DS-EIA-TSH
Este manual contém informações para uso profissional, manutenção e preservação do kit.
Kit reagente suficiente para 96 testes inclui controles sendo possível o uso parcial (tiras
quebráveis) em protocolo manual ou automatizado.
Conjugado
I. Finalidade
DS-EIA-TSH foi desenvolvido para a determinação quantitativa de concentrações do Hormônio
Tireoestimulante em soro humano através de ensaio imunoenzimático em microplaca.
Para uso de diagnostico in vitro.
II. Introdução
A dosagem da concentração sérica do TSH, uma glicoproteína com peso molecular de 28.000
Dalton e secretado pela glândula pituitária anterior, é normalmente considerada o mais sensível
indicador disponível para o diagnostico de hipotiroidismo primário e secundário (pituitário).
Aumento na concentração sérica do TSH, primariamente responsável pela síntese e lançamento
dos hormônios tireoidianos, é um indicador inicial e sensível no declínio da reserva tireoidiana, e
em conjunto com o declínio da concentração de T4 auxilia no diagnostico do hipotiroidismo
primário. O esperado aumento na concentração de TSH demonstra o clássico sistema de
“feedback” negativo entre as glândulas pituitária e tireóide. Adicionalmente, a dosagem de TSH
é igualmente útil na diferenciação secundária e terciária (hipotalâmico) do hipotiroidismo da
patologia da tireóide primária. A liberação do TSH pela glândula pituitária é regulada pelo fator
de liberação da tireóide (TRH) que é secretado pelo hipotálamo e pela ação direta do T4 e T3
na pituitária. Aumento nos níveis de T3 e T4 reduz a resposta da pituitária para a estimulação
pelo TRH. No hipotiroidismo secundário ou terciário, a concentração do T4 é normalmente baixa
e os níveis de TSH são geralmente baixos ou normais. Também a deficiência do TSH pituitário
(hipotiroidismo secundário) ou insuficiência da estimulação da glândula pituitária pelo TRH
(hipotiroidismo terciários) causa esta situação (T4 baixo e TSH baixo ou normal).
O kit “DS-EIA-TSH”é utilizado no auxilio do status tireoidiano, diagnostico de doenças da
tireóide e tratamento das doenças da tireóide.
III. Principio do teste
DS-EIA-TSH é um imunoensaio de um passo, baseado no principio do método do sanduiche. O
teste utiliza anticorpo monoclonal de alta afinidade e especificidade (enzima conjugada e
imobilizada) diretamente contra um determinante antigênico distinto da molécula intacta de
TSH. A amostra teste é estimulada a reagir simultaneamente com dois anticorpos, resultando
num sanduiche das moléculas de TSH entre a fase sólida e anticorpos ligados a enzima. Depois
da incubação as cavidades são lavadas com solução tampão de lavagem para remover os
anticorpos marcados não ligados. Uma solução de Substrato TMB é adicionada e incubada,
resultando no desenvolvimento de uma cor azul. O desenvolvimento da cor é bloqueado com a
adição do Reagente de Parada, mudando a cor para amarelo. A concentração de TSH é
diretamente proporcional a intensidade da cor na amostra teste. A absorbância é medida
espectrofotometricamente a 450 nm.
IV. Componentes do kit
Componente
Microplaca
revestida
com
anticorpos anti-TSH
Calibradores
Soro Controle
Composição
Poliestireno. 96 poços (quebráveis).
Poços revestidos com anticorpo
monoclonal anti-tiroxina. Após aberto,
as tiras podem ser estocadas em 28ºC durante a validade do kit.
Seis frascos de soro humano em
concentrações aproximadas* de 0 (0),
0.25 (1), 0.5 (2), 4.0 (3), 8.0 (4), 16.0
(5) uIU/ml . * Os níveis exatos são
dados nas etiquetas dos frascos e nos
certificados de análise de cada lote. Os
calibradores são calibrados WHO 3nd
IRP
81/565.
Os
líquidos
são
transparentes ou ligeiramente opacos
ou
amarelados.
Agente
de
preservação: 0.1% ProClin 300,
0.004% sulfato gentamicina, 0.1%
fenol. Após abertos, os calibradores
devem ser utilizados dentro de dois
meses. Estocar em 2-8ºC até a
validade no frasco firmemente selado
Soro humano com quantidade definida
de TSH. O líquido é transparente ou
ligeiramente
opaco,
incolor,
ou
amarelado. Agente de Preservação:
0.1% ProClin 300, 0.004% sulfato
gentamicina e 0.1% fenol. Após
aberto, o soro do controle deve ser
utilizado dentro de dois meses. Estocar
2-8ºC até a validade no frasco
firmemente
selado.
Checar
a
concentração do soro no rótulo do
Apresentação
1 placa com 96 poços
(12X8)
6 frascos
cada
de
0.5ml
01 frasco de 0.5ml
Solução
Lavagem
(concentrada
vezes)
Substrato TMB
de
25
Solução de Parada
frasco.
Anticorpo
monoclonal
anti-TSH
conjugado com Peroxidase (HPR).
Liquido pink transparente. Agente de
preservação: 0.1% ProClin 300 e
0.004% sulfato gentamicina. Após
aberto, o conjugado deve ser utilizado
dentro de dois meses.Estocar em 28ºC até a validade no frasco
firmemente selado
O
líquido
é
transparente
ou
ligeiramente
opaco,
incolor,
ou
amarelado. Estocar 2-8ºC até a
validade no frasco firmemente selado
Tetrametilbenzidina (TMB) em tampão
citrato, contendo H2O2. Líquido incolor
transparente. Uma vez que aberto, o
Substrato TMB deve ser utilizado
dentro de dois meses. Estocar em 28ºC até a validade no frasco
firmemente selado
Solução ácida 0,2M de acido sulfúrico.
Líquido incolor transparente. Estocar
em 2-8ºC até a validade no frasco
firmemente selado
1 frasco de 6.0 ml
•
Forneça ventilação adequada.
• Não esqueça de neutralizar e/ou esterilizar os desperdícios da lavagem e líquidos que contêm
amostras biológicas antes de rejeitá-las no recipiente. As amostras e o reagente da origem
humano, assim como, material contaminado e os produtos devem ser rejeitados após a
descontaminação, que pode ser realiada das seguintes formas: imersão em alvejante em
uma concentração final de 5% de hipoclorito de sódio (1 volume de alvejante para 10
volumes de líquido ou de água contaminada) por 30 minutos; esterilização por 1 hora em
temperatura de 124-128ºС e na pressão 1.5 kHz/sm2 (0.15 MPa) ou tratamento de ebulição
por 30 minutos.
•
Alguns reagentes contem Proclin 300 (0,1%)
01 frasco de 50.0ml
•
Irritante. Pode causar sensibilização em contato com a pele. Depois do
contato com a pele, lave imediatamente com água e sabão com abundância.
1 frasco 14.0 ml
VII. Materiais e equipamentos exigidos, mas não fornecido no kit.
• Água destilada
• Pipeta simples e multicanal, ajustável ou fixa, para medir e dispensar 50 ul, 100 ul e 150 ul.
• Lavadora automática de microplacas
• Equipamento de leitura de microplaca com filtro de 450 nm e 405-415nm
• Luvas descartáveis
1 frasco 25.0 ml
VIII. Coleta e manipulação de amostras
Coletas de amostras de sangue devem ser realizadas de acordo com as práticas usuais. Usar
apenas soro. Separar imediatamente o soro para evitar a formação de hemólise. Hemólise forte
pode afetar o desempenho do teste. Amostras com partículas suspensas devem ser clareadas
através de centrifugação antes do início do teste. Partículas de fibrina suspensas ou agregadas
podem dar falsamente resultados positivos. Não aqueça as amostras. O sangue deve ser obtido
através de coleta a vácuo, tubo tampa vermelha, sem aditivo ou barreira de gel.
Amostras podem ser armazenadas entre 2-8°C até 72 horas; para períodos de armazenagem
mais prolongados, recomenda-se o congelamento em -20ºC. Evite repetir ciclos de congelar e
descongelar. Amostras que forem congeladas e descongeladas mais de uma vez não podem ser
utilizadas. Amostras com hemólise, lipídicas ou tratadas com azida sódica não devem ser
analisadas.
Adicionalmente os seguintes ítens são inclusos:
- uma tampa para placas de poliestireno 96 tiras ou uma película protetora para placas de EIA;
- ponteiras descartáveis;
- um prato plástico para reagentes líquidos;
- um filme auto-adesivo.
V. Precauções
A confiabilidade dos resultados depende da execução correta das Boas Práticas de laboratório:
• A temperatura no laboratório deve estar em 18-24 ºC.
• Não use reagentes vencidos.
• Não misture reagentes de diferentes lotes com o teste em uso.
• Reconstitua com cuidado os reagentes para evitar contaminação.
• Não realize o teste na presença dos vapores reativos (vapores de ácido, substâncias alcalinas
e/ou de aldeído) ou da poeira que poderia alterar a atividade de enzima dos conjugados.
• Use os produtos de vidraria completamente lavados e enxaguados com água deionizada ou
preferivelmente, material descartável.
• Não permita que a microplaca seque entre o fim da operação de lavagem e a distribuição do
reagente.
• A reação de enzima é muito sensível aos íons do metal. Conseqüentemente, não permita que
nenhum elemento do metal entre em contato com as várias soluções do conjugado ou da
solução do substrato.
• Use ponteiras novas para distribuição de cada amostra.
• Uma boa lavagem é um passo crítico neste procedimento: respeite o número recomendado de
ciclos de lavagem e certifique-se de que todos os poços estão preenchidos completamente e
então esvaziados completamente. A lavagem incorreta pode conduzir aos resultados imprecisos.
• Nunca use o mesmo recipiente para distribuir o conjugado e a solução de desenvolvimento de
cor.
• Verifique as pipetas e equipamento para ver se há exatidão.
• Não mude o procedimento de ensaio.
• Use água de elevada qualidade.
• Evite a exposição dos reagentes ao calor excessivo ou à luz solar durante o armazenamento e
a incubação.
VI. Instruções de saúde e segurança.
•
Todos os reagentes inclusos no kit são para uso de diagnóstico in vitro.
•
O soro controle foi testado e encontrou-se negativo para HBsAg, anticorpos do vírus da
hepatite C e anticorpos do vírus de imunodeficiência humana (HIV-1 e HIV-2) e antígeno
p24 HIV-1.
•
Manipular reagentes e amostra de pacientes como capazes de transmitir doenças
infecciosas devido à falta de um método capaz de oferecer completa segurança que
agentes infecciosos estão ausentes.
•
Não comer, beber, fumar ou aplicar cosméticos onde materiais imunodiagnósticos
estiverem sendo manipulados.
•
Não pipete com a boca.
•
Qualquer equipamento diretamente em contato com amostras e reagentes bem como as
soluções de lavagem devem ser considerados como produtos contaminados e devem ser
tratadas como tal.
•
Utilizar avental e luvas descartáveis quando manipular reagentes e amostras e lavar as
mãos após a manipulação dos materiais.
•
Evite derramar amostras ou soluções contendo amostras.
•
Evite qualquer contato com o Substrato TMB e Reagente de Parada com a pele e mucosa.
IX. Preparo dos reagentes
1. Reagentes pronto para uso.
•
Microplaca
•
Calibradores
•
Soro controle
•
Conjugado
•
Substrato TMB
•
Solução de Parada
2. Reagente a ser preparado:
Solução de lavagem. Homogeneíze cuidadosamente a solução de lavagem concentrada. Para
preparar a solução de trabalho adicione à solução concentrada água purificada (razão de 1:25)
em frasco separado. Homogeneíze cuidadosamente a solução. A solução de trabalho pode ser
armazenada por até 14 dias em temperatura ambiente ou 28 dias em 2-8ºC.
X. Procedimento do teste
Nota: permita que os reagentes atinjam a temperatura ambiente por 30 min. antes do início do
teste.
1. Traga todos os componentes e amostras dos pacientes a serem testados à temperatura
ambiente.
2. Formate os poços do microplaca para os calibradores, soro controle e amostra dos pacientes
a serem analisados em duplicata e um ou dois poços para o branco. Deixe poços não utilizados
na embalagem, não remova a sílica gel e armazene entre 2–8°C durante a validade do kit.
3. Adicione 50µl de cada calibrador, soro controle e amostras dos pacientes em cada
cavidade. A pipetagem das amostras não deve ultrapassar 10 minutos para não ocorrer erro no
ensaio.
4. Adicione 50µl do conjugado em todas as cavidades, exceto no branco.
5. Cubra a placa com uma tampa ou com o filme adesivo e incube com agitação
(aproximadamente 500-800 RPM) por 45 minutos (37.0 ± 0.5 ºC) ou incube com
agitação (aproximadamente 500-800 RPM) por 60 minutos (20-25ºC). O ensaio pode
ser conduzido na temperatura ambiente (20-25ºC) sem agitação. Neste caso, misture
gentilmente o conteúdo dos poços por 30 segundos após a adição das amostras e da solução
conjugada de trabalho, cubra as tiras com uma tampa ou filme adesivo e incube por 120
minutos (20-25ºC).
6. Lave os poços 5 vezes com 300µl da solução de lavagem de trabalho por poço e bata a
placa levemente em papel toalha para assegurar-se de que esteja seco, o volume residual
dever ser menor que 10µl (O uso de uma lavadora automática é recomendado).
7. Adicione 100µl do Substrato TMB em cada cavidade no mesmo intervalo.
8. Incube por 15-20 minutos em temperatura ambiente no escuro.
9. Adicione 150µl da Solução de parada em cada cavidade no mesmo intervalo do
procedimento 7. Misture gentilmente por 5-10 segundos.
10. Leia em absorbância em leitora de microplaca em 450nm. Em caso de valores de
absorbâncias altas ler em 405-415 nm. A leitura deve realizada em até 20 minutos após a
adição da solução de parada.
O esquema do ensaio é representado abaixo.
1
Adicionar
50 µl de Calibrador
50 µl soro controle
50 µl amostras
Reservar um ou dois poços para o branco
2
Adicionar
50 µl do conjugado, exceto no branco.
3
Incubar
45 min com agitação (500-800 rpm) em 37.0± 0.5ºC
ou 60 min com agitação (500-800 rpm) em 20-25 ºС
ou 120 min em 20-25 ºС
4
Lavar a placa
300 µl de solução de lavagem de trabalho por 5 vezes
5
Adicionar
100 µl do substrato TMB
6
Incubar
15-20 min, no escuro
7
Adicionar
150 µl da solução de parada em cada poço
8
Homogeneizar
5-10 segundos o conteúdo dos poços
9
Ler em densidade
450 nm ou 405/415 nm
optica
Modelo de dados
Calibrador
DO1
DO2
Media DO
0
1
2
3
4
5
desconhecido
0.05
0.073
0.125
0.475
0.988
2.083
0.502
0.05
0.07
0.111
0.429
0.944
2.111
0.54
0
0.0215
0.068
0.402
0.916
2.047
0.471
Valor
(uIU/ml)
0
0.25
0.5
4
8
16
4.53
NOTA: os dados apresentados na tabela acima são meramente ilustrativos e não devem ser
utilizados no lugar das amostras analisadas no momento do ensaio.Cada usuário devera obter
seus dados e curva padrão.
Cálculo dos resultados
1.
Calcule a média da densidade óptica de cada calibrador em duplicata em ambos os
comprimentos de onda (450 e 405-415nm).
2.
Calcule a media da densidade óptica de cada amostra desconhecida em duplicata.
3.
Subtraia o valor médio da absorbância do branco do valor médio da absorbância dos
calibradores, controles e amostras.
4.
Desenhe uma curva de calibração em papel gráfico linear com as densidades medias
ópticas no eixo Y e a concentração dos calibradores no eixo X (450 e 405-415nm)
5.
Leia os valores das amostras desconhecidas diretamente na curva dos calibradores, se
DO da amostra for menor que 2,5 em 450nm utilizar a curva do 450nm. Se DO da
amostra for maior que 2,5 em 450nm utilizar a curva de calibração lida em 405-415nm.
Uma curva de 4 parâmetros é recomendada.
6.
Se a leitura de alguma amostra for superior a 16uIU/ml, a diluição com o calibrador
zero deve ser realizada. O resultado obtido deve ser multiplicado pelo fator de diluição.
Validação do teste
Para o teste ser validado os seguintes critérios deverão ser observados:
1.
DO branco: o valor da absorbância não deverá ser maior que 0,1 em 450 nm.
2.
DO calibrador 5 (16uIU/ml): não deve ser inferior a 1,3.
3.
O valor calculado do soro controle deve estar entre os limites estabelecidos (verificar
valor no rótulo do frasco).
Calibrador 6
Se utilizar o calibrador 6 na curva de calibração obtida em 405-415nm
1. Calcular a densidade óptica média do calibrador 5 e 6 duplicado na 405-415nm
2. Desenhar uma curva de calibração em papel de gráfico linear com densidades ópticas médias
no eixo y e o calibrador no eixo x.
3. Ler os valores desconhecidos com d.o superior calibrador 5 e d.o diretamente fora da curva
obtida em 405-415
Espectrofotômetro
A presença do conjugado + amostra em cada poço deve ser verificada por leitura automática
em 540 (550) nm. Cada poço que contém amostra e conjugado dever ter DO maior que 0,500.
XI Características do desempenho
1. Limite Dinâmico do Ensaio
O limite do ensaio está entre 0 – 16 uIU/ml.
2.
Sensibilidade Analítica
A sensibilidade foi calculada determinando a variabilidade do calibrador 0 mUI/ml (10
replicatas) utilizando dois desvios padrões. DS-EIA-TSH apresentou uma sensibilidade de
0,05 uIU/ml.
Conseqüentemente, os resultados de todos os pacientes que receberem a preparação de
anticorpos de rato para diagnóstico ou a terapia devem ser interpretados com cuidado.
7.Nenhum efeito gancho foi observado neste teste
8.O desempenho deste teste não foi estabelecido com amostras neonatal.
3. Especificidade (Reação Cruzada)
As seguintes substâncias foram testadas para reação cruzada no teste:
Substancia
Concentração, uIU/ml
Reação cruzada
TSH
100%
hCG
50 000
0
1 000
0,000009%
LH
500
0,0003%
25
0,0006%
FSH
1000
0,00007%
50
0
4. Precisão
Precisão Intra-Ensaio
A variação do ensaio é demonstrada no quadro abaixo:
Amostra
n
uIU/ml
1
32
1.75
2
32
15.55
XIV. Condições de Armazenamento e Transporte
Validade do kit é de 18 meses. Mantenha em local escuro entre 2-8°C.
O transporte deve ser feito por todos os tipos de transporte em temperatura entre 9 e 20°C e
não devem durar mais de 10 dias.
É expressamente proibido congelar o material.
SD
0.07
0.79
CV%
4.0
5.1
Precisão Inter-Ensaio
A variação do ensaio é demonstrada no quadro abaixo:
Amostra
uIU/ml
SD
1
1.75
0.07
2
15.55
0.79
CV%
4.0
5.1
5. Recuperação
Varias quantidades de TSH foram adicionadas ao soro da amostra de paciente para determinar
a recuperação. Os resultados estão descritos na tabela abaixo:
Adicionado
conc. uIU/ml
16
8
0
Medido
uIU/ml
3.8
9.0
6.3
1.92
conc.
Esperado
uIU/ml
3.8
9.9
5.9
1.9
RPC “Diagnostic Systems”, Ltd.
22, Yablonevaya, Nizhny Novgorod, 603093, Russia
Tel/fax: (831) 434-86-83
E-mail:[email protected], www.npods.ru
DSI S.r.l.
Saronno (VA), Via A.Volonterio, 36а, 21047, Italy
Tel:+39 02 967 09111, Fax: +39 02 962 0185
E-mail: [email protected], www.dsitaly.com
XV. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1.
Fisher, DA, Physiological variation in Thyroid hormones. Physiological and
pathophysiological considerations. Clin Chem, 42, 135-139 (1996)
Spencer, CA, et al, Interlaboratore/Intermethod differences in functional
2.
sensitivity of immunometric assay of Thyrotropin (TSH) and impact on reliability of
measurement of subnormal concentration of TSH, Clinical Chemistry, 41, 367
(1995)
XVI. Significado dos símbolos
conc.
Recuperação
Marca Europeia (European directive 98/79/CE
on in vitro diagnostic medical devices)
91%
107%
101%
Diagnóstico in vitro
Linearidade
Amostra de soro de paciente foi diluída com o Calibrador zero. Os resultados estão tabulados
abaixo:
Amostra
Medido conc. uIU/ml
Esperado conc. uIU/ml
Recuperação
Não diluido
18
1:2
9.2
9
102%
1:4
4.4
4.5
98%
1:8
2.1
2.25
93%
Limite de temperatura
7. Valor de referência
É recomendado que cada laboratório determine seu próprio valor de referência.
Validade ССYY-MM-DD
Grupo
Recém-nascido
Até 2,5 meses
2,5 meses a 2 anos
2-5 anos
5-14 anos
Adultos
Valor, uIU/ml
1,1 – 17,0
0,6-10,0
0,4-7,0
0,4-6,0
0,4-5,0
0,4-4
8. Precisão
DS EIA TSH foi comparado com kit de imunoensaio de quimiluminescência de microparticulas
como teste de referência. O número total de amostras foi de 1016. Os valores variam de 0,05 a
25 uIU/ml. A análise da regressão linear apresentou y= 1,4+0,9(x) com coeficiente de
correlação de 0.92.
XII Limitações do teste
1.Todos os reagentes do kit estão calibrados para a determinação de TSH no soro humano. O
kit não é calibrado para a determinação de TSH em saliva, plasma ou em outras amostras de
origem humana ou animal.
2.Amostras inadequadas ou a modificação deste teste pode influenciar os resultados.
3.Somente o calibrador 0 pode ser utilizado para diluição das amostras. O uso de outros
reagentes pode ocasionar resultados falsos.
4.Os resultados obtidos com este kit nunca devem ser utilizados como a única base para um
diagnóstico clínico. Todo o resultado de laboratório é somente uma parte do quadro clínico do
paciente.
5. Um decréscimo nos valores de TSH pode ocorrer com administração de propranolol,
metimazol, dopamina e d-tiroxina.
6.A ocorrência de anticorpos heterofilicos em pacientes com exposição regular a animais ou
produtos de origem animal tem potencial de causar interferências nos testes imunológicos.
Fabricação
lote
Consultar instruções de uso
Irritante
Importado e Distribuido por:
RZ DE OLIVEIRA DIAGNÓSTICA
Rua Apinajés, 1694 (antigo Dr. Paulo Vieira, 91)
CEP.01258-000 - Pompéia - São Paulo - SP
CNPJ 05.328.040/0001-80
Técn. Resp. Dra. Renata Zuculin de Oliveira - CRF-SP 37986
Para uso exclusivo diagnóstico "in vitro"
Reg. ANVISA 80313040087
POTENCIALMENTE INFECTANTE
CONSERVAR A TEMPERATURA 2°C A 8°C
PARA DESCARTE, CONSULTAR INSTRUÇÕES DE USO
SERVIÇO DE ATENDIMENTO AO CLIENTE:
Quaisquer dúvidas técnicas no manuseio deste kit ou no seu procedimento, contatar a
nossa ASSESSORIA CIENTÍFICA.
Atendimento ao consumidor - Fone (011)-3871-0095
Revisão: Agosto 2011