III Encontro Paranaense de Engenharia e Ciência
Toledo – Paraná, 28 a 30 de Outubro de 2013
Análise da Influência do pH e da Temperatura no Processo de
Fermentação de Caldo de Cana
Gabriela Bonassa1*, Joel G. Teleken2, Lara T. Schneider3, Carlos de Jesus de Oliveira3.
(1) Graduando de Tecnologia em Biocombustíveis. Universidade Federal do Paraná – UFPR, Setor
Palotina. Rua Pioneiro, n. 2153 – Jardim Dallas – Palotina – Paraná – CEP: 85950-000 – Brasil – Tel:
+55 (44) 3211-8500. E-mail: [email protected]
(2) Docente – Tecnologia em Biocombustíveis. Universidade Federal do Paraná – UFPR, Setor PalotinaPR.
(3) Graduando de Tecnologia em Biocombustíveis. Universidade Federal do Paraná – UFPR, Setor
Palotina-PR.
Resumo: Entre as diversas fontes de energias renováveis no Brasil, destaca-se o bioetanol a advindo da cana-deaçúcar. A indústria do álcool cresceu nos anos 70, com o Proálcool, em um momento que quando o mundo se via em
risco quanto ao desabastecimento energético e com os altos preços do petróleo. Desde então, o etanol tem
importância para o mercado interno e externo, obtido principalmente por meio através de processos fermentativos.
Neste processo, as leveduras consomem o açúcar do mosto, liberando álcool e CO2. A cinética do processo de
fermentação é influenciada por algumas variáveis, como pH, temperatura, concentração de substrato, teor alcoólico,
minerais, nutrição, que afetam o tempo de fermentação, concentração final de produto e microrganismo. Neste
contexto, o presente trabalho visou avaliar a influência do pH e da temperatura, sobre o processo de fermentação
alcoólica, buscando maior concentração de produto em menor tempo. Com concentração de açúcares iniciais de 96,2
g,L-1, temperatura de 29 e 34 ºC, pH’s 4 e 6, a concentração de bioetanol foi maior, no ensaio que utilizava 34 ºC e
pH 4, na quantia de 28,75 g.L-1.
Palavras – Chave: Energias Renováveis; Bioetanol; Fermentação Alcoólica; Temperatura; pH.
importante, em virtude das matérias-primas
fermentescíveis brasileiras (LIMA et al.
2001).
Segundo Amorim (2005), há vários
fatores envolvidos no processo fermentativo,
como o microrganismo utilizado e a forma
de conduzir o processo, os quais devem
proporcionar baixa inibição em relação ao
produto desejado, não serem patogênicos,
utilizar meio de cultura de baixo custo e
rápida conversão dos açúcares em etanol.
Fatores físicos (temperatura, pressão
osmótica), químicos (pH, oxigenação,
nutrientes, inibidores) e microbiológicos
(espécie, linhagem e concentração da
levedura, contaminação bacteriana) afetam o
rendimento da fermentação e a eficiência da
conversão de açúcar em etanol (LIMA et al.
2001).
Durante a fermentação a levedura
pode estar exposta a vários fatores
INTRODUÇÃO
O cultivo da cana-de-açúcar está
entre uma das mais antigas atividades agroeconômicas no Brasil. A principal utilização
da cana é para a produção de etanol e açúcar.
O Brasil contempla 36% da produção de
etanol mundial, possuindo capacidade de
extensão da cultura (MAGALHÃES, 2005).
Desde os tempos do Brasil colônia,
destacava-se no cenário sócio-econômico, a
importância da exploração da cultura
canavieira,
que
atualmente
ganha
importância
também
em
aspectos
econômicos e ambientais, uma vez que o
etanol é uma fonte renovável de energia e
integra a matriz energética nacional (ROS,
2004).
Existem três vias de obtenção do
bioetanol:
destilatória,
sintética
e
fermentativa, sendo a terceira a mais
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estressantes
(físicos,
químicos
e
microbiológicos), sendo os mais frequentes
os altos teores alcoólicos, temperatura elevada, acidez elevada do meio, presença
de sulfito, contaminação bacteriana e
contaminação por leveduras, exceto a
Saccharomyces cerevisiae, os quais afetam
diretamente o rendimento da produção de
etanol (BASSO, 1991).
As leveduras são mesófilas, sendo
temperaturas entre 26 e 35 ºC favoráveis
para produção de etanol. A velocidade de
conversão de açúcares em etanol aumenta
conforme aumenta a temperatura do mosto,
porém, deve-se ter cuidado, pois pode
também propiciar o desenvolvimento de
contaminação bacteriana (LIMA et al.
2001). A temperatura em que o meio se
encontra, é um dos fatores que mais afetam a
atividade dos microrganismos, tendo
influência significativa no metabolismo, no
crescimento, na viabilidade celular e na
capacidade fermentativa (BATISTA, 2001).
A faixa de pH mais adequada para a
fermentação alcoólica está entre 4 e 5, sendo
que os mostos industriais geralmente
possuem pH entre 4,5 e 5,5, sendo
características das leveduras industriais
adaptação até faixas de pH entre 5,2 e 6,8.
Meios mais ácidos são menos sujeitos a
contaminação bacteriana, resultando em
maior rendimento alcoólico (LIMA et al.
2001), porém quando os valores de pH são
muito baixos, ocasionam perda de alguns
nutrientes, como nitrogênio e potássio,
resultando no aumento da sensibilidade ao
etanol e ácidos orgânicos (GOMES, 1988).
Considerando a faixa de temperatura
e pH em que os microrganismos consomem
a sacarose do mosto, convertendo em etanol,
este trabalho teve como objetivo avaliar a
influência dos pH 4 e 6, e temperaturas 30 e
34 ºC ±1 sob o consumo de sólidos solúveis,
que teve valor inicial de 96,2 g.L-1 e
produção de etanol, objetivando-se buscar o
meio que proporciona maior concentração
de etanol, em menor tempo.
Extração do caldo e preparo do mosto
O caldo de cana utilizado para
condução da fermentação alcoólica foi
obtido junto à moenda, na etapa de moagem
da cana-de-açúcar. Este foi filtrado com
auxílio de peneiras granulométricas (66 e
106 μm) para remoção de impurezas
grosseiras, restos de bagaço e sujeiras.
Após o processo de extração,
ajustou-se p caldo pH, concentração de
sólidos solúveis e temperatura conforme o
planejamento apresentado na Tabela 1, de
forma que este ficasse apto a nutrição e
desenvolvimento dos microrganimos, bem
como acúmulo do produto desejado.
Ensaio
1
2
3
4
Tabela 1. Planejamento experimental
T (ºC)
pH
S (g.L-1)
29 (±1)
4
96,2
34 (±1)
4
96,2
29 (±1)
6
96,2
34 (±1)
6
96,2
Utilizando-se
um
refratômetro,
mediu-se a quantidade inicial de sólidos
solúveis e por meio de diluição com água
destilada, adequava-se o mesmo aos valores
desejados. Através da Equação 1,
determinava-se a quantia de água a ser
adicionada:
(Equação 1)
C1  V 1  C 2  V 2
Onde: C1: concentração inicial de sólidos
solúveis; V1: volume inicial de caldo; C2:
concentração
desejada;
V2:
volume
desejado.
A correção de pH foi realizada
medindo-se o valor inicial com pHmetro de
bancada e adequando-o conforme os valores
do planejamento, com auxílio de H2SO4 0,1
mol.L-1, e NaOH 0,1 mol.L-1. Após as
correções, o caldo preparado foi distribuído
em 12 erlenmeyers e os mesmos, eram
levados ao banho-maria, que estava com a
temperatura
controlada
conforme
o
planejamento apresentado na Tabela 1.
Processo Fermentativo
Com o caldo corrigido conforme as
necessidades dos microrganismos em
relação a pH e temperatura adicionavam-se
os microrganismos responsáveis pela
conversão da sacarose em etanol, na
MATERIAIS E MÉTODOS
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quantidade de 0,1 g.L-1 por recipiente, de
levedura
Saccharomyces
cerevisiae
comercial e assim iniciava-se a fermentação
alcoólica.
ambos testes foram próximos, e a redução do
pH ao longo do processo é decorrente da
produção de ácidos orgânicos, como lático,
acético e succínico (Figura 1). O pH mais
alcalino, pode gerar alguma inibição dos
microrganismos no consumo do substrato,
fazendo com que aumente a fase de
adaptação das leveduras ao meio,
justificando o maior tempo que os pH’s
menos ácidos, conforme observado na
Figura 1 (ensaios 3 e 4) levaram para ter
atenuação no processo, uma vez que esta
maior variação do valor de pH ao longo do
processo, pode proporcionar estresse
osmótico, linhagens selvagens de bactérias
que conduzam a floculação ou meio
fermentativo inadequado (SCMIDELL et al.
2001).
Análise da cinética do processo
No decorrer do processo de
fermentação
alcoólica,
fez-se
acompanhamento do comportamento de
algumas variáveis em intervalo de 2 horas,
durante as 6 primeiras horas e
posteriormente, em intervalos de 4 horas até
que fosse observada a atenuação do processo
fermentativo, ou seja, até que o consumo de
substrato pelos microrganismos e produção
de produto, estivessem estabilizados.
Analisou-se o pH (com auxílio de pHmetro),
consumo do substrato (com auxílio de
refratômetro) e calculou-se do teor de etanol
em ºGL, utilizando a Equação 2
(CARVALHO et al. 2008).
( Bi  Bf )  4
(Equação 2)
E
7,4
Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
Ensaio 4
pH
7
6
5
4
3
2
Onde: E é a graduação alcoólica em
ºGL; Bi é o Brix Inicial; Bf é o Brix Final.
Uma vez que a graduação Gay Lussac
representa a porcentagem em volume de
etanol presente em uma mistura álcool/água,
realizou-se os cálculos estequiométricos
necessários para transformar para g.L-1.
0
10
20
30
40
50
Tempo (h)
Figura 1. Comportamento do pH em função do tempo
de fermentação.
Analisando a Figura 1, é possível
observar o comportamento do pH durante a
realização dos diferentes experimentos, e a
tendência aumentar a acidez. O pH do meio
em que os microrganismos se encontravam,
tem importância quanto ao desenvolvimento
de fenômenos de floculação, onde as células
se agrupam, ficam pesadas e sedimentam-se,
seja por leveduras floculantes que se
reproduziram ou por bactérias indutoras de
floculação, seja pelo maior tempo de contato
dos microrganismos com o mosto ou pelas
más condições do meio, comprometendo a
conversão de açúcares em etanol e CO2 no
interior das leveduras (CALLEJA, 1974).
A floculação pode ter ocorrido nos
processos de pH inicial mais alto (ensaios 3
e 4), onde o processo demorou mais para
estabilizar, variando pouco a concentração
de açúcares nas últimas horas e convertendo
menos substrato em produto. Quando o pH
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Conforme as diferentes condições de
temperatura e pH utilizadas para o processo
fermentativo, com concentração de açúcares
fixa de 96,2 g.L-1, o resultado dos testes
quanto ao tempo de fermentação, consumo
do substrato e produção de bioetanol, são
apresentados na Tabela 2.
Tabela 2. Variáveis respostas em relação a
diferentes pH e temperatura.
Ensaio
tf (h)
S (g.L-1)
P (g.L-1)
pH final
1
29,5
29
28,32
3,69
2
31
28
28,75
3,68
3
34
32
27,07
3,96
4
37
31
27,49
4,2
A partir dos resultados da Tabela 2,
observou-se que os valores de pH final para
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não está tão favorável ao desenvolvimento
dos microrganismos, a afinidade com o meio
se torna mais lenta, o que dificulta o
consumo do substrato e a conversão em
etanol, podendo levar as leveduras a
flocularem. Quando floculadas e ao fundo,
os microrganismos perdem atividade, ou
seja, não consumiram mais açúcares para
conversão em etanol (CALEJJA, 1974 e
LIMA, 1999).
Quanto as diferentes temperaturas
testadas nos processos, observa-se na Tabela
2, que o ensaio 2, com temperatura de 34 ºC,
foi o que levou a maior produção de
bioetanol. O aumento da temperatura de
fermentação de 29 para 34 ºC, aumentou a
velocidade da fermentação, porém favorece
a contaminação bacteriana e a levedura fica
sensível à toxidez do álcool, também
podendo haver perdas por volatilização
(Lima et al. 2001). Torija et al. (2003),
demonstrou que o rendimento alcoólico, é
maior em temperaturas mais baixas, de 15 a
20 ºC, porém isto leva a tempos
extremamente longos de processo, sendo que
em temperaturas que excedam 35 ºC, a
viabilidade celular decresce, e até esta
temperatura, a taxa inicial de fermentação é
maior.
A temperatura de fermentação
alcoólica deve ser controlada, porque
quando fora dos limites, pode ocasionar um
estresse celular, promovendo declínio na
viabilidade do microrganismo, no consumo
de substrato e na produção do produto de
interesse (WALKER, 1994).
De acordo com os resultados
apresentados na Tabela 2, todos os ensaios
levaram a uma concentração final de etanol
próxima, apresentando maior diferencial
somente no tempo de condução do processo,
sendo que os ensaios 1 e 2 obtiveram maior
concentração de etanol final e tempos
menores. Na Figura 2 e 3, é apresentado a
cinética dos microrganismos quanto ao
consumo de substrato e produção de etanol,
em função do tempo.
Nos gráficos de cinética de consumo
de substrato e produção de bioetanol (figuras
[S]
Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
Ensaio 4
120
100
80
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
Tempo (h)
Figura 2. Consumo do substrato (g.L-1) em função
do tempo de fermentação.
[P]
Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
Ensaio 4
30
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0
10
20
50
Tempo (h)
Figura 3. Produção de bioetanol (g.L-1) em função
do tempo de fermentação.
2 e 3), a concentração de açúcares decresceu
em função do consumo destes pelos
microrganismos, até que chegasse a um
valor e permanecesse constante, onde os
fatores de conversão são baixos, devido à
falta de condições (açúcares) no meio.
Conforme
os
açúcares
são
consumidos, aumenta a liberação de etanol e
CO2, sendo que a velocidade de
metabolização do açúcar, produção de
produto e tempo de processo são
dependentes das condições em que o meio se
encontra (LIMA et al. 2001). Normalmente,
espera-se que a fermentação alcoólica acuse
esta atenuação completa (0 °Brix) em um
período de 24 a 36 horas (LIMA, 1999),
CONCLUSÕES

A viabilidade celular do processo
fermentativo, foi influenciada pelo
pH e pela temperatura, podendo-se
observar que afetam principalmente
no tempo de fermentação e não tanto
na concentração final do etanol, com
isso, os ensaios que levaram mais
tempo (3 e 4) para ter uma
concentração de etanol próxima aos
demais (1 e 2), são ensaios que
apresentaram um maior consumo
energético, principalmente pelo fato
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

de que necessitam de controle de
temperatura por mais tempo para
manter o mosto nas temperaturas
desejadas;
BATISTA, A.S. Saccharomices cerevisae em milho
armazenado e o efeito na redução de aflatoxicoses.
Tese de Mestrado. Universidade de São Paulo, Escola
Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz",
Piracicaba, SP, Brasil, 2001.
Os ensaios que levaram a maior
produção do produto de interesse,
foram os ensaios 1 e 2, que em 29,5 h
levaram a 28,32 g.L-1 de etanol e em
31 h, 28,75 g.L-1, respectivamente;
CALLEJA, G.B. On the nature of the forces involved
in the sex-directed flocculation of a fission yeast.
Can. J. of Microbiol., v.20, n.6, p.797-803, 1974.
CARVALHO, W.; CANILHA, L.; ALMEIDA E
SILVA, J. B. de. Cinética da fermentação e balanço
de massa da produção de cachaça artesanal. Braz. J.
Food Technol., VII BMCFB, 2008.
Os ensaios com pH inicial de menor
acidez, requerem maior tempo para
estagnação do processo, uma vez que
os meios tendem a se tornar mais
ácidos pela liberação de alguns
ácidos e ésteres, buscando tornar o
meio mais apto ao consumo de
açúcares e produção de etanol. Então,
os meios que se demonstraram
menos propícios, somente levaram
mais tempo, influenciando pouco na
concentração final de bioetanol.
GOMES, E. Efeito do tratamento ácido da levedura
Saccharomyces cerevisiae na fermentação alcoólica.
(Dissertação-MestradoEscola
Superior
de
Agricultura “Luiz de Queiroz” USP). Piracicaba,
1988, p. 206.
LIMA, U. A. et al. Biotecnologia Industrial:
Processos Fermentativos e Enzimáticos. São Paulo –
SP, Blucher, v. 3, 593p., 2001.
LIMA, U. A. Aguardente: fabricacao em pequenas
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Agrarios Luiz de Queiroz, 1999. 187 p
MAGALHÃES, P.G. 30 anos de Pro álcool no
centro de debate. Jornal da Unicamp, Campinas, v.
309, p.11, 2005.
Agradecimentos
ROS, B. P. Avaliação da resistência de variedades de
cana-de-açúcar ao raquitismo-da-soqueira com base
na taxa de colonização dos colmos por Leifsonia xyli
subsp. Xyli, 2004. 70 p. Dissertação (Mestrado em
ciências) – Escola Superior de Agricultura “Luiza de
Queiroz”, Universidade de São Paulo, Piracicaba, SP.
Agradeço a Deus, a UFPR pelo
espaço cedido para realização dos
experimentos, a bolsa de Iniciação Científica
UFPR/TN e a orientação do prof. Joel G.
Teleken.
SCMIDELL, W.; LIMA, U.A.; AQUARONE, E.;
BORZANI, W. Biotecnologia Industrial: Engenharia
Bioquímica. São Paulo - SP, Blücher, v.2, 560 p.,
2001.
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