FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE
PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS
FISIOLOGIA ANIMAL COMPARADA
ESTUDO COMPARATIVO DO BENZO[A]PIRENO E SUA AÇÃO FOTODINÂMICA EM
LINHAGENS CELULARES, UTILIZANDO AS RADIAÇÕES UVA OU VISÍVEL
Daza de Moraes Vaz Batista Filgueira
Tese defendida no âmbito do Programa de
Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas –
Fisiologia Animal Comparada como parte
dos requisitos para obtenção do título de
MESTRE em Fisiologia Animal Comparada
Orientadora: Dra. Gilma Santos Trindade
RIO GRANDE
2006
AGRADECIMENTOS
Agradeço com todas as forças, a minha família. À minha mãe, pelo exemplo de vida, pela
educação que me deu e pela força que dela herdei. Ao meu pai, pelo companheirismo,
“corujism o” e por ter m e ensinado a sonh ar (por que não a voar?). Tia Dira, Tio Paulo,
Fabinho e Franklin, à família Moraes Vaz pelo carinho, preocupação e torcida.
Com toda intensidade agradeço a ti, Marcos, meu grande amor, pela amizade, cumplicidade, e
incansável companheirismo. Agradeço pela família que conquistei junto a ti: D. Jane, S. Luiz,
M arcelo, A dri, G abriel e M arina (“D ina”), m eus presentes de D eus.
Aos meus amigos Karen Lose – minha mana (sofrendo à distância), Karen Bandeira (sofrendo
pertinho), Diego e Patrícia, muito obrigada pelo apoio. Ao meu grande amigo, S. Roni, pelas
horas de conversa e distração.
À minha orientadora, Gilma, pela amizade, pelo exemplo de vida e principalmente por
permitir que nós cresçamos não só como pesquisadoras, mas principalmente, como pessoas.
Trabalhar contigo é uma honra. Agradeço profundamente a toda a tua família, pela paciência,
compreensão e por compartilharem conosco a pessoa maravilhosa que tu és.
A L aura e ao Z é, pelo carinho, e por a toda preocupação, m uito obrigada. “P erfecto”!
Ao professor Luiz Eduardo, Carioca, pela confiança, dedicação e disposição.
Meus mais sinceros agradecimentos aos mestres do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Fisiológicas, por todo auxílio na construção de meu conhecimento.
Aos mais que colegas de laboratório, amigos, Ana Paula, Bia, Caren, Glauce, Kiti, Maikel,
Márcio, Michele (chefinha), Thaís – essa sim é uma equipe nota 1000.
Meu muito obrigada à Prof ª Adriana Vallochi, pela disposição e entusiasmo.
Gostaria de agradecer aos meus colegas do DCF e aos meus colegas patrocinadores, valeu
pela força. Crescer junto com vocês foi fundamental.
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Aos técnicos, Fábio, Black, D. Jú, Rê, Loraine, Robaldo. As Marias que me acompanharam
diariamente, Maria Olsen e especialmente a Maria da Graça, por toda a torcida, preocupação e
dedicação.
Ao meu professor de inglês, Tony, pela amizade, por todo esforço e dedicação.
Agradeço a todos que me amam, pela paciência e por tentarem compreender a minha
ausência.
E o meu mais profundo agradecimento a Deus, pelas oportunidades e pessoas maravilhosas
que colocou em minha vida. Obrigada senhor, pelo dom da VIDA.
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Índice
Lista de abreviaturas ............................................................................................................... 5
Resumo Geral ........................................................................................................................... 6
Introdução Geral ...................................................................................................................... 8
Objetivos ................................................................................................................................. 16
Objetivo Geral ....................................................................................................................... 16
Objetivos Específicos ............................................................................................................ 16
Referências .............................................................................................................................. 17
C om m u n ication a ser su b m etid a à revista “T oxicology in V itro” ..................................... 23
A comparative study of Benzo[a]pyrene and its photodynamic action in MDR and nonMDR cell lines, under UVA or visible radiations ................................................................ 24
Abstract ................................................................................. Error! Bookmark not defined.
1. Introduction ....................................................................... Error! Bookmark not defined.
2. Materials and methods ...................................................... Error! Bookmark not defined.
2.1. Cells and culture conditions ........................................ Error! Bookmark not defined.
2.2. Treatment of cells ........................................................ Error! Bookmark not defined.
2.2.1 Benzo[a]pyrene exposure ....................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.2 UVA or PAR exposure ............................................ Error! Bookmark not defined.
2.3. GC/MS analyses of BaP exposure solutions ............... Error! Bookmark not defined.
2.4 Assessment of the sensitivity of the two cell lines to BaP ............ Error! Bookmark not
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2.5. Statistical analysis ....................................................... Error! Bookmark not defined.
3. Results ............................................................................... Error! Bookmark not defined.
4. Discussion ......................................................................... Error! Bookmark not defined.
5. References ......................................................................... Error! Bookmark not defined.
A rtigo a ser su b m etid o à revista “T oxicology in V itro” ..................................................... 25
Photodynamic action of Benzo[a]pyrene in K562 cells ....................................................... 26
Abstract ................................................................................. Error! Bookmark not defined.
1. Introduction ....................................................................... Error! Bookmark not defined.
2. Materials and methods ...................................................... Error! Bookmark not defined.
2.1. Cell line and culture conditions .................................. Error! Bookmark not defined.
2.2. GC/MS analysis ........................................................... Error! Bookmark not defined.
2.3. Treatment of cells ........................................................ Error! Bookmark not defined.
2.3.1 Benzo[a]pyrene exposure ....................................... Error! Bookmark not defined.
2.3.2 UVA exposure ......................................................... Error! Bookmark not defined.
2.4. Kinetics of BaP by K562 cells ..................................... Error! Bookmark not defined.
2.5 Assessment of the sensitivity of the K562 cell line to BaP .......... Error! Bookmark not
defined.
2.6. Oxidative effects of benzo[a]pyrene ............................ Error! Bookmark not defined.
2.6.1 Assessment of intracellular ROS formation ........... Error! Bookmark not defined.
2.6.2 Determination of lipid peroxidation (LPO)............ Error! Bookmark not defined.
2.6.3 DNA-protein cross-link .......................................... Error! Bookmark not defined.
2.6.4 Single cell electrophoresis (Comet) assay.............. Error! Bookmark not defined.
2.7. Statistical analysis ....................................................... Error! Bookmark not defined.
3. Results ............................................................................... Error! Bookmark not defined.
4. Discussion ......................................................................... Error! Bookmark not defined.
5. References ......................................................................... Error! Bookmark not defined.
Conclusões Gerais .................................................................................................................. 27
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Lista de abreviaturas
8-OHdG – 8-hidroxi-2’deoxiguanosina
A431 – Carcinoma epidérmico humano
AhR – Receptor para hidrocarbonetos aromáticos
BaP – Benzo[a]pireno
BaP+PAR – Ação fotodinâmica do Benzo[a]pireno associado com luz visível
BaP+UVA – Ação fotodinâmica do Benzo[a]pireno associado com radiação UVA
BaP-7,8-DHD – BaP-trans-7,8-dihidrodiol
BaP-PDA- Ação fotodinâmica do Benzo[a]pireno
BPDE – 7,8-diol-9,10-epóxido-benzo[a]pireno
BPQs – Benzo[a]pireno-quinonas
CHP – Cumeno hidroperóxido
DL50 – Dose letal para 50 % de células
DMSO – Dimetilsulfóxido
DNAPC - DNA-proteína crosslink
EGF – Fator de crescimento epidérmico
EROs/ROS – Espécies reativas de oxigênio
FU – Unidade de fluorescência
GC/MS – Cromatografia gasosa/Espectrofotômetro de massa
GPx – Glutationa peroxidase
GSH – Glutationa
H2DCF-DA - 2´,7´-diclorofluoresceína diacetato
Hepa1c1c7 – Hepatoma de rato
HMEC – Célula mamária humana normal
LPO – Lipídeos peroxidados/ lipid peroxidation
MCF-10A – Célula carcinoma epidérmico humano
MCF-7 – Célula carcinoma mamário humano
MDR – Resistência a múltiplas drogas
PAH – Hidrocarboneto aromático policíclico
PAR – Luz visível
PBS – Tampão fosfato salino
PDA – Ação fotodinâmica
Pgp – Glicoproteína P
SOD – Superóxido dismutase
US EPA – Agência Norte Americana de Proteção Ambiental
UV – Radiação ultravioleta
UVA – Radiação ultravioleta A
UVB – Radiação ultravioleta B
UVC – Radiação ultravioleta C
VCR – Vincristina
α -GST – Glutationa-S-transferase α
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Resumo Geral
O benzo[a]pireno (BaP) é um hidrocarboneto aromático policíclico (PAH) amplamente
diststribuído no ambiente e é considerado o mais fototóxico entre os PAHs. Por outro lado, a
ação fotodinâmica é a fotooxidação de moléculas biológicas na presença de oxigênio e um
fotossensibilizador. Tendo em vista que os PAHs podem agir como fotossensibilizadores, o
objetivo deste trabalho foi avaliar a ação fotodinâmica do BaP associado as radiações UVA
ou visível (PAR) nas linhagens celulares K562 (células tumorais quimiosensíveis ditas nãoMDR) e Lucena (células tumorais quimioresistentes , ditas MDR) através da análise do
número de células viáveis e viabilidade celular. Para isso, três tratamentos foram realizados.
O primeiro deles, apenas com BaP em diferentes concentrações (1,08; 2,17; 4,34 ou 8,68
µg/mL) sem receber irradiação. E os outros dois, onde as células além do BaP foram
irradiadas com 1J/cm² de UVA ou de PAR. Além disso, para a linhagem K562, foi
demonstrada a cinética de entrada do BaP e foram realizados testes para verificar a geração de
EROs, produção de lipídeos peroxidados (LPO), dano de DNA (DNA-proteína cross-link e
quebras no DNA). Para estes testes as células foram incubadas por 18 horas com 2,17µg/mL
BaP e irradiadas ou não com 1J/cm² UVA. O número de células viáveis e viabilidade celular
foi avaliado pelo método de exclusão por azul de trypan. Os tratamentos com BaP (sem
irradiação) não alteraram o número de células viáveis nem a viabilidade para ambas as
linhagens celulares (p<0,05). Entretanto, ambos o número de células viáveis e a viabilidade
celular foram alterados pelo tratamento BaP+UVA (p>0,05), já para o tratamento de
BaP+PAR somente o número de células viáveis diminuiu (p>0,05), o que sugere a ocorrência
de inibição de proliferação. Para a linhagem K562, com 18 horas de incubação, houve o maior
acúmulo de BaP e ainda para esta linhagem depois da exposição ao BaP+UVA, houve um
aumento na peroxidação lípidica (controle 14,343,19; BaP+UVA 54,0811,17 nmol
CHP/mg pellet). Quanto a análise de danos de DNA, houve diferença significativa na
6
porcentagem de DNA-proteína cross-link após os tratamentos com BaP, UVA e BaP+UVA
quando comparados ao controle (p>0,05) e um aumento nas quebras no DNA nas células
tratadas com BaP+UVA (controle: 7,27±2,72; BaP+UVA: 58,61±11,47 score). Sendo assim,
sugerimos que os efeitos da associação BaP+UVA foram obtidos pelos dois principais
mecanismos da ação fotodinâmica: através do mecanismo tipo II (capaz de produzir oxigênio
singlete e danificar preferencialmente DNA) e do mecanismo tipo I (envolvendo outras
espécies reativas de oxigênio).
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Introdução Geral
Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAH) são lançados no ambiente através
de fontes naturais, como vulcões ou, na maioria das vezes, pela ação antropogênica. Isto
ocorre durante o processo de refinamento ou queima incompleta de combustíveis fósseis, por
exemplo, queima de carvão, petróleo, fumaça de cigarro, incineração de plantas, tráfego de
automóveis (Cerniglia et al., 1979; Lyons et al., 2002; Yan et al., 2004).
Existem mais de 100 diferentes PAHs conhecidos, porém apenas 16 são considerados
como poluentes prioritários pela United States Environmental Protection Agency (US EPA);
entre eles, o benzo[a]pireno (BaP) é considerado o mais fototóxico (Schirmer et al., 1998).
Por si só, o BaP é relativamente não tóxico, porém quando metabolicamente ativado,
torna-se carcinogênico (Liu et al., 1998). BaP é formado por 5 anéis benzênicos e tem peso
molecular de 252,31.
Os efeitos carcinogênicos do BaP têm sido discutidos para o homem e para os outros
animais bem como para os sistemas celulares de mamíferos (Tokiwa et al., 1993). É sabido
também que o BaP modula a expressão de mais de 12 genes, entre eles os membros do
citocromo p450, bcl-2, e p53 (Hsing et al., 2000; Nebert & Gonzalez, 1987).
Ko e colaboradores (2004), observaram em Hepa1c1c7 (hepatoma de rato) que células
tratadas com BaP apresentam uma diminuição na expressão de Bcl-2 e uma fosforilação de
p53, demonstrando que BaP induz a apoptose neste tipo celular.
Além disso, foi demonstrado para o BaP a capacidade de elevar os níveis de Ca 2+ em
células HMECs (célula mamária humana normal) e MCF-10A (carcinoma epidérmico
humano) através do aumento da atividade da via de sinalização do Fator de Crescimento
Epidérmico (EGF) (Tannheimer et al.,1997; Davis et al., 2000).
Como acontece então a metabolização do BaP?
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O BaP liga-se aos receptores para hidrocarbonetos aromáticos (AhR), ativando-os;
uma vez ativados, induzem a transcrição de um número de genes envolvidos no próprio
processo de metabolização deste PAHs, inclusive CYP1A1. CYP1A1 ativa BaP em BaP-7,8oxide o qual, através de reação de hidrólise envolvendo a enzima epóxido hidrolase, é
metabolizado em (±)-BaP-trans-7,8-dihidrodiol (BaP-7,8-DHD). BaP-7,8-DHD pode então
servir como substrato para uma segunda reação de oxidação CYP-dependente, gerando o
último metabólito carcinogênico 7,8-diol-9,10-epoxido-benzo[a]pireno (BPDE). Estes dióisepóxidos podem resultar em vários tetróis, mas são parcialmente protegidos de hidrólises por
epóxido hidrolase, o que permite que eles atinjam o núcleo. No núcleo, podem se ligar
covalentemente ao DNA, formando principalmente deoxiguanosina-adutos de DNA, levando
a problemas na replicação e mutagênese (Conney, 1982; Shields et al., 1993).
O BPDE pode ser conjugado com a GSH através da -GST e assim ser excretado da
célula como conjugado solúvel em água (Jernström et al.,1996; Robertson & Jernström,
1986). No entanto, caso a quantidade de BPDE torne-se predominante, ou a célula não realize
o processo de conjugação, poderá ocorrer reação deste metabólito com o DNA produzindo
adutos em vários tipos celulares (Lutz & Schlatter, 1979; Melendez-Colon et al., 1999). Além
disso, o próprio processo de metabolização do BaP via CYP1A1 pode produzir espécies
reativas de oxigênio (EROs), as quais podem também reagir com o DNA formando adutos
(Kim & Lee, 1997; Whitlock, 1999).
Benzo[a]pireno-quinonas (BPQs) são outros metabólitos do BaP, que podem ser
produzidos biologicamente por peroxidases e por isoenzimas CYP em combinação com
dihidrodiol dehidrogenases, bem como ambientalmente através da radiação ultravioleta (UV)
(Reed et al., 2003). BPQs são compostos quimicamente ativos que passam por ciclos redox
com seus radicais semiquinonas resultando na formação de anion superóxido, peróxido de
hidrogênio e radical hidroxila. Existe a hipótese de que alguns efeitos do BaP reflitam na
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formação de BPQs e a subseqüente geração de EROs. As quinonas, assim como BPDE,
também podem formar conjugados com a glutationa (Agarwal et al, 1991).
Como dito acima, o BaP está amplamente difundido no meio ambiente e portanto,
torna-se exposto a radiação solar. Cabe esclarecer que ao fazer-se referência ao ultravioleta
(UV) solar estamos tratando das faixas de UVA e UVB, uma vez que a radiação UVC não
chega a atmosfera (Chapman et al., 1995).
Por que é importante considerarmos a capacidade de interação da radiação ultravioleta
com os organismos?
Toda a célula, seja procariótica ou eucariótica, possui cromóforos endógenos para a
UV e por esta razão, esta radiação é conhecida por causar danos em diferentes alvos celulares.
UVA tem como alvo preferencial a membrana celular, enquanto que UVB e UVC têm como
principal alvo, o DNA celular (Godar et al., 1993).
A radiação UV pode produzir danos nas moléculas de DNA por mecanismos direto e
indireto. O mecanismo direto ocorre quando a radiação incide diretamente sobre o DNA
nuclear (UVC e UVB). Já o mecanismo indireto (UVA) é aquele em que, moléculas
intermediárias, preferencialmente a água, são irradiadas e, como conseqüência, EROs são
produzidas. Estas espécies ativas, por sua vez, atingem moléculas celulares críticas, como
DNA, enzimas anti-oxidantes e lipídeos estruturais da membrana celular (Darr & Fridovich,
1994). Para a radiação UVA, o principal dano no DNA, é a formação da 8-hidroxi2’deoxiguanosina (8 -OHdG) (Steenken and Jovanovic, 1997).
Como já foi dito anteriormente, a capacidade tóxica do BaP é altamente significativa
quando este é metabolicamente ativo (Liu et al., 1998) e, tendo em vista que o BaP é o mais
fototóxico (Schirmer et al., 1998) entre os PAHs e considerando-se que determinadas faixas
de comprimento de onda interagem com o BaP, torna-se interessante estudar o seu processo
de ação fotodinâmica.
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A ação fotodinâmica é a fotooxidação de moléculas biológicas na presença de
oxigênio e de uma substância sensibilizante, o fotossensibilizador (Blum, 1941; Trindade et
al., 2000). Existem dois principais caminhos que levam a morte celular pelo processo de
fotooxidação conhecidos como mecanismos do tipo I e tipo II. No mecanismo tipo I a
substância fotossensibilizante ativada pela luz interage com alvos biológicos e em
combinação com o O2 do meio, gera radicais como o radical ânion superóxido (O2-) e radical
hidroxila (∙OH). No mecanismo do tipo II ocorre transferência de energia do
fotossensibilizante ativado pela radiação para o O 2 no estado triplete (3O2), gerando uma
espécie extremamente reativa, o oxigênio singlete (1O2), que, por sua vez, irá atuar nos alvos
biológicos. O mecanismo do tipo II destrói muitos compostos fora e dentro da célula enquanto
que o tipo I necessita da penetração do fotossensibilizador no invólucro celular (Foote, 1991;
Henderson e Dougherty, 1992).
Sabendo-se que os PAHs e seus derivados, podem agir como fotossensibilizadores
(Zhang et al., 2004), torna-se pertinente estudar o mecanismo capaz de produzir os efeitos da
ação fotodinâmica do BaP. A razão pela qual os PAHs podem ser considerados
fotossensibilizadores está relacionada ao fato de sua composição molecular apresentar o
sistema múltiplo de anéis aromáticos que, por sua vez, têm a capacidade de absorver a energia
na faixa do UVA e da luz visível (Dabestani and Ivanovi, 1999). Este processo ocorre quando
o fotossensibilizador absorve a energia luminosa, eleva-se para um estado excitado e ao
retornar ao estado inicial transfere esta energia de excitação para o oxigênio, produzindo
assim EROs (Newsted and Giesy, 1987).
As EROs incluem radicais livres como o ânion superóxido (O2-.), o radical hidroxila
(OH.) e o oxigênio singlete (1O2), assim como intermediários não-radicais, como o peróxido
de hidrogênio (H2O2). A maioria das EROs são produzidas através da utilização do oxigênio
molecular por carreadores de elétrons mitocondriais e enzimas durante o metabolismo normal
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da fosforilação oxidativa de células aeróbicas de mamíferos. Quando as EROs alcançam uma
concentração crítica, se sobrepondo às defesas antioxidantes, poderão ocorrer danos de
macromoléculas, tais como, DNA, proteínas e lipídeos, caracterizando o processo conhecido
como estresse oxidativo (Meewes et al., 2001).
Por outro lado, segundo Darr e Fridovich (1994) para proteção contra o estresse
oxidativo, as células aeróbicas possuem um complexo sistema de defesas antioxidantes,
incluindo antioxidantes não-enzimáticos, como as vitaminas E e C, ácido úrico e glutationa e
antioxidantes enzimáticos, como a superóxido dismutase (SOD), catalase e glutationa
peroxidase (GPx).
Como já foi visto acima, após exposição à radiação UVA, a guanina é a base de DNA
mais facilmente oxidada por ter o menor potencial de oxidação entre as quatro bases
(Steenken & Jovanovic, 1997). A 8-OHdG é uma forma oxidada da guanina formada pela
reação com EROs. O acúmulo desta guanina oxidada reduz a integridade do DNA. Além
disso, a radiação ultravioleta também pode aumentar ligações covalentes de PAHs no DNA
(Sinha & Chignell, 1983). Tem sido mostrado que a exposição concomitante de PAHs e luz
podem causar quebras simples no DNA, oxidação de bases e formação de adutos no DNA
(Liu et al., 1998; Yu, 2002).
No artigo de Zhang e colaboradores (2004) eles verificaram em células KB (carcinoma
epidérmico humano) um aumento de 2,9 vezes na produção de EROs no tratamento destas
células com UVA mais BaP e de 1,3 vezes no tratamento destas células com UVB mais BaP e
que existe uma correlação entre a quantidade de EROs e a quantidade de 8-OHdG nas células
onde o BaP foi irradiado com UVA, levando a um aumento no número de danos de DNA.
Testando a linhagem A431 (carcinoma epidérmico humano) e DNA extraído de timo
de carneiro, Liu e colaboradores (1998) constataram que, na presença de UVA mais BaP,
existe um aumento, em 20 vezes, no número de danos oxidativos de DNA quando comparado
12
com as células tratadas sem BaP. Para o tratamento com UVB esta diferença não foi tão
marcante. Mais uma vez, evidenciando o caráter oxidativo da radiação UVA.
Um outro exemplo desta interação foi demonstrado por Shyong e colaboradores
(2003). Estes autores verificaram que, para a linhagem celular A431 existe aumento de H 2O2
pela exposição das células ao BaP e ao UVA. Resultado similar foi encontrado por estes
pesquisadores para culturas primárias de queratinócitos.
Ibuki e Goto (2002), mostraram que a co-exposição de BaP e UVA induziram a
letalidade em células Jurkat (linfoblasto). Estes autores verificaram que a morte celular
ocorreu por apoptose, e mostraram que houve ativação das caspases, condensação de
cromatina e translocação de fosfatidilserina para fora da membrana celular. Além disso, os
autores sugerem que a indução da apoptose ocorreu pela produção de oxigênio singlete.
Gao e colaboradores (2005) demonstraram que metabólitos microssomais de BaP,
também são potencialmente sinergizados quando associados com UVA e induzem a formação
de 8-OHdG em DNA de mamíferos. Além da participação do oxigênio singlete, estes autores
observaram também, a participação do ânion superóxido. Utilizando captadores específicos
para esta EROs, houve uma inibição de 20% na formação de 8-OHdG.
Os comprimentos de onda da radiação solar que atingem a superfície terreste, UVA e
UVB, por si só, podem causar efeitos deletérios nos organismos e, como foi visto acima, em
associação com algumas substâncias, podem ter seus efeitos sinergizados. Entretanto, a luz
visível que é conhecida por seus benefícios, entre eles a fotossíntese, muitas vezes é deixada
de lado. Qual será o efeito da associação do BaP com a luz visível?
Até o momento, o número de trabalhos envolvendo a interação do BaP com a radiação
UVA é muito superior àqueles envolvendo a interação do BaP com a faixa do espectro
visível. Mauthe e colaboradores (1995) ao demonstrarem que a exposição de células MCF-7
(carcinoma mamário humano) e embriões de hamster quando submetidos a tratamento com
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BaP e luz visível respondem com aumento de 8-OHdG estimulam a continuidade destes
estudos.
A partir da idéia de que a ação fotodinâmica exerce seus efeitos num processo que
envolve estresse oxidativo, ter um modelo biológico que expresse diferenças quanto ao
sistema de defesa celular, por exemplo, uma célula sensível a quimioterápicos e uma célula
resistente a estas drogas, podem contribuir para a compreensão das vias celulares envolvidas
no processo de toxicidade da ação fotodinâmica.
Rumjanek e colaboradores (1994, 2001) estabeleceram um modelo in vitro utilizando o
quimioterápico vincristina para induzir uma linhagem eritroleucêmica resistente e, com isso,
permitir um estudo experimental de células resistentes a múltiplas drogas (MDR). A esta
linhagem MDR foi dado o nome K562-Lucena1 (Lucena) para distinguir de sua linhagem
parental K562, não resistente.
Mas é importante ainda esclarecermos o que caracteriza uma célula MDR. A MDR é
um fenômeno pelo qual, células tumorais que inicialmente respondiam a determinados
quimioterápicos, adquirem resistência não apenas às drogas utilizadas no tratamento, mas
também a um número de outras drogas que não apresentam uma estrutura comum as
primeiras, nem mesmo possuem um mesmo alvo intracelular. Este fenômeno possui
características que ainda não se encontram bem definidas e tem sido sugerido como uma das
principais causas de falta de êxito na quimioterapia de diversos tipos de câncer (Gottesman &
Pastan, 1993). São vários os fatores que podem levar ao fenótipo MDR, porém a
superexpressão da glicoproteína P (Pgp) é o mecanismo melhor estudado (Ford & Hait,
1990). Esta proteína é responsável por um mecanismo de efluxo, dependente de energia,
capaz de bombear agentes quimioterápicos para fora da célula (Uchiumi et al., 1993). As
células Lucena superexpressam Pgp.
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Em geral, tem-se mostrado que células MDR apresentam menor peroxidação lipídica
que suas células parentais. No entanto, apesar de ser um fenômeno comum à maioria das
células MDR estudadas, a razão dessa resistência varia consideravelmente entre as linhagens
celulares, podendo estar relacionada a um aumento da expressão de enzimas antioxidantes
(Benchekroun et al., 1990; Trindade et al., 1999), a um aumento da quantidade de alfatocoferol na membrana celular (Mazzanti et al., 1995), ou a outras razões ainda não
compreendidas. Desta forma, é possível que linhagens MDR possam apresentar uma menor
sensibilidade quando expostas a agentes oxidantes.
Trindade
e
colaboradores
(1999)
estudaram
a
sensibilidade
das
células
eritroleucêmicas K562 e Lucena à radiação UVA, UVB e UVC e verificaram que as células,
sem distinção, morrem quando expostas à radiação UVB e UVC. Entretanto quando as células
são expostas à radiação UVA, a linhagem MDR, foi resistente. Considerando que um dos
principais produtos da radiação UVA é o peróxido de hidrogênio, também foi testada a
sensibilidade a este agente oxidante e novamente a linhagem MDR mostrou-se resistente.
Assim, considerando os efeitos da ação fotodinâmica do BaP e tendo as linhagens
celulares K562 (não MDR) e Lucena (MDR), como modelos biológicos, estudamos os efeitos
da ação fotodinâmica do BaP, utilizando as radiações UVA ou visível, nessas linhagens
celulares através da análise de viabilidade celular. E para a linhagem K562 estudamos a
cinética de entrada do BaP e para a associação BaP+UVA analisamos a geração de EROs,
peroxidação lipídica e dano de DNA (quebras e DNA-proteína cross-link).
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Objetivos
Objetivo Geral
Avaliar os efeitos da ação fotodinâmica com UVA ou luz visível utilizando o Benzo[a]pireno
como substância fotossensibilizadora, em duas linhagens tumorais.
Objetivos Específicos
- Determinar a viabilidade das linhagens celulares, K562 e Lucena, a diferentes concentrações
de BaP.
- Determinar e comparar a viabilidade das linhagens celulares, K562 e Lucena, à ação
fotodinâmica da radiação UVA ou visível para as diferentes concentrações de BaP.
- Analisar a cinética de acumulação do BaP na linhagem K562.
- Verificar a produção de espécies reativas de oxigênio na linhagem K562 tratada com BaP,
irradiada com UVA, bem como na associação do BaP + UVA.
- Verificar peroxidação lipídica, na linhagem K562 tratada com BaP, irradiada com UVA,
bem como na associação do BaP + UVA.
- Verificar a capacidade do BaP, do UVA e da associação BaP + UVA em gerar danos de
DNA (quebras e DNA-proteína crosslink).
16
Referências
Agarwal, R., Medrano, E.E., Khan, I.U., 1991. Metabolism of benzo[a]pyrene by human
melanocytes in culture. Carcinogenesis 12, 1963–1966.
Benchekroun, M.N., Catroux, P., Montaudon, D., Robert, J., 1990. Development of
mechanisms of protection against oxidative stress in doxorubicin-resistant rat tumoral cells in
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22
C om m u n ication a ser su bm etida à revista “T oxicology in V itro”
23
A comparative study of Benzo[a]pyrene and its photodynamic action in MDR and nonMDR cell lines, under UVA or visible radiations
Daza de Moraes Vaz Batista Filgueiraa,b, Daiane da Silva Marquesa, Thaís Martins Lopesa,b,
Adriana Lima Vallochic , Gilberto Fillmannd, Gilma Santos Trindadea,b*
a
Departamento de Ciências Fisiológicas, Fundação Universidade Federal do Rio Grande
(FURG), Rio Grande, (96201-900), BRAZIL.
b
Programa de Pós-graduação em Ciências Fisiológicas, Fisiologia Animal Comparada
FURG, Rio Grande, (96201-900), BRAZIL.
c
Departamento de Patologia, Laboratório de Imunologia, FURG, Rio Grande, (96201-900),
BRAZIL.
d
Departamento de Oceanografia, Laboratório de Microcontaminantes Orgânicos e
Ecotoxicologia Aquática, FURG, Rio Grande, (96201-900), BRAZIL.
*
Corresponding author: Phone/Fax: +55 53 32336855 / +55 53 32336850
E-mail address: [email protected]
Short title: Photodynamic action of Benzo[a]pyrene in MDR and non-MDR cells
24
A rtigo a ser su bm etido à revista “T oxicology in V itro”
25
Photodynamic action of Benzo[a]pyrene in K562 cells
Daza de Moraes Vaz Batista Filgueiraa,b, Diana Paula Salomão de Freitasa, Ana Paula de
Souza Vottoa,b, Gilberto Fillmannc, José Maria Monserrata,b, Laura Alicia Geracitanoa,b, Gilma
Santos Trindadea,b*
a
Departamento de Ciências Fisiológicas, Fundação Universidade Federal do Rio Grande
(FURG), Rio Grande, (96201-900), BRAZIL.
b
Programa de Pós-graduação em Ciências Fisiológicas, Fisiologia Animal Comparada
FURG, Rio Grande, (96201-900), BRAZIL.
c
Departamento de Oceanografia, Laboratório de Microcontaminantes Orgânicos e
Ecotoxicologia Aquática, FURG, Rio Grande, (96201-900), BRAZIL.
*
Corresponding author: Phone/Fax: +55 53 32336855 / +55 53 32336850
E-mail address: [email protected]
Short title: Photodynamic action of Benzo[a]pyrene
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Conclusões Gerais
- BaP não foi citotóxico, nas concentrações estudadas, para as linhagens celulares K562 (nãoMDR) e Lucena (MDR).
- A ação fotodinâmica do BaP associado com UVA foi citotóxica para ambas as linhagens.
- A ação fotodinâmica do BaP associado com PAR causou inibição de proliferação nas duas
linhagens celulares.
- Em 18 h de incubação foi observada a maior acumulação do BaP, na linhagem K562.
- O teste para determinar a geração de ROS foi inconclusivo, uma vez que a viabilidade
celular foi alterada, na linhagem K562.
- A ação fotodinâmica do BaP+UVA induziu um aumento significativo de lipídeos
peroxidados, na linhagem K562.
- Houve um aumento no número de quebras no DNA para as células tratadas com a ação
fotodinâmica do BaP+UVA, na linhagem K562.
- As células K562 tratadas com BaP, UVA e ação fotodinâmica do BaP+UVA apresentaram
dano do tipo DNA-proteína cross-link quando comparados ao controle.
- Esses resultados sugerem a participação dos mecanismos tipo I e tipo II da ação
fotodinâmica nas células K562 tratadas com BaP mais UVA.
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