
0,045
0,075
659
309
409
386
436
0,182
0,235
0,220
0,178
0,147
0,132
0,181
0,163
0,145
573
473
705
782
0,098
0,154
0,130
0,121
0,097
0,082
0,100
0,089
0,068
0,126
423
409
500
0,093
0,161
0,116
0,113
0,080
0,075
0,101
0,104
0,090
0,104
0,093
464
541
0,112
0,166
0,132
0,130
0,111
0,089
0,119
0,106
0,085
0,155
0,090
0,102
459
0,134
0,174
0,144
0,154
0,113
0,110
0,120
0,101
0,096
0,172
0,110
0,119
0,101
-
Os intervalos de valores possíveis para a distância DC, DA e DS são (0, 2
2
π
), (0,1) e
(0,∞), respectivamente. Quando comparámos os resultados obtidos através deste tipo de
distâncias com os registados tendo em conta as distâncias que assentam apenas na
deriva, verificámos que o intervalo relativo de variação foi maior nas distâncias do
primeiro tipo (DRey e DL), enquanto que os valores absolutos foram superiores nas do
segundo tipo. Apesar disso, e à semelhança do que referiu BARKER (1999), registámos
uma correlação altamente significativa (P<0,001) entre todas os pares de matrizes das
distâncias utilizadas (Tabela 15).
Tabela 15. Matriz de coeficientes de correlação de Pearson entre distâncias genéticas.
DA
DC
DL
DRey
DS
DA
1
DC
0,991
1
DL
0,860
0,868
1
DRey
0,828
0,832
0,993
1
DS
0,837
0,848
0,982
0,982
1
Na Figura 13 são apresentadas as árvores construídas a partir das matrizes de
distâncias DRey e DL pelo método NJ as quais evidenciam mais facilmente as relações de
similaridade entre as raças portuguesas de ovinos. Estas duas árvores, apesar de muito
semelhantes (embora se apresentem em posição invertida), diferem principalmente no
ramo que representa a divergência entre as raças CTQ e CM. No caso da distância DRey,
110
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
A
B
Figura 13. Fenograma construído a partir das distâncias genéticas DRey (A) e de DL (B) pelo método
Neighbour-Joining.
111
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
o ramo da CTQ apresenta-se praticamente imperceptível. O facto de se considerar que
ramos muito curtos são característicos de situações nas quais as populações sofreram
fluxo génico (cruzamento) (CAVALLI-SFORZA et al., 1994), concorda com o que se
supõe saber sobre a CTQ, e revela que a distância DRey foi mais eficiente na detecção
desse fenómeno.
Da análise destes fenogramas deduziu-se que as raças CA, MB, SL e CB são as
que mais distam entre si enquanto os pares CTQ/CM e CGM/CGB são os que mais se
assemelham.
Na Figura 14 são apresentadas as árvores construídas a partir das matrizes de
distâncias DA e DC pelo método NJ. Apesar de verificarmos globalmente uma
concordância entre os resultados que foram obtidos e o que tem sido escrito quanto à
origem das raças portuguesas, a robustez da topologia destas árvores não foi
significativa. A melhor árvore, de acordo com o critério de valor de bootstrap, foi a
construída com a DRey que apresentou um valor médio maior (34,5%), mas não foi
muito diferente dos valores de 34,3%, 33,3%, 30,3% e 30,3% obtidos para as árvores
construídas com as distâncias DL, DS, DA e DC, respectivamente.
Nesta árvore, os valores de bootstrap mais elevados foram atingidos nas
ramificações periféricas envolvendo o par CM/CTQ com 88%, o par CA/CMP com
80% e o par MB/MP com 80%, enquanto os nós internos apresentaram valores
inferiores a 25%. Também a maioria dos trabalhos referidos a raças domésticas,
nomeadamente de bovinos (MACHUGH et al., 1997; MOAZAMI-GOUDARZI et al., 1997;
DEL BOL et al., 2001), de caprinos (SAITBEKOVA et al., 1999), de galináceos (WIMMERS
et al., 2000) e de canídeos (KOSKINEN e BREDBACKA, 2000), dão conta de valores de
bootstrap baixos.
Na comparação entre a análise morfométrica (TEIXEIRA, 1991) e a informação
molecular das raças churras portuguesas verificámos que os resultados produzidos
foram diferentes, sendo a correlação entre a matriz de distâncias D e a da distância DRey
não significativa (r=0,729; P=0,104) e a topologia das árvores, por consequência,
também diferente.
112
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
C
D
Figura 14. Fenograma construído a partir das distâncias genéticas DA (C) e de DC (D) pelo método
Neighbour-Joining.
113
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
Apesar de verificarmos globalmente uma concordância entre os resultados que
foram obtidos e o que tem sido escrito quanto à origem das raças portuguesas, a
robustez da topologia destas árvores não foi significativa. A melhor árvore, de acordo
com o critério de valor de bootstrap, foi a construída com a DRey que apresentou um
valor médio maior (34,5%), mas não foi muito diferente dos valores de 34,3%, 33,3%,
30,3% e 30,3% obtidos para as árvores construídas com as distâncias DL, DS, DA e DC,
respectivamente.
Nesta árvore, os valores de bootstrap mais elevados foram atingidos nas
ramificações periféricas envolvendo o par CM/CTQ com 88%, o par CA/CMP com
80% e o par MB/MP com 80%, enquanto os nós internos apresentaram valores
inferiores a 25%. Também a maioria dos trabalhos referidos a raças domésticas,
nomeadamente de bovinos (MACHUGH et al., 1997; MOAZAMI-GOUDARZI et al., 1997;
DEL BOL et al., 2001), de caprinos (SAITBEKOVA et al., 1999), de galináceos (WIMMERS
et al., 2000) e de canídeos (KOSKINEN e BREDBACKA, 2000), dão conta de valores de
bootstrap baixos.
Na comparação entre a análise morfométrica (TEIXEIRA, 1991) e a informação
molecular das raças churras portuguesas verificámos que os resultados produzidos
foram diferentes, sendo a correlação entre a matriz de distâncias D e a da distância DRey
não significativa (r=0,729; P=0,104) e a topologia das árvores, por consequência,
também diferente.
Na Figura 15, é apresentada a árvore obtida com a matriz de distâncias D de
Mahalanobis calculada com informação morfométrica (TEIXEIRA, 1991) e na Figura 16,
a árvore obtida utilizando a matriz de distâncias DRey baseada na informação alélica de
microssatélites, ambas construídas pelo método NJ e relativas às mesmas 7 raças
churras portuguesas.
Apesar do risco que é realizar uma comparação com base em duas distâncias de
natureza diferente, julgamos ser interessante considerar alguns aspectos mais relevantes
entre as duas abordagens:
- Em ambas as árvores nota-se que a raça a CA foi a mais distante de todas as
outras;
- Na Figura 15 a raça CM foi a mais próxima da CA enquanto na Figura 16 foi a
CGB;
114
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
Figura 15. Fenograma construído a partir da distância genética D2 pelo método Neighbour-Joining.
88
44
27
31
63
Figura 16. Fenograma construído a partir da distância genética DRey pelo método NeighbourJoining.
115
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
- Na Figura 15 a raça mais afastada da CA foi a CC enquanto que na Figura 16 foi
a CB, no entanto, nesta representação, as raças CB e CC apresentaram-se próximas;
- Na Figura 15 as raças CGM e CC situaram-se no mesmo ramo enquanto que na
Figura 16 a CGB substituiu a CC.
3.4.3.4 Análise multivariada
A representação gráfica a 3 dimensões dos indivíduos de cada uma das 14 raças
de ovinos, resultante da AFC, apresenta-se na Figura 17. Esta análise revela que a CA é
a única raça cuja totalidade dos indivíduos se encontram claramente separados num dos
lados, situando-se no extremo oposto, mais ou menos isolados, os indivíduos das raças
MB, MP e um ou outro de MBB e SE. A elevada variabilidade intra-racial e o número
relativamente grande de populações em estudo dificultaram a discriminação dos
indivíduos das restantes raças.
BEDM
CA
CB
CC
CGB
CGM
CM
CMP
CTQ
MB
MBB
MP
SE
SL
Figura 17. Análise Factorial de Correspondência realizada a partir dos genótipos individuais das 14
raças ovinas.
O número de populações em análise foi de facto um aspecto relevante como o
demonstram os resultados obtidos quando se analisou apenas três raças (CB, CTQ e
CM), uma vez que, apesar de serem populações das mais próximas considerando as
distâncias genéticas atrás obtidas, foi possível separar a quase totalidade dos seus
indivíduos como mostra a Figura 18.
116
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
Figura 18. Análise Factorial de Correspondência realizada a partir dos genótipos individuais das
raças CB, CM e CTQ.
A partir da substituição das nuvens de indivíduos de cada raça observadas na
Figura 17, pelo respectivo centro de gravidade ou baricentro (BELKHIR et al., 2003),
obteve-se a representação a 3 dimensões que consta na parte central da Figura 19, à qual
se acrescentou as respectivas projecções bidimensionais para facilidade de análise. A
análise bidimensional que envolve somente os dois primeiros eixos permitiu verificar
que as raças merinas e a SL situam-se no 1º quadrante, a CA isolada no 2º, a CGB e a
CMP no 3º e as restantes no 4º quadrante. Por outro lado, em três dimensões
verificámos que o 1º octante8 contém a MB e a MP, o 2º contém a CA isolada, o 3º
contém a CGB e a CMP, 4º contém a BEDM, a CB, a CGM e a CC, o 5º contém a MBB
e a SL, o 6º e o 7º não contêm nenhuma e o 8º contém a CTQ, a CM e a SE.
Na Figura 20 representam-se os valores de inércia acumulados relativos à AFC
sobre as populações. O primeiro factor da AFC apresentou um valor próprio de 0,0527,
que representou 15,15% da inércia observada no espectro das frequências alélicas entre
raças destacando claramente a raça CA das restantes, e colocando no extremo oposto as
raças merinas, principalmente a MB.
8
A nomenclatura dos octantes não é consensual, pelo que neste trabalho definimos o seu ordenamento da
seguinte forma: considerando as coordenadas como (eixo 1, eixo2, eixo3) e o sinal + e - os sectores onde
cada eixo é positivo ou negativo, respectivamente, estabelecemos 1º octante (+,+,+), 2º octante (-,+,+), 3º
octante (-,-,+), 4º octante (+,-,+), 5º octante (+,+,-), 6º octante (-,+,-), 7º octante (-,-,-), 8º octante (+,-,-).
117
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
Figura 19. Análise Factorial de Correspondência para as 14 raças ovinas. No centro - vista a três
dimensões; em cima, esquerda e em baixo as respectivas projecções em duas dimensões.
118
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
Factor
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Traço =
Valores
próprios
0,05271
0,04206
0,03522
0,02976
0,02753
0,02681
0,02579
0,02306
0,02065
0,01819
0,34803
Figura 20. Percentagem de inércia e valores próprios de cada factor da AFC.
O segundo factor apresentou um valor próprio de 0,0421, ligeiramente inferior ao
primeiro, que contribuiu com 12,08% da inércia e separou as raças localizadas a norte
do Mondego (excepção feita à CMP), das localizadas a sul do mesmo rio, tendo como
extremos a MB e a CM.
O terceiro factor foi responsável por 10,12% da inércia e discriminou a SL das
restantes raças ocupando a CB o extremo oposto.
Os valores próprios podem variar entre 0 e 1. Quando próximos de 1, exprimem
uma forte ligação entre as linhas e as colunas que será sempre fácil de traduzir em
termos de dados iniciais (ESCOFIER e PAGÉS, 1998). Neste estudo, são relativamente
baixos sugerindo uma certa dificuldade em associar a diferença das raças às diferenças
concretas das frequências alélicas, também observável nos métodos utilizados na
discriminação racial no capítulo 5.
As contribuições absolutas e relativas para cada raça e factor são apresentados na
Tabela 16. Como era de esperar, as raças mais diferenciadas por cada um dos factores
foram as que maiores contribuições apresentaram para os mesmos. Como exemplo,
podemos referir o caso da raça CA detentora de um valor de 747 representando 74,6%
119
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
da inércia do 1º factor e 862 representando 64,5% da inércia total relativamente às
restantes 14 raças.
Tabela 16 Contribuições médias (absolutas e relativas) de cada raça para cada factor da AFC.
Raça
BEDM
CA
CB
CC
CGB
CGM
CM
CMP
CTQ
MB
MBB
MP
SE
SL
Contribuição Absoluta
Factor1 Factor 2 Factor 3
0
12
14
747
109
1
1
94
114
4
38
4
20
9
64
5
18
31
4
121
6
3
1
1
1
28
6
165
493
25
19
1
51
29
65
31
4
9
10
0
2
642
Contribuição Relativa
Factor 1 Factor 2 Factor 3
0
21
19
862
100
1
2
162
165
8
65
5
51
18
112
12
36
53
8
209
9
7
3
1
2
74
13
249
594
26
51
2
91
76
136
55
9
18
17
0
3
741
Na Tabela 8 do Anexo 3 são apresentados os valores da contribuição absoluta e
relativa para cada alelo dos microssatélites quando a AFC foi realizada considerando os
indivíduos de cada raça como variáveis, indagando assim sobre a importância de cada
um deles na diferenciação racial. O alelo 157 do microssatélite BM6444 foi o que mais
contribuiu (12%) para o 1º factor (MAF209 137), os alelos 163 e 145 do microssatélite
McM218 os que mais contribuíram (9,9% cada) para o 2º factor e o alelo 121 do
microssatélite OarFCB128 o que mais contribuiu (6,6%) para o 3ºfactor.
Quanto à contribuição relativa, os alelos com maior valor foram o 157 do
microssatélite BM6444 (2,8 %) para o 1º factor, o alelo 95 do microssatélite OarFCB20
(2,7%) para o 2º factor e os alelos 205, 192, 205 dos microssatélites BM6506,
OarFCB304 e BM6506, respectivamente (2,9%) para 3º factor.
Na Tabela 17, são apresentadas as contribuições médias (absolutas e relativas) de
cada microssatélite para cada factor. Os que apresentaram maior contribuição absoluta
de inércia foram os OarHH64 (1ºfactor) e o McM218 (2º e 3º factor). A maior
contribuição relativa foi para o OarHH64 (1ºfactor), o OarFCB128 (2º factor) e o
BM6506 (3º factor).
120
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
Tabela 17. Contribuições médias (absolutas e relativas) de cada microssatélite para cada factor da
AFC.
Microssatélite
BM1824
BM4621
BM6444
BM6506
BM757
ETH225
MAF209
MAF23
McM214
McM218
OarCP20
OarCP34
OarCP49
OarFCB11
OarFCB128
OarFCB20
OarFCB304
OarFCB48
OarHH64
Contribuição Absoluta
Factor1 Factor 2 Factor 3
1,6
8,0
0,6
2,6
1,5
6,2
7,8
3,1
3,5
1,4
1,9
4,1
2,0
1,6
4,3
3,2
2,8
1,9
5,9
4,5
3,3
3,7
4,6
2,1
4,9
4,3
1,8
6,2
13,4
7,5
1,1
4,5
2,8
3,4
8,0
6,7
1,7
2,5
4,5
3,9
3,7
3,6
3,8
7,2
5,7
2,9
2,4
1,9
3,1
1,5
4,0
2,2
2,2
1,8
8,0
2,9
4,8
Contribuição Relativa
Factor 1 Factor 2 Factor 3
79,0
175,8
19,2
128,1
54,1
137,5
142,4
89,8
93,3
81,4
116,3
186,3
81,8
57,2
95,8
92,5
59,7
45,2
117,6
88,6
99,6
173,6
171,8
59,8
191,1
103,2
43,4
113,0
146,4
157,4
42,8
131,5
71,2
121,7
144,1
149,6
63,5
96,8
106,9
98,1
90,3
103,4
127,2
243,9
70,4
113,9
111,1
55,6
104,8
67,7
92,4
76,6
61,1
49,2
252,5
116,7
66,4
3.4.4. Discussão
Na história das raças ovinas poruguesas, encontra-se com frequência referências a
uma certa heterogeneidade morfológica no seio da população ovina em geral, que
apenas viria a ser contrariada pelos Serviços do Ministério da Agricultura a partir do
início do século XX, conforme foi já referido capítulo 1. O despertar para as vantagens
económicas da criação formal de raças levou o seu devido tempo e somente em 1981
viria a ser fundada a primeira associação de criadores de ovinos, a da raça Serra da
Estrela. Até essa altura o isolamento reprodutivo das populações ovinas com distinta
morfologia foi principalmente função da distância geográfica, que por vezes era vencida
quer pelo comércio quer pela manutenção de tradições como a transumância. Não será,
assim, de estranhar que se observem alguns desvios aos pressupostos subjacentes a
algumas metodologias utilizadas neste trabalho, contudo são comuns a outros trabalhos
do género.
Seguindo a ordem dos resultados que obtivemos, podemos dizer que o défice de
heterozigóticos observado em alguns dos microssatélites nas raças MP, CM e BEDM
pode ser explicável por vários factores, já explicitados atrás, mas discernir qual ou quais
121
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
deles estão presentes na situação concreta suscita dificuldades. Tratando-se de raças de
animais domésticos, as justificações apontadas com mais frequência prendem-se com o
efeito de WHALUND, ou seja, a existência de uma subestruturação relevante ou com a
presença de consanguinidade. Como exemplo, podemos referir o caso particular da
BEDM, onde verificámos que, a par do valor maior de diferença entre a HO e a HNB, o
qual se traduz no valor de FIS, observámos também um valor elevado de RA, sugerindo,
portanto, uma eventual subestruturação. De facto, quando amostrámos localmente a
BEDM, foi-nos transmitido que na região eram referenciadas duas variedades desta
raça, a “de montanha” e a “do vale”, as quais GARCÍA (2002) descreveu como "brava"
ou "galega" para a primeira e "ovelhas de carro" ou "mansas" para a segunda, facto que
reforça esta hipótese.
Em situações deste tipo, a subestruturação torna-se evidente pela presença de um
ou mais grupos distintos de indivíduos, quando se constrói um dendograma, com base
numa matriz de distâncias genéticas individuais (SANCRISTOBAL et al., 2003). Na
Figura 21 são apresentados os dendogramas construídos segundo os métodos UPGMA e
NJ a partir de uma matriz de distâncias genéticas (DL) individuais para a raça BEDM,
podendo verificar-se que apenas no segundo se regista uma ligeira subestruturação,
embora não em dois como se esperaria, mas sim em quatro grupos.
UPGMA
NJ
Figura 21. Árvores UPGMA e NJ de distâncias individuais (DL) para a raça BEDM.
Pelo contrário, no caso da CM foi observado, simultaneamente, o segundo maior
valor de FIS e dos mais baixos valores de RAA, o que pode sugerir a presença de um
122
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
certo grau de consanguinidade, cuja confirmação carece de informação adicional no que
se refere ao sistema de produção.
As razões subjacentes à variação de θ prendem-se com o efeito combinado da
origem das raças, da deriva genética, da existência de selecção e da extensão de
miscigenação durante a sua formação. Esta última é, obviamente, dependente da
distância geográfica entre as populações, devendo na opinião de IRIONDO et al. (2002)
ser considerada quando se compara valores de θ.
Sendo Portugal um país com uma área relativamente pequena, com uma tradição
de transumância que se manteve até finais do século passado, a qual propiciou eventuais
cruzamento entre raças, aspecto bem patente no textos dos arrolamentos de gado do
final do século XIX e início do XX referidos no primeiro capítulo, e tendo os livros
genealógicos das raças ovinas uma constituição muito recente (anos oitenta e noventa),
parece-nos plausível admitir que todos estes factores tenham contribuído para os valores
de θ relativamente baixos que foram obtidos. Apesar da realidade histórica das raças
bovinas portuguesas comungar de muitos aspectos referidos para os ovinos, a sua
estruturação em raças parece ter sido muito mais acentuada como o demonstra o valor
de θ=0,076±0,004, obtido para 12 raças bovinas portuguesas utilizando 30
microssatélites (MATEUS, 2007). A mobilidade menor desta espécie relativamente aos
ovinos terá contribuído certamente para a diferença de valores observada.
Por outro lado, há que ter em atenção o facto de, quando são utilizados
microssatélites, frequentemente, se obterem valores de heterozigotia superiores a 0,6,
numa escala cujo máximo é 1, determinando que, independentemente da diferenciação
entre populações, os valores obtidos sejam baixos, como demonstrou HEDRICK (1999)
para o caso do uso do GST. A inclusão de populações muito distantes, normalmente
utilizadas como outgroup em análises filogenéticas, é outro factor que pode distorcer,
sobrestimando os valores de diferenciação das populações em análise. No presente
estudo, apesar da CA não ser propriamente um outgroup, a sua exclusão da análise
diminuiu para 0,023 o valor de θ, ou seja 11,5% menos, demonstrando que esta raça foi
responsável por grande parte da diferenciação global entre as populações.
Todos estes aspectos contribuem para explicar o facto dos valores de θ, referidos
na bibliografia para os animais domésticos confinados a uma determinada área
geográfica e calculados com base em frequências alélicas de microssatélites, raramente
ultrapassarem o valor de 0,10.
123
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
A análise dos valores individuais de θ para cada marcador permite ainda pôr em
evidência as forças que sobre eles actuam. Se, por exemplo, estiver sob efeito de
selecção favorável aos heterozigotos, será de esperar que a variação na frequência
alélica entre populações seja pequena, porque as frequências alélicas tenderiam a ser
menos sensíveis ao efeito da deriva genética que promove a fixação ou a perda de alelos
alternativos em diferentes populações (MACHUGH, 1996). Tal parece ser o caso dos
microssatélites OarFcB304 e o BM6506 cujos valores de θ são notavelmente inferiores,
menos de metade da média do conjunto dos 19 marcadores estudado. Não é possível, no
entanto, inferir sobre a significância estatística deste resultado, pois teria sido necessário
que a análise tivesse incidido sobre um número muito superior de loci para gerar uma
distribuição representativa dos estimadores.
Quando se comparou os fenogramas obtidos com diferentes distâncias genéticas,
verificou-se que o construído com a distância DC se distinguiu por apresentar uma
divergência do tipo radial, onde as extensões entre nós internos foram muito pequenas.
Este perfil é característico de situações em que não é possível estabelecer uma filogenia
credível e relaciona-se com a necessidade de dispor de um número maior de marcadores
para diferenciar os grupos de populações (LAVAL et al., 2000b; LAVAL, 2001).
Relativamente à árvore obtida com a distância DA, salienta-se o facto das raças CTQ e
CM se terem posicionado no mesmo ramo que as MBB e SL, o que, em nosso entender,
parece fazer pouco sentido.
Por seu lado, a árvore obtida com a distância DS (Figura 22) apresentou uma
grande semelhança com as duas primeiras (A e B), cujas diferenças se resumiram ao
facto das raças MB, MP e MBB se encontrarem agora individualizadas num mesmo
ramo, acontecendo o mesmo com as raças CGM e CGB. De acordo com o que é
conhecido sobre estas raças, nomeadamente quanto à localização geográfica e
semelhança morfológica, esta representação parece ser a mais adequada, apesar de, sob
o ponto de vista teórico, a distância DS não ser das mais recomendadas para o estudo de
raças de animais domésticos.
No que concerne à robustez dos fenogramas, têm sido avançadas várias
explicações para os valores de bootstrap baixos, os quais, com frequência, surgem nos
estudos de raças animais domésticos. As mais frequentes referem a utilização de um
número insuficiente de marcadores, inferior ao que seria capaz de diminuir a variância
124
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
E
Figura 22. Fenograma construído a partir da distância genética DS (E) pelo método NeighbourJoining.
do erro da estimativa das distâncias entre populações; outras apontam para a possível
discrepância entre as “tipologias” exibidas por cada marcador, resultantes do processo
evolutivo por deriva genética, e detectável pelo facto de cerca de metade das correlações
de Mantel entre marcadores ser negativa; outras ainda, sugerem como causa a
ocorrência de cruzamentos recentes (migrações) entre as populações em análise
(FELSENSTEIN, 1982; CAVALLI-SFORZA et al., 1994; MOAZAMI-GOUDARZI e LALOE,
2002). Paradoxalmente, no nosso estudo, os nós entre a CM e a CTQ e entre o MB e o
MP, onde nos parece provável ter ocorrido mais migração, foram os que apresentaram
valores de bootstrap maiores.
CAVALLI-SFORZA et al. (1994) referem que a aplicação de diferentes distâncias a
um mesmo conjunto de dados pode originar resultados bastante diferentes na topologia
das árvores em resultado da sensibilidade a pequenas variações na matriz de distâncias,
o que é, frequentemente, encarado como embaraçante. No entanto, de acordo com os
125
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
mesmos autores, estas diferenças tendem a surgir com mais frequência quando a
dissemelhança entre populações é pequena, considerando-as triviais quando comparadas
com o erro padrão da estimativa, classificando-as, portanto, de “frequentemente pouco
importantes”.
Pelo contrário, verificámos grandes diferenças entre topologias quando
comparámos as árvores obtidas pelo método NJ com as obtidas pelo método UPGMA
para as mesmas distâncias (Figuras 1, 2, 3, 4 e 5 do Anexo 4).
Da análise pelas distâncias genéticas e respectivos fenogramas, destaca-se a maior
distância da raça CA relativamente às restantes raças portuguesas, o que está de acordo
com a hipótese de uma eventual importação desta raça, aspecto já discutido a respeito
da análise da diversidade genética intra-racial, na qual verificámos que o baixo valor de
RA, não foi acompanhado por um baixo valor correspondente de HNB característico de
um efeito fundador num modelo em ilha (NEI, 1987; MARTIN-BURRIEL et al., 1999).
Esta hipótese poderia assim explicar a maior distância desta raça, pois sendo oriunda de
outro país implicaria um tempo de isolamento maior e, portanto, um antepassado
comum às restantes raças, mais remoto. Os trabalhos de ZAMORANO et al. (1998) e
VALERA et al. (2004) envolveram a caracterização da diversidade genética, com base
em microssatélites, da raça Churra Lebrijana (ou Marismeña), a qual se supõe ser a
origem da CA, contudo, pelo facto de terem utilizado microssatélites diferentes, não foi
possível estabelecer uma relação entre elas. Estes autores referem que aquela raça está
ameaçada de extinção no país vizinho o que reforça a importância de tomar medidas
com vista à conservação da CA. Os resultados obtidos pelo estudo da região controlo do
DNA mitocondrial apontou também a CA como a raça como maior distância genética
das restantes raças ovinas portuguesas (PEREIRA et al., 2006).
Acresce ainda o facto de, como mostra a Figura 23 onde se observa uma
fotografia de exemplares de “Ovino Algarvio” na Exposição Pecuária Nacional em
1888, o ovino representativo do Algarve não ser a CA, mas sim o que parece serem
ovinos campaniços. Estes dados corroboram a indicação proferida por RAMOS
DA
COSTA (1964) de que a raça Churra Algarvia teria derivado da importação do Churro
Lebrijano ou Merismeño por volta de 1870-90.
126
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
Figura 23. Exemplares do "Ovino Algarvio" na Exposição Pecuária Nacional em 1888.
A raça mais próxima da CA foi a CMP o que, do ponto de vista etnológico, parece
fazer pouco sentido, pois são-lhes atribuídas origens diferentes: a primeira, de elevada
corpulência, e marcadamente do tipo Churro, característico do Tronco Ibérico de que
deriva (PEREIRA, 1963), enquanto a segunda de pequena corpulência que, de acordo
com FRAZÃO (1982), é “um dos abencerragens do ovino burdo mais fino que povoava,
e intensamente, a nossa península”. Por outro lado, esta proximidade poderia ser
explicada pela eventual ocorrência de cruzamento entre elas de cujas marcas
morfológicas o tempo se teria encarregado de apagar.
Quando excluímos a CMP da análise, a ramificação da CA passou a efectuar-se
com a CGB (Figura 24), facto que parece fazer mais sentido, pois ambas, no entender de
BELDA e TRUJILLANO (1986), reproduzem com vincada fidelidade as características do
Tronco Ibérico.
De uma forma geral, as raças foram agrupadas de acordo com a proximidade
geográfica e com o tipo de lã, tendo-se obtido, assim, dois grupos embora não muito
distantes um do outro. Um constituído pelas raças BEDM, CB, CC, CGB, CGM, CTQ,
CM, que, com a excepção da CC, todas elas se situam a norte da Serra da Estrela e são
do tipo Churro, também com uma excepção, a BEDM, a qual, como já referimos, é
bastante heterogénea quanto ao velo. O outro grupo reúne as raças MB, MP, MBB, SE,
127
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
Figura 24. Fenograma construído a partir da distância genética DRey pelo método NeighbourJoining, excluindo a raça CMP.
SL, CMP que, com excepção da CA, são do tipo merino ou bordaleiro, portanto com
alguma influência de merino, todas elas situadas a sul da serra referida. Este
agrupamento é concordante com a hipótese das raças ovinas portuguesas serem
originárias de dois troncos, apontada por MIRANDA DO VALE em 1949, e considerando o
tronco Ibérico como a origem do primeiro grupo juntamente com CA e o tronco
Africano como tendo influenciado o segundo grupo, justificando-se a pequena distância
entre os grupos em virtude do tamanho reduzido de Portugal e da elevada mobilidade
dos ovinos, de que a prática de transumância em algumas raças constitui um exemplo. A
inclusão da raça SE no grupo sul terá por certo relação com essa prática de
transumância, concretamente para as terras do Alentejo no período de Inverno. A
128
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
importância deste aspecto fora já realçada por BERNARDO LIMA (1873) quando referiu “
a Guarda tem o gado da Serra da Estrela em grande parte transumante, passando o
Inverno para as bandas do Campo de Ourique no distrito de Beja, e tirando por isso
muito da sua qualidade do gado do sul”.
A origem da CTQ foi atribuída por SOBRAL et al. (1987) ao cruzamento entre a
CB e a CM. Os resultados aqui obtidos são concordantes com essa hipótese mas
sugerem contudo uma maior proximidade com a CM do que com a CB, apontando,
portanto, para um contributo genético muito superior da primeira.
A raça CB surge nos fenogramas em posição oposta à raça MB, revelando que, se
excluirmos a raça CA, se trata das duas raças ovinas portuguesas geneticamente mais
afastadas. Assim, estes resultados não estão de acordo com a possibilidade da raça CB
ser uma “raça mestiça, resultante do cruzamento dos bordaleiros com a merina”
conforme sugeriu (BERNARDO LIMA) (1873) e foi ecoado por COSTA e CASTRO (1900) e
MIRANDA DO VALE (1905).
Relativamente à diferença observada entre resultados obtidos por TEIXEIRA (1991)
com dados morfométricos e os obtidos neste estudo com os microssatélites para as
mesmas raças ovinas churras, apenas fica reforçado o que foi obtido em outros estudos,
nomeadamente em raças caprinas Italianas (CREPALDI et al., 2001) e em etnias humanas
(CAVALLI-SFORZA et al., 1994). Este facto sugere que uma diferenciação morfológica
pode não significar uma diferenciação genética e vice-versa, sendo várias as razões
subjacentes. Os caracteres morfológicos possuem, salvo raras excepções, natureza
poligénica e são afectados pelo ambiente, podendo várias combinações de genes
originar fenótipos semelhantes. No caso concreto dos animais domésticos, observa-se
que grande parte do conceito de raça assenta num morfotipo característico ideal
determinante de uma pressão selectiva artificial, com consequente implicação na
distribuição desses caracteres na população. Pelo contrário, marcadores moleculares
como os microssatélites, não são afectados nem pelo ambiente nem pela selecção,
resultando daqui diferentes taxas evolutivas das regiões do genoma representadas pelos
marcadores ou dos genes responsáveis pelas características morfológicas.
Quando se comparam os valores de bootstrap da Figura 16 com os da Figura 13,
verifica-se que os primeiros são muito superiores, evidenciando a influência que o
número de populações em análise, só por si, pode ter, facto esperado se tivermos em
conta que o número de árvores possíveis cresce exponencialmente com o número de
129
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
populações (PENNY e HENDY, 2001). Assim, quando considerámos 14 raças (n), o
número de árvores sem raiz é iguais a ((2n-5)!!) ou seja (2*14-5)!!=
23*21*19*17*15*...*5*3*1=3*1011, enquanto que no caso de 7 raças esse valor é de
(2n-5)!!) ou seja de (2*7-5)!!= *9*7*5*3*1=945.
Em conformidade com o que foi obtido pela análise dos fenogramas construídos
com base em distâncias genéticas, também nos resultados obtidos pela AFC a raça CA
foi a que mais se distinguiu de entre as raças portuguesas de ovinos. As raças CGB e a
CMP foram igualmente as raças mais próximas da CA, situando-se as três no lado
negativo do eixo 1. No caso da CGB, a proximidade poderá significar sobretudo uma
ancestralidade comum, já que se observa um isolamento geográfico substancial e não
temos conhecimento de troca de animais entre estas duas populações. No entanto, são
referidos cruzamentos da CGB com a CMP na década de 60, para melhoria da qualidade
e quantidade de lã (AURELLE et al., 2002). Relativamente à CMP, a proximidade poderá
ter resultado por ventura de um fluxo génico, pois as duas raças (CA e CMP) terão
partilhado a mesma área geográfica durante várias décadas.
O facto de na análise bidimensional, que envolve os dois primeiros eixos, se
verificar que raça SL e as raças merinas estão reunidas no 1º quadrante está de acordo
com a origem apontada COSTA e CASTRO (1900) para a SL. Estes autores referiram “O
gado da variedade saloia, de velo branco, dos arredores da capital (Lisboa), provêm de
merinos importados de Espanha, por volta de meados do século passado, pelo famoso
ministro, o marquês de Pombal. Estes merinos permaneceram inicialmente em Oeiras;
donde de expandiram, para o Norte e Nordeste, até Torres Vedras e à Póvoa de Santa
Iria”. Uma vez que também as raças merinas portuguesas tiveram origem no Merino
Espanhol, faz sentido que a raça SL apresente maior similaridade com aquelas raças.
Contudo, quando a análise envolveu o 1º e 3º eixos, verificou-se que a SL se destacava
das restantes sugerindo uma diferenciação relevante das restantes raças, facto que não
foi tão evidente pela observação dos fenogramas.
Da mesma forma, os resultados obtidos com a AFC parecem também confirmar
que a qualidade da lã foi, ao longo dos tempos, um critério de selecção muito
importante nos ovinos e, por isso, um factor de divergência racial, patente na disposição
das raças merinas num extremo, as churras no outro, e as bordaleiras mais ou menos
numa posição intermédia. Estes resultados parecem, assim, condizentes com o que é
130
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
conhecido em termos de semelhança morfológica, proximidade geográfica e informação
histórica das raças.
Apesar da congruência dos resultados obtido na AFC das raças portuguesas de
ovinos, o poder estatístico foi relativamente baixo, uma vez que os três primeiros
factores (eixos) explicam apenas 37,35% da inércia (variância), quando na bibliografia é
apontado como referência o valor de pelo menos 80% da inércia para o número de eixos
necessários ao estudo detalhado de uma AFC, o que, no caso concreto, implicaria
analisar os 9 primeiros factores, muito para além das três dimensões passíveis de ser
visualizadas pelo cérebro humano.
3.5. CONCLUSÕES
A análise da informação alélica de 20 microssatélites em 14 raças portuguesas de
ovinos permitiu revelar uma elevada diversidade intra-racial, traduzida pela estimativa
da RAo, que atingiu um valor médio de 9 alelos por locus e por raça, e uma HNB de 0,762
ligeiramente acima do referido para outras das raças ovinas. A CA foi a raça que
apresentou menor valor de RAA (6,9 alelos/locus), contra o valor máximo de 9,1
alelos/locus observado na CGM. Relativamente à HNB, o valor mínimo de 0,729 foi
observado na CB e o máximo de 0,782 na CGB.
A identificação de um total de 26 alelos únicos, envolvendo 15 loci e 11 raças,
não se revelou de grande utilidade prática uma vez que os respectivos valores de
frequência foram inferiores a 5%.
No que respeita à análise da diversidade por microssatélite, obteve-se uma média
de 14 alelos, tendo o OarCP49 sido o que apresentou maior valor (26 alelos), e o
BM1824 o de menor valor (5 alelos), tendo sido identificados um total de 280 alelos,
considerando o conjunto dos 717 animais estudados. O microssatélite BM6444 foi o que
apresentou simultaneamente o maior valor de HNB (0,867) e de PIC (0,844) e por isso o
de maior poder informativo.
O microssatélite McM357 apresentou um excesso de homozigóticos significativo
em 13 das 14 raças ovinas estudadas, sugerindo a existência de alelos nulos neste locus,
pelo que se recomenda a sua não utilização em estudos deste âmbito.
131
Capítulo 3 - Caracterização da diversidade genética das raças ovinas Portuguesas
A análise da estrutura da população ovina Portuguesa revelou existir uma
diferenciação estatisticamente significativa para todos os pares possíveis das 14 raças,
apesar da diversidade genética total, apenas 2,6% ser devida a diferenças entre raças,
enquanto aos restantes 97,4% corresponderem a diferenças entre indivíduos dentro das
raças.
Observou-se uma correlação significativa entre as matrizes de distâncias
genéticas, tendo sido o fenograma construído pelo método de NJ com a DS o que melhor
se adequou ao que é conhecido sobre a história das raças. À semelhança do que foi
referido em geral para as raças de animais domésticos, os valores de bootstrap nos nós
dos fenogramas foram relativamente baixos, em média na ordem dos 30%. Contudo,
apesar desta fraca robustez dos fenogramas, os resultados obtidos concordam de uma
maneira geral com o que é conhecido sobre a história das raças portuguesas de ovinos,
tendo as mesmas sido agrupadas de forma condizente com a distribuição geográfica e
com o tipo de lã, aspectos que se relacionam com a sua origem étnica. Conclusões
idênticas foram obtidas pela metodologia da AFC.
As raças CA e MB revelaram ser aquelas que mais dissemelhanças apresentaram;
em oposição, as raças CM e CTQ foram as mais próximas, tendo havido concordância
de resultados quando a análise foi efectuada quer com base em distâncias genéticas,
quer por AFC.
O facto da se ter observado o menor valor de RA na CA, que não foi
acompanhado por um menor valor de HO, e se ter verificado a maior distância genética
relativamente às restantes raças, é concordante com a hipótese de importação recente
desta raça, já sugerida por outros autores.
Assim, apesar das limitações associadas ao uso dos microssatélites, estes
constituem uma ferramenta muito útil para estudar a diversidade genética e as relações
de similaridade entre populações próximas, como é o caso das raças portuguesas de
ovinos. Contudo, será interessante complementar estes resultados com informação
alélica de loci responsáveis ou associados a características produtivas, de forma a
confrontar as respectivas conclusões.
132
Capítulo 4 – Hierarquia de prioridade de conservação das raças portuguesas de ovinos
CAPÍTULO 4 - HIERARQUIA DE PRIORIDADE DE
CONSERVAÇÃO DAS RAÇAS PORTUGUESAS DE
OVINOS
4.1. INTRODUÇÃO
A maioria das raças de animais domésticos tem uma origem relativamente
recente, facto tanto mais evidente quando se consideram as raças pertencentes a um
mesmo país. Assim, admite-se que a mutação tenha exercido uma influência reduzida na
génese (diferenciação) das mesmas, atribuindo-se à deriva genética, à migração e à
selecção, a responsabilidade pelas diferenças morfológicas e produtivas observadas,
sendo por isso inevitável que entre elas ocorra algum grau de duplicação da diversidade
genética. Este aspecto reveste-se de uma importância enorme quando se pretende gerir
os sempre escassos recursos financeiros a utilizar na conservação das raças de animais
domésticos.
No entanto, decidir sobre quais as raças que devem ser protegidas e quais as que
ficam por conta do risco de extinção apresenta-se como um dilema sensível,
dificilmente consensual e motivo de muito debate (CROZIER, 1992; RUANE, 2000;
SIMIANER, 2002). Importa assim fazer, ainda que breve, uma referência aos critérios e
estratégias que têm sido sugeridos.
De acordo com RUANE (2000), as decisões devem ser tomadas por comités
nacionais de especialistas com experiência nas raças das várias espécies, devendo os
mesmos definir as de maior interesse. Esta opinião assenta na recomendação da
“Convenção para a Diversidade Biológica” (1992) segundo a qual cada país é soberano
dos seus próprios recursos genéticos (artigo 15) e, por conseguinte, é responsável pelo
delineamento de estratégias, planos e programas nacionais para a conservação dos
mesmos.
Os critérios referidos com mais frequência e para os quais é necessário obter o
máximo de informação relativa a cada raça, independentemente da relevância que cada
autor lhes atribui, são:
-
Grau de risco de extinção – (degree of endangerment);
133
Capítulo 4 – Hierarquia de prioridade de conservação das raças portuguesas de ovinos
-
Presença de características com valor económico actual;
-
Presença de características de valor científico;
-
Valor agro-ecológico em especial paisagístico;
-
Valor histórico-cultural;
-
Singularidade genética (genetic uniqueness);
RUANE (2000) sugeriu uma forma simples de ponderar cada um destes aspectos e
de atribuir pontuação às raças cuja importância de conservação se pretende analisar.
Para tal, toma como exemplo o caso particular das raças de animais domésticos da
Noruega. Obviamente, a ponderação que os vários autores dão a cada um destes e outros
aspectos é variável. Por exemplo, enquanto que BARKER (1994b) elege como critério
mais importante a singularidade genética das raças, RUANE (2000) considera o risco de
extinção como prioritário e PONZONI (1997) entende que devem ser prioritárias as raças
com maior frequência relativa de alelos com interesse económico. Por seu lado,
SANCRISTOBAL et al. (2003) consideram que o facto de uma raça apresentar um
reduzido efectivo, isto é, em risco de extinção, não deve por si só constituir uma razão
suficiente para lhe ser conferida prioridade de conservação, pois este tipo de atitude
poderia levar a que fossem privilegiadas linhas consanguíneas, mesmo que não
contivessem riqueza alélica específica. Pelo contrário, grandes populações detêm,
geralmente, um maior potencial para o melhoramento genético futuro devido à sua
maior diversidade genética interna.
Com excepção do critério “valor histórico-cultural”, todos os outros estão
relacionados com as características genéticas das populações, o que demonstra a
importância de obter-se o máximo de informação sobre esta temática.
4.1.1. Singularidade genética
O conceito de singularidade genética, como critério de prioridade na escolha das
populações a conservar, foi referido pela primeira vez por MILLER (1977). Esta ideia
tem subjacente a natureza imprevisível das necessidades futuras a salvaguardar com a
conservação das raças de animais autóctones. Assim, a escolha das que se revelem
geneticamente mais singulares (distintas) parece ser a forma mais racional de o
conseguir. No entanto, a singularidade genética de uma raça não é fácil de definir, tendo
sido sugeridas diferentes estratégias de determinação.
134
Capítulo 4 – Hierarquia de prioridade de conservação das raças portuguesas de ovinos
Uma forma intuitiva, consiste na comparação simples, entre raças, dos valores da
riqueza alélica, da heterozigotia esperada, das frequências alélicas e alelos únicos, etc.,
de preferência para um grande número de loci, normalmente utilizados para descrever a
diversidade e cujas vantagens e limitações respectivas foram alvo de discussão no
capítulo anterior. Embora esta estratégia permita caracterizar a diversidade presente em
cada uma das populações e ter uma noção da diferença, ela não tem em conta a
duplicação de diversidade entre raças e quando estão em análise um elevado número de
loci num elevado número de populações, tal análise torna-se difícil e subjectiva.
A abordagem sugerida por PETIT et al. (1998) utiliza a heterozigotia esperada e a
riqueza alélica como medidas de diversidade e avalia de forma directa a singularidade
genética de cada raça como a contribuição de cada uma delas para a diversidade global,
calculando a diferença entre o valor de diversidade obtido para a globalidade das
populações e a obtida após retirar a população em causa. Além disso, decompõe esta
contribuição em dois componentes, um resultante da diversidade dentro das populações
e outro resultante da divergência entre uma das populações e as restantes, utilizando
para o efeito o cálculo do parâmetro de diferenciação GST, já referido no capítulo
anterior. Contudo, HEDRICK (1999) sobre o uso dos microssatélites nesta abordagem,
chama a atenção para o cuidado a ter em conta na interpretação dos resultados obtidos,
justificando-se com o facto de PETIT et al. (1998) terem desenvolvido esta abordagem
utilizando frequências alélicas de alozimas em populações de palmeiras. Com efeito, a
este tipo de marcador estão associados, normalmente, valores de heterozigotia baixos
(~0,3); pelo contrário, com os microssatélites o valor de 0,6 para a heterozigotia é
frequentemente ultrapassado, limitando a valores pequenos o GST, sendo portanto de
importância duvidosa na análise da diferenciação de populações, ou seja, a relação
obtida entre a significância estatística e a biológica pode ser pequena.
Um outro aspecto fundamental, prende-se com a qualidade da estimativa do
parâmetro heterozigotia pelos marcadores moleculares, uma vez que DEWOODY e
DEWOODY (2004) observaram que a heterozigotia obtida tanto pelas alozimas como
pelos microssatélites e SNPs, era uma fraca estimativa da heterozigotia global (de todo
o genoma).
O cálculo de distâncias genéticas a partir de informação alélica relativa a um
grande número de loci tem constituído uma abordagem muito utilizada para caracterizar
o grau de diferenciação e as relações filogenéticas entre populações. Esta metodologia
135
Capítulo 4 – Hierarquia de prioridade de conservação das raças portuguesas de ovinos
tem o mérito de reduzir a um valor objectivo – distância – a relação entre pares de
populações. Por seu lado, a topologia do dendograma, posteriormente construído com
base na matriz destas distâncias, permite uma explicação clara das relações de
proximidade entre o conjunto de populações. Este aspecto estará certamente na base da
sua recomendação pela FAO para avaliar a singularidade genética das raças. No entanto,
uma análise mais atenta permitirá compreender que esta metodologia, só por si, não
estabelece um ordenamento das raças quanto à sua singularidade, principalmente
quando estiverem em análise um grande número delas. Partindo dos princípios
subjacentes a esta metodologia, alguns autores introduziram adaptações com vista a
permitir uma avaliação da singularidade de cada raça e o ordenamento das mesmas
quanto à prioridade de conservação. Pela sua simplicidade é de referir a abordagem
sugerida por WIMMERS et al. (2000), segundo a qual são estabelecidas prioridades de
conservação para várias populações de galinhas com base no valor médio da distância
entre cada população e as restantes. Assim, quanto maior for o valor médio obtido mais
distinta será a raça e, por conseguinte, maior prioridade terá para a conservação.
Por outro lado, a abordagem proposta pelo economista WEITZMAN (1992; 1993) é,
provavelmente, a que tem motivado mais adesão, tendo em conta o número de trabalhos
publicados (MOAZAMI-GOUDARZI et al., 1997; THAON D'ARNOLDI et al., 1998; LAVAL
et al., 2000b; BARKER et al., 2001; CAÑON et al., 2001). Como foi uma das utilizadas
neste estudo, far-se-á dela uma descrição um pouco mais pormenorizada.
A metodologia de WEITZMAN (1992; 1993) também parte de uma matriz de
distâncias genéticas, mas adopta um método alternativo de construção do respectivo
dendograma das populações, cuja formulação tem como objectivo quantificar a perda de
diversidade genética quando uma população é excluída do conjunto de partida. Esta
assenta na utilização de forma recursiva da seguinte função de diversidade:
V ( S ) = max[V ( S \ i ) + d (i, S \ i )] , com a condição inicial de V(i)=k
i∈S
onde V(S) é a diversidade de um conjunto de populações S, V(S\i) é a diversidade do
conjunto S sem o elemento i e d(i,S\i) é a distância entre o elemento i e o conjunto S
sem i. V(i) designa a diversidade de i a qual, inicialmente, toma uma constante
normalizadora (k) que, em termos de computação, pode ser considerada igual a zero.
136
Capítulo 4 – Hierarquia de prioridade de conservação das raças portuguesas de ovinos
As propriedades desta função (gémea, de ligação, monotonia em espécie e em
distância, continuidade em distância, etc.) permitem uma definição de diversidade
assente em princípios simples e rigorosos (WEITZMAN, 1992).
Esta metodologia conduz à construção de um dendograma com topologia única,
com a propriedade de máxima verosimilhança evolutiva, interpretável com o que
maximiza a probabilidade de existência das espécies que o constituem num dado
instante e cujo tamanho dos ramos representa a diversidade (WEITZMAN, 1992).
A construção deste dendograma assenta na identificação sucessiva de pares de
populações mais próximas, uma delas designada de "ligação" e outra de "representativa"
cuja exemplificação da aplicação do algoritmo de cálculo pode ser encontrada nos
trabalhos de THAON D'ARNOLDI et al. (1998) e de FOULLEY et al. (1999).
A perda absoluta de diversidade d(Vi) associada à extinção de uma raça (i), ou de
um conjunto de raças, pode ser aproximadamente deduzida pela observação do
dendograma, ou quantificada com exactidão recalculando o total de diversidade pela
função atrás referida após retirar do conjunto a raça ou grupo de raças em questão. Este
valor expresso em percentagem da diversidade total é designada de "diversidade
marginal". A bibliografia sobre esta temática é rica em exemplos de aplicação em várias
espécies de animais domésticos (MOAZAMI-GOUDARZI et al., 1997; THAON D'ARNOLDI
et al., 1998; LAVAL et al., 2000a; BARKER et al., 2001; CAÑON et al., 2001; REISTMARTI et al., 2003).
A metodologia de WEITZMAN (1992; 1993), sendo bastante abrangente, foi
também utilizada para estabelecer um sistema de gestão de uma dada quantia de fundos
monetários a repartir por um conjunto de raças, de tal forma que fosse maximizada a
conservação da diversidade entre raças, por unidade monetária investida (GARCIA et al.,
2002; MARTI e SIMIANER, 2002; SIMIANER et al., 2003). Os resultados mostraram que a
repartição óptima de recursos segue um certo padrão mas é difícil de ser aferida sem um
modelo detalhado e sem um conhecimento preciso dos valores dos parâmetros em
causa. Outros autores idealizaram estratégias globais a fim de ser encontrada uma
solução óptima para ponderar a diversidade genética e o mérito produtivo (CHAIWONG,
1999; PIYASATIAN e KINGHORN, 2003), ou modificaram-no a fim de incorporar
informação sobre a diversidade intra-populacional (GARCIA et al., 2005).
137
Capítulo 4 – Hierarquia de prioridade de conservação das raças portuguesas de ovinos
Apesar destas vantagens, as abordagens que assentam em distâncias genéticas são
normalmente criticadas por estarem dependentes de um elevado número de factores
entre os quais: a distância genética utilizada, o tamanho da amostra por raça, o número
de loci usados, o método da construção do dendograma, e outros (NEI e TAKEZAKI,
1994; TAKEZAKI e NEI, 1996). Os valores reduzidos de bootstrap, obtidos na construção
de árvores filogenéticas quando estão em causa raças de animais domésticos, são disso
uma evidência. Assim, a combinação diferente destes factores pode levar a conclusões
diversas perante as mesmas raças. Além disso, não têm uma interpretação em termos da
medida mais aceite de diversidade genética − a heterozigotia esperada − e ignora a
variabilidade intra-populacional, que constitui a parte crucial da variabilidade da
metapopulação, sendo mais adequados ao caso das espécies. Os trabalhos desenvolvidos
por BEHARA et al. (1998), RUANE (1999a) e CABALLERO e TORO (2002) detalharam
cuidadosamente as críticas a esta abordagem. Por outro lado, a natureza recursiva do
algoritmo de cálculo da abordagem de WEITZMAN requer elevados meios
computacionais, restringindo, na prática, a sua utilização a um número reduzido de
populações (inferior a 25), o que representa uma limitação séria desta metodologia, se
se considerar que o objectivo final é uma análise das populações à escala mundial.
Mais recentemente, EDING e MEUWISSEN (2001) propuseram uma outra
abordagem baseada na idealização de um subconjunto de populações, designado de
“core set”, a partir do grupo de populações em análise, de forma a minimizar a
duplicação da diversidade genética inicial. O coeficiente de coancestralidade (ƒ) de
MALECOT (1948) é o parâmetro utilizado para descrever essa sobreposição de
diversidade. Por definição, este coeficiente é a probabilidade de dois alelos de um dado
locus, aleatoriamente amostrados em dois indivíduos, serem idênticos por descendência.
Tendo em conta que numa população com reprodução aleatória, a variância genética é
proporcional a (1- ƒ ) (FALCONER e MACKAY, 1996), ao minimizar-se o ƒ médio ( ƒ )
está-se a maximizar a diversidade genética. Por outro lado, CABALLERO e TORO (2000;
2002) demonstraram também, que minimizar ƒ equivale a maximizar o tamanho
efectivo da população. O trabalho de ALVAREZ et al. (2005) constitui outro exemplo de
como o coeficiente de ancestralidade pode ser usado para estudar a diferenciação de
raças de animais domésticos, no caso concreto raças de ovinos.
138
Capítulo 4 – Hierarquia de prioridade de conservação das raças portuguesas de ovinos
Na prática, se for conhecido ƒ dentro e entre populações, é possível calcular a
contribuição que cada população deve ter para o core set de forma a minimizar ƒ . Estes
valores assim obtidos são considerados como indicadores da singularidade genética de
cada população e usados para as ordenar quanto à prioridade de conservação.
Todavia, ƒ é, por definição, calculado a partir da informação do pedegree dos
indivíduos que constituem as populações (FALCONER e MACKAY, 1996), informação
esta que, na maioria das raças autóctones, não está disponível. Para ultrapassar esta
limitação, e à semelhança de outros autores (LYNCH, 1988; LYNCH e RITLAND, 1999;
VAN DE CASTEELE et al., 2001; ROUSSET, 2002; WANG, 2002; BLOUIN, 2003), EDING e
MEUWISSEN (2001) propuseram um índice de similaridade calculado a partir de
informação alélica de marcadores moleculares para o estimarem. Este método está
muito dependente da capacidade de estimar f a partir de informação molecular o que
levou os mesmos autores a testarem vários modelos com o objectivo de melhorar a
precisão dessa estimativa (EDING e MEUWISSEN, 2003). Os autores referem ainda que o
método que propõem é mais eficaz na escolha das raças a conservar do que o de
WEITZMAN (1992; 1993), argumentando que nem sempre a uma maior distância
genética entre duas populações corresponde uma maior diversidade entre elas, sendo
apenas verdade quando as mesmas apresentarem valores iguais para o coeficiente de
ancestralidade. Por outro lado, o aumento da consanguinidade dentro das populações
diminui a diversidade, mas aumenta a distância genética entre elas, o que determina que
no método de WEITZMAN seja favorecida a conservação de populações consanguíneas
com grandes diferenças nas frequências alélicas, enquanto o método proposto por eles
tende a conservar a frequência alélica da população fundadora, portanto, a minimizar a
perda de alelos (EDING et al., 2002). A concluir, parece-nos aceitável dizer que a
primeira tende a ponderar mais a diversidade entre populações, enquanto que a segunda
pondera mais a diversidade intra-populacional.
Tendo em conta que a maioria das raças europeias de animais domésticos tem
uma origem relativamente recente (últimos 200 anos), a documentação histórica pode
ser também um instrumento relevante na avaliação da sua singularidade genética
(RUANE, 1999a).
139
Capítulo 4 – Hierarquia de prioridade de conservação das raças portuguesas de ovinos
4.2 OBJECTIVOS
Neste capítulo do nosso estudo procurámos aplicar, às raças portuguesas de
ovinos, algumas das abordagens sugeridas na avaliação da singularidade genética, para
que essa informação possa ficar disponível para futuros programas nacionais de
conservação de recursos genéticos animais.
4.3 METODOLOGIA
Para se estabelecer a prioridade de conservação das raças ovinas portuguesas
usámos duas abordagens já descritas, a de WEITZMAN (1992) incluindo a perspectiva de
THAON D'ARNOLDI et al. (1998) e a do core set (EDING e MEUWISSEN, 2001; EDING et
al., 2002; EDING e MEUWISSEN, 2002; EDING e MEUWISSEN, 2003).
4.3.1 Abordagem de WEITZMAN
Partindo da matriz de valores da distância genética DRey (NEI, 1972) calculada no
capítulo anterior, com base em 19 microssatélites, foi construído o dendograma de
diversidade e calculada a diversidade marginal associada a cada raça. A opção pela
distância DRey assentou no facto de esta ser a mais adequada à análise de populações
próximas (EDING e LAVAL, 1999) (LAVAL et al., 2002), como são as raças envolvidas
neste estudo e ter sido aquela cujo fenograma apresentou maior robustez, tendo em
conta o valor médio de bootstrap. Contudo, de acordo com um estudo recente levado a
cabo pela FAO (2004), a distância DS tem sido a mais usada no estudo da diversidade
genética em animais domésticos. Esta distância foi também aquela cuja topologia do
fenograma melhor reproduziu o que empiricamente se conhece sobre as raças
portuguesas de ovinos. Por isso, efectuaram-se também os mesmos cálculos utilizando
esta distância cujos resultados constam do Anexo 5
Com o intuito de facilitar a comparação com a abordagem do core set, realizámos
também os mesmos cálculos utilizando uma distância genética definida por EDING et al.
(2002), a qual se designou por DE=d(i,j) e se descreve adiante.
Seguindo a perspectiva de THAON D'ARNOLDI et al. (1998), foi definido um grupo
de raças com menor probabilidade de extinção, constituído pelas raças MB, SE e CTQ,
140
Capítulo 4 – Hierarquia de prioridade de conservação das raças portuguesas de ovinos
atendendo ao tamanho do efectivo e ao interesse económico actual. De seguida, foi
calculada a perda de diversidade associada à manutenção de apenas este grupo e de
quando a ele foi iterativamente adicionado uma das restantes raças. Isto permitiu
calcular a contribuição relativa da diversidade de cada uma das raças consideradas em
perigo e ordená-las por este critério em termos de prioridade de conservação.
Todos os cálculos envolvidos nesta abordagem foram efectuados recorrendo aos
respectivos algoritmos do programa WEITZPRO Package (DERBAN et al., 2002). O
dendograma em causa foi visualizado no programa TREEVIEW (PAGE, 1996), após
construção do respectivo ficheiro de entrada com base nos resultados obtidos com o
programa anterior.
4.3.2 Abordagem do core set
Com base nos valores da frequência de cada alelo em cada locus, em cada
população, cuja obtenção foi descrita no capítulo anterior, procedeu-se à construção de
matrizes de similaridade entre populações para cada um dos 19 microssatélites,
recorrendo ao programa Excel e à fórmula que se segue:
S ij = ∑ pik p jk
(EDING et al., 2002)
K
onde S ij é a média da similaridade entre pares de populações i e j para um locus com k
alelos, pik é a frequência do alelo k na população i e pjk é a frequência do alelo k na
população j.
Com base nestas matrizes de similaridade obtidas para cada locus, foi estimado o
coeficiente de coancestralidade ( ƒ̂ ij ), pelos modelos WLM (Weigthed Log Linear
Model) e WLMM (Weigthed Log Linear Mixed Model), considerados pelos autores
como os mais adequados (EDING e MEUWISSEN, 2003).
Também foi calculado o quadrado médio do erro da predição para cada
microssatélite com o objectivo de excluir os que apresentassem valores iguais ou
superiores a quatro, conforme recomendação dos autores. No caso concreto, foi
141
Capítulo 4 – Hierarquia de prioridade de conservação das raças portuguesas de ovinos
excluído o ETH225 por ter apresentado um valor próximo (3,6). Pelas razões evocadas
no capítulo anterior, o microssatélite McM357 também não foi considerado.
Seguindo ainda as recomendações destes autores, foi calculada uma matriz de
distâncias genéticas entre populações utilizando os valores de ƒ̂ obtidos pelo WLM,
segundo a fórmula seguinte:
d(i,j) = ƒ̂ii + ƒ̂ jj -2 ƒ̂ij
onde d(i,j) é a distância entre as populações i e j; ƒ̂ii e ƒ̂ jj são as estimativas do
coeficiente de coancestralidade dentro da população i e j, respectivamente; e ƒ̂ij é a
estimativa do coeficiente de coancestralidade entre a população i e j. Relembra-se que a
distância d(i,j) foi designada anteriormente por distância DE.
Na construção do dendograma correspondente foi utilizado o método NJ (SAITOU
e NEI, 1987), recorrendo aos programas POPULATIONS (LANGELLA, 2002) e TREEVIEW
(PAGE, 1996).
Com base no ordenamento das populações obtido neste dendograma foi
reordenada a matriz de valores de ƒ̂ e construído um gráfico de superfície, utilizando o
programa Excel, para melhor análise da mesma (EDING e MEUWISSEN, 2003). A
estimativa das contribuições relativas (c) de cada uma das raças para uma população
ideal (core set) com coeficiente de coancestralidade mínimo [ f ( S ) min ], foram
calculadas, respectivamente, segundo as expressões:
c min =
M −11n
1' n M −11n
f ( S ) min =
1
1' n M −11n
onde M é a matriz de ƒ̂ e 1n é um vector de "uns" com dimensão n (EDING et al., 2002).
Como a variância genética contida dentro do core set é proporcional a 1- f ( S ) min ,
a diversidade genética Div(S) do mesmo é definida como Div(S)= 1- f ( S ) min (EDING et
142
Capítulo 4 – Hierarquia de prioridade de conservação das raças portuguesas de ovinos
al., 2002). Segundo os autores, esta metodologia corresponde à maximização da
conservação da diversidade presente à partida, evitando sobreposições eventuais entre
raças. Os resultados obtidos podem ser utilizados como critério para estabelecer
prioridades de conservação. Com o objectivo de comparar o efeito do modelo de
estimativa de f, estes cálculos foram efectuados para os dois modelos (WLM, WLMM).
À semelhança do que se fez para a abordagem de WEITZMAN, foi estudada
também a perspectiva proposta por THAON
D'ARNOLDI
et al. (1998), descrita
anteriormente.
Para o caso concreto, a diversidade foi definida de duas maneiras:
Div(M) = 1 - fcs,
Nge = (2fcs)-1
onde fcs é a média da estimativa do coeficiente de coancestralidade em cada core set
formado. Div(M) é assim, um parâmetro de diversidade cuja alteração está associado às
variações nas características genéticas quantitativas, enquanto Nge designa o número de
equivalentes de genoma (CABALLERO e TORO, 2000) e a sua alteração está associada à
perda potencial de alelos ou haplotipos raros (EDING et al., 2002)
Todos os cálculos envolvidos nesta metodologia foram realizados no programa
MATLAB (Anónimo, 2002), utilizando rotinas gentilmente cedidas pelo autor do método,
HERWING EDING.
4.4 RESULTADOS
4.4.1 Abordagem de Weitzman
A informação relativa aos pares de populações de "ligação" e "representativas" e
distâncias respectivas, necessária à construção do dendograma de WEITZMAN, é
apresentada na Tabela 18.
143
Capítulo 4 – Hierarquia de prioridade de conservação das raças portuguesas de ovinos
Tabela 18. Ordenadas dos nós do dendograma de Weitzman baseadas nas distâncias DRey e DE.
Representativa
CM
CGB
BEDM
CC
SE
CM
SL
CM
MB
SL
CB
MB
CA
DRey
Ligação Distância Acumulada
CTQ
0,006
0,006
CGM
0,009
0,015
CGB
0,013
0,028
BEDM
0,016
0,044
MBB
0,018
0,061
CC
0,020
0,081
SE
0,021
0,102
CMP
0,021
0,123
MP
0,022
0,145
CM
0,028
0,173
SL
0,037
0,210
CB
0,058
0,268
MB
0,062
0,330
DE
Representativa Ligação Distância Acumulada
CM
CTQ
0,030
0,030
CGB
CGM
0,038
0,068
BEDM
CGB
0,050
0,118
MBB
CMP
0,053
0,171
MBB
SE
0,054
0,225
MP
BEDM
0,056
0,280
MB
MP
0,059
0,339
MBB
CM
0,062
0,401
CC
MBB
0,068
0,469
CB
CC
0,076
0,545
MB
SL
0,084
0,629
CB
MB
0,119
0,748
CA
CB
0,138
0,885
Nos dendogramas de WEITZMAN baseados nas distâncias DRey (REYNOLDS et al.,
1983) (Figura 25) e DE (EDING et al., 2002) (Figura 26), pôde-se verificar que a CA foi
a raça que mais se destacou do conjunto. Pelo contrário, entre a CTQ e a CM e entre a
CGB e a CGM foram registados os valores menores de distância (valores menores de
diversidade entre raças). Estes pares de raças apresentam também uma morfologia
semelhante e o seu solar é contíguo, por isso não será de admirar que na origem desta
pequena distância esteja um curto tempo de divergência e algum fluxo génico entre elas.
Relativamente às restantes raças, a sua posição mostrou-se dependente da distância
considerada.
Figura 25. Dendograma de Weitzman entre as 14 raças portuguesas de ovinos baseado na distância
DRey.
144
Capítulo 4 – Hierarquia de prioridade de conservação das raças portuguesas de ovinos
Figura 26. Dendograma de Weitzman entre as 14 raças portuguesas de ovinos baseado na distância
DE.
Este método permitiu também quantificar a contribuição marginal de diversidade
de cada uma das raças, para a diversidade global do conjunto (Tabela 19), sendo o
contributo mais importante o da CA, com um valor superior ao dobro (18,7% e 15,6%,
conforme a distância) do que seria alcançado se houvesse uma contribuição igual para
todas as raças (100/14=7,14%).
Tabela 19. Valores da diversidade marginal e ordem de prioridade de conservação, calculados a
partir das distâncias DRey e DE.
DRey
V(S)
Raça
BEDM
CA
CB
CC
CGB
CGM
CM
CMP
CTQ
MB
MBB
MP
SE
SL
0,330
V(S\i)
0,315
0,268
0,280
0,311
0,320
0,320
0,315
0,308
0,324
0,272
0,312
0,310
0,310
0,305
dV(i)
0,015
0,062
0,050
0,018
0,009
0,009
0,015
0,021
0,006
0,057
0,018
0,019
0,020
0,024
DE
dV(i)(%)
4,5
18,7
15,0
5,5
2,9
2,8
4,4
6,5
1,8
17,4
5,3
5,8
6,0
7,4
0,885
V(S-i)
0,830
0,748
0,785
0,815
0,842
0,847
0,834
0,832
0,856
0,784
0,826
0,830
0,831
0,813
dV(i)
0,055
0,138
0,100
0,070
0,044
0,038
0,051
0,053
0,030
0,102
0,060
0,056
0,054
0,073
Ordem de prioridade
dV(i) (%)
6,2
15,6
11,3
8,0
5,0
4,3
5,8
6,0
3,3
11,5
6,7
6,3
6,1
8,2
DRey
CA
MB
CB
SL
CMP
SE
MP
CC
MBB
BEDM
CM
CGB
CGM
CTQ
DE
CA
MB
CB
SL
CC
MBB
MP
BEDM
SE
CMP
CM
CGB
CGM
CTQ
V(S) - Diversidade total; V(S\i) – Diversidade total sem a raça i; dV(i) e dV(i)(%)- perda de diversidade, absoluta e relativa
("marginal"), respectivamente, associada ao desaparecimento da raça i.
145
Capítulo 4 – Hierarquia de prioridade de conservação das raças portuguesas de ovinos
Apesar do ordenamento ter sido diferente quando foi considerada uma ou outra
distância genética, foram comuns as primeiras quatro e as últimas quatro posições,
registando-se uma correlação muito significativa (r=0,96; P<0,01) entre os valores
respectivos de perda de diversidade. As 4 primeiras raças (CA, MB, CB e SL)
contribuíram com 58,5% e 46,6% da diversidade global, conforme se considerou a
distância DE ou a DRey, respectivamente. As restantes 10 raças apresentaram valores de
contribuição individuais para a diversidade global semelhantes entre si e próximos de
5%.
Os resultados obtidos para a diversidade marginal, segundo a perspectiva sugerida
por THAON D'ARNOLDI et al. (1998), e considerando como grupo seguro as raças CTQ,
MB e SE, são apresentados na Tabela 20. A partir daqueles foi possível verificar que a
manutenção de apenas estas três raças, implicaria uma perda de diversidade próxima
dos 75 a 80% da diversidade total.
Tabela 20. Valores da diversidade marginal e ordem de prioridade de conservação, considerando
um grupo seguro constituído pelas raças CTQ, MB e SE, com base nas distâncias DRey e DE.
DRey
V(S)
Raça
0,330
V(S\i)
dV(i)
DE
dV(i)
dV(i)
(%)
(%Seg)
Seguro
0,247
0,083
25,2
Seguro + i
BEDM
CA
CB
CC
CGB
CGM
CM
CMP
MBB
MP
SL
0,232
0,185
0,201
0,228
0,237
0,237
0,226
0,225
0,228
0,227
0,218
0,098
0,144
0,129
0,101
0,092
0,092
0,104
0,104
0,101
0,103
0,112
29,7
43,8
39,2
30,7
28,0
28,0
31,6
31,6
30,8
31,1
33,9
18,0
74,0
55,4
21,7
11,3
11,3
25,3
25,6
22,2
23,5
34,6
0,885
V(S-i)
dV(i)
Ordem prioridade
dV(i)
dV(i)
(%)
(%Seg)
0,700
0,185
20,9
0,645
0,562
0,594
0,630
0,656
0,662
0,638
0,647
0,641
0,643
0,609
0,240
0,323
0,292
0,256
0,229
0,223
0,247
0,238
0,244
0,242
0,277
27,1
36,5
33,0
28,9
25,9
25,2
27,9
26,9
27,6
27,3
31,2
29,8
74,4
57,5
38,0
23,7
20,5
33,5
28,7
31,8
30,7
49,3
DRey
DE
CA
CB
SL
CMP
CM
MP
MBB
CC
BEDM
CGB
CGM
CA
CB
SL
CC
CM
MBB
MP
BEDM
CMP
CGB
CGM
V(S) - Diversidade total; V(S\i) – Diversidade total sem a raça i; dV(i) e dV(i)(%)- perda de diversidade, absoluta e relativa,
respectivamente, associada ao desaparecimento da raça i comparativamente ao total; dV(i)(%Seg)– Perda de diversidade relativa,
associada ao desaparecimento da raça i quando consideramos apenas a conservação do grupo seguro {[dV(seguro+i)dV(seguro)]/dV(seguro)*100}.
Por sua vez, a não inclusão de apenas mais uma raça no grupo seguro
representaria uma perda em diversidade entre 11,3 (CGB ou CGM) e 74,0% (CA), no
caso da distância DRey ou entre 20,5 (CGM) a 74.4% (CA), considerando a distância DE.
Estes valores revelam a importância de, a curto prazo, se implementarem programas de
conservação das raças portuguesas de ovinos, principalmente para a raça CA.
146
Capítulo 4 – Hierarquia de prioridade de conservação das raças portuguesas de ovinos
4.4.2 Abordagem do core set
Os valores registados para a estimativa do coeficiente de coancestralidade ( ƒ̂ )
foram relativamente baixos, indicando uma elevada diversidade dentro e entre raças
(Tabela 21 e Tabela 22). Os resultados obtidos para o modelo WLM foram superiores
aos atingidos para o WLMM.
Tabela 21. Matriz de coeficientes de coancestralidade estimados segundo o modelo WLM.
BEDM
CA
CB
CC
CGB
CGM
CM
CMP
CTQ
MB
MBB
MP
SE
SL
BEDM
0,0440
0,0170
0,0316
0,0220
0,0141
0,0177
0,0328
0,0139
0,0191
0,0000
0,0218
0,0246
0,0169
0,0087
CA
0,0170
0,1016
0,0249
0,0209
0,0249
0,0238
0,0361
0,0400
0,0285
0,0087
0,0287
0,0299
0,0242
0,0219
CB
0,0316
0,0249
0,0861
0,0340
0,0256
0,0301
0,0457
0,0287
0,0323
0,0083
0,0308
0,0352
0,0280
0,0199
CC
0,0220
0,0209
0,0340
0,0579
0,0141
0,0245
0,0368
0,0189
0,0222
0,0042
0,0231
0,0262
0,0156
0,0109
CGB
0,0141
0,0249
0,0256
0,0141
0,0343
0,0209
0,0274
0,0200
0,0170
0,0034
0,0149
0,0224
0,0098
0,0112
CGM
0,0177
0,0238
0,0301
0,0245
0,0209
0,0455
0,0377
0,0215
0,0233
0,0119
0,0238
0,0311
0,0189
0,0180
CM
0,0328
0,0361
0,0457
0,0368
0,0274
0,0377
0,0794
0,0416
0,0473
0,0149
0,0368
0,0392
0,0283
0,0296
CMP
0,0139
0,0400
0,0287
0,0189
0,0200
0,0215
0,0416
0,0600
0,0309
0,0113
0,0315
0,0302
0,0266
0,0232
CTQ
0,0191
0,0285
0,0323
0,0222
0,0170
0,0233
0,0473
0,0309
0,0446
0,0110
0,0301
0,0265
0,0222
0,0228
MB
0,0000
0,0087
0,0083
0,0042
0,0034
0,0119
0,0149
0,0113
0,0110
0,0494
0,0165
0,0256
0,0067
0,0095
MBB
0,0218
0,0287
0,0308
0,0231
0,0149
0,0238
0,0368
0,0315
0,0301
0,0165
0,0561
0,0284
0,0253
0,0207
MP
0,0246
0,0299
0,0352
0,0262
0,0224
0,0311
0,0392
0,0302
0,0265
0,0256
0,0284
0,0609
0,0276
0,0240
SE
0,0169
0,0242
0,0280
0,0156
0,0098
0,0189
0,0283
0,0266
0,0222
0,0067
0,0253
0,0276
0,0486
0,0236
SL
0,0087
0,0219
0,0199
0,0109
0,0112
0,0180
0,0296
0,0232
0,0228
0,0095
0,0207
0,0240
0,0236
0,0533
Tabela 22. Matriz de coeficientes de coancestralidade estimados segundo o modelo WLMM.
BEDM
CA
CB
CC
CGB
CGM
CM
CMP
CTQ
MB
MBB
MP
SE
SL
BEDM
0,0385
0,0038
0,0068
0,0048
0,0031
0,0039
0,0071
0,0031
0,0042
0,0000
0,0048
0,0054
0,0037
0,0019
CA
0,0038
0,0489
0,0055
0,0046
0,0054
0,0052
0,0078
0,0085
0,0062
0,0019
0,0062
0,0065
0,0053
0,0048
CB
0,0068
0,0055
0,0460
0,0074
0,0056
0,0065
0,0098
0,0062
0,0070
0,0018
0,0067
0,0076
0,0061
0,0044
CC
0,0048
0,0046
0,0074
0,0410
0,0031
0,0054
0,0080
0,0042
0,0048
0,0009
0,0051
0,0057
0,0035
0,0024
CGB
0,0031
0,0054
0,0056
0,0031
0,0367
0,0046
0,0060
0,0044
0,0038
0,0007
0,0033
0,0049
0,0022
0,0024
CGM
0,0039
0,0052
0,0065
0,0054
0,0046
0,0388
0,0081
0,0047
0,0051
0,0026
0,0052
0,0068
0,0042
0,0039
CM
0,0071
0,0078
0,0098
0,0080
0,0060
0,0081
0,0449
0,0090
0,0102
0,0032
0,0080
0,0085
0,0062
0,0064
CMP
0,0031
0,0085
0,0062
0,0042
0,0044
0,0047
0,0090
0,0414
0,0067
0,0025
0,0068
0,0066
0,0058
0,0051
CTQ
0,0042
0,0062
0,0070
0,0048
0,0038
0,0051
0,0102
0,0067
0,0386
0,0023
0,0066
0,0058
0,0049
0,0049
MB
0,0000
0,0019
0,0018
0,0009
0,0007
0,0026
0,0032
0,0025
0,0023
0,0395
0,0036
0,0056
0,0014
0,0019
MBB
0,0048
0,0062
0,0067
0,0051
0,0033
0,0052
0,0080
0,0068
0,0066
0,0036
0,0407
0,0062
0,0055
0,0046
MP
0,0054
0,0065
0,0076
0,0057
0,0049
0,0068
0,0085
0,0066
0,0058
0,0056
0,0062
0,0416
0,0060
0,0052
SE
0,0037
0,0053
0,0061
0,0035
0,0022
0,0042
0,0062
0,0058
0,0049
0,0014
0,0055
0,0060
0,0393
0,0052
SL
0,0019
0,0048
0,0044
0,0024
0,0024
0,0039
0,0064
0,0051
0,0049
0,0019
0,0046
0,0052
0,0052
0,0401
O menor valor de ƒ̂ entre raças, por imposição do método (EDING e MEUWISSEN,
2001; EDING et al., 2002) igual a zero, correspondeu ao par BEDM/MB, enquanto o
máximo foi obtido pelo par CM/CTQ, cifras que confirmam a proximidade conhecida
entre estas últimas duas raças.
Relativamente aos valores de ƒ̂ no interior das populações, foi patente que a CA
atingiu o valor mais elevado, 0,1016 e 0,0489 para os modelos WLM e WLMM,
respectivamente, indicando ser a raça com indivíduos mais aparentados. Este resultado
está de acordo com a hipótese de esta raça ter uma origem recente em Portugal,
147
Capítulo 4 – Hierarquia de prioridade de conservação das raças portuguesas de ovinos
provavelmente importada de Espanha (SOBRAL et al., 1987) ou de Marrocos (FRAZÃO,
1982). Por outro lado, a CGB foi a que apresentou o valor menor de ƒ̂ . Perante o
desconhecimento de uma explicação para este facto, podemos referir que esta raça
(CGB) revela uma elevada semelhança morfológica com a raça "Churra" espanhola,
apontada por (BELDA e TRUJILLANO) (1986) como a mais fiel representante do antigo
tronco pirenaico. A confirmar-se tal ocorrência, a antiguidade e a amplitude de
dispersão poderão justificar a elevada variabilidade.
A partir da elaboração de um gráfico de superfície (Figura 27) representativo da
matriz de valores de ƒ̂ estimados pelo modelo WLM, onde as zonas mais escuras
indicam maiores valores de coancestralidade intra e inter-populações, foi possível
verificar que as raças CA, CB e CM revelaram os valores mais elevados de
coancestralidades intra-racial, seguidas da CMP, do MBB, da CC, do MP e da SL.
Sabendo que quanto maior for a coancestralidade intra-racial, maior será a
consanguinidade da raça, pode-se deduzir que também será maior o risco de extinção da
mesma. Por outro lado, quando se procedeu à análise destes valores entre raças,
verificou-se que a CM foi a raça que evidenciou um genoma mais parecido com as
restantes raças, seguida do MP e CB, facto que pode ser explicado pela ocorrência de
fluxo génico entre raças.
BEDM
CB
CC
CGB
0,075-0,1
0,05-0,075
0,025-0,05
0-0,025
CGM
CM
CTQ
MB
MP
SE
SL
MBB
CMP
CA
CMP
MBB
SL
SE
MP
MB
CTQ
CM
CGM
CGB
CC
CB
BEDM
CA
Figura 27. Gráfico de superfície representativo da matriz dos coeficientes de coascendência
estimados pelo modelo WLM.
148
Capítulo 4 – Hierarquia de prioridade de conservação das raças portuguesas de ovinos
A matriz de distâncias genéticas d(i,j) e o respectivo dendograma NJ são
apresentados na Tabela 23 e na Figura 28, respectivamente, sendo possível, a partir
destas, verificar que o par de raças CB-CA corresponde às que mais distaram entre si
(d(i,j)=0,1378), enquanto que o par CTQ-CM é formado pelas que mais se aproximaram
(d(i,j)=0,0295).
Tabela 23. Matriz de distâncias d(i,j).
BEDM
CA
CB
CC
CGB
CGM
CM
CMP
CTQ
MB
MBB
MP
SE
SL
BEDM
0,0000
0,1117
0,0668
0,0580
0,0500
0,0540
0,0578
0,0761
0,0505
0,0933
0,0566
0,0555
0,0589
0,0797
CA
0,1117
0,0000
0,1378
0,1177
0,0862
0,0994
0,1087
0,0817
0,0892
0,1335
0,1004
0,1028
0,1017
0,1110
CB
0,0668
0,1378
0,0000
0,0761
0,0692
0,0714
0,0740
0,0886
0,0662
0,1189
0,0806
0,0765
0,0786
0,0996
CC
0,0580
0,1177
0,0761
0,0000
0,0641
0,0545
0,0637
0,0801
0,0581
0,0989
0,0678
0,0665
0,0753
0,0893
CGB
0,0500
0,0862
0,0692
0,0641
0,0000
0,0380
0,0589
0,0542
0,0449
0,0769
0,0606
0,0504
0,0634
0,0651
CGM
0,0540
0,0994
0,0714
0,0545
0,0380
0,0000
0,0495
0,0626
0,0436
0,0711
0,0540
0,0442
0,0563
0,0627
CM
0,0578
0,1087
0,0740
0,0637
0,0589
0,0495
0,0000
0,0562
0,0295
0,0989
0,0620
0,0619
0,0713
0,0735
CMP
0,0761
0,0817
0,0886
0,0801
0,0542
0,0626
0,0562
0,0000
0,0429
0,0867
0,0531
0,0604
0,0555
0,0668
CTQ
0,0505
0,0892
0,0662
0,0581
0,0449
0,0436
0,0295
0,0429
0,0000
0,0719
0,0405
0,0524
0,0489
0,0524
MB
0,0933
0,1335
0,1189
0,0989
0,0769
0,0711
0,0989
0,0867
0,0719
0,0000
0,0725
0,0590
0,0846
0,0836
MBB
0,0566
0,1004
0,0806
0,0678
0,0606
0,0540
0,0620
0,0531
0,0405
0,0725
0,0000
0,0602
0,0540
0,0679
MP
0,0555
0,1028
0,0765
0,0665
0,0504
0,0442
0,0619
0,0604
0,0524
0,0590
0,0602
0,0000
0,0543
0,0661
SE
0,0589
0,1017
0,0786
0,0753
0,0634
0,0563
0,0713
0,0555
0,0489
0,0846
0,0540
0,0543
0,0000
0,0547
SL
0,0797
0,1110
0,0996
0,0893
0,0651
0,0627
0,0735
0,0668
0,0524
0,0836
0,0679
0,0661
0,0547
0,0000
De um modo geral, e em conformidade com o que foi referido para as distâncias
genéticas no capítulo anterior, as raças foram agrupadas de acordo com a proximidade
geográfica e com o tipo de lã, tendo-se obtido dois grandes grupos, um constituído pela
raças BEDM, CB, CC, CGB, CGM, CTQ e CM, as quais, com a excepção da raça CC
se situam todas a norte da Serra da Estrela e, com a excepção da BEDM, se incluem
todas no tipo Churro; o outro grupo reúne as raças MB, MP, MBB, SE e SL, situadas a
sul da referida serra. Quanto às raças CA e CMP elas foram diferenciadas das restantes.
Os resultados assim obtidos parecem condizentes com o que é conhecido em termos de
semelhança morfológica, proximidade geográfica e informação histórica sobre as raças.
Relativamente à raça CMP, FRAZÃO (1982) considerou tratar-se de uma raça distinta
das restantes raças portuguesas. O agrupamento segundo a proximidade geográfica pode
estar associado a um eventual fluxo génico entre populações facto que, nos animais
domésticos, ocorre com certa frequência.
Contudo, não foi possível testar a robustez deste dendograma por bootstrap
(FELSENSTEIN, 1985a), uma vez que esta distância genética não estava incluída em
nenhum programa informático conhecido.
149
Capítulo 4 – Hierarquia de prioridade de conservação das raças portuguesas de ovinos
Figura 28. Dendograma da relação entre as 14 populações de ovinos, construído segundo o método
Neighbour-Joining.
Na Tabela 24 são apresentados os valores da contribuição relativa (c) de cada raça
para o core set obtidos para os modelos WLM e WLMM.
150
Capítulo 4 – Hierarquia de prioridade de conservação das raças portuguesas de ovinos
Tabela 24. Valores da contribuição relativa de cada raça para o core set, calculadas segundo as
estimativas de f pelos modelos WLM e WLMM.
Raça
CGB
MB
BEDM
SL
SE
CC
CA
CB
CGM
CM
CMP
CTQ
MBB
MP
λ=287
ccor
(WLM)
0,2728
0,2654
0,1789
0,1064
0,1005
0,076
0
0
0
0
0
0
0
0
Raça
MB
CGB
BEDM
SL
CC
SE
CGM
CTQ
CMP
MBB
CA
CB
MP
CM
c
(WLMM)
0,1392
0,1148
0,1061
0,0963
0,0863
0,0862
0,0742
0,0676
0,0586
0,0560
0,0475
0,0346
0,0326
0,0000
Com a aplicação do modelo WLM, foram observadas contribuições negativas
para as raças CA, CB, MBB, MP e CM, ou seja, aquelas que apresentaram valores mais
elevados de ƒ̂ . Apesar de existirem situações que, neste modelo, podem justificar o
aparecimento de valores de c negativos como solução, eles não fazem sentido para o
objectivo pretendido, pelo que apenas foi apresentado a solução corrigida (ccor),
conforme recomendado por EDING et al. (2002).
Face aos resultados obtidos, torna-se evidente que o modelo utilizado para estimar
ƒ̂ tem grande influência no cálculo da contribuição relativa de cada raça para o core
set. Assim, enquanto no caso do modelo WLM, as primeiras duas raças contribuíram
com 54% da diversidade do core set, no modelo WLMM foram necessárias 5 raças para
atingir tal valor.
No global, a solução obtida com o modelo WLMM foi a mais conservadora, uma
vez que a contribuição para o core set foi repartida por treze raças em vez de apenas
seis, como no caso do modelo WLM. No entanto, se hipoteticamente, fosse possível
conservar apenas seis raças, ambos os modelos indicariam as mesmas, apesar da ordem
estabelecida apresentar algumas diferenças.
151
Capítulo 4 – Hierarquia de prioridade de conservação das raças portuguesas de ovinos
As raças MB e CGB foram as que mais contribuíram para a diversidade do core
set. Relativamente à primeira, tal pode ser atribuído ao facto de se tratar da raça
portuguesa com maior população e de, em meados do século passado, ter sido alvo de
cruzamento com raças estrangeiras, nomeadamente com o merino francês e alemão
(BETTENCOURT, 1945) o que poderá ter determinado um aumento da diversidade. No
caso da CGB, a justificação pode ser a mesma já apontada anteriormente como
responsável pelos valores baixos de ƒ̂ obtidos para esta raça.
Atenta-se que nas primeiras três raças estejam representadas uma de cada um dos
três tipos de lã (Churra, Merina e Bordaleira), característica muito utilizada para
classificar os ovinos, nomeadamente em troncos (BELDA e TRUJILLANO, 1986).
Apesar da CA ser a raça que surgiu mais diferenciada no dendograma da Figura
28 e dos autores da abordagem do core set referirem que a mesma tende a beneficiar as
"populações cuja diversidade é menos típica", a contribuição obtida para a CA foi
mínima ou nula conforme o modelo utilizado. Esta contradição aparente deve-se,
provavelmente, ao facto de na construção de dendogramas, com base em distâncias
genéticas, não ser considerada a diversidade intra-populacional, enquanto que na
segunda abordagem a diversidade intra-populacional é muito relevante. Como a CA foi
a raça que apresentou o maior valor de ƒ̂ , indicativo de uma menor diversidade intraracial, este aspecto parece ter pesado mais do que a distância que a separa das restantes
raças. Assim, o que à partida constituiria uma vantagem, pelo menos do ponto de vista
de concepção, já que se evitaria que populações cuja distância resultasse apenas da
aumento da consanguinidade da mesma, parece não funcionar na prática, uma vez que
tudo indique que a CA seja de facto uma raça afastada, contudo ocupou as últimas
posições na hierarquia de prioridade de conservação. O mesmo aconteceu com o caso da
raça CB que ocupou a terceira posição na abordagem de WEITZMAN e uma das últimas
no core set, tendo apresentado o segundo maior valor de ƒ̂ .
A única excepção à inversão de posições é o caso da raça MB que ficou
posicionada nos lugares cimeiros nos dois métodos, provavelmente porque esta raça
teve a particularidade de, simultaneamente, ter sido uma das mais afastadas e
apresentado um valor baixo de ƒ̂ , para o qual terá contribuído o facto de ser a raça
Portuguesa com maior efectivo.
152
Capítulo 4 – Hierarquia de prioridade de conservação das raças portuguesas de ovinos
Assim, o método do core set parece penalizar as populações com maior risco de
extinção, uma vez que estas caracterizam-se por um reduzido e isolado número de
indivíduos, sujeitas, portanto, ao efeito da deriva genética que lhes induz uma
diminuição da riqueza alélica e um aumento da consanguinidade (OHTA, 2001).
Uma forma de minorar este problema consiste em reformular a análise de acordo
com a perspectiva de THAON D'ARNOLDI et al. (1998) a qual propõe a definição de um
subconjunto de raças constituído pelas que apresentam menor perigo de extinção e a
análise da contribuição de diversidade de cada uma das restantes em função do mesmo.
Os resultados assim obtidos, considerando o subconjunto seguro composto pelas raças
CTQ, MB, SE, são apresentados na Tabela 25.
Tabela 25. Estimativa da perda de diversidade associada ao desaparecimento eventual de cada
raça, considerando à partida um subconjunto seguro de raças (CTQ, MB, SE).
Grupo
cs+i
Global
Seguro
Seguro +i:
BEDM
CA
CB
CC
CGB
CGM
CM
CMP
MBB
MP
SL
0,327
0,061
0,048
0,220
0,407
0,212
0,000
0,073
0,038
0,000
0,169
Div(M)
0,984
0,976
0,980
0,976
0,976
0,978
0,982
0,977
0,976
0,976
0,976
0,976
0,977
WLM
P
(% )
Nge
P
(% )
0,81
31,3
20,4
34,8
0,45
0,03
0,01
0,26
0,63
0,15
0,00
0,02
0,00
0,00
0,11
24,9
20,7
20,5
22,7
27,2
21,7
20,4
20,6
20,4
20,4
21,4
21,89
1,24
0,41
11,36
33,15
6,52
0,00
0,82
0,00
0,00
4,70
WLMM
cs+i Div(M) P
Nge
P
(% )
(% )
0.993
71,4
0,985 0,81 33,6 59,2
0,257
0,192
0,198
0,240
0,271
0,241
0,183
0,216
0,216
0,204
0,234
0,988
0,987
0,987
0,988
0,989
0,988
0,987
0,987
0,987
0,987
0,988
0,31
0,20
0,20
0,28
0,35
0,26
0,15
0,21
0,21
0,18
0,25
42,4
38,8
38,8
41,3
43,5
40,7
37,3
39,1
39,1
38,2
40,3
26,27
15,50
15,50
23,14
29,57
21,14
11,19
16,41
16,41
13,74
20,16
Ordem prioridade
WLM
WLMM
CGB
BEDM
CC
CGM
SL
CA
CMP
CB
CM
MBB
MP
CGB
BEDM
CC
CGM
SL
CMP
MBB
CA
CB
MP
CM
Global – refere-se ao conjunto das 14 raças; Seguro – grupo constituído pelas raças CTQ, MB, SE; Div(M) - diversidade genética;
Nge – número de equivalentes de genoma fundadores (CABALLERO e TORO, 2000); P – percentagem de perda de Div(M) ou de Nge
calculada como [ (seguro + i – seguro) / seguro *100; cs+i é a contribuição de uma raça quando o core set é constituído pelo
subconjunto seguro mais a raça i.
Quando a diversidade foi definida por Div(M), verificou-se que a conservação das
três raças do subconjunto seguro garantia a manutenção de 99,19% da diversidade, ou
seja, a perda situava-se em 0,81% apenas. Pelo contrário, quando foi definida por Nge, a
conservação exclusiva do subconjunto seguro representou uma perda muito
considerável (59,2%).
Atendendo a que Div(M) é um parâmetro de diversidade cuja alteração está
associada à variabilidade genética quantitativa, enquanto a alteração de Nge está
associada ao potencial de perda de alelos raros (EDING et al., 2002), parece evidente que
o risco ligado ao segundo parâmetro é muito superior.
153
Capítulo 4 – Hierarquia de prioridade de conservação das raças portuguesas de ovinos
Na análise da ordem de prioridade, as primeiras cinco raças (CGB, BEDM, CC,
CGM, SL) foram consensuais entre modelos. A confirmar-se a informação segundo a
qual a raça CC, entretanto, ter-se-ia extinguido (TELO DA GAMA et al., 2004), tal facto
comportou uma perda considerável de diversidade. Na altura em que foi realizada a
amostragem para este estudo não existia uma associação de criadores para a raça
BEDM, pelo que, e dado o contributo importante que esta raça representa para a
diversidade global, parece-nos da máxima urgência a tomada de medidas no sentido de
providenciar a sua conservação.
4.5. DISCUSSÃO
A escolha do método de hierarquização das raças a conservar revelou-se de
grande importância uma vez que a comparação entre abordagens deixou claro que estas
afectam a prioridade atribuída a cada raça, resultado igualmente observado por FABUEL
et al. (2004), quando estudou a prioridade de conservação de cinco variedades de porco
ibérico. Disso é exemplo o caso das raças CA e CGB, que ocuparam o primeiro e um
dos últimos lugares, respectivamente, na abordagem de WEITZMAN, enquanto que esta
posição foi invertida com a metodologia do core set. A opção pela primeira abordagem
deu ênfase à diversidade inter-racial, abstraindo-se da intra-racial, conferindo prioridade
a raças afastadas, independentemente da causa subjacente à dissemelhança genética.
Pelo contrário, a segunda ponderou demasiado a diversidade intra-racial, penalizando
raças que, pelo facto de terem sofrido uma redução drástica do seu efectivo e assim em
risco de extinção, têm tendência a conter menor diversidade intra-racial. O caso da raça
CA constitui disso um exemplo, uma vez que este método colocou-a em último lugar no
ranking apesar de ter sido a mais dissemelhante de acordo como os valores de distância
genética obtidos, uma posição justifcável pelos menores valores de RAA e ƒ̂ ,
eventualmente em virtude de um efeito de bootleneck resultante da importação de um
número reduzido de animais.
A escolha da ponderação a dar a estes dois tipos de diversidade parece decisiva na
escolha das raças a conservar. Segundo RUANE (1999b), a variação entre raças é mais
importante para o incremento dos recursos genéticos do que a variação intra-racial,
porque quanto maior for a variação entre raças maior é a probabilidade de serem
154
Capítulo 4 – Hierarquia de prioridade de conservação das raças portuguesas de ovinos
portadoras de genes ou combinações de genes que reflectem características de
adaptação únicas. Opinião idêntica é apontada por BARKER (1999) ao referir que
enquanto a perda de variabilidade intra-racial é continuamente colmatada por novas
variações através de mutações, a variação entre raças não pode ser recuperada, pois cada
raça é o produto da mutação, da deriva genética, bem como de uma evolução e
adaptação
separadas,
com
diferente
pressão
selectiva
imposta
pelo
clima,
disponibilidade de alimentos, doenças e critérios adoptados pelo Homem. Esta opinião
não é, obviamente, partilhada por EDING et al. (2002) ao considerar que a primeira
abordagem pode ser entendida como um caso particular daquela que ele propõe.
Se se atender ao facto de terem sido analisadas apenas duas das abordagens de um
dos critérios utilizados na escolha das raças a conservar, é por demais evidente que esta
tarefa não se revela fácil. Além disso, deve-se ter em conta que os resultados obtidos
nos métodos utilizados referem-se à amostragem de indivíduos nas raças e de loci no
genoma e não fornecem uma estimativa da variância e do erro envolvidos.
Assim, será necessário definir numa primeira fase a preferência ou ponderação do
que se pretende conservar: se raças geneticamente afastadas sabendo, contudo, que no
caso de raças de animais o afastamento terá resultado em grande parte da deriva
genética podendo incluir uma redução da diversidade genética intra-racial, ou, pelo
contrário, se a opção é por aquelas que, pelo facto de terem sofrido em grau menor esse
efeito, nomeadamente por terem mantido um efectivo elevado, ou por terem sido alvo
de introgressão de outras raças, mantiveram uma RA mais elevada e, por conseguinte,
são levadas a ocuparem posições intermédias, quando se procede ao cálculo de
distâncias genéticas. Uma forma de combinar a informação da diversidade genética intra
e inter-racial adaptando a abordagem de WEITZMAN foi sugerida por GARCIA et al.
(2005).
Por outro lado, é importante referir que as abordagens apresentadas assumem o
pressuposto de que a diversidade determinada a partir de loci selectivamente neutros
reflecte, de uma forma geral, a de loci responsáveis por características com interesse
económico e sendo assim a conservação da primeira conduzirá à conservação da
segunda. Alguns trabalhos publicados recentemente têm questionado este princípio por
terem obtido uma fraca correlação entre as duas diversidades (BUTLIN e TREGENZA,
1998; PFRENDER et al., 2000; CREPALDI et al., 2001; MERILA e CRNOKRAK, 2001;
COLTMAN e SLATE, 2003; DEWOODY e DEWOODY, 2004). Contudo, PFRENDER et al.
155
Capítulo 4 – Hierarquia de prioridade de conservação das raças portuguesas de ovinos
(2000) são de opinião favorável, e segundo estes, mesmo que os marcadores
moleculares possam fornecer pouca informação para o nível de diversidade genética de
características quantitativas dentro de uma população, eles são indicadores válidos da
subdivisão populacional das mesmas.
Uma outra crítica prende-se com a validade da análise da diversidade genética por
locus, quando a unidade de estudo é a raça considerada, do ponto de vista de interesse
para a conservação, como “uma combinação única de genes difícil de reproduzir”
(HALL e BRADLEY, 1995; MARTIN-BURRIEL et al., 1999). Hoje em dia, esta é a
abordagem possível, mas o rápido desenvolvimento da tecnologia de microarrays deixa
antever que a obtenção simultânea de um grande número de SNP irá brevemente
permitir outros tipos de análise. No entanto, também aqui, a questão sobre qual a
combinação de loci a ser analisada não obterá um consenso fácil.
Ainda a este respeito, THAON D'ARNOLDI et al. (1998) sugeriram a fusão de raças
geneticamente próximas como uma estratégia no sentido de preservar uma maior
diversidade sem custos adicionais. Este procedimento tem a vantagem de aumentar o
tamanho da população e de diminuir a perda de alelos apenas à custa da uma pequena
cedência dos padrões da raça. No caso das raças em estudo, os pares que mais se
adequariam a uma tal estratégia seriam, por exemplo, a CM com a CTQ e a CGB com a
CGM, uma vez que foram os pares que apresentaram valores menores de distância
genética e cuja morfologia se assemelha.
Após a identificação das raças com prioridades de conservação, é necessário
estabelecer estratégias reprodutivas de forma a minimizar os efeitos da deriva genética.
Estas incluem vários aspectos independentes, tais como o número e critério de escolha
dos indivíduos e a organização dos acasalamentos (CHAIWONG, 1999; TORO e MAKITANILA, 1999; CABALLERO e TORO, 2000). O conhecimento da genealogia dos
indivíduos é uma informação muito importante para concretizar aquela tarefa, todavia
raramente está disponível quando se trata de populações em perigo de extinção, tendo
por isso sido desenvolvidas metodologias que, recorrendo a informação alélica de
marcadores moleculares, ultrapassam esse constrangimento (LYNCH e RITLAND, 1999;
TORO et al., 2002; VALES-ALONSO et al., 2003). Os marcadores moleculares permitem
inclusivé reconstruir genealogias (GOODNIGHT e QUELLER, 1999; CUNNINGHAM et al.,
2001; BLOUIN, 2003) e seguir a evolução da consanguinidade numa população
(LEUTENEGGER et al., 2003).
156
Capítulo 4 – Hierarquia de prioridade de conservação das raças portuguesas de ovinos
Por último, é indispensável referir que a melhor garantia de sobrevivência que se
pode dar a uma determinada raça é contribuir para o aumento da capacidade de
remunerar os recursos nela investidos pelo criador, quer seja através do favorecimento
da melhoria da produção, quer através da promoção de valor acrescentado dos seus
produtos, uma vez que a não rara modesta economia daquele não lhe permite encarar a
variabilidade genética como um investimento para futuros usos. Nesse sentido, a equipa
na qual nos inserimos tem contribuído com alguns estudos que visaram avaliar a
variabilidade de loci candidatos a associação com características de qualidade do leite,
como é o caso dos genes das caseínas, lactoglobulina e prolactina (RAMOS et al., 2000;
RUSSO-ALMEIDA et al., 2001; RAMOS et al., 2002; RUSSO-ALMEIDA et al., 2002) e de
qualidade da carne, como é o caso do gene da calpastatina (MARTINS, 2004),
procurando disponibilizar informação que consideramos útil e que possa vir a ser
incorporada em futuros programas de melhoramento.
4.6. CONCLUSÕES
Da análise dos resultados deste capítulo foi possível estabelecer uma
hierarquização de prioridade de conservação das raças portuguesas de ovinos tendo em
consideração apenas o critério da singularidade genética e recorrendo a duas abordagens
diferentes:
- De acordo com a abordagem de WEITZMAN, a ordem de prioridade obtida foi
CA, MB, CB, SL, CMP, SE, MP, CC, MBB, BEDM, CM, CGB, CGM, CTQ.
- De acordo com o método core set, a ordem foi MB, CGB, BEDM, SL, CC, SE,
CGM, CTQ, CMP, MBB, CA, CB, MP, CM
Desta forma, confirma-se que a abordagem de WEITZMAN dá prioridade a raças
geneticamente afastadas independentemente da diversidade intra-racial, por sua vez o
método core set dá prioridade a raças cuja diversidade intra-racial é maior. Assim, com
excepção da raça MB que nos dois métodos ocupou um lugar cimeiro, o ordenamento
das restantes foi mais ou menos invertido.
A grande influência dos métodos utilizados na hierarquização da prioridade de
conservação das raças portuguesas de ovinos e o facto de que em análise esteve apenas
um dos critérios passíveis de se ponderar, permitem antever que tal tarefa não sendo
157
Capítulo 4 – Hierarquia de prioridade de conservação das raças portuguesas de ovinos
nem fácil, nem consensual, merecerá mais estudos e uma análise rigorosa e
desapaixonada.
Na altura em que foi realizada a amostragem para este estudo não existia
associação de criadores para a raça BEDM, pelo que, e dado o contributo importante
que esta raça representou para a diversidade global, parece-nos da máxima urgência a
tomada de medidas no sentido de providenciar a sua conservação.
158
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
CAPÍTULO 5 - DISCRIMINAÇÃO RACIAL DOS OVINOS
PORTUGUESES COM BASE EM INFORMAÇÃO
MOLECULAR
5.1. INTRODUÇÃO
No capítulo 1 fez-se referência ao conceito de raça que tão amplamente é utilzado
quando nos referimos a animais domésticos. Aquele assenta, entre outros aspectos, em
características morfológicas, não sendo por isso de estranhar que a morfometria
constitui uma das bases da caracterização das raças e que tenham sido várias foram as
medidas estudadas e os índices definidos com o objectivo de, através de uma análise
multivariada, ser possível discriminar indivíduos pertencentes às diferentes raças em
estudo (TEIXEIRA, 1991; LALLEMAND, 2002). No entanto, apesar do poder
discriminatório da análise das populações, os caracteres morfológicos têm algumas
desvantagens, nomeadamente o seu determinismo poligénico e a sua susceptibilidade
elevada perante os factores ambientais (ESTOUP et al., 1995a). Algumas das limitações
dos estudos morfométricos estão associadas à impossibilidade de os aplicar a situações
nas quais os indivíduos perderam a sua integridade física, como seja em peças de talho,
ou em caso de necessidade de comprovação da origem racial de embriões ou de sémen.
Este aspecto tem especial relevo no que concerne aos produtos animais com
Denominações de Origem Protegida (DOP), uma vez que estão normamente associados
a raças autóctones exploradas em sistemas de produção tradicional, cuja rastreabilidade
é um requisito a garantir. Tal necessidade decorre da diminuição da confiança dos
consumidores, fruto dos recentes acontecimentos envolvendo casos de Encefalopatia
Espongiforme dos Bovinos (BSE) nos bovinos, de dioxinas nos frangos, etc.
Para além da morfometria, os estudos realizados no âmbito do polimorfismo de
grupos sanguíneos e de proteínas (alozimas) demonstraram ser muito úteis na
discriminação de várias espécies. Contudo, o seu uso na discriminação de populações da
mesma espécie é impraticável devido ao número reduzido de alelos apresentados por
estes tipos de marcadores, o que exigiria a análise de uma quantidade enorme de loci.
159
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
Nas últimas décadas foi possível superar, pelo menos em parte, algumas destas
limitações graças ao desenvolvimento de metodologias que envolvem o estudo do
polimorfismo molecular ao nível do DNA, de início utilizando os bem conhecidos
fingerprintings (SIGNER et al., 2000) e, mais recentemente, com o recurso aos
microssatélites. O número elevado de alelos que os microssatélites normalmente
apresentam fazem deles uma ferramenta muito útil, quando se trata de reconhecer a
proveniência racial ou populacional do indivíduo, e apropriada ao estudo de animais
domésticos, ou selvagens proximamente relacionados, como é o caso de bovinos
(MACHUGH et al., 1998; BLOTT et al., 1999; GINJA, 2002; MAUDET et al., 2002a),
ovinos (BUCHANAN et al., 1994; DIEZ-TASCON et al., 2000; ARRANZ et al., 2001b),
equinos (BJØRNSTAD e RØED, 2001), caprinos (GANAI e YADAV, 2001), suínos
(MARTÍNEZ et al., 2000), galináceos (ROSENBERG et al., 2001), abelhas (ESTOUP et al.,
1995a), trutas (RUZZANTE et al., 2001), etc. Outros exemplos de aplicação semelhante
destas metodologias podem ser encontrados nas revisões de WASER e STROBECK (1998)
e DAVIES et al. (1999) e, mais recentemente, nos estudos realizados por MAUDET et al.
(2002b) e MANEL et al. (2002), cujo objectivo consistiu em identificar a origem de
animais caçados clandestinamente; bem como, nos de FAVRE et al. (1997) sobre as
taxas de dispersão por sexo dos animais selvagens.
Embora o procedimento a focar neste capítulo não seja em rigor a filosofia da
rastreabilidade que os organismos oficiais pretendem implementar no controlo dos
produtos animais, pois esta tem como objectivo seguir o animal desde o nascimento, até
ao consumidor passando pela produção, abate, desmancha e comercialização, através de
uma identificação convencional, electrónica e de uma identificação molecular
(PORTETELLE et al., 2000; ROUZAUD et al., 2000; SANCRISTOBAL-GAUDY et al., 2000;
CUNNINGHAM e MEGHEN, 2001), ela tem muitos aspectos em comum, apresentando a
vantagem de poder ser utilizada mesmo quando sobre o animal não houver qualquer
identificação prévia. Não admira, portanto, que tal procedimento tenha sido
desenvolvido no âmbito de estudos de ecologia onde a informação sobre os indivíduos é
escassa ou nula. Tal como qualquer outra metodologia, apresenta limitações e
susceptibilidades a vários níveis, algumas das quais serão referidas no decurso do
capítulo.
A diferenciação racial dos indivíduos com base na informação alélica de vários
loci de microssatélites (multilocus), tem sido objecto de desenvolvimento de métodos
160
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
estatísticos, dos quais se fará, de seguida, uma breve revisão. Alguns destes métodos
estatísticos resultaram da adaptação de outros que haviam sido aplicados a variáveis
quantitativas, nomeadamente a variáveis morfométricas, de que são exemplos a análise
multivariada (Cavalli-Sforza et al., 1994) e a aprendizagem automática (Machine
learning Methods) (CORNUET et al., 1996; MACHUGH et al., 1998; GUINAND et al.,
2002; ANDRIEU et al., 2003). Outros, desenvolvidos especificamente para marcadores
moleculares, como os microssatélites, foram designados como métodos genéticos
(CORNUET et al., 1996). Estes são os métodos de eleição quando é usada apenas
informação genética, enquanto a análise multivariada e a aprendizagem automática
podem ser mais úteis quando a informação genética é combinada, por exemplo, com
informação morfométrica ou ecológica (HANSEN et al., 2001). De entre os métodos
genéticos são considerados três tipos, designadamente os métodos de atribuição, os
métodos de simulação/exclusão e os métodos baseados em modelos.
5.1.1 Métodos de atribuição
Nos métodos de atribuição, os indivíduos com origem desconhecida são sempre
atribuídos a uma população de entre as n populações em estudo, em relação à qual
apresentam um de dois critérios: a menor distância genética ou a maior verosimilhança
de ocorrência do seu genótipo.
5.1.1.1 Distâncias genéticas como critério
Como foi observado no capítulo anterior, o cálculo de distâncias genéticas
representa uma metodologia clássica para o estabelecimento de relações filogenéticas ou
de estrutura populacional entre espécies ou populações de uma mesma espécie. O
primeiro estudo que recorreu a distâncias genéticas para relacionar um indivíduo com
uma população foi realizado por BOWCOCK et al. (1994) em humanos, no qual foi usada
a distância DAS e considerado os indivíduos como OTUs (Operational Taxonomic Units)
em vez de uma espécie ou população, substituindo, portanto, as frequências alélicas
populacionais pelos genótipos multilocus individuais. A matriz de distâncias interindividuais resultante é, à semelhança do estudo de populações, utilizada para construir
uma árvore pelos métodos tradicionais, como sejam o Neighbour-Joining (NJ) ou o
UPGMA. Esta metodologia assenta no pressuposto de que os indivíduos com origem
161
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
numa mesma população terão genótipos mais semelhantes e agrupar-se-ão
conjuntamente quando representados numa árvore. Se o número de populações e de
indivíduos em estudo é relativamente pequeno, torna-se fácil identificar a
correspondência entre um ramo da árvore e uma população e analisar a eficiência deste
método, contabilizando os indivíduos “mal” colocados. Pelo contrário, quando o
número de populações e indivíduos é elevado, tal procedimento é desadequado, dado o
grau de subjectividade que envolve. Na tentativa de ultrapassar este problema, ESTOUP
et al. (1995a), propuseram a introdução de um índice de classificação (CI), tornando
mais objectiva a análise de eficiência deste método. Mesmo assim, PRITCHARD et al.
(2000) consideraram que a utilização deste tipo de abordagem é mais adequada para
explorar os dados do que para a inferência estatística.
Uma abordagem semelhante à de BOWCOCK et al. (1994) foi publicada por
CIAMPOLINI et al. em 1995, propondo uma medida designada por “similaridade
genética”, posteriormente reformulada por CIAMPOLINI et al. (2000) numa “fórmula
genómica”, como metodologia de atribuição.
O critério de distâncias genéticas foi também utilizado por CORNUET et al. (1999),
os quais adaptaram várias distâncias genéticas à relação indivíduo-população.
Concretamente, esta metodologia consiste em:
-
Calcular as frequências alélicas para cada locus em cada população, com base
nos indivíduos nela amostrados;
-
Calcular as frequências alélicas para cada locus em cada indivíduo a atribuir,
considerando o valor de 0 se o alelo em questão estiver ausente, 0,5 se tiver um
exemplar (heterozigótico) e 1 se tiver dois exemplares (homozigótico);
-
Calcular o valor da distância entre cada indivíduo a atribuir e as populações
em causa, com base na expressão que caracteriza cada distância;
-
Atribuir o indivíduo à população em relação à qual apresenta menor valor de
distância;
-
No caso concreto da aplicação da distância DAS, a distância entre um indivíduo
e a população é calculada tomando a média das distâncias entre o indivíduo a
atribuir e cada um dos membros de cada população.
162
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
O método das distâncias genéticas proposto por CORNUET et al. (1999) não requer
que as populações estejam em HWE e, ao contrário do de BOWCOCK et al. (1994), não
representa os indivíduos em árvores, mas atribui-os directamente a cada população. Se a
origem real destes indivíduos for conhecida, então a percentagem de indivíduos
correctamente atribuídos é um bom indicador da eficiência do método. Na prática,
quando se pretende estimar esta eficiência, utiliza-se como indivíduos a atribuir os
mesmos amostrados em cada uma das populações, e que serviram também de base ao
cálculo das suas frequências alélicas. Esta forma de proceder é, normalmente, designada
de atribuição “directa” (MAUDET et al., 2002a) e contrasta com a utilização de
indivíduos simulados, que se descreve mais adiante. Assim, um indivíduo é
sequencialmente e com reposição retirado da sua população de origem, sendo calculadas
as distâncias genéticas entre este indivíduo e cada uma das populações. Este cálculo
pode ser efectuado considerando, ou não, o genótipo do indivíduo a atribuir na
estimativa das frequências alélicas da sua população de origem (procedimento
designado no programa GENECLASS por “as is” e “leave one out”, respectivamente). No
tratamento de uma amostragem relativamente grande, a diferença de valor obtido
através dos dois procedimentos não é significativa mas, quando a amostragem é
pequena, a utilização do procedimento “as is” resulta numa distorção na atribuição,
favorecendo a verdadeira população de origem (EFRON, 1983). Assim, a atitude
aparentemente mais realista é não considerar o genótipo do indivíduo a atribuir nesse
cálculo (procedimento “leave one out”). A opção por um procedimento ou pelo outro
pode ter grandes repercussões na eficiência da atribuição do método, como se verá no
decurso deste capítulo.
5.1.1.2 Máxima verosimilhança como critério
Os métodos que utilizam a máxima verosimilhança como critério de atribuição
têm em comum os seguintes pontos:
-
Calculam as frequências alélicas para cada locus em cada população, com
base nos indivíduos nela amostrados;
-
Calculam a verosimilhança de ocorrência do genótipo multilocus do indivíduo
a atribuir, em cada população, pressupondo HWE e equilíbrio de ligação para
todos os loci considerados;
163
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
-
Atribuem o indivíduo à população em que a verosimilhança do seu genótipo é
mais elevada.
Quanto às diferenças, elas resultam principalmente da natureza dos indivíduos a
atribuir (indivíduos reais ou indivíduos simulados com base nas frequências alélicas
estimadas para cada população), da fórmula de cálculo da verosimilhança e do rigor
(stringency) utilizado na atribuição.
A primeira aproximação sugerida para atribuir indivíduos à população de origem
foi efectuada por JAMIESON (1965) tendo-se baseado na verosimilhança de ocorrência
de um dado genótipo numa população, estimada a partir das frequências alélicas de
alozimas observadas nessa população.
Mais tarde foi adaptada por PAETKAU et al. (1995) ao caso de genótipos
multilocus de microssatélites, tendo para tal elaborado um programa designado de “the
assignment test” disponível na internet 9. Estes autores utilizaram o procedimento
“leave one out”, ou seja, usaram os indivíduos amostrados, dos quais retiraram
sequencialmente o indivíduo a atribuir e recalcularam as frequências alélicas na
população de origem. O cálculo da verosimilhança seguindo este método é efectuado
considerando que o genótipo multilocus do indivíduo a atribuir é uma amostra
multinomial das frequências alélicas que caracterizam cada população, assumindo que
estas se encontram em HWE e em equilíbrio de ligação. O indivíduo é então atribuído à
população na qual o seu genótipo tem maior verosimilhança. Por comodidade, os
valores de verosimilhança são apresentados na forma logarítmica, pois como facilmente
se deduz, a ordem de grandeza é muito pequena. Assim, a verosimilhança é calculada
pelo logaritmo do produtório:
⎛ n 2 ⎞ para i=j
log⎜ ∏ pij ⎟
⎝ l =1 ⎠
e
⎛ n
log⎜ ∏ 2 p i
⎝ l =1
⎞ para i≠j
⎠
p j⎟
onde n significa o número de loci, i e j denotam os dois alelos no l ésimo locus e pi e pj
indicam a frequência no i ésimo e j ésimo alelo do l ésimo locus na população
considerada (HANSEN et al., 2001).
9
Endereço de internet: http://www.biology.ualberta.ca/jbrzusto/Doh.html
164
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
Este procedimento de cálculo da verosimilhança revela contudo uma limitação
uma vez que, se o indivíduo a atribuir tiver um alelo num dado locus que não esteja
presente em alguma das populações a testar, a verosimilhança desse genótipo nessa
população é, então, igual a zero e assim será automaticamente excluída. No entanto, o
alelo em questão pode ser raro nessa população e não ter sido amostrado apenas por
acaso, não devendo ser excluída logo à partida. Para superar esta limitação, PAETKAU et
al. (1995) sugeriram várias alternativas que basicamente consistem em:
-
Adicionar o indivíduo a atribuir a todas as populações eliminando desta forma as
frequência alélicas nulas;
-
Substituir as frequências alélicas nulas por uma constante de pequeno valor;
-
Substituir as frequências alélicas nulas por 1/(2n+1), sendo n o número de
indivíduos amostrados em cada população onde o alelo não foi detectado. Por
outras palavras, é assumido que o alelo não encontrado na amostra seria o
próximo a ser amostrado.
Não tendo sido apresentado no estudo original qualquer método para estimar o
intervalo de confiança dos resultados obtidos, este aspecto foi, posteriormente,
desenvolvido por ALMUDEVAR (2000).
No trabalho de CORNUET et al. (1999), o método de PAETKAU et al. (1995) é
designado por “método frequentista” tendo sido também incorporado no programa
GENECLASS.
Um método semelhante ao de PAETKAU et al. (1995) é também apresentado por
BANKS e EICHERT (2000), no programa WHICHRUN, disponível na internet10. Este
programa apresenta uma melhor interface de utilização do que o programa “assignment
test”, simula os indivíduos a atribuir com base nas frequências alélicas das respectivas
populações, permite variar o grau de stringency com que os indivíduos são atribuídos às
populações e possibilita avaliar a significância estatística de cada indivíduo atribuído.
Concretamente, a possibilidade de variar a stringency consiste na escolha de um valor
para o rácio (LOD score) entre o logaritmo de base dez do maior valor da
verosimilhança e o imediatamente a seguir, que é utilizado como critério para atribuir o
indivíduo a uma população. Isto significa que os indivíduos deixam de ser sempre
atribuídos a uma população passando a sê-lo somente quando se verificar a relação de
165
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
grandeza estabelecida. Por exemplo, quando se considera um LOD score igual a 2, o
indivíduo só será atribuído se o maior valor de verosimilhança for 100 vezes superior ao
imediatamente a seguir no ranking de verosimilhanças calculadas para as populações.
Por outro lado, a escolha de um LOD Score igual a zero é equivalente ao método
original.
Segundo ROQUES et al. (1999), a probabilidade de um genótipo (indivíduo)
amostrado ter origem numa ou noutra população não é apenas função da verosimilhança
da ocorrência desse genótipo em cada uma das populações mas também do seu tamanho
relativo. Embora seja impossível saber com precisão a discrepância do tamanho relativo
das populações estudadas, os valores de LOD score podem, assim, ser ajustados para ter
em conta esse efeito, o que se revela de particular importância quando há necessidade
de elevadas margens de segurança como é o caso de estudos forenses, nos quais
normalmente se utilizam LOD scores iguais ou superiores a 3 (SHRIVER et al., 1997).
Uma outra forma de calcular a verosimilhança de um dado indivíduo ter origem
numa população, consiste na utilização do Teorema de Bayes, assumindo uma
distribuição a priori uniforme. Tal procedimento foi adoptado por BUCHANAN et al.
(1994) no estudo de 6 raças ovinas. Utilizando 8 microssatélites, simularam 1000
genótipos multilocus de cada raça, tendo por base as frequências alélicas obtidas nas
respectivas populações amostradas, e atribuíram estes indivíduos simulados às
populações cuja verosimilhança, calculada pelo teorema de Bayes, era maior, tendo
obtido uma média de 95,7% de indivíduos correctamente atribuídos. Igual metodologia
foi também aplicada, com resultados semelhantes, por outros autores, nomeadamente
MACHUGH et al. (1998) e DIEZ-TASCON et al. (2000) no estudo de populações de
bovinos e de ovinos, respectivamente.
Inspirados no trabalho de RANNALA e MOUNTAIN (1997), sobre a detecção de
indivíduos imigrantes ou descendentes de imigrantes através de uma aproximação
Bayesiana, CORNUET et al. (1999) desenvolveram um método de atribuição –Método
Bayesiano–, semelhante ao de PAETKAU et al. (1995), no qual o cálculo da
verosimilhança é substituído pelo produto das probabilidades marginais da observação
de um indivíduo com genótipo AkAk’ no locus j na população i, traduzido na expressão:
10
Endereço na internet: http://www-bml.ucdavis.edu/whichrun.htm
166
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
(nijk + 1 / K j + 1)(nijk + 1 / K j )
se k = k'
(CORNUET et al., 1999)
se k ≠ k'
(CORNUET et al., 1999)
(nij + 2)(nij + 1)
2(nijk + 1 / K j )(nijk ' + 1 / K j )
(nij + 2)(nij + 1)
onde nijk é o número de cópias do alelo k amostradas no locus j na população i (não
contabilizando o indivíduo a atribuir), nij é o número total de cópias de todos os alelos
amostrados no locus j na população i, e Kj é o número total de alelos observados na
colecção de populações no locus j. É de notar que a dificuldade anteriormente referida
para a eventual presença de alelos com frequência nula, desaparece devido ao
coeficiente 1/Kj.
5.1.2 Métodos de simulação/exclusão
Uma das limitações dos métodos anteriores prende-se com o facto de um
indivíduo, mesmo que não tenha origem nas populações amostradas, ser sempre
atribuído a uma delas, não sendo importante até que ponto a verosimilhança seja
pequena (pois é escolhido o valor maior entre as populações testadas). Por outro lado,
estes métodos não dão uma medida de confiança da atribuição do indivíduo, pois a
verosimilhança mencionada não mede a probabilidade de origem (pertença) mas apenas
a probabilidade de ocorrência de um genótipo, o que é patente no decréscimo observado
na verosimilhança sempre que aumenta o número de loci considerados, sendo de esperar
também que aumente a probabilidade de um indivíduo ser correctamente atribuído. Há
que ter em conta ainda situações específicas, no âmbito da medicina forense, da
detecção de caça ilegal ou da certificação de origem de um produto animal, nas quais se
revela de maior interesse garantir (especificando uma probabilidade) a exclusão de um
indivíduo ou produto, relativamente a determinada origem referenciada como sendo
verdadeira. Com o objectivo de dar resposta a estas questões, CORNUET et al. (1999)
reformularam alguns dos métodos descritos anteriormente sugerindo uma nova
metodologia que consiste em:
– Calcular as frequências de cada alelo de cada locus em todas as populações
candidatas, com base nos indivíduos amostrados;
167
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
– Simular um grande número de genótipos para cada uma das populações,
tomando aleatoriamente alelos de acordo com a sua frequência, a fim de computar a
distribuição do critério escolhido (distância ou verosimilhança) em cada população;
– Localizar o valor do critério relativo ao indivíduo a atribuir, na distribuição de
cada população simulada; a proporção de valores com maior distância, ou menor
verosimilhança do que o valor do critério para o indivíduo a atribuir, é considerado
como uma medida de probabilidade desse indivíduo pertencer à população;
– Rejeitar todas as populações cuja probabilidade seja inferior a um valor mínimo
(e.g. P<0,01)., sendo óbvio que a escolha deste valor tem repercussões sobre a
repartição dos indivíduos pelas populações.
No caso dos métodos de atribuição, a proporção dos indivíduos correctamente
atribuídos fornece uma boa ideia da eficiência daqueles, mas no caso dos métodos de
simulação/exclusão este parâmetro não pode ser calculado uma vez que o output
relativo ao indivíduo em estudo pode tomar várias formas, como descreveram CORNUET
et al. (1999). A situação ideal consiste na exclusão do indivíduo em causa de todas as
populações menos da que realmente lhe deu origem, em oposição ao caso em que todas
as populações são excluídas, concluindo-se, por uma forte evidência, que a população
de origem desse indivíduo não foi amostrada.
A metodologia da simulação/exclusão não requer o pressuposto de que a
população de origem tenha sido amostrada, porque não compara populações, mas antes
trata-as separadamente. Assim, este método pode ser usado com apenas uma única
população.
5.1.3 Métodos baseados em modelos
Os métodos atrás mencionados, disponíveis na sua maioria no programa
GENECLASS, requerem uma prévia definição das populações amostradas, necessária ao
cálculo das frequências alélicas respectivas e, posteriormente, ao cálculo do critério
(distância genética ou verosimilhança) entre o indivíduo a atribuir e uma população.
Pelo contrário, a metodologia inteiramente Bayesiana proposta por PRITCHARD et al.
(2000), e disponível no programa "Structure"11, trata o número de populações (K) em
11
Endereço de internet: http://pritch.bsd.uchicago.edu
168
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
estudo como mais um parâmetro a estimar. As diferenças entre este e o método
Bayesiano de RANNALA e MOUNTAIN (1997) foram extensivamente discutidas por
BEAUMONT (2001).
No método de PRITCHARD et al. (2000), a totalidade das amostras em estudo é
considerada conjuntamente e constituída por indivíduos cujo genótipo comporta uma
mistura de alelos retirados de um número desconhecido de populações e com
frequências alélicas desconhecidas. O objectivo é, então, calcular simultaneamente o
número de populações, as suas frequências alélicas e a proporção com que cada uma
contribui para o genótipo de cada indivíduo, para que essas populações se encontrem em
HWE e LE. Esta abordagem revela-se particularmente importante quando a estrutura do
conjunto das populações de interesse é difícil de ser detectada por outros critérios, por
exemplo morfológicos. A estimativa destes parâmetros exige, no entanto, a escolha
combinada de um modelo de ancestralidade (“admixture model, no admixture model,
linkage model, using prior population information”) e de um modelo de frequências
alélicas (independentes, correlacionadas), o que, de alguma forma, implica um
conhecimento prévio da história das populações em estudo, informação que nem sempre
está disponível. Assim, é importante avaliar criteriosamente os resultados obtidos à luz
dos pressupostos a partir dos quais eles foram construídos.
Em termos práticos, este método utiliza a informação do conjunto de genótipos
multilocus dos indivíduos amostrados para estimar um valor de verosimilhança para
cada valor de K (número de grupos) num intervalo que se julgue adequado, com a
correspondente estimativa da proporção do genoma de cada indivíduo que pertence a
cada grupo construído. O valor de K com maior verosimilhança deverá, em princípio,
ser o escolhido. No entanto, os autores do método referem que a estimativa de K deve
ser considerada apenas como indicativa. No estudo de raças de animais domésticos, as
populações são normalmente definidas à partida com base em caracteres morfológicos,
daí poder-se inferir que a estimativa do número de grupos (K) faz pouco sentido neste
caso concreto. No entanto, a análise dos valores de verosimilhança calculados para um
intervalo de valores de K que contém o número real de raças amostradas, fornece-nos
uma indicação da consistência entre a estrutura previamente definida e a que melhor é
suportada em termos genéticos. Com este propósito, ROSENBERG et al. (2001)
descreveram, com detalhe, o procedimento prático a seguir na avaliação de K e da
percentagem de indivíduos correctamente atribuídos, quando é utilizado o método de
169
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
PRITCHARD et al. (2000), tomando como exemplo os genótipos multilocus de 27
microssatélites de 20 raças distintas de galinhas.
No programa "Partition"12 DAWSON e BELKHIR (2001) apresentam uma
abordagem semelhante ao método de PRITCHARD et al. (2000), diferindo essencialmente
quanto ao tratamento matemático do output da Cadeia de Markov (MCMC).
Também ANDERSON e THOMPSON (2002) utilizaram a mesma abordagem, por sua
vez, formulada especificamente para situações nas quais as populações são constituídas
por indivíduos “puros” ou por híbridos recentes de duas espécies.
5.1.4. Factores que influenciam os testes de atribuição e simulação/exclusão
No que concerne à metodologia de atribuição, os resultados obtidos apresentam-se
contraditórios, concluindo uns pela elevada capacidade de atribuição, enquanto que
outros se situam em valores mais modestos. Com efeito, ROQUES et al. (1999)
referiram, em peixe vermelho (Sebaster spp.), um sucesso de atribuição de 95 %,
utilizando apenas 4 loci, enquanto que BAMSHAD et al. (2003), no estudo de populações
humanas com proveniências diferentes (África, Ásia, Europa) e usando 60
microssatélites, não foram além de 96% de atribuição correcta. Importa então conhecer
a causa desta disparidade de valores, analisando os factores que influenciam a
capacidade de discriminação dos métodos de atribuição em geral (SHRIVER et al., 1997;
SMOUSE e CHEVILLON, 1998; CORNUET et al., 1999; ROQUES et al., 1999; BAMSHAD et
al., 2003), entre os quais se contam o número de loci e o seu grau de polimorfismo, o
número de populações estudadas e a sua diferenciação genética, bem como o tamanho
da amostra efectuada.
De um modo geral, o número de indivíduos correctamente atribuídos aumenta
com o número e com o polimorfismo (heterozigotia, número de alelos) dos loci
utilizados (ROSENBERG et al., 2001). O polimorfismo requerido para os testes de
atribuição foi estudado por ESTOUP et al. (1998) comparando o polimorfismo elevado
dos microssatélites e o reduzido das alozimas e registando que o poder de atribuição era
muito maior nos primeiros (92% vs 52%). BERNATCHEZ e DUCHESNE (2000),
modelaram a relação entre o número de alelos e o número de loci requeridos para a
12
Endereço de internet: http://www.univmontp2.fr/~genetix/partition.htm
170
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
obtenção de uma certa probabilidade na atribuição, tendo concluído que, para além de 6
a 10 alelos por locus, não havia incremento significativo no poder de atribuição. No
entanto, a sua abordagem baseou-se num modelo com apenas duas populações, sem ter
sido considerado o grau de diferenciação entre elas e por isso resultando difícil inferir o
número de loci e o polimorfismo óptimos em situações de mais do que duas populações.
Também SMOUSE e CHEVILLON (1998) referiram a pouca utilidade dos loci com elevado
número de alelos com baixa frequência. Porém, estas recomendações genéricas não são
suficientes como critério de selecção dos microssatélite, pois tanto o número de alelos
como a sua frequência estão dependentes das populações em estudo. Exemplos de
metodologias para quantificar o poder de atribuição de cada microssatélite podem ser
encontrados em SHRIVER et al. (1997) e BANKS et al. (2003).
Quanto ao número de populações analisadas, SMOUSE e CHEVILLON (1998)
referiram que quanto maior for o seu número, mais difícil será a atribuição para um
mesmo nível de diferenciação genética e maior será o número de loci necessários.
Parece correcto, assim, esperar que o poder de atribuição esteja positivamente
correlacionado com o grau de diferenciação entre as populações, pois no caso extremo
em que ocorresse fixação de diferentes alelos, a análise de um só locus seria suficiente
para obter 100% de sucesso. No entanto, BLOTT et al. , (1999) não encontraram relação
entre o erro na atribuição e o valor de FST entre populações. Também CORNUET et al.
(1999) desenvolveram esta temática no estudo realizado simulando 10 populações
divergentes segundo dois modelos de mutação diferentes (IAM e SMM), das quais
foram amostrados entre 5 a 20 loci e entre 10 a 90 indivíduos por população. O
objectivo foi inferir sobre a melhor combinação possível destas variáveis, em diferentes
graus de diferenciação (0<FST<0,35) entre populações, quando é usado o método
Bayesiano. Em suma, foi possível demonstrar que, com uma amostra de 30 indivíduos e
usando 10 loci e com um grau de diferenciação entre populações correspondente a um
FST = 0,1, o sucesso de atribuição situou-se nos 100%. Pelo contrário, quando a
diferenciação foi pequena (FST = 0,01), o sucesso também diminuiu (~25%), mesmo
quando foram amostrados 90 indivíduos e analisados 20 microssatélites.
Por último, uma questão surge naturalmente: qual dos métodos é o melhor e, em
particular, qual deles é o mais adequado à realidade dos animais domésticos? Como se
pode deduzir, a resposta não é fácil, tanto mais que, como se viu anteriormente, não
existe um parâmetro de qualidade que seja considerado válido para todos os métodos.
171
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
Não se conhece nenhum trabalho que compare todos os métodos que aqui foram
referidos, em especial no que respeita aos que se baseiam em modelos com
desenvolvimento ainda recente e aplicação em número reduzido. No que concerne aos
outros, parece consensual que o método Bayesiano é aquele que, genericamente,
melhores resultados produziu, ou seja, maior percentagem de indivíduos atribuídos
correctamente (CORNUET et al., 1999; ARRANZ et al., 2001b). No entanto, é relevante
aludir que o uso da metodologia Bayesiana é objecto de alguma controvérsia, centrada
no facto da distribuição a priori ser, com frequência, baseada em pressupostos
subjectivos, arbitrários ou mesmo convenientes (MEYER, 1983; SORENSEN e GIANOLA,
2002).
5.2. OBJECTIVOS
Neste capítulo pretendeu-se avaliar: (a) a eficácia de alguns dos métodos de
atribuição para discriminar a origem populacional de indivíduos quando aplicados às
raças portuguesas de ovinos, utilizando para o efeito informação alélica de 19
microssatélites; (b) quais os factores e de que forma estes influenciam o poder de
atribuição dos métodos; e (c) a hierarquização dos microssatélites estudados quanto ao
seu poder discriminante.
5.3. METODOLOGIA
Tendo em conta os objectivos mencionados, e tendo presente as vantagens e
limitações já descritos, bem como a disponibilidade de programas informáticos que
permitissem a sua aplicação, seleccionaram-se os seguintes métodos:
1. Método frequentista de CORNUET et al. (1999), adaptado de PAETKAU et al.
(1995);
2. Método Bayesiano de CORNUET et al. (1999), adaptado de RANNALA e
MOUNTAIN (1997);
3. Método das distâncias de CORNUET et al. (1999);
4. Método de simulação/exclusão Bayesiano de CORNUET et al. (1999);
172
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
5. Método da máxima verosimilhança de BANKS e EICHERT (2000).
O estudo dos primeiros quatros métodos foi realizado recorrendo ao programa
GENECLASS13, utilizando os dois procedimentos existentes “as is” e “leave one out”.
Para o método frequentista, considerou-se a frequência de 0,01 para os alelos que em
algumas populações apresentassem frequência nula. No método das distâncias foram
usadas todas as distâncias disponibilizadas, ou seja, DAS (Shared allele distance de
CHAKRABORTY e JIN 1993), DC (Cord distance de CAVALLI-SFORZA e EDWARDS), DA,
Dm e DS (distâncias de NEI et al., 1983), com excepção da distância (δµ)² (GOLDSTEIN
et al., 1995b), por esta requerer um formato diferente de ficheiro e, principalmente,
porque todos os estudos que dela fizeram uso terem referido os piores resultados
(CORNUET et al., 1999; ARRANZ et al., 2001b).
Pelo facto de alguns dos programas aplicados neste capítulo não permitirem a
utilização de dados incompletos para os genótipos multilocus, foi elaborado um novo
ficheiro para análise de dados, excluindo todos os animais dos quais, por qualquer
motivo, não foi possível obter informação relativa a alguns dos alelos de um ou mais
microssatélites. Assim, o novo número de animais considerados para cada raça
encontra-se referido nas Tabelas 1 e 2 do Anexo 6.
Alguns dos métodos empregues pressupõem que os microssatélites se encontrem
em HWE e em equilíbrio de ligação nas populações estudadas. Com excepção do
microssatélite McM357, optou-se por manter os restantes que não satisfizeram tais
requisitos, uma vez que CORNUET et al. (1999) verificaram que desvios ligeiros do
HWE (défice de heterozigotos) não afectavam significativamente a eficácia dos testes
de atribuição.
Os métodos de atribuição foram comparados quanto à sua eficácia (EA) traduzida
em percentagem de indivíduos correctamente atribuídos à população de origem por cada
um deles. Pelo contrário, BLOTT et al. (1999) preferiram utilizar o erro de atribuição,
tendo considerado dois tipos de erro: o erro tipo I equivalente a 100-EA, e o erro tipo II
definido como a percentagem de indivíduos atribuídos a uma dada raça, mas que na
realidade não tiveram origem na mesma. Tendo em vista a comparação de resultados,
considerou-se também esta abordagem neste estudo. No entanto, no cálculo do erro tipo
II, os mesmos autores consideraram no denominador a totalidade dos indivíduos em
13
Endereço de internet: http://www.montpellier.inra.fr/URLB/
173
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
estudo, enquanto aqui se achou ser mais correcto subtrair a este valor os indivíduos da
raça para a qual se está a calcular o erro tipo II, para assim evitar uma distorção a favor
de raças com tamanho amostral maior.
Com o objectivo de quantificar o efeito resultante do facto de considerar, ou não,
o genótipo do indivíduo que se está a atribuir, no cálculo das frequências alélicas da
população de origem, adoptou-se os dois procedimentos correspondentes, ou seja, as
opções “as is” e “leave one out” nos métodos já referidos. Sendo o número de raças em
estudo um dos factores que podem influenciar a eficácia dos testes de atribuição, todos
os métodos foram também aplicados considerando apenas as 5 raças, cuja morfologia
nos pareceu mais distinta, nomeadamente a CA, a CB, a CGB, o MB e a SE, para se
avaliar a amplitude desse efeito. Tal número foi escolhido de modo a permitir a
comparação destes resultados com os obtidos por outros autores, nomeadamente
ARRANZ et al. (2001b), em cinco raças ovinas espanholas, e KOSKINEN (2003), em
cinco raças de cães finlandeses.
No que se refere à metodologia de simulação/exclusão, optou-se por testar apenas
o método Bayesiano, pois à semelhança dos resultados obtidos por vários autores
(CORNUET et al., 1999; ARRANZ et al., 2001b), foi o que apresentou melhor EA. Por
outro lado, como já foi referido, a comparação dos métodos de simulação/exclusão
revela-se mais difícil já que exige mais parâmetros para a quantificação da sua eficácia.
Assim, foram simulados 10000 indivíduos para cada população e considerado como
critério de exclusão um nível de significância α=0,01.
O poder informativo dos microssatélites nas raças de ovinos portuguesas foi
estudado recorrendo ao programa WHICHLOCI (BANKS et al., 2003), tendo sido
determinado o poder de cada locus isoladamente em cada população ovina pelo
“método da população crítica” e para o conjunto das populações pelo “método da
máxima verosimilhança” (BANKS e EICHERT, 2000). Em qualquer dos casos, simularamse 1000 indivíduos para cada população, tendo em conta as frequências alélicas nelas
obtidas e considerou-se um valor de exigência (LOD score) igual a zero. Enquanto que
para o segundo, o valor da EA para cada microssatélite obtém-se directamente, para o
método da população crítica o resultado corresponde a um índice (score) calculado pela
seguinte fórmula:
Score=EA-[Erro tipo II*(100-Precisão)/Imprecisão)]
174
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
No entanto, quando se definiu a precisão = 100 (opção tomada), o score é
transformado num valor igual à EA. Este procedimento foi repetido 10 vezes e a média
dos 10 valores do score foi utilizada para quantificar o poder discriminatório de cada
microssatélite em cada população e para o conjunto de populações, respectivamente.
Este programa permitiu também testar o poder de atribuição com um número crescente
de loci, utilizando para tal o ordenamento dos loci obtido anteriormente, até alcançar um
nível pré-determinado (100%) para o sucesso da atribuição.
Para avaliar as características dos microssatélites que influenciam a sua eficiência
na discriminação da origem dos indivíduos nas raças ovinas portuguesas, realizou-se
uma análise de correlação entre o score e os parâmetros mais referenciados como
determinantes dessa eficiência, nomeadamente, a heterozigotia esperada não enviesada
(HNB) (NEI, 1978), o número de alelos estimados pelo parâmetro “riqueza alélica” que
tem em conta a variação do tamanho da amostra (ELMOUSADIK e PETIT, 1996) e o valor
de FST WEIR e COCKERHAM (1984). Para o efeito, estes parâmetros foram calculados
como foi descrito no capítulo anterior, mas apenas tendo em conta os indivíduos
utilizados nos testes de atribuição.
5.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os valores médios da eficiência de atribuição obtidos para cada método, segundo
os procedimentos “leave one out” e “as is”, considerando as 14 raças ou apenas as 5
mais distintas, são apresentados na Tabela 26. Os valores individuais por raça e por
procedimento constam das Tabelas 2 e 3 do Anexo 6.
Tabela 26. Variação da eficácia da atribuição com o método, o procedimento ("as is" e "leave one
out") e o número de raças consideradas.
Métodos
B
F
DAS
DC
DA
Dm
DS
Média
14 Raças
“1 out”
“as is”
62,4
91,2
61,8
85,5
49,2
67,5
57,8
76,6
60,4
81,0
47,7
69,0
48,0
68,5
55,3
77,0
5 Raças
“1 out” “as is”
88,6
98,5
87,1
94,7
75,7
83,7
79,1
90,9
81,8
93,5
76,1
90,1
76,4
89,4
80,7
91,5
DeP
14 R 5 R
28,8 9,9
23,7 7,6
18,3 8,0
18,7 11,8
20,6 11,8
21,2 14,1
20,5 12,9
21,7 10,9
DeR
“1 out” “as is”
26,2
7,3
25,3
9,2
26,5
16,2
21,3
14,3
21,4
12,6
28,3
21,2
28,4
20,9
25,3
14,5
B – Bayesiano; DeP – Diferença de EA entre procedimentos; DeR - Diferença de EA entre número de raças;
DAS - Share allele distance; DC - Cord Distance, DA, Dm e DS – Distâncias de Nei; F – Frequentista; R – Raças.
175
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
Da análise dos resultados obtidos foi possível constatar uma elevada variabilidade
entre métodos, entre procedimentos e entre o número de raças envolvidas na análise. O
método Bayesiano (B) foi o que melhores resultados apresentou para todas as situações
estudadas, seguido pelo método frequentista (F). No que se refere aos métodos baseados
em distâncias, obteve-se os melhores resultados com a DA. Exceptuando a posição
relativa entre o método F e o da distância DA, ARRANZ et al. (2001b) obtiveram idêntica
hierarquia de métodos, utilizando o procedimento “as is”, embora os respectivos valores
absolutos de EA se tenham apresentado bastante superiores. A razão deste facto prendese, provavelmente, com a maior diferenciação observada nas 5 raças espanholas, a
avaliar pelos valores de FST (0,07 vs 0,04), pois os resultados relativos à heterozigotia
foram muito idênticos (0,76 vs 0,77).
A ordem relativa estabelecida para os métodos com base na EA foi afectada pelo
procedimento utilizado. Assim, enquanto o método DAS ocupou a 5ª posição para o
procedimento “leave one out”, o mesmo posicionou-se em último para o “as is”. Os
valores de EA obtidos com o procedimento “as is” foram sempre superiores para todos
os métodos, tendo sido observada uma diferença média de 21,7 e 10,9 pontos
percentuais, quando foram consideradas as 14 raças ou apenas 5 raças, respectivamente.
Este facto sugere que a diferença entre procedimentos será maior quanto maior for o
número de raças considerado. A escolha do procedimento a adoptar tem, assim, um
efeito notório no sucesso ou insucesso apontado aos métodos de atribuição.
Por outro lado, comparados os valores de EA tendo em conta as 14 raças ou
apenas 5, verificou-se uma diferença média de 25,3 pontos percentuais para o
procedimento “leave one out” e 14,5 para o “as is”. Estes resultados demonstraram a
importância do número de raças em análise no sucesso ou insucesso dos métodos de
atribuição e estão de acordo com as sugestões de vários autores que apontam para a
necessidade de aumentar-se consideravelmente o número de marcadores e o número de
indivíduos amostrados quando se pretende discriminar num grande número de
populações, principalmente se o grau de diferenciação entre elas for pequeno
(MOAZAMI-GOUDARZI et al., 1997; BLOTT et al., 1999; CORNUET et al., 1999; MAUDET
et al., 2002a).
Na Tabela 27 pôde-se observar como variou a EA para cada raça e para cada
método, tendo sido omitidos os valores relativos às distâncias DS e Dm, por estes se
terem revelado sempre inferiores. Optou-se por apresentar apenas os resultados do
176
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
procedimento “leave one out” por considerar-se que ele reproduz melhor a realidade
prática dos métodos de atribuição, já que a origem do animal a atribuir é desconhecida.
Constatou-se também uma elevada variabilidade de valores entre raças e entre métodos
numa mesma raça, tendo a CA apresentado, de forma mais consistente, os valores de EA
maiores para todos os métodos. Os registos históricos indicam que esta raça foi,
provavelmente, importada de Espanha no final do século XIX, o que pode justificar uma
maior diferenciação, fruto de um maior isolamento. Para as restantes raças, a posição
relativa mostrou-se variável com o método utilizado. Por exemplo, a CB foi a raça com
o segundo valor mais elevado de EA, considerando o método DAS, mas ocupou o
terceiro lugar com base na metodologia Bayesiana. Pôde-se registar um comportamento
semelhante quando se comparou entre as metodologias de atribuição. Com efeito, o
método Bayesiano foi o que apresentou a EA média maior, mas foi o método DAS que
revelou o valor absoluto maior (100%) para a CA, embora tenha sido também o método
que expressou o valor mínimo (8,9%) para a CTQ.
Tabela 27. Eficácia de Atribuição (EA) para cada raça, obtida com os vários métodos estudados
segundo o procedimento "leave one out".
Raça
BEDM
CA
CB
CC
CGB
CGM
CM
CMP
CTQ
MB
MBB
MP
SE
SL
B
57,8
98,1
70,0
48,4
64,0
52,9
68,8
56,6
37,5
74,6
43,6
46,8
66,7
76,0
F
48,9
98,1
86,0
61,3
58,0
43,1
66,7
54,7
35,7
74,6
41,0
48,9
66,7
74,0
Métodos
DA
51,1
100,0
96,0
51,6
34,0
39,2
77,1
58,5
23,2
72,9
43,6
46,8
70,6
74,0
Dc
37,8
98,1
96,0
41,9
34,0
39,2
77,1
64,2
19,6
74,6
43,6
40,4
66,7
64,0
DAS
17,8
100,0
98,0
32,3
22,0
19,6
64,6
52,8
8,9
72,9
38,5
19,1
62,7
64,0
Média
42,7
98,9
89,2
47,1
42,4
38,8
70,8
57,4
25,0
73,9
42,1
40,4
66,7
70,4
F*
89,3
99,1
95,4
95,6
87,3
84,0
92,2
89,1
75,6
93,2
87,4
85,8
89,2
95,0
B - Bayesiano, F - Frequentista, DAS - Shared allele distance, DC-Cord Distance, DA - distância de Nei,
respectivamente, * Frequentista utilizando o programa WHICHRUN com indivíduos simulados.
O programa WHICHRUN tem disponível um método idêntico ao frequentista, mas
no qual os indivíduos a atribuir são simulados com base nas frequências alélicas das
respectivas populações. Os valores da EA obtidos com este programa (Tabela 27) foram
177
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
muito superiores aos atingidos pelo método frequentista que utiliza indivíduos reais, o
que está de acordo com os resultados obtidos por DIEZ-TASCON et al. (2000).
Na Tabela 28 são apresentados os valores relativos ao erro tipo II para os métodos
de atribuição nas 14 raças estudadas. A análise dos mesmos sugere que a média do erro
tipo II é semelhante entre métodos, mas muito variável entre raças, registando-se o valor
mínimo de 1,3% para a raça CC e o máximo de 17,4% para a CB.
Tabela 28. Erro tipo II (percentagem média de indivíduos que são atribuídos erroneamente a cada
uma das raças) para os vários métodos de atribuição e procedimento "leave one out".
Raça
BEDM
CA
CB
CC
CGB
CGM
CM
CMP
CTQ
MB
MBB
MP
SE
SL
Média
B
2,7
0,8
2,1
1,2
3,3
2,7
3,6
2,4
6,4
2,2
3,6
4,9
3,2
1,6
2,9
F
1,7
0,8
3,2
1,8
3,5
1,3
5,4
2,5
5,7
1,9
4,3
2,8
4,7
1,4
2,9
Método
DAS
0,6
6,3
17,4
1,4
0,5
1,7
8,8
4,1
1,3
3,0
1,7
1,1
4,6
2,2
3,9
Dc
1,3
2,7
9,3
0,8
0,3
1,3
8,5
5,2
3,0
1,6
3,0
1,9
5,5
1,1
3,2
DA
1,6
2,2
6,5
1,5
0,9
1,4
8,5
3,5
3,7
1,8
3,1
2,7
3,9
1,4
3,0
Média
1,6
2,6
7,7
1,3
1,7
1,7
7,0
3,6
4,0
2,1
3,1
2,7
4,4
1,5
1,6
B - Bayesiano, F - Frequentista, DAS - Shared allele distance, DC-Cord Distance, DA - Distância de Nei
Os valores elevados de erro tipo II obtidos para as raças CB e CM resultaram,
principalmente, da atribuição errónea de indivíduos da raça CTQ (ver Tabelas 1 e 2 do
Anexo 6), o que poderá ser uma consequência, como indicam evidências, pelo facto da
última ter origem no cruzamento das duas primeiras raças (SOBRAL et al., 1987). É, no
entanto, a partir do método DAS que se obteve os valores mais elevados de erro tipo II
para as raças CB e CM, o que parece reforçar tal hipótese, pois esta distância ao
quantificar a partilha de alelos, expressará valores semelhantes quando estão presentes a
raça cruzada e as que lhe deram origem. TEIXEIRA (1991) observou maior facilidade de
agrupamento dos indivíduos da CA e da CC com base em variáveis morfométricas.
Os resultados obtidos para o método de simulação/exclusão Bayesiano, com o
procedimento “leave on out” e nível de significância (α) igual a 0,01, são apresentados
na Tabela 29 e Tabela 30. Por um lado, observou-se que, em média 88,8% dos
indivíduos provenientes de uma raça não puderam ser excluídos dessa raça, o que é
178
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
equivalente a dizer que 11,2% dos indivíduos foram erroneamente excluídos da raça de
proveniência, por outro lado, em média apenas 6,7% dos indivíduos foram excluídos de
todas elas, excepto da raça de origem respectiva, com valores a variar entre 0% para a
CB e 13,3% para a BEDM. Estes valores reduzidos sugerem assim ser inviável a
utilização desta metodologia na rastreabilidade dos produtos animais das raças ovinas
portuguesas, pois o grau de confiança normalmente exigido é superior (P≤0,001) ao que
foi aqui considerado (P=0,01). Acresce ainda o facto de que em média, 48,8% dos
indivíduos provenientes de uma dada raça, não serem excluídos de outras raças, com
valores a variarem desde 90% dos indivíduos da CB a poderem passar por CTQ, até 0 %
de indivíduos BEDM a passarem por CA. Por outro lado observou-se ainda que em
média, 1,5% dos indivíduos foram excluídos de todas as raças excepto uma, mas que
não se tratava da sua origem verdadeira.
Tabela 29. Percentagens de animais com origem em cada raça (linha) que não puderam ser
excluídos de outras raças (coluna), quando foi utilizado o método de simulação/exclusão Bayesiano,
com o procedimento "leave on out" e nível de significância α=0,01.
BEDM
BEDM
84,4
CA
58,5
CB
88,0
CC
48,4
CGB
48,0
CGM
54,9
CM
75,0
CMP
67,9
CTQ
60,7
MB
50,8
MBB
79,5
MP
61,7
SE
70,6
SL
54,0
Erro II* 62,9
CA
0,0
96,2
14,0
9,7
2,0
11,8
10,4
17,0
10,7
5,1
2,6
10,6
11,8
8,0
8,7
CB
15,6
26,4
86,0
32,3
18,0
7,8
41,7
35,8
33,9
10,2
28,2
36,2
29,4
18,0
25,7
CC
33,3
39,6
66,0
83,9
20,0
43,1
60,4
54,7
48,2
30,5
48,7
38,3
43,1
46,0
44,0
CGB
53,3
79,2
84,0
48,4
90,0
62,7
66,7
75,5
58,9
52,5
48,7
63,8
78,4
68,0
64,6
CGM
64,4
60,4
84,0
58,1
66,0
88,2
70,8
83,0
64,3
54,2
71,8
61,7
78,4
62,0
67,6
CM
17,8
22,6
60,0
32,3
52,0
29,4
87,5
43,4
53,6
20,3
46,2
40,4
35,3
32,0
37,3
CMP
28,9
60,4
66,0
41,9
32,0
43,1
56,3
90,6
57,1
37,3
61,5
44,7
68,6
64,0
50,9
CTQ
51,1
67,9
90,0
45,2
64,0
62,7
85,4
73,6
82,1
57,6
79,5
63,8
70,6
76,0
68,3
MB
33,3
35,8
54,0
41,9
26,0
39,2
43,8
60,4
48,2
94,9
56,4
63,8
45,1
36,0
44,9
MBB
35,6
52,8
52,0
45,2
34,0
37,3
64,6
71,7
64,3
54,2
84,6
46,8
60,8
66,0
52,7
MP
44,4
54,7
80,0
48,4
44,0
49,0
60,4
69,8
57,1
83,1
69,2
89,4
60,8
58,0
59,9
SE
42,2
47,2
74,0
54,8
26,0
37,3
58,3
67,9
55,4
32,2
61,5
51,1
98,0
50,0
50,6
SL
20,0
32,1
50,0
32,3
24,0
23,5
45,8
45,3
46,4
23,7
53,8
31,9
49,0
88,0
36,8
Erro I*
33,8
49,1
66,3
41,4
35,1
38,6
56,9
58,9
50,7
39,4
54,4
47,3
54,0
49,1
48,2
Erro I – percentagem média de animais que sendo da raça em linha, não puderam ser excluídos de cada raça da
coluna; Erro II - percentagem média de animais que sendo de cada uma das raças em linha, não puderam ser
excluídas da raça da coluna; * - no cálculo da média não se considera os valores da diagonal a “negrito”.
Tabela 30. Parâmetros de eficácia para o método de simulação/exclusão Bayesiano, com o
procedimento "leave on out" e nível de significância α=0,01.
Parâmetro BEDM CA CB CC CGB CGM CM CMP CTQ MB MBB MP SE SL Média
a
84,4 96,2 86,0 83,9 90,0 88,2 87,5 90,6 82,1 94,9 84,6 89,4 98,0 88,0 88,8
b
15,6
3,8 14,0 16,1 10,0 11,8 12,5 9,4 17,9 5,1 15,4 10,6 2,0 12,0 11,2
c
13,3
9,4 0,0 12,9 10,0 7,8
6,3 1,9
3,6 5,1
2,6
6,4 7,8 6,0
6,7
d
2,2
0,0 2,0 3,2 0,0
3,9
0,0 1,9
3,6 0,0
2,6
2,1 0,0 0,0
1,5
e
8,9
1,9 4,0 12,9 4,0
5,9
6,3 3,8
8,9 0,0
7,7
4,3 2,0 6,0
5,5
a – % de animais cuja a raça de origem não foi excluída; b – % de animais que foram excluídos da sua raça de origem
(100-a); c – % de animais que somente não foram excluídos da sua raça de origem; d – % de animais que não foram
excluídos somente de uma raça mas que não era a da sua origem; e – % de animais que foram excluídos de todas as
raças
179
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
Também em média 5,5% dos animais foram excluídos de todas as raças o que,
em termos teóricos, poderia ser interpretado como provenientes das populações não
amostradas, mas que, no caso concreto, eventualmente ser justificado pela presença de
alelos raros nestes animais e com reduzida probabilidade de aparecerem em todas as
populações (MAUDET et al., 2002a). De facto, a raça CC, foi simultaneamente a que
apresentou a maior percentagem de animais excluídos de todas as raças (12,9%) e o
maior número de alelos únicos (4) com reduzida frequência.
Os indivíduos CB foram os que revelaram a tendência maior (66,3%) para
passarem por outras raças, sendo a CTQ a raça pela qual foi mais provável (68,3%) que
animais com outra origem lhe fossem atribuidos. Pelo contrário, os indivíduos BEDM
foram os que evidenciaram a tendência menor (33,8%) para passarem por outras raças e
a CA a raça pela qual foi menos provável (8,7%) que animais originários de outras raças
passassem por ela.
Os resultados relativos ao score de cada microssatélite em cada raça, isoladamente
e para o seu conjunto, determinados com recurso ao programa WHICHLOCI, são
apresentados na Tabela 3 do Anexo 6. Da sua análise foi possível constatar que o poder
de cada microssatélite, avaliado pelo valor do score, mostrou-se muito variável com a
raça. Tomando como exemplo o microssatélite OarFCB304, este apresentou um valor
máximo de 0,83 para a CGM e um valor mínimo de 0,00 para o MP e a SE. Isto
significa que aquele microssatélite foi capaz de atribuir correctamente 83% dos
indivíduos no caso da CGM, enquanto que, para o MP e a SE esse poder foi nulo. Para
se definir melhor esta variabilidade, construiu-se a Tabela 31 onde consta o número de
vezes (igual ao número de raças) para a posição relativa que cada microssatélite ocupou
quando estes foram ordenados de acordo com o score de atribuição em cada uma das 14
raças de ovinos estudadas.
Quanto às características dos microssatélites que afectam o seu poder de
atribuição nas populações ovinas portuguesas, foram estudados o efeito da
heterozigotia, da riqueza alélica e da diferenciação genética (FST).
A relação entre a HNB e o poder de atribuição dos microssatélites (score) foi
analisada a dois níveis. Por um lado, a relação entre a HNB média de cada
microssatélite nas 14 raças analisadas e o score respectivo, obtido pelo método da
máxima verosimilhança do programa WHICHLOCI (Figura 29), por outro, a relação
180
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
entre a HNB de cada microssatélite em cada população e o score respectivo, obtido pelo
“método da população crítica” no mesmo programa, conforme descrito na metodologia
(Figura 30).
Tabela 31. Número de vezes (igual ao número de raças) para a posição relativa que cada
microssatélite obteve quando estes foram ordenados de acordo com o poder de atribuição em cada
uma das 14 raças de ovinos estudadas, utilizando o programa WICHLOCI.
BM1824
BM4621
BM6444
BM6506
BM757
ETH225
MAF209
MAF23
McM214
McM218
OarCP20
OarCP34
OarCP49
OarFCB11
OarFCB128
OarFCB20
OarFCB304
OarFCB48
OarHH64
1ª
1
1
2
1
1
2
1
1
2
1
1
2ª
2
1
1
1
1
2
2
1
1
2
-
3ª
1
1
1
2
2
1
1
1
1
2
1
4ª
1
1
1
2
1
1
1
1
4
1
-
5ª
1
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
6ª
1
3
2
1
1
1
1
1
1
1
1
7ª
1
2
1
2
2
2
1
2
1
Posição Relativa
8ª 9ª 10ª 11ª
3 - 1
2 1 3
1 - 1
- 1
- 1 1
- 1 1
2 1 1 1 1 1
- 4 1
- 2 1
- - 1 2 1 1 2
- 1 1
- 2 1 2
- 2
2 - 1 1
1 - 1
- 2 -
12ª 13ª 14ª 15ª 16ª 17ª 18ª 19ª
1
1
5
1
1
1
1
1
1
1
2
4
1
2
2
2
1
2
1
1
2
3
1
1
2
1
2
1
2
3
1
1
1
3
1
1
2
1
1
1
1
1
3
1
2
2
1
1
1
2
1
1
2
3
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
3
1
2
3
1
1
0,30
0,25
Score
0,20
0,15
0,10
y = 0,3137x - 0,0448
R2 = 0,4782
0,05
0,00
0,5
0,55
0,6
0,65
0,7
0,75
0,8
0,85
0,9
H nb média
Figura 29. Relação entre a média da heterozigotia esperada não enviesada das 14 raças, para cada
microssatélite e o respectivo score de atribuição.
181
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
0,90
0,80
0,70
Score
0,60
0,50
y = -0,0846x + 0,2622
R2 = 0,0021
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
H nb
Figura 30. Relação entre a heterozigotia esperada não enviesada (HNB) das 14 raças, para cada
microssatélite e o respectivo score de atribuição.
No primeiro caso, foi registada uma correlação positiva e significativa (r=0,691;
P<0,01), enquanto que no segundo, a correlação revelou-se negativa mas não
significativa (r=-0,046; P>0,05). Esta contradição pode ser justificada pelo facto de o
mesmo valor médio de HNB poder ser obtido pela combinação de vários valores de HNB
individuais e, portanto, com valores de desvio padrão diferentes. Pela análise da Figura
31 pode-se notar uma tendência no sentido de quanto maior for o desvio padrão da HNB,
menor é o score, embora esta relação não tenha sido estatisticamente significativa.
Assim, o efeito da HNB no poder de atribuição dos microssatélites parece estar
condicionado pela variância deste parâmetro nas populações a estudar. Isto sugere que
os microssatélites não devem ser seleccionados apenas pelo valor da HNB numa dada
população individualmente, mas sim com base na média e na variância da HNB para o
conjunto de populações que se pretenda estudar, devendo ser seleccionados os que
apresentem os maiores valores médios de HNB, mas com a menor variância possível.
Uma relação positiva entre a HNB média e o poder de atribuição tem sido referida por
alguns autores (BLOTT et al., 1999; ROSENBERG et al., 2001), enquanto outros não
encontraram diferença de eficácia entre loci de heterozigotias elevadas ou baixas
quando estudaram populações com valores baixos de FST (<0,1) (MANEL et al., 2002).
182
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
0,30
0,25
Score
0,20
0,15
y = -0,5401x + 0,2195
R2 = 0,0739
0,10
0,05
0,00
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
DP
Figura 31. Relação entre o Desvio Padrão (DP) da HNB para cada microssatélite nas 14 raças e o
respectivo score de atribuição.
Como pode ser observado na Figura 32, foi com a riqueza alélica média nas
populações analisadas para cada microssatélite que o poder de atribuição apresentou a
correlação mais elevada (r=0,898; P<0,01). A análise deste gráfico parece contradizer
os resultados obtidos por BERNATCHEZ e DUCHESNE (2000), que sugeriram não haver
ganho significativo no incremento da diversidade alélica para além dos 6 a 10 alelos por
locus; enquanto que, no nosso estudo, é mantida a linearidade muito para além destes
valores. Em contrapartida, deve-se ter em conta que os loci com maior número de alelos
apresentam dificuldades técnicas acrescidas, nomeadamente na leitura dos géis,
sobretudo se esta for efectuada “a olho nú”. Ao contrário do que foi referido
anteriormente para a HNB, verificou-se ser positiva e significativa a correlação entre o
DP e o score de atribuição. Assim, parece evidente que se deva seleccionar os loci com
o maior valor da média e da variância da riqueza alélica para o conjunto de populações
que se pretenda estudar.
Do ponto de vista teórico, o marcador com maior poder de atribuição será o que
apresentar maior variabilidade entre populações e menor dentro de cada população. O
FST é um índice que quantifica a componente de variação dos loci entre populações. No
183
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
entanto, como pode ser observado na Figura 33, a correlação entre o θWC (estimador de
FST) das 14 populações para cada microssatélite e o respectivo score de atribuição, não
0,30
0,25
Score
0,20
0,15
y = 0,0094x + 0,1073
2
R = 0,8065
0,10
0,05
0,00
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
16,0
RA O média
Figura 32. Relação entre a Riqueza Alélica (RAO) média nas 14 raças para cada microssatélite e o
respectivo score.
Figura 33. Relação entre o θWC nas 14 raças para cada microssatélite e o respectivo score de
atribuição.
184
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
foi significativa (r=0,079; P>0,05). Conclusão idêntica foi apontada por BLOTT et al.
(1999) e ROSENBERG et al. (2001). Este efeito parece ser mais evidente à medida que o
nível de exigência (stringency) nos métodos de atribuição aumenta (BJØRNSTAD e
RØED, 2002). BJØRNSTAD e RØED (2002) e MAUDET et al. (2002a) obtiveram melhores
valores de EA quando compararam pares de populações com valores superiores de FST.
Por último, concluiu-se que os 19 microssatélites revelaram-se insuficientes para
alcançar-se um sucesso de 100% de atribuição para as raças ovinas portuguesas,
apresentando em média o potencial de atingir apenas 90%. Os microssatélites ordenados
de acordo com o score respectivo na atribuição para o conjunto das 14 raças encontra-se
na Tabela 1 do Anexo 6, podendo constatar-se que os microssatélites BM6444,
OarCP49 e BM4621 ocuparam as primeiras três posições, enquanto os BM1824 e
BM6056 ocuparam as últimas. É interessante notar que os microssatélites isolados em
bovinos atingiram, simultaneamente, os primeiros e os últimos lugares no ordenamento,
segundo o poder de atribuição, sugerindo que nem sempre os microssatélites que foram
isolados numa determinada espécie são os mais informativos nessa espécie.
Comparativamente ao ordenamento obtido por ARRANZ et al. (2001b) em 5 raças
espanholas de ovinos, verificou-se que os quatro microssatélites utilizados em comum
(BM6444, OarFCB11, BM4621, OarCP34) ocuparam uma posição relativa idêntica,
tendo também o BM6444 alcançado a primeira posição. No entanto, mais uma vez, a
ordem de grandeza foi muito superior.
5.5. CONCLUSÕES
Da análise dos resultados deste capítulo pôde-se concluir que a eficácia de
atribuição foi muito variável com os métodos e procedimentos (“as is” ou “leave one”)
utilizados e com a raça, tendo o número de raças em análise sido outro aspecto que
ditou muito o sucesso ou insucesso desses métodos. O método Bayesiano foi aquele
que, em média, produziu melhores resultados enqunto a CA e CTQ foram as raças que
apresentaram o maior e o menor valor de eficácia, respectivamente.
No teste de simulação/exclusão, a raça CB foi a que revelou a tendência maior
para se confundir com por outras raças, enquanto a CTQ foi a que com maior
probabilidade se verificou que animais com outra origem passavam por lhe pertencer.
185
Capítulo 5 – Discriminação racial dos ovinos Portugueses com base em informação molecular
Pelo contrário, a raça BEDM foi a que evidenciou a tendência menor para se confundir
com outras raças e a CA aquela pela qual foi menos provável que animais originários de
outras raças lhe fossem atribuidos. Apesar de se ter observado que um elevado número
(88,8%) dos indivíduos provenientes de uma raça não puderam ser excluídos dessa raça,
o valor baixo (6,7%) dos indivíduos excluídos de todas com excepção da raça de origem
respectiva, sugere ser inviável, também, a utilização desta perspectiva (exclusão) na
rastreabilidade dos produtos animais das raças ovinas portuguesas.
Assim, com a excepção da raça CA, os 19 microssatélites foram insuficientes
para discriminar com segurança entre as 14 raças ovinas portuguesas. As expectativas
que têm vindo a ser apontadas às metodologias descritas, não se traduziram num êxito
cabal quando aplicadas às raças portuguesas de ovinos, provavelmente devido à baixa
diferenciação, a avaliar pelos valores de FST observados, em resultado de uma eventual
separação evolutiva relativamente recente e/ou de um fluxo génico entre populações
relevante. Com efeito, MAUDET et al. (2002a) constactarm que só quando os valores de
FST são superiores a 0,1, é que os testes de atribuição se tornam promissores. Contudo,
assim que o desenvolvimento tecnológico permita um custo aceitável, a utilização de
um elevado número de microssatélites (ou SNPs) permitirá colmatar as limitações
apresentadas.
No que diz respeito aos microssatélites, a escolha deve, entre outros aspectos,
incidir nos que apresentarem o maior valor médio de riqueza alélica e de heterozigotia
esperada, relativamente ao conjunto de populações em análise. Neste estudo os
microssatélites BM6444 e OarCP49 foram os que apresentaram os melhores resultados
e por isso, os mais adequados para discrimação racial dos ovios portugueses, enquanto
que os microssatélites BM1824 e BM6506 foram os que se classificaram em última
posição.
186
Capítulo 6 – Considerações finais e perspectivas futuras
CAPÍTULO 6 - CONSIDERAÇÕES FINAIS E
PERSPECTIVAS FUTURAS
É reconhecido que a análise dos padrões de variação genética molecular constitui
hoje em dia uma faceta decisiva na reconstrução da história evolutiva, na estimativa da
diversidade genética e na estruturação das populações de animais, o que naturalmente
abrange as espécies domésticas. A utilidade de tais procedimentos tem sido igualmente
comprovada na gestão destes recursos genéticos, uma vez que permite uma melhor
definição das unidades taxómicas quando se trata de tomar decisões sobre quais as
populações a conservar e auxilia na escolha dos progenitores em esquemas de
reprodução com vista a minimizar a perda de variabilidade genética.
Com o estudo que agora se apresenta pretendemos aplicar aquelas metodologias
aos ovinos portugueses e extrair delas informação que fosse útil para a caracterização da
diversidade genética e diferenciação das raças ovinas portuguesas numa perspectiva de
conservação. Com esse propósito determinou-se a variabilidade de 20 microssatélites
em 14 raças portuguesas de ovinos, num total de 717 animais. A análise desses
resultados permitiu avaliar o grau de estruturação da população portuguesa de ovinos e
estimar parâmetros de diversidade genética em cada uma das raças. Os valores então
obtidos indicaram a presença de uma diferenciação estatisticamente significativa
(P<0,01), embora comparando com registados em estudos semelhantes noutras raças
europeias, o valor médio atingido tenha sido inferior (FST=0,026). O mesmo significa
que da diversidade global observada, apenas 2,6% se deve a diferenças entre raças,
cabendo os 97,4% restantes às diferenças existentes entre indivíduos no seio de cada
raça. Por outro lado, os valores de diversidade genética intra-racial situaram-se
ligeiramente acima dos observados também noutras raças europeias da mesma espécie,
apenas superados pelas espanholas. Os resultados do nosso estudo parecem, assim,
consonantes com os registos históricos sobre o passado recente das raças ovinas
portuguesas. Com efeito, os investigadores da altura descreveram uma população ovina
composta por animais de três tipos conforme o velo, não sendo raro, contudo, observálos a todos num mesmo rebanho, factor revelador não só da pouca importância que o
conceito de raça representava na altura para os criadores, como das circunstâncias que
propiciavam os cruzamentos, ao que não será alheio o valor baixo da diferenciação que
registámos. Só a partir do início do século XX este panorama foi alterado com a
implementação dos programas levados a cabo pelos Serviços Oficiais da Agricultura
187
Capítulo 6 – Considerações finais e perspectivas futuras
tendo como finalidade caracterizar e melhorar os ovinos, acções que viriam mais tarde a
servir de base à criação oficial das raças da actualidade. Também as associações de
criadores e os registos zootécnicos só viriam a ter lugar muito recentemente, a partir dos
anos oitenta, aspectos que foram determinantes para a redução do fluxo génico entre
raças e para a implantação de uma identidade racial, embora não tenham travado a
redução drástica do efectivo ovino, que se tem vindo a observar. Os resultados obtidos
neste estudo demonstraram contudo que foi mantido um grau elevado de diversidade,
certamente em resultado de uma diversidade inicial muito grande por um lado, e da
pouco expressiva pressão selectiva dos programas de melhoramento.
A diferenciação baixa registada entre as raças ovinas pode justificar o facto dos
19 microssatélites se terem revelado insuficientes para, com a excepção da raça CA,
discriminar com segurança entre as 14 raças portuguesas de ovinos quando se utilizou
os testes de atribuição e simulação/exclusão. No futuro, poderíamos ultrapassar
facilmente este insucesso através do aumento do número de microssatélites a analisar,
mas as abordagens mais recentes têm procurado fazer uso de polimorfismo de genes que
afectam características morfológicas definidoras das raças, como é o caso do gene
MCR1 envolvido na cor da pelagem, perspectiva que nos tem interessado em particular.
Não obstante, a informação molecular revelou-se adequada a estabelecer a relação
de similaridade entre as raças, com recurso ao cálculo de distâncias genéticas e
construção de fenogramas. Os dados assim tratados expressaram um agrupamento das
raças conforme o tipo de lã e a distribuição geográfica, o que denota a influência das
forças evolutivas subjacentes à divergência entre raças, concretamente a selecção para o
tipo de velo e a deriva genética associada ao isolamento geográfico. Para aferir com
precisão o seu efeito, este último factor será objecto de uma análise estatística posterior,
envolvendo a correlação entre distâncias genéticas e distâncias geográficas. As raças
CA, MB e CB foram as que mais distaram entre si, enquanto que a CM e a CTQ as que
mais
se
aproximaram,
resultados
corroborados
pela
Análise
Factorial
de
Correspondência realizada. Ainda neste âmbito, devemos realçar dois aspectos
reveladores da fiabilidade do uso de microssatélites neste tipo de estudo, apesar das
limitações conhecidas. Por um lado, o caso da CA, uma vez que os resultados obtidos
foram de encontro à hipótese, anteriormente avançada por alguns autores, segundo a
qual, esta terá sido introduzida em Portugal nos finais do século XIX; por outro, o
registo da proximidade já conhecida, entre a CM e CTQ.
188
Capítulo 6 – Considerações finais e perspectivas futuras
Um outro objectivo centrou-se na definição de uma hierarquia entre as raças
quanto à prioridade de conservação, perante um cenário de recursos escassos e
necessidade de escolher. A partir da aplicação de duas abordagens propostas na
bibliografia, a de WEITZMAN e a do core set, obtiveram-se resultados contraditórios,
uma vez que a ordem de prioridade de conservação estabelecida se revelou invertida
entre si. Este resultado refletiu a ponderação diferente implícita nos métodos, um que
optou
por
dar
prioridade
a
raças
consideradas
geneticamente
afastadas
independentemente da diversidade intra-racial que contenham e o outro pelo contrário,
que elegeu como prioritárias as raças cuja diversidade intra-racial se mostrou superior,
independentemente da distância genética entre elas. Estes resultados põem em evidência
o dilema inerente ao arbítrio da escolha de raças para fins de conservação de diversidade
genética. Pese embora a complexidade que esta temática envolve, parece-nos que
qualquer que seja a estratégia tida como a mais adequada, deva promover a
remuneração justa dos criadores que optem por raças autóctones, assente no princípio de
que as raças se devem conservar a si mesmas pelo rendimento que gerarem e não
através de subsídios de eficácia eventualmente duvidosa a longo prazo. O caso da raça
Merina Branca constitui um bom exemplo, já que sendo uma das raças ovinas
portuguesas alvo de maior incidência de acções de melhoramento genético conserva
uma diversidade elevada, em resultado naturalmente da dimensão considerável do
efectivo, aspecto que por seu turno minimiza a perda de variabilidade por deriva
genética. Por se ter revelado uma das raças em estudo mais dissemelhantes, foi também
a que registou maior prioridade de conservação, nos dois métodos aplicados. Todavia, e
no que se refere às raças com efectivo reduzido urge, no curto prazo, evitar a perda
irreparável desse património genético ainda que para tal possam ser necessárias
compensações de natureza monetária ou outra.
A utilização de loci ditos neutros, como é o caso dos microssatélites, apresenta
algumas vantagens para os fins a que nos propusemos neste estudo, no entanto, estamos
cientes de que, a curto prazo, e em resultado dos avanços nas áreas da biologia
molecular e das tecnologias de genotipagem em massa, estes tenderão a ser substituídos
por polimorfismos de nucleótido único (SNPs). A concretização dos projectos de
sequenciação do genoma dos animais domésticos constituirá um grande impulso nesse
sentido. Todos esses progressos permitirão avaliar de forma mais objectiva os recursos
genéticos dos animais domésticos. A variabilidade de genes responsáveis por
189
Capítulo 6 – Considerações finais e perspectivas futuras
características produtivas e de resistências a doenças será, obviamente, o alvo preferido
como forma de valorizar raças portadoras de variantes com interesse económico ou
científico e assim de justificar a manutenção de raças autóctones. Nesse sentido, a
equipa na qual nos inserimos tem vindo a realizar alguns estudos que visam avaliar a
variabilidade de loci candidatos relacionados com a qualidade do leite e da carne.
Contudo, para que os resultados alcançados nestes e em futuros estudos seja
consequente, torna-se necessária a aquisição de equipamento laboratorial com maior
capacidade de resposta e a concertação com as associações de criadores que procedem à
recolha e organização dos dados produtivos.
Um outro aspecto, não menos interessante de salientar é a importância que os
recursos genéticos dos animais domésticos, constitui como modelo para a investigação
científica de mecanismos funcionais básicos. Um exemplo que ilustra bem esse
potencial é o caso do fenótipo callipyge identificado em ovinos da raça Dorset. O seu
estudo permitiu descobrir um tipo de herança não mendeliana até então desconhecida, a
sobredominância polar (COCKETT et al., 1996), o qual poderá ocorrer também na
herança de outros fenótipos, incluindo eventuais doenças hereditárias complexas da
espécie humana. A base genética subjacente ao referido fenótipo foi identificada como
uma transição de A para G, designada de SNPCLPG, e localizada no que se parece ser um
elemento regulador que controla a expressão génica na região próxima dos genes
PEG11 e MEG8 (CHARLIER et al., 2001). As principais características que tornam os
animais domésticos um modelo excelente, são a diversidade genética elevada que
apresentam e a possibilidade de se obter famílias extensas por cruzamento orientado,
vantagens que no âmbito da biologia molecular, se revelam mais importantes à medida
que passamos da genómica para a transcriptómica, protéomica, metabolómica e
interactómica.
A história e a localização geográfica fizeram de Portugal um ponto de confluência
de variadíssimos povos e comerciantes, por consequência, um reduto de elevada
diversidade genética de raças de animais domésticos em geral, e de ovinas em
particular, conforme revelou este estudo. Assim, e por todas as razões já apontadas
justifica-se a tomada de medidas urgentes que visem impedir a perda de tão valioso
património. Porque cremos que só se valoriza o que se conhece julgamos que o estudo
das raças portuguesas de animais domésticos constitui um meio privilegiado de
190
Capítulo 6 – Considerações finais e perspectivas futuras
promover a sua conservação, aspecto para o qual pretendemos continuar a dar o nosso
contributo.
191
Referências Bibliográficas
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234
ANEXOS
ANEXO 1
Descrição dos protocolos utilizados no capítulo 2
ANEXO 1 - Descrição dos protocolos utilizados no capítulo 2
1- MATERIAL UTILIZADO
1.1. Equipamento
Na execução do trabalho experimental foi utilizado o material e o equipamento
que a seguir se apresenta:
-
Agulhas estéreis 0,80 mm, Vacuette®greiner
-
Aplicadores, Vacutainer para tubos de vácuo de 9 ml
-
Arca frigorífica a -70 ºC, Forma Scientific
-
Arca térmica, Camping gaz com acumuladores
-
Autoclave JSM modelo NR 384
-
Balança TM 560 Gibertini
-
Balança Sartorius, máximo 162 g
-
Balões volumétricos 25 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml, 2000 ml, Duran
-
Banho-maria, Julabo SW-20C
-
Caixas de cartão para guardar os microtubos eppendorf com DNA (10x10), Sarstedt
# 95.64.997
-
Câmara de fluxo laminar, Nuaire Classe II Type A/B3
-
Centrifuga : Sigma 2k15, B. Braun Biotech International
-
Centrífuga Bifuge 1.0, Heraeus Sepatech
-
Cuvettes de quartzo, Hellma 6040-UV de 10 mm
-
Doseador 100 ml, Geprüfte Sicherheit
-
Doseador 25 ml, Geprüfte Sicherheit
-
Doseador de 10 ml, Geprüfte Sicherheit
-
Detector de radiactividade, Series 900 (0,5-2K counts/seg)
-
Espectrofotómetro, Hitachi U-2000
-
Espaçadores para o gel de poliacrilamida de 0,4 mm
-
Etiquetas auto-adesivas permanentes, Tesa®
-
Filme radiografia – Kodak XK –1 – (34 cm X 45 cm) Cat. 1653872
-
Fita-cola 3M com 1,5 cm de largura
-
Fonte de alimentação, EC 105, E-C Apparatus Corporation
-
Fonte de alimentação, Pharmacia LKB- MultiDrive XL
-
Fonte de alimentação, LKB Broma 2197
-
Frascos Duran 25 ml, 100 ml, 1000 ml e 2000 ml
239
ANEXO 1 - Descrição dos protocolos utilizados no capítulo 2
-
Frigoríficos, Iberna (4 estrelas) e Fagor (4 estrelas)
-
Goblés 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml, Simax
-
Luvas látex
-
Potenciómetro, pH Meter 3320 Jenway
-
Microcentrífuga, Sigma 113 da B. Braun Biotech International,
-
Microondas, Ufesa Precise 190
-
Micropipetas 0.1-2.5 μl, 2-20 μl, 20-200 μl, 100-1000 μl, Eppendorf
-
Micropipetas P1000, P200, P100, P20, P10, P2, Gilson
-
Microplacas de 96 poços para PCR, Costar® #6511
-
Microtubos com tampa de 0.5 ml, Sarstedt # 72.735.002
-
Microtubos com tampa de 1.5 ml, Sarstedt # 72.692.005
-
Microtubos estéreis com rosca de 2ml, Sarstedt # 72.693.005
-
Multipipeta de 5 a 100 μl e 50 a 1000 μl, Eppendorf
-
Parafilme, 4IN.x125 FT Roll Laboratory Film
-
Parafina líquida, Merck # 1.07162.100
-
Pentes para o gel de agarose
-
Pentes para o gel de poliacrilamida
-
Pipeta Distriman até 12,5 ml, Gilson
-
Pipeta multicanal de 12, Transferpette®- 20-200 μl e 2,5-20 μl-- Brand
-
Pipetas Pasteur
-
Vidros com dimensões adequadas para a preparação dos géis de poliacrilamida
-
Pontas de micropipeta de 0.1-10 μl, 20-200 μl e 100-1000 μl, Sarstedt #701130,
#70760002 #70762 (brancas)
-
Pontas para pipeta “Distritip” de 12,5 ml, Gilson
-
Pontas para pipeta “Distritip” de 125 μl, Gilson
-
Protectores faciais UVC-803 da UVP
-
Provetas de vidro 25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml, Normax
-
Secador de géis, Model SE 1169, Hoeffer Scientific Instruments
-
Sistema de análise de géis, BioCapture da Viver Lourmat
-
Suportes, Scotlab Eppendorf cat. Nº SL. 4112 e SL. 4111
-
Tabuleiros para revelação dos géis corados com nitrato de prata
-
Termociclador PTC-100TM
240
ANEXO 1 - Descrição dos protocolos utilizados no capítulo 2
-
Tinas de electroforese horizontais Corporation; Minicell 370 e Midicell 350, ECApparatus
-
Tina de electroforese vertical TM SQ3 Sequencer, Hoefer
-
Transiluminador de luz ultra-violeta, LKB Bromma modelo 2011
-
Tubos de centrífuga de 50 ml de polipropileno com rosca, NalgeneTM # 3119
-
Tubos com rosca de 50 ml graduados, Sarstedt # 62.559001
-
Tubos de vácuo de 9 ml com heparina de sódio, Vacuette®greiner
-
Vortex Genie – 2, VWR Scientific (máx. 8000 rpm)
Todo o material descartável (pontas de pipeta, microtubos tipo eppendorf) usado
foi esterilizado por autoclavagem a 121 ºC e à pressão de 1 atmosfera durante 20
minutos.
1.2. Reagentes
-
Acetato de Sódio anidro (C2 H3 O2 Na) – Sigma #S-2889 (NaAc)
-
Acetona
-
Ácido acético glacial 100% - Merck # 100063.2511
-
Ácido etilenodiamino-tetracético (EDTA) – Sigma #ED4SS
-
Acrilamida – BDH Laboratories supplies # 44300 4X
-
Ready Sol DNA /PAGE, 40%- Pharmacia Biotech # 17-1308-01
-
Agarose - GibcoBRL® (Life Technologies) # 15510-027
-
Albumina Sérica Bovina (BSA) – Boheringer
-
Amberlite 1R120 – Rohn and HAAS Co # 63318
-
Amberlite IRN-150L - Pharmacia Biotech #17-1326-01
-
Azul de Bromofenol - Sigma # B-8026
-
ATP [gama – 33P] – Cat #5840401
-
Bicarbonato de potássio (KHCO3) - Sigma #P-9144
-
Bis-Acrilamida – BDH Laboratories supplies # 44349 5X
-
Bind silane- Amersham Pharmacia Biotech # 17-1330-01
-
Beta-mercaptoetanol – Merck #15433
-
Brometo de Etídio (EtBr) – Sigma #E-1510
-
Cloreto de amónia (NH4Cl) – Sigma #A-4514
-
Cloreto de cálcio - Sigma #C-3309
241
ANEXO 1 - Descrição dos protocolos utilizados no capítulo 2
-
Cloreto de Magnésio (MgCl2) – Sigma #M-8266
-
Cloreto de Potássio (KCl) – Merck #4936.0500
-
Cloreto de Sódio (NaCl) – Merck #1.06404
-
dNTPS (dATP, dCTP, dGTP, dTTP – 100mM) Amersham Pharmacia Biotech #
27-2035-02
-
Espermidina – Sigma #S2501
-
Etanol absoluto – Merck #1.00983.2511
-
Fenol Red – Merck # 7241
-
Ficoll (type 400) - Sigma F # 4375
-
Formamida – Sigma #F-7508
-
Gel Repel – CBS Scientific, Del Mar, USA
-
Hidróxido de Sódio (NaOH) – Sigma # S-0899
-
Kit Silver SequenceTM DNA Sequencing System, Promega # Q4132 inclui:
#Q440 Carbonato de sódio anidro
#Q426A Nitrato de Prata
# Q421A Bind Silane
# Q427A Formaldeído, 37%
# Q428A Tiosulfato de sódio
-
Marcador de 100 pb – MBI Fermentas #SM0321
-
Marcador de 50 pb – MBI Fermentas #SM
-
N, N – Dimetilformamida – USB – US14862
-
Polimerase Red Hot – Advanced Technologies #N.AB-0406/B
-
Polimerase – Bioline
-
Parafina Líquida – Merck #1.07162.1000
-
Persulfato de amónia – Sigma # A – 3678
-
Proteinase K – Sigma #P-8044
-
Quinase polinucleotido T4 – Bio Labs, New England, com o respectivo tampão
(10X)
-
Repel Silane - Amersham Pharmacia Biotech # 17-1332-01
-
Sulfato dodecil sódio (SDS) - Amersham Pharmacia Biotech # 17-1313-04
-
TEMED - Sigma # T – 9281
-
Tris Base - Amresco # 0826
-
Trizma HCl – Sigma #T-6666
-
Ureia - – Sigma #U-6504
242
ANEXO 1 - Descrição dos protocolos utilizados no capítulo 2
-
Xileno cianol FF - Sigma X # 4126
Todos os reagentes utilizados foram de do tipo adequado à utilização em
Biologia Molecular.
2 - PROTOCOLO DE EXTRACÇÃO DE DNA
2.1 -Composição e preparação das soluções e tampões
Solução stock de EDTA 0,5 M pH 8,0
Para 200 ml de solução: Preparar 37,2 g de EDTA em 180 ml de água bidestilada e
dissolver com agitador magnético. Verificar o pH e ajustar para pH 8,0 com NaOH
(cerca de 3,0g/200ml de solução). Perfazer o volume para 200 ml e esterilizar em
autoclave. O EDTA é pouco solúvel para valores muito abaixo de pH 8,0. Armazenar à
temperatura ambiente.
Solução stock Tris 1 M pH 8,0
Para 1 litro de solução: Preparar Trizma base 121,1 g em aproximadamente 800 ml de
água bidestilada e dissolver. Ajustar o pH a 8,0 usando HCl concentrado. Perfazer a um
litro, esterilizar em autoclave e armazenar à temperatura ambiente.
Solução de lise dos glóbulos vermelhos (RCB)
Para um litro de solução: Preparar 8,02 g de cloreto de amónia (NH4Cl), 1,0 g de
bicarbonato de potássio (KHCO3), 200 μl de solução stock de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,5 M. Perfazer a 1,0 litro com água bidestilada. Esterilizar por
autoclave e arrefecer a 4 ºC antes de utilizar. Conservar a 4 ºC.
Tampão salino Tris pH 7,4
Para um litro de solução: Preparar 8 g de NaCl, 0,38 g de KCl, 3g de Trizma base e
0,015 g Fenol Red em aproximadamente 800 ml de água bidestilada. Dissolver e ajustar
o pH a 7,4 utilizando HCl concentrado. Perfazer para 1 litro com água bidestilada,
esterilizar em autoclave e arrefecer a 4 ºC antes de utilizar. Conservar a 4 ºC.
Tampão TE pH 8,0
Para um litro de solução: Preparar 10 ml de solução Tris 1 M pH 8,0, 200 μl de solução
stock de EDTA 0,5 M pH 8,0. Perfazer o volume a 1 litro com água bidestilada.
Esterilizar pelo autoclave, e armazenar à temperatura ambiente.
243
ANEXO 1 - Descrição dos protocolos utilizados no capítulo 2
Etanol 75%
Adicionar 75 ml de etanol absoluto a 25 ml de água bidestilada. Armazenar à
temperatura ambiente.
SDS 10 %
Para um litro de solução: Preparar 100g de SDS e perfazer o volume de 1 litro com água
bidestilada. Armazenar à temperatura ambiente.
Nota: Não autoclavar. Utilizar uma máscara na face para prevenir inalação do pó. Se
necessário aquecer cuidadosamente para dissolver rapidamente.
Solução saturada de NaCl (6M)
Para um litro de solução: Preparar 360 g de NaCl e perfazer um litro com água
bidestilada.
2.2 -Procedimentos
Para a extracção das amostras de DNA, seguiram-se os protocolos que se
descrevem
• Transferir cerca de 10 ml do sangue para um tubo de centrífuga de 50 ml
esterilizado e identificado. Perfazer o volume com solução de lise dos glóbulos
vermelhos (RCB) à temperatura de 4°C, tapar, misturar e colocar numa tina com gelo. A
lise dos glóbulos vermelhos é observável pelo escurecimento da solução de sangue.
• Após a lise , centrifugar durante 10 minutos a 3500 rpm, a 4°C.
• Retirar as amostras da centrífuga e colocar no gelo, decantar cuidadosamente
rejeitando o sobrenadante que contém os glóbulos vermelhos lisados. Recolher o
pequeno “pellet” de glóbulos brancos no fundo do tubo.
• Adicionar 10 ml de Tampão Tris Salino (TBS) à temperatura de 4 ºC e agitar
bem para ressuspender as células.
• Centrifugar os tubos 3000 rpm durante 5 minutos. Decantar rejeitando o
sobrenadante.
• Adicionar novamente 10 ml de TBS e agitar para ressuspender as células.
• Centrifugar os tubos 3000 rpm durante 5 minutos. Decantar deitando fora o
sobrenadante.
244
ANEXO 1 - Descrição dos protocolos utilizados no capítulo 2
• Adicionar 9 ml do tampão TE (pH 8,0) e agitar no vórtex vigorosamente para
ressuspender as células. É importante que as células fiquem submersas na solução para
que seja possível a ocorrência de uma boa digestão de DNA.
• Adicionar 500 µl de EDTA 0,5 mM e 50 µl da solução de protease K a todos
os tubos. Adicionar lentamente 500 µl de SDS (10%) a cada tubo, agitando enquanto se
adiciona. Tapar os tubos e agitar vigorosamente.
• Incubar todos os tubos a 50°C em banho-maria, de preferência com agitação
suave durante pelo menos 3 horas.
• Remover os tubos do banho-maria, deixar arrefecer e adicionar 4,3 ml de
solução saturada de cloreto de sódio. Agitar vigorosamente durante 30 segundos e
depois a 4000 rpm, durante 15 minutos.
• Retirar cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta Pasteur para um tubo
Falcon 50 ml com rosca, tendo o cuidado para não arrastar o "pellet" de sal e proteína.
• Adicionar cerca de 30 ml de etanol absoluto a 4 ºC, fechar o tubo, inverter
suavemente várias vezes até precipitar todo o DNA na
forma de um novelo de
filamentos brancos.
• Retirar o DNA enrolado da solução utilizando uma ansa plástica. Lavar num
pequeno volume de etanol (75%) (um pouco para cada amostra) e secar com papel de
filtro. Transferir para um microtubo de tampa roscada devidamente identificado.
• Adicionar uma quantidade apropriada (normalmente cerca de 500 µl) de
tampão TE (pH 8), deixar a dissolver durante a noite a 4°C.
• A concentração e a qualidade do DNA foram determinadas pela metodologia
clássica de espectrofotometria, com base na leitura da absorvência a 260 nm (A260) e
280 nm (A280) de uma solução constituída por 5 μl da solução base de DNA a medir e
995 μl de tampão TE, utilizando como “branco” 1 ml de tampão TE. O valor de A260 foi
multiplicado por 50 para se obter a concentração de DNA em μg/ml e o valor do rácio
A260/A280 usado como indicativo da qualidade
• Preparar soluções de trabalho prontas a utilizar, normalmente à concentração
de 50 ng/µl. As soluções destinadas a uso corrente devem ser guardadas no frigorífico.
As soluções não diluídas para guardar a longo prazo devem ser congeladas a 20°C.
245
ANEXO 1 - Descrição dos protocolos utilizados no capítulo 2
3 - Protocolo da PCR
3.1 – Procedimento seguido na Unidade de Biologia Molecular do Laboratório de
Bioquímica da Universidade de Otago - Nova Zelândia, incluiu:
a) Marcação de um dos primers (no caso concreto o primer reverso)
-
Primer dissolvidos em tampão TE de acordo com as indicações do fabricante e a
solução de trabalho à concentração de 20 pmol/μl.
-
T4 Quinase (10 000 U/µl)
-
Tampão da T4 Quinase (10X)
-
[℘ -33P]ATP (3000 ci/mmole)
-
Água MilliQ autoclavada
Para 100 amostras, misturar todos os reagentes na proporção que se segue, adicionando
em último a quinase e o P33. Incubar a mistura a 37 ºC cerca de 30 a 40 minutos.
Primers
2 µl
Tampão da Quinase
5 µl
[℘ -33P] ATP
2,5 µl
T4 Quinase
2,5 µl
Água MilliQ autoclavada
38 µl
b) Preparação de 1000 µl de solução para PCR (mesmo que 100 amostras)
-
Amostras de DNA (50ng/µl)
-
Tampão J (10X) - Para uma solução de 100 ml: 5,69 g de Trizma base, 1,45 g
(NH4)2SO4, 0.914 g MgCl2, 468 μl de Beta-mercaptoetanol, 9 μl de EDTA
(0,5M), 0,063 Espermidina. Dissolver com 80 ml de água bidestilada, ajustar a
pH 8,8 com HCl, perfazer a 100 ml.
-
BSA (20mg/ml)
-
dNTPs 200 μM
-
Água MilliQ autoclavada
Num microtubo de tampa (1,5 ml), misturar todos os reagentes na proporção que se
segue
246
ANEXO 1 - Descrição dos protocolos utilizados no capítulo 2
Primer não marcado
50 µl
Tampão J
100 µl
dNTPs
100 µl
BSA
10 µl
Red Hot Polimerase
5 µl
Primer marcado
50 µl
Água MilliQ autoclavada
685 µl
Pipetar 10 µl desta mistura para cada um dos 96 poços de uma microplaca para PCR
contendo cada um deles 2 µl de solução de DNA da respectiva amostra e adicionar uma
gota de parafina para prevenir a evaporação.
c) Colocar a microplaca no termociclador utilizando o seguinte programa térmico de
amplificação:
3 ciclos
95 C
45 s
60 ºC 1min
3 ciclos
95 ºC
45 s
57 ºC 1min
3 ciclos
95 ºC
45 s
54 ºC 1min
3 ciclos
95 ºC
45 s
51 ºC 1min
20 ciclos
95 ºC
45 s
48 ºC 1min
3.2 - Procedimento seguido no Laboratório de Fisiologia Animal da UTAD,
incluiu:
a) Preparação de 1000 µl de solução para PCR (mesmo que 100 amostras)
-
Primers dissolvidos em tampão TE de acordo com as indicações do fabricante e
solução de trabalho ajustada à concentração de 20 pmol/μl.
-
Amostras de DNA (50ng/µl)
-
Tampão 10X
-
dNTPs 200 μM
-
Água milliQ autoclavada
-
Polimerase da Bioline (5 U/µl)
-
Parafina líquida
247
ANEXO 1 - Descrição dos protocolos utilizados no capítulo 2
Misturar num microtubo de 1,5 ml
Tampão
100 µl
Primer A
60 µl
Primer B
60 µl
dNTPs
100 µl
TAQ Polimerase
5 µl
Água
675 µl
Depois de distribuir esta mistura por cada um dos “poços” da microplaca, contendo já 2
µl das amostras de DNA, foi adicionada uma gota de parafina líquida para prevenir a
evaporação.
Colocar no termociclador utilizando o seguinte programa térmico de amplificação:
3 ciclos
95 ºC 45 s
60 ºC 1min
3 ciclos
95 ºC 45 s
57 ºC 1min
3 ciclos
95 ºC 45 s
54 ºC 1min
3 ciclos
95 ºC 45 s
51 ºC 1min
20 ciclos
95 ºC 45 s
48 ºC 1min
4 - Protocolo da Electroforese
4.1 - Procedimento seguido na Unidade de Biologia Molecular, Laboratório de
Bioquímica, Universidade de Otago - Nova Zelândia
4.1.1 - Preparação do gel de Acrilamida 6% desnaturante (8M Ureia )
4.1.1.1- Preparação das placas de vidro
a) Material
Placas de vidro
Álcool absoluto
Acetona
Gel Repel
Fita adesiva com largura de 1,5 cm
Espaçadores (0,4 mm de espessura)
248
ANEXO 1 - Descrição dos protocolos utilizados no capítulo 2
Embora o Gel Repel não seja tóxico, convém utilizar luvas na preparação das placas,
para não deixar marcas de dedos e para proteger da acção da acetona e do etanol
utilizados na limpeza.
b) Siliconização das placas de vidro
•
Marcar as placas exteriormente (1, 2).
•
Lavar bem as placas com detergente, passar bem por água e deixar secar.
•
Limpar o lado interno das placas com acetona e depois etanol absoluto, usando para
o efeito folhas de papel de cozinha e deixar secar.
•
Aplicar o Gel Repel em toda a superfície interna da placa. Deixar secar. Esfregar
bem com uma folha de papel de cozinha. Podem ser siliconizados cerca de 7 placas por
cada toalhinha de Gel Repel.
•
Deixar secar bem e colocar os espaçadores entre as placas e imobilizar com molas e
facilitar a aplicação de fita adesiva para manter firme a união entre as placas de vidro e
vedar o espaço entre eles. Este conjunto (“sandwich”) está pronto a receber a solução
de gel.
4.1.1.2- Preparação das soluções para o gel
Solução stock de acrilamida (40%)
Para 1 litro: misturar 380 g de acrilamida com 20 g bis-acrilamida (proporção de 19:1) e
38 g de amberlite.
•
Dissolver bem (cerca de 30 minutos) a mistura com água MilliQ em
aproximadamente 800ml de água bidestilada
•
Remover a resina por filtração através de 3 camadas de papel Whatman #1 e ajustar
o volume a 1 litro com água bidestilada.
•
Armazenar a 4 ºC num recipiente escuro.
Tampão TBE 10x (solução stock)
Para o volume de 1 litro: Preparar 108 g Tris-base, 55 g de ácido bórico, 40 ml 0,5M
EDTA, pH 8,0. Adicionar água até perfazer um litro e autoclavar.
249
ANEXO 1 - Descrição dos protocolos utilizados no capítulo 2
Instangel
Para 1 litro: Preparar 480 g de ureia, 100 ml de TBE 10x, 150 ml de solução stock de
acrilamida 40%. Perfazer a 1 litro com água bidestilada, dissolvendo bem.
Persulfato de amónia 10%
Para um volume de 500 μl: Preparar pesar 0,06g persulfato de amónia e adicionar 500
μl de água bidestilada.
TBE 1x
Para um litro de solução: Preparar 100 ml de TBE 10x e perfazer a 1 litro com água
bidestilada agitar bem para homogeneizar.
Formamide Loading Dye
Para um volume de 100 ml: Adicionar a 100ml de Formamida cerca de 2-3 g de
Amberlite, deixando actuar durante uma hora com agitação ocasional, tendo como
objectivo a desionização da mesma. A 90 ml de formamida desionisada adicionar 10 ml
de Tris 1 M (pH 7,2), 5 mg de azul de bromofenole 5 mg Xileno cianol FF.
Persulfato de Amónia (APS) a 10%
Dissolver 4 g de APS em 40 ml de água MilliQ e dissolver bem.
4.1.1.3 – Preparação do gel
Material
Uma proveta de 100 ml
Um copo de 150 ml
Instangel
Persulfato de Amónia (APS) a 10%
TEMED
TBE 1X
Pipetas Pasteur
•
Na “sandwich” colocar lateralmente molas para as manter firmes e paralelas, tendo
o cuidado de estas pressionarem no meio dos espaçadores.
•
No copo juntar: 60 ml de Instangel, 360
250
l de APS, 48
l TEMED
ANEXO 1 - Descrição dos protocolos utilizados no capítulo 2
•
Agitar bem a mistura
•
Utilizando luvas, pois a acrilamida é tóxica enquanto líquida, deitar a mistura entre
os dois vidros, mantendo-os ligeiramente inclinados e apoiados em duas pontas para
evitar a formação de bolhas de ar.
•
Colocar o pente de forma invertida, isto é, com os bicos para fora por forma a que a
mistura depois de solidificada forme nesta superfície uma linha direita.
•
Deixar cerca de 2 horas o conjunto em repouso, com uma pequena inclinação.
•
Tirar as molas, a fita adesiva e, com cuidado, o pente.
•
Lavar por fora as placas de vidro e passar bem por água a linha formada pelo pente
no gel de forma a garantir que fica livre de eventuais pequenos pedaços.
4.1.1.4. Electroforese propriamente dita
•
Colocar as placas na tina de electroforese e preencher os respectivos reservatórios
com TBE 1 X.
•
Com uma pipeta Pasteur lavar a linha do gel com tampão TBE 1X e aplicar o pente
com os bicos para baixo, tendo muito cuidado de apenas picar ligeiramente o gel
•
Adicionar ao produto de PCR 10 μl de corante (Formamida Dye 98%) tendo o
cuidado de verificar que o mesmo atravessou a camada de parafina que o cobre.
Colocar no termociclador para desnaturar a 95 ºC durante pelo menos 2 minutos.
•
Aplicar 3 a 4 μl de amostra. Aplicar as amostras com genótipo conhecido nas
extremidades do gel para servirem como referência.
•
Fechar a tina e ligar à corrente eléctrica definindo a potência de 1000 V durante
cerca de 2 horas. O tempo de corrida depende do microssatélite.
•
Um pré-aquecimento é opcional. Nesse caso, após o pré-aquecimento, lavar
novamente a linha do gel com o tampão TBE e aplicar o pente com os bicos para
baixo., tendo muito cuidado de apenas picar ligeiramente o gel.
•
Após a corrida, retirar os vidros da tina, os espaçadores e com cuidado separar os
vidros de modo a que o gel fique no vidro no qual não se aplicou o gel repel.
•
Aplicar uma folha de papel tipo filtro a toda a superfície do gel para o retirar do
segundo vidro.
•
Secar o gel num secador de géis.
•
Medir a radioactividade do gel seco para confirmar que o produto radiactivo se
encontra lá.
251
ANEXO 1 - Descrição dos protocolos utilizados no capítulo 2
•
Numa câmara escura, colocar o gel conjuntamente com um filme de radiografia
numa caixa adequada para o efeito e deixar cerca de 18 horas a impregnar. Retirar a
radiografia e revelar em máquina apropriada.
•
Identificar os alelos presentes em cada amostra.
4.2 Alterações efectuadas No Laboratório de Fisiologia da UTAD
O procedimento seguido na UTAD sofreu as seguintes modificações:
Na preparação dos vidros além de utilizarmos um produto com a mesma função
que o Gel Repel (Repel Silane), utilizámos um outro produto (Bind Silane) com função
oposta no segundo vidro, de forma a evitar que o gel se solte nas sucessivas imersões no
processo de revelação.
A solução de acrilamida utilizada foi uma solução pronta a usar (Ready Sol DNA
/PAGE, 40%).
A quantidade de produto de PCR aplicado foi apenas 2 µl, aspecto que se revelou
de extrema importância, uma vez que quando era aplicado 4 µl não foi possível
visualizar as microssatélites, mas apenas “borrões” devido ao excesso de amostra.
A tina de electroforese utilizada, uma Hoefer TM SQ3 Sequencer, com dimensões
muito diferentes das utilizadas na Nova Zelândia, exigiu condições de electroforese
também diferentes. Assim, optámos por s uma corrida com potência constante de 45 W
(voltagem e amperagem no máximo porque fica limitado pelo menor valor da potência).
Normalmente foi realizado um pré-aquecimento de 10 minutos.
Como nenhum dos primers foi marcado, na parte final, o gel manteve-se aderido a
um dos vidros e tendo-se procedido à sua revelação com nitrato, de prata de acordo com
a metodologia que se segue.
252
ANEXO 1 - Descrição dos protocolos utilizados no capítulo 2
4.2.1 -Protocolo de revelação do gel de poliacrilamida pelo kit da Promega (Silver
SequenceTM DNA Sequencing System)
1. Preparar três soluções:
Solução fix/stop (10% de ácido acético glacial): adicionar 300 ml de ácido acético
glacial em 2700 ml de água bidestilada, não reutilizar esta solução.
Solução de coloração: combinar 2g (1 pacote) de nitrato de prata (AgNO3) e 3ml (1
frasco) de 37% de formaldeído em 2 litros de água bidestilada.
Solução de desenvolvimento: dissolver 60 g de carbonato de sódio (Na2CO3) em 2
litros de água bidestilada e arrefecer a 10 ºC em gelo; imediatamente antes de utilizar
(passo 6), adicionar 3ml de 37% formaldeído e uma alíquota de 400 μl de tiossulfato de
sódio (10mg/ml); descartar o tiosulfato de sódio restante.
2. Separar as placas de vidro: após a electroforese, separar as placas de vidro com
muito cuidado utilizando uma cunha de plástico; o gel deve permanecer agarrado à
placa de vidro pequena.
3. Fixar o gel: colocar o gel num tabuleiro de plástico, cobrir com solução fix/stop e
agitar bem durante 20 minutos ou até que o arrastamento do corante não seja visível;
o gel pode ser armazenado na solução fix/stop durante a noite (sem agitar); guardar a
solução fix/stop para terminar a reacção de desenvolvimento (passo9); se a solução
de desenvolvimento ainda não estiver arrefecida, deve ser colocada no gelo nessa
altura.
4. Lavar do gel: lavar o gel 3x (2 minutos cada) com água bidestilada utilizando
agitação. Suspender o gel fora da água de lavagem e deixar drenar 10-20 segundos
antes de transferir para a lavagem seguinte.
5. Coloração do gel: transferir o gel para a solução de coloração e agitar bem durante
30 minutos.
6. Completar a preparação da solução de desenvolvimento pela adição de 3 ml de 37%
de formaldeído e uma alíquota de 400 μl de tiossulfato de sódio (10 mg/ml) para a
solução de carbonato de sódio pré-arrefecida (10 ºC). Colocar 1 litro da solução de
desenvolvimento pré-arrefecida num tabuleiro e o restante desta no gelo.
253
ANEXO 1 - Descrição dos protocolos utilizados no capítulo 2
7. Remover o gel da solução de coloração e transferir a solução para um frasco de
recolha de prata, para não poluir as águas residuais. Lavar o tabuleiro em
abundância com água bidestilada.
Nota:Cuidado: o tempo do próximo passo (lavagem) é muito importante. O tempo total em que o gel é
colocado em água bidestilada e o tempo em que é colocado em solução de desenvolvimento não deve ser
superior a 5 a 10 segundos. Lavagens mais prolongadas resultam em sinal muito fraco ou ausência deste.
8. Lavagem do gel: mergulhar o gel rapidamente no tabuleiro contendo água
bidestilada, drenar e colocar imediatamente no tabuleiro que contem solução de
desenvolvimento arrefecida.
Nota: se os procedimentos de lavagem forem demasiado longos, repetir passos 5, 7 e 8 com a solução de
coloração.
9. Desenvolver o gel: agitar bem o gel por balanceamento até a banda temporária
começar a desenvolver-se ou até as primeiras bandas serem visíveis; transferir o gel
para a restante solução de desenvolvimento arrefecida e continuar o processo durante
2-3 minutos, ou até todas as bandas se tornarem visíveis.
Nota: As bandas desenvolvidas aparecem claramente à luz. Duração de desenvolvimento prolongado
resulta num elevado ruído de fundo que dificulta a clareza das bandas.
10. Parar o desenvolvimento: para terminar a reacção de desenvolvimento e fixar o gel,
adicionar um litro de solução fix/stop.
11. Deixar secar o gel e aplicar um acetato para mais facilmente se escrever sobre ele.
254
ANEXO 2
Gráficos de frequências alélicas de cada locus em cada
população
ANEXO 2 - Gráficos de frequências alélicas de cada locus em cada população
BM1824
BEDM
CA
CB
CC
CGB
CGM
CM
BM4621
BM6444
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
CMP
257
ANEXO 2 - Gráficos de frequências alélicas de cada locus em cada população
BM1824
CTQ
MB
MBB
MP
SE
SL
Média
BM4621
BM6444
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,50
0,50
0,50
0,25
0,25
0,25
0,00
0,00
0,00
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
258
ANEXO 2 - Gráficos de frequências alélicas de cada locus em cada população
BM6506
BEDM
CA
CB
CC
CGB
CGM
CM
BM757
ETH225
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
CMP
259
ANEXO 2 - Gráficos de frequências alélicas de cada locus em cada população
BM6506
CTQ
MB
MBB
MP
SE
SL
Média
BM757
ETH225
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,50
0,50
0,50
0,25
0,25
0,25
0,00
0,00
0,00
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
260
ANEXO 2 - Gráficos de frequências alélicas de cada locus em cada população
MAF209
BEDM
CA
CB
CC
CGB
CGM
CM
MAF23
McM214
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
CMP
261
ANEXO 2 - Gráficos de frequências alélicas de cada locus em cada população
MAF209
CTQ
MB
MBB
MP
SE
SL
Média
MAF23
McM214
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,50
0,50
0,50
0,25
0,25
0,25
0,00
0,00
0,00
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
262
ANEXO 2 - Gráficos de frequências alélicas de cada locus em cada população
McM218
BEDM
CA
CB
CC
CGB
CGM
CM
McM357
OarCP20
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
CMP
263
ANEXO 2 - Gráficos de frequências alélicas de cada locus em cada população
McM218
CTQ
MB
MBB
MP
SE
SL
Média
McM357
OarCP20
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,50
0,50
0,50
0,25
0,25
0,25
0,00
0,00
0,00
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
264
ANEXO 2 - Gráficos de frequências alélicas de cada locus em cada população
OarCP34
BEDM
CA
CB
CC
CGB
CGM
CM
OarCP49
OarFCB11
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
CMP
265
ANEXO 2 - Gráficos de frequências alélicas de cada locus em cada população
OarCP34
CTQ
MB
MBB
MP
SE
SL
Média
OarCP49
OarFCB11
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,50
0,50
0,50
0,25
0,25
0,25
0,00
0,00
0,00
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
266
ANEXO 2 - Gráficos de frequências alélicas de cada locus em cada população
OarFCB128
BEDM
CA
CB
CC
CGB
CGM
CM
OarFCB20
OarFCB304
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
CMP
267
ANEXO 2 - Gráficos de frequências alélicas de cada locus em cada população
OarFCB128
CTQ
MB
MBB
MP
SE
SL
Média
OarFCB20
OarFCB304
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
0,75
0,75
0,75
0,50
0,50
0,50
0,25
0,25
0,25
0,00
0,00
0,00
0,75
0,75
0,75
0,5
0,5
0,5
0,25
0,25
0,25
0
0
0
268
ANEXO 2 - Gráficos de frequências alélicas de cada locus em cada população
OarFCB48
BEDM
CA
CB
CC
CGB
CGM
CM
OarHH64
0,75
0,75
0,5
0,5
0,25
0,25
0
0
0,75
0,75
0,5
0,5
0,25
0,25
0
0
0,75
0,75
0,5
0,5
0,25
0,25
0
0
0,75
0,75
0,5
0,5
0,25
0,25
0
0
0,75
0,75
0,5
0,5
0,25
0,25
0
0
0,75
0,75
0,5
0,5
0,25
0,25
0
0
0,75
0,75
0,5
0,5
0,25
0,25
0
0
0,75
0,75
0,5
0,5
0,25
0,25
0
0
CMP
269
ANEXO 2 - Gráficos de frequências alélicas de cada locus em cada população
OarFCB48
CTQ
MB
MBB
MP
SE
SL
Média
OarHH64
0,75
0,75
0,5
0,5
0,25
0,25
0
0
0,75
0,75
0,5
0,5
0,25
0,25
0
0
0,75
0,75
0,5
0,5
0,25
0,25
0
0
0,75
0,75
0,5
0,5
0,25
0,25
0
0
0,75
0,75
0,5
0,5
0,25
0,25
0
0
0,75
0,75
0,50
0,50
0,25
0,25
0,00
0,00
0,75
0,75
0,5
0,5
0,25
0,25
0
0
270
ANEXO 3
Tabelas do capítulo 3
Loci
BEDM
CA CB CC
CGB
CGM
BM1824
5
5
5
5
5
5
BM4621
13
10
14
14
15
14
BM6444
17
12
14
13
16
18
BM6506
5
5
5
6
7
4
BM757
7
5
4
6
5
6
ETH225
6
5
5
8
5
7
MAF209
11
9
10
8
9
11
MAF23
6
5
6
4
7
6
McM214
9
9
9
9
12
10
McM218
9
7
8
7
10
8
McM357
11
8
8
7
10
10
OarCP20
7
6
9
9
9
8
OarCP34
7
5
6
7
6
6
OarCP49
13
12
11
13
17
20
OarFCB11
10
6
9
7
10
10
OarFCB128
8
7
9
7
8
8
OarFCB20
12
8
13
10
9
11
OarFCB304
11
7
10
10
10
13
OarFCB48
12
9
8
9
10
13
OarHH64
10
8
7
7
9
7
Média
9,5
7,4
8,5
8,3
9,4
9,9
EP
0,7
0,5
0,6
0,6
0,8
0,9
*Total – referido ao conjunto dos 717 indivíduos não considerando a raça.
CM
5
13
14
7
6
5
9
7
11
7
8
10
6
13
9
7
11
8
9
6
8,6
0,6
CMP
5
14
18
7
5
4
12
4
9
9
10
8
7
17
9
6
10
9
11
10
9,2
0,9
Tabela 1 – Riqueza alélica observada por microssatélite e por raça.
CTQ
5
17
11
7
6
5
9
8
11
11
10
9
6
18
8
9
13
12
11
9
9,8
0,8
MB
5
14
15
7
5
5
9
4
12
9
9
9
7
19
8
7
13
14
11
9
9,6
0,9
MBB
5
12
12
5
6
9
12
5
11
9
9
6
6
12
9
7
11
12
12
8
8,9
0,6
MP
5
16
18
6
7
5
11
5
11
9
8
10
6
17
9
8
10
9
11
10
9,6
0,8
SE
5
12
15
6
5
5
10
6
10
8
7
6
6
13
8
7
14
14
9
9
8,8
0,7
SL
5
11
12
8
7
4
7
5
11
8
8
8
6
12
7
7
10
11
9
9
8,3
0,5
*Total
5
19
22
8
10
11
14
9
16
12
15
13
7
26
14
13
16
21
17
11
14,0
1,2
Média
5,0
13,5
14,6
6,1
5,7
5,6
9,8
5,6
10,3
8,5
8,8
8,1
6,2
14,8
8,5
7,5
11,1
10,7
10,3
8,4
EP
0,0
0,5
0,7
0,3
0,2
0,4
0,4
0,3
0,3
0,3
0,3
0,4
0,2
0,8
0,3
0,2
0,5
0,6
0,4
0,3
ANEXO 3 - Tabelas do capítulo 3
273
Loci
BEDM
CA CB CC
CGB
CGM
BM1824
5
5
5
5
5
5
BM4621
13
10
14
14
15
14
BM6444
17
12
14
13
16
18
BM6506
5
5
5
6
7
4
BM757
7
5
4
6
5
6
ETH225
6
5
5
8
5
7
MAF209
11
9
10
8
9
11
MAF23
6
5
6
4
7
6
McM214
9
9
9
9
12
10
McM218
9
7
8
7
10
8
McM357
11
8
8
7
10
10
OarCP20
7
6
9
9
9
8
OarCP34
7
5
6
7
6
6
OarCP49
13
12
11
13
17
20
OarFCB11
10
6
9
7
10
10
OarFCB128
8
7
9
7
8
8
OarFCB20
12
8
13
10
9
11
OarFCB304
11
7
10
10
10
13
OarFCB48
12
9
8
9
10
13
OarHH64
10
8
7
7
9
7
Média
9,5
7,4
8,5
8,3
9,4
9,9
EP
0,7
0,5
0,6
0,6
0,8
0,9
*Total – referido ao conjunto dos 717 indivíduos não considerando a raça.
CM
5
13
14
7
6
5
9
7
11
7
8
10
6
13
9
7
11
8
9
6
8,6
0,6
CMP
5
14
18
7
5
4
12
4
9
9
10
8
7
17
9
6
10
9
11
10
9,2
0,9
Tabela 1 – Riqueza alélica observada por microssatélite e por raça.
CTQ
5
17
11
7
6
5
9
8
11
11
10
9
6
18
8
9
13
12
11
9
9,8
0,8
MB
5
14
15
7
5
5
9
4
12
9
9
9
7
19
8
7
13
14
11
9
9,6
0,9
MBB
5
12
12
5
6
9
12
5
11
9
9
6
6
12
9
7
11
12
12
8
8,9
0,6
MP
5
16
18
6
7
5
11
5
11
9
8
10
6
17
9
8
10
9
11
10
9,6
0,8
SE
5
12
15
6
5
5
10
6
10
8
7
6
6
13
8
7
14
14
9
9
8,8
0,7
SL
5
11
12
8
7
4
7
5
11
8
8
8
6
12
7
7
10
11
9
9
8,3
0,5
*Total
5
19
22
8
10
11
14
9
16
12
15
13
7
26
14
13
16
21
17
11
14,0
1,2
Média
5,0
13,5
14,6
6,1
5,7
5,6
9,8
5,6
10,3
8,5
8,8
8,1
6,2
14,8
8,5
7,5
11,1
10,7
10,3
8,4
EP
0,0
0,5
0,7
0,3
0,2
0,4
0,4
0,3
0,3
0,3
0,3
0,4
0,2
0,8
0,3
0,2
0,5
0,6
0,4
0,3
ANEXO 3 - Tabelas do capítulo 3
274
ANEXO 3 - Tabelas do capítulo 3
Tabela 3 - Valores de Heterozigotia Observada (HO) por locus e por raça.
Locus
BM1824
BM4621
BM6444
BM6506
BM757
ETH225
MAF209
MAF23
McM214
McM218
McM357
OarCP20
OarCP34
OarCP49
OarFCB11
OarFCB128
OarFCB20
OarFCB304
OarFCB48
OarHH64
BEDM
CA
CB
CC
CGB CGM
CM
CMP
CTQ
MB
MBB
MP
SE
SL
Média
0,667
0,698
0,600
0,742
0,820
±
±
±
±
±
0,784
0,688
0,623
0,750
0,780
0,692
0,575
0,667
0,760
0,703
±
±
±
±
±
±
±
±
±
0,070
0,062
0,069
0,079
±
0,054
0,058
0,066
0,066
0,055
0,053
0,063
0,069
0,065
0,060
0,019
0,756
0,679
0,900
±
±
±
0,936
0,900
0,824
0,813
0,849
0,857
0,881
0,923
0,830
0,863
0,840
0,847
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
0,064
0,064
±
0,042
0,044
0,042
0,053
0,055
0,049
0,045
0,041
0,037
0,052
0,047
0,052
0,017
0,667
±
0,623
0,680
0,742
0,780
0,784
0,729
0,774
0,696
0,695
0,641
0,681
0,745
0,720
0,711
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
0,070
0,066
0,066
0,079
0,059
0,058
0,063
0,057
0,059
0,058
0,066
0,065
0,060
0,063
0,013
0,489
0,585
0,700
0,613
0,680
0,726
0,583
0,679
0,732
0,746
0,692
0,787
0,628
0,720
0,669
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
0,075
0,067
0,065
0,087
0,066
0,062
0,070
0,064
0,057
0,055
0,063
0,057
0,066
0,063
0,021
0,622
0,642
0,720
0,774
0,700
0,628
0,708
0,717
0,821
0,678
0,769
0,575
0,726
0,800
0,706
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
0,072
0,065
0,063
0,075
0,065
0,068
0,064
0,061
0,049
0,059
0,058
0,069
0,061
0,057
0,018
0,467
0,585
0,260
0,742
0,520
0,392
0,521
0,283
0,500
0,593
0,513
0,340
0,373
0,340
0,459
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
0,074
0,067
0,062
0,079
0,071
0,068
0,071
0,061
0,064
0,062
0,069
0,066
0,066
0,067
0,035
0,667
0,887
0,680
0,677
0,800
0,784
0,854
0,906
0,804
0,729
0,846
0,702
0,784
0,740
0,776
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
0,070
0,043
0,066
0,084
0,057
0,058
0,050
0,040
0,051
0,056
0,050
0,063
0,057
0,062
0,020
0,467
0,491
0,660
0,742
0,700
0,608
0,583
0,528
0,554
0,729
0,564
0,660
0,608
0,640
0,610
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
0,074
0,068
0,067
0,079
0,065
0,068
0,070
0,068
0,064
0,056
0,068
0,066
0,067
0,068
0,022
0,756
0,660
0,640
0,774
0,700
0,843
0,792
0,755
0,857
0,831
0,744
0,660
0,726
0,780
0,751
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
0,064
0,064
0,068
0,075
0,065
0,051
0,057
0,059
0,045
0,048
0,060
0,066
0,061
0,059
0,018
0,867
0,679
0,740
0,677
0,800
0,686
0,646
0,698
0,714
0,797
0,692
0,745
0,726
0,780
0,732
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
0,051
0,064
0,062
0,084
0,057
0,065
0,068
0,062
0,058
0,051
0,063
0,060
0,061
0,059
0,016
0,489
0,426
0,360
0,258
0,540
0,490
0,440
0,537
0,400
0,436
0,245
0,385
0,519
0,380
0,422
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
0,075
0,067
0,068
0,079
0,070
0,070
0,070
0,068
0,063
0,063
0,059
0,067
0,069
0,069
0,024
0,711
0,698
0,760
0,710
0,680
0,863
0,625
0,585
0,679
0,729
0,641
0,787
0,784
0,840
0,721
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
0,068
0,062
0,060
0,081
0,066
0,048
0,068
0,067
0,060
0,056
0,066
0,057
0,057
0,052
0,021
0,667
0,604
0,780
0,677
0,720
0,824
0,646
0,698
0,696
0,763
0,641
0,681
0,843
0,820
0,719
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
0,070
0,067
0,059
0,084
0,063
0,053
0,068
0,062
0,059
0,054
0,066
0,065
0,050
0,054
0,019
0,667
0,830
0,740
0,871
0,860
0,922
0,771
0,755
0,839
0,746
0,821
0,766
0,824
0,740
0,797
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
0,070
0,051
0,062
0,060
0,049
0,038
0,059
0,059
0,047
0,055
0,053
0,059
0,052
0,062
0,017
0,756
0,679
0,840
0,677
0,880
0,726
0,521
0,679
0,768
0,797
0,795
0,787
0,745
0,720
0,741
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
0,064
0,064
0,052
0,084
0,046
0,062
0,071
0,064
0,054
0,051
0,055
0,057
0,060
0,063
0,022
0,689
0,717
0,680
0,677
0,800
0,726
0,771
0,736
0,679
0,814
0,769
0,872
0,706
0,720
0,740
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
0,069
0,061
0,066
0,084
0,057
0,062
0,059
0,060
0,060
0,049
0,058
0,046
0,063
0,063
0,015
0,889
0,736
0,940
0,613
0,720
0,824
0,875
0,793
0,732
0,695
0,692
0,745
0,824
0,740
0,773
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
0,047
0,060
0,034
0,087
0,063
0,053
0,047
0,055
0,057
0,058
0,063
0,060
0,052
0,062
0,023
0,711
0,830
0,820
0,774
0,880
0,784
0,708
0,774
0,696
0,661
0,667
0,702
0,784
0,740
0,752
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
0,068
0,051
0,054
0,075
0,046
0,058
0,064
0,057
0,059
0,060
0,065
0,063
0,057
0,062
0,017
0,600
0,849
0,600
0,936
0,820
0,804
0,646
0,755
0,804
0,848
0,744
0,681
0,843
0,760
0,764
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
0,073
0,049
0,069
0,044
0,054
0,056
0,068
0,059
0,051
0,046
0,060
0,065
0,050
0,060
0,026
0,711
0,642
0,600
0,581
0,640
0,196
0,333
0,736
0,375
0,644
0,462
0,447
0,608
0,820
0,557
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
0,068
0,065
0,069
0,089
0,068
0,056
0,067
0,060
0,062
0,061
0,068
0,069
0,067
0,054
0,044
0,666a 0,677ace 0,685acd 0,710ab 0,747b 0,711bc 0,663ace 0,693acd 0,698acd 0,729bd 0,678ace 0,670ac 0,716bde 0,720abc
Média*
EP
0,027 0,026 0,036 0,032 0,024 0,039 0,031 0,030 0,031 0,022 0,034 0,032 0,027 0,030
EPs
0,016 0,014 0,015 0,018 0,014 0,014 0,015 0,014 0,013 0,013 0,014 0,015 0,014 0,014
0,021 0,021 0,033 0,026 0,019 0,037 0,027 0,027 0,028 0,018 0,030 0,028 0,024 0,026
EPl
* - Valores médios para cada raça com presença de, pelo menos, uma letra igual não diferem significativamente (P≥0,05) – WILCOXON signed
ranks test.
275
ANEXO 3 - Tabelas do capítulo 3
Tabela 4 - Valores de Heterozigotia Esperada não Inviesada (HNB) por locus e por raça.
Locus
BM1824
BM4621
BM6444
BM6506
BM757
ETH225
MAF209
MAF23
McM214
McM218
McM357
OarCP20
OarCP34
OarCP49
OarFCB11
OarFCB128
OarFCB20
OarFCB304
OarFCB48
OarHH64
BEDM
CA
CB
0,755
0,800
0,609
±
±
±
0,023
0,009
0,879
±
CC
CGB CGM
CM
CMP
CTQ
MBB
MP
SE
SL
Média
0,764
0,789
0,773
0,772
0,732
0,773 0,751
±
±
±
±
±
0,755
0,752
0,658
0,753
0,745
±
±
±
±
0,044
0,021
0,015
0,018
0,012
0,018
±
0,014 0,019
0,013
0,020
0,040
0,024
0,013
0,786
0,890
0,873
0,890
0,859
0,849
0,894
±
±
±
±
±
±
±
0,868 0,854
0,870
0,890
0,886
0,833
0,866
±
±
±
±
0,015
0,028
0,015
0,024
0,014
0,019
0,024
0,013
±
0,022 0,016
0,017
0,014
0,012
0,020
0,008
0,919
0,875
0,870
0,875
0,878
0,866
0,879
0,880
±
±
±
±
±
±
±
±
0,856 0,854
0,840
0,886
0,863
0,797
0,867
±
±
±
±
0,011
0,014
0,013
0,023
0,017
0,021
0,016
0,018
±
0,012 0,017
0,019
0,017
0,023
0,027
0,007
0,576
0,647
0,638
0,674
0,700
0,703
0,674
0,672
±
±
±
±
±
±
±
±
0,726 0,653
0,659
0,773
0,651
0,736
0,677
±
±
±
±
0,046
0,027
0,033
0,031
0,028
0,028
0,031
0,029
±
0,025 0,026
0,027
0,022
0,028
0,023
0,012
0,754
0,681
0,739
0,743
0,728
0,705
0,709
0,755
±
±
±
±
±
±
±
±
0,761 0,743
0,764
0,717
0,687
0,794
0,734
±
±
±
±
0,025
0,030
0,014
0,043
0,019
0,024
0,029
0,011
±
0,015 0,021
0,017
0,026
0,029
0,016
0,008
0,600
0,602
0,415
0,717
0,608
0,574
0,545
0,386
±
±
±
±
±
±
±
±
0,627 0,634
0,687
0,621
0,542
0,397
0,568
±
±
±
±
0,051
0,043
0,056
0,045
0,039
0,030
0,042
0,051
±
0,030 0,023
0,033
0,041
0,019
0,050
0,027
0,739
0,845
0,757
0,667
0,746
0,742
0,803
0,863
±
±
±
±
±
±
±
±
0,809 0,777
0,844
0,723
0,860
0,777
0,782
±
±
±
±
0,041
0,015
0,026
0,058
0,040
0,032
0,023
0,011
±
0,019 0,020
0,017
0,039
0,015
0,025
0,015
0,617
0,543
0,648
0,707
0,632
0,643
0,642
0,576
±
±
±
±
±
±
±
±
0,596 0,687
0,643
0,702
0,648
0,644
0,638
±
±
±
±
0,034
0,044
0,033
0,024
0,032
0,026
0,032
0,025
±
0,025 0,011
0,031
0,027
0,027
0,026
0,012
0,818
0,710
0,696
0,821
0,815
0,817
0,782
0,760
±
±
±
±
±
±
±
±
0,818 0,855
0,791
0,802
0,775
0,836
0,793
±
±
±
±
0,022
0,029
0,035
0,024
0,023
0,019
0,029
0,031
±
0,018 0,012
0,025
0,027
0,020
0,019
0,012
0,866
0,696
0,737
0,793
0,793
0,759
0,734
0,726
±
±
±
±
±
±
±
±
0,709 0,801
0,748
0,792
0,717
0,768
0,760
±
±
±
±
0,014
0,027
0,025
0,028
0,026
0,024
0,038
0,034
±
0,038 0,017
0,029
0,022
0,035
0,028
0,012
0,850
0,794
0,719
0,713
0,804
0,841
0,823
0,830
±
±
±
±
±
±
±
±
0,805 0,818
0,805
0,791
0,764
0,797
0,797
±
±
±
±
0,017
0,021
0,032
0,047
0,025
0,015
0,019
0,019
±
0,018 0,016
0,019
0,020
0,022
0,022
0,010
0,762
0,748
0,722
0,789
0,796
0,836
0,705
0,694
±
±
±
±
±
±
±
±
0,751 0,788
0,738
0,762
0,761
0,831
0,763
±
±
±
±
0,023
0,018
0,029
0,029
0,018
0,017
0,036
0,029
±
0,023 0,021
0,017
0,020
0,014
0,014
0,011
0,768
0,657
0,776
0,801
0,773
0,798
0,696
0,756
±
±
±
±
±
±
±
±
0,773 0,757
0,704
0,765
0,767
0,743
0,752
±
±
±
±
0,021
0,026
0,019
0,025
0,021
0,015
0,032
0,023
±
0,018 0,020
0,027
0,019
0,019
0,023
0,010
0,888
0,833
0,819
0,847
0,909
0,905
0,826
0,858
±
±
±
±
±
±
±
±
0,860 0,874
0,892
0,797
0,864
0,851
0,859
±
±
±
±
0,012
0,023
0,020
0,030
0,011
0,014
0,026
0,023
±
0,022 0,018
0,013
0,033
0,020
0,018
0,009
0,830
0,640
0,825
0,720
0,839
0,814
0,770
0,750
±
±
±
±
±
±
±
±
0,846 0,779
0,809
0,795
0,808
0,796
0,787
±
±
±
±
0,021
0,044
0,017
0,037
0,015
0,019
0,026
0,033
±
0,012 0,019
0,016
0,019
0,016
0,018
0,014
0,727
0,766
0,694
0,719
0,807
0,817
0,772
0,777
±
±
±
±
±
±
±
±
0,717 0,780
0,786
0,834
0,801
0,788
0,770
±
±
±
±
0,038
0,020
0,039
0,045
0,020
0,023
0,025
0,020
±
0,025 0,013
0,021
0,012
0,016
0,021
0,011
0,865
0,683
0,882
0,849
0,779
0,825
0,806
0,830
±
±
±
±
±
±
±
±
0,852 0,827
0,863
0,801
0,889
0,844
0,828
±
±
±
±
0,017
0,033
0,011
0,020
0,028
0,022
0,025
0,018
±
0,015 0,021
0,012
0,018
0,014
0,016
0,013
0,715
0,759
0,790
0,763
0,795
0,739
0,786
0,748
±
±
±
±
±
±
±
±
0,798 0,680
0,772
0,703
0,719
0,725
0,749
±
±
±
±
0,035
0,021
0,022
0,038
0,024
0,031
0,023
0,024
±
0,021 0,029
0,025
0,029
0,032
0,028
0,010
0,756
0,811
0,652
0,851
0,799
0,779
0,777
0,779
±
±
±
±
±
±
±
±
0,801 0,816
0,761
0,685
0,774
0,748
0,771
±
±
±
±
0,032
0,017
0,047
0,021
0,029
0,036
0,032
0,029
±
0,021 0,023
0,030
0,049
0,031
0,033
0,013
0,789
0,794
0,698
0,772
0,769
0,674
0,602
0,749
±
±
±
±
±
±
±
±
0,731 0,714
0,613
0,729
0,838
0,809
0,734
±
±
±
±
0,031
0,021
0,035
0,032
0,031
0,045
0,044
0,030
±
0,051
0,036
0,018
0,024
0,018
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
MB
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
±
0,032 0,033
0,774acd 0,733ab 0,729bc 0,773cde 0,782d 0,774cd 0,748abe 0,751abcf 0,774df 0,772df 0,767dce 0,766bcd 0,764bcd 0,763bcd
Média*
EP
0,021 0,020 0,025 0,015 0,017 0,018 0,019 0,026 0,017 0,016 0,017 0,015 0,021 0,022
EPs
0,006 0,006 0,007 0,008 0,006 0,006 0,007 0,006 0,005 0,005 0,006 0,006 0,005 0,006
0,020 0,019 0,024 0,012 0,016 0,018 0,018 0,025 0,016 0,015 0,016 0,013 0,020 0,022
EPl
*-Valores médios para cada raça com presença de, pelo menos, uma letra igual não diferem significativamente (P≥0,05) – WILCOXON signed
ranks test.
276
277
BEDM
0,706
0,857
0,902
0,517
0,706
0,558
0,707
0,544
0,785
0,840
0,822
0,715
0,722
0,866
0,799
0,688
0,840
0,667
0,715
0,757
0,736
0,024
CA
0,759
0,746
0,851
0,571
0,625
0,546
0,816
0,487
0,655
0,640
0,758
0,697
0,582
0,807
0,614
0,726
0,641
0,715
0,779
0,757
0,689
0,022
CB
0,559
0,870
0,846
0,572
0,682
0,381
0,713
0,585
0,649
0,686
0,673
0,672
0,732
0,787
0,792
0,653
0,859
0,752
0,619
0,652
0,687
0,026
CC
0,709
0,846
0,847
0,599
0,701
0,669
0,630
0,636
0,782
0,749
0,669
0,744
0,758
0,817
0,664
0,673
0,815
0,718
0,818
0,726
0,728
0,017
CGB
0,747
0,870
0,857
0,644
0,670
0,547
0,718
0,562
0,784
0,760
0,773
0,757
0,729
0,892
0,809
0,772
0,744
0,759
0,769
0,735
0,745
0,020
CGM
0,729
0,836
0,845
0,647
0,646
0,486
0,702
0,567
0,784
0,714
0,812
0,807
0,758
0,888
0,779
0,788
0,796
0,696
0,754
0,642
0,734
0,022
*Total – referido ao conjunto dos 717 indivíduos não considerando a raça.
Loci
BM1824
BM4621
BM6444
BM6506
BM757
ETH225
MAF209
MAF23
McM214
McM218
McM357
OarCP20
OarCP34
OarCP49
OarFCB11
OarFCB128
OarFCB20
OarFCB304
OarFCB48
OarHH64
Média
EP
CM
0,721
0,832
0,856
0,605
0,662
0,483
0,763
0,562
0,749
0,682
0,792
0,669
0,655
0,788
0,724
0,726
0,767
0,743
0,737
0,583
0,705
0,021
CMP
0,679
0,877
0,866
0,610
0,701
0,338
0,836
0,477
0,731
0,687
0,802
0,637
0,715
0,843
0,708
0,732
0,803
0,698
0,739
0,702
0,709
0,029
CTQ
0,731
0,840
0,830
0,689
0,707
0,553
0,775
0,504
0,792
0,670
0,771
0,722
0,733
0,837
0,809
0,684
0,828
0,768
0,786
0,717
0,737
0,020
MB
0,698
0,835
0,826
0,582
0,691
0,563
0,743
0,612
0,828
0,763
0,786
0,752
0,713
0,855
0,746
0,739
0,809
0,635
0,784
0,668
0,731
0,019
Tabela 5- Valores do PIC (Polymorphism Information Content) por locus e por raça.
MBB
0,717
0,836
0,821
0,581
0,723
0,619
0,811
0,563
0,757
0,716
0,770
0,680
0,675
0,863
0,780
0,717
0,845
0,774
0,745
0,572
0,728
0,020
MP
0,703
0,865
0,862
0,713
0,664
0,579
0,677
0,643
0,765
0,763
0,753
0,718
0,719
0,786
0,760
0,803
0,771
0,652
0,648
0,707
0,728
0,016
SE
0,616
0,868
0,841
0,584
0,621
0,429
0,833
0,589
0,743
0,685
0,721
0,712
0,722
0,846
0,777
0,761
0,863
0,668
0,751
0,808
0,722
0,025
SL Total* Média
0,708 0,730 0,699
0,804 0,868 0,842
0,764 0,881 0,844
0,684 0,631 0,614
0,754 0,706 0,682
0,342 0,531 0,507
0,738 0,786 0,747
0,569 0,587 0,564
0,807 0,786 0,758
0,730 0,758 0,720
0,761 0,797 0,762
0,799 0,752 0,720
0,693 0,745 0,708
0,824 0,867 0,836
0,758 0,792 0,751
0,749 0,769 0,729
0,816 0,831 0,800
0,674 0,725 0,708
0,712 0,768 0,740
0,778 0,731 0,700
0,723 0,752
0,024
EP
0,014
0,009
0,008
0,015
0,010
0,027
0,017
0,013
0,014
0,014
0,012
0,013
0,012
0,010
0,015
0,012
0,015
0,012
0,014
0,019
ANEXO 3 - Tabelas do capítulo 3
Loci
BM1824
BM4621
BM6444
BM6506
BM757
ETH225
MAF209
MAF23
McM214
McM218
McM357
OarCP20
OarCP34
OarCP49
OarFCB11
OarFCB128
OarFCB20
OarFCB304
OarFCB48
OarHH64
Média
EP
BEDM
0,065
0,049
0,233
0,192
0,211
0,416
0,034
0,090
0,018
0,022
0,371
0,052
0,044
0,155
0,072
0,021
-0,006
0,053
0,081
0,113
0,114
0,026
CA
0,138
0,062
0,336
0,017
-0,017
0,014
-0,049
0,262
-0,009
0,133
0,396
0,013
0,039
0,029
-0,044
0,017
0,021
-0,058
-0,031
0,154
0,071
0,029
CB
0,036
0,010
0,091
-0,073
0,029
0,236
0,085
-0,027
0,087
-0,018
0,389
0,044
-0,011
0,159
-0,035
0,015
-0,034
0,137
0,087
0,096
0,065
0,024
CC
-0,002
-0,035
0,085
0,059
-0,054
-0,030
-0,043
0,092
0,048
0,137
0,638
0,084
0,078
-0,034
0,027
-0,011
0,183
-0,027
-0,081
0,272
0,069
0,036
CGB
-0,002
0,019
0,077
0,052
0,034
0,086
-0,062
-0,012
0,073
0,007
0,287
0,063
0,046
0,016
-0,019
-0,001
0,062
-0,055
-0,024
0,109
0,038
0,017
CGM
0,008
0,019
0,088
-0,017
0,105
0,142
-0,027
0,021
-0,028
0,027
0,437
0,051
-0,037
-0,000
0,137
0,107
-0,008
-0,022
-0,026
0,652
0,081
0,038
CM
0,108
0,071
0,127
0,006
-0,009
0,005
-0,058
0,048
0,000
0,052
0,500
0,142
0,191
0,081
0,193
0,005
-0,013
0,057
0,107
0,268
0,094
0,028
CMP
0,061
0,019
0,070
-0,028
0,017
0,259
-0,035
0,087
0,013
0,033
0,301
0,020
0,071
0,068
0,058
0,007
0,035
-0,025
-0,011
0,007
0,051
0,019
CTQ
-0,021
-0,002
0,104
-0,013
-0,031
0,130
-0,007
0,009
-0,037
0,014
0,546
0,150
0,087
0,001
0,049
0,011
0,064
0,133
-0,017
0,411
0,079
0,034
MB
-0,069
-0,034
0,110
-0,055
0,022
0,017
0,008
-0,068
0,055
-0,002
0,395
0,024
-0,021
0,110
-0,014
-0,033
0,158
0,013
-0,027
0,051
0,032
0,023
MBB
0,054
-0,026
0,190
-0,045
-0,004
0,121
0,054
0,199
0,041
-0,023
0,562
0,013
0,124
0,195
0,009
0,023
0,094
0,082
0,001
0,117
0,089
0,030
Tabela 6 - Valores de FIS por locus e por raça, calculados de acordo com ROBERTSON e HILL (1984).
MP
0,173
0,038
0,165
0,024
0,078
0,371
0,002
0,024
0,120
0,026
0,463
-0,032
0,058
0,004
-0,006
-0,029
0,020
-0,007
-0,032
0,215
0,084
0,030
SE
-0,003
0,006
0,139
-0,013
0,005
0,084
0,033
0,038
0,158
-0,003
0,167
-0,018
-0,049
0,024
0,056
0,082
0,074
-0,024
-0,044
0,195
0,045
0,016
SL
Média
-0,069 0,034
-0,004 0,014
0,199 0,144
0,007 0,008
-0,001 0,028
0,062 0,137
0,035 -0,002
-0,008 0,054
0,009 0,039
0,018 0,030
0,488 0,424
-0,004 0,043
-0,040 0,041
0,144 0,068
0,124 0,043
0,059 0,020
0,065 0,051
0,033 0,021
-0,031 -0,003
0,008 0,191
0,055 0,069
0,027
EP
0,051
0,060
0,054
0,046
0,050
0,045
0,056
0,043
0,054
0,052
0,041
0,051
0,052
0,058
0,055
0,053
0,056
0,051
0,055
0,058
ANEXO 3 - Tabelas do capítulo 3
278
Loci
BM1824
BM4621
BM6444
BM6506
BM757
ETH225
MAF209
MAF23
McM214
McM218
McM357
OarCP20
OarCP34
OarCP49
OarFCB11
OarFCB128
OarFCB20
OarFCB304
OarFCB48
OarHH64
Média
EP
BEDM
0,118
0,142
0,277
0,152
0,176
0,224
0,099
0,246
0,077
-0,001
0,428
0,067
0,134
0,251
0,090
0,053
-0,028
0,005
0,208
0,100
0,141
0,024
CA
0,121
0,147
0,280
0,109
0,050
0,035
-0,054
0,082
0,057
0,018
0,466
0,060
0,066
-0,000
-0,054
0,062
-0,075
-0,098
-0,049
0,194
0,071
0,029
CB
0,014
-0,012
0,220
-0,098
0,026
0,376
0,103
-0,019
0,081
-0,005
0,502
-0,053
-0,006
0,098
-0,019
0,020
-0,067
-0,038
0,081
0,142
0,067
0,033
CC
0,030
-0,073
0,154
0,092
-0,043
-0,036
-0,015
-0,051
0,058
0,148
0,642
0,101
0,157
-0,029
0,060
0,059
0,281
-0,015
-0,101
0,251
0,084
0,038
CGB
-0,040
-0,011
0,113
0,029
0,038
0,146
-0,074
-0,109
0,143
-0,008
0,331
0,147
0,069
0,054
-0,050
0,009
0,076
-0,108
-0,027
0,169
0,045
0,024
CGM
-0,014
0,042
0,095
-0,032
0,111
0,319
-0,058
0,055
-0,032
0,097
0,420
-0,032
-0,032
-0,019
0,109
0,113
0,002
-0,062
-0,033
0,711
0,088
0,043
CM
0,118
0,087
0,181
0,103
-0,009
0,057
-0,078
0,115
-0,022
0,138
0,468
0,100
0,090
0,070
0,335
0,009
-0,072
0,106
0,170
0,460
0,121
0,033
CMP
0,144
0,048
0,121
-0,011
0,043
0,271
-0,055
0,095
0,005
0,030
0,355
0,145
0,073
0,121
0,104
0,043
0,043
-0,044
0,041
0,028
0,080
0,022
CTQ
0,011
0,007
0,215
0,013
-0,063
0,209
0,005
0,085
-0,058
0,018
0,505
0,133
0,090
0,023
0,077
0,082
0,141
0,162
-0,009
0,498
0,107
0,035
MB
-0,038
-0,035
0,166
-0,154
0,069
0,066
0,050
-0,083
0,036
-0,009
0,469
0,079
-0,023
0,152
-0,030
-0,053
0,149
0,018
-0,034
0,112
0,045
0,029
MBB
0,064
-0,054
0,199
-0,033
-0,030
0,246
0,056
0,071
0,094
-0,000
0,697
0,052
0,168
0,147
0,004
0,060
0,138
0,158
0,014
0,152
0,110
0,036
MP
0,204
0,067
0,217
0,012
0,143
0,421
0,055
0,047
0,181
0,062
0,516
-0,058
0,147
0,023
0,042
-0,038
0,053
0,048
-0,004
0,446
0,129
0,036
Tabela 7 - Valores de FIS por locus e por raça, calculados de acordo com WEIR e COCKERHAM (1984).
SE
-0,022
0,026
0,130
0,031
-0,056
0,305
0,077
0,081
0,093
0,015
0,323
-0,040
-0,107
0,046
0,078
0,104
0,083
-0,103
-0,085
0,280
0,063
0,028
SL
Média
-0,009 0,050
-0,009 0,027
0,097 0,176
0,022 0,017
-0,007 0,032
0,144 0,199
0,048 0,011
0,006 0,044
0,068 0,056
-0,016 0,035
0,526 0,475
-0,011 0,049
-0,105 0,052
0,131 0,076
0,097 0,060
0,087 0,044
0,125 0,061
-0,021 0,001
-0,016 0,011
-0,014 0,252
0,057 0,086
0,029
EP
0,051
0,061
0,051
0,047
0,050
0,042
0,056
0,044
0,053
0,052
0,035
0,052
0,053
0,058
0,056
0,052
0,059
0,055
0,057
0,062
ANEXO 3 - Tabelas do capítulo 3
279
ANEXO 3 - Tabelas do capítulo 3
Tabela 8 - Valores da contribuição absoluta (C Abs) e relativa (C Rel) para cada
alelo dos 19 microssatélites.
Loci - Alelo
BM1824 - 170
BM1824 - 172
BM1824 - 173
BM1824 - 174
BM1824 - 176
BM4621 - 131
BM4621 - 137
BM4621 - 139
BM4621 - 141
BM4621 - 145
BM4621 - 147
BM4621 - 149
BM4621 - 151
BM4621 - 153
BM4621 - 155
BM4621 - 157
BM4621 - 159
BM4621 - 161
BM4621 - 163
BM4621 - 165
BM4621 - 167
BM4621 - 169
BM4621 - 171
BM4621 - 173
BM6444 - 117
BM6444 - 121
BM6444 - 127
BM6444 - 129
BM6444 - 131
BM6444 - 133
BM6444 - 135
BM6444 - 137
BM6444 - 139
BM6444 - 141
BM6444 - 143
BM6444 - 145
BM6444 - 147
BM6444 - 149
BM6444 - 151
BM6444 - 153
BM6444 - 155
BM6444 - 157
BM6444 - 159
BM6444 - 161
BM6444 - 163
BM6444 - 165
BM6506 - 191
BM6506 - 193
BM6506 - 195
BM6506 - 197
BM6506 - 199
BM6506 - 201
BM6506 - 203
BM6506 - 205
F1
6
1
0
1
0
2
5
0
4
1
3
3
0
1
1
14
3
3
5
0
3
2
0
0
6
1
14
0
2
2
3
3
0
3
0
0
6
1
0
8
1
120
1
0
1
0
2
2
3
1
1
1
1
0
C Abs
F2
0
21
0
18
1
1
2
0
1
0
0
3
2
0
0
1
5
2
2
1
2
0
0
6
1
3
3
2
0
0
11
0
8
1
5
0
9
7
1
0
3
14
0
1
0
0
3
5
1
2
0
4
0
0
F3
0
2
0
0
1
16
2
0
14
52
1
2
3
0
4
6
6
9
1
0
0
0
2
0
0
4
0
1
4
21
0
0
2
1
1
4
3
2
2
5
0
3
3
0
12
8
5
1
12
0
5
0
0
10
280
F1
340
28
0
13
14
87
357
1
181
21
228
148
15
32
35
434
118
142
339
33
75
153
31
4
183
19
808
13
111
80
61
115
10
155
3
11
203
21
3
301
67
853
50
36
17
12
116
151
109
54
56
68
97
0
C Rel
F2
4
455
9
369
42
31
129
31
22
2
6
120
82
0
5
31
151
73
129
35
32
4
14
130
24
90
118
37
4
13
177
4
246
28
320
1
254
221
22
11
240
77
18
40
3
27
132
313
21
65
8
383
6
2
F3
4
33
31
0
28
399
89
6
442
520
42
80
84
3
169
119
140
352
51
5
3
15
87
7
0
93
2
15
143
474
7
2
47
43
46
142
71
42
43
120
1
13
117
0
226
405
230
39
259
0
268
3
1
690
ANEXO 3 - Tabelas do capítulo 3
Tabela 8 - Valores da contribuição absoluta (C Abs) e relativa (C Rel) para cada
alelo dos 19 microssatélites (continuação).
Loci - Alelo
BM757 - 178
BM757 - 179
BM757 - 180
BM757 - 181
BM757 - 182
BM757 - 183
BM757 - 185
BM757 - 191
BM757 - 197
BM757 - 199
ETH225 - 141
ETH225 - 143
ETH225 - 145
ETH225 - 147
ETH225 - 149
ETH225 - 151
ETH225 - 153
ETH225 - 155
ETH225 - 157
ETH225 - 159
ETH225 - 161
MAF209 - 109
MAF209 - 111
MAF209 - 115
MAF209 - 117
MAF209 - 119
MAF209 - 121
MAF209 - 123
MAF209 - 125
MAF209 - 127
MAF209 - 129
MAF209 - 131
MAF209 - 133
MAF209 - 135
MAF209 - 137
MAF23 - 133
MAF23 - 135
MAF23 - 137
MAF23 - 139
MAF23 - 141
MAF23 - 143
MAF23 - 145
MAF23 - 147
MAF23 - 149
McM214 - 068
McM214 - 074
McM214 - 076
McM214 - 078
McM214 - 080
McM214 - 082
McM214 - 086
McM214 - 088
McM214 - 090
McM214 - 092
McM214 - 094
F1
2
0
2
3
0
1
0
0
12
0
2
0
3
1
14
1
11
2
0
0
1
2
0
0
0
0
1
0
1
6
0
0
13
1
59
2
11
0
6
1
1
12
0
0
0
3
14
6
1
0
2
0
2
0
13
C Abs
F2
7
1
0
0
1
1
1
0
4
1
0
0
0
1
23
2
0
0
1
2
2
5
0
0
1
2
1
0
0
3
1
3
39
0
8
7
2
12
0
0
9
6
2
3
0
0
35
4
1
0
4
4
0
1
13
F3
1
1
29
2
6
1
0
1
1
1
8
1
1
1
8
1
0
0
0
0
1
2
2
0
0
3
15
0
1
5
0
12
1
4
1
4
9
3
1
0
1
1
0
0
0
0
13
4
0
0
2
1
0
1
0
281
F1
78
9
62
132
10
56
31
8
432
0
59
20
112
54
313
61
303
61
12
4
19
87
24
0
24
12
34
91
17
188
43
0
228
112
787
115
378
8
652
34
47
295
24
9
5
244
243
238
25
57
122
2
127
0
306
C Rel
F2
249
66
0
0
35
36
70
0
103
13
10
1
3
26
427
95
2
1
32
40
20
171
2
13
40
46
13
36
0
82
81
108
554
8
86
308
44
427
40
1
270
120
146
190
19
7
481
127
47
2
177
156
10
108
253
F3
18
59
534
51
163
35
34
37
13
14
186
55
14
47
116
57
1
7
1
4
9
43
155
14
0
53
290
0
14
118
14
363
7
317
6
131
197
79
62
11
14
21
0
23
33
22
150
99
5
7
60
38
15
48
3
ANEXO 3 - Tabelas do capítulo 3
Tabela 8 - Valores da contribuição absoluta (C Abs) e relativa (C Rel) para cada
alelo dos 19 microssatélites (continuação).
Loci - Alelo
McM214 - 096
McM214 - 098
McM214 - 100
McM214 - 102
McM214 - 112
McM218 - 143
McM218 - 145
McM218 - 147
McM218 - 149
McM218 - 151
McM218 - 153
McM218 - 155
McM218 - 157
McM218 - 159
McM218 - 161
McM218 - 163
McM218 - 165
OarCP20 - 071
OarCP20 - 073
OarCP20 - 075
OarCP20 - 077
OarCP20 - 079
OarCP20 - 081
OarCP20 - 083
OarCP20 - 085
OarCP20 - 087
OarCP20 - 091
OarCP20 - 093
OarCP20 - 095
OarCP20 - 097
OarCP34 - 112
OarCP34 - 114
OarCP34 - 116
OarCP34 - 118
OarCP34 - 120
OarCP34 - 122
OarCP34 - 124
OarCP49 - 083
OarCP49 - 085
OarCP49 - 087
OarCP49 - 089
OarCP49 - 091
OarCP49 - 093
OarCP49 - 095
OarCP49 - 097
OarCP49 - 099
OarCP49 - 101
OarCP49 - 103
OarCP49 - 105
OarCP49 - 107
OarCP49 - 109
OarCP49 - 111
OarCP49 - 113
OarCP49 - 115
OarCP49 - 117
F1
0
10
12
2
14
5
3
5
0
0
1
22
0
1
1
36
0
0
1
1
4
0
2
1
3
1
0
0
0
1
6
1
10
3
3
1
0
1
0
1
1
3
2
0
0
0
0
1
0
0
12
16
1
0
0
C Abs
F2
0
0
0
3
3
0
42
7
1
0
3
1
3
2
3
99
0
0
0
10
0
22
18
2
2
0
2
2
1
0
3
38
9
0
4
2
0
0
2
1
0
0
3
2
0
2
1
1
7
4
13
2
2
4
0
F3
0
2
5
1
0
12
26
4
2
8
0
2
6
17
3
10
0
1
1
0
3
1
22
2
3
2
0
0
0
2
8
17
8
2
11
1
0
1
3
16
0
5
5
1
1
6
0
43
3
7
4
5
5
5
1
282
F1
4
411
358
108
808
233
33
224
2
0
22
452
0
19
81
285
5
0
80
22
162
6
49
15
83
64
16
4
4
51
193
24
223
167
184
59
2
32
17
58
79
98
103
29
13
6
14
12
22
17
257
488
13
0
4
C Rel
F2
30
7
0
109
118
5
371
251
15
7
92
13
115
54
172
622
40
15
2
344
6
595
358
35
43
21
116
130
40
5
73
486
172
5
193
80
0
18
102
22
4
3
95
101
7
68
33
22
281
142
212
39
39
185
16
F3
2
56
105
50
2
366
192
134
26
390
1
28
180
382
117
55
18
108
77
1
88
14
373
29
71
94
2
7
4
57
177
185
132
64
449
38
2
19
137
570
1
121
133
32
11
195
6
538
100
205
49
94
77
211
103
ANEXO 3 - Tabelas do capítulo 3
Tabela 8 - Valores da contribuição absoluta (C Abs) e relativa (C Rel) para cada
alelo dos 19 microssatélites (continuação).
Loci - Alelo
OarCP49 - 119
OarCP49 - 125
OarCP49 - 133
OarCP49 - 135
OarCP49 - 137
OarCP49 - 139
OarCP49 - 141
OarCP49 - 143
OarFCB11 - 117
OarFCB11 - 121
OarFCB11 - 123
OarFCB11 - 125
OarFCB11 - 127
OarFCB11 - 129
OarFCB11 - 131
OarFCB11 - 133
OarFCB11 - 135
OarFCB11 - 137
OarFCB11 - 139
OarFCB11 - 141
OarFCB11 - 143
OarFCB11 - 145
OarFCB128 - 099
OarFCB128 - 101
OarFCB128 - 111
OarFCB128 - 113
OarFCB128 - 115
OarFCB128 - 117
OarFCB128 - 119
OarFCB128 - 121
OarFCB128 - 123
OarFCB128 - 125
OarFCB128 - 127
OarFCB128 - 129
OarFCB128 - 131
OarFCB20 - 101
OarFCB20 - 105
OarFCB20 - 107
OarFCB20 - 109
OarFCB20 - 111
OarFCB20 - 113
OarFCB20 - 115
OarFCB20 - 117
OarFCB20 - 119
OarFCB20 - 121
OarFCB20 - 123
OarFCB20 - 125
OarFCB20 - 93
OarFCB20 - 95
OarFCB20 - 97
OarFCB20 - 99
OarFCB304 - 142
OarFCB304 - 150
OarFCB304 - 152
OarFCB304 - 154
F1
0
1
0
0
1
2
1
1
0
4
4
0
23
1
1
0
20
0
0
0
1
0
3
0
17
0
1
22
0
1
5
1
0
0
0
1
1
3
0
6
0
1
3
1
0
0
0
0
0
6
25
0
1
1
0
C Abs
F2
2
5
0
0
3
0
8
3
0
2
9
0
1
0
1
1
23
5
4
3
1
2
6
1
16
28
5
3
7
0
8
7
6
1
6
0
5
0
1
2
0
1
0
4
2
1
0
0
21
2
0
0
1
0
0
F3
0
0
1
1
0
1
2
0
0
0
15
0
1
7
1
12
4
0
4
0
0
6
0
0
1
0
0
0
0
66
0
1
2
0
4
2
2
4
0
5
2
0
0
7
1
1
1
0
0
1
4
1
1
0
0
283
F1
3
180
0
4
59
65
60
19
4
100
90
21
612
85
21
18
358
17
4
4
36
3
117
31
343
10
180
774
10
9
118
30
27
4
1
79
42
81
1
240
16
113
258
21
8
0
23
3
17
351
569
4
55
57
0
C Rel
F2
63
540
4
3
158
9
299
53
10
38
160
11
30
4
15
31
320
231
117
130
47
120
192
70
254
709
540
94
330
0
170
288
276
40
208
4
291
13
114
73
3
171
25
109
70
58
2
1
749
94
1
34
25
14
13
F3
2
28
18
23
10
26
68
3
11
5
219
5
10
408
28
358
41
12
106
7
10
227
6
34
14
0
28
5
3
604
2
32
72
4
111
98
99
76
29
123
45
4
0
148
22
59
62
2
0
53
69
49
49
2
14
ANEXO 3 - Tabelas do capítulo 3
Tabela 8 - Valores da contribuição absoluta (C Abs) e relativa (C Rel) para cada
alelo dos 19 microssatélites (continuação).
Loci - Alelo
OarFCB304 - 158
OarFCB304 - 162
OarFCB304 - 164
OarFCB304 - 166
OarFCB304 - 168
OarFCB304 - 170
OarFCB304 - 172
OarFCB304 - 174
OarFCB304 - 176
OarFCB304 - 178
OarFCB304 - 180
OarFCB304 - 182
OarFCB304 - 184
OarFCB304 - 186
OarFCB304 - 188
OarFCB304 - 190
OarFCB304 - 192
OarFCB48 - 140
OarFCB48 - 144
OarFCB48 - 146
OarFCB48 - 148
OarFCB48 - 150
OarFCB48 - 152
OarFCB48 - 154
OarFCB48 - 156
OarFCB48 - 158
OarFCB48 - 160
OarFCB48 - 162
OarFCB48 - 164
OarFCB48 - 166
OarFCB48 - 168
OarFCB48 - 170
OarFCB48 - 172
OarFCB48 - 174
OarHH64 - 124
OarHH64 - 126
OarHH64 - 128
OarHH64 - 130
OarHH64 - 132
OarHH64 - 134
OarHH64 - 135
OarHH64 - 136
OarHH64 - 138
OarHH64 - 140
OarHH64 - 142
Total
Valor Maior
Valor maior em %
F1
1
0
0
3
1
0
2
2
2
0
5
0
0
42
4
2
0
0
5
0
2
3
6
5
1
0
8
0
0
0
7
1
0
0
9
34
7
8
8
11
3
1
6
0
1
990
120
12,1
C Abs
F2
1
3
0
2
1
0
5
1
0
0
1
0
0
4
8
4
0
1
0
0
1
1
3
0
5
1
1
1
3
0
19
1
1
0
3
0
1
7
0
3
10
1
1
6
0
998
99
9,9
F3
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
3
2
58
9
0
0
10
0
1
0
1
0
1
5
0
1
0
3
12
0
3
1
2
1
1
1
40
3
4
0
1
0
1
0
2
1001
66
6,6
284
F1
52
2
3
144
30
26
233
114
126
7
399
4
0
683
196
66
0
1
172
6
103
101
149
219
41
24
191
0
15
6
198
39
5
33
343
573
87
355
357
485
180
67
281
9
41
30262
853
2,8
C Rel
F2
41
188
5
57
45
0
409
23
27
15
71
10
2
49
305
86
2
31
0
35
35
26
51
3
137
64
10
22
69
9
418
42
78
8
78
2
8
236
4
103
540
54
26
232
1
27427
749
2,7
F3
0
7
19
0
1
70
0
2
18
3
167
59
690
93
0
8
690
6
24
12
28
3
18
143
1
22
2
84
240
0
62
18
101
73
14
8
355
80
126
7
28
3
21
14
74
23733
690
2,9
ANEXO 4
Fenogramas obtidos com o método UPGMA
ANEXO 4 - Fenogramas obtidos com o método UPGMA
CMP
SL
CB
SE
MBB
CA
BEDM
24
30
90
24 11
16
20
2
59
MB
CTQ
CM
CC
CGM
CGB
0.01
MP
Figura 1 - Fenograma construído a partir da distância genética Drey pelo método UPGMA
MBB
CMP
SE
SL
CA
26
613
6
6611
MB
11
BEDM
CC
24
14
CB
89
CGM
CGB
MP
CM
0.01
CTQ
Figura 2 - Fenograma construído a partir da distância genética DL pelo método UPGMA
287
ANEXO 4 - Fenogramas obtidos com o método UPGMA
SL
CB
MP
MB
BEDM
CA
85
3
CC
70
MBB
38
11
18
512
64
CTQ
CMP
CM
SE
CGM
0.01
CGB
Figura 3 - Fenograma construído a partir da distância genética DA pelo método UPGMA
SL
MP
MB
BEDM
CB
CA
79
CGB
29 6
57
10
15
317
7
75
CC
SE
CGM
CMP
MBB
CM
0.1
CTQ
Figura 4 - Fenograma construído a partir da distância genética Dc pelo método UPGMA
288
ANEXO 4 - Fenogramas obtidos com o método UPGMA
SL
CB
BEDM
CC
MB
27
17
17
18
4
9
1
CMP
51
97
CA
MP
SE
0.01
CGB
MBB
CTQ
CM
CGM
Figura 5 - Fenograma construído a partir da distância genética DS pelo método UPGMA
289
ANEXO 5
Tabelas do capítulo 4
ANEXO 5 - Tabelas do capítulo 4
Tabela 1 - Ordenadas dos nós do dendograma de WEITZMAN baseadas nas
distâncias DS e DE.
Representativa
CM
CGB
MP
CMP
BEDM
MP
SL
SL
MB
CB
CB
CA
CA
DS
Ligação Distância Acumulada
CTQ
0,045
0,045
CGM
0,066
0,111
CGB
0,080
0,191
MBB
0,089
0,280
CM
0,090
0,370
BEDM
0,093
0,463
SE
0,101
0,564
CMP
0,101
0,664
MP
0,104
0,768
CC
0,125
0,893
SL
0,144
1,036
CB
0,213
1,250
MB
0,235
1,485
DE
Representativa Ligação Distância Acumulada
CM
CTQ
0,030
0,030
CGB
CGM
0,038
0,068
BEDM
CGB
0,050
0,118
MBB
CMP
0,053
0,171
MBB
SE
0,054
0,225
MP
BEDM
0,056
0,280
MB
MP
0,059
0,339
MBB
CM
0,062
0,401
CC
MBB
0,068
0,469
CB
CC
0,076
0,545
MB
SL
0,084
0,629
CB
MB
0,119
0,748
CA
CB
0,138
0,885
Ilustração 2 - Dendograma de WEITZMAN entre as 14 raças portuguesas de ovinos,
baseado na distância DS.
293
ANEXO 5 - Tabelas do capítulo 4
Tabela 2 - Valores da diversidade marginal e ordem de prioridade de conservação,
calculados a partir das distâncias DS e DE.
DS
V(S)
Raça
BEDM
CA
CB
CC
CGB
CGM
CM
CMP
CTQ
MB
MBB
MP
SE
SL
1,485
V(S\i)
1,394
1,257
1,335
1,367
1,414
1,419
1,418
1,394
1,441
1,260
1,396
1,389
1,390
1,377
DE
dV(i)
0,091
0,228
0,150
0,118
0,072
0,066
0,067
0,092
0,045
0,226
0,089
0,096
0,095
0,108
dV(i)(%)
6,1
15,4
10,1
8,0
4,8
4,5
4,5
6,2
3,0
15,2
6,0
6,5
6,4
7,3
0,885
V(S-i)
0,830
0,748
0,785
0,815
0,842
0,847
0,834
0,832
0,856
0,784
0,826
0,830
0,831
0,813
dV(i)
0,055
0,138
0,100
0,070
0,044
0,038
0,051
0,053
0,030
0,102
0,060
0,056
0,054
0,073
Ordem de prioridade
dV(i) (%)
6,2
15,6
11,3
8,0
5,0
4,3
5,8
6,0
3,3
11,5
6,7
6,3
6,1
8,2
DS
CA
MB
CB
CC
SL
MP
SE
CMP
BEDM
MBB
CGB
CM
CGM
CTQ
DE
CA
MB
CB
SL
CC
MBB
MP
BEDM
SE
CMP
CM
CGB
CGM
CTQ
V(S) - Diversidade total; V(S\i) – Diversidade total sem a raça i; dV(i) e dV(i)(%)- perda de diversidade, absoluta e relativa
("marginal"), respectivamente, associada ao desaparecimento da raça i.
Tabela 3 - Valores da diversidade marginal e ordem de prioridade de
conservação, considerando um grupo seguro constituído pelas raças CTQ, MB e
SE, com base nas distâncias DS e DE.
DS
V(S)
Raça
1,485
V(S\i)
dV(i)
DE
dV(i)
dV(i)
(%)
(%Seg)
Seguro
1,115
0,370
24,9
Seguro + i
BEDM
CA
CB
CC
CGB
CGM
CM
CMP
MBB
MP
SL
1,025
0,912
0,988
0,992
1,043
1,049
1,024
1,026
1,026
1,020
0,983
0,461
0,574
0,497
0,493
0,442
0,437
0,461
0,459
0,460
0,466
0,503
31,0
38,6
33,5
33,2
29,8
29,4
31,1
30,9
31,0
31,3
33,9
24,4
54,9
34,3
33,1
19,3
17,9
24,6
24,0
24,2
25,7
35,8
0,885
V(S-i)
dV(i)
Ordem prioridade
dV(i)
dV(i)
(%)
(%Seg)
0,700
0,185
20,9
0,645
0,562
0,594
0,630
0,656
0,662
0,638
0,647
0,641
0,643
0,609
0,240
0,323
0,292
0,256
0,229
0,223
0,247
0,238
0,244
0,242
0,277
27,1
36,5
33,0
28,9
25,9
25,2
27,9
26,9
27,6
27,3
31,2
29,8
74,4
57,5
38,0
23,7
20,5
33,5
28,7
31,8
30,7
49,3
DS
DE
CA
SL
CB
CC
MP
CM
BEDM
MBB
CMP
CGB
CGM
CA
CB
SL
CC
CM
MBB
MP
BEDM
CMP
CGB
CGM
V(S) - Diversidade total; V(S\i) – Diversidade total sem a raça i; dV(i) e dV(i)(%)- perda de diversidade, absoluta e relativa,
respectivamente, associada ao desaparecimento da raça i comparativamente ao total; dV(i)(%Seg)– Perda de diversidade relativa,
associada ao desaparecimento da raça i quando consideramos apenas a conservação do grupo seguro {[dV(seguro+i)dV(seguro)]/dV(seguro)*100}.
294
ANEXO 6
Tabelas do capítulo 5
ANEXO 6 - Tabelas do capítulo 5
Tabelas 1 – Eficácia de Atribuição e Erro Tipo II para cada um dos métodos de
atribuição testados na opção “as is”.
Método Bayesiano (“as is”)
N BEDM CA CB CC CGB CGM CM CMP CTQ MB MBB MP
BEDM
45
CA
53
CB
50
CC
31
CGB
50
CGM
51
CM
48
1
39
1
1
1
42
1
1
MB
59
1
MBB
39
MP
47
SE
51
1
1
1
47
1
1
1
45
2
1
3
86,7
46
2
1
1
1
92,2
93,8
3
1
1
2
0,3
0,5
1,1
1,0
54
1
1
2
33
1
84,6
1
1
42
89,4
1
0,8
86,8
87,5
1
0,6
1,1
91,5
88,2
45
1
0,3 0,8 0,3
1
3
49
2
93,5
84,0
1
1
2
1
2
1
0,2
EA
100,0
29
53
50
1
50
56
683
2
53
CTQ
Total
1
SL
100,0
CMP
SL
1
SE
1,1
49
0,9 0,5
Erro Tipo II
98,0
60
NIMA
N – Número de animais, EA – Eficácia de atribuição (%), NIMA – Número de indivíduos mal atribuídos
Método Frequentista (“as is”)
N BEDM CA CB CC CGB CGM CM CMP CTQ MB MBB MP
BEDM
45
1
CA
53
CB
50
CC
31
CGB
50
CGM
51
46
2
CM
48
1
44
CMP
53
CTQ
56
1
3
1
MB
59
1
1
1
MBB
39
MP
47
SE
51
1
1
SL
50
1
1
Total
683
0,8
0,3 1,7 0,6
36
1
1
1
1
1
SE
2
SL
EA
1
80,0
100,0
53
1
47
1
1
1
27
1
1
1
1
40
1
1
3
4
2
1
2
3
1
1
41
2
1
50
1
2
2
84,7
2
30
1
3
76,9
1
2
38
1
1
1
1
0,3
1,9
0,8
1,8
0,8
1,9
2
80,9
86,3
44
1,4
46
1,7 0,5
Erro Tipo II
N – Número de animais, EA – Eficácia de atribuição (%), NIMA – Número de indivíduos mal atribuídos
297
79,2
73,2
2
1,1
91,7
2
2
2
80,0
90,2
2
42
1
2
1
1
87,1
1
3
1
94,0
1
1
2
1
92,0
99
NIMA
ANEXO 6 - Tabelas do capítulo 5
Método Distância DAS (“as is”)
N BEDM CA CB CC CGB CGM CM CMP CTQ MB MBB MP
BEDM
45
CA
53
CB
50
CC
31
CGB
22
2
10
1
4
1
SE
SL
EA
2
3
48,9
100,0
53
100,0
50
1
2
1
23
50
7
9
1
CGM
51
3
9
CM
48
CMP
53
2
2
5
CTQ
56
3
11
MB
59
3
3
MBB
39
2
3
MP
47
6
6
SE
51
1
SL
50
1
1
Total
683
0,5
1
3
23
1
1
1
1
1
1
3
1
26
6
1
1
1
43
1
4
2
12
37
1
17
2
2
4
7
1
4
2
1
5,1 11,1 0,8
0,2
0,9
6,1
1
1
1
2
1
46,0
1
1
1
1
2
74,2
1
1
2
1
49
3
69,8
30,4
1
2
83,1
2
20
1
4
51,3
3
3
1
21
2
44,7
2
1
37
2
72,5
1
1
40
80,0
2,7 1,6
222
2,1
1
89,6
1
3
51,0
0,6
1,8
0,8
0,9
Erro Tipo II
NIMA
N – Número de animais, EA – Eficácia de atribuição (%), NIMA – Número de indivíduos mal atribuídos
Método Distância DC (“as is”)
N BEDM CA CB CC CGB CGM CM CMP CTQ MB MBB MP
BEDM
45
3
CA
53
CB
50
CC
31
CGB
50
CGM
51
3
CM
48
1
CMP
53
1
2
CTQ
56
3
5
MB
59
MBB
39
MP
47
SE
51
1
1
SL
50
1
1
Total
683
0,6
1,1 3,4 0,5
34
1
2
1
SE
2
SL
EA
2
75,6
100,0
53
100,0
50
1
1
1
1
2
26
1
36
1
2
2
37
6
2
1
1
1
1
2
3
44
1
11
1
29
1
1
1
1
1
0,5
0,3
1
1
3
2
2
1
5,0
2
3
2
1
2
44
1
1
83,9
1,8
3
1,1
1
72,0
72,5
1
3
50
2
2
1
0,5
91,7
1
83,0
1
51,8
4
1
84,7
27
1
2
69,2
2
35
1
2
2,1
2,1
74,5
41
2
80,4
1
37
92,5
1,0 0,9
130
Erro Tipo II
N – Número de animais, EA – Eficácia de atribuição (%), NIMA – Número de indivíduos mal atribuídos
298
NIMA
ANEXO 6 - Tabelas do capítulo 5
Método Distância DA (“as is”)
N BEDM CA CB CC CGB CGM CM CMP CTQ MB MBB MP
BEDM
45
CA
53
5
30
1
1
1
2
SE
SL
EA
3
2
66,7
100,0
53
CB
50
CC
31
100,0
CGB
50
CGM
51
4
CM
48
1
44
CMP
53
1
3
3
CTQ
56
3
MB
59
MBB
39
MP
47
SE
51
SL
Total
50
1
1
1
24
2
1
1
2
30
1
1
2
4
34
7
2
3
3
1
60,0
2
1
1
66,7
1
91,7
1
81,1
2
1
12
1
27
1
1
1
49
2
2
1
1
3
2
26
1
3
4
3
1
1
3
29
1
3
1
3
50
1
1
1
683
0,6
1,6 4,9 0,5
5
1
1
1
2
3
1
0,2
0,3
5,4
2,5
1
3
1
1,8
0,6
3
1
2,2
1,7
48,2
1
1
83,1
66,7
61,7
40
1
78,4
2
45
90,0
2,1 0,8
159
Erro Tipo II
N – Número de animais, EA – Eficácia de atribuição (%), NIMA – Número de indivíduos mal atribuídos
299
77,4
2
43
2
1
NIMA
ANEXO 6 - Tabelas do capítulo 5
Tabelas 2 – Eficácia de Atribuição e Erro Tipo II para cada um dos métodos de
atribuição testados na opção “Leave one out”.
Método Bayesiano (“Leave one out”)
N BEDM CA CB CC CGB CGM CM CMP CTQ MB MBB MP
BEDM
45
CA
53
CB
50
1
CC
31
2
CGB
50
3
CGM
51
2
CM
48
1
CMP
53
CTQ
56
MB
59
1
MBB
39
1
MP
47
2
1
26
2
SE
51
1
SL
50
3
Total
683
2,7
2
2
15
3
3
1
3
57,8
4
1
1
1
2
1
70,0
1
48,4
2
1
1
3
1
1
1
32
2
1
1
3
1
5
1
64,0
2
4
27
3
1
3
3
1
3
52,9
1
2
1
1
1
3
1
1
1
33
2
7
2
1
1
1
4
3
30
4
1
2
5
4
2
10
1
3
2
EA
98,1
3
35
1
1
SL
1
52
1
3
SE
1
1
2
3
1
0,8 2,1 1,2
4
3,3
68,8
1
56,6
4
37,5
21
1
6
5
3
44
1
7
1
74,6
1
5
3
17
2
3
43,6
2
2
6
2
22
1
46,8
1
2
2
34
1
1
1
2
3
3
1
1
2
3
2,7
3,6
2,4
6,4
2,2
3,6
4,9
66,7
38
76,0
3,2 1,6
257
Erro Tipo II
NIMA
N – Número de animais, EA – Eficácia de atribuição (%), NIMA – Número de indivíduos mal atribuídos
Método Frequentista (“Leave one out”)
N BEDM CA CB CC CGB CGM CM CMP CTQ MB MBB MP
BEDM
45
CA
53
CB
50
CC
31
2
CGB
50
1
CGM
51
1
CM
48
1
CMP
53
1
CTQ
56
3
22
2
1
1
3
1
2
3
2
EA
1
2
48,9
98,1
1
3
19
1
2
29
1
2
2
1
5
2
4
22
5
2
1
2
32
1
9
1
1
4
1
4
29
4
4
1
3
1
13
2
20
1
1
1
1
1
1
2
3
4
1
2
59
1
1
1
39
1
1
2
MP
47
SE
51
1
2
SL
50
2
1
1
1
Total
683
1,7
0,8 3,2 1,8
3,5
1,3
3
2
1
5,4
86,0
2
1
MBB
1
3
1
MB
3
1
1
43
1
1
SL
1
52
1
4
SE
2
3
3
4
1
5
61,3
1
58,0
43,1
2
1
66,7
2
1
2
2
54,7
5
4
1
1
35,7
44
3
5
2
3
16
1
6
1
41,0
2
3
4
23
1
1
48,9
3
2
1
4
1
34
1
2
1
2,5
5,7
1,9
Erro Tipo II
4
4,3
2,8
74,6
66,7
37
74,0
4,7 1,4
261
NIMA
N – Número de Animais, EA – Eficácia de atribuição (%), NIMA – Número de indivíduos mal atribuídos
300
ANEXO 6 - Tabelas do capítulo 5
Método Distância DAS (“Leave one out”)
N BEDM CA CB CC CGB CGM CM CMP CTQ MB MBB MP
BEDM
45
CA
53
CB
50
CC
31
CGB
8
4
17
1
1
7
1
SE
SL
EA
2
4
17,8
100,0
53
1
49
1
2
8
10
2
50
8
10
3
11
CGM
51
4
11
CM
48
1
8
CMP
53
3
8
5
1
1
3
6
1
2
10
8
2
1
1
1
31
2
3
1
7
28
1
1
1
2
1
3
1
22,0
1
3
4
2
19,6
1
3
3
56
5
14
2
15
1
5
2
MB
59
3
4
1
1
3
1
43
MBB
39
2
5
2
2
2
1
3
MP
47
6
10
1
4
4
6
SE
51
1
10
2
2
2
SL
50
2
1
5
1
2
3
1
1
Total
683
0,6
1,7
8,8
4,1
3,0
1,7
1
6,3 17,4 1,4
0,5
1,3
32,3
1
CTQ
1
1
3
98,0
1
64,6
1
4
3
52,8
8,9
1
2
72,9
15
1
5
38,5
1
9
5
19,1
1,1
32
2
62,7
2
32
64,0
4,6 2,2
347
Erro Tipo II
NIMA
N – Número de animais, EA – Eficácia de atribuição (%), NIMA – Número de indivíduos mal atribuídos
Método Distância DC (“Leave one out”)
N BEDM CA CB CC CGB CGM CM CMP CTQ MB MBB MP
BEDM
45
6
CA
53
CB
50
CC
31
CGB
50
CGM
51
8
CM
48
2
CMP
53
1
6
CTQ
56
3
8
MB
59
1
1
3
MBB
39
2
MP
47
SE
51
1
SL
50
2
3
Total
683
1,3
2,7 9,3 0,8
17
2
1
2
4
2
2
2
SL
EA
4
3
37,8
1
52
1
48
2
SE
2
4
13
4
7
2
1
17
1
4
2
2
3
5
20
8
2
2
37
2
3
1
7
34
1
1
18
3
11
5
1
5
19,6
1
2
1
44
2
2
2
74,6
1
4
4
2
17
1
4
1
1
4
1
1
96,0
1
1
2
98,1
41,9
2
3
1
34,0
3
1
9
39,2
2
77,1
1
1
1
64,2
43,6
5
4
5
4
1
4
3
19
2
1
6
1
3
1
1
1
1
34
1
66,7
1
4
2
1
2
3
32
64,0
1,3
8,5
5,2
3,0
1,6
5,5 1,1
288
0,3
3,0
1,9
40,4
Erro Tipo II
N – Número de animais, EA – Eficácia de atribuição (%), NIMA – Número de indivíduos mal atribuídos
301
NIMA
ANEXO 6 - Tabelas do capítulo 5
Método Distância DA (“Leave one out”)
N BEDM CA CB CC CGB CGM CM CMP CTQ MB MBB MP
BEDM
45
CA
53
CB
50
CC
31
CGB
50
CGM
51
CM
48
CMP
53
6
23
2
2
2
2
2
2
SE
SL
EA
2
2
51,1
100,0
53
1
48
2
2
2
16
3
6
2
17
5
2
1
1
1
1
5
1
1
CTQ
56
1
3
7
1
MB
59
2
1
1
1
MBB
39
2
MP
47
SE
51
1
2
SL
50
1
2
Total
683
1,6
2,2 6,5 1,5
5
1
1
2
4
4
4
20
8
3
2
37
1
4
1
2
7
31
1
1
1
17
3
13
1
2
4
2
1
1
96,0
1
51,6
3
3
2
34,0
3
1
7
39,2
1
77,1
1
1
2
2
1
4
1
1
43
3
6
1
58,5
23,2
72,9
1
3
4
3
17
1
4
5
2
3
4
3
22
1
3
2
1
1
1
2
36
2
70,6
1
2
1
2
1
3
37
74,0
1,4
8,3
3,5
3,7
1,8
4,0 1,4
270
1
0,9
1
1
3,1
2,7
1
46,8
Erro Tipo II
N – Número de animais, EA – Eficácia de atribuição (%), NIMA – Número de indivíduos mal atribuídos
302
43,6
NIMA
ANEXO 6 - Tabelas do capítulo 5
303
ANEXO 6 - Tabelas do capítulo 5
304
ANEXO 6 - Tabelas do capítulo 5
305