INFLUÊNCIA E ELIMINAÇÃO DO COBRE E DO CHUMBO NA
FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
Sofia CATARINO1,2*; M.M. BALEIRAS-COUTO1,3; R. BRAZ1; A.S. CURVELOGARCIA1
Resumo
A presença de metais pesados nos mostos tem sido apontada como um dos factores na origem de paragens de
fermentação alcoólica. No presente trabalho pretendeu-se avaliar o efeito do cobre e do chumbo, a diferentes
níveis de concentração, na fermentação alcoólica. Estudou-se igualmente a eliminação dos dois metais
pesados ao longo desta etapa tecnológica. Para tal, realizou-se um ensaio experimental com mostos
adicionados de Cu (25, 40 e 65 mg/L) e de Pb (250, 500 e 700 µg/L), no total de sete modalidades de
fermentação. Os teores de Cu e de Pb nos mostos e vinhos foram quantificados por espectrofotometria de
absorção atómica com atomização electrotérmica (ETAAS). Os resultados obtidos demonstraram a influência
do Cu em diversos parâmetros da fermentação alcoólica. O vinho resultante da modalidade com adição de 65
mg/L de Cu apresentou um teor alcoólico [10,0 % (v/v)] inferior ao do vinho testemunha [11,3 % (v/v)]. Aos
níveis de adição estudados, o Pb não teve efeito assinalável na fermentação alcoólica. No final da
fermentação verificou-se uma diminuição nos teores de Cu e de Pb, em função dos seus teores iniciais no
mosto.
Palavras-chave: mosto, Cu, Pb, fermentação alcoólica, vinho.
1. INTRODUÇÃO
As paragens de fermentação alcoólica de mostos ocorrem com alguma frequência,
conduzindo normalmente a perdas de qualidade dos vinhos, com consequente prejuízo
económico. Como factores na origem deste problema são vulgarmente referidas
deficiências nutritivas, a presença de compostos tóxicos produzidos pelas próprias
leveduras e resíduos de pesticidas e metais pesados, embora na realidade o conhecimento
sobre a influência destes últimos seja bastante deficitário.
O cobre (Cu) e o chumbo (Pb) são dois metais pesados associados a contaminação,
cujos teores no vinho são objecto de controlo legal. O Cu devido à sua relação com
fenómenos de instabilidade físico-química, o Pb por razões de ordem toxicológica. A
presença de Cu nos mostos deve-se essencialmente a tratamentos cúpricos antifúngicos
(CURVELO-GARCIA e CATARINO, 1998; RIBÉREAU-GAYON et al., 1998;
GARCÍA-ESPARZA et al., 2006). Os mostos apresentam normalmente teores de Cu na
ordem dos 10 a 20 mg/L, originando vinhos com teores relativamente pequenos, na ordem
1
Estação Vitivinícola Nacional, 2565-191 Dois Portos, Portugal
Universidade Técnica de Lisboa, Instituto Superior de Agronomia, Departamento de Química Agrícola e
Ambiental, Tapada de Ajuda, 1349-017 Lisboa, Portugal.
3
Universidade do Minho, Centro/Departamento de Biologia, 4710-057 Braga, Portugal
* Autor para correspondência: [email protected]
2
de 0,1 a 0,2 mg/L (CURVELO-GARCIA e CATARINO, 1998; CATARINO et al., 2006).
O limite máximo actualmente estabelecido para a sua presença em vinhos é de 1 mg/L
(OIV, 2005). A incorporação do Pb nos combustíveis tem sido particularmente responsável
pela introdução de grandes quantidades deste metal no ambiente, reflectindo-se a sua
presença no vinho (MÉDINA et al., 2000). Foi igualmente verificada a relação entre o teor
de Pb das uvas e a sua proximidade a vias rodoviárias (TEISSÈDRE et al., 1993). De uma
forma geral, os vinhos em final de fermentação alcoólica são menos ricos em Pb do que os
mostos correspondentes, apresentando normalmente teores inferiores a 100 μg/L
(CATARINO, 2000; LIMA et al., 2004; CATARINO et al., 2006). O limite máximo em
vigor para a sua presença em vinhos é de 200 µg/L (OIV, 2005), diminuindo para 150 µg/L
a partir da vindima de 2007 (Resolução OIV Oeno 13/2006). Devido a fenómenos naturais
de estabilização do vinho, no decorrer das fermentações alcoólica e maloláctica, ocorre a
eliminação parcial destes metais por precipitação sob a forma de sais orgânicos e
sulfuretos, e por absorção e adsorção por leveduras e bactérias.
Por outro lado, a capacidade de absorção e adsorção de metais pesados,
particularmente do Cu e do Pb, por leveduras Saccharomyces cerevisiae e por bactérias,
tem sido estudada (BRADY e DUNCAN, 1994; BRANDOLINI et al., 2002; SOARES et
al., 2002; DOSTALEK et al., 2004). Estudos realizados no âmbito da cinética de
crescimento de leveduras Saccharomyces cerevisiae demonstraram que o número de
unidades formadoras de colónias em presença de metais pesados decresce com aumento da
concentração do elemento (SOARES et al., 2002; DOSTALEK et al., 2004).
Recentemente, FERREIRA et al. (2006) observaram que concentrações elevadas de Cu no
mosto estavam relacionados com maiores teores de frutose e glucose no final da
fermentação alcoólica, dependendo contudo da estirpe de leveduras. No entanto, os estudos
realizados com mosto de uva, em condições experimentais próximas da prática enológica,
são ainda muito escassos.
Com o presente trabalho pretendeu-se avaliar a influência do Cu e do Pb, a
diferentes níveis de concentração, na fermentação alcoólica de mosto, por medição de
parâmetros microbiológicos e por caracterização dos vinhos obtidos. Dada a importância
de minimizar os teores destes metais pesados no vinho, avaliou-se igualmente a sua
capacidade de eliminação ao longo desta etapa tecnológica.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Ensaio Experimental
Realizou-se um ensaio experimental de fermentação, utilizando mosto previamente
pasteurizado (pH = 3,224; acidez total = 5,930; [SO2] = 20 mg/L; [Cu] = 2,4 mg/L; [Pb] <
12 µg/L). Em cada frasco de vidro de 1 L (tipo Schoh) foram colocados 800 mL de mosto,
com rolha de algodão, seguindo-se a sua esterilização (121ºC / 20 min). De acordo com o
esquema da Figura 1, procedeu-se à adição a três níveis de concentração de CuSO4.5H2O e
Pb(NO3)2, e inoculação com uma suspensão de cultura pura da levedura Saccharomyces
cerevisiae EVN 166 (QA23). Todas as modalidades foram preparadas em duplicado,
totalizando 14 amostras.
2.2. Acompanhamento das fermentações
Controlo do peso
Foram realizadas curvas de perda de peso estabelecidas por pesagens diárias dos
frascos de fermentação: 12 em 12 horas (até às 263,5 horas); 24 em 24 horas (desde as
277,5 até 491,6 horas).
Contagem de leveduras na Testemunha (UFC)
A quantificação de leveduras no mosto testemunha ao longo da fermentação foi
realizada recorrendo a diluições sucessivas das amostras de mosto recolhidas diariamente
(1 mL), de modo a obter entre 30 a 300 colónias por placa. A análise foi feita por
espalhamento à superfície em meio YEPD (5 g/L extracto de levedura, 10 g/L peptona, 20
g/L glucose) em placas de Pétri. As placas foram incubadas em posição invertida em estufa
a 25 ºC durante 3 a 5 dias, em aerobiose. Após o período de crescimento procedeu-se à
contagem das colónias (UFC). Os resultados são expressos em UFC/mL (unidades
formadoras de colónias por mL).
Controlo da percentagem de sólidos em suspensão
Foi realizada a leitura diária da percentagem de sólidos em suspensão nos mostos,
por refractometria (Carl Zeiss 51542).
2.3. Determinação dos teores de Cu e Pb ao longo da fermentação
Diariamente recolheram-se 10 mL de mosto de cada frasco de fermentação,
seguindo-se a sua centrifugação (14000 rpm / 10 min). O sobrenadante foi recolhido e
adicionado de 2,5 mL de HNO3, e 12 horas depois sujeito a um banho a 100ºC (4 horas)
para destruição da matéria orgânica. A repetibilidade e taxas de recuperação desta
metodologia foram previamente estudadas (Braz, 2006).
A determinação analítica do Cu e do Pb no sobrenadante foi realizada por ETAAS,
segundo os métodos descritos por Catarino et al. (2005) e Catarino (2000),
respectivamente. Foi utilizado um Espectrofotómetro de Absorção Atómica com Câmara
de Grafite Perkin Elmer 4110 ZL. Todo o material utilizado foi descontaminado numa
solução de HNO3 a 20 % (V/V) e passado abundantemente por água ultra-pura.
No final das fermentações, mediu-se o pH, acidez total, acidez volátil e o teor
alcoólico volumétrico das amostras de vinho.
Mosto
testemunha
Mosto
Mosto
Mosto
Mosto
Mosto
Mosto
+ 25
mg/L Cu
+ 40
mg/L Cu
+ 65
mg/L Cu
+ 250
µg/L Pb
+ 500
µg/L Pb
+ 700
µg/L Pb
Pesagem dos frascos de fermentação
Recolha de 10 mL de mosto em cada frasco
Leitura da % de sólidos em suspensão
Centrifugação do mosto e recolha do sobrenadante
Avaliação do nº de células viáveis
Preparação do mosto para análise mineral
(via húmida)
Tempo de fermentação: 21 dias (25ºC)
Determinação analítica do Cu e do Pb por ETAAS
Figura 1 – Representação esquemática do ensaio experimental de fermentação e procedimentos
para o seu acompanhamento.
3. RESULTADOS
3.1. Evolução das fermentações ao longo do tempo
Dinâmica populacional
As fermentações decorreram durante 21 dias, tendo a população de leveduras no
mosto testemunha estabilizado aproximadamente ao 6º dia. No Quadro 1 apresenta-se a
contagem total de leveduras nos mostos em duas fases da fermentação. Ao 5º dia de
fermentação os mostos com adição de Cu apresentaram menor número de UFC/mL do que
o mosto testemunha, com destaque para a modalidade com adição de 65 mg/L. Os mostos
adicionados com Pb apresentaram sensivelmente o mesmo número de UFC/mL do que o
mosto testemunha.
Quadro 1 – Contagem total de leveduras nos mostos em fermentação (UFC/mL).
UFC/mL
Modalidade
1º dia de fermentação
5º dia de fermentação
Mosto testemunha
2,3×107
1,1×108
Mosto + 25 mg/L Cu
2,3×107
8,9×107
Mosto + 40 mg/L Cu
2,3×107
8,8×107
Mosto + 65 mg/L Cu
2,1×107
6,8×107
Mosto + 250 µg/L Pb
2,0×107
1,1×108
Mosto + 500 µg/L Pb
2,0×107
1,1×108
Mosto + 700 µg/L Pb
2,0×107
1,0×108
de fermentação
Perda de peso e percentagem de sólidos em suspensão
Verificou-se que nos mostos adicionados com Cu, particularmente na modalidade
com adição de 65 mg/L, a diminuição da % de sólidos em suspensão ao longo do tempo foi
mais lenta do que no mosto testemunha (Figura 2).
% de sólidos em suspensão
25
Test
20
Test + 25 mg/L Cu
15
10
Test + 40 mg/L Cu
5
Test + 65 mg/L Cu
0
0
5
10
15
20
25
Tempo (dias)
Figura 2 – Evolução ao longo do tempo da percentagem de sólidos em suspensão nos mostos com
adição de Cu.
Não se observaram diferenças assinaláveis entre os níveis de adição de 25 mg/L e
40 mg/L. Estas observações foram confirmadas pela perda de peso ao longo do tempo nas
diferentes modalidades de fermentação (resultados não apresentados). Não se verificaram
diferenças assinaláveis na evolução ao longo do tempo do peso e da % de sólidos em
suspensão, entre a testemunha e as modalidades com adição de Pb.
Teor alcoólico dos vinhos
No final da fermentação alcoólica as amostras com maior adição de Cu (40 e 65
mg/L) apresentaram um teor alcoólico inferior ao da testemunha. Nas modalidades com
adição de Pb não se observaram diferenças assinaláveis relativamente à testemunha
(Quadro 2).
Quadro 2 - Teor alcoólico volumétrico dos vinhos (%V/V) (médias dos duplicados).
Vinho
TAV (%)
Test
11,3
Test + 25 mg/L Cu
11,3
Test + 40 mg/L Cu
11,2
Test + 65 mg/L Cu
10,0
Test + 250 µg/L Pb
11,4
Test + 500 µg/L Pb
11,2
Test + 700 µg/L Pb
11,3
3.2. Evolução dos teores de Cu e Pb ao longo da fermentação alcoólica
A evolução dos teores de Cu e Pb ao longo do tempo foi estudada em todas as
modalidades de fermentação. Não foi possível quantificar o Pb no mosto testemunha
devido ao seu baixo teor. Verificou-se um decréscimo bastante acentuado do teor de Cu no
mosto testemunha nos primeiros dias de fermentação, sendo de aproximadamente 90% ao
fim do 2º dia (Figura 3). O decréscimo nos mostos com adição de Cu foi mais lento,
apresentando taxas de eliminação entre 29 e 60% no final da fermentação, em função da
concentração inicial do elemento. Os teores de Cu observados no final das fermentações
foram os seguintes: 0,3 mg/L (mosto testemunha); 8,8 mg/L (mosto + 25 mg/L); 18,8 mg/L
(mosto + 40 mg/L) e 40,1 mg/L (mosto + 65 mg/L).
3000
[Cu] µg/L
2500
2000
1500
1000
500
0
0
5
10
15
Tempo (dias)
Figura 3 – Evolução do teor de Cu ao longo da fermentação (mosto testemunha).
A evolução do teor de Pb observada nos mostos com adição deste elemento foi
muito semelhante nas três modalidades. A título de exemplo, na Figura 4 apresentam-se os
resultados referentes ao mosto com adição de 500 µg/L Pb.
600
[Pb] ug/L
500
400
300
200
100
0
0
5
10
15
20
25
Tempo (dias)
Figura 4 – Evolução do teor de Pb ao longo da fermentação (mosto + 500 µg/L Pb).
Verificou-se um ligeiro aumento no 3º dia de fermentação, provavelmente
relacionado com a libertação de Pb de complexos com polissacáridos pécticos do mosto
(PELLERIN et al., 1997), e um decréscimo global até ao final da fermentação. As taxas de
eliminação variaram entre 21 e 23%. Os teores de Pb observados no final das fermentações
foram os seguintes: 133 µg/L (mosto + 250 µg/L), 373 µg/L (mosto + 500 µg/L) e 520
µg/L (mosto + 700 µg/L).
4. CONCLUSÕES
Os resultados obtidos indicam um efeito inibidor do Cu, aos níveis de concentração
estudados, no crescimento da população de leveduras. Verificou-se a influência deste metal
pesado na evolução da percentagem de sólidos em suspensão e na perda de peso ao longo
da fermentação, com reflexos no teor alcoólico dos vinhos. Por outro lado, o Pb não teve
efeito assinalável na fermentação alcoólica.
No decorrer da fermentação verificou-se uma diminuição nos teores de Cu e de Pb
dos mostos, em função dos seus teores iniciais. A maior capacidade de eliminação do Cu
relativamente ao Pb, poderá em parte ser explicada pela forma química em que estes
metais se encontram no mosto.
Agradecimentos
As autoras M. M. Baleiras-Couto e Sofia Catarino agradecem à Fundação para a Ciência e
a Tecnologia a bolsa de pós-doutoramento (BPD/18959/2004) e a bolsa de doutoramento
(BD/17237/2004), respectivamente.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BRADY D., DUNCAN J.R., 1994. Bioaccumulation of metal cations by Saccharomyces cerevisiae. Applied
Microbiology and Biotechnology, 41, 149-154.
BRANDOLINI V., Tedeschi P., Capece A., Maietti A., Mazzotta D., Salzano G., Paparella A., Romano P.,
2002. Saccharomyces cerevisiae wine strains differing in copper resistance exhibit different capability to
reduce copper content in wine. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 18, 499-503.
BRAZ R.A.C., 2006. Influência dos teores em Cu e Pb na fermentação alcoólica de mosto de uva. Relatório
de Estágio Curricular de Licenciatura em Tecnologia e Segurança Alimentar. Faculdade de Ciências e
Tecnologia, Universidade Nova de Lisboa, Lisboa.
CATARINO S.C.G., 2000. A ocorrência de chumbo e cádmio em vinhos. Tese de Mestrado em Viticultura e
Enologia. Faculdade de Ciências, Universidade do Porto, Porto.
CATARINO S., Pimentel I., Curvelo-Garcia A.S., 2005. Determination of copper in wine by ETAAS using
conventional and fast thermal programs: validation of analytical method. Atomic Spectroscopy, 26 (2), 73-78.
CATARINO S., Capelo J.L., Curvelo-Garcia A.S., Bruno de Sousa R., 2006. Evaluation of contaminant
elements in portuguese wines and original musts by high intensity focused ultrasound combined with
inductively coupled plasma mass spectrometry. Journal International des Sciences de la Vigne et du Vin, 40
(2), 91-100.
CURVELO-GARCIA A.S., CATARINO S., 1998. Os metais contaminantes dos vinhos: origens da sua
presença, teores, influência dos factores tecnológicos e definição de limites. Ciência e Técnica Vitivinícola,
13 (1-2), 49-70.
DOSTALEK P., Patzak M., Matejka P., 2004. Influence of specific growth limitation on biosorption of
heavy metals by Saccharomyces cerevisiae. International Biodeterioration & Biodegradation, 54, 203-207.
FERREIRA J., Du Toit M., Du Toit W., 2006. The effects of copper and high sugar concentrations on
growth, fermentation efficiency and volatile acidity production of different commercial wine yeast strains.
Australian journal of Grape and Wine Research, 12, 50-56.
GARCÍA-ESPARZA M.A., Capri M., Pirzadeh P., Trevisan M., 2006. Copper content of grape and wine
from Italian farms. Food Additives and Contaminants, 23 (3), 274-280.
LIMA M.T.R., Cabanis M.T., Matos L., Cassanas G., Kelly M.T., Blaise A., 2004. Determination of lead and
cadmium in vineyard soils, grapes and wines of the Azores. Journal International des Sciences de la Vigne et
du Vin, 38 (3), 163-170.
MÉDINA B., Augagneur S., Barbaste M., Grousset F.E., Buat-Ménard P., 2000. Influence of atmospheric
pollution on the lead content of wines. Food Additives and Contaminants, 17 (6), 435-445.
OIV, 2005. Recueil des méthodes internationales d’analyse des vins et des môuts. Organisation International
de la Vigne et du Vin, Paris.
PELLERIN P., O’Neill M.A., Pierre C., Cabanis M.T., Darvill A.G., Albersheim P., Moutounet M., 1997.
Complexation du plomb dans les vins par les diméres de rhamnogalacturonane II, un polysaccharide pectique
du raisin. Journal Internacional des Sciences de la Vigne et du Vin, 31 (1), 33-41.
RIBÉREAU-GAYON P., Glories Y., Maujean A., Dubourdieu D., 1998. Traité d’œnologie 2. Chimie du vin.
Stabilisation et traitements. Dunod, Paris.
SOARES E.V., Duarte A.P.R.S., Boaventura R.A., Soares H.M.V.M., 2002. Viability and release of
complexing compounds during accumulation of heavy metals by brewer´s yeast. Applied Microbiology and
Biotechnology, 58, 836-841.
TEISSÈDRE P.L., Cabanis M.T., Daumas F., Cabanis J.C., 1993. Evolution de la teneur en plomb au cours
de l’élaboration des vins des côtes du rhône et de la vallée du rhône. Revue Française d’Oenologie. Cahiers
Scientifiques, 14, 6-18.