AGRADECIMENTOS|I
AGRADECIMENTOS
Os principais agradecimentos são dedicados ao meu Orientador Prof. Doutor Manuel Mota e
Co-Orientador Prof. Doutor António Augusto Cunha. Esta oportunidade que me concederam
de enveredar por um novo percurso numa nova área de Investigação, trouxe um grande
enriquecimento a nível pessoal e científico, apesar de ter sido uma tarefa árdua e difícil. Com
a orientação, ensinamentos transmitidos e estímulo dos meus orientadores esta tarefa foi
facilitada, não tanto pela sua constante presença mas pela sabedoria, inteligência e partilha
de conhecimentos demonstrados. De facto não foi fácil ter como exemplo dois orientadores
de tão elevado mérito científico. As suas capacidades inesgotáveis, inteligência e sapiência,
fizeram-me sentir bastante incipiente na investigação. Durante todos estes anos é difícil não
criar laços de amizade mesmo com as pessoas aparentemente mais distantes, pelo que até
já sinto nostalgia pela presença destas duas pessoas de tão elevada estima que foram e
serão sempre um exemplo académico de elevada competência.
Ao longo destes anos ao qual sempre estive ligada ao meu Doutoramento, nem sempre a
tempo inteiro, é difícil expressar por escrito todas as pessoas que contribuíram para a sua
realização. Quem me conhece sabe que foram anos muito difíceis da minha vida, o que com
a ajuda de amigos e familiares se tornou uma tarefa menos “penosa”. É difícil separar a
nossa vida pessoal do nosso trabalho, daí eu dedicar esta Tese aos meus queridos pais. Tudo
o que eu consegui até hoje deve-se a eles. A minha dedicação, o meu empenhamento, a
minha persistência, às vezes confundida com “teimosia”, perseverança, a minha capacidade
de trabalho são reflexo dos seus ensinamentos e do seu exemplo de trabalho. A sua presença
incondicional foi fundamental, principalmente o espírito positivo e a determinação que a
minha mãe sempre me incutiu. O seu incentivo, encorajamento e apoio permitiu superar
todos os momentos de pessimismo e desalento por que passei.
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
AGRADECIMENTOS|II
À minha irmã devo muitas horas de ausência, foi ela que sempre ajudou os meus pais nas
horas difíceis e esteve sempre presente quando necessário, sem ela nunca conseguiria
dedicar tantos anos a esta Tese, em detrimento da sua companhia e amizade.
Queria também manifestar o meu agradecimento à Escola Superior de Tecnologia e Gestão,
com especial carinho à Doutora Manuela Vaz Velho, minha Coordenadora de Subgrupo pela
disponibilidade, dispensa, amizade e incentivo que sempre me concedeu ao longo destes
anos. Sem essa disponibilidade e apoio este trabalho nunca teria sido desenvolvido.
As minhas queridas amigas estiveram sempre presentes para os desânimos e para os
tempos de descontracção, e a amizade e o carinho demonstrados foram imprescindíveis para
a prossecução deste trabalho. Não posso deixar de mencionar a amiga Ana Queiroz, que me
apoiou no início conturbado da escrita desta Tese e que me possibilitou o acesso à biblioteca
do INEB, estando sempre disponível para ajudar. Teve também a amabilidade de corrigir
parte importante desta Tese. Será desnessário mencionar a Rita, minha amiga ao longo do
curso e durante todos estes anos. Tenho a felicidade de a ter conhecido. Esteve sempre
presente nas horas mais difíceis partilhando comigo esses maus momentos, a sua
cumplicidade, solidariedade e encorajamento foram imprescindíveis.
Ao Pablo, meu grande amigo durante todos estes anos e conhecedor nas questões
informáticas, queria agradecer a sua paciência, amizade, disponibilidade e apoio que sempre
demonstrou mesmo quando aparentemente tudo parecia difícil, ele simplificava tudo não
deixando que eu desmotiva-se e desistisse.
Ao Prof. Doutor Eugénio Ferreira agradeço a sua dedicação, paciência e empenhamento no
auxílio do desenvolvimento de um modelo matemático que possibilitou a publicação de um
artigo durante o desenvolvimento deste trabalho. Os seus conhecimentos ao nível da
informática foram imprescindíveis durante o desenvolvimento desta Tese.
Ao Departamento de Engenharia Biológica agradeço toda a disponibilidade, apoio e
facilidades concedidas. Um agradecimento muito especial ao Sr. Santos pela ajuda em todas
as tarefas solicitadas ao qual sempre correspondeu com amabilidade, simpatia e
disponibilidade. Não podia deixar de agradecer à Engenheira Madalena Vieira toda a ajuda e
auxílio prestado, principalmente durante a realização das análises em HPLC.
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MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
AGRADECIMENTOS|III
Ao Departamento de Engenharia de Polímeros agradeço toda a ajuda disponibilizada de
meios materiais e humanos, assim como a cedência dos materiais utilizados durante o
desenvolvimento deste trabalho.
Por fim agradeço à Junta Nacional de Investigação Científica e Tecnológica, pelo seu apoio
financeiro de uma bolsa de Doutoramento que me foi concedida no âmbito do Programa
PRAXIS XXI, BD/13659/97.
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
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AGRADECIMENTOS|IV
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MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
SUMÁRIO|V
SUMÁRIO
Misturas termoplásticas à base de amido e respectivos compósitos têm sido propostas em diferentes
aplicações biomédicas, especialmente em aplicações ósseas temporárias, devido às suas
propriedades mecânicas análogas ao osso e comportamento biodegradável e bioactivo (promoverem
ligação ao tecido ósseo). Estes materiais têm comportamento biocompatível, tal como demonstrado
em vários ensaios in-vitro e in-vivo. Uma característica intrínseca destes materiais é a sua capacidade
de serem degradados por enzimas, assegurando que o implante seja metabolizado por mecanismos
fisiológicos normais, biocompaveis com o organismo. As misturas à base de amido, contêm
monómeros de origem natural, o que reduz a possibilidade de ocorrência de problemas associados à
toxicidade destes materiais, seus produtos de degradação (glucose, maltose e cadeias de amido de
baixo peso molecular), ou estimulação de reacções inflamatórias crónicas.
Vários estudos in vitro e in vivo têm sido preconizados com vista à aplicação destas misturas
termoplásticas na área biomédica. No entanto, a informação que existe sobre a degradabilidade
destas misturas e efeito dos seus produtos de degradação na biocompatibilidade do organismo é
escassa. A avaliação dos produtos libertados por degradação é de crucial importância, sendo
necessário assegurar que os produtos de degradação não sejam tóxicos para o organismo e sejam
elimináveis através de qualquer um dos sistemas orgânicos de eliminação. Em substituições ósseas
temporárias, uma das aplicações biomédicas propostas para estes materiais, é essencial conhecer a
taxa de degradação e se esta acompanha minimamente a restituição do novo osso, caso contrário, a
mistura termoplástica não tem viabilidade funcional. É necessário assegurar uma transferência
gradual da carga do implante para o osso em recuperação e evitar assim uma segunda cirurgia para a
remoção do implante.
O principal objectivo deste trabalho é a caracterização dos principais mecanismos de degradação
desencadeados nestas misturas quando imersas em meio fisiológico, que simule as condições a que
estes materiais são sujeitos quando implantados e em contacto com os fluidos do corpo humano. Os
estudos de degradação foram realizados numa solução fisiológica simulada, com e sem adição de αamílase, numa concentração enzimática semelhante à encontrada no plasma sanguíneo humano. A
perda de propriedades por degradação foi monitorizada pela identificação e quantificação da
percentagem de produtos de degradação e de plasticizador em solução, e alterações morfológicas
superficiais ao longo do tempo de imersão. A cinética de degradação destes materiais foi
acompanhada por estudos de difusão na ausência de reacção enzimática, quantificando os
coeficientes de difusão da glucose e glicerol em SEVA-C de diferentes espessuras. A limitação
estrutural à degradação associada à razão área exposta/substrato foi estudada em experiências
fazendo variar a espessura dos materiais entre provete e filmes (diferentes áreas de exposição), e a
concentração de enzima em solução.
As misturas termoplásticas em solução fisiológica sem enzimas degradam pouco, podendo ser
identificadas 3 fases distintas: a primeira, até 3-4 dias, está relacionada com a difusão simples rápida
de plasticizador (glicerol) e cadeias poliméricas de baixo peso molecular para a solução, assim como
a acção lubrificante da água. A fase seguinte corresponde a um período sem perda significativa de
peso (entre 4 e 30 dias). Na fase final para períodos de imersão superiores a 60 dias existe uma
estabilização da taxa de degradação, atribuída possivelmente ao ataque do complexo amilose-EVOH,
menos susceptível de ser degradado. Além destes resultados analíticos foi possível observar, por SEM,
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SUMÁRIO|VI
alterações na superfície morfológica do material, pelo aumento do número e tamanho dos poros e
rugosidade ao longo do tempo de imersão, permitindo a absorção de crescentes quantidades de água
e difusão de produtos para a solução.
Durante os ensaios de difusão o único composto libertado foi glicerol, com coeficiente de difusão mais
elevado que a glucose. As alterações no coeficiente de difusão variam na razão directa da espessura
dos materiais. Os valores calculados encontram-se bem ajustados ao modelo, de acordo com os
valores do coeficiente de correlação obtidos em materiais de espessura mais elevada.
Os estudos de degradação na presença de enzima evidenciaram a forte acção enzimática na
velocidade de degradação. Na ausência de enzimas a percentagem de açúcares libertados é cerca de
100% inferior.
Com base nos resultados das experiências de degradação na presença de enzimas foi proposto um
modelo estrutural, que descreve os parâmetros condicionadores e limitantes do processo de
degradação, associados à especificidade da microestrutura/porosidade destes materiais e rearranjo
do amido nos domínios internos, fortemente interligado com o componente sintético (IPN). Este tipo
de configuração dificulta a difusão hidrolítica interna/externa e a ligação das enzimas ao substrato,
sendo degradada apenas parte da fase amorfa do material (25%), estabilizando a velocidade de
degradação após 100 dias de imersão. A libertação da fase amorfa foi compensada pelo aumento da
percentagem de absorção de água estrutural, obtendo-se uma boa correlação entre o grau de
hidratação e a percentagem de perda de massa total de compostos libertados.
A limitação da área superficial exposta e a concentração enzimática em solução, foi confirmada pela
diferença na percentagem de açúcares em solução nas experiências realizadas com provetes e filmes.
A degradação enzimática não depende directamente da massa de material mas da área superficial
exposta, já que para materiais com a mesma massa mas com áreas diferentes a percentagem de
sacarídeos em solução é diferente. No entanto, o aumento da área nos filmes não conduziu a um
aumento proporcional da percentagem de sacarídeos, devido à saturação do número de locais activos
e de união enzimáticos.
O aumento da concentração enzimática aumenta o número de ligações enzima/substrato,
aumentando a velocidade de degradação apenas nos instantes iniciais. No final foi atingido um valor
de velocidade de degradação semelhante para diferentes concentrações enzimáticas em solução,
atribuído à limitação estrutural de substrato na estrutura polimérica de SEVA-C.
O limite de espessura crítico destas misturas termoplásticas deve situar-se em valores inferiores a 0.5
mm, de acordo com o limite máximo de saturação de degradação atingido nas experiências de filmes
de diferentes espessuras.
A degradação do amido é influenciada por um conjunto de factores: tipo de processamento
nomeadamente à superfície, especificidade da microestrutura/porosidade, grau de encapsulamento
do amido e extensão da superfície de exposição.
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
ABSTRACT|VII
ABSTRACT
Starch based thermoplastic blends and its composites have been used for several biomedical
applications, namely for temporary bone replacements, due to their mechanical properties similar to
the bone, biodegradability and bioactivity (promote bone bonding). These materials are known to be
biocompatible, as shown in in vitro and in vivo studies. The main property of these materials is their
ability to be enzimatically degraded; the implant is metabolized and excreted by normal physiological
mechanisms. Starch based blends; contain natural monomers that reduce the problems associated
with the materials and its degradation products (glucose, maltose), toxicity or the stimulation of
chronic inflammatory reactions.
Although in vitro and in vivo studies have been made in order to apply these materials in the
biomedical field, the information regarding its degradability is scarce. The evaluation of the
degradation products is of utmost important. They must be non toxic and excreted by any normal
physiological mechanisms. In the use of temporary bone replacement, the functional viability of the
implant is related to its degradation rate and its ability to accompany the bone growth. If a gradual
load transfer from the implant to the bone is successful then a second surgery for implant removal can
be avoided.
The main objective of the work is the characterization of the degradation mechanisms, in physiological
media of these blends, which should simulate the implant conditions. The effect of enzymes in the
degradation process was evaluated by degradation studies in simulated body fluid, with and without αamylase in a concentration similar to human blood plasma. The degradation behaviour was evaluated
by quantification of the degradation products and plasticizer in solution and by the surface
morphological modifications during immersion. Diffusion studies in the absence of enzymatic reaction,
where the quantification of diffusion coefficients of glucose and glycerol in SEVA-C was achieved, were
carried out in order to study the degradation kinetics of these materials. The structural limitations to
degradation were studied using materials with different thickness (different exposure areas) and
varying enzyme concentration solutions.
In the absence of enzymes thermoplastic blend barely degrade in physiological media. In this case
three phases can be identified: the first, in the initial 3 to 4 days, related both to the simple and rapid
diffusion to the solution of plasticizer (glycerol) and low molecular weight polymeric chains and to the
lubricating action of water. The next phase is a period of no significant weight loss (between 4 and 30
days). The third and last phase occurs for immersion periods longer than 60 days; there is a
stabilization of the degradation rate due to the attack of a lesser susceptible to degradation amyloseEVOH complex. SEM observations suggest surface morphological modifications, with an increase, with
immersion time, in the pore size and number and in roughness, allowing a rising in the amount of
water absorption and diffusion of degradation products to the solution.
Glycerol, with a diffusion coefficient higher than glucose was the only compound released during the
diffusion studies. Changes on the diffusion coefficient are directly related to the materials’ thickness.
The correlation coefficient indicates that the calculated values are well in accordance with the model.
Enzymatic degradation studies clearly show a strong enzymatic action in the degradation rate. In the
absence of enzyme the amount of sugar released is 100% less.
A structural model that describes the degradation process conditionings, associated to the specific
microstructure/porosity of these materials and to the starch intern rearrangement (strongly bonded to
the synthetic component), was conceived. This configuration limits the intern/extern hydrolytic
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
ABSTRACT|VIII
diffusion and the enzyme bonds to the substrate; the degradation rate stabilizes after 100 days and
only one quarter of the amorphous phase is degraded. Never the less, the absorption of structural
water increased, obtaining a good correlation between the hydration rate and the amount of total mass
loss of released compound.
A clear change in the amount of sugars in solution when using different thickness materials was
shown. The enzymatic degradation depends on the exposed surface area. Materials with the same
weight and different exposed surface area have different amount of saccharides in solution. However,
the increase of film surface area did not result in a proportional increase in the saccharides amount
due to the lack of active and enzymatic union sites.
The number of enzyme/substrate bonds increases with the enzyme concentration, and enhances the
initial degradation rate. The final degradation rate is similar for all enzymatic concentrations due to the
structural limitations of the SEVA-C polymeric substrate. In accordance to the maximum degradation
saturation limit in the films experiments, the critical thickness of these thermoplastic blends is lower
than 0.5 mm.
Starch degradation is influenced by a number of factors, namely: processing mechanism (especially
surface), microstructure/porosity specificity, starch encapsulation rate and amount of exposed
surface.
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
INDÍCE|IX
INDÍCE
AGRADECIMENTOS
I
SUMÁRIO
V
ABSTRACT
VII
INDÍCE
IX
LISTA DE ABREVIATURAS
XIII
LISTA DE FIGURAS
XV
LISTA DE TABELAS
XXV
1. INTRODUÇÃO
1.1
BIOMATERIAIS
3
3
1.2
MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO EM APLICAÇÕES BIOMÉDICAS
4
1.3
OBJECTIVOS
6
1.4
ESTRUTURA DA TESE
8
1.5
BIBLIOGRAFIA
10
2. MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1
BIOMATERIAIS
15
17
2.2
18
POLÍMEROS E COMPÓSITOS
2.2.1
Polímeros ................................................................................................................................... 18
2.2.2
Biopolímeros .............................................................................................................................. 20
2.2.3
Sistemas bioartificias .................................................................................................................. 22
2.2.4
Processamento de polímeros ...................................................................................................... 22
2.2.5
Compósitos poliméricos .............................................................................................................. 23
2.2.6
Biocompósitos ............................................................................................................................ 24
2.3
ÁREAS DE APLICAÇÃO BIOMÉDICA
25
2.3.1
Próteses e implantes ortopédicos ................................................................................................ 25
2.3.2
Engenharia de tecidos................................................................................................................. 28
2.4
ENSAIOS IN VITRO
31
2.5
BIOMATERIAIS DEGRADÁVEIS E BIODEGRADAÇÃO
32
2.5.1
Biomateriais degradáveis ............................................................................................................ 32
2.5.2
Biodegradação............................................................................................................................ 34
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
INDÍCE|X
2.5.3
2.6
Degradação enzimática............................................................................................................... 38
AMIDO
41
2.6.1
Estrutura e composição do amido ............................................................................................... 41
2.6.2
Degradação enzimática do amido ............................................................................................... 44
2.6.3
Propriedades do amido............................................................................................................... 46
2.7
AMIDO TERMOPLÁSTICO
48
2.7.1
Amido termoplástico como biomaterial em aplicações biomédicas............................................... 52
2.7.2
Misturas termoplásticas de SEVA-C ............................................................................................. 55
2.7.3
Degradação e biocompatibilidade de SEVA-C............................................................................... 59
2.8
BIBLIOGRAFIA
61
3. MATERIAIS E MÉTODOS GERAIS
3.1
MATERIAIS
81
83
3.2
MEIOS
84
3.3
ESTUDOS DE DEGRADAÇÃO IN-VITRO
85
3.4
MÉTODOS DE ANÁLISE MORFOLÓGICA E ESTRUTURAL
87
3.4.1
Microscopia electrónica de varrimento ........................................................................................ 87
3.4.2
Microscopia de força atómica...................................................................................................... 88
3.4.3
Espectroscopia de infravermelho................................................................................................. 89
3.4.4
Medição do ângulo de contacto e determinação da energia livre superficial.................................. 92
3.5
MÉTODOS ANALÍTICOS
98
3.5.1
Cromatografia de troca aniónica.................................................................................................. 98
3.5.2
Cromatografia líquida de elevada resolução................................................................................. 99
3.5.3
Análise térmica......................................................................................................................... 100
3.5.4
Método colorimétrico para detecção do amido .......................................................................... 107
3.5.5
Polissacarídeos totais (método Dubois) ..................................................................................... 107
3.5.6
Glucose (método do ácido 3,5-dinitrossalicílico)......................................................................... 108
3.5.7
Extracção total (Soxhlet)............................................................................................................ 108
3.5.8
Hidrólise ácida.......................................................................................................................... 109
3.5.9
Actividade enzimática ............................................................................................................... 110
3.5.10
Ensaios com concentrações enzimáticas diferentes................................................................... 112
3.5.11
Interacção entre oligossacarídeos e glicerol nas soluções enzimáticas ....................................... 112
3.6
BIBLIOGRAFIA
113
4. DEGRADAÇÃO IN-VITRO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO
4.1
INTRODUÇÃO
119
121
4.2
123
4.2.1
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Morfologia superficial e alterações estruturais de SEVA-C........................................................... 124
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
INDÍCE|XI
4.2.2
Avaliação da degradação in-vitro de SEVA-C............................................................................... 133
4.3
CONCLUSÕES
140
4.4
BIBLIOGRAFIA
142
5. ESTUDOS DE DIFUSÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO EM SOLUÇÃO FISIOLÓGICA SIMULADA147
5.1
INTRODUÇÃO
149
5.2
MATERIAIS E MÉTODOS
152
5.2.1
Materiais .................................................................................................................................. 152
5.2.2
Métodos analíticos .................................................................................................................... 153
5.2.3
Tratamento dos dados: aproximação analítica ........................................................................... 154
5.3
RESULTADOS E DISCUSSÃO
158
5.3.1
Amido na solução de degradação.............................................................................................. 158
5.3.2
Sacarídeos e glicerol em solução............................................................................................... 159
5.3.3
Coeficiente de difusão efectivo de glucose e glicerol .................................................................. 163
5.4
CONCLUSÕES
166
5.5
BIBLIOGRAFIA
167
6. DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO
6.1
INTRODUÇÃO
173
175
6.1.1
Estrutura de misturas termoplásticas à base de amido .............................................................. 175
6.1.2
Degradação de misturas à base de amido................................................................................. 176
6.2
RESULTADOS E DISCUSSÃO
178
6.2.1
Avaliação da degradação de SEVA-C em solução ....................................................................... 179
6.2.2
Fase amorfa total na mistura SEVA-C ........................................................................................ 186
6.2.3
Glicerol em solução e na mistura termoplástica de SEVA-C........................................................ 187
6.2.4
Velocidade cinética de degradação............................................................................................ 189
6.2.5
Interacções entre oligossacarídeos e glicerol ............................................................................. 189
6.2.6
Avaliação da actividade enzimática............................................................................................ 191
6.2.7
Limitação estrutural do material à degradação enzimática ......................................................... 192
6.2.8
Comportamento de hidratação de misturas termoplásticas de SEVA-C ....................................... 194
6.2.9
Morfologia e alterações superficiais de SEVA-C .......................................................................... 197
6.3
CONCLUSÕES
207
6.4
BIBLIOGRAFIA
209
7.
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO UTILIZANDO FILMES DE
215
DIFERENTES ESPESSURAS
7.1
INTRODUÇÃO
217
7.1.1
Misturas termoplásticas à base de amido.................................................................................. 217
7.1.2
Degradação de misturas termoplásticas à base de amido.......................................................... 218
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
INDÍCE|XII
7.2
RESULTADOS E DISCUSSÃO
219
7.2.1
Quantificação do amido em solução.......................................................................................... 221
7.2.2
Quantificação de monossacarídeos e seus derivados em solução .............................................. 224
7.2.3
Quantificação dos açúcares totais em solução........................................................................... 230
7.2.4
Quantificação do glicerol em solução e na mistura termoplástica de SEVA-C.............................. 236
7.2.5
Avaliação da actividade enzimática............................................................................................ 240
7.2.6
Análise térmica de misturas termoplásticas de SEVA-C.............................................................. 241
7.2.7
Morfologia e alterações superficiais de SEVA-C .......................................................................... 250
7.3
CONCLUSÕES
261
7.4
BIBLIOGRAFIA
264
8. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS DE TRABALHO FUTURO
8.1
CONCLUSÕES
269
271
8.2
275
PERSPECTIVAS DE TRABALHO FUTURO
APÊNDICES
277
A. VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA DE ANÁLISE EM TGA
A.1 MASSA DE AMOSTRA INICIAL
279
279
A.2 ESTUDOS DE REVERSIBILIDADE DA VELOCIDADE DE SECAGEM
283
A.3 OPTIMIZAÇÃO DA TEMPERATURA FINAL
285
A.4 EFEITO DO TEMPO DE IMERSÃO NA PERDA DE MASSA DE ÁGUA
286
A.5 AVALIAÇÃO DO TEMPO DE ESTABILIZAÇÃO DO ENSAIO
287
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
LISTA DE ABREVIATURAS|XIII
LISTA DE ABREVIATURAS
SIGLA
UHMWPE
Polietileno de elevado peso molecular
PMMA
Poli (metacrilato de metilo)
PVC
Poli (cloreto de vinilo)
PLA
Poli (ácido láctico)
PGA
Poli (ácido glicolítico)
PHB
Poli (hidroxibutirato)
HEMA
Hidroxietilmetacrilato
PSU
Poli (sulfona)
PEEK
Poli (eteretercetona)
PLG
Poli (lactato-co-glicolato)
PCL
Poli (caprolactona)
PEG
Poli (etileno glicol)
PVA
Poli (álcool vinílo)
PHBV
Poli (hidroxibutirato-co-valerato)
SEVA-C
Copolímero de amido de milho com etileno-álcool vinílico
EVOH
Etileno-álcool vinílico
EAA
Etileno-ácido acrílico
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LISTA DE ABREVIATURAS|XIV
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LISTA DE FIGURAS|XV
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1 Mecanismos de degradação química. O mecanismo I envolve a clivagem entre cadeias
polímericas solúveis em água. O mecanismo II envolve a clivagem ou transformação
química das cadeias laterais poliméricas, resultando na formação de grupos polares ou
carregados. A presença de grupos polares ou carregados conduz à solubilização da cadeia
polimérica intacta. O mecanismo III envolve a clivagem de ligações instáveis na ligação
polimérica, seguida de solubilização dos fragmentos de baixo peso molecular (Langer e
Kohn, 1996). ................................................................................................................37
Figura 2.2 Técnicas de caracterização na degradação de polímeros (Karlsson e Albertsson, 1995). FTIR –
espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier; CL – quimiluminescência; SEM –
microscopia electrónica de varrimento; DSC – calorimetria diferencial de varrimento; SEC –
cromatografia de exclusão de tamanhos moleculares; DM – análise mecânica dinâmica, GC –
cromatografia gasosa; LC – cromatografia líquida; MS – espectroscopia de massa. ......................38
Figura 2.3 Estrutura de uma molécula de amilose...........................................................................................41
Figura 2.4 Estrutura da amilopectina...............................................................................................................42
Figura 2.5 Modelo de cristalinidade do amido mostrando os diferentes factores estruturais: a) hélice
amilopectina; b) amilose livre; c) lípido livre; d) amilose em hélice; e) hélice híbrida de
amilose/amilopectina. .................................................................................................................43
Figura 2.6 Fragmentação dos grânulos de amido nativo (a) e após aquecimento a 90ºC (b).............................48
Figura 2.7 Estrutura em gota (a) e camada (b) de misturas de amido de milho termoplástico/EVOH num filme,
após destruição em água a ferver (Bastioli, 1995). .......................................................................58
Figura 3.1 Provetes (secção quadrada) utilizados durante os ensaios de degradação. ......................................83
Figura 3.2 Esquema representativo das principais técnicas utilizadas durante os ensaios de degradação. HPLCcromatografia líquida, HPAEC-cromatografia de troca aniónica, FTIR-espectroscopia de
infravermelho com transformada de Fourier, TGA - análise termogravimétrica, DSC-calorimetria
diferencial de varrimento, AFM- microscopia de força atómica, SEM-microscopia electrónica de
varrimento. ..................................................................................................................................87
Figura 3.3 Esquema do modo ATR..................................................................................................................91
Figura 3.4 Ângulo de contacto e componentes da tensão superficial................................................................93
Figura 3.5 Suporte utilizado para secagem dos provetes antes da medição dos ângulos de contacto................96
Figura 3.6 Imagem do ângulo de contacto de uma gota de água formado sobre a superfície, em provetes SEVAC. ................................................................................................................................................97
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
LISTA DE FIGURAS|XVI
Figura 3.7 Imagem do ângulo de contacto de uma gota de água formado sobre a superfície, em filmes SEVA-C.
...................................................................................................................................................98
Figura 4.1 Micrografias SEM da espessura SEVA-C: (a) controlo (provete não imerso em solução), (b) após 6
dias de imersão, (c) após 8 dias de imersão e (d) após 21 dias de imersão (x1500) (os provetes
foram secos antes da análise SEM)............................................................................................125
Figura 4.2 Micrografias SEM da superfície SEVA-C: (a) controlo, (b) após 8 dias de imersão, (c) após 16 dias de
imersão e (d) após 21 dias de imersão (x 1500) (os provetes foram secos antes da análise SEM).
.................................................................................................................................................126
Figura 4.3 Micrografias SEM da superfície SEVA-C: (a) controlo, (b) após 18 dias de imersão, (c) após 35 dias de
imersão, (d) após 48 dias de imersão, (e) após 81 dias e (f) após 100 dias de imersão (x 1500) (os
provetes foram secos antes da análise SEM). .............................................................................127
Figura 4.4 Percentagem de absorção de água de SEVA-C em função do tempo de imersão, 20 dias (média de
pelo menos 3 resultados em cada amostra). As barras de erro são os intervalos de confiança de
95% em cada valor médio. Condições da análise: 5ºC/min, Tfinal = 120ºC, tempo final=110 min
.................................................................................................................................................128
Figura 4.5 Percentagem de absorção de água de SEVA-C em função do tempo de imersão, 110 dias (média de
pelo menos 3 resultados em cada amostra). As barras de erro são os intervalos de confiança de
95% em cada valor médio. Condições da análise: 5ºC/min, Tfinal = 120ºC, tempo final=110 min.
.................................................................................................................................................129
Figura 4.6 Variação do ângulo de contacto medido com água em SEVA-C, em função do tempo de imersão
(medições efectuadas em amostras secas). ...............................................................................130
Figura 4.7 Espectro IR do controlo e das soluções de degradação após 2 e 13 dias de imersão.....................131
Figura 4.8 Espectro IR das soluções de degradação: (A) controlo, (B) após 0,5 dias de imersão, (C) após 6 dias
de imersão, (D) após 16 dias de imersão e (E) após 21 dias de imersão. ...................................132
Figura 4.9 Espectro IR do padrão de amido e das soluções de degradação após 2 e 13 dias de imersão. ......133
Figura 4.10 Massa de glicerol libertado para a solução por massa inicial de provete (1.6 g) em 50 ml de
solução, em função do tempo de imersão (20 dias)....................................................................134
Figura 4.11 Massa de glicerol libertado para a solução por massa inicial de provete (1.6 g) em 50 ml de
solução, em função do tempo de imersão (110 dias)..................................................................134
Figura 4.12 Massa de amido libertado para a solução por massa inicial de provete (1.6 g) em 50 ml de solução,
em função do tempo de imersão (20 dias). ................................................................................135
Figura 4.13 Massa de amido libertado para a solução por massa inicial de provete (1.6 g) em 50 ml de solução,
em função do tempo de imersão (120 dias). ..............................................................................135
Figura 4.14 Massa de glucose libertada para a solução por massa inicial de provete (1.6 g) em 50 ml de
solução, em função do tempo de imersão. .................................................................................136
Figura 4.15 Massa de polissacarídeos totais libertados para a solução por massa inicial de provete (1.6 g) em
50 ml de solução, em função do tempo de imersão (20 dias).....................................................137
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
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LISTA DE FIGURAS|XVII
Figura 4.16 Massa de polissacarídeos totais libertados para a solução por massa inicial de provete (1.6 g) em
50 ml de solução, em função do tempo de imersão (120 dias)...................................................137
Figura 4.17 Comparação entre a massa de todos os compostos libertados para a solução por massa inicial de
provete (1.6 g) em 50 ml de solução, e a percentagem de absorção de água em função do tempo
de imersão (20 dias)..................................................................................................................138
Figura 4.18 Comparação entre a massa de todos os compostos libertados para a solução por massa inicial de
provete (1.6 g) em 50 ml de solução, e a percentagem de absorção de água em função do tempo
de imersão (120 dias)................................................................................................................139
Figura 4.19 Cromatograma de provete SEVA-C após extracção total em soxtec durante 12 horas...................140
Figura 5.1 Exemplo do ensaio 2 realizado com 15 provetes (a,c), ensaio 3 com 10 provetes (b) e aspecto geral
dos 4 ensaios realizados (d).......................................................................................................153
Figura 5.2 Dimensões (l, a) para as placas planas no interior do tubo............................................................155
Figura 5.3 Esquema de cálculo dos coeficientes de difusão a partir da equação 5.5, utilizando a função de
minimização dos quadrados.......................................................................................................157
Figura 5.4 Concentração de amido em 50 ml de solução do ensaio 1, em função do tempo de imersão. Cada
valor representa a média de 2 duplicados (4 valores na totalidade).............................................159
Figura 5.5 Concentração de polissacarídeos em 50 ml de solução, para o ensaio 1(■), 2 ( ) e 3(▲), em função
do tempo de imersão. Cada valor representa a média de 2 duplicados (4 valores na totalidade); as
barras de erro são os intervalos de confiança para 95% de cada média de resultados. ................160
Figura 5.6 Concentração de glucose obtida pelo método DNS em 50 ml de solução, para o ensaio 1(■), 2( ) e
3(▲), em função do tempo de imersão. Cada valor representa a média de 2 duplicados (4 valores
na totalidade); as barras de erro são os intervalos de confiança para 95% de cada média de
resultados..................................................................................................................................160
Figura 5.7 Concentração de glucose obtida por HPLC em 50 ml de solução, para o ensaio 1(■), 2( ) e 3(▲),
em função do tempo de imersão. Cada valor representa a média de 2 duplicados (4 valores na
totalidade); as barras de erro são os intervalos de confiança para 95% de cada média de resultados.
.................................................................................................................................................161
Figura 5.8 Concentração de glicerol em 50 ml de solução, para os 4 ensaios realizados (■ , , ▲, Δ), em
função do tempo de imersão. Cada valor representa a média de 2 duplicados (4 valores na
totalidade); as barras de erro são os intervalos de confiança para 95% de cada média de resultados.
.................................................................................................................................................162
Figura 5.9 Valores dos coeficientes de difusão de glicerol (■) e glucose ( ) em função de alfa. As barras de erro
são os intervalos de confiança para 95% do parâmetro estimado. ...............................................164
Figura 5.10 Concentração adimensional (C´t/C´∞) de glucose em função do tempo adimensional (Dt/l ) ) para
2 1/2
os ensaios 1(■), 2( ) e 4(▲). As curvas representam os resultados da aproximação analítica (-).
.................................................................................................................................................165
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LISTA DE FIGURAS|XVIII
Figura 5.11 Concentração adimensional (C´t/C´∞) de glicerol em função do tempo adimensional (Dt/l ) ) para
2 1/2
os ensaios 1(■), 2( ) e 4(▲). As curvas representam os resultados da aproximação analítica (-).
.................................................................................................................................................166
Figura 6.1 Massa de amido libertado para a solução, com enzima, por massa inicial de provete (1.6 g) em 50
ml de solução, em função do tempo de imersão (10 dias). .........................................................180
Figura 6.2 Massa de amido libertado para a solução, com (■) e sem (□) enzimas, por massa inicial de provete
(1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. .................................................180
Figura 6.3 Massa de glucose libertada para a solução, por massa inicial de provete (1.6 g) em 50 ml de solução,
em função do tempo de imersão (10 dias). ................................................................................181
Figura 6.4 Massa de glucose libertada para a solução, com (■) e sem (□) enzimas por massa inicial de provete
(1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. .................................................182
Figura 6.5 Massa de sacarídeos de glucose libertados para a solução, por massa inicial de provete (1.6 g) em
50 ml de solução, em função do tempo de imersão. ..................................................................183
Figura 6.6 Massa de polissacarídeos libertados para a solução, por massa inicial de provete (1.6 g) em 50 ml de
solução, em função do tempo de imersão (10 dias)....................................................................184
Figura 6.7 Massa de polissacarídeos libertados para a solução, com (■) e sem (□) enzima, por massa inicial de
provete (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. .....................................184
Figura 6.8 Massa de todos os açúcares libertados para a solução, por massa inicial de provete (1.6 g) em 50 ml
de solução, em função do tempo de imersão. ............................................................................185
Figura 6.9 Massa de glicerol libertado para a solução, por massa inicial de provete (1.6 g) em 50 ml de solução,
em função do tempo de imersão, obtido por HPLC (■) e HPAE-PAD (□). ....................................187
Figura 6.10 Velocidade de degradação de todos os compostos libertados para a solução, em função do tempo
de imersão. ...............................................................................................................................189
Figura 6.11 Concentrações de glucose (■), maltose (□) e glicerol (▲) (misturados) em função do tempo de
imersão. ....................................................................................................................................190
Figura 6.12 Concentrações de glucose (■), maltose (□) e glicerol (▲) em função do tempo de imersão........190
Figura 6.13 Actividade enzimática (em mg glucose/unid/min) para três concentrações enzimáticas 50 (■), 100
(□) e 150 (▲) unid/l, em função do tempo de imersão. Cada valor representa a média de 2
duplicados (4 valores na totalidade); as barras de erro são os intervalos de confiança de 95% em
cada valor médio. ......................................................................................................................192
Figura 6.14 Massa de glucose libertada para a solução para cada concentração enzimática 50 ( ■), 100 (□) e
150 (▲) unid/l, por massa inicial de provete (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de
imersão. Cada valor representa a média de 2 duplicados (4 valores na totalidade); as barras de erro
são os intervalos de confiança de 95% em cada valor médio.......................................................193
Figura 6.15 Percentagem de absorção de água de SEVA-C, na presença (■) e ausência (□) de enzima, em
função do tempo de imersão, em TGA (média de pelo menos 3 resultados em cada amostra). As
barras de erro são os intervalos de confiança de 95% em cada valor médio. ...............................194
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LISTA DE FIGURAS|XIX
Figura 6.16 % Perda de massa de água de SEVA-C, na presença (■) e ausência (□) de enzima, em função do
tempo de imersão (valores obtidos durante o pré-condicionamento dos provetes). ......................195
Figura 6.17 Comparação entre a massa de todos os compostos libertados para a solução (■), por massa inicial
de provete (1.6 g) em 50 ml de solução, e a percentagem de perda de massa de água (□), em
função do tempo de imersão......................................................................................................196
Figura 6.18 Variação do ângulo de contacto em superfícies SEVA-C, na presença (■) e ausência (□) de enzimas,
em função do tempo de imersão, utilizando água como líquido de medição (medições em provetes
secos)........................................................................................................................................198
Figura 6.19 Termogramas DSC em provetes SEVA-C após imersão durante 0.67, 100 e 169 dias. ................200
Figura 6.20 Variação do pico de fusão de SEVA-C em função do tempo de imersão. ......................................200
Figura 6.21 Entalpia associada à degradação de SEVA-C em função do tempo de imersão (valores obtidos a
partir dos termogramas DSC).....................................................................................................201
Figura 6.22 Micrografias SEM das superfícies SEVA-C (x 1500). (a) Controlo, (b) após 8 dias de imersão, (c)
após 30 dias de imersão, (d) após 80 dias de imersão, (e) após 100 dias de imersão e (f) após 117
dias de imersão. Os provetes foram secos antes da análise SEM. ...............................................202
Figura 6.23 Micrografias SEM de soluções de degradação em (a) placas e (b) pós SEVA-C após ferver em água
destilada durante 5 h (x 1000). As soluções de degradação foram liofilizadas antes de analisadas.
.................................................................................................................................................203
Figura 6.24 Micrografia SEM da solução de degradação de placas de amido após ferver em água destilada
durante 5 h (x 1000). As soluções de degradação foram liofilizadas antes de analisadas.............204
Figura 6.25 Imagens AFM em “tapping mode”. (a) Controlo, (b) após 21 dias de imersão, (c) após 91 dias de
imersão e (d) após 101 dias de imersão (eixo ZZ 1500 nm e scan 10 μm). Os provetes foram secos
após cada período de imersão ...................................................................................................205
Figura 6.26 Espectro FTIR 2ª derivada das soluções de degradação em pó SEVA-C e amido após ferver em
água destilada durante 5 horas. .................................................................................................206
Figura 7.1 Massa de amido libertado para a solução com 50 unid/l de enzima, por massa inicial de provete de
amido (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As barras de erro são os
intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com a distribuição t
Student......................................................................................................................................221
Figura 7.2 Massa de amido libertado para a solução com 100 (■) e 50 (□) unid/l de enzima, por massa inicial
de provete SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As barras de erro
são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com a
distribuição t Student. ................................................................................................................222
Figura 7.3 Massa de amido libertado para a solução com 100 (■) e 50 (□) unid/l de enzima, por massa inicial
de 2 filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As barras de
erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com a
distribuição t Student. ................................................................................................................222
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
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LISTA DE FIGURAS|XX
Figura 7.4 Massa de amido libertado para a solução com 100 (■) e 50 (□) unid/l de enzima, por massa inicial
de 4 filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As barras de
erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com a
distribuição t Student. ................................................................................................................223
Figura 7.5 Massa de glucose libertada para a solução com 50 unid/l de enzima, por massa inicial de provetes e
filmes (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As barras de erro são os
intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com a distribuição t
Student......................................................................................................................................224
Figura 7.6 Massa de glucose libertada para a solução com 100 unid/l de enzima, por massa inicial de provetes
e filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As barras de erro
são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com a
distribuição t Student. ................................................................................................................225
Figura 7.7 Massa de maltotriose libertada para a solução com 50 (□) e 100 (■) unid/l de enzima, por massa
inicial de provete SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As barras
de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com
a distribuição t Student. .............................................................................................................226
Figura 7.8 Massa de maltotriose libertada para a solução com 50 (□) e 100 (■) unid/l de enzima, por massa
inicial de 2 filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As barras
de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com
a distribuição t Student. .............................................................................................................226
Figura 7.9 Massa de maltotriose libertada para a solução com 50 (□) e 100 (■) unid/l de enzima, por massa
inicial de 4 filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As barras
de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com
a distribuição t Student. .............................................................................................................227
Figura 7.10 Massa de maltose libertada para a solução com 50 (□) e 100 (■) unid/l de enzima, por massa
inicial de provete SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As barras
de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com
a distribuição t Student. .............................................................................................................228
Figura 7.11 Massa de maltose libertada para a solução com 50 (□) e 100 (■) unid/l de enzima, por massa
inicial de 2 filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As barras
de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com
a distribuição t Student. .............................................................................................................228
Figura 7.12 Massa de maltose libertada para a solução com 50 (□) e 100 (■) unid/l de enzima, por massa
inicial de 4 filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As barras
de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com
a distribuição t Student. .............................................................................................................229
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
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LISTA DE FIGURAS|XXI
Figura 7.13 Massa de polissacarídeos totais libertados para a solução com 50 unid/l de enzima, por massa
inicial de provetes SEVA-C e amido, 2 e 4 filmes (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo
de imersão. As barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor
médio, de acordo com a distribuição t Student. ..........................................................................230
Figura 7.14 Massa de polissacarídeos totais libertados para a solução com 100 unid/l de enzima, por massa
inicial de provete, 2 e 4 filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de
imersão. As barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor
médio, de acordo com a distribuição t Student. ..........................................................................231
Figura 7.15 Massa de polissacarídeos totais libertados para a solução com 50 unid/l de enzima, por massa
inicial de provete SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As barras
de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com
a distribuição t Student. .............................................................................................................232
Figura 7.16 Massa de polissacarídeos totais libertados para a solução com 50 unid/l de enzima, por massa
inicial de provete amido (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As barras
de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com
a distribuição t Student. .............................................................................................................232
Figura 7.17 Massa de polissacarídeos totais libertados para a solução com 50 unid/l de enzima, por massa
inicial de 2 filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As barras
de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com
a distribuição t Student. .............................................................................................................233
Figura 7.18 Massa de polissacarídeos totais libertados para a solução com 50 unid/l de enzima, por massa
inicial de 4 filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As barras
de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com
a distribuição t Student. .............................................................................................................233
Figura 7.19 Massa de polissacarídeos totais libertados para a solução com 100 unid/l de enzima, por massa
inicial de provete SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As barras
de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com
a distribuição t Student. .............................................................................................................234
Figura 7.20 Massa de polissacarídeos totais libertados para a solução com 100 unid/l de enzima, por massa
inicial de 2 filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As barras
de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com
a distribuição t Student. .............................................................................................................235
Figura 7.21 Massa de polissacarídeos totais libertados para a solução com 100 unid/l de enzima, por massa
inicial de 4 filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As barras
de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com
a distribuição t Student. .............................................................................................................235
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
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LISTA DE FIGURAS|XXII
Figura 7.22 Massa de glicerol libertado para a solução com 50 (□) e 100 (■) unid/l de enzima, por massa
inicial de provete SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As barras
de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com
a distribuição t Student. .............................................................................................................237
Figura 7.23 Massa de glicerol libertado para a solução com 50 (□) e 100 (■) unid/l de enzima, por massa
inicial de 2 filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As barras
de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com
a distribuição t Student. .............................................................................................................237
Figura 7.24 Massa de glicerol libertado para a solução com 50 (□) e 100 (■) unid/l de enzima, por massa
inicial de 4 filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As barras
de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com
a distribuição t Student. .............................................................................................................238
Figura 7.25 Actividade enzimática (em mg glucose/unid/min) para o ensaio com 50 unid/l de α-amílase em
provetes de SEVA-C e amido e filmes SEVA-C, em função do tempo de imersão. As barras de erro
são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com a
distribuição t Student. ................................................................................................................240
Figura 7.26 Actividade enzimática (em mg glucose/unid/min) para o ensaio com 100 unid/l de enzima em
provetes e filmes SEVA-C, em função do tempo de imersão........................................................241
Figura 7.27 Percentagem de absorção de água de SEVA-C, com 50 unid/l de enzima, para provete e filmes, em
função do tempo de imersão, em TGA (média de pelo menos 3 resultados em cada amostra). As
barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de
acordo com a distribuição t Student. ..........................................................................................242
Figura 7.28 Percentagem de perda de massa de água de SEVA-C, com 50 unid/l de enzima, para provete e
filmes, em função do tempo de imersão (valores obtidos durante o pré-condicionamento das
amostras). As barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor
médio, de acordo com a distribuição t Student. ..........................................................................242
Figura 7.29 Comparação entre a massa de polissacarídeos totais libertados para a solução, por massa inicial de
provete (1.6 g) em 50 ml de solução, e a percentagem de perda de massa de água, em função do
tempo de imersão. As barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada
valor médio, de acordo com a distribuição t Student...................................................................244
Figura 7.30 Comparação entre a massa de polissacarídeos totais libertados para a solução, por massa inicial de
2 filmes (1.6 g) em 50 ml de solução, e a percentagem de perda de massa de água, em função do
tempo de imersão. As barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada
valor médio, de acordo com a distribuição t Student...................................................................244
Figura 7.31 Comparação entre a massa de polissacarídeos totais libertados para a solução, por massa inicial de
4 filmes (1.6 g) em 50 ml de solução, e a percentagem de perda de massa de água, em função do
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LISTA DE FIGURAS|XXIII
tempo e imersão. As barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada
valor médio, de acordo com a distribuição t Student...................................................................245
Figura 7.32 Resultados obtidos por termogravimetria da percentagem de perda de massa em amido (■), glicerol
(□), SEVA-C (▲) e polivinilálcool (Δ) , em função da temperatura (média de pelo menos 3
resultados em cada amostra). ....................................................................................................247
Figura 7.33 Resultados obtidos por termogravimetria da percentagem de perda de massa no provete SEVA-C
para diferentes tempos de imersão, em função da temperatura (média de pelo menos 3 resultados
em cada amostra)......................................................................................................................248
Figura 7.34 Resultados obtidos por termogravimetria da percentagem de perda de massa em 4 filmes SEVA-C
para diferentes tempos de imersão, em função da temperatura (média de pelo menos 3 resultados
em cada amostra)......................................................................................................................248
Figura 7.35 Percentagem da extensão de degradação (ED) de amido no provete e filmes, ao longo do tempo de
imersão (média de pelo menos 3 resultados em cada amostra)..................................................249
Figura 7.36 Percentagem da extensão de degradação (ED) do glicerol no provete e filmes, ao longo do tempo de
imersão (média de pelo menos 3 resultados em cada amostra)..................................................249
Figura 7.37 Variação do ângulo de contacto em superfícies SEVA-C, em função do tempo de imersão, utilizando
água como líquido de medição (medições efectuadas em amostras secas). As barras de erro são os
intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com a distribuição t
Student......................................................................................................................................251
Figura 7.38 Variação do ângulo de contacto em superfícies SEVA-C, em função do tempo de imersão, utilizando
formamida como líquido de medição (medições efectuadas em amostras secas). As barras de erro
são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com a
distribuição t Student. ................................................................................................................251
Figura 7.39 Variação do ângulo de contacto em superfícies SEVA-C, em função do tempo de imersão, utilizando
di-iodometano como líquido de medição (medições efectuadas em amostras secas). As barras de
erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com a
distribuição t Student. ................................................................................................................252
Figura 7.40 Parâmetros da tensão superficial γ e γ em mJ/m , determinados na superfície de provetes SEVA-C,
+
-
2
ao longo do tempo de imersão. ..................................................................................................253
Figura 7.41 Parâmetros da tensão superficial γ e γ em mJ/m , determinados na superfície de 4 filmes SEVA-C,
+
-
2
ao longo do tempo de imersão. ..................................................................................................253
Figura 7.42 Valores das componentes apolar ( ΔG sws ) e polar ( ΔG sws ) em mJ/m da energia livre de
LW
LW
2
atracção hidrofóbica, determinados na superfície de provetes SEVA-C, em função do tempo de
imersão. ....................................................................................................................................254
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
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LISTA DE FIGURAS|XXIV
Figura 7.43 Valores das componentes apolar ( ΔG sws ) e polar ( ΔG sws ) em mJ/m da energia livre de
LW
LW
2
atracção hidrofóbica, determinados na superfície de 4 filmes SEVA-C, em função do tempo de
imersão. ....................................................................................................................................255
Figura 7.44 Micrografias SEM das superfícies SEVA-C do controlo, após 10, 50 e 90 dias de imersão,
respectivamente (x 1500). (a), (b), (c), (d) provete; (e), (f), (g), (h) 2 filmes e (i), (j), (l), (m) 4 filmes.
Todos os materiais foram secos antes da análise SEM. ..............................................................256
Figura 7.45 Micrografias SEM dos materiais de degradação de SEVA-C fervidas em água destilada durante 5 h
no controlo, após 20, 50 e 90 dias de imersão, respectivamente (x 1500). (a), (b), (c), (d) provete;
(e), (f), (g), (h) 2 filmes e (i), (j), (l), (m) 4 filmes. As soluções de degradação foram liofilizadas antes
de analisadas. ...........................................................................................................................258
Figura 7.46 Micrografia SEM da solução de degradação de amido após ferver em água destilada durante 5 h (x
1500). A solução de degradação foi liofilizada antes de analisada...............................................259
Figura 7.47 Imagens AFM em “tapping mode”das superfícies SEVA-C do controlo, após 30, 60 e 90 dias de
imersão, respectivamente (x 1500). (a), (b), (c), (d) provete; (e), (f), (g), (h) 2 filmes e (i), (j), (l), (m)
4 filmes (scan 10 μm). Todos os materiais foram secos antes da análise em AFM. ....................260
Figura 7.48 Rugosidade máxima (nm) em superfícies de provete e filmes SEVA-C, em função do tempo de
imersão. ....................................................................................................................................261
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
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LISTA DE TABELAS|XXV
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1 Lista de biopolímeros (Kaplan DL, 1998). ...................................................................................... 21
Tabela 2.2 Aplicações de materiais sintéticos e materiais naturais modificados em medicina........................... 28
Tabela 2.3 Polímeros biodegradáveis sintéticos em engenharia de tecidos....................................................... 34
Tabela 2.4 Estrutura e composição de amidos comerciais de diferentes fontes (Shogren, 1998). ..................... 44
Tabela 2.5 Propriedades térmicas de dispersões amido-água (Shogren, 1998). ............................................... 48
Tabela 2.6 Propriedades mecânicas do osso cortical humano em diferentes condições de carga (Reis, 1999). 54
Tabela 3.1 Composição da solução HBSS (Gibco 041-04025M Life Technologies)........................................... 85
Tabela 3.2 Resumo dos ensaios de degradação in-vitro. .................................................................................. 86
Tabela 3.3 Parâmetros da tensão superficial dos líquidos em mJ/m (Van Oss, 1994)..................................... 97
2
Tabela 5.1 Valores de alfa (α) e metade da espessura (l) em cada ensaio. .................................................... 156
Tabela 5.2 Valores calculados dos coeficientes de difusão de glicerol e glucose, intervalos de confiança
assimptóticos para 95% (95% I.C.) e o coeficiente de correlação, R , para os 4 ensaios realizados, a
2
partir do ajuste não linear dos valores experimentais, utilizando a aproximação analítica............. 163
Tabela 6.1 Massa de sacarídeos libertados por hidrólise ácida pelo método HPLC e Dubois, a partir 5 mg de
SEVA-C em pó............................................................................................................................ 186
Tabela 6.2 Massa de glicerol libertado por extracção em Soxhlet e extraído por hidrólise ácida e quantificado por
HPLC, por massa inicial de provete sem qualquer tratamento e após degradação enzimática. .... 188
Tabela 6.3 Parâmetros cinéticos, Km e Vmax, para 3 ensaios efectuados...................................................... 191
Tabela 6.4 Componentes de tensão superficial de superfícies SEVA-C (em mJ/m ), determinadas pelas
2
medições dos ângulos de contacto, para diferentes tempos de imersão. ..................................... 199
Tabela 6.5 Interacção de energia livre interfacial (ΔG em mJ/m ) entre a superfície (s) e água (w), para
sws
2
diferentes tempos de imersão. ................................................................................................... 199
Tabela 6.6 Rugosidade superficial de provetes SEVA-C em RMS (média quadrática), Ra (rugosidade média) e
Rmax (rugosidade máxima) para diferentes tempos de imersão. ................................................. 206
Tabela 7.1 Massa de glicerol libertado por extracção total em soxhlet, por massa inicial de provete, 2 e 4 filmes
(%), sem qualquer tratamento e após degradação enzimática (50 unid/l), (ensaios em triplicado).239
Tabela 7.2 Percentagem de absorção de água em provete e filmes SEVA-C em 2 ensaios realizados e respectiva
média. ....................................................................................................................................... 245
Tabela 8.1 Percentagem de compostos libertados em solução durante os ensaios de degradação in vitro,
realizados em diferentes condições. ........................................................................................... 275
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
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LISTA DE TABELAS|XXVI
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CAPITULO 1
INTRODUÇÃO
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
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AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
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1. INTRODUÇÃO
SUMÁRIO
A área dos biomateriais é multidisciplinar, englobando o conhecimento de diversos campos, desde o
comportamento mecânico até às funções biológicas a nível molecular nos tecidos, passando pela
engenharia de materiais. A evolução dos biomateriais depende assim dos avanços atingidos nestas
diferentes áreas.
Neste capítulo é apresentado um breve resumo teórico da área estudada nesta tese, biomateriais,
principais conceitos associados à aplicabilidade dos biomateriais, classes dos biomateriais utilizadas e
suas propriedades, assim como as principais aplicações biomédicas. São também apresentadas as
principais propriedades das misturas termoplásticas à base de amido propostas em aplicações
biomédicas temporárias, e estudadas nesta Tese. São ainda referidos os objectivos globais deste
trabalho e a estrutura da tese.
1.1
BIOMATERIAIS
3
1.2
MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO EM APLICAÇÕES BIOMÉDICAS
4
1.3
OBJECTIVOS
6
1.4
ESTRUTURA DA TESE
8
1.5
BIBLIOGRAFIA
10
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
INTRODUÇÃO |3
1.1 Biomateriais
Biomateriais são um campo de aplicação de materiais poliméricos e compósitos. Existem
várias definições para o conceito de biomateriais, podendo ser todos os materiais destinados
a possuir uma interface com os sistemas biológicos para avaliar, tratar, aumentar ou
substituir qualquer tecido, órgão ou função do corpo (Amaral et al., 2003; Booth e Price,
1989). Muitas vezes associa-se o conceito de biomateriais a materiais de origem natural,
mais conhecidos por biopolímeros, mas esta definição não é inteiramente correcta, já que
existem biomateriais de origem sintética que podem contactar directamente com o
organismo, desempenhando diversas funções benéficas na área da saúde. A evolução dos
biomateriais é relativamente recente. No entanto, é possível dividi-la em 3 gerações: i)
primeira geração de biomateriais – implantes ósseos (primeira articulação artificial da anca
desenvolvida em 1961); ii) segunda geração de biomateriais – dispositivos bioactivos (iniciouse nos anos 70); iii) terceira geração – engenharia de tecidos (até à actualidade).
A área de biomateriais engloba o conhecimento e a colaboração de diversas especialidades,
desde o comportamento mecânico até às funções biológicas a nível molecular nos tecidos,
passando pela engenharia de materiais, onde são desenvolvidos sistemas com propriedades
adequadas a determinadas aplicações no organismo. A evolução actual dos biomateriais
depende assim dos avanços das diversas áreas, nomeadamente da biotecnologia e da ciência
dos materiais.
Uma definição importante, é a de biocompatibilidade com o organismo, podendo ser definida
como a capacidade do material ter uma resposta favorável numa aplicação específica, com o
mínimo de reacções alérgicas, inflamatórias ou tóxicas, quando em contacto com os tecidos
vivos ou fluidos orgânicos (Hench, 1998). Não existem materiais totalmente inertes, há
sempre uma resposta dos tecidos a qualquer corpo estranho quando inserido no corpo
humano. Alterando algumas propriedades dos materiais é possível minimizar ou controlar a
resposta do tecido.
Biomateriais poliméricos não devem exibir toxicidade, comportamento irritante, ou ter
respostas fisiológicas adversas (Lyman e Rowland, 1989).
A bioactividade é também importante na funcionalidade de um biomaterial. Um material é
bioactivo quando tem uma resposta biológica específica na interface do material, permitindo
o crescimento ósseo e a ligação entre o tecido e o material (Ducheyne, 1987a).
MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO EM APLICAÇÕES BIOMÉDICAS |4
As 3 principais classes de materiais utilizados em medicina são os metais, polímeros,
cerâmicos e combinações destes três tipos em compósitos.
Os biomateriais podem ser bioinertes ou biodegradáveis. Materiais bioinertes não sofrem
alterações durante o período de implantação, causando resposta mínima nos tecidos
adjacentes, e mantendo as propriedades estruturais durante longos períodos (Gilding, 1981)
Os biomateriais degradáveis degradam-se quando em contacto com os fluidos orgânicos. A
taxa de degradação deve permitir a substituição gradual do novo tecido, transferindo
progressivamente a tensão para o tecido em recuperação, evitando assim uma segunda
intervenção cirúrgica para a remoção do implante (Pereira et al., 1998a). Os polímeros
biodegradáveis apresentam grande potencial em aplicações biomédicas, como por exemplo
em placas ósseas, parafusos de fixação ou suturas.
Os sistemas biodegradáveis devem ser degradados in vivo, e formar produtos solúveis
facilmente removíveis do local de implantação e excretados do corpo pelos mecanismos
metabólicos normais. Os principais factores que afectam a taxa de degradação de polímeros
sintéticos em meio biológico são: (i) estrutura do polímero, principalmente hidrofilicidade e a
presença de grupos funcionais, peso molecular; (ii) estado físico e morfológico do polímero,
particularmente se é cristalino ou amorfo; (iii) condições ambientais (temperatura, pH,
humidade, oxigénio); (iv) razão superfície/volume, tamanho e pureza do polímero (Lenz,
1990). A necessidade de ajustar a taxa de degradação do implante temporário ao
crescimento dos tecidos adjacentes é um dos principais factores da viabilidade de um
suporte temporário (Visser et al., 1996).
Entre as aplicações mais frequentes de biomateriais em ortopedia, salientam-se as próteses
da anca, joelho e ombro, visando restabelecer a capacidade de movimento e de transferência
de carga (Amass et al., 1998).
1.2 Misturas termoplásticas à base de amido em aplicações biomédicas
Os polímeros naturais têm sido propostos como alternativas aos biomateriais actualmente
utilizados em aplicações biomédicas. Uma das vantagens destes materiais é o seu baixo
custo como resultado da disponibilidade da matéria-prima (Kaplan DL, 1998). Uma
característica intrínseca dos polímeros naturais é a sua capacidade de serem degradados por
enzimas, garantindo que o implante seja metabolizado por mecanismos fisiológicos,
INTRODUÇÃO |5
conferindo biocompatibilidade com o organismo. Esta propriedade tem interesse em
aplicações biomateriais no qual se pretende uma função específica por um período
temporário, seguido do qual é esperado que o implante degrade completamente por
processos metabólicos normais, por exemplo em placas de fixação de fracturas ósseas, ou no
preenchimento de defeitos ósseos (Stacy et al., 1989).
O amido tem sido misturado com polímeros sintéticos, para melhorar as suas propriedades
mecânicas, físicas e diminuição da sensibilidade à água, devido à sua forte natureza
higroscópica (Bastioli et al., 1990b). O amido baixa o custo dos produtos finais, conferindo
características biodegradáveis ao polímero termoplástico. Dependendo do componente
sintético da mistura, métodos de processamento, aditivos e materiais de reforço, é possível
obter diferentes combinações estruturas/propriedades em aplicações específicas (Reis et al.,
1997a).
O tipo de amido (razão amilose/amilopectina), quantidade de água, pressão, temperatura,
tipo e quantidade de plasticizadores, são parâmetros que influenciam o processo de
conversão do amido em amido termoplástico. As propriedades finais de amidos
termoplásticos são dependentes dos parâmetros de processamento e das etapas de
preparação.
As misturas à base de amido, contêm monómeros de origem natural, semelhantes aos
encontrados nas matrizes orgânicas do organismo, o que reduz a possibilidade de ocorrência
de problemas associados à toxicidade destes materiais, ou seus produtos de degradação, ou
estimulação de reacções inflamatórias crónicas (Kaplan DL, 1998; Shogren, 1998).
Várias publicações confirmaram que as misturas termoplásticas de SEVA-C, tem
comportamento degradável em solução fisiológica simulada, propriedades biocompatíveis e
mecânicas adequadas em várias aplicações temporárias biomédicas, especialmente em
aplicações ósseas (substituição, regeneração e preenchimento de defeitos ósseos) (Leonor,
2001; Oliveira et al., 2003b).
As misturas termoplásticas à base de amido são degradáveis, sendo a maltose, a glucose e
cadeias de amido de baixo peso molecular os seus principais produtos de degradação, estes
produtos são biocompatíveis e não induzem resposta inflamatória (Bastioli et al., 1993;
Gomes et al., 2001b). A composição química, condições de processamento, e a estrutura das
misturas poliméricas à base de amido influenciam a taxa de hidrólise enzimática,
OBJECTIVOS |6
condicionando a acessibilidade das enzimas ao substrato de amido e influenciando assim os
seus perfis de degradação (Azevedo et al., 2003a).
As misturas termoplásticas à base de amido são biocompatíveis, tal como demonstrado em
vários estudos in vitro (Gomes et al., 2001a) e in vivo (Mendes et al., 2001).
Os polímeros à base de amido têm sido propostos como biomateriais alternativos em várias
aplicações ortopédicas, como por exemplo, em placas ósseas e parafusos, transportadores
de libertação controlada de fármacos/agentes bioactivos, hidrogeis e estruturas de suporte
tridimensionais em engenharia de tecidos (Gomes et al., 2002c; Gomes et al., 2001b;
Malafaya et al., 2002a; Salgado et al., 2004a). Estes sistemas devem ser capazes de manter
a sua integridade e propriedades mecânicas em meio aquoso nos primeiros estágios de
implantação, e degradar posteriormente (Booth e Price, 1989; Demirgoz et al., 2000).
Os compósitos SEVA-C/HA exibem comportamento não citotóxico, bioactivo, induzindo uma
resposta satisfatória do tecido quando implantado e crescimento do osso, demonstrado em
estudos in vivo (Mendes et al., 2001).
1.3 Objectivos
O presente trabalho pretende caracterizar os principais mecanismos desencadeados na
degradação de misturas termoplásticas à base de amido em meio fisiológico simulado. Vários
estudos tem sido preconizados com vista à aplicação destas misturas termoplásticas na área
biomédica, desde estudos in vitro a estudos in vivo, tendo sido confirmada a sua
biocompatiilidade, tal como definido pelos padrões internacionais. No entanto, a informação
que existe acerca da degradabilidade destas misturas e efeito dos seus produtos de
degradação na biocompabilidade do organismo é escassa. Para o sucesso da aplicação
destes materiais em aplicações ósseas temporárias é essencial conhecer a taxa de
degradação destes materiais e se esta taxa acompanha minimamente a restituição do novo
osso. A percentagem total de produtos libertados ao longo do tempo de imersão deve
acompanhar a taxa de crescimento do novo tecido, caso contrário a mistura termoplástica
não apresenta viabilidade funcional.
Não basta que um polímero utilizado como material de prótese possua propriedades
mecânicas adequadas e cinéticas controladas na presença de fluidos corporais. É também
necessário assegurar que os produtos de biodegradação não sejam tóxicos para o organismo
INTRODUÇÃO |7
e sejam elimináveis através de qualquer um dos sistemas orgânicos de eliminação, renal,
digestivo, cutâneo ou respiratório.
A agressividade dos fluidos orgânicos quando em contacto com os materiais, conduz à
degradação dos materiais, com consequente libertação de partículas de desgaste ou de iões,
podendo apresentar toxicidade e induzir uma resposta inflamatória. A avaliação dos produtos
libertados por efeito da degradação é de crucial importância pois interfere na
biocompatibilidade destes materiais, propriedade fundamental em aplicações biomédicas.
A biocompabilidade destas misturas deve ser avaliada tanto na função do material numa
determinada aplicação como no impacto dos seus lixiviados no organismo.
Na linha de investigação já efectuada na caracterização destes materiais, pretendeu-se assim
caracterizar a degradação destas misturas à base de amido em solução fisiológica simulada,
equivalente à concentração salina do soro humano, simulando os mecanismos de
degradação desencadeados no organismo, em diferentes condições de operação.
O objectivo global do trabalho desenvolvido visa assim o estudo da degradação de misturas
termoplásticas à base de amido, num meio que simule as condições quando estes materiais
são implantados em contacto com os fluidos do corpo humano em aplicações biomédicas
temporárias, propostas para estes biomateriais.
Os estudos de degradação foram realizados numa solução fisiológica simulada, com e sem
adição de enzimas, numa concentração enzimática semelhante à encontrada no plasma
sanguíneo humano, comparando assim o efeito das enzimas no processo de degradação. Foi
seleccionada uma enzima α-amílase que actua directamente na degradação da fase amorfa
do material (amido), e que se encontra presente no plasma sanguíneo humano. A perda de
propriedades por degradação foi monitorizada pela identificação e quantificação da
percentagem de produtos de degradação e plasticizador em solução, e alterações superficiais
ao longo do tempo de imersão. O comportamento superficial do biomaterial em contacto com
o meio, é de grande importância, dado que a superfície é o primeiro contacto que o material
estabelece com o meio, formando uma interface biocompatível ou não com o meio que
rodeia. Estabeleceu-se assim uma relação entre a estrutura, microestrutura/morfologia e
variações na superfície em função do tempo de imersão.
A cinética de degradação destes materiais foi acompanhada por estudos de difusão (na
ausência de reacção enzimática), quantificando os coeficientes de difusão dos principais
compostos libertados (glucose e glicerol) para materiais de diferentes espessuras.
ESTRUTURA DA TESE |8
Mediante os estudos de degradação, pretendeu-se construir um modelo estrutural, que
permita compreender os mecanismos de degradação desencadeados e limitação estrutural
do material à degradação, associados à microestrutura/porosidade destes materiais,
atribuídos fundamentalmente ao rearranjo das moléculas nas regiões internas da mistura e
baixa porosidade da microestrutura.
No âmbito do estudo da limitação estrutural do material à degradação, foram realizados
ensaios de degradação, variando a área exposta à degradação utilizando filmes de diferentes
espessuras e diferentes concentrações de enzima em solução, e que afectam a cinética de
degradação. O estudo incidiu fundamentalmente na perda de propriedades por análise
analítica e variações na microestrutura, tal como em ensaios anteriores.
1.4 Estrutura da Tese
Esta dissertação encontra-se organizada de acordo com os temas abordados, dividida em
sete capítulos fundamentais.
No capítulo 2 é feita uma revisão bibliográfica sobre o material estudado nesta tese, SEVA-C,
onde são enumeradas as suas principais propriedades mecânicas, de biocompatibilidade,
bioactividade e de biodegradação. Como se trata de um biomaterial proposto para aplicações
biomédicas, são abordados os principais temas gerais associados aos biomateriais: definição
de biomateriais e pré-requisitos fundamentais, principais classes de biomateriais e áreas de
aplicação biomédica. É também dedicado um subcapítulo à Engenharia de tecidos, dado que
se trata de uma das áreas emergentes e inovadoras em biomateriais, onde se concentra
grande parte da investigação actualmente dedicada aos biomateriais. São enumerados os
principais biomateriais degradáveis e mecanismos de biodegradação, onde se encontram
inseridos os biomateriais estudados nesta tese.
Como se trata de uma mistura termoplástica à base de amido, é descrita a composição deste
composto, sua estrutura, propriedades e principais vias de degradação. São enumerados os
principais métodos de processamento de obtenção da mistura termoplástica e sua influência
nas propriedades finais. Finalmente, são apresentadas as propriedades da mistura
termoplástica em aplicações biomédicas, uma das áreas propostas para estas misturas, e
que se encontra numa fase incipiente de investigação. É também analisada a degradação
desta mistura, fenómeno estudado nesta dissertação.
INTRODUÇÃO |9
Os materiais e as metodologias utilizadas na execução laboratorial deste trabalho encontramse descritos no capítulo 3. Os princípios básicos que sustentam cada uma das técnicas
utilizadas encontram-se também neste capítulo.
No capítulo 4 são apresentados os resultados obtidos nos estudos de degradação in-vitro de
SEVA-C em solução salina simulada (NaCl=9 g/l). Mediante os resultados analíticos e de
morfologia foram descritas as principais fases de degradação ao longo do tempo de imersão
estudado. O estudo incidiu na perda de propriedades por degradação e sua relação com a
microestrutura interna do material.
No capítulo 5 foram determinados os coeficientes de difusão de glicerol e glucose, variando a
espessura do material SEVA-C. Neste trabalho, foi avaliada a desorção destes compostos em
solução em placas planas ao longo de 30 dias, mediante métodos analíticos apropriados. Os
coeficientes de difusão foram calculados através da resolução analítica da equação diferencial
parcial de difusão, utilizando transformada de Laplace. Os valores calculados foram
comparados com as medições experimentais, para avaliar a aplicabilidade do modelo aos
dados.
No capítulo 6 são apresentados os principais resultados obtidos nos estudos de degradação
in-vitro de SEVA-C em solução fisiológica simulada (HBSS), com actividade enzimática (αamilase). Foi efectuado um estudo comparativo entre os resultados analíticos e de morfologia
na presença e ausência de enzimas na cinética de degradação. No final é apresentado um
modelo estrutural que descreve os parâmetros condicionadores durante o processo de
degradação destas misturas termoplásticas.
No capítulo 7 são apresentados os resultados obtidos em 2 ensaios realizados em solução
fisiológica simulada, variando a espessura do material e concentração enzimática entre 50 e
100 unid/l de α-amílase em solução. Os materiais utilizados consistiram em provetes de
secção quadrada de SEVA-C e provetes de amido com área superficial de 10 cm2 e filmes
SEVA-C com área exposta de 95 cm2 e 190 cm2, mantendo a massa total igual a 1.6 g em
todos os materiais. A limitação estrutural do material por efeito da área exposta e da
concentração enzimática em solução no processo de degradação, foi confirmado nestes
ensaios mediante os resultados analíticos e de morfologia microestrutura.
No capítulo 8, são referidas as principais conclusões resultantes de todos os trabalhos
realizados e apontadas algumas sugestões de trabalho futuro.
BIBLIOGRAFIA |10
1.5 Bibliografia
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CAPITULO 2
MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO:
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS Á BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
2. MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO:
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
SUMÁRIO
Neste capítulo faz-se uma breve revisão bibliográfica sobre as misturas termoplásticas à base de
amido de milho, nomeadamente SEVA-C, descrevendo os principais aspectos relacionados com as
suas propriedades, degradação, biocompatibilidade e aplicações biomédicas.
Como se trata de um biomaterial, aborda-se a definição de biomateriais e as diferentes classes de
polímeros e compósitos disponíveis em várias aplicações biomédicas, com incidência em próteses e
implantes ortopédicos.
São descritos os mecanismos de degradação de SEVA-C, bem como as principais vias de
biodegradação de biomateriais degradáveis.
Tendo em conta que a base estrutural deste biomaterial é o amido é dada especial atenção a este
composto, à sua estrutura, composição e degradação enzimática.
Os temas abordados encontram-se organizados do seguinte modo:
2.1
BIOMATERIAIS
17
2.2
POLÍMEROS E COMPÓSITOS
18
2.3
ÁREAS DE APLICAÇÃO BIOMÉDICA
25
2.4
ENSAIOS IN VITRO
31
2.5
BIOMATERIAIS DEGRADÁVEIS E BIODEGRADAÇÃO
32
2.6
AMIDO
41
2.7
AMIDO TERMOPLÁSTICO
48
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS Á BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA |17
2.1 Biomateriais
Biomateriais são materiais inseridos no corpo humano para tratar, melhorar ou substituir
qualquer tecido, órgão ou função do corpo, podendo ser de origem natural ou sintética
(Amaral et al., 2003; Booth e Price, 1989; Dee et al., 2002; Lyman e Rowland, 1989;
Muster, 1991; San Ramon e Garcia, 1992).
Uma definição complementar essencial para a ciência dos biomateriais, é a
“biocompatibilidade”, que pode ser definida como a capacidade do material ter uma resposta
apropriada numa aplicação específica, com o mínimo de reacções alérgicas, inflamatórias ou
tóxicas, quando em contacto com os tecidos vivos ou fluidos orgânicos (Hench, 1998;
Muster, 1991). A biocompatibilidade compreende as interacções dos tecidos humanos e
fluidos, incluindo sangue, com um implante ou material. As interacções podem ser do meio
fisiológico sobre o material ou acção do material no corpo. Sendo difícil separar estas duas
interacções (Azhar e Usmani, 1990; Von Recum et al., 1998a).
Um biomaterial deve ser biocompatível numa aplicação específica, assim, as especificações
da biocompatibilidade devem incluir as condições de utilização e avaliação (Lyman e
Rowland, 1989).
Um dos pré-requisitos mais importantes na escolha de um biomaterial é o seu carácter
atóxico (Ikada, 2002). Não deve ocorrer biodegradação que possa comprometer a função,
libertados produtos tóxicos para o meio ou alterações na interface polimérica, que possam
alterar as propriedades mecânicas. A corrosão de polímeros biomédicos em implantes deve
ser mínima, uma vez que as partículas libertadas podem ser prejudiciais para os tecidos
(Lyman e Rowland, 1989).
Assim, os polímeros biomédicos (incluindo aditivos e produtos de degradação) não devem
exibir toxicidade, comportamento irritante, ou ter respostas fisiológicas adversas (Hunt e
Shoichet, 2001; Lyman e Rowland, 1989).
As propriedades superficiais dos biomateriais são muito importantes na sua escolha para
uma aplicação específica, dado que, os átomos superficiais do material de implante são os
primeiros a contactar directamente com o meio biológico (Booth e Price, 1989; Piskin, 1992;
Ratner, 1996b). A hidrofobicidade ou hidrofilicidade, a carga superficial (aniónica ou
catiónica), a polaridade (polar ou apolar), a heterogeneidade na distribuição de grupos
químicos reactivos, a energia superficial (elevada ou baixa), a mobilidade das moléculas
POLÍMEROS E COMPÓSITOS |18
superficiais e rugosidade (lisa, rugosa ou porosa) são algumas das propriedades das
superfícies dos biomateriais. Todas estas propriedades são dependentes do meio físicoquímico do local de aplicação do biomaterial, pelo que, este deve ser conhecido (Piskin,
1992).
A bioactividade é também de grande importância. Um material é bioactivo quando tem uma
resposta biológica específica na sua interface, que resulta na formação de uma ligação entre
os tecidos e o material (Ducheyne, 1987b; Ducheyne, 1998; Hench e Wilson, 1984).
2.2 Polímeros e compósitos
Têm sido implantados diversos tipos de materiais tais como: polímeros naturais e sintéticos,
vidros, cerâmicos, ligas metálicas e compósitos (Booth e Price, 1989; Griffith, 2000; Lemons,
1986), com elevada versatilidade de propriedades mecânicas e superficiais. Apesar desta
diversidade de propriedades, nenhum é totalmente inerte ou totalmente absorvido. Todos os
materiais implantáveis provocam uma resposta dos tecidos, esta resposta pode ser atribuída
a interacções complexas das propriedades mecânicas, química superficial, topografia, forma,
e taxa de degradação do material com o tecido circundante. Modificando as propriedades dos
materiais usados como implante é possível minimizar ou controlar a resposta do tecido
(Anderson e Zhao, 1991; Baldwin e Saltzman, 1996; Booth e Price, 1989; Dee et al., 2002;
Griffith, 2000; Hayashi, 1994; Ikada, 2002; Lyman, 1998; Visser et al., 1996)
2.2.1 Polímeros
Um polímero é uma substância constituída por moléculas de grandes dimensões
(macromoléculas), caracterizadas pela repetição de uma ou mais unidades de dimensões
inferiores, ligadas entre si por ligações covalentes. As unidades repetitivas dos polímeros
unem-se, de modo a formar uma estrutura linear, ou ramificada. As ramificações podem,
ainda, interligar-se e formar uma rede tridimensional reticulada.
Polímeros amorfos são geralmente transparentes e apresentam propriedades de rigidez, e
fragilidade semelhantes ao vidro. Os polímeros constituídos por zonas parcialmente
cristalinas, com cristalites embebidas numa matriz amorfa, apresentam maior densidade,
maior resistência e menor dureza ( Booth e Price, 1989; Dee et al., 2002; Lyman, 1998;
Stevens, 1990b; Visser et al., 1996).
MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA |19
Os polímeros podem ser classificados em homopolímeros (se tiverem apenas um tipo de
unidade repetitiva de monómeros da mesma natureza), ou copolímeros (se conterem duas ou
mais unidades repetitivas) (Visser et al., 1996).
Os plásticos são constituídos por macromoléculas, capazes de assumir formas complexas por
aplicação de calor e pressão. Para além da matriz macromolecular, contém impurezas e
aditivos, de modo a conferir-lhes propriedades específicas.
Os polímeros sintéticos podem dividir-se em termoplásticos e termoendurecíveis, consoante
podem ser fundidos e solidificados repetidamente sem perda significativa das suas
propriedades fundamentais (polietilenos, polimetacrilato de metilo e policloreto de vinilo) ou,
uma vez aquecidos, assumirem uma forma permanente (poliuretanos).
Os termoplásticos são materiais capazes de passar por sucessivos ciclos de fusãosolidificação, sem sofrer degradação das suas propriedades.
Os elastómeros (poliisopreno e polibutadieno) são polímeros de origem natural ou sintética,
com elevado grau de elasticidade, isto é, quando submetidos a uma tensão, deformam-se
significativamente. Esta deformação é reversível, voltando o material às suas dimensões
originais ao ser removida a tensão (Lyman, 1998; Stevens, 1990b).
Polímeros naturais e sintéticos (e respectivos compósitos) tem sido utilizados como
biomateriais em aplicações ortopédicas, dado existirem numa grande variedade de
composições e as suas propriedades serem modificadas em várias aplicações (Swift, 1994).
Os biomateriais poliméricos são divididos principalmente em dois grandes grupos: bioinertes
e biodegradáveis. Materiais bioinertes são aqueles que não sofrem alterações durante o
período de implantação, causando resposta mínima nos tecidos adjacentes, e mantendo as
propriedades estruturais durante longos períodos (Gilding, 1981; Pereira et al., 1998a). Os
polímeros mais utilizados são: polietileno de elevado peso molecular (UHMWPE) (Cornwall et
al., 1995; Wang et al., 1995) utilizado em próteses da anca, mas sofrem alterações durante
a sua implantação, tal como referido por vários autores (Huang et al., 1997; Rimnac et al.,
1994). Outro exemplo deste tipo de polímeros são cimentos ósseos à base de poli(metacrilato
de metilo) (PMMA) (Nguyen et al., 1997; Reis, 1999; Verdonschot e Huiskes, 1995) aplicados
na fixação de próteses da anca em cirurgias de substituição, estes cimentos são
polimerizados in situ através de uma reacção exotérmica, provocando muitas vezes necrose
dos tecidos vizinhos. Os polímeros biodegradáveis podem também ser usados em ortopedia,
tais como: poli (ácido láctico) (PLA) e poli (ácido glicolítico) (PGA) ou poli(hidroxibutirato)
POLÍMEROS E COMPÓSITOS |20
(PHB) em placas ósseas, parafusos, estruturas de suporte tridimensionais (scaffolds)
biodegradáveis em engenharia de tecidos, e polietileno reforçado com hidroxiapatite (HA), em
pequenos implantes permanentes e outras aplicações (Pereira et al., 1998a; Reis, 1999).
Diversos cimentos ósseos, nomeadamente hidroxietilmetacrilato (HEMA), e outros baseados
em ionómeros de vidro, sistemas acrílicos incorporando hidroxiapatite ou vidros bioactivos e
cimentos biodegradáveis ou parcialmente biodegradáveis têm sido propostos nos últimos
anos (Espigares et al., 2002; Leonor et al., 2003; Leonor et al., 2002; Nguyen et al., 1997).
No entanto, na prática clínica, são apenas utilizados cimentos ósseos baseados em PMMA
(Deb et al., 1997; Lemons, 1986).
Exemplos de aplicações de biomateriais poliméricos em aplicações clínicas incluem:
pacemakers cardíacos, válvulas cardíacas, sistemas contraceptivos, cateteres, sensores,
adesivos médicos, lentes de contacto, pele artificial, coração artificial, sangue artificial,
cimentos ortopédicos e dentários, suturas e sistemas de libertação controlada de fármacos
(Agrawal, 2002; Amass et al., 1998; Burg e Shalaby, 1998; Hayashi, 1994; Ikada, 2002;
Mano et al., 2004).
2.2.2 Biopolímeros
Os biopolímeros são polímeros naturais tais como colagénio, elastina, ácido hialurónico,
dextrano, celulose e quitina (Kaplan DL, 1998; Lenz, 1990; Stevens, 1990a; Yannas, 1996).
A sua síntese envolve reacções catalisadas enzimaticamente e reacções de polimerização de
cadeia. Os biopolímeros estruturais e de reserva mais importantes são os polissacarídeos
(Amaral et al., 2003; Hayashi, 1994; Kaplan DL, 1998; Lenz, 1990). Os polissacarídeos de
maior interesse em aplicações são o amido e a celulose (Averous et al., 2001; Bastioli, 1995;
Bergthaller et al., 1999; Friedman, 1995; Galliard, 1987; Jane et al., 1995; Jane, 1995;
Shogren, 1998).
Nos últimos anos, os polímeros naturais tem sido propostos como alternativas aos
biomateriais actualmente usados em aplicações biomédicas. Uma das vantagens destes
materiais é o seu baixo custo como resultado da disponilidade da matéria-prima (Dumitri S et
al., 1996; Kaplan DL, 1998). A Tabela 2.1 mostra alguns dos biopolímeros actualmente
disponíveis.
MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA |21
Tabela 2.1 Lista de biopolímeros (Kaplan DL, 1998).
Polissacarídeos
(plantas/algas)
Polissacarídeos
(animais)
Polissacarídeos
(bactérias)
Amido (amilose, amilopectina)
Celulose
Pectina
Alginato
Carraginato
Gomas
Soja, glúten de trigo, caseína,
soro de albumina
Sedas
Elastina
Polihidroxialcanoatos
Ácido hialurónico
quitina, quitosano
xantano
Poligalactosamina
gelano
dextrano
Os biopolímeros são uma importante fonte de materiais com grande versatilidade química e
elevado potencial em diversas aplicações biomédicas. As suas propriedades podem ser
facilmente alteradas por diferentes métodos físicos e químicos. Isto permite a selecção de
propriedades importantes tais como capacidade de absorção de água, cinéticas de
degradação, ou propriedades mecânicas com especificações apropriadas em determinadas
aplicações (Kaplan DL, 1998; Yannas, 1996).
Os polímeros naturais são apropriados como materiais biomédicos, devido à sua semelhança
estrutural com os componentes dos tecidos. O facto de conterem monómeros semelhantes,
ou mesmo idênticos, aos encontrados nas matrizes orgânicas do organismo reduz a
possibilidade de ocorrência de problemas associados à toxicidade dos materiais, ou seus
produtos de degradação, ou estimulação de reacções inflamatórias crónicas (Kaplan DL,
1998; Lenz, 1990; Stevens, 1990a). No entanto, existem algumas desvantagens em utilizar
polímeros naturais como por exemplo: (i) fortes actividades fisiológicas e potencial para
rejeição; (ii) dificuldade na avaliação das taxas de degradação in vivo devido a diferenças nas
concentrações enzimáticas em diferentes partes dos tecidos vivos; e (iii) a resistência
mecânica dos polímeros naturais é geralmente insuficiente. Por estas razões, a sua aplicação
como materiais biomédicos tem sido limitada a pequenas áreas específicas (Hayashi, 1994;
Huang, 1989; Ikada, 2002; Mano et al., 2004).
POLÍMEROS E COMPÓSITOS |22
Uma característica intrínseca dos polímeros naturais é a sua capacidade de serem
degradados por enzimas, garantindo que o implante seja metabolizado por mecanismos
fisiológicos. Esta propriedade tem interesse em aplicações de biomateriais no qual se
pretende uma função específica por um período de tempo temporário, seguido do qual é
esperado que o implante degrade completamente por processos metabólicos normais (Stacy
et al., 1989; Yannas, 1996).
2.2.3 Sistemas bioartificias
Os materiais poliméricos bioartificiais são biomateriais que resultam das interacções entre
polímeros sintéticos e naturais. Os materiais bioartificiais combinam as propriedades dos
polímeros sintéticos (boas propriedades mecânicas, fácil processamento, custos baixos de
produção e transformação) com as propriedades específicas de biocompatibilidade e
degradabilidade dos biopolímeros. A biocompatibilidade do material é determinante para as
interacções a nível molecular entre o material e os constituintes dos tecidos. Quanto menos
afectada
a
funcionalidade
biológica
dos
constituintes
dos
tecidos,
melhor
a
biocompatibilidade do material sintético. Os materiais poliméricos bioartificiais têm melhor
biocompatibilidade
na
redução
de
interacções
indesejáveis
com
os
tecidos,
comparativamente aos biomateriais sintéticos. Relativamente aos biopolímeros mostram
melhores propriedades físicas e mecânicas (Lazzeri, 1996).
2.2.4 Processamento de polímeros
A variedade dos modos de processamento dos polímeros reflecte a grande diversidade desta
classe de materiais. Os polímeros termoplásticos podem ser processados por extrusão,
moldação por injecção, termoformação ou outros processos de menor representatividade. Os
polímeros termoendurecíveis podem ser moldados por compressão, transferência e por
injecção. O processamento de polímeros pode ser efectuado por fusão e solvatação (Liao et
al., 2002).
Por exemplo, os sistemas de fixação, como placas e parafusos utilizados em ortopedia, são
normalmente fabricados utilizando técnicas de extrusão ou moldação por injecção. As
propriedades físicas e mecânicas do produto final são determinadas pelos parâmetros de
moldação. Estas propriedades incluem o peso molecular, a percentagem de cristalinidade, a
orientação da cadeia, e flexibilidade (Agrawal e Ray, 2001).
MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA |23
2.2.5 Compósitos poliméricos
A definição tradicional de um material compósito é um material com pelo menos duas fases,
uma fase contínua e uma fase dispersa (Ambrosio et al., 1998; Latour, 1998). A fase
contínua é responsável por preencher o volume e transferência de carga para a fase dispersa.
A fase dispersa melhora normalmente uma ou mais propriedades do compósito. Muitos
compósitos têm como objectivo melhorar as propriedades mecânicas, tais como tenacidade e
resistência (Ambrosio et al., 1998; Latour, 1998; Mano et al., 2004; Ramakrishna et al.,
2001). A fase descontínua dos compósitos poliméricos pode ser da mesma natureza ou, de
material diferente. Compósitos podem ser desenvolvidos com requisitos específicos,
utilizando várias matrizes poliméricas, reforços e etapas de processamento (Mano et al,
2004).
Até ao momento, nenhum polímero tem comportamento bioactivo por si só (a não ser que
sejam aplicados diversos pré-tratamentos). Uma forma de promover a sua bioactividade é
combinar polímeros e cerâmicos bioactivos, criando materiais compósitos com propriedades
que derivam dos materiais constituintes. Desta forma, é possível criar materiais com
propriedades mecânicas, taxas de degradação e biocompatibilidade satisfatórias dos
polímeros e cerâmicos na substituição de tecido ósseo e outras aplicações ortopédicas
(Azevedo et al., 2003b; Nazhat et al., 2001; Ramakrishna et al., 2001). A interface
revestimento/matriz é determinante para o comportamento mecânico dos compósitos, isto é,
os implantes devem ser superficialmente e estruturalmente/mecanicamente compatíveis com
os tecidos adjacentes (Azevedo et al., 2003c; Oliveira et al., 2003a). Os reforços mais
comuns em matrizes de compósitos poliméricos são o vidro e fibras de carbono. Exemplos de
enchimentos bioactivos como materiais de reforço em implantes ósseos ou substitutos de
tecidos são a HA e vidros bioactivos. O vidro bioactivo é um tipo de vidro especial com
afinidade ao osso mineral, permitindo a obtenção de reforço mecânico e bioactividade em
matrizes de compósitos poliméricos. O material ideal deve evidenciar o melhor compromisso
entre a rigidez/flexibilidade, aproximando ao módulo do osso, mas com alguma flexibilidade
da matriz compósita (Reis et al., 1997b).
Os sistemas de compósitos biodegradáveis permitem a transferência gradual de carga para
os tecidos em recuperação, evitando a necessidade de uma segunda intervenção cirúrgica
para a sua remoção. Evitam também o efeito de perda de massa óssea devido ao desvio das
POLÍMEROS E COMPÓSITOS |24
tensões aplicadas, associado à utilização de materiais mais duros (Oliveira et al., 2003a).
Exemplos de polímeros em matrizes de compósitos biomédicos incluem PMMA (Nguyen et
al., 1997), polisulfona (PSU), poli(eteretercetona) (PEEK) e resinas epoxídicas. As
propriedades de um material polimérico nestas aplicações incluem resistência à fadiga,
resistência em meio salino aquoso, biocompatibilidade, estabilidade dimensional, ausência de
migração de aditivos e esterilizáveis por métodos padrão sem perda das propriedades.
Um dos exemplos de sucesso de compósitos poliméricos são baseados em matrizes de
polietileno reforçado com cerâmicos bioactivos, tais como hidroxiapatite e vidros bioactivos.
Os resultados têm sido promissores, e os compósitos têm mostrado calcificação in vitro,
cobrindo as matrizes poliméricas inactivas. O compósito com cerâmicos bioactivos ou vidros
tem evidenciado crescimento do osso in vivo (Nazhat et al., 2001).
Apesar de terem sido divulgadas várias patentes neste campo (Allan e Bevis, 1987; Griffin,
1991; Stepto et al., 1989; Wittwer e Tomka, 1987; Wittwer e Tomka, 1989), nenhuma
aplicação comercial dos compósitos em tecidos duros encontra-se disponível actualmente no
mercado (Mano et al., 2004).
2.2.6 Biocompósitos
Os materiais biocompósitos são obtidos quando se misturam biopolímeros de derivados de
por exemplo, celulose, amido, ácido láctico, etc. As biofibras funcionam como elemento de
reforço para melhorar a resistência e a tenacidade das estruturas dos compósitos resultantes.
Uma vez que ambos os componentes são biodegradáveis, o compósito é também
biodegradável. As vantagens das biofibras sobre os materiais reforçados tradicionais tais
como fibras de vidro são: o baixo custo, a baixa densidade, a elevada tenacidade, a redução
do desgaste, as boas propriedades térmicas, fácil separação e biodegradabilidade. A principal
desvantagem é a sua natureza hidrofílica que diminui a compatibilidade com a matriz
polimérica hidrofóbica do compósito. Outro aspecto negativo é a baixa temperatura de
processamento requerida, devido à possibilidade da degradação das fibras, e/ou
possibilidade de emissão de compostos voláteis que influenciam as propriedades do
compósito. As temperaturas de processamento de muitas biofibras estão limitadas a 200 ºC,
no entanto, é possível utilizar temperaturas mais elevadas durante curtos períodos de tempo
(Mohanty et al., 2000).
MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA |25
2.3 Áreas de aplicação biomédica
2.3.1 Próteses e implantes ortopédicos
Próteses e implantes ortopédicos são dispositivos médicos, aplicados mediante acto cirúrgico,
total ou parcialmente no interior do organismo, com o objectivo de restabelecer ou substituir
a capacidade funcional de um dado osso ou articulação (Amaral et al., 2003; Booth e Price,
1989; Dee et al., 2002; Hayashi, 1994; Ikada, 2002).
Nenhum implante tem propriedades biomecânicas equivalentes aos tecidos que substitui.
Todos os implantes apresentam um balanço entre a compatibilidade bioquímica e
biomecânica. Além da bioactividade, as propriedades físicas e mecânicas são essenciais para
que um implante seja capaz de substituir o osso. Têm sido utilizados diversos materiais, ou
propostos para serem usados, principalmente na fixação óssea, substitutos do osso e
estruturas ósseas (graft). Os implantes metálicos tradicionais têm sido substituídos por
cerâmicos, metais cerâmicos, polímeros e compósitos, em várias aplicações biomédicas.
(Amass et al., 1998; Mano et al., 2004; Reis, 1999).
São realizados ensaios mecânicos com o objectivo de avaliar o desempenho mecânico de um
potencial biomaterial como implante. Em implantologia ortopédica é de extrema importância
conhecer a resistência do biomaterial à solicitação de forças de compressão, torção, tracção,
tenacidade à fractura e o comportamento elástico. O desgaste e a fadiga são duas causas
comuns de degradação dos materiais ortopédicos. Os principais tipos de desgaste envolvidos
na deterioração dos implantes prostéticos são: desgaste por abrasão, fadiga e adesão
(Amaral et al., 2003).
As aplicações médicas de polímeros encontram-se divididas em duas categorias principais:
implantes permanentes e temporários. Os implantes temporários são utilizados para
restabelecer ou apoiar um dado osso na sua consolidação, após fractura, ou promover o seu
alongamento (caso de fixadores externos). Os dispositivos permanentes uma vez aplicados,
não devem terminar a sua função durante o tempo de vida do paciente. Há muitas vezes
necessidade de revisão da prótese, devido à deterioração da junção prótese/osso na zona de
interface com separação entre a prótese e o osso, bem como a possível degradação dos
componentes da prótese, devido a fenómenos de desgaste e corrosão, ou problemas
associados a possíveis infecções (Agrawal e Ray, 2001).
ÁREAS DE APLICAÇÃO BIOMÉDICA |26
De entre os diversos tipos de próteses e implantes que se utilizam em ortopedia, salientam-se
as próteses da anca, joelho e ombro, todas do tipo articular, visando restabelecer a
capacidade do movimento e de transferência de carga. Outro tipo de próteses bastante
comum são as placas de osteossíntese, que visam fixar porções de osso fracturado, de modo
a inibir o respectivo movimento relativo, e assim permitir a consolidação do calo formado na
zona fracturada (Amass et al., 1998).
Muitos destes dispositivos, sobretudo quando destinados a permanecer em contacto com o
organismo durante períodos relativamente curtos, são fabricados com ligas metálicas, que
permitem fácil construção a custos relativamente baixos. De entre as ligas mais utilizadas,
salientam-se os aços inoxidáveis AISI 316L (Ti-6Al-4V), constituídos por crómio, níquel,
molibdénio e ferro. Estas ligas são de baixo custo mas apresentam problemas de
degradação, podendo libertar iões agressivos para os tecidos envolventes, ou que se
acumulem em órgãos específicos, possuem propriedades elásticas bastante diferentes das do
osso, podendo alterar a biomecânica do conjunto (Amaral et al., 2003). O osso cortical e o
aço têm propriedades mecânicas muito diferentes. A constante de elasticidade do osso é
1/10 do aço implantado. Assim, a remoção dos implantes metálicos pode ser seguida por
um período de enfraquecimento do osso, com o perigo de refractura (Hayashi, 1994;
Thomson et al., 1995b).
Nas próteses articulares é comum associar diferentes polímeros, com boa resistência e
razoável “biocompatibilidade”. A combinação de metais ou cerâmicos é uma forma de
minimizar a deterioração da zona de contacto na articulação, devido à elevada resistência ao
desgaste na zona de contacto destes materiais (Amaral et al., 2003; Visser et al., 1996).
É comum distinguir dois tipos de implantes degradáveis: estruturas de suporte temporárias e
sistemas de libertação controlada de fármacos (Hayashi, 1994; Langer e Kohn, 1996). Nas
matrizes de libertação controlada de fármacos, a matriz polimérica degradável serve como
transportador que desaparece tão rapidamente quanto necessário, após a libertação do
agente activo farmacológico. Muitos polímeros biodegradáveis são hidrofílicos por natureza,
quando a água penetra na matriz, o fármaco torna-se mais hidrofílico, sendo mais facilmente
removido (Gilding, 1981).
As suturas cirúrgicas estão divididas em duas classes: absorvíveis e não absorvíveis (Burg e
Shalaby, 1998; Hayashi, 1994). As suturas absorvíveis, de origem natural ou sintética,
fornecem suporte aos tecidos durante os estados inicial de reabilitação, sendo depois
MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA |27
eliminados por absorção ou digestão metabólica. As suturas não absorvíveis, devem fornecer
suporte aos tecidos durante longos períodos de tempo, ou permanecer ligados aos tecidos
em sistemas prostéticos (Mukherjee, 1989).
A primeira sutura sintética degradável foi aplicada originalmente em 1970 à base de PGA
(Dexon). Uma limitação prática das suturas Dexon é que tendem a perder a resistência
mecânica rapidamente, durante um período de duas a quatro semanas após implantação.
Mais tarde, outros copolímeros de PGA e PLA foram desenvolvidos. A sutura mais utilizada,
Vicryl, é composta por um copolímero PGA/PLA (90/10), tendo sido introduzida no mercado
em 1974 (Langer e Kohn, 1996; Mukherjee, 1989).
As estruturas de suporte temporário são utilizadas nos casos em que o tecido natural
enfraqueceu por doença, lesão, ou cirurgia e que necessita de um suporte artificial. Uma
lesão mal curada, um osso partido, ou um vaso sanguíneo danificado são alguns exemplos.
Sistemas de fixação óssea (parafusos ou placas) são sistemas de suporte. Em todas estas
circunstâncias, o implante degradável funciona como suporte mecânico temporário. Para que
um implante temporário desempenhe correctamente a sua função, deve ocorrer uma
transferência gradual da carga: à medida que o tecido natural cresce, o implante degradável
deve tornar-se mais fraco. A necessidade de ajustar a taxa de degradação do implante
temporário ao crescimento dos tecidos adjacentes é um dos principais factores da viabilidade
do suporte temporário (Visser et al., 1996).
O osso é um órgão dinâmico capaz de auto-regeneração após lesão. Ocasionalmente, quando
a lesão é grave, o osso não recupera correctamente falhando na função mecânica (Thomson
et al., 1995b). Muitas vezes, os defeitos ósseos necessitam de um substituto ósseo
extrínseco para a sua restauração funcional e morfológica. A função dos substitutos ósseos é
de enchimento ou estrutura de suporte (John et al., 2001). O cimento ósseo é uma
alternativa sintética viável ao tecido natural, utilizado normalmente para preencher defeitos ou
na fixação de próteses do osso. Desde 1960, PMMA tem sido utilizado, devido à sua
bioestabilidade e boas propriedades mecânicas (Espigares et al., 2002).
Um problema comum na substituição da anca é o desprendimento de cimento na junção da
prótese, em muitos casos está relacionado com a falha mecânica no cimento ósseo acrílico
(Deb et al., 1997; Thomson et al., 1995b). Melhoramentos no uso de cimentos PMMA têm
sido obtidos com o uso de reforços de partículas ou fibras na matriz. A adição de pequenas
fibras de carbono ou enchimentos inorgânicos, ajuda a reduzir a deformação dos cimentos
ÁREAS DE APLICAÇÃO BIOMÉDICA |28
ósseos, aumentando a dureza e reduzindo a mobilidade molecular das cadeias poliméricas
(Deb et al., 1997; Espigares et al., 2002). Sistemas de fixação óssea, parafusos, placas,
substitutos de ligamentos degradáveis e suturas são exemplos comuns de implantes
temporários em medicina humana.
Outros sistemas biodegradáveis à base de colagénio, PHB, policaprolactona, policarbonatos
derivados de tirosina, derivados de celulose, quitina, quitosano, poli(etilenoglicol) (PEG),
poli(álcool de vinilo) (PVA), tem sido propostos mas nenhum tem aplicação actual no
mercado (Langer e Kohn, 1996).
A Tabela 2.2 seguinte descreve algumas aplicações de materiais sintéticos no corpo. (Ratner,
1996a).
Tabela 2.2 Aplicações de materiais sintéticos e materiais naturais modificados em medicina.
Aplicações
Esqueleto
Próteses (anca, joelho)
Placas ósseas para fixação de fracturas
Cimentos ósseos
Reparação de defeitos ósseos
Tendões e ligamentos artificiais
Implantes dentários para fixação de dentes
Sistema cardiovascular
Vasos sanguíneos
Válvulas cardíacas
Cateteres
Tipos de materiais
Titânio, ligas de Ti-Al-V, polietileno
Aço inoxidável, ligas cobalto-crómio
Poli(metilmetacrilato)
Hidroxiapatite
Teflon, dacron
Titânio, fosfato de cálcio, alumina
Dacron, teflon, poliuretano
Aço inoxidável, carbono
Silicone, poliuretano
Orgãos
Coração artificial
Pele artificial
Rins
Poliuretano
Compósito silicone-colagénio
Celulose, poliacrilonitrilo
Olhos
Lentes intra-oculares
Lentes de contacto
Poli(metilmetacrilato), silicone, hidrogel
Silicone-acrilato, hidrogel
2.3.2 Engenharia de tecidos
A “engenharia de tecidos” é uma área multidisciplinar, podendo ser definida como uma
“combinação de princípios e métodos das ciências da vida e da engenharia, desenvolvendo
MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA |29
materiais e métodos para reparar tecidos lesados, e criar substitutos de tecidos” (Nordgren,
2004; Von Recum et al., 1998b; Wang et al., 2001). Em contraste à aproximação clássica de
biomateriais, é baseada na formação de tecido e regeneração, e tem como objectivo induzir
novos tecidos funcionais, em vez de implantar novas partes (Salgado et al., 2004b).
É uma solução alternativa na reparação de defeitos ósseos (Baldwin e Saltzman, 1996; Buma
et al., 2004). Envolve a expansão de células de uma pequena biopsia, seguida da cultura das
células em estruturas a três dimensões, para formar um novo tecido ou órgão (Chen et al.,
2001). A essência da engenharia de tecidos é o uso de células vivas, juntamente com
componentes naturais ou sintéticos extracelulares, no desenvolvimento de partes
implantáveis ou sistemas para a restauração das funções do corpo (Wang et al., 2001).
Apesar da engenharia de tecidos ter múltiplas facetas e várias definições, pode ser definida
como uma ciência em que o corpo regenera e repara tecidos que falharam na regeneração
ou cura espontânea (Buma et al., 2004; Nordgren, 2004; Salgado et al., 2004a). No caso
ideal, as estruturas de suporte bioabsorvem in vivo a uma taxa predefinida, de forma que o
espaço a três dimensões ocupado pelo suporte inicial é substituído pelo tecido regenerado
(Agrawal e Ray, 2001; Salgado et al., 2004a; Von Recum et al., 1998b; Wu e Ding, 2004).
Além disso, a estrutura de suporte deve ser porosa e permeável para permitir o crescimento
de células e nutrientes, e química superficial apropriada para a ligação e a proliferação das
células (Gomes et al., 2002a; Salgado et al., 2004a; Von Recum et al., 1998b).
Um dos objectivos da engenharia de tecidos é criar alternativas biológicas para a
transplantação de orgãos e tecidos, em que o processo de crescimento do tecido pode
ocorrer in vitro ou in vivo. Os polímeros sintéticos biodegradáveis são alternativas para a
produção de estruturas de suporte a três dimensões no crescimento de tecidos, devido a não
apresentarem risco de transmissão patogénica e imunorejeição, degradam após a função da
estrutura estar completa, eliminando a inflamação a longo prazo e complicações associadas
com as reacções do corpo estranho (Ma e Zhang, 2001).
Em adição à adesão celular, ao crescimento celular, e à retenção de células com funções
diferenciadas, a estrutura deve ser biocompatível com os produtos de degradação que podem
ser excretados por via metabólica; biodegradável com taxa de degradação controlada;
altamente porosa com elevada razão área/volume; e mecanicamente forte. A selecção do
polímero mais adequado para produzir a estrutura de suporte a três dimensões em
engenharia de tecidos é muito importante, uma vez que as suas propriedades intrínsecas
ÁREAS DE APLICAÇÃO BIOMÉDICA |30
determinam as propriedades da estrutura de suporte (Gomes et al., 2002c; Salgado et al.,
2004a).
As propriedades essenciais para a estrutura de suporte são (Agrawal, 2002): i) ser
biocompatível; ii) biodegradável a uma taxa semelhante à reparação ou regeneração do
processo; iii) altamente poroso com tamanho correcto de poros; iv) altamente permeável para
facilitar a difusão; v) possuir propriedades mecânicas adequadas; vi) superfície adequada ao
crescimento das células; vii) auxiliar na formação da matriz extracelular promovendo funções
celulares; e viii) possibilidade de transportar fármacos/factores de crescimento (Agrawal,
2002).
Os biomateriais utilizados nestas estruturas porosas incluem polímeros sintéticos
biodegradáveis tais como PGA, PLA, e os seus copolímeros PLG, e polímeros naturais tais
como colagénio e HA inorgânica (Chen et al., 2001; Thomson et al., 1995b).
O processamento polimérico é importante no desenvolvimento de estruturas de suporte em
engenharia de tecidos. A técnica utilizada para a obtenção de estruturas de suporte em
engenharia de tecidos depende das propriedades do polímero e suas aplicações (Gomes et
al., 2002c).
Muitas das técnicas de processamento convencional utilizadas para produzir materiais
porosos na indústria polimérica não são adequadas para produzir materiais em aplicações
médicas, dado que envolvem normalmente a adição de aditivos, tais como surfactantes,
estabilizantes, lubrificantes e agentes de enchimento padrão, que podem libertar resíduos
tóxicos ou produtos secundários incompatíveis com os organismos vivos (Gomes et al.,
2002c).
Têm sido desenvolvidas várias técnicas de processamento para fabricar estas estruturas, tais
como solvatação, libertação de partículas, laminação membranar, separação/inversão fase,
métodos de alta pressão, tecnologias de moldação, e microondas (Gomes et al., 2002c;
Thomson et al., 1995b). O maior problema das estruturas produzidas por estes métodos é a
sua fraca resistência mecânica, não permitindo a sua utilização na regeneração de tecido
duro, onde é requerida elevada resistência das estruturas (Gomes et al., 2002c).
MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA |31
2.4 Ensaios in vitro
A crescente utilização de biomateriais em medicina, conduziu à necessidade de
desenvolvimento de testes reprodutíveis e efectivos de biomateriais. A restrição da
experimentação animal ao mínimo aumentou o interesse pelos sistemas in vitro, na distinção
entre potenciais biomateriais e os que não são adequados para aplicação humana. Os
métodos in vitro são um auxiliar necessário para os estudos in vivo na avaliação de
biomateriais (Agrawal, 2002; Buma et al., 2004; Kirkpatrick e Mittermayer, 1990). Uma das
funções mais importantes é detectar efeitos tóxicos dos biomateriais numa fase preliminar.
As alterações variam desde morte celular a alterações de adesão celular, proliferação e
actividade biossintética. Os métodos in vitro devem ser confrontados com a validação de
extrapolação para a situação in vivo (Kirkpatrick e Mittermayer, 1990). Os ensaios in vitro são
testes conduzidos em condições que simulam o meio com o qual o material vai estar em
contacto quando implantado, pelo que, permitem avaliar possíveis mecanismos de reacções
interfaciais entre o implante e os tecidos (Amaral et al., 2003; Gros, 1989; Williams, 1992).
Os principais factores que afectam a taxa de degradação de polímeros sintéticos em meio
biológico são (Lenz, 1990): (i) estrutura do polímero, especialmente hidrofilicidade e a
presença de grupos funcionais, peso molecular e a distribuição de peso molecular; (ii) estado
físico e morfológico do polímero, particularmente se é cristalino ou amorfo; (iii) condições
ambientais (temperatura, pH, humidade, oxigénio); (iv) razão superfície/volume, tamanho e
pureza do polímero (Lenz, 1990).
A selecção das condições experimentais para os ensaios in vitro devem ser baseadas na
relação estrutura/propriedades do polímero biomédico, componentes fisiológicos e
interacções no meio in vivo (Anderson e Zhao, 1991).
O primeiro passo para testar potenciais biomateriais são os testes de biocompatibilidade
“gerais”, que permitem o reconhecimento de efeitos nocivos do biomaterial nas células,
envolvem normalmente a utilização de várias linhas celulares cultivadas em laboratório
durante longos períodos. A avaliação pode ser feita directamente (em contacto com o
material), em extractos (detectando produtos lixiviados que possam ter efeitos nocivos) ou
indirectamente (as células estão separadas do material por um gel ou uma membrana
permeável). Estes métodos devem ser seguidos de uma segunda fase in vitro, no qual são
utilizadas células primárias relevantes para a aplicação proposta do sistema médico. Os
BIOMATERIAIS DEGRADÁVEIS E BIODEGRADAÇÃO |32
materiais com baixa toxicidade são sujeitos a testes de citocompatibilidade, na presença de
células com as quais o material vai contactar quando implantado (Amaral et al., 2003;
Kirkpatrick e Mittermayer, 1990). Os testes de biocompatibilidade “específica” são uma
forma de simular a situação in vivo tão próximo quanto possível. A elevada sensibilidade do
método, permite o reconhecimento de potenciais materiais citotóxicos a excluir numa fase
inicial de experimentação. No entanto, a experimentação in vitro, “geral” ou “específica”, não
pode substituir a experimentação in vivo. Ambas as componentes são necessárias para testar
potenciais biomateriais (Kirkpatrick e Mittermayer, 1990).
Uma das principais desvantagens dos métodos in vitro é o problema fundamental de
extrapolação para a situação in vivo. Os testes in vitro representam apenas uma parte do
estudo da biocompatibilidade. As espécies classificadas como biocompatíveis in vitro devem
entrar numa fase seguinte de observação in vivo (Agrawal, 2002; Buma et al., 2004;
Kirkpatrick e Mittermayer, 1990). Os ensaios in vivo constituem a última etapa a que os
biomateriais são sujeitos antes da fase do ensaio clínico; procuram avaliar a força e a
natureza da ligação implante-tecido ósseo e a resposta biológica do organismo hospedeiro à
presença do biomaterial, através da identificação e quantificação de tecidos e células
circundantes (Amaral et al., 2003; Gros, 1989; Huang, 1989; Marchant, 1990).
2.5 Biomateriais degradáveis e biodegradação
2.5.1 Biomateriais degradáveis
Nas aplicações clínicas é importante distinguir polímeros biodegradáveis e bioabsorvíveis. Os
polímeros biodegradáveis são decompostos no corpo humano, mas os seus produtos de
degradação permanecem nos tecidos durante bastante tempo. Os polímeros bioabsorvíveis
podem ser definidos como polímeros que degradam após implantação em produtos não
tóxicos, que são eliminados do corpo ou metabolizados (Hayashi, 1994).
Os materiais degradáveis devem obedecer a parâmetros mais estritos de biocompatibilidade
que os materiais não degradáveis. Além do problema potencial de contaminantes tóxicos
libertados pelo implante (monómeros residuais, estabilizantes, iniciadores de polimerização),
é necessário considerar a toxicidade potencial dos produtos de degradação e metabolitos
subsequentes (Amass et al., 1998; Coury et al., 1996; Langer e Kohn, 1996).
MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA |33
Um material biodegradável quando implantado, contacta directamente com os fluidos do
corpo que difundem para o interior do polímero à medida que ocorre degradação (Coury et
al., 1996; Gilding, 1981; Oliveira e Reis, 2004). Os produtos de degradação são libertados
para o tecido adjacente e portanto devem ser biocompatíveis. Os produtos de degradação
poderão dissolver-se nos fluidos extracelulares à medida que são formados, sendo excretados
pelos rins e pulmões (Gilding, 1981; Ikada, 2002). Os materiais biodegradáveis utilizados em
aplicações clínicas devem ter propriedades mecânicas adequadas, e taxas de absorção
equivalentes às taxas de crescimento dos tecidos, sendo completamente reabsorvidos e
gradualmente substituídos pelo novo tecido. A taxa de crescimento é diferente para cada
tecido dependendo da sua localização no corpo humano. Após a regeneração, os polímeros
biodegradáveis implantados devem ser degradados e absorvidos tão rápido quanto possível
para minimizar efeitos indesejáveis (Hayashi, 1994).
A degradação contínua de sistemas cirúrgicos bioabsorvíveis causa uma transferência gradual
de carga entre o osso e o elemento, previne o atrofiamento, estimula a remodelação óssea e
evita o efeito de escudo de tensões (El-Amin et al., 2003; Hayashi, 1994; Ikada, 2002; Mano
et al., 2004).
Os materiais biodegradáveis incluem substâncias orgânicas e inorgânicas, mas a maior parte
são polímeros orgânicos. Poli(α-hidroxiésteres), tais como PLA, PGA e seus copolímeros PLG,
encontram-se entre os polímeros sintéticos aprovados para o uso clínico humano. Exibem
biocompatibilidade, biodegradabilidade e são facilmente processados por técnicas
convencionais de moldação (Amass et al., 1998; Ikada, 2002; Langer et al., 1990; Langer e
Kohn, 1996; Mano et al., 2004).
A incorporação de partículas de HA nas matrizes assegura o comportamento bioactivo do
compósito, e resistência. A aplicação de tratamentos antes da implantação para induzir a
formação de uma camada de apatite na superfície do material implantado, assegura o
carácter de ligação do implante ao osso, por revestimento biomimético da superfície, sem
aplicação de reforços bioactivos.
Outros materiais de relevância incluem poli(ortoésteres), poli(glicolide-co-trimetileno
carbonato), poli(p-dioxanona), poli(anidridos), poli(caprolactona) (PCL), PHB e copolímeros de
PBH/PHB (Amass et al., 1998; Mano et al., 2004). Os polímeros bidegradáveis mais comuns
na área médica são descritos na tabela seguinte (Agrawal e Ray, 2001).
BIOMATERIAIS DEGRADÁVEIS E BIODEGRADAÇÃO |34
Tabela 2.3 Polímeros biodegradáveis sintéticos em engenharia de tecidos.
Polímero
Aplicação
PLA-PGA
Polianidridos
Poliortoésteres
Policaprolactona
Osso, cartilagem
Osso, libertação controlada de fármacos
Libertação controlada de fármacos
Sistemas de fixação biodegradáveis
Libertação controlada de fármacos
Osso, sistemas de fixação biodegradável
Libertação controlada de fármacos
Osso
Policarbonato
Polifumarato
Todos os polímeros referidos na tabela anterior são biocompatíveis. No entanto, para além da
biocompatibilidade, as suas propriedades mecânicas são igualmente importantes em
aplicações ortopédicas, devido às solicitações contínuas (Agrawal e Ray, 2001).
2.5.2 Biodegradação
Os polímeros podem ser definidos quanto aos mecanismos e características de degradação
em quatro termos: biodegradáveis, bioabsorvíveis, bioressorvíveis e bioerodível (Langer e
Kohn, 1996; Park et al., 1993b).
A biodegradação tem sido definida de várias formas por diferentes investigadores (Coury et
al., 1996; Gilding, 1981; Huang e Edelman, 1995). Inclui alterações nas propriedades
superficiais ou perda de resistência mecânica, assimilação por microrganismos, degradação
por enzimas, ruptura de ligações da cadeia, redução do peso molecular médio do polímero,
ou extracção de material de baixo peso molecular, conduzindo a defeitos superficiais. A
degradação pode ocorrer por um dos mecanismos anteriores ou a sua combinação
(Aminabhavi et al., 1990; Park et al., 1993b).
Durante o Second International Scientific Workshop on Biodegradable Polymers and Plastics,
foram consideradas as seguintes definições (Lenz, 1990; Li e Vert, 1995): i) degradação
polimérica: variação das propriedades do polímero devido a variações na estrutura química;
ii) polímero biodegradável é um polímero no qual a degradação é conduzida, pelo menos
parcialmente, por um sistema biológico; iii) polímero bioabsorvível é um polímero que pode
ser assimilado por um sistema biológico; iv) erosão reflecte o processo de dissolução ou
desgaste da superfície do polímero.
MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA |35
Os efeitos da degradação de polímeros incluem (Kulshreshtha, 1990): i) variações na
estrutura química; ii) variações na superfície (muitas degradações ocorrem na superfície do
material, onde os efeitos de degradação são máximos); iii) perda de propriedades mecânicas;
iv) redução no peso molecular devido à cisão da cadeia; v) geração de radicais livres; vi)
perda de aditivos e plasticizadores; vii) enfraquecimento (Kulshreshtha, 1990).
Os sistemas biodegradáveis devem ser degradados in vivo, mas também formar produtos
solúveis facilmente removíveis do local de implantação e excretados do corpo pelas vias
metabólicas normais. A biodegradação reflecte os processos de degradação hidrolítica,
enzimática e bacteriológica dentro da matriz polimérica (Li e Vert, 1995).
A biodegradação pode ocorrer a diferentes níveis estruturais: molecular, macromolecular,
microscópico e macroscópico. A degradação pode iniciar-se por hidrólise, mas à medida que
o polímero é destruído, a área superficial e acessibilidade aumentam, podendo predominar a
degradação enzimática. A definição de biodegradação deve incluir todos os tipos de
degradação que ocorrem in vivo (Park et al., 1993b).
Heller (Heller, 1996) definiu o termo “polímero bioerodível” como a conversão de um
polímero insolúvel num material solúvel em condições fisiológicas, sem atender ao
mecanismo específico envolvido no processo de erosão. A bioerosão indica a conversão de
polímeros insolúveis em água em polímeros solúveis ou pequenas moléculas. O prefixo “bio”
indica que a erosão ocorre em condições fisiológicas (Langer e Kohn, 1996).
A erosão de polímeros envolve várias etapas, que diferem para cada um dos polímeros. O
objectivo é determinar o passo controlador de reacção. Na primeira etapa a água contacta
com o polímero por acesso directo à superfície polimérica, ou penetra no interior do polímero
por forças capilares. A degradação hidrolítica de polímeros causa a ruptura do polímero em
unidades mais pequenas. Esta reacção pode ser catalisada em condições ácidas, básicas ou
outras condições (Kulshreshtha, 1990; Langer et al., 1990). Os principais factores que
influenciam o processo de erosão são a estabilidade química da cadeia polimérica; a
hidrofobicidade do monómero; a morfologia do polímero; a cristalinidade; o peso molecular
inicial do polímero; a presença de catalisadores, aditivos, ou plasticizadores; e a geometria do
implante (Langer e Kohn, 1996; Mayer e Kaplan, 1994). A hidrofobicidade pode evitar a
absorção de água pelo polímero, reduzindo assim as taxas de hidrólise (Mayer e Kaplan,
1994). Em polímeros hidrofóbicos, a degradação é geralmente um fenómeno superficial com
erosão lenta do polímero, em polímeros hidrofílicos a degradação ocorre normalmente
BIOMATERIAIS DEGRADÁVEIS E BIODEGRADAÇÃO |36
através do interior do material. Assim, qualquer tratamento que altere a hidrofobicidade do
polímero, tais como orientação e cristalinidade, afecta a sua taxa de degradação (Lyman,
1998).
O processo de bioerosão de um implante polimérico está associado a variações
macroscópicas; variações nas propriedades físico-mecânicas do material polimérico;
propriedades físicas tais como inchamento, deformação, ou desintegração estrutural; perda
de peso e eventual perda funcional (Langer e Kohn, 1996).
A bioerosão de um sólido não está apenas associada à clivagem química da cadeia
polimérica, a simples solubilização do polímero como resultado de variações no pH, pode
conduzir à erosão do sólido (Langer e Kohn, 1996).
Baseado na susceptibilidade da estrutura polimérica à hidrólise, é possível prever a tendência
de qualquer polímero à bioerosão. No entanto, a taxa de erosão de um polímero sólido não
pode ser baseada apenas na estrutura da cadeia polimérica. A taxa de erosão é fortemente
dependente da capacidade das moléculas de água penetrarem na matriz polimérica (Langer
e Kohn, 1996).
Para um polímero ser degradável e erodível, os grupos hidrolisáveis da cadeia principal
devem estar presentes e acessíveis (Huang e Edelman, 1995). A taxa de bioerosão é
influenciada pela morfologia do polímero. No estado cristalino, as cadeias poliméricas são
densas e regulares e oferecem elevada resistência à penetração da água na matriz
polimérica. Consequentemente, a taxa de hidrólise é superior nas regiões amorfas de um
polímero semi-cristalino que nas regiões cristalinas (Langer e Kohn, 1996). A
Figura 2.1 mostra os diferentes mecanismos que conduzem à transformação de um material
insolúvel num material solúvel (Langer e Kohn, 1996).
A taxa de hidrólise tende a aumentar com o aumento do número de grupos hidrolisáveis na
cadeia principal ou cadeia laterais, grupos polares que aumentam a hidrofilicidade, baixa
cristalinidade, baixa densidade e elevada área superficial/volume. Factores que tendem a
inibir as cinéticas hidrolíticas incluem misturas hidrofóbicas, ligações cruzadas, elevada
cristalinidade devido à orientação da cadeia, baixa carga e forma compacta (Langer e Kohn,
1996).
Uma vez que a superfície do polímero é o primeiro local de ataque na reacção de hidrólise
dos materiais poliméricos, a estrutura superficial e área superficial são os factores mais
importantes. Como as reacções ocorrem normalmente em meio aquoso, o balanço hidrofílico-
MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA |37
hidrofóbico do polímero afecta bastante a sua biodegradabilidade. Os polímeros que contêm
segmentos hidrofílicos e hidrofóbicos tem maior biodegradabilidade que os polímeros com
estruturas hidrofóbicas ou hidrofílicas apenas (Hayashi, 1994). A Figura 2.2 demonstra as
análises necessárias para descrever as diferentes fases durante o processo de degradação.
As variações podem ser monitorizadas ao longo do tempo, pelo aparecimento de novos
grupos funcionais em espectros FTIR (Karlsson e Albertsson, 1995).
Insolúvel em água
Mecanismo I:
Clivagem das ligações entre cadeias poliméricas solúveis em água
Solúvel em água
Insolúvel em água
X
X
X
X
X
Mecanismo II:
Transformação ou clivagem das cadeias laterais (X) conduzindo à formação de
grupos polares carregados (Y)
Solúvel em água
Y
Y
Y
Y
Y
Insolúvel em água
Mecanismo III:
Clivagem das ligações entre unidades políméricas repetidas
Solúvel em água
Figura 2.1 Mecanismos de degradação química. O mecanismo I envolve a clivagem entre cadeias
poliméricas solúveis em água. O mecanismo II envolve a clivagem ou transformação química das
cadeias laterais poliméricas, resultando na formação de grupos polares ou carregados. A presença de
grupos polares ou carregados conduz à solubilização da cadeia polimérica intacta. O mecanismo III
envolve a clivagem de ligações instáveis na ligação polimérica, seguida de solubilização dos
fragmentos de baixo peso molecular (Langer e Kohn, 1996).
BIOMATERIAIS DEGRADÁVEIS E BIODEGRADAÇÃO |38
FTIR
SEM
DSC
CL
Morfologia e cristalinidade
Variações nos grupos funcionais
Radicais hidroxil
SEC
Variações no peso molecular
Caracterização da degradação
Percentagem de degradação
Propriedades mecânicas
Perda de massa
DM
Produtos de degradação
GC
GC/MS
Figura 2.2 Técnicas de caracterização na degradação de polímeros (Karlsson e Albertsson, 1995).
FTIR – espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier; CL – quimiluminescência; SEM
– microscopia electrónica de varrimento; DSC – calorimetria diferencial de varrimento; SEC –
cromatografia de exclusão de tamanhos moleculares; DM – análise mecânica dinâmica, GC –
cromatografia gasosa; LC – cromatografia líquida; MS – espectroscopia de massa.
2.5.3 Degradação enzimática
As enzimas são catalisadores que actuam em reacções químicas em processos bioquímicos.
São moléculas proteicas consistindo em centenas de aminoácidos, ligados covalentemente
por ligações peptídicas na forma linear, produzidos por células para actuar em reacções
químicas específicas (Lenz, 1990; Park et al., 1993b; Park et al., 1993a; Poldermans e
Roels, 1989). A estrutura da enzima tem domínios hidrofóbicos e hidrofílicos; os domínios
hidrofílicos estão situados no exterior e domínios hidrofóbicos no interior da enzima
(Poldermans e Roels, 1989).
As enzimas apresentam especificidade de acção: actuam apenas em certos substratos e num
único tipo de reacção. Não alteram as constantes de equilíbrio das reacções que catalisam,
baixam a energia de activação das reacções e aumentam as taxas de reacção (Park et al.,
1993b; Poldermans e Roels, 1989). A formação de um complexo estereoespecífico entre a
enzima e o substrato é responsável pela elevada actividade catalítica das enzimas. Todas as
LC
MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA |39
enzimas apresentam um sítio activo composto por um local de ligação e um sítio catalítico
(Poldermans e Roels, 1989).
A utilização de implantes poliméricos biodegradáveis e sistemas de libertação controlada de
fármacos na área biomédica, conduziu a um interesse crescente dos processos de
degradação enzimática de polímeros. Hidrólises e oxidações são os principais processos na
degradação polimérica (Coury et al., 1996; Huang et al., 1994; Karlsson e Albertsson, 1995).
A biodegradação polimérica refere-se essencialmente à degradação de polímeros em
pequenos compostos metabolizáveis como resultado da actividade biológica, inclui reacções
químicas e enzimáticas. O principal factor que determina a degradação enzimática de
polímeros é a existência de enzimas naturais que catalisam a sua degradação (enzimas
despolimerase). Os polímeros naturais são inerentemente degradáveis, porque existem na
natureza as enzimas que os degradam em subunidades metabólicas mais pequenas. Muitos
polímeros sintéticos não são biodegradáveis, não existindo na natureza despolimerases, e as
suas unidades estruturais têm pouca semelhança com os compostos normalmente presentes
nos ciclos metabólicos dos sistemas vivos (Marchant, 1990; Park et al., 1993a; Timmins e
Lenz, 1994).
Nenhum polímero é totalmente inerte aos processos químicos e acção mecânica do corpo.
Geralmente, os biomateriais poliméricos degradam devido aos constituintes do corpo, que
atacam directamente os biomateriais ou outros componentes do sistema, ou pela intervenção
de factores externos (Coury et al., 1996). A capacidade das enzimas penetrarem nos
polímeros sintéticos determina a extensão da degradação e a forma de degradação, isto é,
degradação superficial ou interior. O grau de penetração enzimática nos polímeros depende
do tamanho da enzima, assim como das propriedades físicas do polímero (Park et al.,
1993b). Geralmente, as degradações enzimáticas são superfíciais, devido à incapacidade das
enzimas difundirem para o sistema polimérico. A cristalinidade, as ligações cruzadas e outras
propriedades morfológicas dos polímeros afectam a difusão dos catalisadores nos sistemas e
difusão dos produtos de degradação para o sistema polimérico (Huang et al., 1994). À
medida que as cadeias de polímero se tornam mais flexíveis, maior é a interacção com os
locais activos das enzimas (Huang, 1989; Park et al., 1993b).
A degradação enzimática de um polímero por hidrólise é um processo composto por duas
etapas, no qual a enzima se une inicialmente ao substrato e catalisa depois a clivagem
hidrolítica. Este ataque inicial do polímero pode ocorrer de dois modos, exo ou endo,
BIOMATERIAIS DEGRADÁVEIS E BIODEGRADAÇÃO |40
dependendo do local onde a ligação do polímero é clivada e dos produtos formados. O ataque
exo é estrito das cadeias terminais poliméricas, com formação de pequenos oligómeros e
monómeros como produtos. O ataque endo pode, em princípio, ocorrer em qualquer local da
cadeia polimérica, neste caso formam-se produtos de baixo peso molecular (Timmins e Lenz,
1994).
A degradação enzimática envolve um passo adicional de difusão da enzima para o local de
ligação. Os produtos de degradação resultantes, monómeros e pequenos oligómeros,
dissolvem de acordo com a sua solubilidade aquosa local. Se a degradação ocorre no interior,
os produtos de degradação devem difundir para a superfície do polímero. A combinação
destas fases conduz à erosão global do polímero, isto é, ao aparecimento de monómeros em
solução. Uma das variações mais importante da degradação enzimática de polímeros é a
variação morfológica devido às alterações das regiões cristalinas e amorfas. As regiões
amorfas são geralmente degradadas mais rapidamente que as regiões cristalinas. A
cristalinidade da amostra residual aumenta com o tempo de degradação (Huang et al.,
1994). Os polímeros sintéticos apresentam geralmente pequenas unidades repetidas, e esta
regularidade aumenta a cristalização, tornando os grupos hidrolisáveis inacessíveis às
enzimas. Durante a degradação, a cristalinidade da amostra aumenta, este facto é atribuído
ao desaparecimento da porção amorfa da amostra. O tamanho, a forma, e o número de
cristalites tem grande efeito na mobilidade da cadeia polimérica nas regiões amorfas;
controlando a taxa de degradação (Huang, 1989).
O processo de degradação do complexo enzima-polímero pode variar de acordo com a
reversibilidade de formação do complexo e com o número de cisões que a enzima causa na
molécula polimérica antes da dissociação. O ataque inicial pode ocorrer em pontos aleatórios
ao longo da cadeia polimérica, mas após a clivagem inicial a enzima pode dissociar-se da
cadeia, ou continuar ligada causando cisões sucessivas e múltiplas; o processo inicia-se com
uma degradação tipo endo, e continua por degradação tipo exo por múltiplas cisões (Lenz,
1990).
O grupo funcional no interior da unidade estrutural é também importante, as ligações éster,
amida e uretano são as mais hidrolisadas e “reconhecidas” pelas enzimas hidrolíticas
(Timmins e Lenz, 1994).
Em polímeros insolúveis, a reacção é heterogénea e confinada à superfície da amostra, uma
vez que as enzimas que catalisam a reacção são macromoléculas impedidas de penetrar na
MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA |41
massa de substrato. No entanto, os produtos da reacção de hidrólise, quando de baixo peso
molecular, são normalmente solúveis em água e podem difundir do interior (Timmins e Lenz,
1994).
2.6 Amido
2.6.1 Estrutura e composição do amido
O amido é um polissacarídeo produzido por muitas plantas como fonte de reserva de energia.
Muitos amidos comerciais são isolados de cereais tais como milho, trigo, batata e tapioca.
Estes cereais contêm elevadas quantidades de amido, normalmente 60-90% em peso seco.
Em geral, o amido é constituído por uma fracção de cerca de 20% solúvel em água,
denominada amilose, e por 80% de uma fracção insolúvel em água, designada amilopectina.
A amilose (Figura 2.3) é composta por moléculas de D-glucose linear com ligações α-1,4, e
peso molecular 105 a 106 g/mol, a amilopectina (Figura 2.4) é formada por moléculas Dglucose com ligações α-1,4 e α-1,6, peso molecular 107 a 108 g/mol, aparecendo em cada
25-30 unidades de glucose.
Figura 2.3 Estrutura de uma molécula de amilose.
AMIDO |42
Figura 2.4 Estrutura da amilopectina.
As ligações α-1,4 dão origem a cadeias lineares, enquanto as ligações α-1,6 resultam em
pontos ramificados.
Além do grão de amido (73% amilopectina, 27% amilose), podem ser produzidas outras
variantes tais como amido de milho waxy (contendo apenas amilopectina, sem amilose)
extraídos de mutantes de cereais, e amilomilho (contendo mais de 80% de amilose), extraídas
de mutantes de milho; os amidos de diferentes fontes diferem nas estruturas químicas e
morfologias (Aggarwal e Dollimore, 1996; Chen et al., 1997; Colonna et al., 1992; Friedman,
1995; Gallant et al., 1992; Gallant e Bouchet, 1986; Galliard, 1987; Galliard e Bowler, 1987;
Gebelein, 1995; Hanashiro et al., 2002; Ispas-Szabo et al., 2000; Jane, 1995; Jane et al.,
1995; Lenz, 1990; Mukerjea et al., 2002; Poutanen e Forssell, 1996; Roger et al., 1999;
Shogren, 1998; Stevens, 1990a; Timmins e Lenz, 1994; Van Soest et al., 1997; Yook e
Robyt, 2002; Yoshida et al., 2003).
Os grânulos de amido apresentam uma cristalinidade que varia entre 15% e 45%. Assim, a
cristalinidade não é o principal modo de organização dos grânulos de amido (Dumitri S et al.,
1996; Gallant et al., 1992; Gallant et al., 1997).
Na natureza o amido apresenta-se como grânulos semi-cristalinos com diâmetro 15 μm-100
μm, em três estruturas cristalinas designadas A (cereais), B (tubérculos), e C (em ervilhas e
feijões), caracterizados por hélices duplas. Esta classificação é baseada no espectro de
difracção, e agrupa os amidos de acordo com as propriedades físicas (Gallant et al., 1992;
Gallant et al., 1997; Shogren, 1998; Singh et al., 1995).
MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA |43
No grânulo de amido, a amilopectina é parcialmente cristalina enquanto a amilose encontrase nas zonas amorfas (não-cristalino) (Figura 2.5) (Dumitri S. et al., 1996). As regiões
amorfas controlam a variação do volume do grânulo, devido à capacidade de absorver e/ou
libertar água dos grânulos de amido.
A amilopectina é predominantemente responsável pela cristalinidade do grânulo (Gallant et
al., 1997).
Figura 2.5 Modelo de cristalinidade do amido mostrando os diferentes factores estruturais: a) hélice
amilopectina; b) amilose livre; c) lípido livre; d) amilose em hélice; e) hélice híbrida de
amilose/amilopectina.
Os grânulos de amido de milho, batata e trigo diferem bastante no tamanho e forma; os de
amido de batata são relativamente largos (15-100 μm de diâmetro), forma alongada e
assimétricos; os de amido de milho variam entre 10 e 25 μm em diâmetro e têm forma
poliédrica (Gallant et al., 1992; Galliard e Bowler, 1987; Jane, 1995; Poutanen e Forssell,
1996; Yook e Robyt, 2002).
A Tabela 2.4 mostra as composições típicas de amidos comerciais. Estes amidos apresentam
quantidades de amilose que variam entre 0 (milho) a 70% (grãos de cereal com elevada
amilose). Todos os amidos contêm pequenas quantidades de proteínas, lípidos e minerais
(principalmente fosfatos), no entanto, estas pequenas quantidades (0.1 a 0.8%) podem ter
efeitos significativos nas propriedades finais dos amidos.
AMIDO |44
Tabela 2.4 Estrutura e composição de amidos comerciais de diferentes fontes (Shogren, 1998).
Fonte de
amido
Milho
Grão
Amilomilho
Trigo
Batata
Tapioca
Dmédio
grânulo
(μm)
15
15
10
25
40
25
Amilose
%
Amilopectina
%
Proteína
%
Lípidos
%
Cinza
%
Fósforo
%
26-31
27
50-70
27-31
23-27
17
69-74
72
30-50
69-73
73-77
82
0.2-0.4
0.35
0.5-0.9
0.7
1.0-1.2
0.7-1.2
0-0.2
0.1
0.05-0.1
0.1
0.1-0.4
0.3-0.4
0.2
0.01
0.02
0.1-0.6
0.050.2-0.1
0.06
0.08
0.01
Os componentes menores do amido comercial podem ser agrupados em três tipos, de
acordo com a sua localização.
1. Material particulado - fragmentos de material separado do amido.
2. Componentes superficiais - material associado à superfície dos grânulos que pode ser
removido por processos de extracção, não causando destruição da estrutura interna do
grânulo.
3. Componentes internos - material dentro da matriz do grânulo, inacessível por extracção
sem destruição do grânulo.
A quantidade de lípidos internos em amidos de milho e trigo é semelhante: 0.6-0.8% e 0.81.2%,
respectivamente
em
peso
seco.
Estudos
recentes
demonstraram
uma
proporcionalidade directa entre a quantidade de amilose e lípidos em amidos de diferentes
grãos de cereal. O amido waxy com pequena quantidade de amilose tem baixo conteúdo em
lípidos, e variedades com elevados níveis de amilose tem elevada quantidade de lípidos. Os
efeitos dos lípidos no amido são: (i) reduzir a capacidade de ligação da água, inchamento e
solubilização dos amidos; (ii) formação de complexos “inertes” com amilose em pastas de
amido e filmes; (iii) formação de pastas de amido opacas e filmes, devido à presença de
complexos insolúveis amido-lípidos (Colonna et al., 1992; Galliard e Bowler, 1987; Jane,
1995).
2.6.2 Degradação enzimática do amido
O ataque enzimático ou ácido do amido é semelhante, uma vez que ambos envolvem a
hidrólise das ligações no polímero de amido. Em ambos os processos as zonas semicristalinas do grânulo são mais fácil e rapidamente hidrolisadas que as camadas cristalinas. A
MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA |45
taxa de hidrólise dos grânulos de amido depende da distribuição e tamanho das camadas
semi-cristalinas e cristalina, e interacção dos seus constituintes. A quantidade de amilose
presente no grânulo está relacionada com a resistência do amido ao ataque enzimático. Uma
vez que, os amidos com elevados níveis de amilose são mais resistentes ao ataque
enzimático que amidos com baixa amilose (Gallant et al., 1997).
Kimura e Robyt (Kim e Robyt, 1999) dividiram os amidos em três grupos, de acordo com as
suas susceptibilidades à hidrólise: o grupo I, muito susceptível (amido waxy sem amilose), o
grupo II, susceptibilidade moderada (amidos tapioca e milho), e grupo III, relativamente
resistentes (amilomilho contendo 80% amilose) (Kim e Robyt, 1999).
O amido pode ser despolimerizado por catálise ácida, mas esta despolimerização é
incompleta e são formadas elevadas quantidades de outros subprodutos. A hidrólise
enzimática do amido é uma alternativa ao processo de despolimerização ácida. As enzimas
hidrolíticas incluem α-amílases, glucoamilase, pululanase, isoamilase, e β-amílase (Colonna
et al., 1992; Nakazawa e Wang, 2003). As endoamilases hidrolisam apenas as ligações
acetal de amilose ou amilopectina, não sendo activas nos pontos ramificados da
amilopectina, as exoamilases podem actuar nas cadeias principais e ramificadas. A αamílase é uma endo-hidrolase com actividade apenas na ligação glicosídica α-1,4 da amilose
e amilopectina (Duedahl-Olesen et al., 2000; Poldermans e Roels, 1989), que pode ser
encontrada na saliva, sangue humano e pâncreas. As ligações α-1,4 para as quais a αamílase tem pouca afinidade são as que se situam próximo dos pontos de ramificação α-1,6
da amilopectina. As β-amílases são exoamilases que hidrolisam as ligações α-D(1,4) dos
terminais não redutores do amido. A amilopectina devido à sua estrutura ramificada é menos
susceptível ao ataque da amílase do que amilose, no entanto, as ligações ramificadas α-1,6
são clivadas pelas enzimas glucosidase, resultando na conversão de amido em D-glucose. A
quantidade de D-glucose obtida nos grânulos é dependente do tempo de reacção e tipo de
amido (Colonna et al., 1992; Duedahl-Olesen et al., 2000; Kim e Robyt, 1999; Poldermans e
Roels, 1989; Timmins e Lenz, 1994; Yook e Robyt, 2002).
A enzima β-amílase, em conjugação com α-amílase, produz soluções com elevada
quantidade de maltose (>55%) e pouca glucose livre (<1%); não apresentam afinidade para as
ligações α-1,6 e não hidrolisam a maltose (Poldermans e Roels, 1989). A amílase ataca
inicialmente formando pequenos buracos na superfície dos grânulos de amido. Ao longo do
AMIDO |46
tempo os buracos aumentam em número e tamanho, e os poros aumentam em direcção ao
centro do grânulo (Gallant et al., 1997). A α-amílase pode actuar maioritariamente por erosão
da superfície, ou penetração em pontos específicos da superfície (Galliard e Bowler, 1987). A
hidrólise por α-amílase em solução compreende quatro fases sucessivas: difusão da
molécula enzimática até ao substrato, adsorção das enzimas aos substratos, e acção
catalítica. Formam-se forças específicas entre a enzima e os locais de ligação do substrato,
formando o complexo enzima-substrato. O número de locais de adsorção na enzima é
dependente da porosidade e acessibilidade do substrato.
A difusão é um passo limitante na hidrólise devido à natureza macromolecular das amílases e
porosidade dos substratos. O tamanho das partículas e razão área superficial/amido
influenciam bastante o mecanismo de degradação: áreas superficiais elevadas conduzem a
elevada taxa inicial de hidrólise, logo, quanto mais fragmentado estiver o amido, maior é a
susceptibilidade do amido às amílases (Colonna et al., 1992).
Por ataque ácido ou acção enzimática, os componentes do amido são hidrolisados
progressivamente em dextrinas (mistura de polissacarídeos de baixa massa molecular),
maltose e, finalmente glucose.
2.6.3 Propriedades do amido
As propriedades de diferentes amidos comerciais são dependentes da forma dos grânulos de
amido, isto é, do alinhamento e associação das cadeias poliméricas dentro dos grânulos de
amido e presença de pequenos componentes que influenciam as propriedades físicas do
amido (Galliard e Bowler, 1987).
Os tamanhos moleculares de amilose, os comprimentos da cadeia ramificada de
amilopectina, e a proporção de amilose e amilopectina, afectam as propriedades funcionais
do amido. Amilopectina com longas cadeias ramificadas pode interagir com amilose, gerando
maior viscosidade e elevada resistência. Quando a quantidade de amilose no amido aumenta,
a viscosidade e resistência também aumentam (Jane, 1995).
A capacidade dos polissacarídeos formarem uma estrutura em gel, mesmo a baixas
concentrações, constitui uma das suas propriedades funcionais mais importantes (Shefer et
al., 1992). Os grânulos de amido são insolúveis em água à temperatura ambiente devido às
fortes ligações de hidrogénio. Quando expostos a elevada humidade, os grânulos absorvem
MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA |47
água e aumentam de volume. A abundância dos grupos hidroxilo no grânulo de amido é um
factor primário na sua tendência para absorver água (Kasapis et al., 2000).
A gelatinização é o processo de destruição granular do amido que ocorre em duas fases:
primeira fase, por volta de 60-70ºC, corresponde ao aumento de volume dos grânulos, as
ligações de hidrogénio nos grânulos começam a enfraquecer, ocorre perda de birrefringência,
as macromoléculas deixam de estar orientadas, aumenta a viscosidade e a cristalinidade
diminui. A segunda fase, acima de 90ºC, a integridade granular desaparece completamente
devido ao excessivo aumento de volume e solubilização (Bastioli, 1995; Kasapis et al., 2000;
Poutanen e Forssell, 1996; Van Der Burgt et al., 1996). A gelatinização destrói a estrutura
cristalina do amido, devido à destruição das ligações de hidrogénio (Shefer et al., 1992). A
amilose separa-se parcialmente da amilopectina após a gelatinização e forma uma fase
contínua rodeando os grânulos. À medida que as dispersões de amido arrefecem, a amilose
separa-se e cristaliza rapidamente (minutos a horas), conduzindo à formação de gel
(Shogren, 1998).
Os grânulos de amido com elevada amilose são mais resistentes à água, do que amidos com
baixa amilose. Este facto é ilustrado pela diferença na temperatura de gelatinização (à qual a
ordem molecular no grânulo de amido é destruída) para ambos os tipos. A temperatura de
gelatinização em amidos com elevada amilose é cerca de 90ºC. Em grânulos de amido com
baixa amilose, a temperatura gelatinização é cerca de 60ºC (Eagles et al., 1996).
Amido “destruturizado” é um termo utilizado para descrever a destruição das cadeias de
amido e fusão das cristalites, quando o amido é aquecido na presença de quantidades
limitadas de água (Bastioli, 1995). Os principais fenómenos que ocorrem a nível estrutural
quando o amido é destruído são: fragmentação dos grânulos de amido, quebra das ligações
de hidrogénio entre as moléculas de amido, conduzindo à perda de cristalinidade e
despolimerização parcial dos polímeros de amido (Poutanen e Forssell, 1996). A Figura 2.6
mostra um exemplo da morfologia dos grânulos de amido após aquecimento a 90ºC.
Após a destruição da estrutura granular, na presença de excesso de água, os polímeros de
amido podem reassociar-se. Este é o processo de retrogradação. Os processos de
gelatinização e retrogradação são importantes, para a funcionalidade do amido em aplicações
específicas (Friedman, 1995). A retrogradação é um processo de separação, resultando no
alinhamento das regiões lineares do polissacarídeo e redução da solubilidade (Galliard e
AMIDO TERMOPLÁSTICO |48
Bowler, 1987). A retrogradação de dispersões de amido é aumentada pelas baixas
temperaturas (0-5ºC) e elevada concentração de amido (Jane, 1995).
Figura 2.6 Fragmentação dos grânulos de amido nativo (a) e após aquecimento a 90ºC (b).
Uma vez que as cadeias de amido são relativamente rígidas com fortes ligações de
hidrogénio, Tg e Tm são elevadas, a solubilidade em água é baixa e a energia superficial é
elevada. A água e outras moléculas polares reduzem Tm e Tg. A Figura 2.6 mostra as
diferenças entre Tm dependendo da fonte de amido.
Tabela 2.5 Propriedades térmicas de dispersões amido-água (Shogren, 1998).
Fonte de amido
Milho
Grão de cereal
Grão com elevada amilose
Trigo
Tm
(ºC)
64-82
55-70
66-120
50-80
2.7 Amido termoplástico
A crescente preocupação relativamente às questões ambientais pela acumulação de plásticos
depositados no meio ambiente, suscitou um interesse crescente na aplicação de amido em
plásticos biodegradáveis. Uma vez que o amido é um biopolímero barato (quando comparado
com outros polímeros degradáveis), disponível em elevadas quantidades, totalmente
biodegradável em CO2 e água, sendo uma alternativa possível aos polímeros sintéticos
utilizados actualmente (Andreopoulos e Theophanides, 1994; Bastioli, 1995; Demirgoz et al.,
2000; Galliard, 1987; Jane, 1995; Mayer e Kaplan, 1994; Mohanty et al., 2000; Rouilly et al.,
MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA |49
2004; Simmons e Thomas, 1995). Iniciou-se nos anos 70 com o uso de amido granular
como agente de enchimento em plásticos, principalmente em polietileno, seguindo o trabalho
de Griffin et al (Gomes et al., 2002c; Griffin, 1978; Griffin, 1991). Griffin foi o primeiro a
desenvolver formulações com base em amido granular e polímeros sintéticos com elevada
biodegradação, em quantidades inferiores a 10%, mantendo a estrutura granular intacta
(Griffin, 1978; Lourdin et al., 1995; Shah et al., 1995). Alguns copolímeros de amido têm
sido propostos como materiais plásticos, ou transformados em amido termoplástico, e
processados em combinação com polímeros sintéticos específicos (Bastioli, 1995; Lawton,
1997).
O tipo de amido nativo (razão amilose/amilopectina), a quantidade de água, a pressão, a
temperatura, o tipo e quantidade de plasticizadores são parâmetros que influenciam o
processo de conversão do amido em amido termoplástico. Amido termoplástico pode ser
obtido com diferentes propriedades, alterando um destes factores (Copinet et al., 2001;
Matzinos et al., 2002b; Matzinos et al., 2002a; Van Soest et al., 1996a; Van Soest e Borger,
1997; Van Soest e Essers, 1997). A escolha da fonte de amido é um factor importante na
regulação das propriedades de amido termoplástico. Os amidos granulares diferem
principalmente na quantidade de amilose e amilopectina, assim como na distribuição da
massa molecular e grau de ramificação de ambas as moléculas (Mani e Bhattacharya,
1998b; Mani e Bhattacharya, 1998a; Van Soest et al., 1996b). As propriedades finais de
amidos termoplásticos são dependentes dos parâmetros de processamento e fases de
preparação (Ramkumar et al., 1997).
O amido puro não apresenta propriedades físico-químicas e mecânicas que permitam o seu
uso isolado (pelo menos na forma não modificada) como termoplástico em muitas
aplicações. Por esta razão, apesar de terem sido feitas várias aproximações em utilizar
comercialmente amido em aplicações de plásticos biodegradáveis, quase todos envolvem a
mistura de amidos com termoplásticos sintéticos (Boesel et al., 2004; Sagar et al., 1996).
A estrutura do grânulo de amido tem de ser destruída antes da sua utilização como potencial
polímero, dado que, a degradação do amido ocorre a uma temperatura mais baixa que o
ponto de fusão, assim, o amido nativo não pode ser processado utilizando as tecnologias
convencionais de processamento sem modificação. A temperatura de transição vítrea é
superior à temperatura de decomposição das cadeias de polímero, devido às fortes
interacções das ligações de hidrogénio das cadeias. Assim, durante o processamento de
AMIDO TERMOPLÁSTICO |50
amido termoplástico são adicionados plasticizadores, principalmente glicerol, glicóis e água
para baixar Tg do amido abaixo de temperatura de decomposição (Td), através da introdução
de energia mecânica e calor para destruir a estrutura granular, e fundir parcialmente a
natureza cristalina do grânulo de amido (Barron et al., 2000; Bastioli et al., 1990a;
Bergthaller et al., 1999; Myllarinen et al., 2002; Ramkumar et al., 1997; Simmons e Thomas,
1995; Willett et al., 1995). A quantidade de energia, e presença de outros componentes,
especialmente água, determinam a extensão de destruição da estrutura do grânulo. O grau
de decomposição da estrutura granular tem influência na natureza do produto final
(Friedman, 1995; Maddever, 1990). A água actua como bom plasticizador da fase amorfa
dos grânulos de amido durante o aquecimento (Forssell et al., 1996; Poutanen e Forssell,
1996; Sagar et al., 1996), influencia a mobilidade dos polissacarídeos e formação de
interacções entre as cadeias (Hulleman et al., 1998; Shogren, 1992). A natureza e
quantidade de plasticizadores influenciam as propriedades do amido final de duas formas:
controlando o grau de destruição e a despolimerização durante a ruptura das ligações de
hidrogénio, ou actuando como lubrificante no material processado (Poutanen e Forssell,
1996).
É possível alterar as propriedades do amido termoplástico, desde um material mole (elevada
quantidade de plasticizador) a um material quebradiço (baixa quantidade de plasticizador), de
acordo com a humidade e quantidade de glicerol (Averous et al., 2000a; Averous et al.,
2000b). No entanto, o amido quando armazenado durante longos períodos pode cristalizar, e
as propriedades mecânicas diminuírem. Plasticizadores, tais como ureia e sulfuramida,
podem evitar a recristalização do amido (Averous et al., 2000a; Bastioli et al., 1990a; Huang
et al., 2004; Lourdin et al., 1997; Myllarinen et al., 2002; Shogren et al., 1992; Teramoto et
al., 2003; Van Soest et al., 1996c; Van Soest et al., 1996b; Van Soest e Borger, 1997; Van
Soest e Knooren, 1997).
As três transformações principais que ocorrem durante o processamento são: aumento da
razão área superficial/fase sólida de amido, modificação da cristalinidade, destruição dos
grânulos e despolimerização das macromoléculas de amido (Bergthaller et al., 1999; Colonna
et al., 1992). A modificação da razão área superficial/volume na fase sólida ocorre durante
os processos de fragmentação do grão, a superfície dos grânulos de amido, aparentemente
lisa à escala microscópica, torna-se rugosa e quebradiça após a destruição. Alguns grânulos
podem quebrar ou fragmentar (Colonna et al., 1992). Os grupos hidroxilo dos resíduos de
MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA |51
glucose de amido são modificados quimicamente, de forma a alterar as propriedades do
amido. A fragmentação do amido conduz a variações no peso molecular, distribuição do peso
molecular, mas também na estrutura das moléculas (amilose e amilopectina) (Mohanty et al.,
2000; Sagar e Merrill, 1995).
Actualmente o amido é processado utilizando equipamento convencional por extrusão,
moldação por compressão, e moldação por injecção entre 120-220 ºC (Averous et al.,
2000a; Averous et al., 2000b; Copinet et al., 2001; Demirgoz et al., 2000; George et al.,
1994; Maddever e Chapman, 1989; Matzinos et al., 2001; Matzinos et al., 2002b; Matzinos
et al., 2002a; Shah et al., 1995; Simmons e Thomas, 1995; Van Soest et al., 1996b; Van
Soest et al., 1996a; Van Soest e Knooren, 1997; Vikman et al., 1999; Wiedmann e Strobel,
1991; Willett et al., 1995; Willett e Doane, 2002). As propriedades mecânicas podem ser
melhoradas pelo uso de técnicas não convencionais tais como SCORIM (shear controlled
orientation in injection moulding), induzindo orientação da estrutura molecular (Mano et al.,
2000; Reis et al., 1996b; Reis et al., 1997a; Sousa et al., 2000). O uso de SCORIM é uma
forma de induzir anisotropia morfológica e produzir materiais rígidos, mas não quebradiços,
com potencial em aplicações de baixa carga (Reis et al., 1997b).
O amido termoplástico é amido granular destruído formado pela mistura dos seus
constituintes poliméricos (amilose e amilopectina) e várias proteínas, lípidos, e pequenas
moléculas (tais como água) que fazem parte do grânulo de amido (Shogren, 1996; Simmons
e Thomas, 1998).
A utilização comercial de amido termoplástico requer a mistura com outros polímeros
degradáveis para melhoria das suas propriedades mecânicas, físicas e diminuição da
sensibilidade à água, devido à natureza higroscópica do amido. Amido gelatinizado,
modificado, ou plasticizado tem sido misturado com polímeros sintéticos tais como
poli(cloreto de vinilo), poli(etileno-co-acrílico), polietileno, PVA, etileno-álcool vinílico e PCL ou
polímeros naturais tais como poli(hidroxialcanoatos) (Liu et al., 1999; Okaya et al., 1992;
Sagar et al., 1996). Um exemplo de um produto industrial é Mater-Bi. Este produto é obtido
misturando amido termoplástico com copolímero parcialmente hidrofílico de etileno-ácido
acrílico (Bastioli et al., 1993; Bastioli, 1998; Fringant et al., 1996; Lawton e Fanta, 1994;
Stenhouse et al., 1992).
Otey (Otey, 1979) utilizou amido gelatinizado incorporado no copolímero de etileno-ácido
acrílico (EAA) e amónia no desenvolvimento de misturas biodegradáveis de amido/polímero
AMIDO TERMOPLÁSTICO |52
sintético. Bastioli (Bastioli, 1995) demonstrou o aumento da biodegradação de PCL na
presença de amido, aumentando a área superficial (Bastioli, 1995; Franco et al., 2004;
Preechawong et al., 2004; Singh et al., 2003).
O mais comum (e um dos mais simples) envolve a mistura de amido nativo não modificado
com polietileno, onde o amido actua como enchimento granular e serve para aumentar a
degradação do polímero sintético. A selecção de um compatibilizador, para melhorar a
adesão interfacial da mistura amido/polímero sintético, é muitas vezes utilizado. A
biofragmentação destes produtos é reduzida devido à inacessibilidade das enzimas aos
grânulos de amido (Fringant et al., 1996; Matzinos et al., 2001; Matzinos et al., 2002b).
As propriedades mecânicas de materiais termoplásticos à base de amido diminuem quando
os níveis de amido aumentam, assim como a diminuição da resistência e tenacidade
comparativamente aos termoplásticos simples. Apesar das fracas propriedades mecânicas,
estes materiais têm sido recomendados devido à sua biodegradabilidade, em várias
aplicações comerciais (Lourdin et al., 1995).
Dependendo do componente sintético da mistura, dos métodos de processamento, aditivos e
materiais de reforço usados, é possível obter distintas combinações estruturas/propriedades,
com diferentes aplicações potenciais (Elvira et al., 2002; Gomes et al., 2001b; Reis et al.,
1997b).
2.7.1 Amido termoplástico como biomaterial em aplicações biomédicas
Para além da sua versatilidade de processamento, o amido termoplástico é degradável
(Bastioli et al., 1993; Reis et al., 1997e; Reis et al., 1996a; Reis e Cunha, 1995b), sendo a
maltose, a glucose e cadeias de amido de baixo peso molecular os seus principais produtos
de degradação. Estes produtos são totalmente biocompativeis, quer in vitro (Gomes et al.,
2001a; Marques et al., 2001; Marques et al., 2002; Marques et al., 2003) e in vivo (Mendes
et al., 2001), tal como definido pelos padrões internacionais (Alves et al., 2003; Espigares et
al., 2002; Leonor et al., 2002; Mano et al., 2002; Mano et al., 2004; Oliveira et al., 2002a).
O amido tem sido misturado com polímeros sintéticos, em quantidades superiores a 50%,
para melhorar as suas propriedades mecânicas e resistência à água (Bastioli et al., 1990a;
George et al., 1994; Mano et al., 2003; Matzinos et al., 2002b; Park e Seung, 2000;
Preechawong et al., 2004; Reis et al., 1996b; Reis et al., 1997e; Reis et al., 1997b; Rouilly et
al., 2004; Teramoto et al., 2003; Tuovinen et al., 2004; Van Soest et al., 1996c)
MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA |53
Os polímeros à base de amido têm sido propostos como biomateriais alternativos em várias
aplicações ortopédicas, como por exemplo (Gomes et al., 2002c; Gomes et al., 2001b;
Gomes et al., 2003; Mano et al., 2000; Mano et al., 2004; Mano et al., 2003; Oliveira et al.,
2003a; Oliveira et al., 2002b; Reis et al., 1997e; Reis et al., 1997a; Reis et al., 1996b; Reis
et al., 1996a; Reis et al., 1997b; Reis e Cunha, 1995b; Salgado et al., 2002; Vaz et al.,
2002), em placas ósseas (Espigares et al., 2002; Reis e Cunha, 1995b) e parafusos,
transportadores de libertação controlada de fármacos/agentes bioactivos, hidrogeis (Elvira et
al., 2002; Laakso et al., 1987; Malafaya et al., 2001b; Pereira et al., 1998b) e estruturas de
suporte tridimensionais em engenharia de tecidos ósseo e cartilagem (Demirgoz et al., 2000;
Gomes et al., 2001b; Mano et al., 2000; Mendes et al., 2003; Reis et al., 1997e; Salgado et
al., 2002).
O objectivo é desenvolver sistemas capazes de manter a sua integridade e propriedades
mecânicas na presença de meio aquoso nos primeiros estágios de implantação, e degradar
subsequentemente (Demirgoz et al., 2000).
Os biomateriais biodegradáveis à base de amido têm um comportamento mecânico
compatível com o osso humano, com uma cinética de degradação adequada à regeneração
dos tecidos substituídos ou fixados. O desenvolvimento de novas técnicas de processamento
e o reforço com vários tipos de enchimento, permite o desenvolvimento de materiais com
propriedades mecânicas semelhantes ao osso (Mano et al., 1999; Marques et al., 2002; Reis
et al., 1997a; Reis e Cunha, 2000). A título de exemplo a Tabela 2.6 mostra as principais
propriedades do osso a diferentes modos de aplicação de carga.
AMIDO TERMOPLÁSTICO |54
Tabela 2.6 Propriedades mecânicas do osso cortical humano em diferentes condições de carga (Reis,
1999).
Propriedade mecânica
Valores
Modo de carga
Módulo elástico (GPa)
7 - 25
Tracção
Módulo (GPa)
6 - 12
Corte
Tensão máxima (MPa)
50 - 160
Tracção
Deformação final (%)
0.5 - 3
Tracção
Módulo (GPa)
15-18
Compressão
Tensão máxima (MPa)
130 - 280
Compressão
Módulo
16 - 19
Vibração (bending)
Tensão máxima (MPa)
195 - 235
Vibração (bending)
Os polímeros à base de amido têm sido também propostos como estruturas de suporte
temporárias para ligação de células transplantadas, crescimento e manutenção de funções
diferenciadas em várias aplicações de engenharia de tecidos. Foi possível desenvolver
arquitecturas porosas baseadas nestas misturas biodegradáveis à base de amido, utilizando
tecnologias de processamento inovadoras e produzindo subsequentemente revestimentos
biomiméticos para adesão, proliferação celular e crescimento de tecido (Costa e Reis, 2004;
Gomes et al., 2002b; Oliveira et al., 2002b).
Os polímeros com grupos funcionais capazes de interactuar com o grupo hidroxilo no amido
(ou grupos carboxilo em amidos modificados) são preferenciais. Estes grupos reactivos
incluem ácido carboxílico e anidrido (Ramkumar et al., 1996).
Para reduzir a sensibilidade à água, o amido tem sido misturado com PCL, polietileno, PLA,
copolímero de PHB/PHV, poli(ésteramida), acetato de celulose (CA) e etileno-álcool vinílico
(Averous et al., 2000b; Averous et al., 2001; Chandra e Rustgi, 1997; Elvira et al., 2003;
Koenig e Huang, 1995; Mano et al., 2000; Mano et al., 2004; Matzinos et al., 2001;
Matzinos et al., 2002b; Park e Seung, 2000; Ramaswamy e Bhattacharya, 1998; Reis et al.,
1996b; Reis et al., 1997e; Reis et al., 1997a; Reis e Cunha, 1995b; Simmons e Thomas,
1998; Sousa et al., 2000; Vikman et al., 1999; Zhiqiang et al., 1996). A estrutura a nível
MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA |55
molecular destas misturas é complexa, envolvendo interpenetração ou reacção química
durante a mistura dos componentes (Mano et al., 2003).
Reis et al (Gomes et al., 2002b; Gomes et al., 2002a; Reis e Cunha, 1995b; Sousa et al.,
2000) propuseram misturas de amido com copolímeros de etileno álcool vinílico (SEVA-C),
acetato de celulose (SCA), policaprolactona (SPCL) e poli(ácido láctico) (SPLA) como
potenciais materiais biodegradáveis alternativos em diversas aplicações biomédicas (Baran et
al., 2004; Gomes et al., 2002c; Mano et al., 2004; Mano e Reis, 2004; Pereira et al., 1998a;
Reis, 1999; Silva et al., 2004). Além de serem biodegradáveis, baratos e disponíveis em
elevadas quantidades, os polímeros à base de amido podem ser convertidos em geometrias
complexas com propriedades mecânicas adequadas às funções a desempenhar (Mano et al.,
2002; Oliveira et al., 2002b; Reis et al., 1997e).
A incorporação de enchimentos inorgânicos semelhantes ao osso, tais como HA e vidros
bioactivos, permitiu o desenvolvimento de compósitos degradáveis bioactivos à base de
amido com boas propriedades mecânicas (Espigares et al., 2002; Mano et al., 2000; Oliveira
et al., 2002a; Reis et al., 1996b; Reis et al., 1997a; Reis et al., 1997b; Sousa et al., 2003;
Vaz et al., 2002). Apesar dos resultados obtidos serem positivos, estes compósitos exibem
fraca interface polímero/enchimento (Reis et al., 1997a). Para melhorar esta situação, é
necessário tornar as superfícies de enchimento e polímero compatíveis, o que pode ser
assegurado por vários agentes de ligação, revestimentos superficiais, ou aditivos semelhantes
(Vaz et al., 2002). A presença de compatibilizadores entre o amido e polímeros sintéticos,
pode melhorar as propriedades de compósitos de amido (Bastioli, 1998). O amido baixa o
custo dos produtos finais, conferindo características biodegradáveis ao polímero
termoplástico (Koenig e Huang, 1995; Park e Seung, 2000).
No entanto, os materiais termoplásticos à base de amido encontram-se numa fase inicial de
desenvolvimento e o mercado destes produtos deverá aumentar futuramente, melhorando as
propriedades e diminuindo o preço (Mano et al., 2004; Mohanty et al., 2000).
2.7.2 Misturas termoplásticas de SEVA-C
As misturas termoplásticas à base de amido (SEVA-C) exibem comportamento termoplástico,
podendo ser produzidos por técnicas de processamento convencional, tais como moldação
por injecção, moldação por sopro e termoformação. É também possível formar espumas, por
um processo de expansão baseado na tecnologia de moldação por injecção (Bastioli, 1995;
AMIDO TERMOPLÁSTICO |56
Reis et al., 1996b; Reis et al., 1997e). O uso de técnicas de processamento não convencional
em compósitos SEVA-C e SEVA-C/HA foi estudado por Reis et al., demonstrando um
melhoramento das propriedades mecânicas pela utilização de SCORIM (Reis et al., 1997a;
Reis et al., 1997b; Sousa et al., 2000). A combinação de extrusão com parafuso duplo (twin-
screw extrusion-TSE) e SCORIM no processo de moldação, permite o desenvolvimento de
compósitos à base de amido, com orientação estrutural induzida e elevadas propriedades
mecânicas. O aumento do comportamento mecânico na aplicação SCORIM é atribuído à
orientação da estrutura molecular, cristalinidade e consequentemente rigidez e resistência de
SEVA-C (Mano et al., 2004).
EVOH é um copolímero de etileno e álcool vinílico, menos hidrofílico que PVA. As suas
propriedades dependem da razão de composição de etileno/vinilálcool (Stenhouse et al.,
1997). Poli(álcool de vinilo) e EVOH, são boas alternativas como polímeros sintéticos nas
misturas à base de amido, devido aos grupos hidroxilo promoverem compatibilidade entre o
amido e os grupos etileno, aumentando a hidrofobicidade ou diminuindo o carácter
higroscópico do amido (Dell e Kohlman, 1994; Villar et al., 1995). EVOH é biodegradável
porque é composto por cadeias de PVA biodegradável, e polietileno biodegradável de baixos
pesos moleculares. Devido ao preço baixo e biodegradabilidade do amido, pretende-se
maximizar a quantidade de amido nas misturas de amido/EVOH a nível aceitável (Stenhouse
et al., 1997). A adição de EVOH melhora a processabilidade, aumenta a resistência, mas
diminui a taxa global de biodegradação do sistema (EVOH biodegrada a uma taxa mais lenta
que o amido) (Mayer e Kaplan, 1994; Simmons e Thomas, 1995). O número de variáveis
envolvidas durante a mistura de amido/EVOH torna este processo complexo, conduzindo a
várias morfologias e propriedades associadas (Simmons e Thomas, 1995).
Os dois maiores produtores de polímeros biodegradáveis à base de amido são a Novamont,
Itália, e Warner-Lamber, USA (Novon). Os materiais produzidos são utilizados em diversas
aplicações ambientais, mas não têm sido testados para aplicação médica. Os produtos
produzidos por Novamont com marca comercial, Mater-Bi, incluem quatro classes de
materiais biodegradáveis, baseados em amido e diferentes componentes sintéticos: A, Z, V e
Y. A classe A é definida como biodegradável e não compostável, e também endurecem a
baixa humidade e/ou baixa temperatura. Contêm copolímeros de etileno-álcool vinílico
superior a 45% em peso como principal componente sintético (Bastioli et al., 1993; Bastioli,
1995; Bastioli, 1998; Fang e Hanna, 2001; Maddever, 1990; Mohanty et al., 2000; Reis et
MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA |57
al., 1996b; Reis et al., 1997e; Yoshida e Uemura, 1994). A classe de materiais Z é definida
como biodegradáveis e compostáveis. Contêm policaprolactona em concentrações superiores
a 50% como principal componente sintético e amido termoplástico. A sua sensibilidade à
humidade é grande quando comparada com a classe A. A classe de materiais V é definida
como biodegradáveis, compostáveis e solúveis. São utilizados principalmente como espumas
e para enchimento. Estes materiais são misturas de SCA caracterizados por um conteúdo em
amido superior a 85% (Bastioli et al., 1993; Bastioli, 1995; Bastioli, 1998; Fang e Hanna,
2001; Maddever, 1990; Mohanty et al., 2000; Yoshida e Uemura, 1994). A classe Y é
definida como biodegradável e compostável, contendo apenas materiais de origem natural,
tais como amido termoplástico na forma dispersa e derivados de celulose. As suas
propriedades mecânicas e de moldação são semelhantes ao poliestireno (Bastioli, 1998).
Os sistemas de copolímeros de amido/álcool vinílico, podem apresentar várias morfologias e
propriedades, dependendo das condições de processamento, tipo de amido e composição do
copolímero, como resultado do complexo formado entre a amilose e as moléculas sintéticas.
Podem ocorrer diferentes microestruturas, desde a estrutura em “gota” até à estrutura em
camada, em função da diferente hidrofilicidade do polímero sintético.
Os materiais com razão amilose/amilopectina superior a 20/80 (p/p) não se dissolvem
mesmo em água a ferver. Nestas condições, é produzida uma microdispersão consistindo em
agregados de microesferas, onde o diâmetro das partículas individuais é inferior a 1 μm (a)
(Bastioli et al., 1993; Bastioli, 1995; Bastioli, 1998; Bastioli et al., 1994a).
A morfologia dos materiais na forma de filmes, contendo amido com uma razão
amilose/amilopectina inferior a 20/80 (p/p), perde gradualmente a forma em gota, gerando
estruturas em camada. Neste caso, não se formam microesferas ao ferver e o amido torna-se
parcialmente solúvel (Figura 2.7b) (Bastioli et al., 1993; Bastioli, 1995; Bastioli et al., 1994a).
AMIDO TERMOPLÁSTICO |58
(A)
(B)
Figura 2.7 Estrutura em gota (a) e camada (b) de misturas de amido de milho termoplástico/EVOH
num filme, após destruição em água a ferver (Bastioli, 1995).
Estas evidências resultaram na construção de um modelo que considera moléculas
individuais de amilopectina interligadas em vários pontos, como resultado das ligações de
hidrogénio e ligações cruzadas por cadeias de copolímeros de amilose/álcool vinílico Esta
estrutura tem sido definida na literatura como “interpenetrada” e torna o amido
completamente insolúvel. Variando a composição do copolímero sintético é possível alterar o
balanço entre as interacções hidrofóbicas e hidrofílicas e consequentemente a microestrutura
(Bastioli et al., 1993; Bastioli, 1995; Bastioli, 1998; Bastioli et al., 1994a).
As misturas de amido de milho (constituído por amilose e amilopectina) com EVOH são
alternativas potenciais aos polímeros actualmente utilizados em aplicações clínicas (Bastioli,
1998; Reis et al., 1996b; Reis et al., 1997e; Reis e Cunha, 1995b). Nestas aplicações,
pretende-se o seguinte comportamento para um material biodegradável: i) uma vez
implantado, deve manter as suas propriedades mecânicas por um período específico de
tempo, e ii) transferir depois gradualmente as funções estruturais para o tecido recuperado,
até não ser mais necessário (a situação ideal corresponde à completa absorção do material
degradado) (Vaz et al., 2001).
Várias publicações confirmam que a mistura termoplástica de SEVA-C, tem comportamento
degradável em solução fisiológica simulada, propriedades biocompatíveis e mecânicas
adequadas em várias aplicações temporárias biomédicas, especialmente em aplicações
ósseas (substituição, regeneração e preenchimento de defeitos ósseos) (Leonor et al., 2003;
Leonor et al., 2002; Mano et al., 1999; Oliveira et al., 2003a; Reis et al., 1996b; Reis et al.,
1997e; Reis et al., 1997a; Reis et al., 1997b; Reis e Cunha, 1995b).
MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA |59
Os compósitos de misturas à base de amido (amido-EVOH) reforçados com hidroxiapatite têm
sido propostos para uso em implantes biomédicos temporários (Mano et al., 1999; Vaz et al.,
2001). A incorporação de revestimentos bioactivos, tais como HA (principal constituinte
inorgânico do osso humano) ou vidros bioactivos em SEVA-C, tem como objectivo assegurar
comportamento bioactivo do implante e fornecer a rigidez necessária, dentro do intervalo
típico das propriedades de osso cortical humano (Reis et al., 1996b; Reis et al., 1997a; Reis
et al., 1997c; Reis e Cunha, 1995b). Em SEVA-C, o aumento da quantidade de HA conduz a
um aumento da rigidez. Os testes de bioactividade mostraram que o reforço com
revestimentos bioactivos tais como biovidro ou partículas HA é eficiente para assegurar o
comportamento bioactivo pretendido no compósito (Leonor et al., 2003; Leonor et al., 2002;
Mano et al., 2004; Oliveira et al., 2003c; Rodriguez-Lorenzo et al., 2002).
A presença de grupos hidroxilo na superfície de SEVA-C facilita a ligação com a camada de
apatite, por tratamento biomimético (Oliveira et al., 1999; Oliveira et al., 2003b). A introdução
de agentes de ligação (tais como titanoatos, zirconatos e silanos) nestes materiais, contribui
para a produção de compósitos com maior resistência, devido à capacidade de
melhoramento das interacções entre o enchimento cerâmico (HA) e a matriz polimérica
(SEVA-C), produzindo estruturas semelhantes à morfologia óssea (Mano et al., 1999).
Como exemplo típico, a mistura polimérica de SEVA-C, 50/50 wt%, foi reforçado com 10 a
40% (em peso) de biovidro (45S5®). Os compósitos SEVA-C+10% 45S5® mostraram maior
dureza e resistência que os compósitos de SEVA-C com HA. No entanto, em compósitos
SEVA-C+40% 45S5® não foi possível produzir materiais com melhor resistência que reforços
HA. A bioactividade de compósitos SEVA-C torna-se relevante com quantidades de apenas
10% wt 45S5®, após imersão durante 14 dias em SBF foi possível observar a formação de
uma camada de apatite (Oliveira et al., 2003a).
Os compósitos SEVA-C e SEVA-C/HA exibem comportamento não citotóxico, induzindo uma
resposta satisfatória do tecido quando implantado, demonstrado pelos estudos in vivo (Mano
et al., 2002; Mano et al., 2004; Mendes et al., 2001).
2.7.3 Degradação e biocompatibilidade de SEVA-C
O conhecimento dos processos de degradação de biomateriais poliméricos biodegradáveis e
do efeito dos seus produtos de degradação no corpo, é fundamental para o sucesso de
biomateriais a longo prazo (Gomes et al., 2001a).
AMIDO TERMOPLÁSTICO |60
Os polímeros biodegradáveis são degradados em compostos compatíveis no corpo, e podem
ser eliminados. A sua degradação pode ser química ou enzimática. A velocidade de
degradação é determinada principalmente pela natureza dos grupos funcionais nas ligações
do polímero (Tuovinen et al., 2002).
A biodegradação de amido milho com aditivos naturais e EVOH apresenta um mecanismo de
biodegradação diferente para os dois componentes: i) o componente natural, mesmo quando
interpenetrado na estrutura, é inicialmente hidrolisado por enzimas extracelulares (Bastioli et
al., 1993; Bastioli, 1995); ii) o componente sintético é biodegradado através da absorção
superficial, provocando um aumento da área superficial durante a hidrólise do componente
natural (Bastioli et al., 1993; Bastioli, 1995).
A presença de amido aumenta a biodegradação destes polímeros sintéticos; o tamanho e
distribuição das cadeias de etileno são também importantes. A taxa de biodegradação do
amido nestes materiais é inversamente proporcional à quantidade de amilose/álcool vinílico
(Bastioli, 1995; Bastioli, 1998). O processo de degradação in-vitro de compósitos de amidoEVOH+HA consiste, aparentemente, em três estágios principais: i) para pequenos períodos
(0-6 dias) é caracterizado por uma elevada taxa de degradação devido à libertação de
plasticizadores, cadeias poliméricas de baixo peso molecular e alguma dissolução de HA; ii)
para períodos maiores (7-15 dias), ocorre maior extracção de plasticizadores e o material
torna-se mais quebradiço e; iii) a partir de 15 dias, ocorre degradação enzimática e
eventualmente ataque químico da estrutura polimérica, principalmente na presença de
enzimas/proteínas. Estes polímeros são também degradados enzimaticamente na presença
de α-amílase. A degradação depende do peso molecular da mistura, sendo mais pronunciada
em materiais de baixo peso molecular. Os produtos finais típicos de degradação são amidos
de baixo peso molecular, glucose e maltose. Estes produtos são claramente biocompatíveis e
não induzem resposta inflamatória (Gomes et al., 2001a; Mano et al., 2004; Vaz et al.,
2001).
A composição química, as condições de processamento, e a estrutura das misturas
poliméricas à base de amido influenciam a taxa de hidrólise enzimática, limitando a
acessibilidade das enzimas ao substrato de amido, influenciando assim os seus perfis de
degradação (Azevedo et al., 2003a).
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CAPITULO 3
MATERIAIS E MÉTODOS GERAIS
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
3. MATERIAIS E MÉTODOS GERAIS
SUMÁRIO
Neste capítulo são descritos os materiais e as metodologias utilizadas na execução laboratorial deste
trabalho, comuns a todos os ensaios.
Algumas técnicas utilizadas pontualmente encontram-se descritas nos capítulos posteriores, pois
foram aplicadas na realização de trabalhos específicos.
É também apresentada uma tabela resumo dos ensaios de degradação in-vitro, assim como um
esquema das técnicas utilizadas nos ensaios de degradação.
São também descritos os princípios básicos que sustentam cada uma das técnicas.
3.1
MATERIAIS
83
3.2
MEIOS
84
3.2
ESTUDOS DE DEGRADAÇÃO IN-VITRO
85
3.4
MÉTODOS DE ANÁLISE MORFOLÓGICA E ESTRUTURAL
87
3.4
MÉTODOS ANALÍTICOS
98
3.6
BIBLIOGRAFIA
113
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
MATERIAIS E MÉTODOS GERAIS |83
3.1 Materiais
O material estudado consistiu numa mistura termoplástica de amido de milho com etilenoálcool vinílico, SEVA-C (60/40 mol/mol), com índice de fluidez de 0,71 g/600 s, marca
registada Mater-Bi 1128 RR, Novamont, Itália. A quantidade típica de amido nesta mistura
termoplástica é 50-60% (p/p), com composição de 70% de amilopectina e 30% de amilose
(p/p).
As dimensões dos provetes foram escolhidas de forma a apresentarem uma área específica
de exposição à solução de aproximadamente 0,2 cm-1 (área/volume), para um volume final
de 50 cm3. Foram utilizados provetes de duas dimensões: secção quadrada 2 x 30 mm,
massa 1.6 g (ver Figura 3.1) e cilindros de 10 mm de diâmetro e 1 mm de espessura.
Figura 3.1 Provetes (secção quadrada) utilizados durante os ensaios de degradação.
Os provetes quadrados foram utilizados durante os ensaios de degradação e os cilindros para
análise em microscopia electrónica. Os provetes foram moldados numa máquina injectora
Klockner Ferromatic FM-20.
A esterilização do material foi efectuada por óxido de etileno em equipamento industrial
(Pronefro, Portugal) e consistiu no seguinte programa:
Exposição ao óxido de etileno = 15-18 h (10% EtO e 90% CO2)
Temperatura = 45ºC
Pressão = 180 kPa
Humidade relativa = 50%
Duração do ciclo = 20-22 h
MEIOS |84
Nos ensaios enzimáticos além dos provetes foram utilizados filmes de diferentes espessuras
(0.15 e 0.5 mm), aumentando assim a área exposta, e mantendo a mesma massa total (1,6
g), em cada um dos ensaios (ver Figura 3.2):
Provete = 10 cm2
2 Filmes = 95 cm2
4 Filmes = 190 cm2
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 3.2 Filmes de 0.5 mm (2 filmes) (a e b), 0.15 mm de espessura (4 filmes) (c) e filmes e
provetes de 2 mm de espessura (d) utilizados nos ensaios de degradação com actividade enzimática
(50 uni/l).
3.2 Meios
Foram seleccionados dois meios para os ensaios:
Ensaios sem actividade enzimática: NaCl = 9 g/l
Ensaios enzimáticos: Solução HBSS (Hank´s balanced salt solution, Sigma reference
H8264), solução fisiológica que simula a concentração salina do soro humano, tendo a
seguinte composição em sais:
MATERIAIS E MÉTODOS GERAIS |85
Tabela 3.1 Composição da solução HBSS (Gibco 041-04025M Life Technologies).
Composto
Concentração
(g/dm3)
NaCl
8.0
CaCl2
0.14
KCl
0.4
NaHCO3
0.35
MgCl2.6H2O
0.1
Na2HPO4.2H2O
0.06
KH2PO4
0.06
MgSO4.7H2O
0.06
Glucose
1.0
3.3 Estudos de degradação in-vitro
Com os ensaios de degradação pretendeu-se estudar o comportamento de biodegradação do
material num meio que simula os mecanismos desencadeados no organismo, que ocorrem
quando estes materiais são colocados em contacto com os fluidos do corpo humano.
Durante os ensaios de degradação os provetes foram imersos a 37±1ºC, pH = 7.4 em
recipientes individuais de 50 cm3, e com agitação (150 rpm) por períodos pré-definidos.
A amostragem foi efectuada de acordo com um programa de degradação pré-definido.
Nos ensaios com actividade enzimática foi adicionada α-amílase (human saliva, Sigma
referência A0521) numa concentração semelhante à encontrada no plasma sanguíneo, 50
unid/l. A solução enzimática tem uma actividade de 0,35 mg/U/min a pH 6.9 e 20ºC por
grama de amido solúvel, dada pelo fornecedor (1 unidade liberta 1 mg de maltose a partir de
amido em 3 minutos na presença de iões cálcio). Para estabilizar a enzima foi usada uma
solução de cloreto de cálcio 1 mM.
Foram também efectuados testes com diferentes concentrações enzimáticas (50, 100 e 150
unid/l), adicionadas a provetes (1,6 g) juntamente com a solução HBSS, de forma a analisar
a limitação estrutural do material, assim como o efeito da porosidade.
ESTUDOS DE DEGRADAÇÃO IN-VITRO |86
Além dos ensaios com actividade enzimática foram realizados ensaios para a quantificação
dos coeficientes de difusão, onde foram utilizados 1, 10, 15 e 20 provetes em solução HBSS,
variando a espessura exposta à solução (Capítulo 5).
Todos os ensaios foram realizados em duplicado e as respectivas manipulações foram
realizadas numa câmara de fluxo laminar.
A Tabela 3.2 resume os ensaios realizados ao longo deste trabalho.
Tabela 3.2 Resumo dos ensaios de degradação in-vitro.
Dimensões SEVA-C
Meio de degradação
(área superficial)
Provetes 10 cm2
NaCl = 9 g/l
Tempos
de
degradação (dias)
20
120
Provetes 10 cm2
HBSS+enzima
150
(50, 100 e 150 unid/l)
HBSS+enzima
10
(50 unid/l)
200
1, 10, 15 e 20 provetes 10 cm2
HBSS
30
SEVA-C e amido 10 cm2
HBSS+enzima
90
2 Filmes 95 cm2
(50 unid/l)
Provetes 10 cm2
4 Filmes 190 cm2
Provetes SEVA-C 10 cm2
HBSS+enzima
2 Filmes 95 cm2
(100 unid/l)
76
4 Filmes 190 cm2
O esquema seguinte descreve as principais técnicas utilizadas durante a realização de todos
os ensaios, que se encontram descritas seguidamente (Figura 3.2).
MATERIAIS E MÉTODOS GERAIS |87
Provetes ou Filmes SEVA-C
(60/40 mol/mol)
Imerso em HBSS com ou sem α-amilase
(50 unit/l) a pH 7.4 e 37ºC
HPLC e HPAEC-PAD
TGA
AFM
Amido,
polissacarídeos e
glucose
Morfologia superficial
e rugosidade
FTIR
DSC
SEM
Ângulos de
contacto
Figura 3.2 Esquema representativo das principais técnicas utilizadas durante os ensaios de
degradação. HPLC-cromatografia líquida, HPAEC-cromatografia de troca aniónica, FTIR-espectroscopia
de infravermelho com transformada de Fourier, TGA - análise termogravimétrica, DSC-calorimetria
diferencial de varrimento, AFM- microscopia de força atómica, SEM-microscopia electrónica de
varrimento.
3.4 Métodos de análise morfológica e estrutural
3.4.1 Microscopia electrónica de varrimento
A microscopia electrónica de varrimento (“scannig electron microscopy”-SEM) é uma das
técnicas de caracterização e análise microestrutural mais usadas na investigação de
materiais. Permite, além da caracterização microestrutural da matriz, a observação da
morfologia da estrutura e, através da análise de imagem, a determinação do tamanho, forma
dos poros e a sua distribuição.
MÉTODOS DE ANÁLISE MORFOLÓGICA E ESTRUTURAL |88
O princípio básico de um microscópio de varrimento consiste no seguinte: um feixe de
electrões varre a superfície da amostra seguindo uma sequência de linhas muito próximas. A
onda incidente interage com a superfície da amostra de tal modo que a onda pode ser
absorvida, reflectida, dispersa e polarizada. A amostra pode emitir um feixe similar ou
diferente do feixe incidente. Um sinal proporcional a um dos fenómenos físicos é recolhido e
amplificado.
O SEM tem a capacidade de fornecer uma imagem com ampliações desde 10 x até 100000
x, com um poder de resolução desde 3 até 100 nm, dependendo da amostra a analisar.
Condições experimentais
O efeito da solução na morfologia da superfície de provetes e filmes SEVA-C, em função do
tempo de imersão, foi seguido por microscopia electrónica de varrimento (SEM) num
microscópio Leica Cambridge S360.
Na caracterização morfológica foi utilizado um molde de amostra preparada apenas para
SEM (cilindros 10 mm de diâmetro e 1 mm de espessura).
Antes da análise, os provetes foram secos a 50ºC durante 1 semana e condicionados a
temperatura e humidade controlada. Como controlo foi utilizado um provete não imerso.
A análise permitiu avaliar a morfologia, tamanhos e distribuição dos poros, tendo sido
realizadas algumas medições de tamanhos de poros.
Foi também efectuada a análise microestrutural de provetes, filmes de SEVA-C e amido sem
qualquer tratamento e após degradação enzimática, fervidos em 150 ml de água destilada
com agitação durante 5 horas, de forma a simular condições extremas de degradação. A
solução de degradação de cada uma das amostras foi liofilizada antes da análise em SEM.
3.4.2 Microscopia de força atómica
A técnica de microscopia de força atómica (atomic force microscopy “-AFM) apresenta três
vantagens comparativamente a outras técnicas de imagem convencional: i) tem elevada
resolução (tipicamente 2-3 nm) a três dimensões; ii) analisa a topografia das amostras sem
tratamento superficial ou revestimento (a amostra pode ser analisada no seu estado natural);
iii) pode adquirir imagens em meio líquido. As superfícies podem ser analisadas quando
expostas em meio aquoso ou outro líquido. Assim, a técnica AFM fornece um método de
análise de superfícies na interface sólido/água. Além disso, devido à superfície não tratada,
MATERIAIS E MÉTODOS GERAIS |89
qualquer alteração na superfície resultante do comportamento na interface pode ser
visualizado.
AFM utiliza uma sonda que se move ao longo da superfície da amostra. A sonda é uma
agulha, que se move em resposta à força entre a ponta da agulha e a amostra. A topografia
das imagens pode ser obtida por vários modos de operação, dependendo da força entre a
ponta da agulha e a amostra. “Tapping mode” é um dos modos dinâmicos em AFM mais
comuns, a superfície e a agulha encontram-se em movimento oscilatório na direcção z,
tocando a superfície apenas numa pequena fracção da sua oscilação. As forças de corte
aplicadas são eliminadas neste modo, devido à agulha não se encontrar em contacto directo
com a superfície da amostra e o movimento lateral da agulha ocorrer acima da amostra, ao
contrário do modo por contacto (Siedlecki e Marchant, 1998). A microscopia de força atómica
é baseada no registo das forças interatómicas, que actuam entre os átomos da ponta da
agulha, e os átomos superficiais (Leonor, 2001).
Condições experimentais
Para observar as propriedades superficiais e de rugosidade em provetes e filmes SEVA-C, em
função do tempo de imersão, foi usado um microscópio de força atómica NanoScope III
(Digital Instruments).
Foi utilizado o molde de amostra cilíndrica (10 mm de diâmetro e 1 mm de espessura) na
análise dos provetes. Os cilindros foram secos previamente a 50ºC durante 1 semana e
condicionados a temperatura e humidade controlada antes da análise. Para controlo foi
utilizado um cilindro não imerso.
Foi utilizada uma agulha de silício em “tapping mode”.
Foi seleccionado um varrimento de 10x10 μm até uma altura máxima de 1500 nm (eixo ZZ).
A escala no eixo ZZ foi alterada conforme a rugosidade da superfície. A rugosidade da
superfície do material foi medida, em função do tempo de imersão, utilizando o software
instalado no aparelho. As medidas mais comuns de rugosidade são: rugosidade média (Ra) e
rugosidade máxima (Rmax).
3.4.3 Espectroscopia de infravermelho
A espectroscopia de infravermelhos estuda a interacção deste tipo de radiação com a
matéria. Esta técnica tem sido utilizada na detecção de alterações na estrutura química de
MÉTODOS DE ANÁLISE MORFOLÓGICA E ESTRUTURAL |90
materiais poliméricos. A principal vantagem desta técnica é a sua capacidade de identificar e
seguir, quantitativamente, o desaparecimento ou a formação de grupos funcionais.
Conceitos teóricos fundamentais
A radiação electromagnética correspondente à região dos infravermelhos, contém energia
suficiente para promover transições nos níveis energéticos translacionais, rotacionais e
vibracionais de uma molécula. As moléculas constituintes de um material sofrem uma
alteração da sua energia total, quando interagem com a radiação electromagnética.
Quando uma molécula vibra, a distância internuclear entre os seus átomos varia, provocando
uma alteração no seu momento dipolar. Assim, a vibração de uma molécula produz um
campo eléctrico dipolar alternado, cuja magnitude varia periodicamente com o tempo e com
a frequência igual à frequência de vibração. É a interacção deste campo eléctrico dipolar com
a componente eléctrica da radiação electromagnética que origina a absorção de energia.
Instrumentação
A maior parte dos espectrofotómetros de infravermelhos cobrem a região entre 4000 e 200
cm-1. O espectrofotómetro consiste numa fonte de radiação de emissão infravermelha na
gama de frequência do instrumento. A radiação infravermelha emitida pela fonte é
alternadamente dividida em dois feixes, um passa pela amostra e outro pela referência. A
energia emitida, depois de recombinada, atravessa o monocromador, onde se dá a dispersão
da radiação; esta energia dispersa converge para o detector.
O espectro é examinado por comparação da intensidade dos dois feixes, sendo o espectro
final um gráfico com os picos correspondentes à absorção de energia, em função do
comprimento de onda ou frequência (Afremow et al., 1968; Williams e Fleming, 1980).
O modo de reflectância total atenuada (“Attenuated total relectance” - ATR) é uma das
técnicas superficiais utilizadas no estudo da composição de uma amostra em IR. A Figura 3.3
mostra esquematicamente o modo ATR.
MATERIAIS E MÉTODOS GERAIS |91
Detector
infra-vermelho
Fonte
infra-vermelha
Prisma
Amostra
Figura 3.3 Esquema do modo ATR.
Na observação do modo ATR, a radiação infravermelha penetra na amostra a uma
profundidade de poucos microns. Assim, qualquer material em contacto com o prisma pode
absorver a radiação incidente, do que resulta o espectro infravermelho. Uma vez que a
profundidade de penetração é apenas de poucos microns, só a composição da superfície
pode ser estudada, e o espectro obtido é independente da espessura da amostra. No entanto,
a profundidade de penetração é proporcional ao comprimento de onda.
A preparação das amostras em ATR é relativamente simples. O material a ser identificado
deve ser colocado em contacto com o prato de reflectância interna e aplicada pressão
suficiente, para a amostra se encontrar em contacto directo com o prato (Afremow et al.,
1968).
Interpretação qualitativa dos espectros de infravermelhos
A existência de bandas características de absorção de radiação infravermelha, constitui a
base de análise qualitativa e das determinações estruturais por espectrofotometria de
infravermelhos.
A análise da posição, intensidade e forma de uma banda de absorção é de extrema
importância na interpretação de um espectro infravermelho, em análise qualitativa. Uma
banda intensa indica que ocorreu uma grande variação do momento dipolar, ou que existem
na mesma molécula vários átomos ou grupos funcionais que possuem a mesma energia
vibracional.
MÉTODOS DE ANÁLISE MORFOLÓGICA E ESTRUTURAL |92
Para fazer a análise qualitativa de um espectro de infravermelho, podem ser utilizadas as
seguintes técnicas de interpretação: i) comparação directa; ii) interpretação negativa; ou iii)
interpretação positiva.
No presente trabalho, a técnica de espectroscopia de infravermelho com transformadas de
Fourier (FTIR) foi seleccionada para avaliar possíveis alterações na estrutura química, do
efeito da degradação térmica das cadeias poliméricas, durante o processamento ou durante
os ensaios de degradação em solução.
Condições experimentais
Os espectros de absorção de cada amostra foram registados num espectrofotómetro de
infravermelho, de duplo feixe, Perkin-Elmer FT-IR 1600. Scan=16 cm-1. O tratamento dos
dados foi executado pelo “software” SPECTRAFILE.
As soluções resultantes dos ensaios de degradação com provetes para diferentes tempos de
imersão, foram previamente liofilizadas num liofilizador Freeze Dryer Alpha 2-4, antes das
análises, de forma a evitar a sobreposição das bandas OH provocadas pela presença de
água. No final da liofilização, os pós foram guardados num exsicador antes da preparação
das pastilhas KBr.
Foram preparadas pastilhas à base de KBr, utilizando os pós resultantes da liofilização. A
proporção de amostra adicionada foi de aproximadamente 1-100. Para obtenção de
espectros com elevada transmitância foram preparadas pastilhas o mais finas possível. Foi
efectuada uma análise qualitativa das amostras em função do tempo de imersão.
Nos ensaios enzimáticos as análises de FTIR foram efectuadas no modo ATR (SPECAC).
Foram também analisadas amostras de amido e provetes SEVA-C após degradação em água
destilada a ferver com agitação durante 5 horas, de forma a simular condições extremas de
degradação.
Para obter melhor resolução dos picos sobrepostos, em alguns espectros foi aplicada a
segunda derivada.
3.4.4 Medição do ângulo de contacto e determinação da energia livre superficial
A medição do ângulo de contacto, constitui um método clássico para determinar energias
livres entre um sólido e um líquido, a uma distância mínima de equilíbrio (Van Oss, 1994). O
co-seno do ângulo de contacto (medido através da tangente à gota, no ponto sólido-líquido-
MATERIAIS E MÉTODOS GERAIS |93
ar), é uma medida da energia de coesão do líquido, γl, e energia de adesão entre o líquido e o
sólido, expresso como ΔGSL. O ângulo formado por um líquido sobre uma superfície sólida
está directamente relacionado com a molhabilidade da superfície por esse líquido.
A tensão superficial de um líquido em equilíbrio com o vapor, γlv, e o ângulo de contacto de
uma gota de líquido na superfície do sólido, estão relacionados pela equação de Young:
cosθγlv = γsv - γsl
(3.1)
em que: γlv representa a energia livre da interface líquido-vapor, γsv a tensão superficial do
sólido-vapor e γsl a tensão interfacial sólido-líquido.
Os únicos parâmetros que podem ser medidos experimentalmente são θ e γlv. Portanto, para
determinar indirectamente as duas tensões superficiais individuais do sólido, γsv e γsl, é
necessária uma equação adicional.
Um dos métodos disponíveis para medir o ângulo de contacto líquido/sólido é o da gota
séssil (Figura 3.4).
vapor v
líquido l
θ
sólido s
γsl
γlv
γsv
Figura 3.4 Ângulo de contacto e componentes da tensão superficial.
A aproximação de Owen e Wendt (Owens e Wendt, 1969), é baseada na hipótese que a
tensão superficial total pode ser expressa como a soma das duas componentes, γd e γp, que
resultam do tipo de forças intermoleculares, componentes de dispersão e polar,
respectivamente. A tensão interfacial líquido-sólido, pode ser calculada por:
d
d
p
p
γSL = γSV + γLV - 2 γ SV
γ LV
− 2 γ SV
γ LV
(3.2)
Utilizando as equações anteriores, γsv e γsl podem ser determinadas utilizando valores
experimentais dos ângulos de contacto, medidos com líquidos com componentes de tensão
superficial de dispersão e polares conhecidos.
MÉTODOS DE ANÁLISE MORFOLÓGICA E ESTRUTURAL |94
Van Oss (Van Oss, 1994) desenvolveu uma metodologia de cálculo que permite quantificar a
hidrofobicidade da superfície dos materiais através das componentes da tensão superficial.
Segundo este autor, a hidrofobicidade é expressa em termos de energia hidrofóbica de
atracção, e define o grau de interacção entre as moléculas de um material imerso em água
tot
( ΔG sws
).
De acordo com este critério, quando a energia livre global de interacção entre as moléculas
tot
de (s) imersa em água é atractiva ( ΔG sws
é negativo), as moléculas do sólido têm menor
afinidade para a água do que entre si. Assim, uma superfície hidrofóbica apresenta valores de
tot
ΔG sws
negativos. Quando a energia livre global de interacção entre as moléculas de um
tot
sólido (s) imerso em água é suficientemente repulsiva ( ΔG sws
é positivo), a superfície do
tot
sólido é considerada hidrofílica. Quanto maior for o valor absoluto de ΔG sws
mais hidrofóbica
(valores negativos) ou mais hidrofílica (valores positivos) é a superfície.
tot
A energia livre global de interacção ΔG sws
entre as moléculas da superfície (s) imersa em
água (w), é calculada pelo somatório das componentes apolar e polar de energia livre de
tot
AB
interacção, ΔG sws
e ΔG sws
respectivamente:
tot
ΔG sws
(3.3)
LW
AB
= ΔG sws
+ ΔG sws
Em que a componente apolar é determinada por:
LW
ΔG sws
= -2 (
γ sLW
e a componente polar calcula-se do seguinte modo:
AB
ΔG sws
= -4
[γ
+
s
(3.4)
- γ wLW )2
γ w− + γ s− γ w+ − γ s+ γ s− − γ s− γ s+
]
(3.5)
γ s+ - parâmetro da tensão superficial devido à capacidade de aceitar electrões.
γ s− - parâmetro da tensão superficial devido à capacidade de ceder electrões.
tot
) permite quantificar a hidrofobicidade
O cálculo da energia hidrofóbica de atracção ( ΔG sws
das superfícies. É possível estimar o carácter hidrofóbico ou hidrofílico dos materiais a partir
das suas componentes da tensão superficial: i) quanto maior for o valor da componente LW
MATERIAIS E MÉTODOS GERAIS |95
mais apolar é a superfície e portanto, menor afinidade terá para líquidos polares; ii) quanto
maior for o valor da componente AB, mais água de hidratação tem a superfície e portanto
será mais hidrofílica.
Para determinar as componentes da energia livre superficial de um sólido, devem ser
medidos os ângulos de contacto utilizando três líquidos diferentes, sendo um deles apolar. O
requisito mais importante dos líquidos utilizados na medição de ângulos de contacto é que a
tensão superficial seja superior à tensão superficial do sólido, caso contrário, o líquido
espalhar-se-á sobre a superfície do sólido.
De uma maneira geral, os líquidos apolares apresentam tensões superficiais inferiores às dos
líquidos polares. Como exemplos, podemos indicar:
Líquidos apolares: di-iodometano, α-bromonaftaleno
Líquidos polares: glicerol, água e formamida
A escolha do conjunto de líquidos utilizados nas determinações é muito importante, uma vez
que o cálculo da tensão superficial do sólido é inteiramente dependente dos líquidos
utilizados. Só é possível comparar tensões superficiais de sólidos e calcular as energias de
interacção, quando é utilizado o mesmo conjunto de líquidos nas determinações. Este
método deve ser utilizado sobre superfícies homogéneas, planas, lisas e secas.
Tensão superficial determinada com água, formamida e di-iodometano
Com os valores dos ângulos de contacto obtidos com formamida (θF), água (θW) e diiodometano (θD) e os componentes da tensão superficial de cada um dos líquidos, obtém-se o
seguinte sistema de equações:
γ sLW = 12,7 (1 + cosθ )
D
5,049 γ s+ + 5,049
(3.6)
2
γ s− = 36,4 (1 + cosθ ) – 16,639 (1 + cosθ )
W
6,293 γ s+ + 1,510 γ s− = 29 (1 + cosθF) – 22,255 ( 1 + cosθD)
D
(3.7)
(3.8)
O efeito da degradação enzimática na superfície dos provetes SEVA-C em função do tempo de
imersão, foi seguido pela medição dos ângulos de contacto, utilizando o conjunto de líquidos
anterior.
MÉTODOS DE ANÁLISE MORFOLÓGICA E ESTRUTURAL |96
Condições experimentais:
Os provetes foram secos a 80ºC durante uma semana num suporte perfurado, antes das
medições dos ângulos, para evitar que deformassem pela diferença de calor e pressão entre
ambas as superfícies (Figura 3.5).
Figura 3.5 Suporte utilizado para secagem dos provetes antes da medição dos ângulos de contacto.
As medições foram efectuadas à temperatura ambiente de aproximadamente 20ºC, num
medidor de ângulos de contacto (Kruss-GmH, Hamburg), utilizando a técnica de gota séssil.
As determinações dos ângulos formados foram efectuadas recorrendo a um sistema de
análise de imagem, que permite captar imagens com uma câmara de vídeo, e digitalizá-las
num computador onde está instalado um sistema automático de leitura (G2/G40). As
imagens das gotas foram visualizadas no modo manual, para evitar os erros na escolha da
linha de base no modo automático.
Nos ensaios sem actividade enzimática foi utilizada apenas água como líquido de medição
nas determinações dos ângulos de contacto. O valor do ângulo foi contabilizado inicialmente
(cerca de 3 segundos), utilizando 2 μl de líquido. Foram efectuadas cerca de 30 medições
em cada amostra com cerca de 6 ·l de líquido (água).
Nos ensaios enzimáticos foi utilizado outro aparelho para medição de ângulos de contacto:
Dataphysics (modelo OCA 20). Os líquidos utilizados para determinação das tensões
superficiais foram: água, formamida e di-iodometano.
Na Tabela 3.3 encontram-se os valores dos parâmetros da tensão superficial associadas a
cada um dos líquidos utilizados durante as experiências (mJ/m2):
MATERIAIS E MÉTODOS GERAIS |97
Tabela 3.3 Parâmetros da tensão superficial dos líquidos em mJ/m2 (Van Oss, 1994).
Líquido
Água
γTOT
72,8
γLW
21,8
γ+
25,5
γ25,5
Diiodometano
50,8
50,8
0,0
0,0
Formamida
58,0
39,0
2,3
39,6
O valor do ângulo foi contabilizado após estabilização (aproximadamente 40 segundos,
dependendo do tipo de amostra, provete ou filme), desprezando os valores iniciais, onde
ocorrem maiores variações devido a efeitos fundamentalmente de “ajuste” da gota na
superfície. No cálculo do ângulo foi utilizado o método Laplace-Young.
As Figura 3.6 e Figura 3.7 mostram as imagens da determinação do ângulo de contacto,
utilizando água como líquido de medição em provete e filmes SEVA-C.
Figura 3.6 Imagem do ângulo de contacto de uma gota de água formado sobre a superfície, em
provetes SEVA-C.
MÉTODOS ANALÍTICOS |98
Figura 3.7 Imagem do ângulo de contacto de uma gota de água formado sobre a superfície, em
filmes SEVA-C.
Foram efectuadas pelo menos 10 determinações para cada um dos líquidos (volume da
bolha=4 μl) em cada amostra, sendo determinada a média dos valores nos cálculos das
tensões, assim como o desvio padrão.
Os componentes da energia livre superficial do material foram determinados utilizando as
respectivas equações.
3.5 Métodos analíticos
3.5.1 Cromatografia de troca aniónica
O desenvolvimento da técnica de cromatografia de troca aniónica (“high performance anion
exchange chromatography”-HPAEC) permite a obtenção de uma melhoria considerável na
sensibilidade da análise de monossacarídeos. O detector amperométrico de pulsante (“pulsed
amperometric detection”-PAD), permite a quantificação directa de carbohidratos, a baixos
níveis de concentração, com o mínimo de preparação e purificação da amostra. A
cromatografia HPAEC tira vantagem da natureza acídica fraca dos carboidratos, para
obtenção de separações altamente selectivas, a pH elevado, utilizando uma fase estacionária
de forte troca aniónica (Dionex Corporation, 1993).
A detecção dos carboidratos é efectuada por medição da corrente eléctrica, gerada pela sua
oxidação à superfície de um eléctrodo de ouro.
MATERIAIS E MÉTODOS GERAIS |99
Em HPAEC são utilizados como eluentes soluções fortemente alcalinas, normalmente de
NaOH, as quais provocam a ionização dos grupos carboxilo dos carboidratos (perda de H+),
que ficando carregados negativamente, interagem com o enchimento da coluna que se
encontra carregada positivamente (amina quaternária) (Lee, 1990).
A HPAE-PAD foi utilizada neste trabalho para separação de carboidratos e glicerol nas
soluções de degradação dos ensaios sem actividade enzimática.
Condições experimentais
As análises foram realizadas um aparelho Dionex BioLC system, com as seguintes condições:
Coluna: Carbopac PA1 (Dionex) (4x250 mm2) e pré-coluna (4x50 mm2).
Detector: detecção amperométrica de pulso (PAD)
Eluentes: 0,2 M NaOH e água ultra-pura filtrados, desgaseificados em hélio e
pressurizados, para evitar a contaminação por carbonato, utilizando o módulo de
desgaseificação do Dionex (“dionex eluent degas module”- EDM).
Caudal=1 ml/min.
Padrão interno=Lactose=50 mg/l
Gradientes: NaOH=50% e H2O=50%
A regeneração da coluna foi efectuada entre cada injecção.
A quantificação das amostras foi efectuada utilizando os factores de resposta, calculados a
partir das respectivas áreas dos picos de soluções padrão.
3.5.2 Cromatografia líquida de elevada resolução
Os métodos de análise por cromatografia líquida (“high performance liquid chromatography “HPLC) usualmente aplicados para a quantificação dos monossacarídeos, utilizam geralmente,
colunas de troca catiónica com indíce refractivo (RI). Estes métodos requerem especial
atenção em relação à solubilidade e concentração da amostra, e um aquecimento da coluna
antes de efectuar a injecção.
A cromatografia líquida com índice de refracção de infravermelho foi utilizada para separar
carboidratos e glicerol das soluções de degradação com actividade enzimática, para tempos
de imersão pré-definidos.
Foram utilizadas as seguintes condições experimentais:
Coluna e pré coluna: Chrompack carbohydrates Ca (300 x 6,5 mm)
Eluente: água ultra-pura, filtrada (0,2 μm) e desgaseificada.
Caudal: 0,5 ml/min
Temperatura: 90ºC
Detector: 830-RI (infravermelho) (Jasco, Japan)
MÉTODOS ANALÍTICOS |100
Padrão interno (sorbitol) =1 g/L
Procedimento experimental
O procedimento experimental consiste em injectar a amostra, previamente filtrada por
membranas de 0,22 mm (Milipore corporation), para remover possíveis partículas do meio de
degradação, na coluna aquecida a 90ºC. A amostra é arrastada pela coluna a um caudal de
eluente de 0.5 mL/min.
Foram efectuados 3 duplicados em cada amostra analisada.
A concentração final de cada um dos compostos analisados foi obtida através de rectas de
calibração previamente construídas com soluções padrão.
3.5.3 Análise térmica
A análise térmica compreende um conjunto de técnicas experimentais analíticas,
nomeadamente análise termogravimétrica (TGA), calorimetria diferencial de varrimento
(DSC), análise térmica diferencial (DTA), análise termomecânica (TMA) e análise mecânica
dinâmica (DMA) (Hatakeyama e Quinn, 1994). As técnicas por TGA pretendem medir as
alterações mássicas de uma dada amostra, ao contrário das técnicas de DTA e DSC, cujo
objectivo consiste na medição das alterações da sua energia.
Contudo, existem certas desvantagens destes métodos analíticos. Os resultados das análises
térmicas não são dados directos de uma propriedade da amostra, e como tal, devem ser
confrontados com os resultados obtidos por medições espectroscópicas (NMR,
espectroscopia de infravermelhos de Fourier, difracção de raios-X), antes que os processos
moleculares responsáveis por um dado fenómeno sejam elucidados, uma vez que a
sensibilidade e a precisão dos instrumentos de análise térmica a transformações físicoquímicas é baixa, quando comparado com as análises espectroscópicas (Hatakeyama e
Quinn, 1994).
A conformação geral de um equipamento em análise térmica consiste num sensor, um forno
com atmosfera controlada, um programador de temperatura e um sistema de detecção.
A nível experimental, uma amostra pode ser estudada sob uma ampla gama de
temperaturas, sendo possível aplicar uma variedade de programas de temperaturas. Existe
uma variedade de contentores específicos, os cadinhos: de alumínio, prata, ouro ou
cerâmica, que permitem uma preparação prática e segura, de qualquer tipo de amostra (em
estado sólido, líquido ou gasoso), de acordo com a gama de temperaturas estudada. A
MATERIAIS E MÉTODOS GERAIS |101
utilização destes cadinhos, e a elevada sensibilidade dos aparelhos calorimétricos e
termogravimétricos, permitem trabalhar com pequenas quantidades de amostras, entre 0,1
μg e 10 mg. Durante os ensaios experimentais, a atmosfera que rodeia uma dada amostra
pode ser devidamente padronizada, pela escolha de um gás apropriado (por exemplo árgon,
néon, azoto, hélio ou ar).
Estas técnicas investigam o comportamento de uma amostra, qualitativa e quantitativamente,
quanto à alteração das suas propriedades físico-químicas em função da temperatura
(Hatakeyama e Quinn, 1994). O termo “diferencial”, significa que as medições envolvem não
só uma dada substância (amostra), mas também um material de referência. Uma
propriedade física (massa, calor, ou temperatura) de uma dada amostra, é continuamente
medida ao longo do tempo, numa gama de temperatura pré-estabelecida.
Os registos termográficos são afectados pelas condições de análise, nomeadamente: da
amostra (massa, volume e forma física), da metodologia da preparação (moagem, corte,
empacotamento), do material dos cadinhos, da taxa de aquecimento e da atmosfera de
análise (presença/ausência de gás de arraste) (Hatakeyama e Quinn, 1994; Pope e Judd,
1977). A selecção da metodologia mais apropriada é essencial à qualidade dos resultados
obtidos, e depende essencialmente da amostra em questão.
Em particular, a análise térmica de misturas termoplásticas apresenta algumas dificuldades.
O principal problema reside na preparação das amostras, principalmente na reprodutibilidade
obtida e amostragens de massa semelhante (forma irregular).
No presente trabalho as técnicas de DSC e TG permitiram a determinação da quantidade de
água adsorvida nas amostras analisadas e entalpia específica de desidratação,
respectivamente.
3.5.1.1
Análise termogravimétrica (TGA)
A termogravimetria é um ramo da análise térmica, que examina a alteração da massa de
uma determinada amostra, em função da gama de temperaturas estudadas, para um
processo dinâmico, ou em função do tempo, num processo isotérmico (Hatakeyama e Quinn,
1994).
As curvas de TGA são registadas com o auxílio de uma termobalança, uma combinação de
uma balança electrónica com um forno, associados a um programador de temperaturas e um
termopar (Brown, 1988).
MÉTODOS ANALÍTICOS |102
A microbalança deverá registar, com precisão e reprodutibilidade, as alterações na massa de
uma amostra, nas condições experimentais definidas. Mede a quantidade de água absorvida
pelo material e a velocidade com que estas se perdem, ou seja, a velocidade de evaporação.
Preparação das amostras
As amostras devem ter tamanhos pequenos, de forma a diminuir as limitações à
transferência de massa e calor (variações térmicas), melhorando assim a reprodutividade.
A amostra deve também ser o mais compacto possível no interior dos cadinhos, para
minimizar o número de vazios entre as partículas da amostra, dado que, a condutividade
térmica do ar é geralmente muito baixa quando comparada com a amostra. Devem ser
consideradas o maior número possível de amostras na obtenção da média dos resultados. A
amostra deve ser o mais homogénea possível, pois se a forma da amostra não for regular, a
amostra pode tornar-se deformada durante o aquecimento, aumentando o nível de ruído na
linha de base da amostra.
Gás de arrasto
O gás de arrasto é frequentemente utilizado de modo a evitar que os subprodutos de reacção
permaneçam na câmara. Quando está envolvido carbono no processo de decomposição, é
aconselhável o uso de atmosfera inerte, para evitar a oxidação de carbono residual, ou
monóxido de carbono (Pope e Judd, 1977).
A taxa do caudal de gás de arrasto influencia as características da linha de base do aparelho.
Quando o caudal é demasiado elevado a linha de base do instrumento torna-se instável.
Flutuações no caudal alteram o gradiente da linha de base. O caudal de gás de arrasto
recomendado é 20-50 ml/min (Charsley e Warrington, 1992).
O uso de gás de arrasto evita que o vapor de água libertado por certos materiais reaja com o
alumínio dos cadinhos, formando hidróxido de alumínio, podendo alterar o perfil térmico
(Brown, 1988).
Condições experimentais
Os ensaios experimentais foram realizados num aparelho TGA Shimadzu, modelo 50.
Durante as análises foram utilizados cadinhos de alumínio com tampas perfuradas, de modo
a permitir a saída do vapor de água formado durante os ensaios.
MATERIAIS E MÉTODOS GERAIS |103
Foi efectuado um processo inicial de validação da massa de amostra e metodologia de
análise (Apêndice).
Em algumas experiências prévias conclui-se que a amostra deve ocupar o maior espaço
possível no cadinho, portanto maior massa, de forma a diminuir a instabilidade da linha de
base e aumentar a reprodutibilidade. Foram também realizados alguns ensaios de
reversibilidade para averiguar se durante a análise a amostra era degradada, utilizando
diferentes programas térmicos e tempos de estabilização entre 110 e 350 min (ver
Apêndice).
As condições de análise foram as seguintes:
Gás de arrasto, hélio: 30 ml/min.
Gradiente: 5ºC/min, Tfinal = 160ºC, tempo = 30 min (ensaios prévios)
Gradiente: 5ºC/min, Tfinal = 120ºC, tempo=110 min (ensaios com e sem actividade
enzimática)
Gradiente: 5ºC/min, Tf = 200ºC, tempo final=30 min (Ensaios com filmes de diferente
espessura)
Nos ensaios com filmes de diferentes espessuras (provete, 2 e 4 filmes) foram realizadas
análises para diferentes tempos de imersão, utilizando o seguinte programa de Pirólise:
Gás de arrasto, hélio: 30 ml/min.
Gradiente: 10ºC/min, Tf = 550ºC, tempo final=30 min
Em todos os programas de temperatura as amostras foram cortadas em massas de
aproximadamente 10 mg e condicionadas a temperatura constante, até não apresentarem
variação de peso (frigorífico). Durante este processo ocorre perda de massa devido
principalmente ao efeito da porosidade do material (efeito “inchamento”). Os ensaios foram
realizados em 3 duplicados, sendo a média dos resultados o resultado final.
Foram também realizados ensaios utilizando os componentes puros de amido e glicerol,
utilizando o programa de Pirólise. Desta forma foi possível determinar a percentagem de
degradação ao longo do tempo de imersão para cada material (provete, 2 e 4 filmes),
correspondente a cada fase de degradação (ED): glicerol (ED <230ºC), amido (230 <ED
<345ºC) e EVOH (ED> 345ºC). A preparação das amostras seguiu o mesmo procedimento
dos ensaios anteriores em TGA.
MÉTODOS ANALÍTICOS |104
Expressão dos resultados
Foram efectuadas duas determinações: absorção de água no material durante ensaio TGA e a
percentagem de perda de massa de água durante pré-condicionamento das amostras.
No cálculo da percentagem de absorção de água pelo material foi utilizada a seguinte
equação:
(Ps - Pf)/Ps x 100%
(3.9)
Em que:
Ps - massa da amostra após o pré-condicionamento em condições controladas
Pf - massa final da amostra após análise TGA
A percentagem de perda de massa de água do material relativamente à massa inicial, em
cada período de imersão pré-definido, foi determinada pela seguinte equação:
(Pi - Ps)/Pi x 100%
(3.10)
Em que:
Pi - massa inicial da amostra
Ps - massa da amostra após pré-condicionamento (até apresentar peso constante).
Para cada amostra foram efectuadas 6 análises, determinando-se simultaneamente o desvio
padrão e intervalo de confiança de 95%
3.5.1.2
DSC
A calorimetria diferencial de varrimento (“differential scannig calorimetry”-DSC) pertence ao
grupo de técnicas de análise térmica, em que se medem propriedades físicas primárias em
função da temperatura, ou em função do tempo. Mede as alterações de energia nas
amostras, registando-as em termos de calor (entalpia), emitido ou absorvido, relativamente a
uma referência, daí a designação de “calorimetria diferencial” (Hatakeyama e Quinn, 1994).
Caracteriza o fenómeno em termos de Ti, Tf e Tp.
Temperatura inicial, Ti: quando se inicia o processo
Temperatura final, Tf: quando o processo termina
Temperatura máxima, Tp: temperatura do pico.
Quando um material sofre uma alteração no seu estado físico-químico, ou quando reage
quimicamente, verifica-se uma absorção ou libertação de calor associada a essa alteração,
que se manifesta através de um desvio da linha de base, pela diferença de fluxos caloríficos
entre os fornos da amostra e da referência. Este fenómeno corresponde, respectivamente, a
MATERIAIS E MÉTODOS GERAIS |105
uma alteração endotérmica ou exotérmica. Sendo assim, quando uma amostra funde, é
necessário fornecer energia (sob a forma de calor), para ultrapassar as forças que mantêm a
amostra no seu estado sólido. A entrada de energia para o sistema, corresponde a um
processo endotérmico.
Um instrumento de DSC é constituído por dois fornos individuais que aquecem,
independentemente, uma amostra e uma referência, e ainda, por dois sensores de
temperatura.
Num aparelho de DSC, a diferença de temperatura entre uma amostra e a célula de
referência, é medida em função da temperatura ou do tempo, sob condições de temperatura
controladas. Esta diferença de temperatura é proporcional ao fluxo de calor (energia/tempo).
A amostra e a referência são aquecidas (ou arrefecidas), num intervalo de temperaturas a
uma velocidade previamente estabelecida. Em cada instante, a temperatura do forno da
amostra é mantida igual à temperatura do forno de referência, sendo para isso fornecido,
independentemente, fluxos caloríficos a cada um dos fornos. O sinal detectado pelo DSC é
uma medida da diferença de fluxos caloríficos que atravessam os fornos da amostra e da
referência, em função da temperatura, ou no modo isotérmico, em função do tempo
(Hatakeyama e Quinn, 1994).
O circuito de temperatura garante que, tanto a temperatura da amostra como da referência,
sejam incrementadas segundo uma taxa previamente determinada (taxa de aquecimento ou
de arrefecimento). O circuito de compensação de calor, promove a entrada de energia para o
sistema, para compensar quaisquer efeitos endo ou exotérmicos, que ocorram na amostra
(desta forma, assegura-se que as temperaturas da amostra e da referência sejam idênticas,
na gama de temperaturas estudada) (Brown, 1988).
Num termograma, a área de um pico é directamente proporcional à variação de entalpia de
uma amostra. A massa de amostra e a sua preparação, material do cadinho, taxa de
aquecimento, atmosfera do gás de arrasto, são alguns factores que afectam a forma das
curvas DSC (Charsley e Warrington, 1992).
Um calorímetro (DSC) é calibrado por medição das áreas dos picos, em processos em que as
variações de entalpia são conhecidas, tais como a entalpia de fusão de determinados metais.
A calibração deve ser conduzida nas mesmas condições das experiências (Hatakeyama e
Quinn, 1994).
MÉTODOS ANALÍTICOS |106
Preparação da amostra
A amostra deve encontrar-se em bom contacto térmico com a base do cadinho, de forma a
obter uma boa curva DSC e evitar o número de vazios na amostra. Para evitar os gradientes
de temperatura, a amostra utilizada deve ter sempre a menor massa possível. Deve também
ser representativa da totalidade da amostra, pelo que a massa mínima está associada à
homogeneidade do material. Quando a massa a analisar é elevada, a taxa de variação da
temperatura deve ser lenta, para compensar o aumento dos gradientes de temperatura na
amostra (Hatakeyama e Quinn, 1994).
Condições experimentais
As análises de DSC, foram efectuadas num calorímetro Shimadzu, modelo 50.
A calibração foi efectuada com Indium com as seguintes propriedades: Tfusão= 156,6ºC e ΔH
= 28,5 J/g
fusão
Como referência foi usado um cadinho vazio fechado com tampa perfurada, no lado
esquerdo do forno do aparelho DSC.
A preparação das amostras em cadinhos fechados de alumínio é idêntica para os ensaios por
DSC e TGA. As amostras foram cortadas em tamanhos de aproximadamente 10 mg de
massa, para tempos de amostragem pré-definidos e condicionadas a temperatura e
humidade constante. Como controlo foi utilizado um provete não imerso em solução. Antes
de iniciar a análise, o aparelho deve encontrar-se estabilizado completamente mantendo-se
em estado estacionário, isto é, o valor da referência e amostra apresentam valor 0.
Caudal de gás de arrasto, hélio=30 ml/min
Programa: gradiente = 5ºC/min; Tfinal = 200ºC, tempo final = 30 minutos.
Foram realizados dois triplicados em cada provete, sendo a média dos seis resultados o valor
final. Foram obtidos dois parâmetros em cada um dos termogramas: temperatura do pico e
entalpia (fluxo de calor). A entalpia foi calculada por integração da área dos picos respectivos,
traçando tangentes às curvas nos pontos inicial e final, dividindo no final pelo peso da
amostra correspondente antes da análise.
MATERIAIS E MÉTODOS GERAIS |107
3.5.4 Método colorimétrico para detecção do amido
O amido é constituído por dois componentes, a amilose e a amilopectina, que se enrolam
espontaneamente em hélice. Os átomos de iodo, na presença de amido, são retidos no
interior dessas hélices por forças dipolares, o que faz corar o amido de azul. Se o complexo
amido-iodo for aquecido, as hélices são destruídas e a coloração desaparece. Este fenómeno
é no entanto reversível, por arrefecimento.
As moléculas de amilose são raramente ramificadas, ao contrário das de amilopectina, o que
faz com que as primeiras tenham uma maior contribuição na estruturação da hélice de
amido. Assim, a análise quantitativa do amido pela medição de cor na presença de iodo
depende da composição do amido nestes componentes. O complexo amido-iodo é
determinado espectofotometricamente a 580 nm.
Procedimento Experimental
O procedimento experimental consiste em adicionar a 5 ml da solução a analisar, 100 μl de
ácido sulfúrico 2M e 0.5 ml de solução KI-I2. Agitar bem e medir a densidade óptica a 580
nm em placa ELISA (microplaca com 96 poços de leitura), contra um branco preparado da
mesma forma com solução controlo. A concentração foi determinada por consulta de uma
curva de calibração, construída com amido de milho utilizado no processamento dos provetes
SEVA-C. A calibração foi efectuada sempre que se preparava novos reagentes.
3.5.5 Polissacarídeos totais (método Dubois)
Os polissacarídeos nas soluções de degradação foram quantificados pelo método Dubois
(Dubois et al., 1956). Este método envolve um aquecimento prévio da amostra com ácido
sulfúrico e posterior adição de fenol para desenvolvimento da cor. Os polissacarídeos são
hidrolisados em monossacarídeos, sendo estes desidratados a derivados furfurálicos que
reagem com o fenol, originando compostos de coloração amarela, posteriormente doseados
espectofotometricamente. A principal vantagem do método Dubois é a alta especificidade
para os carboidratos, e a idêntica intensidade de cor desenvolvida por todos os açúcares
medidos.
MÉTODOS ANALÍTICOS |108
Procedimento Experimental
O procedimento experimental consiste em adicionar a 1 ml de amostra, 1 ml de solução de
fenol 5% e homogeneizar durante 15 segundos ao vórtex. Adicionar 5 ml de solução de ácido
sulfúrico concentrado 95-97% e deixar repousar ao abrigo da luz 10 minutos. Homogeneizar e
deixar arrefecer. Ler a absorvância a 490 nm em placa ELISA (microplaca com 96 poços de
leitura) contra um branco (controlo) preparado do mesmo modo.
A calibração foi efectuada sempre que se preparava novo reagente fenol 5%.
3.5.6 Glucose (método do ácido 3,5-dinitrossalicílico)
A concentração de glucose foi estimada pelo doseamento dos açúcares redutores pelo
método do ácido 3,5-dinitrossalicílico (Miller, 1959). Os açúcares redutores em presença de
uma base reduzem o ácido 3,5-dinitrossalicílico a ácido 3-amino-5-nitrossalicílico, sendo os
grupos carbonilo dos açúcares oxidados a carboxilo. A presença na solução de sal de La
Rochelle (tartarato duplo de sódio e potássio), visa proteger o reagente da acção do oxigénio
dissolvido.
Há evidência de que a química deste teste pode ser complicada por reacções colaterais que
envolvem a decomposição do açúcar em solução alcalina, competindo com a redução do
DNS pelo açúcar.
Procedimento Experimental
O procedimento experimental consiste em adicionar num tubo de ensaio, 0,5 ml de DNS com
0,5 ml de cada uma das soluções, agitar e colocar num banho a 100ºC durante 5 minutos.
Após arrefecimento, adiciona-se 5 ml de água destilada e lê-se a absorvâncias a 540 nm em
placa ELISA (microplaca com 96 poços de leitura), contra um branco (controlo) preparado do
mesmo modo. A concentração final foi obtida por comparação com uma curva padrão. A
calibração foi efectuada sempre que se preparava novo reagente DNS.
3.5.7 Extracção total (Soxhlet)
O processo de extracção total por Soxhlet foi utilizado com o objectivo de remover todas as
matérias solúveis, tais como aditivos, do material SEVA-C, num meio extractor (água), de
forma a caracterizar a composição interna dos provetes sem qualquer tratamento e após
degradação em solução fisiológica. A extracção ocorre num processo em duas etapas: a água
MATERIAIS E MÉTODOS GERAIS |109
(meio extractor) passa várias vezes pela amostra provocando condições rápidas de
degradação, e extraindo todo o material solúvel da amostra. No passo seguinte, o provete é
“lavado” com a água dos condensadores. No final a matéria é contabilizada no extracto por
HPAEC-PAD (ver 3.5.1).
Condições experimentais
Na extracção total foi utilizado um aparelho Soxtec system HT2 Tecator para isolar a matéria
solúvel, durante 12 h. Os provetes SEVA-C foram pesados e inseridos em cartuchos na
unidade de extracção. Após adição de solvente (foi usada água como meio extractor) ao meio
extractor, a matéria solúvel é extraída. Terminadas as extracções, secar os copos de
extracção e pesar. As soluções de extracção resultantes foram injectadas em HPAEC-PAD
(NaOH 20% e água 80% para melhor resolução dos picos), para análise da quantidade de
glicerol e carboidratos totais.
Foram efectuados ensaios de extracção total em soxhlet a provetes sem qualquer tratamento
e provetes após um longo período de degradação.
3.5.8 Hidrólise ácida
Os polissacarídeos são vulgarmente determinados por métodos colorimétricos, que envolvem
o aquecimento da amostra com ácido sulfúrico concentrado e adição de um reagente, como
o fenol (Dubois et al., 1956). O mecanismo de acção destes métodos, envolve a hidrólise dos
polissacarídeos em monossacarídeos que reagem especificamente com o reagente,
desenvolvendo uma cor característica. O método mais vulgarmente utilizado é o método do
fenol/ácido sulfúrico, porque permite obter resultados expeditos com precisão.
Foi efectuada uma hidrólise ácida (com HCl) a amostras SEVA-C sob a forma de pó, sem
qualquer tratamento, de forma a determinar a quantidade de amido presente inicialmente
nos provetes. A análise dos resultados finais pode ser feita por diferentes métodos analíticos:
polissacarídeos totais ou HPLC (ver 3.5.2. e 3.5.5).
Procedimento experimental
O procedimento experimental consiste em adicionar a 5 mg de SEVA-C em pó a 250 μl de
ácido sulfúrico 78%, agitar e colocar num banho a 25ºC durante 30 min em tubo fechado.
MÉTODOS ANALÍTICOS |110
Adicionar 1,2 ml de água e 0,5 ml de glucose (0,05 g/l) e sorbitol (1 g/l) utilizados como
padrão interno nos métodos Dubois e HPLC, respectivamente. Colocar os tubos a incubar a
100ºC durante 120 min. Deixar arrefecer (15-30 min) e juntar 0,6 ml de solução de amónia
25%. Arrefecer durante 10 min.
Para cada método foram utilizados 3 duplicados, sendo a média dos resultados a
percentagem final de amido presente no material.
Além dos carbohidratos foi também contabilizado o glicerol por HPLC.
3.5.9 Actividade enzimática
Foi determinada a actividade enzimática inicial com a finalidade de comparar com a fornecida
pelo fornecedor (0,35 mg/unid/min a 20ºC e pH 6.9, 1 unidade de enzima liberta 1 mg de
maltose em 3 min, a partir do amido), e assim determinar a actividade enzimática no início
de cada um dos ensaios. Na caracterização da enzima foram também determinados os
parâmetros cinéticos, velocidade máxima (Vmax) e constante de saturação (Km) e
comparados com o teoricamente previsto. Os parâmetros cinéticos da enzima foram
calculados utilizando o método Eadie-Hoffstee, em diferentes soluções de substrato (amido)
(Bailey e Ollis, 1986).
Ao longo dos ensaios podem também ocorrer processos de desactivação que comprometem
o processo degradativo, pelo que se torna fundamental determinar periodicamente se a
enzima se encontra activa/inactiva durante todo o ensaio. Foi assim determinada a actividade
enzimática periodicamente, utilizando como substrato amido e contabilizando a velocidade de
degradação pela quantidade de açúcares redutores formados.
3.5.1.3
Determinação da actividade enzimática inicial
A actividade inicial da enzima foi calculada utilizando três concentrações enzimáticas: 50,
100 e 150 unid/l. O objectivo é saber se a enzima se encontra activa inicialmente e se ocorre
perda de actividade ao longo dos ensaios. O procedimento experimental consiste em
adicionar α-amílase a uma solução de amido (1%) pH 6.9, para cada uma das três
concentrações enzimáticas. A hidrólise prosseguiu a 37ºC durante 4 h. Periodicamente (10
minutos) retiraram-se 0.5 ml de amostra para avaliação da libertação de açúcares ao longo
do tempo, pelo método DNS (ver 3.5.6.). A actividade é calculada para cada concentração de
enzima e expressa em mg glucose/unit/min durante a primeira fase de reacção.
MATERIAIS E MÉTODOS GERAIS |111
3.5.1.4
Determinação da actividade enzimática ao longo dos ensaios de
degradação
Foram utilizadas três concentrações de enzimas: 50, 100 e 150 unid/l, para analisar
diferenças na actividade enzimática. O procedimento experimental consistiu em dissolver as
três soluções de enzima em solução HBSS a pH 7.4 e 37ºC, durante um período semelhante
aos ensaios de degradação (aproximadamente 6 meses). Simultaneamente foi determinado
do mesmo modo a actividade enzimática nos ensaios de degradação a decorrer.
Para períodos pré-definidos, uma vez por semana, adicionar 0,5 ml de cada solução
enzimática a 0,5 ml de solução de amido 1% (pH 6.9) e incubar a 37ºC durante 20 minutos,
para avaliação do processo de activação/desactivação. Após incubação, parar a reacção pela
adição de reagente DNS à solução.
Como controlo foi utilizada uma solução HBSS + provete, de forma a descontar os açúcares
libertados pelo processo de degradação do provete.
A actividade enzimática foi expressa em mg glucose/unid/min para cada concentração
enzimática em função do tempo de imersão.
Cada valor representa a média de dois duplicados das três concentrações enzimáticas (4
valores na totalidade). Os erros associados foram determinados pelo teste t-Student baseados
no intervalo de confiança de 95%.
3.5.1.5
Determinação dos parâmetros cinéticos da enzima
No cálculo dos parâmetros cinéticos foi utilizada uma concentração de α-amílase de 50
unid/l, a mesma concentração utilizada durante os ensaios de degradação.
O procedimento experimental consistiu em adicionar a enzima a cinco concentrações de
substrato (amido) de 0,5%, 1%, 1.5%, 2% e 2,5% (p/v) tamponadas (pH 7.0), iniciando-se
assim o processo de digestão enzimática. A hidrólise procedeu durante 250 min a 37ºC,
sendo retiradas amostras periodicamente (em cada 10 minutos), para avaliar o aumento da
concentração de açúcares redutores, até a maior parte do amido ser hidrolisado. O aumento
da concentração de açúcar foi seguido pelo método de ácido dinitrossalicílico (Miller, 1959).
Após medição dos açúcares redutores solúveis, calculou-se a velocidade de reacção para
cada concentração de substrato.
MÉTODOS ANALÍTICOS |112
Os parâmetros cinéticos (Km e Vmax) foram obtidos pelo declive e ordenada na origem do
gráfico S/v em função de v (onde v e S são a velocidade e concentração de substrato,
respectivamente).
Foram realizados três ensaios, sendo a média dos resultados os valores finais de Km e Vmax.
3.5.10 Ensaios com concentrações enzimáticas diferentes
De forma a avaliar a limitação estrutural do material à degradação enzimática foi realizado
simultaneamente um ensaio com diferentes concentrações enzimáticas, utilizando a mesma
massa de provete (1.6 g), durante aproximadamente 150 dias. Uma das concentrações
enzimáticas é idêntica à utilizada nos ensaios de degradação, para fins comparativos (50
unid/l).
Procedimento Experimental
As três concentrações enzimáticas utilizadas foram: 50, 100 e 150 unid/l. O procedimento
experimental consistiu em dissolver cada das três concentrações em solução HBSS durante
aproximadamente 150 dias. Periodicamente (duas vezes por semana) a concentração de
açúcares foi avaliada pelo método DNS (ver 3.5.6.). Como controlo foi utilizada uma solução
HBSS e provete SEVA-C sem enzima.
A percentagem de massa de glucose libertada para a solução foi calculada para cada
concentração enzimática por massa de provete (1.6 g).
Cada valor representa a média de dois duplicados das três concentrações enzimáticas
(quatro valores na totalidade). Os erros associados foram determinados pelo teste t-Student
baseados no intervalo de confiança de 95%.
3.5.11 Interacção entre oligossacarídeos e glicerol nas soluções enzimáticas
Para avaliar possíveis alterações e interacções entre oligossacarídeos e glicerol nas soluções
de α-amílase, os compostos puros foram misturados e os respectivos produtos analisados
em HPLC periodicamente em função do tempo de imersão.
MATERIAIS E MÉTODOS GERAIS |113
Procedimento Experimental
O procedimento experimental consistiu em dissolver cada um dos padrões de maltose (1.5
g/l), glucose (3 g/l) e glicerol (1 g/l) em soluções separadas, em solução HBSS com 50
unid/l de α-amílase a 37ºC e pH 7.4. Os mesmos compostos (1 g/l) foram também
misturados com enzima α-amílase durante 150 dias de imersão. Periodicamente (uma vez
por semana) efectuaram-se amostragens para análise dos derivados de açúcar e glicerol por
HPLC (ver 3.5.2).
3.6 Bibliografia
Afremow, L. C, Isakson, K. E., Netzel, D. A., Tessari, D. J., Vandeberg, J. T. (1968) Infrared
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CAPITULO 4
DEGRADAÇÃO IN-VITRO DE MISTURAS
TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
4. DEGRADAÇÃO IN-VITRO DE MISTURAS
TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO
SUMÁRIO
As misturas à base de amido de milho com copolímero de etileno-álcool vinílico, têm sido propostas
como alternativas potenciais aos polímeros biodegradáveis normalmente utilizados em aplicações
clínicas. Uma das funções mais importantes do seu uso é conhecer os produtos libertados durante a
sua degradação e se esses produtos apresentam efeitos tóxicos para o organismo.
Neste capítulo são apresentados os resultados obtidos dos estudos de degradação in-vitro de SEVA-C
em solução fisiológica simulada (NaCl=9 g/l). Foi possível observar, por SEM, alterações da superfície
morfológica do material em função do tempo de imersão, pelo aumento do número e tamanho dos
poros e rugosidade ao longo do período de imersão.
A quantidade de açúcares redutores libertada para a solução é bastante baixa (0,15%), ao longo de
todo o tempo de imersão. É pouco provável que o amido que se encontra no interior da fase amorfa
seja libertado para a solução isotónica, porque é uma molécula formada por cadeias longas de
carboidratos, o que dificulta a sua difusão hidrolítica para o exterior da matriz, libertando-se apenas
pequenas cadeias poliméricas dispersas na matriz para a solução.
Na degradação de SEVA-C em solução isotónica podem ser identificadas 3 fases distintas. A primeira,
entre 0 e 3-4 dias, está relacionada com o fenómeno físico de libertação de plasticizadores e outros
produtos de degradação, tais como cadeias poliméricas de baixo peso molecular para a solução,
assim como a acção lubrificante da água. Após os primeiros dias, existe um período sem perda de
peso significativa (entre 4 e 30 dias). Nos restantes estados do período testado existe uma
estabilização da taxa de degradação, atribuída possivelmente ao ataque do complexo amilose-EVOH,
menos susceptível à degradação.
4.1
INTRODUÇÃO
121
4.2
RESULTADOS E DISCUSSÃO
123
4.2
CONCLUSÕES
140
4.4
BIBLIOGRAFIA
142
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
DEGRADAÇÃO IN-VITRO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |121
4.1 Introdução
A utilização de polímeros bioabsorvíveis pode ser benéfica em sistemas de fixação de
fracturas ortopédicas temporárias, principalmente quando combinam uma resistência e
rigidez inicial apropriadas, associada a uma cinética de degradação controlada. A redução
esperada do módulo do biomaterial deve também conduzir a uma transferência gradual de
carga para o osso em recuperação, e a absorção completa do implante pode evitar uma
segunda operação para a sua remoção (Andriano KP et al., 1994; Baumgart FW e Perren SM,
1994; Danniels AU et al., 1994).
Os sistemas baseados em poli (ácido láctico) (PLA), poli(ácido glicolítico) (PGA), seus
copolímeros e polihidroxibutirato (PHB) são exemplos comuns de polímeros biodegradáveis
utilizados actualmente em ortopedia. Estes polímeros utilizados como material de prótese
devem apresentar propriedades mecânicas adequadas, e cinéticas de degradação
controladas na presença de fluidos corporais.
Recentemente, as misturas à base de amido de milho com copolímero de etileno-álcool
vinílico (SEVA-C), têm sido propostas como alternativas potenciais aos polímeros
biodegradáveis normalmente utilizados em aplicações clínicas (Reis et al., 1997d; Reis et al.,
1996b; Reis e Cunha, 1995b). Esta classe de materiais tem sido referida como biodegradável
(Bastioli et al., 1993; Bastioli et al., 1994b; Bastioli et al., 1990a; Bhattarcharya et al., 1995;
Griffin, 1994), biocompatível in vivo e in vitro, com comportamento mecânico semelhante ao
osso humano e bioactivo (Reis et al., 1997d; Reis et al., 1996b; Reis e Cunha, 1995b). A
grande vantagem desta classe de materiais comparativamente aos materiais sintéticos, é a
sua biocompatibilidade com os tecidos orgânicos, a sua semelhança com o comportamento
dinâmico mecânico do osso, o seu baixo custo e a sua disponibilidade. No entanto, a sua
utilização no campo biomédico não está completamente investigada. Uma das funções mais
importantes do seu uso é conhecer os produtos libertados durante a sua degradação, e se
esses produtos apresentam efeitos tóxicos para o organismo. Assume assim grande
importância o estudo dos mecanismos associados à degradação destes materiais em meios
fisiológicos simulados, nomeadamente a avaliação dos problemas associados à eliminação
dos resíduos da sua degradação no interior do organismo.
INTRODUÇÃO |122
Os biomateriais quando em contacto com os tecidos devem apresentar determinados
propriedades (Ratner, 1996a), resultantes do efeito do organismo no implante e efeito do
implante no organismo. Os requisitos mínimos de aceitação de um biomaterial em aplicações
clínicas devem incluir: (i) o material não deve libertar componentes solúveis para os tecidos
vivos, a não ser que esta libertação seja intencional; (ii) os tecidos vivos não devem degradar
o implante, a não ser que seja requerida degradação; (iii) o comportamento mecânico e físico
do polímero deve ser apropriado à função considerada, as propriedades mecânicas devem
persistir durante o tempo de vida do implante; e finalmente (iv) os materiais devem ser
biocompatíveis e esterilizáveis com o organismo (Langer e Kohn, 1996).
Em geral, um material polimérico deve obedecer a estes critérios estritos, sendo a
degradabilidade dos polímeros um dos factores mais importantes da aceitação ou não de um
polímero em aplicações clínicas (Williams, 1992).
A degradação pode ser definida como uma alteração da estrutura química ou perda das
propriedades físicas, ou ainda o aparecimento de um novo composto, podendo incluir
(Langer e Kohn, 1996): quebra da cadeia polimérica (redução do peso molecular), libertação
de plasticizadores e aditivos, ligações em cadeia (aumento do peso molecular efectivo),
hidrólise ou reacção de cadeias laterais e absorção de água. A degradação in-vitro e in-vivo de
sistemas poliméricos depende de vários factores, tais como: a estrutura química e massa
molecular do polímero, a sua formulação e morfologia, e a espessura dos materiais utilizados
(Tjong e Bei, 1998). Em algumas aplicações a degradação pode ser indesejável, devendo o
implante permanecer no corpo durante um longo período de tempo, sem alteração das suas
propriedades funcionais e sem induzir resposta adversa nos tecidos (Williams, 1992). Noutros
casos, a degradação pode ser intencional, se a função for temporária, sendo o implante
eliminado num período apropriado ou a função ter associado um processo degenerativo, tal
como na libertação controlada de fármacos ou outro agente biológico activo (Miller ND e
Wiiliams, 1987; Zaikov GE, 1989).
A degradação de polímeros insolúveis depende da sua estrutura química, estado físico,
hidrofilicidade (tal como no caso de materiais à base de amido), assim como das suas
propriedades superficiais (Bastioli et al., 1995; Van Soest et al., 1996a).
Uma vez que o meio aquoso do corpo se mantém constante (pH=7.4 e T=37ºC), pode ser
possível prever a cinética do processo de degradação in-vivo, considerando que a hidrólise é o
único mecanismo presente (Williams, 1992).
DEGRADAÇÃO IN-VITRO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |123
No âmbito dos estudos de polímeros biodegradáveis em aplicações ortopédicas temporárias,
é conveniente estudar previamente o comportamento de degradação do material ao longo do
tempo, para que o implante possa ser correctamente produzido em função do tempo de
recuperação óssea.
Os testes de degradação in-vitro em soluções fisiológicas simuladas, são uma forma de
simular as interacções entre os fluidos corporais e o biomaterial, e o estudo da sua
estabilidade e taxa de degradação. Apesar de ser impossível simular completamente o
carácter químico, mecânico e dinâmico do sistema in-vivo para prever o comportamento dos
biomateriais no meio fisiológico humano, os estudos in-vivo e in-vitro são uma parte
integrante importante de potenciais materiais para implantes. No entanto, a experimentação
in vitro, não pode substituir a experimentação in vivo. Ambas as componentes são
necessárias para testar potenciais biomateriais. Os testes in vitro representam apenas uma
parte do estudo da biocompatibilidade. As espécies classificadas como biocompatíveis in vitro
devem entrar numa fase seguinte de observação in vivo. A restrição ao mínimo da
experimentação animal tornou importante o uso de sistemas in vitro, para distinguir de forma
adequada potenciais biomateriais para aplicação humana.
Apesar dos polímeros biodegradáveis serem preferencialmente compostos por moléculas
normalmente presentes no corpo humano e portanto biocompatíveis, os implantes à base
destes materiais podem induzir respostas inflamatórias, sendo necessário estudar os
principais mecanismos de degradação destes polímeros quando inseridos no corpo humano.
É também necessário assegurar que os produtos de biodegradação não sejam tóxicos para o
organismo, e sejam elimináveis através de qualquer um dos sistemas orgânicos de
eliminação.
4.2 Resultados e Discussão
Neste capítulo são apresentados os principais resultados obtidos nos estudos de degradação
in-vitro de SEVA-C em solução fisiológica simulada (NaCl = 9 g/l). As dimensões dos provetes
foram de secção quadrada e 10 cm2 de área superficial, de acordo com a Tabela 3.2
apresentada no capítulo de Materiais e Métodos. Nestes ensaios de degradação os provetes
foram imersos a 37±1ºC, pH=7.4 em recipientes individuais de 50 cm3, e com agitação (150
RESULTADOS E DISCUSSÃO |124
rpm) por períodos de amostragem pré-definidos. Todas as manipulações foram realizadas
numa câmara de fluxo laminar.
Os resultados seguidamente apresentados foram realizados em dois ensaios de degradação
durante 20 e 120 dias, respectivamente. Inicialmente, realizou-se o ensaio de curta duração
(20 dias), para estudo dos principais mecanismos associados à cinética de degradação in-
vitro, assim como a aplicabilidade dos métodos analíticos e morfológicos de análise. Após
análise dos resultados, verificou-se que o processo de degradação seria bastante lento, tendo
sido realizado um ensaio mais longo (120 dias).
A descrição de todos os métodos analíticos e de morfologia estrutural utilizados na
caracterização das soluções de degradação e do material, após períodos de degradação prédefinidos em cada um dos ensaios, encontram-se no respectivo capítulo de Materiais e
Métodos.
Os principais objectivos na realização destes ensaios de degradação in-vitro foram: verificar a
estabilidade dos materiais em solução, quantificar os seus produtos de degradação e
estabelecer uma relação entre a sua estrutura, morfologia, alterações superficiais e perda de
propriedades por degradação em solução fisiológica simulada.
4.2.1 Morfologia superficial e alterações estruturais de SEVA-C
As alterações da superfície morfológica do material em função do tempo de imersão foram
analisadas em SEM. Inicialmente foi estudado o local de análise: superfície do material ou
mais afastado da superfície (espessura), de forma a induzir se o mecanismo de degradação é
superficial, ou pelo contrário, se a actuação é mais interior. As micrografias apresentadas na
Figura 4.1 mostram as alterações na espessura do material, resultantes do ensaio de curta
duração (20 dias).
DEGRADAÇÃO IN-VITRO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |125
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 4.1 Micrografias SEM da espessura SEVA-C: (a) controlo (provete não imerso em solução), (b)
após 6 dias de imersão, (c) após 8 dias de imersão e (d) após 21 dias de imersão (x1500) (os
provetes foram secos antes da análise SEM).
Pelas micrografias anteriores é visível que o processo de degradação não actua na espessura
do material, não se registam alterações por efeito do tempo de imersão. A microestrutura
interna mantém-se mais ao menos compacta, não se notando diferenças entre o controlo e
as restantes amostras em solução, ao longo do tempo de imersão.
Foram efectuadas análises da superfície morfológica do material para diferentes tempos de
imersão (até 20 dias), encontrando-se os resultados das micrografias na Figura 4.2.
RESULTADOS E DISCUSSÃO |126
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 4.2 Micrografias SEM da superfície SEVA-C: (a) controlo, (b) após 8 dias de imersão, (c) após
16 dias de imersão e (d) após 21 dias de imersão (x 1500) (os provetes foram secos antes da análise
SEM).
Comparativamente à Figura 4.1 são visíveis pequenas alterações na superfície morfológica ao
longo do tempo de imersão, pelo aumento da rugosidade e porosidade, ao contrário da
Figura 4.1 onde praticamente não se registam alterações. Confirma-se assim que o processo
de degradação deverá ocorrer preferencialmente na superfície, tal como esperado, dado que
o primeiro contacto que a solução tem com o material é na superfície. A camada superficial
pode facilitar a retenção e acesso da solução de degradação. Registam-se diferenças entre a
amostra imersa durante 21 dias e o controlo, nomeadamente ao nível da porosidade e
textura superficial. Provavelmente a solução de imersão actuou sobre a superfície do
material, e após secagem deu origem ao aparecimento de pequenos poros na superfície
(processo de absorção e secagem). A análise morfológica superficial está também
relacionada com o processo de processamento utilizado na preparação das amostras.
Como se verificaram pequenas alterações na superfície morfológica foi realizado um novo
ensaio durante um período mais longo (120 dias), sendo os resultados das micrografias em
SEM apresentados na Figura 4.3.
DEGRADAÇÃO IN-VITRO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |127
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
Figura 4.3 Micrografias SEM da superfície SEVA-C: (a) controlo, (b) após 18 dias de imersão, (c) após
35 dias de imersão, (d) após 48 dias de imersão, (e) após 81 dias e (f) após 100 dias de imersão (x
1500) (os provetes foram secos antes da análise SEM).
Nas micrografias anteriores já se notam alterações significativas entre o controlo (a) e a
amostra com 100 dias de imersão (f). O número e tamanho dos poros foi aumentando ao
longo do tempo de imersão e para tempos de imersão mais longos (81 e 100 dias), os poros
foram alargando formando fissuras na superfície do material. Isto é resultado do processo de
degradação do material, devido à grande diferença morfológica entre o controlo e amostras
com mais tempo de imersão, além do processo normal de absorção característico deste tipo
de materiais.
RESULTADOS E DISCUSSÃO |128
Estes resultados são importantes na análise analítica das soluções de degradação, que se
apresentam nos subcapítulos seguintes, pois complementam o processo de degradação in-
vitro ao nível morfológico.
Tal como referido no capítulo de Materiais e Métodos foi aplicada a análise termogravimétrica
nos estudos de degradação, para quantificação da percentagem de água absorvida pelo
material em função do tempo de imersão.
Quando um biomaterial é implantado na presença de fluidos humanos, difunde para o meio à
medida que ocorre degradação. Neste sentido, os estudos de absorção de água do material
são de grande importância. Foi utilizado um programa pré-definido de análise em TGA, de
acordo com o subcapítulo 3.5.1.1. A análise em TGA dos provetes após períodos de imersão
pré-definidos, foi efectuada nos dois ensaios de degradação in vitro durante 20 e 120 dias,
respectivamente.
Absorção de água de SEVA-C (%)
10
8
6
4
2
0
0
5
10
15
Tempo de imersão (dias)
20
25
Figura 4.4 Percentagem de absorção de água de SEVA-C em função do tempo de imersão, 20 dias
(média de pelo menos 3 resultados em cada amostra). As barras de erro são os intervalos de
confiança de 95% em cada valor médio. Condições da análise: 5ºC/min, Tfinal = 120ºC, tempo
final=110 min.
Pela análise da Figura 4.4, verifica-se que o SEVA-C absorve inicialmente crescentes
quantidades de água, que tendem a estabilizar após 5 dias de imersão em aproximadamente
8%. Este facto poderá estar directamente relacionado com o processo de absorção/libertação
de água durante o período de imersão, característicos deste tipo de materiais e com a
libertação de plasticizadores que ocorre nos primeiros dias de imersão. Após este período (5
DEGRADAÇÃO IN-VITRO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |129
dias), não se registam alterações apreciáveis, não ocorrendo alterações ao nível da absorção
de água pelo material.
Absorção de água de SEVA-C
(%)
10
8
6
4
2
0
0
20
40
60
80
100
120
Tempo de imersão (dias)
Figura 4.5 Percentagem de absorção de água de SEVA-C em função do tempo de imersão, 110 dias
(média de pelo menos 3 resultados em cada amostra). As barras de erro são os intervalos de
confiança de 95% em cada valor médio. Condições da análise: 5ºC/min, Tfinal = 120ºC, tempo
final=110 min.
Os resultados em TGA demonstram que SEVA-C tem uma capacidade de absorção de água
de aproximadamente 7% (p/p) até 60 dias de imersão, devido ao seu carácter hidrofílico. As
pequenas variações que se registam na massa água/peso seco podem ser devidas à
microestrutura interna ser bastante compacta, não permitindo grandes variações na massa
de água absorvida/adsorvida e portanto na porosidade. Após 2 meses de imersão, a
percentagem de absorção de água aumentou até 10% e tende a estabilizar até ao final do
ensaio. Este fenómeno pode estar relacionado com a degradação do material, principalmente
com o aumento da porosidade superficial ao longo do tempo de imersão (Figura 4.3). O
aumento da porosidade conduz a um aumento da absorção de água, responsável pelo
aumento da velocidade de degradação dos materiais.
A água pode também actuar como lubrificante da matriz polimérica, aumentando assim a
quantidade de água absorvida para tempos de imersão crescentes. As amostras menos
cristalinas têm maior capacidade de absorção de água, devido ao maior número de grupos
hidroxilo. Ao degradar, o número de grupos hidrofílicos aumenta, aumentando assim a
quantidade de água adsorvida.
RESULTADOS E DISCUSSÃO |130
O conhecimento do comportamento superficial de um biomaterial em contacto com o meio é
de grande importância nas interacções de um material com os tecidos circundantes,
principalmente quando aplicado numa aplicação biomédica específica. Estes parâmetros são
determinados, geralmente por experiências de molhabilidade, pela técnica de gota séssil. Na
análise morfológica superficial do material foram efectuadas medições da variação do ângulo
de contacto pelo método da gota séssil, ao longo do tempo de imersão. Foi utilizada água
como líquido teste (líquido polar), avaliando o grau de molhabilidade da superfície. As
variações registadas ao longo do tempo de imersão encontram-se na Figura 4.6.
Ângulo contacto (º)
100
80
60
40
20
0
0
20
40
60
80
100
120
Tempo de imersão (dias)
Figura 4.6 Variação do ângulo de contacto medido com água em SEVA-C, em função do tempo de
imersão (medições efectuadas em amostras secas).
Os resultados das medições do ângulo de contacto praticamente não variam durante todo o
tempo de imersão, 110 dias. Como não se registaram alterações no carácter polar da
superfície, não foram efectuadas medições com outros líquidos, para determinação dos
valores de tensão e energia hidrofóbica superficial.
Pelos resultados anteriores, é provável que não haja alterações da fase amorfa do amido
durante o ensaio, pois caso ocorresse libertação deste polímero, a superfície tornar-se-ia mais
hidrofóbica pela perda de grupos hidrofílicos, alterando assim o carácter polar da superfície.
Durante os ensaios de degradação foi utilizada a técnica de espectroscopia de infravermelho,
para avaliar possíveis alterações de grupos funcionais em solução. Tal como descrito no
capítulo de Materiais e Métodos, subcapítulo 3.4.3, para tempos de imersão pré-definidos, as
soluções de degradação foram liofilizadas e analisadas em espectroscopia de infravermelho.
Foram efectuados alguns testes preliminares ao provete em degradação, tendo sido obtida
DEGRADAÇÃO IN-VITRO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |131
uma transmitância baixa, devido à elevada absorção característica deste tipo de materiais,
apesar das análises terem sido efectuadas em filmes bastante finos de material. O espectro
de infravermelho da mistura polimérica SEVA-C, fornece assim poucas informações da
estrutura química deste material, podendo dever-se ao facto desta mistura polimérica se
apresentar sob a forma de uma rede interpenetrada (IPN), e com um grande número de
grupos funcionais activos. Como resultado, o espectro de infravermelho apresenta forte
sobreposição de bandas características de diversos grupos funcionais. Efectuaram-se assim
análises da solução de degradação para tempos de amostragem pré-definidos, sendo a
solução liofilizada para evitar a sobreposição no espectro das bandas de OH características
da água. O objectivo nesta análise não é quantificar e identificar as bandas de absorção, mas
estabelecer uma base comparativa e relativa entre amostras imersas em diferentes tempos
de imersão, fixando a quantidade de solução liofilizada em cada amostra.
A análise baseou-se na identificação e na formação/desaparecimento de grupos funcionais
por efeito do tempo de imersão, e comparação do tamanho e forma das bandas
características de absorção. O espectro de IR de 3 amostras liofilizadas em diferentes tempos
de imersão: controlo (solução isotónica sem provete) e solução de degradação após 2 e 13
dias de imersão, encontra-se na Figura 4.7.
Controlo
2 dias
13 dias
Figura 4.7 Espectro IR do controlo e das soluções de degradação após 2 e 13 dias de imersão.
RESULTADOS E DISCUSSÃO |132
As diferenças entre o controlo e as soluções de degradação em diferentes tempos de imersão
situam-se entre 850 e 1150 cm-1 e 2850 e 2920 cm-1, características dos grupos carbonilo (CO) e metilo (CH), respectivamente. No controlo estas bandas não aparecem, podendo ser um
sinal da degradação parcial do material na solução.
O provete quando imerso em solução liberta automaticamente pequenas cadeias carbonadas
para a solução, registando-se o aparecimento de novos grupos funcionais, que aumentam ao
longo do tempo de imersão. O espectro da Figura 4.8 mostra a diferença das bandas de
absorção entre as soluções de degradação, para tempos de imersão entre 0 e 21 dias.
Figura 4.8 Espectro IR das soluções de degradação: (A) controlo, (B) após 0,5 dias de imersão, (C)
após 6 dias de imersão, (D) após 16 dias de imersão e (E) após 21 dias de imersão.
Os resultados deste espectro confirmam os resultados anteriores, em que, ao aumentar o
tempo de imersão aumenta a absorção das bandas características entre 850 e 1150 cm-1 e
2850 e 2920 cm-1, aumentando assim a libertação de cadeias carbonadas por efeito da
solução de degradação. É provável que estas cadeias carbonadas correspondam à
degradação da fase amorfa do material ou libertação de cadeias dispersas da matriz
polimérica, formadas durante o processamento a elevadas temperaturas, que conduzem ao
aparecimento de novos grupos funcionais em solução.
Na tentativa de identificação destes grupos, efectuou-se uma análise comparativa com o
espectro do padrão de amido, utilizando o método de interpretação positiva, que se baseia na
DEGRADAÇÃO IN-VITRO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |133
comparação da intensidade relativa de bandas características, podendo fornecer informação
da quantidade e identidade de um grupo funcional específico. A comparação entre os
espectros das soluções de degradação e do padrão de amido encontra-se na Figura 4.9:
2 dias
13 dias
amido
Figura 4.9 Espectro IR do padrão de amido e das soluções de degradação após 2 e 13 dias de
imersão.
Comparando os espectros das soluções de degradação e do padrão de amido, nas zonas
situadas 850 e 1150 cm-1 e 2850 e 2920 cm-1, verifica-se que as bandas são semelhantes ao
padrão de amido e portanto características destas moléculas. Ao aumentar o tempo de
imersão, aumenta a concentração de açúcares nas soluções de degradação, diminuindo a
transmitância destas bandas. Estes resultados são importantes, podendo induzir a
degradação da fase amorfa do material, pelo aumento dos açúcares em solução.
4.2.2 Avaliação da degradação in-vitro de SEVA-C
De forma a identificar possíveis produtos de degradação de SEVA-C em solução, foram
realizadas análises complementares. Juntamente com a capacidade de absorção de água, os
testes de degradação são importantes para determinar o tempo de vida de um polímero
biodegradável quando implantado.
A libertação de glicerol utilizado como plasticizador, nas soluções de degradação foi
quantificado por cromatografia de troca aniónica nos dois ensaios realizados, sendo os
resultados obtidos apresentados nas Figura 4.10 e Figura 4.11:
massa de glicerol libertado/massa
inicial provete (%)
RESULTADOS E DISCUSSÃO |134
10
8
6
4
2
0
0
5
10
15
20
25
Tempo de imersão (dias)
massa de glicerol libertado/ massa
inicial de provete (%)
Figura 4.10 Massa de glicerol libertado para a solução por massa inicial de provete (1.6 g) em 50 ml
de solução, em função do tempo de imersão (20 dias).
12
10
8
6
4
2
0
0
20
40
60
80
100
120
Tempo de imersão (dias)
Figura 4.11 Massa de glicerol libertado para a solução por massa inicial de provete (1.6 g) em 50 ml
de solução, em função do tempo de imersão (110 dias).
Em ambos os ensaios, a libertação de glicerol para a solução aumenta nos primeiros dias de
imersão, estabilizando posteriormente até ao final do ensaio. O provete quando imerso em
solução, liberta automaticamente o plasticizador para a solução por um fenómeno físico de
solubilidade. A massa de glicerol libertado para a solução por massa inicial de provete é de
aproximadamente 10%, para tempos de imersão mais longos. Este é o principal composto
libertado para a solução, uma vez que corresponde praticamente à quantidade de água total
absorvida pelo provete, fornecida pela curva de TGA (Figura 4.5).
DEGRADAÇÃO IN-VITRO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |135
A percentagem de massa de amido libertado para a solução por massa inicial de provete é
bastante baixa, em ambos os ensaios (Figura 4.12 e Figura 4.13).
g amido/g provete (%)
0,03
0,025
0,02
0,015
0,01
0,005
0
0
5
10
15
20
25
Tempo de imersão (dias)
massa de amido libertado/massa
inicial de provete (%)
Figura 4.12 Massa de amido libertado para a solução por massa inicial de provete (1.6 g) em 50 ml
de solução, em função do tempo de imersão (20 dias).
0,01
0,0075
0,005
0,0025
0
0
20
40
60
80
100
120
Tempo de imersão (dias)
Figura 4.13 Massa de amido libertado para a solução por massa inicial de provete (1.6 g) em 50 ml
de solução, em função do tempo de imersão (120 dias).
Após dois meses de imersão esta quantidade aumentou ligeiramente, até 0,008%. É pouco
provável que o amido que se encontra no interior da fase amorfa seja libertado para a
solução isotónica, porque é uma molécula formada por cadeias longas de carbohidratos,
libertando-se apenas pequenas cadeias poliméricas para a solução por efeito de difusão.
Provavelmente, a amilose encontra-se entrecruzada com o EVOH e com a amilopectina,
RESULTADOS E DISCUSSÃO |136
pouco acessíveis à difusão. A fase amorfa libertada para a solução deve corresponder a
pequenas cadeias de carboidratos, constituídas por açúcares mais reduzidos, não ocorrendo
decomposição do amido nas condições do ensaio. É também necessário considerar que o
método utilizado para o doseamento do amido em solução fornece apenas uma análise
qualitativa do amido em solução, porque o iodo em solução reage apenas com parte da
molécula de amido (aproximadamente onze moléculas de glucose) em forma de hélices onde
o iodo se combina, podendo assim existir maior quantidade de amido em solução, mas que
não se encontra acessível à reacção com iodo. As pequenas cadeias de amido ou fragmentos
de açúcar hidrolisados em solução, não são quantificados por este método.
Para quantificação dos açúcares redutores em solução foi utilizado o método do ácido 3,5
massa de glucose libertada/massa
inicial de provete (%)
dinitrossalicílico, de acordo com o subcapítulo 3.5.6.
0,2
0,16
0,12
0,08
0,04
0
0
20
40
60
80
100
120
Tempo de imersão (dias)
Figura 4.14 Massa de glucose libertada para a solução por massa inicial de provete (1.6 g) em 50 ml
de solução, em função do tempo de imersão.
A quantidade de açúcares redutores libertada para a solução é bastante baixa,
comparativamente à massa inicial de provete. A quantidade mantém-se mais ao menos
constante e igual a 0,15% aproximadamente, ao longo de todo o tempo de imersão. O provete
quando imerso em solução liberta automaticamente por difusão pequenas cadeias
carbonadas de açúcar, que se encontram dispersas na matriz polimérica, resultantes
provavelmente da degradação térmica durante o processamento do material e não da
degradação hidrolítica por efeito da solução isotónica.
DEGRADAÇÃO IN-VITRO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |137
De forma a quantificar os polissacarídeos totais em solução, foi utilizado o método Dubois
(subcapítulo 3.5.5). A percentagem de massa de polissacarídeos libertados para a solução,
aumentou desde o início em ambos os ensaios como consequência da degradação química,
mas esta quantidade é bastante baixa, aproximadamente 0,13%, até ao final do ensaio.
g polissacarídeos/g provete (%)
0,15
0,1
0,05
0
0
5
10
15
20
25
Tempo de imersão (dias)
massa de políssacarídeos
libertados/massa inicial provete
(%)
Figura 4.15 Massa de polissacarídeos totais libertados para a solução por massa inicial de provete
(1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão (20 dias).
0,2
0,16
0,12
0,08
0,04
0
0
20
40
60
80
100
120
Tempo de imersão (dias)
Figura 4.16 Massa de polissacarídeos totais libertados para a solução por massa inicial de provete
(1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão (120 dias).
Estes resultados juntamente com a análise analítica do amido, confirmam que se libertam
para a solução apenas pequenas cadeias de carbohidratos dispersas na matriz polimérica, e
que correspondem aproximadamente à quantidade de açúcares redutores libertados em
RESULTADOS E DISCUSSÃO |138
solução (Figura 4.14), não sendo afectada a fase amorfa (amido) do material, pelo efeito do
processo de degradação em solução isotónica.
Durante as análises em HPAEC-PAD para a quantificação do glicerol e separação de
carboidratos nas soluções de degradação, não foram detectados dissacarídeos e
monossacarídeos incluindo maltodextrina nas soluções de degradação, ao longo de todo o
tempo de imersão, confirmando os resultados anteriores. Como a amilopectina é constituída
por maltodextrina, este facto reforça a ideia que a amilopectina deve libertar-se a uma taxa
mais lenta que a amilose, devido à ramificação da cadeia. Isto significa que não ocorreu
decomposição do amido, nas condições do ensaio. No entanto, é possível que na presença
de um tecido vivo com actividade enzimática como por exemplo o plasma, possa ocorrer
hidrólise metabólica do amido estrutural, devido à presença de amílase, enzima com
capacidade de actuar sobre a molécula de amido.
A comparação das curvas entre a percentagem de absorção total de água determinada por
TGA e a soma de todos os compostos quantificados em solução, para os dois ensaios tem o
seguinte comportamento:
massa libertada/massa
inicial provete (%)
10
8
6
4
2
0
0
5
10
15
20
25
Tempo de imersão (dias)
% absorção água
glicerol+amido+polissacarídeos
Figura 4.17 Comparação entre a massa de todos os compostos libertados para a solução por massa
inicial de provete (1.6 g) em 50 ml de solução, e a percentagem de absorção de água em função do
tempo de imersão (20 dias).
DEGRADAÇÃO IN-VITRO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |139
massa libertada/massa inicial
provete (%)
12
8
4
0
0
20
40
60
80
100
120
Tempo de imersão (dias)
glicerol+amido+polissacarídeos
% absorção água
Figura 4.18 Comparação entre a massa de todos os compostos libertados para a solução por massa
inicial de provete (1.6 g) em 50 ml de solução, e a percentagem de absorção de água em função do
tempo de imersão (120 dias).
A percentagem de massa de água absorvida pelo provete corresponde aproximadamente à
perda de massa de todos compostos quantificados em solução, ao longo do tempo de
imersão. A percentagem de perda de compostos em solução é constituída principalmente
pelo glicerol. Os compostos ao libertar-se vão conduzir a um aumento da percentagem de
absorção de água do sistema polimérico. Os restantes produtos de degradação
correspondem a cadeias de baixo peso molecular, aproximadamente 0,14%. No ensaio mais
longo (Figura 4.18), existe um desvio na comparação das curvas, podendo ser atribuído ao
método de quantificação de polissacarídeos em solução. Neste método há libertação de uma
molécula de água durante a reacção, não contabilizada pelo método, o que pode conduzir a
menor quantidade quantificada em solução no final da análise.
Para caracterizar a composição interna dos provetes antes dos ensaios de degradação em
solução fisiológica, foi efectuada uma extracção total em Soxtec, (subcapítulo 3.5.7) para
remoção de todas as matérias solúveis, tal como aditivos, utilizando água como meio
extractor durante 12 horas. O principal objectivo deste procedimento é provocar uma
degradação severa em tempos curtos, que simulam tempos de imersão mais longos. As
soluções de degradação resultantes da extracção em soxtec foram analisadas quanto ao
conteúdo em glicerol e carbohidratos em HPAEC-PAD. A quantidade máxima de glicerol
extraído foi de aproximadamente 13±3%/massa de provete inicial. Os resultados obtidos da
percentagem de glicerol durante os ensaios de degradação (Figura 4.10 e Figura 4.11)
CONCLUSÕES |140
indicam a libertação de aproximadamente 10% de massa glicerol/massa provete inicial. A
comparação de resultados sugere que nem todo o glicerol terá sido libertado do provete,
ficando uma quantidade residual no seu interior. Durante o processo de extracção total foram
também libertados carboidratos, de acordo com a Figura 4.19.
Figura 4.19 Cromatograma de provete SEVA-C após extracção total em soxtec durante 12 horas.
A comparação do cromatograma obtido com padrões de derivados de glucose, permitiu a
identificação de maltodextrina. Os restantes picos devem ser derivados de dextrinas,
resultantes da degradação da fase amorfa (amido) do material. Mais uma vez é confirmada a
não degradação da fase amorfa, permanecendo inalterada no interior do material, durante
todo o ensaio de degradação.
4.3 Conclusões
Na análise dos resultados relativos à degradação in-vitro de SEVA-C em solução isotónica
podem ser identificadas 3 fases distintas. A primeira, entre 0 e 3-4 dias, está relacionada
com o fenómeno físico de libertação de plasticizadores adicionados à formulação do material
e outros produtos de degradação, tais como cadeias poliméricas de baixo peso molecular
para a solução (resultantes da degradação termo-oxidativa no processamento), assim como a
acção lubrificante da água (aumento da percentagem de água estrutural). A libertação destes
materiais tem como primeira consequência a perda de massa do material. O efeito do
DEGRADAÇÃO IN-VITRO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |141
plasticizador, é compensado pelo efeito lubrificante da água na estrutura do material. Após os
primeiros dias durante os quais ocorre a libertação de plasticizador como principal
ocorrência, existe um período sem perda de peso significativa (entre 4 e 30 dias). Após este
período (cerca de 60 dias) as cadeias de baixo peso molecular começam a espalhar-se na
solução, resultantes de pequenas degradações da matriz polimérica responsáveis pela perda
de peso observada. Durante os restantes estados do período testado existe uma estabilização
da taxa de degradação, atribuída possivelmente ao ataque do complexo amilose-EVOH,
menos susceptível à degradação. Após extracção física das pequenas cadeias moleculares e
de plasticizador, deve ocorrer a degradação química do material. Embora a perda de massa
não seja significativa, esta fase final pode significar o início da fragmentação da estrutura
polimérica.
O SEVA-C tem uma capacidade de absorção média de 7% (p/p) até 60 dias de imersão. Após
2 meses a percentagem de absorção de água aumentou até 10%, estabilizando
posteriormente. Este facto poderá estar directamente relacionado com a libertação de
plasticizadores que ocorre nos primeiros dias de imersão e com o aumento da porosidade,
por efeito da solução de imersão.
As variações na microestrutura superficial de SEVA-C podem ser caracterizadas por um
aumento da porosidade, rugosidade superficial e alteração da textura ao longo do tempo de
imersão. O número e tamanho dos poros foi aumentando ao longo do tempo de imersão e
para tempos de imersão mais longos, os poros foram alargando formando fissuras na
superfície do material.
Por análise em espectroscopia de infravermelho foi confirmado o aparecimento de novos
grupos funcionais associados à libertação de cadeias carbonadas em solução, em função do
tempo de imersão. Por comparação com o espectro do padrão de amido é possível que estas
cadeias carbonadas correspondam a moléculas características de açúcares.
Do ponto de vista físico-químico a degradação do material está associada principalmente à
libertação de glicerol, não se libertam outros metabolitos em quantidades apreciáveis, a
quantidade de amido e polissacarídeos em solução é de aproximadamente 0,14%,
relativamente à massa inicial de provete. Após a libertação do plasticizador, o material
encontra-se mais susceptível à degradação, podendo verificar-se maiores variações na fase
amorfa, o que não se verificou. Nas condições do ensaio realizado não ocorreu degradação
da fase amorfa do amido, devido à ”dificuldade” de difusão hidrolítica das cadeias longas de
BIBLIOGRAFIA |142
carboidratos do interior para o exterior da matriz. A fase amorfa libertada para a solução
corresponde a pequenas cadeias de carboidratos dispersas na matriz polimérica, constituídas
por açúcares mais reduzidos.
O conhecimento dos principais mecanismos de degradação e o seu controlo, são importantes
na produção de materiais com propriedades mecânicas e de degradação adequadas em
aplicações biomédicas temporárias.
4.4 Bibliografia
Andriano KP, Pohojen T, Tomalla P (1994) Processing and characterization of absorbable
polylactide polymers for use in surgical implants. J.Appl.Biomater, 133Bastioli, C., Belloti, V., Del Giudice, L., De Tredici, G., Lombi, R., Rallis A. (1990). PCT Int
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DEGRADAÇÃO IN-VITRO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |143
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and mechanisms. Jellinek HHG(eds), Elsevier, 469
CAPITULO 5
ESTUDOS DE DIFUSÃO DE MISTURAS
TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO EM
SOLUÇÃO FISIOLÓGICA SIMULADA
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
5. ESTUDOS DE DIFUSÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS
À BASE DE AMIDO EM SOLUÇÃO FISIOLÓGICA SIMULADA
SUMÁRIO
Têm sido investigadas várias metodologias para a produção de sistemas de libertação controlada de
fármacos, durante um longo período de tempo.
Nas estruturas de suporte à base de amido de milho a porosidade tem grande influência na cinética
de libertação, sendo possível controlar o perfil de libertação variando a porosidade. A libertação é
controlada inicialmente por difusão e numa segunda fase pela degradação da matriz.
Neste capítulo apresenta-se a determinação dos coeficientes de difusão de 2 componentes (glicerol e
glucose) em provetes SEVA-C que fazem parte da sua composição, variando a espessura de material.
A variação do número de provetes em cada ensaio teve como objectivo o estudo da possível influência
da espessura dos provetes, no processo de libertação por desorção dos compostos numa placa plana,
e a avaliação dos parâmetros cinéticos de difusão correspondentes. Os coeficientes de difusão,
ignorando a existência de resistências externas à transferência de massa, foram calculados pela
resolução analítica da equação diferencial parcial de difusão, utilizando a transformada de Laplace.
A quantidade de açúcares redutores libertada para a solução permaneceu mais ao menos constante e
baixa para todos os ensaios realizados. A não libertação de polissacarídeos totais para a solução
poderá estar associada à composição e baixa porosidade do material. O único composto libertado
para as soluções de degradação foi o glicerol, libertando-se rapidamente nos primeiros dias de
imersão e estabilizando posteriormente até ao final dos ensaios, apresentando um coeficiente de
difusão mais elevado que a glucose.
As alterações no coeficiente de difusão ao longo dos ensaios estão directamente associadas com a
espessura do material, variando na razão directa da espessura. Os valores encontram-se bem
ajustados às equações teóricas, tal como demonstrado pelos valores do coeficiente de correlação (R2)
obtidos.
5.1
INTRODUÇÃO
149
5.2
MATERIAIS E MÉTODOS
152
5.3
RESULTADOS E DISCUSSÃO
158
5.4
CONCLUSÕES
166
5.5
BIBLIOGRAFIA
167
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
ESTUDOS DE DIFUSÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO EM SOLUÇÃO FISIOLÓGICA SIMULADA |149
5.1 Introdução
Têm sido estudadas misturas termoplásticas biodegradáveis de amido de milho com etilenoálcool vinílico (SEVA-C), sendo potenciais alternativas aos polímeros biodegradáveis utilizados
em aplicações clínicas (Araújo et al., 2004a; Araújo et al., 2001; Araújo et al., 2004b; Reis et
al., 1997e; Reis et al., 1996b; Reis e Cunha, 1995b) devido principalmente às suas
propriedades de biodegradação (Bastioli et al., 1993; Bastioli et al., 1994b; Bastioli et al.,
1990a; Bhattarcharya et al., 1995; Griffin, 1994), à sua biocompatibilidade com os tecidos
orgânicos e à semelhança com o comportamento mecânico dinâmico do osso. Como
biomaterial, o SEVA-C é composto por uma molécula natural de amido, geralmente
biodegradável, barato e disponível em elevadas quantidades como matéria-prima. Nesta
mistura, a fase amorfa (amido) é degradada enzimaticamente, tal como foi demonstrado em
ensaios realizados na presença de α-amílase (Araújo et al., 2004b) (ver Capítulo 6).
O glicerol é utilizado como plasticizador na mistura, sendo absorvido pelas duas fases, o
copolímero de amido de milho e o etileno-álcool vinílico. Em trabalhos anteriores concluiu-se
que, do ponto de vista físico-químico, a degradação da mistura está principalmente associada
à libertação de glicerol, não se libertando outros compostos para a solução de degradação,
como por exemplo carboidratos (Araújo et al., 2004b) (ver Capítulo 4).
De uma forma geral, um sistema polimérico utilizado em aplicações clínicas deve obedecer a
determinados requisitos (Visser et al., 1996), sendo a degradabilidade polimérica um dos
factores mais importantes para a aceitação ou não dos polímeros no campo biomédico
(Williams, 1992).
Actualmente, existem vários polímeros biodegradáveis naturais modificados e sintéticos
utilizados em próteses ortopédicas temporárias, tais como: colagénio reconstituído, fibrina,
poli(ácido glicolítico) e poli(ácido láctico). A utilização de polímeros biodegradáveis pode ser
benéfica em determinadas aplicações, mas é necessário avaliar a toxicidade dos produtos de
degradação e a influência da degradação da matriz na velocidade de libertação, antes da sua
aplicação efectiva (Kim et al., 1980). O material biodegradável deve ser desenvolvido com
uma taxa de degradação adequada, mantendo a resistência da estrutura de suporte até ao
crescimento do novo tecido sobre o suporte sintético (Gomes et al., 2001b; Maquet e
Jerome, 1997; Thomson et al., 1995b; Zhang e Ma, 1999). Além disso, o processo de
INTRODUÇÃO |150
degradação de um polímero biodegradável e os efeitos dos produtos de degradação
correspondentes no corpo, são fundamentais para a função do biomaterial a longo prazo
(Gomes et al., 2001b).
O sucesso da aplicação de biomateriais em engenharia de tecido ósseo depende das
propriedades específicas da estrutura de suporte. Os requisitos mínimos da estrutura de
suporte devem incluir a degradabilidade, biocompatibilidade, elevada área superficial/volume
e integridade mecânica. O principal objectivo é desenvolver um material de suporte
biocompatível, biodegradável em produtos de degradação não tóxicos que desaparecem ao
mesmo tempo que se forma o novo osso e a uma taxa controlada, sendo portanto substituído
pelo novo tecido natural (Malafaya et al., 2002a; Malafaya et al., 2002b; Murphy et al.,
2000).
Têm sido investigadas várias metodologias para produção de sistemas de libertação
controlada, durante um longo período de tempo (Chidambaram et al., 1998; Colombo et al.,
1990; Colombo et al., 1992; Qiu et al., 1998; Vaz et al., 2003a; Vaz et al., 2003b). A
libertação controlada dos componentes pode ser assegurada utilizando polímeros
biodegradáveis como transportadores físicos. A libertação dos componentes da matriz
polimérica é efectuada por difusão e/ou degradação das cadeias poliméricas.
Demonstrou-se que nas estruturas de suporte à base de amido de milho a porosidade tem
grande influência na cinética de libertação, sendo possível controlar o perfil de libertação,
variando a porosidade. A libertação é controlada inicialmente por difusão e numa segunda
fase pela degradação da matriz (Malafaya et al., 2001a).
As cinéticas de libertação de primeira ordem são as mais comuns. No entanto, é necessário
considerar também as cinéticas mais complexas, uma vez que a difusão depende da
degradação da matriz (Kim et al., 1980), e as propriedades físico-químicas dos polímeros
também influenciam as cinéticas de libertação (Baldwin e Saltzman, 1998; Gupta e Kumar,
2000; Yang e Alexandridis, 2000).
A difusão é provavelmente o mecanismo mais importante de transporte de solutos através da
espessura de um material, e é geralmente descrito utilizando um único parâmetro, a
difusividade efectiva (D), que relaciona o gradiente de concentração característica (C), com o
fluxo difusional médio de soluto (J), através da coordenada do objecto em estudo (x). Para
uma solução ideal ou solução diluída, o fluxo (J) reduz-se à primeira lei de Fick:
ESTUDOS DE DIFUSÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO EM SOLUÇÃO FISIOLÓGICA SIMULADA |151
J = −D
dC
dx
(5.1)
onde C é a concentração de soluto no meio e x a coordenada axial.
D não pode ser obtido directamente, uma vez que a concentração de soluto dentro do
material não é conhecida. As concentrações dentro do material podem ser relacionadas com
as concentrações na solução adjacente, pela seguinte equação em estado estacionário:
J = −D
ΔC
l
(5.2)
onde l é a espessura de material.
O processo de transferência de massa por difusão pode ser representado pela segunda lei de
Fick:
∂C
∂ 2C
=D 2
∂t
∂x
(5.3)
A solução da segunda lei de Fick pode ser usada para estimar o coeficiente de difusão.
A transferência de massa ocorre normalmente quando um componente numa mistura migra
de uma fase para outra, devido à diferença de concentração entre as duas fases. O
transporte das espécies permeadas é afectado pelas propriedades de absorção do material,
admitindo que as espécies permeáveis não são miscíveis na fase cristalina e são
transportadas apenas através das regiões amorfas. A tortuosidade e porosidade são factores
físicos que devem ser considerados no estudo da permeação do soluto. Têm sido
considerados normalmente dois mecanismos básicos para caracterizar o transporte de soluto
através de polímeros: os mecanismos por “poro” e de “partição”. No mecanismo por “poro”,
o transporte de soluto ocorre via difusão através de microcanais ou poros dentro da estrutura
polimérica. No mecanismo por “partição”, o transporte de soluto envolve a dissolução do
soluto dentro do polímero, seguido por difusão dentro e entre as cadeias poliméricas (Kim et
al., 1980).
O objectivo deste capítulo é determinar os coeficientes de difusão de 2 componentes (glicerol
e glucose) em provetes SEVA-C de diferentes espessuras e que fazem parte da sua
composição. Os coeficientes de difusão são calculados pela resolução da equação diferencial
parcial de difusão, aplicando transformada de Laplace. Os dados experimentais foram obtidos
medindo a desorção destes compostos nos provetes em solução. Os resultados finais
permitem assim comparar os valores teóricos obtidos pelo modelo com os valores
MATERIAIS E MÉTODOS |152
experimentais, e concluir acerca da aplicabilidade do modelo no cálculo dos parâmetros
cinéticos de difusão.
5.2 Materiais e Métodos
5.2.1 Materiais
O material estudado consistiu numa mistura termoplástica de amido de milho com etilenoálcool vinílico (60/40 mol/mol), SEVA-C. Os provetes utilizados nos ensaios de difusão foram
placas planas de secção quadrada 2x30 mm e massa 1.6 g.
Foram realizados quatro ensaios utilizando 1, 10, 15 e 20 provetes SEVA-C em diferentes
frascos, considerados como ensaios 1, 2, 3 e 4, respectivamente. A Figura 5.1 mostra a
forma como os provetes se encontram distribuídos no interior dos frascos dos ensaios
realizados.
ESTUDOS DE DIFUSÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO EM SOLUÇÃO FISIOLÓGICA SIMULADA |153
(a)
(c)
(b)
(d)
Figura 5.1 Exemplo do ensaio 2 realizado com 15 provetes (a,c), ensaio 3 com 10 provetes (b) e
aspecto geral dos 4 ensaios realizados (d).
A variação do número de provetes em cada ensaio, teve como objectivo o estudo da possível
influência da espessura dos provetes no processo de libertação dos compostos e a avaliação
dos parâmetros cinéticos de difusão correspondentes.
Os provetes SEVA-C, foram imersos durante 30 dias a pH 7.4 e 37±1ºC em tubos individuais
(volume de aproximadamente 50 cm3), em solução de HBSS, sob agitação contínua (150
r.p.m.).
Para tempos de amostragem pré-definidos, foi recolhido 1 ml de solução de cada frasco, e o
frasco eliminado subsequentemente. Os frascos de solução de cada ensaio foram utilizados
apenas para uma única amostragem, de forma a evitar erros devido à diferença de volume de
líquido por amostragem, que poderiam interferir na definição do estado estacionário final.
5.2.2 Métodos analíticos
Os métodos analíticos aplicados para quantificação dos carboidratos nas soluções de
degradação em cada um dos 4 ensaios foram: método colorimétrico para detecção do amido,
polissacarídeos totais (método Dubois) e o DNS (método do ácido 3,5- dinitrossacilíco) para
MATERIAIS E MÉTODOS |154
os açúcares redutores. Estes métodos encontram-se descritos no capítulo de Materiais e
Métodos.
Na separação dos carboidratos e glicerol das soluções de degradação foi utilizada a técnica
de cromatografia líquida, encontrando-se o método descrito no correspondente capítulo de
Materiais e Métodos.
5.2.3 Tratamento dos dados: aproximação analítica
Se as condições hidrodinâmicas que rodeiam as moléculas em solução estiverem bem
caracterizadas, é possível aplicar correlações empíricas para calcular o valor de D. Essas
correlações estão disponíveis apenas para geometrias bem definidas, isto é, esfera, cilindro
infinito e placa plana, e com condições hidrodinâmicas bem caracterizadas. A solução das
correlações depende, entre outros factores, da geometria do objecto em estudo e das
condições fronteira.
Neste trabalho variou-se a espessura dos provetes, tal como descrito anteriormente, de forma
a avaliar a sua influência nos perfis de concentração de desorção da placa e nos coeficientes
cinéticos de difusão correspondentes.
O modelo de Fick é aplicado a sistemas de difusão passiva onde os coeficientes de difusão se
mantêm constantes, sem ocorrer modificação das propriedades do polímero durante a
libertação.
O processo de transferência de massa por difusão através da espessura de cada placa em
suspensão, assumindo que a solução se encontra bem misturada, e as concentrações dos
componentes são as mesmas que na superfície do material e em solução, pode ser
representado pela equação de difusão de Fick:
∂C´
∂ 2 C´
=D 2
∂t
∂x
(5.4)
onde C´ é definido por:
C´(t) = C – C(t)
0
C(t) é a concentração de soluto no meio no tempo t, C é a concentração inicial de soluto na
0
superfície da placa e D o coeficiente de difusão. A placa ocupa o espaço –l ≤ x ≤ l
(coordenada axial) sendo 2l a espessura de material
Para o problema de desorção da placa as condições iniciais e fronteira são:
t = 0, -l < x < l
C´(t) = C0
ESTUDOS DE DIFUSÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO EM SOLUÇÃO FISIOLÓGICA SIMULADA |155
t > 0, x = ± l
t > 0, x = 0
a
∂C´
∂C´
= ±D
∂x
∂t
∂C´
=0
∂x
A segunda condição implica uma mistura perfeita da fase líquida que rodeia as partículas,
isto é, não existe resistência externa à transferência de massa, se for possível manter uma
agitação suficiente para considerar perfeita a mistura em torno das partículas.
Para este conjunto de condições, e assumindo a geometria da placa plana, a solução
analítica da equação 5.4 utilizando a transformada de Laplace (Crank, 1975) é a seguinte:
∞
⎛ − Dqn 2 t ⎞
C´t
2α (1 + α )
⎟
⎜
exp
= 1− ∑
2
2
⎜ l2 ⎟
C´∞
n =1 1 + α + α .q n
⎠
⎝
(5.5)
C´ e C´∞ são as concentrações de soluto no meio no tempo t e t∞, respectivamente.
t
q são as raizes positivas não nulas de:
n
tan(qn) + α qn = 0
Alfa (α) é definido como a razão entre os volumes de solução (a) e da placa (l), tal como
elucidado na Figura 5.2.
Figura 5.2 Dimensões (l, a) para as placas planas no interior do tubo.
Foram estudadas as cinéticas de libertação de glucose e glicerol para a solução, nos
diferentes ensaios, durante 30 dias de imersão. Cada ensaio contém um número diferente de
provetes a que corresponde diferentes valores de alfa e espessuras (Tabela 5.1).
MATERIAIS E MÉTODOS |156
Tabela 5.1 Valores de alfa (α) e metade da espessura (l) em cada ensaio.
Ensaios
1
2
3
4
α
49.0
4.0
2.33
1.50
l (m)
0.0015
0.0115
0.01725
0.0230
Foram determinados os valores de desorção dos compostos libertados pela placa para cada
tempo de imersão, variando a espessura do material, utilizados no cálculo dos parâmetros
cinéticos de difusão.
Os valores do coeficiente de difusão (D) para a glucose e glicerol foram determinados através
da solução analítica da lei de Fick de difusão (equação 5.5), ignorando a existência de
resistências externas à transferência de massa. No cálculo, foi aplicado o método dos
mínimos quadrados, utilizando como critério a soma dos quadrados dos resíduos entre os
valores calculados e os valores medidos. Quanto mais próximo o perfil teórico for do
experimental, mais correcto é o valor de D arbitrado inicialmente.
O esquema seguinte mostra um exemplo da rotina de cálculo de cada um dos parâmetros.
ESTUDOS DE DIFUSÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO EM SOLUÇÃO FISIOLÓGICA SIMULADA |157
Ler dados de ficheiro
(t, C't )
l, α, D
SSE=0
Calcular as 6 raízes
periódicas de
tan(qn)+αq n=0
Para todos os pontos
Não
y = C' t/C' ∞
y* = (C't /C' ∞)model
(eq. 5 com somente 6 termos no
sumatório)
SE = (y - y*)2
SSE = SSE + SE
Fim dos dados
Não
Sim
"nonlinfit" (min SSE) para obter D
"nlparci" para calcular 95% Intervalo de
Confiança e R 2
Figura 5.3 Esquema de cálculo dos coeficientes de difusão a partir da equação 5.5, utilizando a
função de minimização dos quadrados.
A função “nonlinfit” das ferramentas estatísticas de programa Matlab 6.5 (Mathworks,
USA) foi utilizada como estimativa do parâmetro no modelo não linear. Esta função determina
o parâmetro (D) que minimiza a soma quadrática das diferenças entre os valores medidos e
RESULTADOS E DISCUSSÃO |158
os valores calculados. Foi utilizado o algoritmo de Gauss-Newton com modificações de
Levenberg-Marquart para a convergência global. A função “nlparci” foi usada para
obtenção dos intervalos de confiança de 95% do parâmetro estimado, baseada na distribuição
assimptótica normal do parâmetro (Bates e Watts, 1988). Foi calculado o coeficiente de
correlação, R2, para quantificar a variação da variável dependente na curva de regressão.
O modelo descrito assume:
- Que a placa se encontra em suspensão num volume de solução tão elevado, que a
quantidade de soluto libertado pela placa é uma fracção desprezável relativamente à
totalidade, e que a solução se encontra bem agitada, isto é, a concentração na solução
mantém-se constante.
- Que a solução se encontra bem agitada, de tal forma que a concentração na solução
depende apenas do tempo, sendo determinada principalmente pela condição que a
quantidade total de soluto na solução e na placa se mantém constante à medida que ocorre
difusão.
- Que a concentração de soluto na superfície da placa é a mesma que na solução.
5.3 Resultados e Discussão
5.3.1 Amido na solução de degradação
Tal como descrito anteriormente, para estimar os coeficientes de difusão de glucose e
glicerol, foi necessário avaliar a libertação destes compostos em provetes SEVA-C para as
soluções de degradação. Os compostos analisados consistiram basicamente em sacarídeos e
glicerol, tendo sido utilizados métodos de análise apropriados no cálculo dos coeficientes.
Foi quantificado o amido em solução no ensaio 1 em função do tempo de imersão, de forma
a avaliar a libertação deste composto pelo provete para a solução agitada. A Figura 5.4
mostra a concentração de amido libertado para a solução para o primeiro ensaio, onde foi
utilizado apenas 1 provete. Os resultados (Figura 5.4) evidenciam uma quantidade muito
baixa de amido em solução.
ESTUDOS DE DIFUSÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO EM SOLUÇÃO FISIOLÓGICA SIMULADA |159
[Amido] (mg/l)
3
2
1
0
0
5
10
15
20
25
30
35
Tempo de imersão (dias)
Figura 5.4 Concentração de amido em 50 ml de solução do ensaio 1, em função do tempo de
imersão. Cada valor representa a média de 2 duplicados (4 valores na totalidade).
Tal como esperado, as macromoléculas de amido presentes no material têm dificuldade em
difundir, permanecendo no interior dos domínios semi-cristalinos da mistura. A libertação de
amido da superfície para o meio é limitada pela baixa porosidade do material, e também pelo
facto das moléculas de amido se encontrarem fortemente interligadas com o componente
sintético insolúvel. Esta estrutura interpenetrada do amido e etileno-álcool vinílico reduz a taxa
de hidrólise, devido à presença do copolímero de etileno e à sua conformação na estrutura do
material. Tal como esperado, não ocorreu degradação do material de SEVA-C, como resultado
da limitação estrutural do material à degradação. Aplicando o teste t Student aos resultados
experimentais não se verificaram diferenças significativas, sendo pequena a variação dos
valores médios para um intervalo de confiança de 95%.
Não foi determinada a concentração de amido nos restantes ensaios, em virtude da não
ocorrência de difusão de amido para a solução neste ensaio.
5.3.2 Sacarídeos e glicerol em solução
A glucose difunde dos provetes SEVA-C para a solução, ao longo do tempo de imersão, de
acordo com os perfis de concentração das Figura 5.5 a Figura 5.7. As figuras mostram as
curvas obtidas a partir dos três métodos analíticos aplicados: quantificação de polissacarídeos
totais, DNS e HPLC, permitindo a comparação entre os diferentes métodos por quantificação
dos sacarídeos em solução.
RESULTADOS E DISCUSSÃO |160
2
[Sacarídeos] (g/l)
1,6
1,2
0,8
0,4
0
0
5
10
15
20
25
30
35
Tempo de imersão (dias)
Figura 5.5 Concentração de polissacarídeos em 50 ml de solução, para o ensaio 1(■), 2 ( ) e 3(▲),
em função do tempo de imersão. Cada valor representa a média de 2 duplicados (4 valores na
totalidade); as barras de erro são os intervalos de confiança para 95% de cada média de resultados.
2
[Sacarídeos] (g/l)
1,6
1,2
0,8
0,4
0
0
5
10
15
20
25
30
35
Tempo de imersão (dias)
Figura 5.6 Concentração de glucose obtida pelo método DNS em 50 ml de solução, para o ensaio
1(■), 2( ) e 3(▲), em função do tempo de imersão. Cada valor representa a média de 2 duplicados
(4 valores na totalidade); as barras de erro são os intervalos de confiança para 95% de cada média de
resultados.
ESTUDOS DE DIFUSÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO EM SOLUÇÃO FISIOLÓGICA SIMULADA |161
2
[Sacarídeos] (g/l)
1,6
1,2
0,8
0,4
0
0
5
10
15
20
25
30
35
Tempo de imersão (dias)
Figura 5.7 Concentração de glucose obtida por HPLC em 50 ml de solução, para o ensaio 1(■), 2( )
e 3(▲), em função do tempo de imersão. Cada valor representa a média de 2 duplicados (4 valores
na totalidade); as barras de erro são os intervalos de confiança para 95% de cada média de
resultados.
Os três métodos utilizados para quantificar os açúcares redutores nas soluções de
degradação conduziram a resultados semelhantes: a quantidade de sacarídeos em solução
permanece mais ao menos constante e baixa ao longo dos ensaios, não ocorrendo hidrólise
da placa para as soluções de degradação.
Durante a análise em cromatografia líquida para separação e quantificação dos sacarídeos
em solução, foram detectados apenas maltose e glucose como sacarídeos em pequenas
quantidades. Estes resultados são uma consequência da dificuldade de difusão das fracções
de baixo peso molecular e pequenas moléculas difundirem dos domínios internos fortemente
interpenetrados na mistura para a solução.
Comparando as curvas das Figura 5.5 a Figura 5.7, os principais sacarídeos em solução são
derivados de oligómeros de glucose. Os únicos resíduos que se difundem são cadeias de
glucose de baixo peso molecular resultantes do processo de degradação térmica durante o
processamento do material, e que se encontram dispersas no material, difundindo-se
posteriormente por hidrólise quando em solução. Na Figura 5.5, a quantidade de
polissacarídeos totais aumenta desde o ensaio 1 até ao ensaio 3, possivelmente como
resultado da libertação de componentes de baixa massa para a solução, pelo aumento da
espessura de material. A não libertação de polissacarídeos em concentrações apreciáveis
para as soluções poderá estar associada à composição do material. O material deve
RESULTADOS E DISCUSSÃO |162
apresentar um limite estrutural a partir do qual os açúcares se encontram “encapsulados” no
componente sintético, sendo difícil a sua libertação. A diferença quantitativa de resultados
nas Figura 5.6 e Figura 5.7 obtidos por métodos diferentes (DNS e HPLC), pode ser atribuído
à diferente sensibilidade dos métodos analíticos. No entanto, ao longo do tempo de imersão
os resultados são semelhantes, permanecendo mais ao menos constantes durante as
experiências. Não existem diferenças significativas nos valores médios, os valores são
semelhantes para um intervalo de confiança de 95%, tal como validado pela aplicação do
teste t Student aos resultados experimentais.
Nos primeiros dias de imersão, após estabelecido o estado estacionário, os perfis de
concentração não devem variar. Este facto é importante para o estudo do comportamento do
sistema polimérico em aplicações específicas.
A quantidade de compostos libertados pelos provetes deve também depender do volume de
poros formados durante o processo de libertação por difusão.
A libertação de glicerol para as soluções foi determinada por HPLC (Figura 5.8).
50
[Glicerol] (g/l)
40
30
20
10
0
0
5
10
15
20
25
30
35
Tempo de imersão (dias)
Figura 5.8 Concentração de glicerol em 50 ml de solução, para os 4 ensaios realizados (■ , , ▲, Δ),
em função do tempo de imersão. Cada valor representa a média de 2 duplicados (4 valores na
totalidade); as barras de erro são os intervalos de confiança para 95% de cada média de resultados.
Os resultados evidenciam que o glicerol é o único composto libertado, comparativamente aos
perfis de concentração dos restantes compostos nas soluções de degradação.
O glicerol liberta-se rapidamente nos primeiros dias de imersão, estabilizando posteriormente
até ao final dos ensaios. A diferença do glicerol libertado em cada ensaio é aproximadamente
ESTUDOS DE DIFUSÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO EM SOLUÇÃO FISIOLÓGICA SIMULADA |163
proporcional ao número de provetes em cada ensaio, variando ao longo da espessura do
material e ao longo do tempo. Quando em solução, o glicerol liberta-se do material, sendo
completamente solúvel, uma vez que não tem interacção com o copolímero, encontrando-se
apenas a envolver as cadeias de material. Comparando com os resultados de concentração
de glicerol publicados noutros trabalhos de degradação de SEVA-C (Araújo et al., 2004b), a
quantidade de glicerol total obtida por extracção na mistura com um provete foi de
aproximadamente 1.12 g/l, semelhante ao obtido no ensaio 1. Tal como esperado, este
processo é seguido pelo endurecimento do material como resultado da libertação do
plasticizador.
5.3.3 Coeficiente de difusão efectivo de glucose e glicerol
Os coeficientes de difusão do soluto foram calculados através de estudos de difusão em
solução de HBSS. A glucose e o glicerol difundem da superfície das placas dos provetes para
as soluções de imersão. Foi aplicada a solução analítica da lei de Fick resolvida pelo uso de
transformada de Laplace, para obtenção dos coeficientes de difusão de glicerol e glucose nos
4 ensaios analisados. A resolução da lei de Fick relaciona a variação do coeficiente de
difusividade com a área efectiva do material e a solução, a partir da medição da
permeabilidade do material ao longo do tempo de imersão.
A Tabela 5.2 sintetiza os resultados obtidos dos coeficientes de difusão para os 2 compostos,
incluindo os respectivos intervalos de confiança assimptóticos para 95% e o coeficiente de
correlação, R2, quantificando a variação da variável dependente.
Tabela 5.2 Valores calculados dos coeficientes de difusão de glicerol e glucose, intervalos de
confiança assimptóticos para 95% (95% I.C.) e o coeficiente de correlação, R2, para os 4 ensaios
realizados, a partir do ajuste não linear dos valores experimentais, utilizando a aproximação analítica.
Ensaios De(gli)x1010
95% I.C.x1011
R2
(m2/s)
De(glu)x1011
95% I.C.x1010
R2
(m2/s)
1
0.0659
±0.785
0.889
1.62
±1.455
0.872
2
2.10
±9.655
0.962
3.07
±0.171
0.684
3
2.89
±12.54
0.950
9.09
±0.254
0.930
4
8.08
±21.68
0.992
25.07
±0.737
0.967
RESULTADOS E DISCUSSÃO |164
A Figura 5.9 mostra a variação de D com os valores de alfa, e os respectivos intervalos de
confiança assimptóticos para 95%, associados ao parâmetro estimado.
100
D x10 10 (m2/s)
10
1
0,1
0,01
0
10
20
alfa
30
40
50
Figura 5.9 Valores dos coeficientes de difusão de glicerol (■) e glucose ( ) em função de alfa. As
barras de erro são os intervalos de confiança para 95% do parâmetro estimado.
As alterações no coeficiente de difusão ao longo dos ensaios estão directamente relacionadas
com a variável alfa, que depende directamente da espessura do material. D aumenta à
medida que alfa diminui, variando na razão directa da espessura, uma vez que o equilíbrio
entre os compostos libertados e o volume de líquido aumenta (Figura 5.9).
De acordo com a solução analítica da lei de Fick, o modelo é mais apropriado para valores
baixos de alfa, tal como demonstrado pelos resultados obtidos de R2 (R2≈1). No processo de
optimização foi utilizada a função que minimiza a soma de quadrados residual, por medição
do desvio entre a difusão efectiva e a difusividade aparente.
No sistema em estudo o passo controlador da difusão é a transferência de massa da placa
para a solução, devido à diferença de concentrações entre o interior e o exterior da matriz,
associada à baixa porosidade (aproximadamente 0.05). Este mecanismo é bastante lento,
comparativamente à velocidade obtida com reacção enzimática e mencionada em trabalhos
publicados (Araújo et al., 2004b). A difusão de amido das regiões internas da mistura para o
meio está dependente da baixa porosidade do material, do rearranjo dentro da mistura e da
limitação ao transporte do interior para a superfície e da superfície para o meio (difusão
interna e externa). Além da difusão, a limitação ocorre pelo transporte do soluto da superfície
do SEVA-C para o meio.
ESTUDOS DE DIFUSÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO EM SOLUÇÃO FISIOLÓGICA SIMULADA |165
Os compostos libertados para a solução são principalmente o plasticizador (glicerol), tal como
confirmado pelas figuras anteriores, com coeficiente de difusão mais elevado. Este
plasticizador tem uma fraca interacção com a matriz polimérica, sendo exsudado
rapidamente para a solução nos primeiros dias de imersão. Estes resultados estão de acordo
com o teoricamente esperado, uma vez que a degradação do material está dependente
principalmente da acção enzimática, actuando fundamentalmente sob a degradação da fase
amorfa, tal como foi demonstrado anteriormente (Araújo et al., 2004a; Araújo et al., 2004b).
As Figura 5.10 e Figura 5.11 mostram os pontos experimentais dos diferentes ensaios
realizados e as curvas dos valores de concentração para cada composto calculados como
estimativa, pela aplicação da aproximação analítica do modelo de difusão proposto para os
ensaios.
C´t/C´∞
1,2
0,8
0,4
0
0
1
2
3
4
5
6
7
2 1/2
(Dt/l )
Figura 5.10 Concentração adimensional (C´t/C´∞) de glucose em função do tempo adimensional
(Dt/l2)1/2) para os ensaios 1(■), 2( ) e 4(▲). As curvas representam os resultados da aproximação
analítica (-).
As curvas são as melhores aproximações dos valores à equação descrita pela segunda lei de
Fick de difusão numa placa.
CONCLUSÕES |166
C´t/C´∞
1,2
0,8
0,4
0
0
0,5
1
1,5
2
(Dt/l2)1/2
2,5
3
3,5
Figura 5.11 Concentração adimensional (C´t/C´∞) de glicerol em função do tempo adimensional
(Dt/l2)1/2) para os ensaios 1(■), 2( ) e 4(▲). As curvas representam os resultados da aproximação
analítica (-).
Em ambos os casos o modelo teórico tende para uma assímptota. Os valores encontram-se
bem ajustados às equações teóricas, principalmente para baixos valores de alfa, tal como
demonstrado pelos valores de R2 (Tabela 5.2). O comportamento das curvas é mais ao
menos semelhante.
5.4 Conclusões
Este trabalho vem confirmar e validar os resultados obtidos no Capítulo 4 (Araújo et al.,
2001).
Neste capítulo foi demonstrado que:
A biodegradabilidade de misturas à base de amido de milho está principalmente associada à
libertação de glicerol, não se libertando outros metabolitos. O glicerol liberta-se rapidamente
nos primeiros dias de imersão, estabilizando posteriormente até ao final do ensaio.
A libertação da superfície para o meio pode estar limitada pela baixa porosidade do material,
e estrutura específica interpenetrada desta mistura termoplástica.
A quantidade de sacarídeos nas soluções de degradação permanece constante ao longo das
experiências, não ocorrendo hidrólise do interior da matriz polimérica para a solução
(problemas de difusão interna e externa).
4
ESTUDOS DE DIFUSÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO EM SOLUÇÃO FISIOLÓGICA SIMULADA |167
O coeficiente de difusão do glicerol tende a aumentar à medida que os valores de alfa
diminuem.
Foi obtido um bom ajuste entre os valores calculados e os valores medidos para pequenos
valores de alfa, o que valida o modelo proposto (R2≈1).
Foi possível quantificar o processo controlador de difusão, através da determinação dos
coeficientes de difusão dos principais compostos em solução.
Os resultados estão de acordo com o teoricamente previsto, uma vez que a degradação do
material é fundamentalmente enzimática, tal como demonstrado em trabalhos anteriores
(Araújo et al., 2004a; Araújo et al., 2004b), não ocorrendo degradação da matriz polimérica
na ausência de reacção.
A optimização da degradabilidade do material poderá ser controlada alterando a porosidade
do material.
5.5 Bibliografia
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CAPITULO 6
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS
TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS Á BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
6. DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS
TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO
SUMÁRIO
A adição de etileno-álcool vinílico a misturas termoplásticas à base de amido melhora o
processamento, aumenta a resistência e reduz a sensibilidade à humidade, mas também diminui a
taxa global de biodegradabilidade do sistema. A degradação polimérica é de grande importância na
produção e utilização de sistemas implantáveis em substituições ósseas temporárias, uma vez que
um material deve apresentar propriedades mecânicas associadas a cinéticas de degradação
apropriadas, comportamento bioactivo e biocompatível.
Neste capítulo são apresentados os principais resultados obtidos nos estudos de degradação in-vitro
de SEVA-C em solução fisiológica simulada, HBSS, com actividade enzimática.
A percentagem de massa de polissacarídeos totais libertados para a solução, aumentou durante 100
dias, estabilizando posteriormente. A percentagem de polissacarídeos totais libertados na ausência de
enzimas é cerca de 100% inferior, sendo evidenciada a forte acção enzimática na velocidade de
degradação. O número e tamanho de poros foi aumentando ao longo do tempo de imersão e para
tempos de imersão mais longos, os poros foram alargando formando fissuras na superfície do
material. A alteração no regime de degradação após 100 dias poderá estar associada à especificidade
da microestrutura da mistura e à porosidade do material. A percentagem de sacarídeos totais
encontrados nas soluções de degradação (25%) no final do ensaio é praticamente metade da massa
de amido presente inicialmente no material (42%), pelo que só parte da fase amorfa do material foi
degradada.
6.1
INTRODUÇÃO
175
6.2
RESULTADOS E DISCUSSÃO
178
6.3
CONCLUSÕES
207
6.4
BIBLIOGRAFIA
209
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |175
6.1 Introdução
As misturas termoplásticas à base de amido são alternativas potenciais para serem utilizadas
em diferentes aplicações biomédicas (Araujo et al., 2004c; Mano et al., 2003).
As propriedades físicas e químicas do amido têm sido investigadas devido à sua facilidade
em ser convertido numa mistura termoplástica, podendo ser utilizado em diferentes
aplicações como resultado da sua biodegradabilidade, disponibilidade e rentabilidade
económica (Demirgoz et al., 2000; Reis e Cunha, 1995b; Whistler et al., 1984).
Tem sido demonstrado em diversos estudos, que estes sistemas poliméricos exibem cinéticas
de degradação apropriadas (Demirgoz et al., 2000; Gomes et al., 2001b; Vaz et al., 2001),
comportamento biocompatível e libertação de produtos não citotóxicos (Gomes et al., 2001a;
Mendes et al., 2001)
Na área ortopédica, um dos objectivos é desenvolver sistemas biodegradáveis que mantêm a
sua integridade e propriedades mecânicas em meio aquoso nos primeiros estágios de
implantação, acabando por degradar nos restantes períodos de implantação (Lawton, 1997;
Roper e Koch, 1990; Van Soest et al., 1997). O material deve assim ser desenvolvido de
forma a ter uma taxa de degradação apropriada para manter a resistência da estrutura de
suporte, até ao crescimento do novo tecido sobre o suporte sintético (Gomes et al., 2001b;
Maquet e Jerome, 1997; Thomson et al., 1995a; Zhang e Ma, 1999).
A utilização de polímeros sintéticos degradáveis como biomateriais, além de apresentar
propriedades físico-químicas e mecânicas favoráveis, deve assegurar que: (i) os polímeros
sejam biocompatíveis entre si; e (ii) que o uso de aditivos particulares e/ou tecnologias de
processamento para obtenção de diferentes propriedades e/ou geometrias, não
comprometem o comportamento biocompatível nem induzem citotoxicidade (Pachence JM e
Kohn J, 1997). O seu efeito combinado deve assegurar a compatibilidade dos produtos de
degradação do material com cinéticas controladas.
6.1.1 Estrutura de misturas termoplásticas à base de amido
O amido é em geral totalmente biodegradável no meio ambiente, dando origem a produtos
também degradáveis. É constituído por dois componentes principais: a amilose, um glucano
linear com ligações α-D-(1,4) e a amilopectina, com ligações α-D-(1,6) nos pontos
INTRODUÇÃO |176
ramificados (Otey e Doane, 1984). Os grânulos de amido contêm regiões concêntricas
alternadas de zonas cristalinas (≈30%) e material amorfo. São birrefringentes com elevado
grau de organização interna.
A estrutura a nível molecular das misturas à base de amido é complexa, envolvendo
estruturas interpenetradas e outras interacções físicas e químicas (Reis e Cunha, 2001). É
possível obter diferentes microestruturas em copolímeros de amido e etileno-álcool vinílico
(Bastioli et al., 1994a), desde as morfologias tipo gota até às estruturas em camada,
dependendo da hidrofilicidade do copolímero sintético (Bastioli et al., 1993; Yoshida e
Uemura, 1994). Quando a razão amilose/amilopectina é inferior a 20/80 (p/p), é possível
formar morfologias em camada. Na microestrutura em gota há um aumento da dificuldade
das enzimas se unirem às moléculas de amido fortemente interpenetradas com o
componente sintético insolúvel. Contrariamente, na microestrutura em camada, o amido
encontra-se em domínios separados, podendo as enzimas penetrar mais facilmente.
A adição de etileno-álcool vinílico às misturas de amido melhora o processamento, aumenta a
resistência e reduz a sensibilidade à humidade do produto, mas também diminui a taxa
global de biodegradabilidade do sistema (Bastioli et al., 1990b; George et al., 1994;
MacCassie JE et al., 1993; Mayer e Kaplan, 1994; Simmons e Thomas, 1995).
Quando os grânulos de amido são aquecidos, desintegram-se e dissolvem-se, há ruptura das
ligações de hidrogénio dentro dos grânulos, o que facilita a penetração e absorção de água
no grânulo. Adicionalmente, liberta-se amilose da superfície do grânulo, aumentando a
porosidade superficial. Durante estes processos de fragmentação, a superfície do grânulo de
amido, que na estrutura nativa é aparentemente lisa à escala microscópica, torna-se rugosa e
quebradiça.
A morfologia da mistura final depende das condições de processamento utilizadas, influencia
as propriedades mecânicas, e os modos de degradação dos respectivos produtos. Por
exemplo, a cristalinidade diminui a velocidade de degradação e contribui para dificultar a
acessibilidade às zonas internas das misturas resultantes (Simmons e Thomas, 1995).
6.1.2 Degradação de misturas à base de amido
A amilose e a amilopectina, componentes base do amido, são totalmente hidrolisadas por
enzimas. A ligação α-1,4 nos dois componentes do amido é atacada pela amílase e a ligação
α-1,6 na amilopectina é atacada pelas glucosidases.
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |177
As endoamilases geralmente hidrolisam apenas as ligações lineares das cadeias da amilose
ou amilopectina e não são activas nos pontos de ramificação da amilopectina. As exoamilases
podem actuar sobre as cadeias lineares nas ligações ramificadas. As exoamilases podem
gerar glucose ou dissacarídeos (maltose) ou trissacarídeos (maltotriose), por ataque do
terminal não redutor das moléculas de amido.
As regiões cristalinas do amido são mais resistentes às acções química e enzimática.
Quando uma quantidade suficiente de amido é alvo da acção enzimática, diminui a sua
resistência e/ou integridade estrutural e a molécula acaba por desagregar-se.
Os polímeros apresentam normalmente componentes de baixo peso molecular, “lixiviados”
(aditivos, fragmentos de iniciação) com diferentes níveis de actividade fisiológica e toxicidade
celular (Gomes et al., 2001a; Kirkpatrick, 1992; Kirkpatrick e Mittermayer, 1990; Ratner,
1997). Os componentes de baixa massa molecular identificados na degradação de polímeros
estão, em princípio, relacionados com a sua síntese, processamento e/ou utilização. Os
polímeros com ligações fracas, sujeitos a degradação específica (tal como hidrólise), dão
origem a produtos de degradação bem definidos (Hakkarainen et al., 1996; Karlsson et al.,
1988). O conhecimento do processo de degradação de um polímero biodegradável e efeitos
dos respectivos produtos de degradação no corpo, é fundamental para o sucesso a longo
prazo de um biomaterial (Wake et al., 1998).
A degradação polimérica é de grande importância na produção e utilização de sistemas
implantáveis ou outros sistemas em substituições ósseas temporárias, uma vez que, um
material ideal deve apresentar propriedades mecânicas adequadas (próximas das do osso)
associadas a cinéticas de degradação apropriadas, ter comportamento bioactivo e ser
biocompatível.
Vários estudos assinalaram o papel fundamental das enzimas, radicais livres e células
fagocíticas no processo de biodegradação polimérica (Gallant et al., 1992; Klemchuk, 1990;
Piskin, 1992; Scott, 1995; Zaikov GE, 1989). No entanto, não existe um único padrão de
simulação do respectivo mecanismo de degradação, e consequentemente não existem
processos de previsão para o controlo do processo de degradação consequente.
RESULTADOS E DISCUSSÃO |178
6.2 Resultados e Discussão
Neste capítulo são apresentados os principais resultados obtidos nos estudos de degradação
in-vitro de SEVA-C em solução fisiológica simulada, HBSS, com actividade enzimática.
Pretendeu-se estudar o comportamento de biodegradação do material num meio equivalente
ao soro humano, simulando os mecanismos de degradação desencadeados no organismo,
quando estes materiais são implantados em contacto com os fluidos do corpo humano. Os
provetes usados foram de secção quadrada com 10 cm2 de área superficial, 1.6 g de massa
ou, em alternativa, cilindros de 10 mm de diâmetro e 1 mm de espessura, de acordo com a
tabela 1.2 apresentada no capítulo de Materiais e Métodos. Os cilindros foram utilizados para
estudos de morfologia superficial em SEM e AFM.
Foi adicionada uma enzima α-amílase numa concentração semelhante à encontrada no
plasma sanguíneo humano, ou seja, 50 unid/l.
Para analisar o efeito da limitação estrutural e da porosidade inicial do material à degradação,
foram também efectuados em simultâneo ensaios com diferentes concentrações enzimáticas
(50, 100 e 150 unid/l), dissolvidas em solução HBSS e adicionadas a provetes (1,6 g),
durante um período semelhante aos ensaios de degradação (150 dias).
Os provetes foram imersos a 37±1ºC, pH=7.4 em recipientes individuais de 50 cm3, e com
agitação (150 r.p.m.) por períodos de amostragem pré-definidos. Todas as manipulações
foram realizadas numa câmara de fluxo laminar.
À semelhança do Capítulo 4, onde são apresentados os resultados da degradação in-vitro,
foram realizados dois ensaios de degradação durante 10 e 200 dias, respectivamente. O
ensaio de curta duração (10 dias), serviu como uma primeira abordagem do estudo dos
principais mecanismos associados à cinética de degradação enzimática. Da análise dos
resultados deste ensaio, optou-se pela realização de um ensaio mais longo (200 dias), uma
vez que os mecanismos de degradação associados a materiais biodegradáveis quando
implantados no corpo humano, são normalmente bastante lentos. Teoricamente, deverão
evidenciar uma cinética de degradação semelhante à reconstituição do tecido ósseo (≈3
meses).
A descrição de todos os métodos analíticos, de morfologia microestrutural e de actividade
enzimática utilizados na caracterização das soluções de degradação, do material e da
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |179
actividade enzimática, após períodos de degradação pré-definidos, encontram-se no
respectivo capítulo de Materiais e Métodos.
Os principais objectivos na realização destes ensaios de degradação enzimática foram: (i)
identificar e quantificar os produtos de degradação de misturas termoplásticas à base de
amido de milho e etileno-álcool vinílico (SEVA-C), em solução fisiológica simulada com enzima
α-amílase durante longos períodos de tempo; (ii) acompanhar a actividade enzimática média
durante longos períodos de tempo; (iii) avaliar a limitação estrutural do SEVA-C à degradação
enzimática para diferentes concentrações enzimáticas; (iv) verificar a perda de propriedades
do material e alterações superficiais por degradação, quando em contacto com solução
fisiológica simulada com actividade enzimática e (v) estabelecer uma relação entre a cinética
de degradação analítica e a microestrutura/porosidade do material desta classe de materiais,
utilizando modelos estruturais.
A caracterização das diferentes fases de degradação enzimáticas, da estrutura morfológica e
dos principais mecanismos envolvidos durante os processos complexos de degradação
destas misturas termoplásticas, é baseada no ataque dos domínios internos das moléculas
de amido acessíveis à solução enzimática, e limitado nas regiões onde o amido se encontra
rodeado por grupos etileno não degradáveis.
6.2.1 Avaliação da degradação de SEVA-C em solução
Tal como descrito anteriormente, foram analisadas as soluções de degradação para tempos
de amostragem pré-definidos, por identificação e quantificação dos subprodutos que se
encontram em solução, resultantes da degradação enzimática dos provetes de SEVA-C.
Foi quantificada a percentagem de massa de amido libertado para a solução por massa
inicial de provete, sendo bastante baixa em ambos os ensaios.
RESULTADOS E DISCUSSÃO |180
g amido/g provete (%)
0,002
0,0016
0,0012
0,0008
0,0004
0
0
2
4
6
8
Tempo de imersão (dias)
10
12
g amido/g provete inicial (%)
Figura 6.1 Massa de amido libertado para a solução, com enzima, por massa inicial de provete (1.6 g)
em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão (10 dias).
0,01
0,005
0
0
40
80
120
160
200
Tempo de imersão (dias)
Figura 6.2 Massa de amido libertado para a solução, com (■) e sem (□) enzimas, por massa inicial de
provete (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão.
Nos dois ensaios efectuados durante períodos de imersão diferentes, 10 e 100 dias, na
presença de enzima, praticamente não se detectou amido em solução (Figura 6.1 e Figura
6.2). Foram quantificadas apenas pequenas cadeias de açúcares dispersas na matriz do
material libertadas para a solução.
Não se registam diferenças entre os ensaios na presença e ausência de enzima, uma vez que
a quantidade de amido em solução é bastante baixa. Este resultado deve-se à dificuldade de
transferência de massa por difusão externa e interna do amido do interior dos grânulos,
condicionada também pela baixa porosidade do material. A fase amorfa de amido estrutural
poderá ter sido libertada para a solução por hidrólise, mas por acção enzimática da amílase
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |181
sobre o amido este foi decomposto em oligómeros de glucose, sendo a quantidade de amido
encontrada em solução bastante baixa. No entanto, é também necessário considerar que o
método utilizado no doseamento do amido fornece somente uma medida qualitativa do
amido em solução, porque o iodo reage apenas com parte da molécula de amido
(aproximadamente onze moléculas de glucose) em forma de hélice, onde o iodo se combina,
podendo existir maior quantidade de amido em solução, mas que não se encontra acessível à
reacção com iodo. Pequenas cadeias de amido ou fragmentos de açúcar hidrolisados em
solução, não são quantificados por este método.
Na quantificação dos açúcares redutores nas soluções de degradação, foi utilizado o método
do ácido dinitrossalicílico. A quantidade de açúcares redutores aumentou desde o início até
ao final, para ambos os ensaios (Figura 6.3 e Figura 6.4). No ensaio realizado durante 10
dias (Figura 6.3) a percentagem de açúcar libertado por massa inicial de provete é baixa
(≈2%). O provete quando imerso em solução liberta automaticamente pequenas cadeias
carbonadas, dissolvendo-se na solução analítica. No ensaio realizado durante mais tempo é
evidenciada a diferença de resultados entre os ensaios na presença e ausência de enzima,
assim como o comportamento final da percentagem de açúcares libertados. A reacção
enzimática deve ser lenta, possivelmente devido à limitação de substrato durante a reacção.
g glucose/g provete (%)
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
2
4
6
8
10
12
Tempo de imersão (dias)
Figura 6.3 Massa de glucose libertada para a solução, por massa inicial de provete (1.6 g) em 50 ml
de solução, em função do tempo de imersão (10 dias).
RESULTADOS E DISCUSSÃO |182
g glucose libertada com
enzima/g provete inicial (%)
16
0,15
12
0,1
8
0,05
4
0
0
40
80
120
160
g glucose libertada sem
enzima/g provete inicial (%)
0,2
20
0
200
Tempo de imersão (dias)
Figura 6.4 Massa de glucose libertada para a solução, com (■) e sem (□) enzimas por massa inicial
de provete (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão.
A Figura 6.4 mostra a comparação das curvas resultantes do ensaio enzimático e na
ausência de enzimas (Capítulo 4), evidenciando a acção da actividade enzimática no
processo de degradação hidrolítica do material. Na presença de enzima, a fase inicial linear
da curva de degradação corresponde à fase de hidrólise mais rápida. Após 100 dias de
imersão, a massa de glucose libertada (% p/p) tende a estabilizar num valor final de
aproximadamente 16% (p/p). Para tempos de imersão mais longos, foram detectados apenas
pequenos incrementos na velocidade de degradação.
A quantidade relativa de açúcares redutores nas soluções de degradação em ensaios
semelhantes na ausência de enzimas é cerca de 100 vezes menor, mantendo-se mais ao
menos constante ao longo de todo o ensaio, sendo evidenciada a forte acção da enzima na
velocidade de degradação.
De forma a separar e quantificar todos os sacarídeos em solução libertados por acção
enzimática na fase amorfa de amido da mistura de SEVA-C, foi utilizada cromatografia líquida
numa coluna de Ca.
De acordo com a Figura 6.5, o composto mais abundante identificado foi a glucose, seguido
da maltose, e finalmente a maltotriose.
Massa de sacarídeos
libertados/massa inicial provete
(%)
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |183
30
20
10
0
0
50
100
150
200
Tempo de imersão (dias)
maltotriose
maltose
glucose
polissacarídeos
Figura 6.5 Massa de sacarídeos de glucose libertados para a solução, por massa inicial de provete
(1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão.
A α-amílase hidrolisa aleatoriamente as ligações α-1,4-glucosídicas do amido em dextrinas,
tal como demonstrado na figura anterior. A hidrólise das ligações de amido por α-amílase
conduz a um aumento significativo da percentagem de perda de massa. Foram obtidos
valores superiores a 20%, de acordo com a curva de polissacarídeos, associado
principalmente a oligómeros de glucose. A digestão degrada ainda a amilose em maltose e
glucose, aumentando a libertação de substratos de oligossacarídeos de cadeia longa.
Todos os oligossacarídeos em solução tendem a aumentar para tempos de imersão mais
longos, desde monossacarídeos a trissacarídeos, sendo uma evidência da degradação da
mistura de SEVA-C.
A alteração no regime de degradação após 100 dias poderá estar associada à especificidade
da estrutura da mistura e porosidade do material. Parte do amido pode encontrar-se disperso
dentro das cadeias do copolímero de etileno-álcool vinílico, aumentando a dificuldade das
enzimas se unirem às moléculas de amido nos domínios interiores, fortemente
interpenetrados no componente sintético insolúvel, diminuindo a acessibilidade às enzimas.
Para a quantificação dos polissacarídeos libertados nas soluções de degradação em ambos
os ensaios, foi utilizado o método de Dubois. A percentagem de massa de polissacarídeos
libertados para a solução aumentou desde o início em ambos os ensaios, evidenciando o
efeito da enzima na velocidade de catálise.
RESULTADOS E DISCUSSÃO |184
g polissacarídeos/g provete
inicial (%)
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
2
4
6
8
10
12
Tempo de imersão (dias)
Figura 6.6 Massa de polissacarídeos libertados para a solução, por massa inicial de provete (1.6 g)
em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão (10 dias).
30
0,16
20
0,12
0,08
10
0,04
0
g polissacarídeos libertados
com enzima
(% p/p)
g polissacarídeos libertados
sem enzima
(% p/p)
0,2
0
0
50
100
150
200
Tempo de imersão (dias)
Figura 6.7 Massa de polissacarídeos libertados para a solução, com (■) e sem (□) enzima, por massa
inicial de provete (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão.
Na Figura 6.7 é visível o efeito da enzima na velocidade de libertação de produtos, devido à
grande diferença de valores obtidos nos ensaios com e sem enzima. A percentagem de
polissacarídeos totais libertados na presença de enzima é cerca de 100% superior.
Na presença de enzima a fase amorfa de amido do material foi degradada, tendo sido
libertado aproximadamente 20% em massa, relativamente à massa inicial, correspondendo
maioritariamente à percentagem de glucose libertada. O material, quando em contacto com
uma solução com actividade enzimática, difunde para a solução, libertando compostos que
fazem parte da sua composição. O aumento da velocidade de degradação ao longo do
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |185
tempo, pode ser atribuído ao aumento dos terminais redutores da cadeia por efeito da
degradação enzimática.
Comparou-se o somatório de todos os açúcares quantificados nas soluções de degradação
com a curva de polissacarídeos totais, sendo o resultado apresentado na Figura 6.8.
Massa sacarídeos
libertados/massa inicial
provete
(%)
30
20
10
0
0
50
100
150
200
Tempo de imersão (dias)
glucose+maltose+maltotriose
polissacarídeos
Figura 6.8 Massa de todos os açúcares libertados para a solução, por massa inicial de provete (1.6 g)
em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão.
As curvas apresentam um comportamento semelhante ao longo do tempo de imersão,
aumentando desde o inicio e estabilizando após 100 dias de imersão.
O crescimento da actividade enzimática pode ser atribuído ao aumento dos domínios
disponíveis para degradação enzimática, como consequência do ataque enzimático aos
grupos redutores. O ataque enzimático às regiões interfaciais implica a deterioração das
ligações que sustentam a adesão entre as fases, contribuindo para a diminuição da rigidez do
material. As soluções enzimáticas atacam a matriz polimérica fragmentando a estrutura
molecular. Torna-se evidente que é crucial o papel das enzimas na iniciação da fase de
degradação química.
Após 75 dias de imersão as curvas apresentam uma pequena diferença. Este desvio pode ser
atribuído ao método de quantificação de Dubois, em que se liberta uma molécula de água
durante a reacção, não contabilizada pelo método, o que pode conduzir a menor quantidade
quantificada em solução, sendo esta diferença mais pronunciada para maiores tempos de
imersão. Os sacarídeos em solução representam praticamente 25% da perda de massa total
do material. Apenas parte do amido estrutural do material foi degradado para a solução, a
RESULTADOS E DISCUSSÃO |186
restante parte permaneceu no interior da estrutura, possivelmente por efeito dos açúcares
“encapsulados” pelo copolímero sintético de EVOH. É provável que na presença de um tecido
vivo, possa ocorrer maior hidrólise metabólica do amido estrutural, devido à presença de
outros constituintes importantes que possam interferir na taxa metabólica de degradação,
nomeadamente enzimas.
6.2.2 Fase amorfa total na mistura SEVA-C
Para quantificar e caracterizar a composição interna em percentagem de amido presente
inicialmente no material SEVA-C, foi efectuada uma hidrólise ácida com ácido sulfúrico numa
amostra de SEVA-C em pó. O extracto foi separado e quantificado na fase solvente, quanto ao
conteúdo em carboidratos por dois métodos. O objectivo desta extracção é também avaliar se
todo o amido presente inicialmente no material, terá sido libertado durante os processos de
degradação enzimática.
A Tabela 6.1 mostra os resultados obtidos a partir de dois métodos: HPLC e Dubois.
Tabela 6.1 Massa de sacarídeos libertados por hidrólise ácida pelo método HPLC e Dubois, a partir 5
mg de SEVA-C em pó.
Massa sacarídeos
libertada/massa provete inicial (%)
HPLC
Dubois
43
40
A partir de 5 mg de pó, foi possível detectar 40% e 43% (p/p) de amido respectivamente, pelo
método de Dubois e por HPLC. A média de resultados é de aproximadamente 42%,
significativamente diferente do teoricamente estimado, 60% (p/p). Esta quantidade de fase
amorfa quantificada não corresponde à totalidade da fase acessível ao ataque enzimático,
nem se deve libertar por processos simples de difusão. A extracção efectuada corresponde à
quantidade total de fase amorfa de amido no interior do material e não a moléculas de
glucose, que poderão ser libertadas facilmente por hidrólise para a solução.
A percentagem de sacarídeos encontrados nas soluções de degradação (25%) (Figura 6.7) é
praticamente metade da massa de amido quantificada inicialmente na estrutura do material
(42%). Verifica-se assim que, parte da fase amorfa terá permanecido inalterada no interior do
material (≈17%), mas é provável que o material apresente alterações apreciáveis ao nível da
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |187
sua estrutura interna. A não degradação da totalidade da fase amorfa pode ser atribuída à
dificuldade das enzimas se unirem às moléculas de amido nos domínios internos, fortemente
interpenetrados com o componente sintético insolúvel. A baixa porosidade do material
também contribui para a diminuição da acessibilidade dos açúcares ao ataque enzimático.
6.2.3 Glicerol em solução e na mistura termoplástica de SEVA-C
A libertação de glicerol utilizado como plasticizador, para as soluções de degradação foi
Massa glicerol libertado/massa
inicial provete (%)
quantificada por dois métodos cromatográficos: HPLC e HPAE-PAD.
6
4
2
0
0
50
100
150
200
Tempo de imersão (dias)
Figura 6.9 Massa de glicerol libertado para a solução, por massa inicial de provete (1.6 g) em 50 ml
de solução, em função do tempo de imersão, obtido por HPLC (■) e HPAE-PAD (□).
A diferença de resultados entre os dois métodos é de aproximadamente 2% (p/p). A
libertação de glicerol para a solução aumentou nos primeiros dias, estabilizando
posteriormente até ao final do ensaio. A massa de glicerol libertado para a solução por massa
inicial de provete é de aproximadamente 5% e 3% por HPLC e HPAE-PAD, respectivamente.
Nos primeiros dias de imersão a libertação de glicerol é a principal observação, ao que se
segue um período sem perda significativa de massa (após 20 dias). Isto corresponde à
quebra de ligações covalentes acessíveis, tal como demonstrado nas figuras anteriores
referentes à libertação de carboidratos. O efeito da perda de plasticizador deve induzir uma
redução da ductilidade dos materiais, podendo ser compensado pelo efeito lubrificante da
água na estrutura do material.
RESULTADOS E DISCUSSÃO |188
Para caracterizar a composição interna em plasticizador de provetes antes dos ensaios de
degradação e no final dos ensaios, foram efectuadas extracções totais em Soxhlet para
remoção de toda a matéria solúvel, utilizando água como meio extractor. A Tabela 6.2 mostra
os resultados obtidos das extracções a provetes SEVA-C, resultantes da degradação
enzimática e sem qualquer tratamento.
Tabela 6.2 Massa de glicerol libertado por extracção em Soxhlet e extraído por hidrólise ácida e
quantificado por HPLC, por massa inicial de provete sem qualquer tratamento e após degradação
enzimática.
Soxhlet
HPLC
Massa glicerol libertado/massa provete
inicial sem tratamento (%)
7.71 ± 0.1
7.35 ± 2.1
Massa glicerol libertado/massa provete
inicial após degradação (%)
2.2 ± 0.1
Foi também contabilizado o glicerol extraído por hidrólise ácida ao pó SEVA-C sem qualquer
tratamento, e quantificado por HPLC. A quantidade média de glicerol extraído pelos dois
métodos (Soxhlet e HPLC) foi de aproximadamente 7.5%. A extracção total em Soxhlet não
significa que todo o glicerol tenha sido extraído, dado que se trata de um ensaio normalizado
realizado durante 24 h, não garantindo que todo o glicerol tenha sido extraído.
A quantidade obtida nas soluções de degradação (5%) por HPLC (Figura 6.9), coincide
praticamente com a diferença dos resultados entre os provetes sujeitos a degradação e sem
qualquer tratamento. A quantidade de glicerol residual obtido no final do processo de
degradação sugere que nem todo o glicerol terá sido libertado para a solução, cerca de 2%
permaneceu no interior do material. Quando em solução, o glicerol liberta-se do material por
hidrólise por um fenómeno físico de solubilidade, sendo completamente solúvel, já que não
tem interacção com o copolímero. Tal como esperado, este processo é seguido pelo
endurecimento e diminuição da flexibilidade do material, como resultado da libertação do
plasticizador.
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |189
6.2.4 Velocidade cinética de degradação
Considerando a concentração de todos os compostos libertados para a solução, foi
representada a velocidade de degradação em função do tempo de imersão, tal como
demonstrado na Figura 6.10.
dC/dt(g/l.dias)
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Tempo imersão (dias)
Figura 6.10 Velocidade de degradação de todos os compostos libertados para a solução, em função
do tempo de imersão.
De acordo com os resultados obtidos, a velocidade diminui logaritmicamente em função do
tempo de imersão. A diminuição da velocidade de degradação observada na fase final, pode
ser atribuída à diminuição da degradabilidade dos domínios de amilose-EVOH situados no
interior do material, menos susceptíveis à hidrólise.
Após 75-100 dias a variação é mínima (aproximadamente zero) não se libertam sacarídeos
ou outros compostos para a solução, tal como demonstrado anteriormente. A velocidade
tende para um limite assimptótico nulo. O abrandamento da velocidade de perda de massa
pode corresponder a um processo de fragilização do material. A redução da velocidade de
degradação é também afectada pela limitação da capacidade de absorção de água deste tipo
de misturas termoplásticas.
6.2.5 Interacções entre oligossacarídeos e glicerol
Para avaliar possíveis alterações e interacções entre oligossacarídeos e glicerol em soluções
contendo α-amílase, os compostos puros foram misturados e os respectivos produtos
analisados periodicamente em função do tempo de imersão. A Figura 6.11 mostra a evolução
RESULTADOS E DISCUSSÃO |190
das concentrações de glucose, maltose e glicerol em solução fisiológica simulada com
actividade enzimática, em função do tempo de imersão (compostos misturados).
2,5
[ ] (g/l)
2
1,5
1
0,5
0
0
20
40
60
80
100
Tempo de imersão (dias)
Figura 6.11 Concentrações de glucose (■), maltose (□) e glicerol (▲) (misturados) em função do
tempo de imersão.
Não ocorreu interacção entre sacarídeos e o glicerol, nem entre eles e a enzima. As
concentrações de todos os compostos em solução mantêm-se constantes durante todo o
ensaio. Os resultados obtidos quando os compostos se encontram separados são
semelhantes (Figura 6.12).
3
[ ] (g/l)
2
1
0
0
40
80
120
Tempo de imersão (dias)
Figura 6.12 Concentrações de glucose (■), maltose (□) e glicerol (▲) em função do tempo de
imersão.
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |191
6.2.6 Avaliação da actividade enzimática
É importante conhecer as principais propriedades da enzima utilizada nos ensaios de
degradação do material SEVA-C.
Para a caracterização da enzima foram determinados os parâmetros cinéticos (Km e Vmax)
em condições semelhantes aos ensaios de degradação, [enzima] = 50 unid/l, pH=7.4 e
T=37ºC. Os valores cinéticos obtidos encontram-se na Tabela 6.3.
Tabela 6.3 Parâmetros cinéticos, Km e Vmax, para 3 ensaios efectuados.
Ensaios
1
2
3
Média
Vmax
(mg/l.min)
Km (g/l)
15.2
11.5
12.2
12.2 ± 3
1.01
1.71
1.51
1.5 ± 0.5
O valor de Vmax obtido (≈12.2 mg/l.min) é bastante superior ao obtido na velocidade de
degradação de polissacarídeos, utilizando a mesma concentração enzimática (0.045
mg/l.min, Figura 6.7). De facto, as condições de realização dos ensaios são bastante
diferentes. Nos ensaios para determinação dos parâmetros cinéticos, o amido dissolvido
encontra-se em contacto directo com a enzima, enquanto nos ensaios de degradação
enzimática do material, a fase amorfa do amido encontra-se encapsulada e o amido está
inserido no interior do componente sintético da mistura termoplástica, dificultando o acesso à
enzima. A limitação da reacção pelo substrato é o principal factor que contribui para a grande
diferença de resultados.
Antes da realização de cada um dos ensaios de degradação enzimática, foi também
determinada a actividade enzimática.
Ao longo dos ensaios de degradação enzimática podem também ocorrer processos de
desactivação que comprometem o processo degradativo, pelo que se torna fundamental
determinar periodicamente se a enzima se encontra activa/inactiva durante todo o ensaio.
Foi assim determinada a actividade enzimática periodicamente, utilizando como substrato
amido e contabilizando a velocidade de degradação pela quantidade de açúcares redutores
formados.
Actividade enzimática específica
(mg gluc/unid/min)
RESULTADOS E DISCUSSÃO |192
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
20
40
60
80
100
Tempo de imersão (dias)
120
140
160
Figura 6.13 Actividade enzimática (em mg glucose/unid/min) para três concentrações enzimáticas 50
(■), 100 (□) e 150 (▲) unid/l, em função do tempo de imersão. Cada valor representa a média de 2
duplicados (4 valores na totalidade); as barras de erro são os intervalos de confiança de 95% em cada
valor médio.
Foi obtido um valor médio de aproximadamente 0.3 mg glucose/unid/min, cerca de 86%
da actividade de referência (0,35 mg glucose/unid/min).
Apesar de actividade enzimática ser relativamente baixa, não ocorreu desactivação ao
longo dos ensaios. Tal como esperado, a actividade enzimática para as três concentrações de
enzima é semelhante ao longo do tempo. Teoricamente, sendo a enzima uma molécula
catalisadora, deve actuar a velocidade constante, quando as condições do meio (T, pH e
concentração substrato) se mantêm constantes. Não se registaram também diferenças
significativas entre as três concentrações enzimáticas, tal como validado pelo teste t de
Student aplicado aos resultados experimentais. Os valores são semelhantes para um intervalo
de confiança de 95%.
6.2.7 Limitação estrutural do material à degradação enzimática
A cinética de uma reacção enzimática pode ser descrita por uma correlação linear entre a
velocidade de hidrólise e a concentração de substrato (reacção de 1ª ordem), podendo ser
seguida por um segundo estágio correspondente à saturação enzimática (reacção de ordem
zero).
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |193
De forma a avaliar a limitação estrutural do material à degradação enzimática foi realizado
um ensaio com diferentes concentrações enzimáticas, utilizando a mesma massa de provete
Massa glucose libertada/massa
inicial provete (% g/g)
(1.6 g), durante aproximadamente 150 dias (Figura 6.14).
20
15
10
5
0
0
50
100
150
Tempo de imersão (dias)
Figura 6.14 Massa de glucose libertada para a solução para cada concentração enzimática 50 (■),
100 (□) e 150 (▲) unid/l, por massa inicial de provete (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do
tempo de imersão. Cada valor representa a média de 2 duplicados (4 valores na totalidade); as barras
de erro são os intervalos de confiança de 95% em cada valor médio.
A Figura 6.14 mostra o aumento da concentração em açúcares redutores libertados por
massa inicial de provete, em função do tempo de imersão e concentração enzimática. A
libertação de glucose é semelhante para as diferentes concentrações enzimáticas,
aumentando rapidamente durante os primeiros 80 dias e tendendo a estabilizar
posteriormente num valor constante, diferente para cada concentração de enzima. À medida
que a concentração enzimática aumenta, o número de ligações que a enzima estabelece à
superfície de SEVA-C aumenta, sendo a velocidade de reacção proporcional à concentração
de centros activos (concentração efectiva). Após 80 dias de imersão, a libertação de glucose
tende a estabilizar, associada provavelmente à diminuição dos locais activos de degradação
enzimática, limitação pela concentração de substrato e condicionada pelo tamanho dos poros
da estrutura polimérica. A velocidade de reacção estará condicionada pelo facto do amido se
encontrar encapsulado no interior do copolímero, impedindo a actuação enzimática,
funcionando como barreira à degradação. A enzima pode actuar apenas na superfície, não
penetrando na estrutura interna, sendo o processo de degradação incompleto. A degradação
RESULTADOS E DISCUSSÃO |194
não depende da solução enzimática, mas da alteração da porosidade adequada à velocidade
de degradação. Não se registaram diferenças significativas entre as três concentrações
enzimáticas, os valores são semelhantes para um intervalo de confiança de 95%, tal como
validado pelo teste t de Student aplicado aos resultados experimentais
Estes resultados confirmam que 50 unid/l é uma concentração saturante de enzima após
80 dias de imersão, sendo esta a concentração de enzima normalmente presente no plasma
sanguíneo humano.
6.2.8 Comportamento de hidratação de misturas termoplásticas de SEVA-C
O comportamento de misturas poliméricas na presença de soluções aquosas é importante
quando um sistema é aplicado no campo biomédico, uma vez que o grau de hidratação
influencia as propriedades superficiais, a mobilidade e o tipo de mecanismo de transporte de
soluto. Quando um biomaterial é implantado na presença de fluidos humanos, difunde para o
meio à medida que ocorre degradação.
Tal como referido no capítulo de Materiais e Métodos, foi utilizada a análise
termogravimétrica em provetes imersos em solução, em estudos de degradação, e
quantificação da percentagem de água absorvida e libertada pelo material, em diferentes
tempos de imersão.
Os valores obtidos em TGA encontram-se nas Figura 6.15 e Figura 6.16.
Absorção água SEVA-C (%)
12
10
8
6
4
2
0
0
50
100
Tempo de imersão (dias)
150
200
Figura 6.15 Percentagem de absorção de água de SEVA-C, na presença (■) e ausência (□) de enzima,
em função do tempo de imersão, em TGA (média de pelo menos 3 resultados em cada amostra). As
barras de erro são os intervalos de confiança de 95% em cada valor médio.
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |195
A percentagem de absorção de água de SEVA-C na presença de enzima, medida em TGA,
tem um valor aproximado de 9%, durante 100 dias de imersão. Esta percentagem foi
calculada considerando a massa de provete após o processo de pré-condicionamento como
referência. Assim, os provetes com menores perdas de massa de água durante o processo de
pré-condicionamento poderão perder menos água durante a análise em TGA, dado tratar-se
de processos sequenciais. Esta poderá ser uma possível explicação para a diminuição da
percentagem de absorção de água das misturas, para tempos de imersão superiores a 100
dias.
A percentagem de absorção de água quantificada resulta da perda de massa durante o
processo de degradação enzimática, que conduz a um aumento da porosidade superficial,
associada à libertação de produtos. A água pode também actuar como lubrificante da matriz
polimérica, devido ao carácter predominantemente hidrofílico desta mistura termoplástica.
Provavelmente, a presença do copolímero de etileno-álcool vinílico, com unidades
hidrofóbicas resultantes dos grupos etileno, diminui o grau de hidratação e dificulta a difusão
das moléculas de água para a estrutura polimérica. Ensaios realizados na ausência de
enzimas apresentam cerca de 3% menos percentagem de absorção de água.
A Figura 6.16 mostra a perda de massa de água cumulativa durante o processo de pré-
% Perda de água SEVA-C
condicionamento.
30
20
10
0
0
50
100
150
200
Tempo de imersão (dias)
Figura 6.16 % Perda de massa de água de SEVA-C, na presença (■) e ausência (□) de enzima, em
função do tempo de imersão (valores obtidos durante o pré-condicionamento dos provetes).
RESULTADOS E DISCUSSÃO |196
Durante o processo de pré-condicionamento a água absorvida que se encontra na estrutura
molecular ou entre as cadeias do polímero liberta-se para a atmosfera, como resultado do
aumento da degradação e da porosidade superficial, em função do tempo de imersão. Após
100 dias, a perda de massa de água de SEVA-C estabilizou num valor próximo de 35%, no
caso dos provetes imersos em solução enzimática. A enzima ataca a estrutura superficial
permitindo a libertação de cadeias de baixo peso molecular, aumentando a porosidade do
material e a percentagem de absorção de água do sistema polimérico, devido ao seu carácter
predominantemente hidrofílico. A perda de massa de água em ensaios na ausência de
enzima foi constante e igual a aproximadamente 20%, estando associada principalmente à
libertação de glicerol para a solução e ao processo de absorção/libertação de água
característico deste tipo de misturas.
A Figura 6.17 mostra a comparação das curvas entre a percentagem de perda de massa de
água durante o processo de pré-condicionamento, e a soma da massa total dos compostos
Massa libertada/massa inicial
provete (% p/p)
quantificados em solução.
30
20
10
0
0
50
100
Tempo de imersão (dias)
150
200
Figura 6.17 Comparação entre a massa de todos os compostos libertados para a solução (■), por
massa inicial de provete (1.6 g) em 50 ml de solução, e a percentagem de perda de massa de água
(□), em função do tempo de imersão.
As duas curvas exibem um comportamento semelhante. A avaliação da massa total de
compostos degradados em solução é aproximadamente equivalente à percentagem de perda
de massa de água dos provetes durante o processo de pré-condicionamento, mostrando uma
boa correlação entre o grau de hidratação e a quantidade de produtos degradados ao longo
do tempo de imersão. O que se libertou do material é equivalente à percentagem de
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |197
compostos que se encontram em solução. O aumento do volume livre da matriz polimérica (e
respectivo aumento de mobilidade molecular) resulta da extracção de cadeias moleculares da
matriz polimérica por degradação, tendo como consequência a lubrificação da estrutura
polimérica, devido ao aumento da percentagem de água estrutural.
6.2.9 Morfologia e alterações superficiais de SEVA-C
O conhecimento do comportamento superficial de um biomaterial em contacto com o meio é
de grande importância nas interacções de um material com os tecidos circundantes, dado
que a superfície é o primeiro contacto que o material estabelece com o meio, formando uma
interface biocompatível ou não com o meio que rodeia. A natureza química e morfológica da
superfície de biomateriais determina como o biomaterial interage com o tecido circundante e
com os fluidos fisiológicos após implantação.
O efeito da degradação na presença e ausência de enzimas, na superfície dos provetes SEVAC em função do tempo de imersão, foi seguido pela medição dos ângulos de contacto pelo
método da gota séssil. Os resultados das medições do ângulo de contacto em superfícies
SEVA-C, após contacto com solução fisiológica simulada na presença e ausência de enzimas,
em função do tempo de imersão, utilizando água como líquido de medição, encontram-se na
Figura 6.18.
RESULTADOS E DISCUSSÃO |198
Ângulo contacto (º)
90
70
50
0
20
40
60
80
100
Tempo de imersão (dias)
Figura 6.18 Variação do ângulo de contacto em superfícies SEVA-C, na presença (■) e ausência (□)
de enzimas, em função do tempo de imersão, utilizando água como líquido de medição (medições em
provetes secos).
Em ambos os casos o ângulo de contacto é superior a 50º, tratando-se portanto de
superfícies SEVA-C hidrofóbicas. Na presença e ausência de enzimas não ocorrem variações
de hidrofobicidade superficial ao longo do tempo de imersão, notam-se apenas pequenas
diferenças entre as duas superfícies. As superfícies degradadas na presença de enzima
exibem hidrofobicidade mais elevada, uma vez que a média do valor dos ângulos de contacto
é superior ao ângulo medido em superfícies na ausência de enzimas. Esta diferença de
resultados no carácter polar das superfícies pode ser atribuída à combinação de vários
factores: superfície mais rugosa, menor fase amorfa de amido na superfície exterior por
degradação, maior porosidade (confirmado pelas análises em SEM e AFM) e menor
quantidade de água.
A partir dos valores do ângulo de contacto medido com diferentes líquidos foi possível
determinar os valores da tensão e energia hidrofóbica superficial. A energia livre de
superfícies SEVA-C degradadas na presença de enzimas (Tabela 6.4) revela que a
componente apolar ( γ sLW = 24 mJ/m2) se mantém mais ao menos constante ao longo do
tempo de imersão, sendo predominantemente dadora de electrões ( γ s− > γ s+ ) e hidrofóbica
( γ s− < 28 mJ/m2). Existem pequenas variações de γ s− , todavia não concordantes ao longo do
tempo. Isto pode estar associado com a deposição de iões na superfície (não confirmado por
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |199
outras técnicas), com a variação dos produtos libertados por degradação para a solução que
irão interagir com a superfície, alterando a capacidade dadora de electrões.
Tabela 6.4 Componentes de tensão superficial de superfícies SEVA-C (em mJ/m2), determinadas
pelas medições dos ângulos de contacto, para diferentes tempos de imersão.
Tempo de
imersão (dias)
5
37
80
101
γ sLW
γ s−
γ s+
γ sAB
γ sTOT
22.02
26.62
22.07
23.89
14.19
13.69
6.46
12.33
0.39
0.55
1.29
0.4
4.7
5.5
5.78
4.43
26.72
32.17
27.85
28.32
Os valores da energia livre de interacção hidrofóbica entre as moléculas da superfície e a
água são semelhantes (Tabela 6.5), confirmando pequenas variações ao longo do tempo de
imersão. Estes valores também evidenciam uma superfície de natureza hidrofóbica
tot
( ΔG sws
<0).
Tabela 6.5 Interacção de energia livre interfacial (ΔGsws em mJ/m2) entre a superfície (s) e água (w),
para diferentes tempos de imersão.
Tempo de imersão
(dias)
LW
ΔG sws
AB
ΔG sws
tot
ΔG sws
5
37
80
101
-0.001
-0.48
-0.002
-0.096
-22.71
-23.25
-39.26
-27.19
-22.71
-23.73
-39.26
-27.29
Foram realizadas análises em DSC para detectar eventuais alterações na estrutura semicristalina de SEVA-C durante o processo de degradação. As alterações de energia foram
registadas em termos de calor (entalpia) absorvido ou emitido, relativamente a uma
referência.
Os termogramas típicos de SEVA-C obtidos para diferentes tempos de imersão encontram-se
na Figura 6.19.
RESULTADOS E DISCUSSÃO |200
0
Fluxo calor (mW)
-1
0
50
100
150
200
-2
-3
-4
-5
0.67 dias
-6
100 dias
-7
169 dias
Temperatura (ºC)
Figura 6.19 Termogramas DSC em provetes SEVA-C após imersão durante 0.67, 100 e 169 dias.
A temperatura de fusão de SEVA-C deve estar associado principalmente à fusão de EVOH.
Durante o processo de fusão, só a parte amorfa é afectada, ao contrário da fase cristalina
que deve manter-se inalterada. No entanto, como o amido é uma molécula semi-cristalina, a
libertação dos carboidratos pode alterar parte da fase cristalina.
Referência
Pico fusão (ºC)
170
160
150
140
130
0
50
100
150
200
Tempo de imersão (dias)
Figura 6.20 Variação do pico de fusão de SEVA-C em função do tempo de imersão.
O pico de fusão de SEVA-C mantém-se praticamente constante (aproximadamente 140ºC),
durante todo o tempo de imersão.
A Figura 6.21 mostra a variação de entalpia de fusão de EVOH ao longo do tempo de
imersão.
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |201
Tempo de imersão (dias)
0
Entalpia (J/g)
0
50
100
150
200
-10
-20
-30
Referência
Figura 6.21 Entalpia associada à degradação de SEVA-C em função do tempo de imersão (valores
obtidos a partir dos termogramas DSC).
A variação de energia associada aos primeiros dias de imersão, pode ser atribuída à saída de
plasticizador. Ambos os resultados demonstram um ataque preferencial da fase amorfa
durante o processo de degradação.
O efeito da solução fisiológica na morfologia superficial de provetes SEVA-C, em função do
tempo de imersão foi seguido por microscopia electrónica de varrimento (SEM). A Figura 6.22
mostra as micrografias SEM da superfície morfológica em provetes SEVA-C, antes e após
degradação durante 200 dias de imersão, em solução HBSS com actividade enzimática.
RESULTADOS E DISCUSSÃO |202
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
Figura 6.22 Micrografias SEM das superfícies SEVA-C (x 1500). (a) Controlo, (b) após 8 dias de
imersão, (c) após 30 dias de imersão, (d) após 80 dias de imersão, (e) após 100 dias de imersão e (f)
após 117 dias de imersão. Os provetes foram secos antes da análise SEM.
É visível um aumento do número, tamanho de poros e rugosidade superficiais em função do
tempo de imersão. O controlo (a) apresenta uma superfície mais ao menos lisa,
comparativamente ao provete mais degradado (f) com uma superfície mais rugosa, por efeito
da dissolução hidrolítica superficial. O número e tamanho de poros foi aumentando ao longo
do tempo de imersão e para tempos de imersão mais longos, os poros foram alargando
formando fissuras na superfície do material. Este facto pode estar relacionado com a
dissolução hidrolítica superficial do provete inicial pela acção enzimática, dado que o primeiro
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |203
contacto que a enzima tem com o material é à superfície. A análise permitiu também avaliar
a morfologia, tamanho e distribuição dos poros, tendo sido realizadas algumas medições de
tamanho de poros, que se situaram entre 300 e 400 nm. O aparecimento de poros à
superfície é resultante do processo de degradação de perda de massa, que após secagem
deu origem ao aparecimento de poros.
Foi também efectuada a análise microestrutural das soluções de degradação de provetes e
pós SEVA-C e amido sem qualquer tratamento, fervidos em água destilada com agitação
durante 5 horas, de forma a simular condições extremas de degradação. As soluções de
degradação de cada uma das amostras foram liofilizadas antes da análise de SEM. As
imagens mostram que a mistura termoplástica à base de amido (SEVA-C) não se dissolveu,
formando uma microdispersão de agregados de microesferas (Figura 6.23).
(a)
(b)
Figura 6.23 Micrografias SEM de soluções de degradação em (a) placas e (b) pós SEVA-C após ferver
em água destilada durante 5 h (x 1000). As soluções de degradação foram liofilizadas antes de
analisadas.
As microesferas observadas apresentam uma estrutura tipo gota. A fase contínua de amido
pode formar complexos na presença de EVOH, gerando uma estrutura granular,
provavelmente devido à capacidade do amido estabelecer interacções hidrofóbicas com o
copolímero de etileno-álcool vinílico (EVOH). O material perdeu a integridade estrutural,
tomando uma configuração granular.
Tal como demonstrado nos resultados analíticos anteriores, para tempos de imersão
superiores a 100 dias, a velocidade de degradação tende a estabilizar. No entanto, a enzima
mantém-se activa, existindo ainda fase amorfa no interior do material por degradar. Uma
hipótese possível para este comportamento é o aumento de dificuldade das enzimas se
RESULTADOS E DISCUSSÃO |204
unirem às moléculas de amido residuais na estrutura interna, e que se encontram fortemente
misturadas com o componente sintético insolúvel, tal como demonstrado na estrutura em
gota (Figura 6.23). O amido residual que permanece na estrutura, após um longo período de
degradação, pode encontrar-se rodeado de cadeias de EVOH não degradáveis, formando uma
barreira à degradação. Estas imagens sugerem um mecanismo de degradação baseado na
actividade enzimática sobre a superfície do material e regiões de amido acessíveis, e inibidas
nas zonas onde o copolímero de EVOH rodeia os domínios de amido.
As micrografias das soluções de degradação de placas de amido puro após ferver em água,
mostram uma morfologia superficial lisa, com pequenos poros resultantes da degradação.
Figura 6.24 Micrografia SEM da solução de degradação de placas de amido após ferver em água
destilada durante 5 h (x 1000). As soluções de degradação foram liofilizadas antes de analisadas.
Para observar as propriedades superficiais e de rugosidade em provetes SEVA-C, em função
do tempo de imersão, foi utilizada microscopia de força atómica. As imagens topográficas de
AFM em “tapping mode” confirmam um aumento de porosidade e rugosidade em função do
tempo de imersão (Figura 6.25).
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |205
(a)
(c)
Figura 6.25 Imagens AFM em “tapping mode”. (a) Controlo, (b) após 21 dias de imersão, (c) após 91
dias de imersão e (d) após 101 dias de imersão (eixo ZZ 1500 nm e scan 10 μm). Os provetes foram
secos após cada período de imersão.
Foram observadas alterações morfológicas superficiais nos provetes ao longo do tempo de
imersão. Os provetes com mais tempo de imersão (102 dias) apresentam pequenos poros na
superfície e aumento da rugosidade, evidenciando vazios estruturais. À medida que a
rugosidade aumenta em provetes imersos durante mais tempo, a área específica efectiva
disponível para a degradação deve também aumentar.
A rugosidade superficial do material foi também medida, em função do tempo de imersão. As
medidas mais comuns de rugosidade são: rugosidade média (Ra) e rugosidade máxima
(Rmax). A média de rugosidade variou entre 47 nm para o controlo e 384 nm em provetes
com mais tempo de imersão (102 dias). O mesmo comportamento foi obtido nas restantes
medidas de rugosidade (RMS e Rmax), tal como demonstrado na Tabela 6.6.
(b)
(d)
RESULTADOS E DISCUSSÃO |206
Tabela 6.6 Rugosidade superficial de provetes SEVA-C em RMS (média quadrática), Ra (rugosidade
média) e Rmax (rugosidade máxima) para diferentes tempos de imersão.
Tempo de imersão
(dias)
Controlo
21
91
101
Ra
(nm)
RMS
(nm)
47.21
169.98
184.13
384.17
63.19
218.97
242.78
497.74
Rmax
(nm)
66
143
253
298
A técnica de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) foi
seleccionada para avaliar possíveis alterações na estrutura química dos grupos funcionais,
por efeito da degradação térmica das cadeias poliméricas durante o processamento ou após
degradação em solução. Foram analisadas as soluções de degradação resultantes da
imersão de placas de amido e SEVA-C em água destilada a ferver com agitação durante 5
horas, de forma a simular condições extremas de degradação. As soluções foram liofilizadas
para evitar a sobreposição no espectro das bandas OH características da água.
Para melhor resolução dos picos sobrepostos foi aplicada a segunda derivada. Uma
comparação do espectro da 2ª derivada, entre os diferentes materiais, amido de milho e
SEVA-C, encontra-se na Figura 6.26.
0,066
SEVA-C
0,04
0,02
Amido
0,00
%T
-0,02
-0,04
-0,06
-0,08
-0,10
Amido fervido
-0,12
961,7
940
920
900
880
860
cm
840
820
800
780
760
740
720 707,1
-1
Figura 6.26 Espectro FTIR 2ª derivada das soluções de degradação em pó SEVA-C e amido após
ferver em água destilada durante 5 horas.
As principais diferenças situam-se na banda de 780 cm-1, associadas a alterações nos modos
de vibração dos grupos glucosídicos. O amido na mistura termoplástica de SEVA-C sofreu
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |207
degradação térmica durante o processamento, encontrando-se parcialmente destruído na
estrutura do material, por alteração dos grupos funcionais associados às ligações
glucosídicas. Nesta zona, o provete SEVA-C e amido após ebulição, apresentam bandas de
absorção muito semelhantes, o que confirma a degradação da fase amorfa durante o
processamento na mistura. As bandas 860-800 cm-1 mostram diferenças entre o amido e
SEVA-C; estas bandas podem ser referentes a padrões adjacentes de C-H de vibração do anel
benzénico e CH2 resultantes da degradação térmica.
6.3 Conclusões
A biodegradabilidade de misturas à base de amido com α-amílase aumentou até 100 dias de
imersão aproximadamente, sendo a percentagem de perda de massa total de 35%. Foi
possível observar diferentes velocidades de degradação, sendo a fase hidrolítica mais rápida
até 100 dias de imersão, e tendendo a estabilizar posteriormente. Os principais sacarídeos
nas soluções de degradação foram a glucose, a maltose e a maltotriose, resultantes do
processo de degradação enzimática das macromoléculas de amido de SEVA-C em
fragmentos de glucose, sendo a quantidade de amido encontrada em solução bastante baixa.
O glicerol (plasticizador) libertou-se rapidamente, encontrando-se praticamente todo em
solução durante os primeiros dias de imersão.
A quantidade relativa de açúcares redutores nas soluções de degradação em ensaios
semelhantes na ausência de enzimas é cerca de 100 vezes menor, sendo evidenciada a forte
acção da enzima na velocidade de degradação.
A libertação da fase amorfa foi compensada pelo aumento da percentagem de absorção de
água estrutural, devido à acção lubrificante da água na estrutura polimérica e aumento da
porosidade e rugosidade superficiais por efeito da solução enzimática, tal como confirmado
pelas micrografias SEM e imagens AFM. Para tempos de imersão mais longos, os poros
foram alargando, formando fissuras na superfície do material. Este facto pode estar
relacionado com a dissolução hidrolítica superficial do provete pela acção enzimática.
Foi obtida uma boa correlação entre a percentagem de massa total de compostos libertados
em solução e a percentagem de perda de massa de água durante o processo de précondicionamento, devido à acção lubrificante da água sobre a estrutura polimérica.
CONCLUSÕES |208
As superfícies degradadas na presença de enzima exibem hidrofobicidade mais elevada,
podendo ser atribuída à combinação de vários factores: superfície mais rugosa, menor fase
amorfa de amido na superfície exterior por degradação, maior porosidade (confirmado pelas
análises em SEM e AFM) e menor quantidade de água.
Os ensaios de degradação experimentais podem ser realizados durante longos períodos
(superior a 150 dias) sem perda de actividade enzimática, no entanto as cinéticas de
degradação são bastante lentas.
A cinética do processo de degradação depende da concentração enzimática para os períodos
iniciais, aumentando à medida que a concentração aumenta durante os primeiros estágios e
estabilizando posteriormente num nível constante, diferente para cada uma das
concentrações enzimáticas.
Por análise em IR foi confirmada a degradação parcial térmica do amido nas misturas
termoplásticas durante o seu processamento, por alteração das bandas de absorção
características dos grupos glucosídicos associados à fase amorfa, o que contribui para a sua
libertação durante os ensaios de degradação.
Durante os ensaios, foi libertada e degradada apenas parte da fase amorfa da mistura SEVAC para a solução (25%). A restante fase permaneceu interpenetrada com a estrutura interna.
No entanto, é natural que a estrutura polimérica interna se encontre fragmentada. A não
degradação da totalidade da fase amorfa de amido deve estar associada à especificidade da
estrutura desta mistura termoplástica. Como o amido se deve encontrar no interior dos
grupos de etileno, o acesso das enzimas às moléculas de amido fortemente interpenetradas
com o componente sintético insolúvel é dificultado, sendo menos susceptível à degradação.
Por outro lado, a difusão hidrolítica das cadeias de carboidratos do interior para o exterior da
matriz é difícil, condicionado também pela baixa porosidade. A estabilização da taxa de
degradação para tempos de imersão mais longos pode ser atribuída possivelmente ao início
do ataque ao complexo amilose-EVOH, menos susceptível à degradação, e às partículas de
amido encapsuladas pelo EVOH, que permanecem praticamente inalteráveis, bloqueando o
acesso enzimático.
Estes ensaios evidenciam o papel fundamental das enzimas (α-amílase) presentes no plasma
sanguíneo humano, na velocidade de degradação de SEVA-C. A quantidade de amido residual
não degradado após 100 dias de degradação, sugere a possibilidade de optimização da
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO |209
degradação do material, variando a porosidade e espessura do material (por exemplo:
utilização de estruturas em espuma).
No entanto, estes sistemas poliméricos podem ser reabsorvidos e degradados mais
rapidamente quando implantados in vivo, pelo aumento do número de enzimas disponíveis
para a hidrólise enzimática, o que aumenta a taxa de degradação metabólica.
Os estudos de degradação em solução fisiológica simulada são importantes, servindo como
primeira abordagem dos mecanismos que ocorrem in vivo, permitindo também uma seriação
de materiais com propriedades mecânicas e de degradação mais apropriadas às aplicações
específicas pretendidas.
6.4 Bibliografia
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CAPITULO 7
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS
TERMOPLÁSTICAS À BASE DE
AMIDO UTILIZANDO FILMES DE
DIFERENTES ESPESSURAS
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
7. DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS
TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO UTILIZANDO
FILMES DE DIFERENTES ESPESSURAS
SUMÁRIO
As misturas poliméricas à base de amido de milho são degradadas por processos hidrolíticos e
enzimáticos. O processo de degradação depende do tipo de polímero, do seu peso molecular,
cristalinidade, porosidade, estrutura química, do meio bioquímico específico e do comportamento
mecânico no interior do corpo. A presença de amido afecta positivamente as cinéticas de degradação.
Neste capítulo são apresentados os resultados obtidos em 2 ensaios realizados em solução fisiológica
simulada (HBSS), fazendo variar a espessura do material e a concentração enzimática entre 50 e 100
unid/l de α-amilase. Foram utilizados provetes de secção quadrada de SEVA-C e provetes de amido
com área superficial de 10 cm2, assim como filmes SEVA-C com área exposta de 95 cm2 e 190 cm2,
mantendo a massa total igual a 1.6 g.
A percentagem de amido e de outras moléculas de açúcares mais pequenas (maltotriose, maltose,
glucose) em solução é superior no ensaio com 100 unid/l, relativamente ao ensaio realizado com 50
unid/l de enzima. O aumento da concentração de enzima aumenta o número de locais activos e de
ligação, aumentando a velocidade de libertação de sacarídeos em solução. A limitação da área
superficial exposta à acção enzimática SEVA-C, foi confirmada pela diferença na percentagem de
glucose e polissacarídeos entre provete e filmes em solução. A degradação enzimática não depende
assim directamente da massa mas da área exposta à degradação, já que para materiais com a
mesma massa mas com áreas diferentes a percentagem de sacarídeos em solução é diferente. O
aumento da área superficial nos filmes não conduziu a um aumento proporcional da percentagem de
sacarídeos, devido ao limite atingido no número de sítios disponíveis de catálise/volume.
Foram libertados apenas parte dos açúcares em solução, aproximadamente 20% em massa,
relativamente à massa inicial nos filmes, por degradação enzimática. Os restantes açúcares devem
encontrar-se retidos no interior do material, uma vez que a percentagem total de fase amorfa no
interior do material é cerca de 42%.
A libertação de parte da fase amorfa da microestrutura interna do material conduziu a um aumento da
porosidade superficial tal como confirmado em SEM e AFM, permitindo a absorção de crescentes
quantidades de água. A porosidade e rugosidade superficiais aumentaram ao longo do tempo de
imersão. Verificou-se que o aumento da porosidade facilita a difusão externa e interna dos produtos
para a solução, aumentando a perda de massa do material.
7.1
INTRODUÇÃO
217
7.2
RESULTADOS E DISCUSSÃO
219
7.3
CONCLUSÕES
261
7.4
BIBLIOGRAFIA
264
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO UTILIZANDO FILMES DE DIFERENTES ESPESSURAS |217
7.1 Introdução
A procura de novos materiais na reparação e regeneração óssea são um dos campos mais
estudados na área de biomateriais. As propriedades particulares do osso tornam difícil a
produção de um material que reúna todas as características desejáveis, incluindo as
propriedades mecânicas, capacidade de osteossíntese e biocompatibilidade.
Nas aplicações temporárias, os biomateriais utilizados como substitutos ósseos devem ser
temporários, servindo apenas como estruturas de suporte durante o processo de regeneração
óssea (Reis et al., 1997a), permitindo ao mesmo tempo uma distribuição de carga entre o
osso e o material mais uniforme, e contribuindo para uma recuperação mais eficiente.
Os principais requisitos de um biomaterial biodegradável utilizado como implante foram já
referidos no capítulo 2 (Revisão bibliográfica).
Os estudos in vitro do comportamento dos materiais para implantes ósseos são importantes,
podendo servir como modelo e primeira abordagem para seleccionar e testar biomateriais na
avaliação da biocompatibilidade e bioactividade, antes da sua implantação in vivo (Marques et
al., 2002). Passados estes testes, o passo seguinte antes dos ensaios clínicos é a sua
avaliação em animais, uma vez que a complexidade do sistema fisiológico completo não pode
ser totalmente avaliada por ensaios in vitro (Mendes et al., 2001).
7.1.1 Misturas termoplásticas à base de amido
As propriedades, composição e modos de processamento de misturas termoplásticas
biodegradáveis à base de amido de milho com vários polímeros sintéticos, foram já referidas
no capítulo 2 (Revisão bibliográfica). Estas misturas termoplásticas têm sido propostas em
várias aplicações biomédicas.
O número de variáveis envolvidas durante a mistura de amido/EVOH torna este processo
complexo, conduzindo a várias morfologias e propriedades associadas (Simmons e Thomas,
1995). Variando a composição do copolímero sintético é possível alterar o balanço entre as
interacções hidrofóbicas e hidrofílicas e consequentemente a microestrutura (Bastioli et al.,
1994a).
INTRODUÇÃO |218
A biodegradação e a biocompatibilidade de polímeros à base de amido quando em contacto
com as células, tem sido demonstrado em vários estudos in vitro (Gomes et al., 2001a;
Marques et al., 2002; Marques et al., 2003) e in vivo (Mendes et al., 2001), e induzem uma
boa resposta biológica, tal como definido pelos padrões internacionais.
As misturas à base de amido, exibem propriedades mecânicas próximas do osso humano, e
cinéticas de degradação apropriadas durante o processo de recuperação do tecido afectado
(Demirgoz et al., 2000; Gomes et al., 2001b; Reis e Cunha, 1995a). Quando revestidos com
uma camada de apatite semelhante ao osso, estes polímeros biodegradáveis têm também
um elevado potencial como materiais de reparação óssea com carácter bioactivo (Oliveira et
al., 1999; Oliveira et al., 2003b; Reis et al., 1997c).
7.1.2 Degradação de misturas termoplásticas à base de amido
As misturas poliméricas à base de amido de milho são degradadas por processos hidrolíticos
e enzimáticos. A amilose e a amilopectina, componentes base do amido, são totalmente
hidrolisadas por enzimas de ligação (Araujo et al., 2001; Azevedo et al., 2003a). As regiões
cristalinas do amido são mais resistentes às acções química e enzimática.
Estes materiais, quando imersos em meio fisiológico, apresentam os seguintes mecanismos:
a água infiltra-se no polímero e ataca as cadeias poliméricas conduzindo a cisão da cadeia
por hidrólise; subsequentemente o polímero perde massa e as cadeias de baixo peso
molecular são extraídas. O processo de cisão da cadeia é também influenciado pela
actividade enzimática e pela acção de fluidos do organismo. O processo de degradação
depende do tipo de polímero, do seu peso molecular, da cristalinidade, porosidade, estrutura
química, do meio bioquímico específico e do comportamento mecânico no interior do corpo.
Estudos realizados utilizando misturas à base de amido mostram que a fase amorfa de amido
no composto, sendo mais hidrofílica, aumenta o processo de infiltração de água (Reis et al.,
1997e; Reis e Cunha, 2000), conduzindo a alterações na forma, rugosidade superficial e
libertação de produtos de degradação. A presença de amido afecta positivamente as cinéticas
de degradação de polímeros sintéticos biodegradáveis (Neves et al., 2005).
As principais fases do processo de degradação in vitro de compósitos de amido+EVOH+HA
foram já referidas no capítulo 2 (Revisão bibliográfica).
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO UTILIZANDO FILMES DE DIFERENTES ESPESSURAS |219
Como confirmado em trabalhos já publicados (Araujo et al., 2004a; Araujo et al., 2004b), o
processo de degradação destas misturas termoplásticas ocorre preferencialmente na
superfície, zona de primeiro contacto do material com a solução. Foram observadas
alterações significativas na rugosidade, porosidade e textura superficial, como resultado da
dissolução hidrolítica superficial pela acção enzimática.
A reacção enzimática é lenta, devido possivelmente à limitação morfológica de substrato
durante a reacção. A maior parte da fase amorfa do amido deve encontrar-se dispersa numa
matriz de cadeias do copolímero de etileno-álcool vinílico, dificultando a interacção das
enzimas com as moléculas de amido nos domínios interiores, fortemente interpenetrados no
componente sintético insolúvel.
A enzima pode actuar apenas na superfície, não penetrando na estrutura interna, sendo o
processo de degradação incompleto, variando na razão directa da porosidade e espessura,
mais adequada à velocidade de degradação do material.
Para complementar e aprofundar o estudo da limitação estrutural do material à degradação
foram realizados ensaios enzimáticos variando a espessura do material (mantendo a mesma
massa de material) e concentração enzimática, paralelamente foi também realizado um
ensaio com provete constituído exclusivamente por amido em solução enzimática.
Neste capítulo são apresentados os resultados obtidos em 2 ensaios realizados em solução
fisiológica simulada (HBSS) com actividade enzimática (α-amílase). Pretendeu-se estudar o
fenómeno de limitação estrutural e de porosidade do material à degradação enzimática,
confirmado nos estudos analíticos e de morfologia apresentados nos capítulos anteriores.
Nestes ensaios variou-se a espessura do material, aumentando assim a área exposta à
degradação.
7.2 Resultados e Discussão
Foram processados provetes de SEVA-C e provetes de amido de secção quadrada com área
superficial de 10 cm2, além dos provetes foram também processados filmes de material
SEVA-C, com área exposta para 95 cm2 e 190 cm2, respectivamente, tal como descrito na
Tabela 3.2 no capítulo de Materiais e Métodos. Em qualquer um dos materiais a massa
manteve-se constante e igual a 1,6 g. Foram também utilizados discos de 10 mm de
diâmetro e 1 mm de espessura nos estudos de morfologia superficial em SEM e AFM. Estes
RESULTADOS E DISCUSSÃO |220
materiais foram imersos em solução HBSS com enzima numa concentração semelhante ao
plasma sanguíneo, 50 unid/l, a 37ºC e pH 7.4 em frascos individuais de 50 cm3, com
agitação (150 r.p.m). Foram retiradas amostras durante aproximadamente 3 meses por
períodos de amostragem pré-definidos, para quantificação dos produtos libertados e
alterações morfológicas durante o processo de degradação enzimática.
Posteriormente, foi realizado um novo ensaio utilizando provetes SEVA-C com área superficial
de 10 cm2, 2 e 4 filmes de SEVA-C com área de 95 cm2 e 190 cm2, respectivamente. Em
qualquer um dos materiais a massa manteve-se constante e igual a 1,6 g. Após confirmação
da limitação estrutural do material à degradação enzimática nos ensaios com filmes,
pretendeu-se confirmar a limitação por efeito da concentração enzimática. Neste ensaio
duplicou-se a concentração de enzima α-amílase para 100 unid/l, apesar de 50 unid/l ser a
concentração de α-amílase, normalmente presente no organismo. Estes ensaios foram
também realizados por imersão em solução HBSS a 37ºC e pH 7.4 em frascos individuais de
50 cm3, com agitação (150 r.p.m). Periodicamente foram retiradas amostras durante
aproximadamente 2,5 meses para controlo analítico e morfológico. Todas as manipulações
foram realizadas numa câmara de fluxo laminar.
A descrição de todos os métodos analíticos, da morfologia microestrutural e da actividade
enzimática utilizados na caracterização das soluções de degradação e do material, para
períodos de degradação pré-definidos em cada um dos ensaios, encontra-se no capítulo de
Materiais e Métodos.
Os principais objectivos na realização destes ensaios de degradação enzimática foram: (i)
confirmar a limitação estrutural do material à degradação enzimática variando a área exposta,
mantendo a mesma massa de material; (ii) verificar a limitação do material por efeito da
concentração enzimática, aumentando a concentração de enzima para o dobro; (iii) identificar
e quantificar os produtos de degradação em solução fisiológica simulada com α-amílase e
perda de propriedades, utilizando métodos analíticos apropriados; (iv) utilizar a análise
térmica por termogravimetrica para quantificar a extensão da degradação em cada um dos
materiais e ao longo do processo de imersão, utilizando padrões puros de cada um dos
componentes da mistura; (v) avaliar por microscopia e por medição do valor das tensões
superficiais as alterações morfológicas superficiais, resultantes do contacto com a solução
fisiológica simulada com actividade enzimática, ao longo do tempo de imersão; (vi) criar um
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO UTILIZANDO FILMES DE DIFERENTES ESPESSURAS |221
modelo estrutural de degradação enzimática, estabelecendo uma correlação entre a cinética
de degradação analítica e a microestrutura/porosidade desta classe de materiais.
7.2.1 Quantificação do amido em solução
Foi quantificada a percentagem de amido libertado para a solução por massa inicial de
provete de amido por acção de enzima (50 unid/l), que se encontra na Figura 7.1. Dada a
elevada percentagem de amido em solução, não foi possível representar no mesmo gráfico os
resultados referentes aos restantes materiais.
g amido/ g provete inicial (%)
35
30
25
20
15
10
5
0
0
20
40
60
80
100
Tempo imersão (dias)
Figura 7.1 Massa de amido libertado para a solução com 50 unid/l de enzima, por massa inicial de
provete de amido (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As barras de erro
são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com a
distribuição t Student.
Ao fim de 10 dias atinge-se praticamente o valor máximo de amido libertado para a solução,
sendo também uma evidência de que a enzima se encontra em actividade. Logo no início da
experiência foram observadas pequenas partículas de material em solução, confirmando-se
assim a fragmentação do provete pela acção enzimática e o efeito da acção lubrificante da
água no material. A restante percentagem de amido, aproximadamente 75%, deve encontrarse em fragmentos menores de sacarídeos, não quantificados pelo método.
Nas Figura 7.2 a Figura 7.4 são apresentados os resultados referentes à quantificação do
amido em solução, para o provete e filmes, comparando os resultados obtidos com 50 e 100
unid/l de α-amílase.
RESULTADOS E DISCUSSÃO |222
g amido/g inicial (%)
0,04
0,03
0,02
0,01
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Tempo de imersão (dias)
Figura 7.2 Massa de amido libertado para a solução com 100 (■) e 50 (□) unid/l de enzima, por
massa inicial de provete SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As
barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo
com a distribuição t Student.
g amido/g inicial (%)
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Tempo de imersão (dias)
Figura 7.3 Massa de amido libertado para a solução com 100 (■) e 50 (□) unid/l de enzima, por
massa inicial de 2 filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As
barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo
com a distribuição t Student.
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO UTILIZANDO FILMES DE DIFERENTES ESPESSURAS |223
g amido/g inicial (%)
0,06
0,04
0,02
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Tempo de imersão (dias)
Figura 7.4 Massa de amido libertado para a solução com 100 (■) e 50 (□) unid/l de enzima, por
massa inicial de 4 filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As
barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo
com a distribuição t Student.
Verifica-se que, em qualquer um dos materiais a quantidade de amido libertado no ensaio
com 100 unid/l é sempre superior relativamente ao ensaio com 50 unid/l de enzima, apesar
da quantidade detectada em solução ser bastante baixa, aproximadamente 0.08% no
máximo. Este resultado seria previsível, já que ao aumentar a concentração de enzima
aumenta o número de locais activos e de ligação, aumentando a quantidade de subprodutos
libertados. Foram quantificadas apenas pequenas cadeias de açúcares dispersas na matriz
do material libertadas para a solução, resultantes da degradação térmica durante o
processamento das amostras e não da acção enzimática. A decomposição do amido está
também condicionada pelo facto de este se encontrar no interior da microestrutura rodeado
de cadeias do copolímero de EVOH, dificultando a transferência de massa por difusão externa
e interna do amido. A quantidade total de fase amorfa no interior do material (SEVA-C)
corresponde a aproximadamente 42%, de acordo com ensaios realizados anteriormente,
bastante superior ao amido encontrado em solução. Confirma-se assim a limitação estrutural
do material, condicionada ainda pela baixa concentração enzimática em solução.
Parte da fase amorfa de amido estrutural deve ter sido libertada e degradada em oligómeros
de açúcares mais pequenos pela acção enzimática, não quantificados pelo método. É
também necessário considerar que o método de doseamento do amido fornece somente uma
medida qualitativa do amido em solução, porque o iodo reage apenas com parte da molécula
RESULTADOS E DISCUSSÃO |224
de amido em forma de hélice, onde o iodo se aloja, podendo existir maior quantidade de
amido em solução, não quantificada pelo método.
7.2.2 Quantificação de monossacarídeos e seus derivados em solução
A percentagem de glucose libertada para a solução foi quantificada pelo método do ácido
dinitrossalicílico (DNS) para ambos os ensaios, de acordo com as Figura 7.5 e Figura 7.6.
g glucose/g inicial (%)
80
60
40
20
0
0
20
40
60
80
100
Tempo de imersão (dias)
SEVAC
2 filmes
4 filmes
amido
Figura 7.5 Massa de glucose libertada para a solução com 50 unid/l de enzima, por massa inicial de
provetes e filmes (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As barras de erro
são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com a
distribuição t Student.
É visível uma grande diferença nos resultados entre os filmes e o provete de amido. A
percentagem de glucose quantificada em solução no provete de amido corresponde à
restante percentagem não contabilizada pelo método de doseamento de amido, perfazendo
um total de 100%, pelo que o provete foi completamente destruído pela acção enzimática. É
também evidenciada a diferença na percentagem de glucose em solução entre o provete e os
filmes SEVA-C, sendo assim confirmada a limitação pela diferença de área superficial
exposta, já que a massa total em todos os casos se mantém constante e igual a 1.6 g. A fase
inicial linear da curva de degradação corresponde à fase de hidrólise mais rápida, tendendo a
estabilizar num valor final próximo de 20% (p/p) a partir de 60 dias de imersão, no caso dos
filmes.
Na Figura 7.6 estão representados os resultados do ensaio com 100 unid/l de enzima.
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO UTILIZANDO FILMES DE DIFERENTES ESPESSURAS |225
g glucose/g inicial (%)
20
15
10
5
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Tempo de imersão (dias)
SEVAC
2 filmes
4 filmes
Figura 7.6 Massa de glucose libertada para a solução com 100 unid/l de enzima, por massa inicial de
provetes e filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As barras de
erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com a
distribuição t Student.
A quantidade de açúcares redutores aumentou desde o início até ao final do ensaio no
provete e filmes. Tal como no ensaio anterior verificaram-se diferenças na percentagem de
glucose libertada entre o provete e os filmes. Quando se aumenta a área superficial nos
filmes para o dobro (2 e 4 filmes), a percentagem de glucose não aumenta na mesma
proporção, a enzima encontra-se saturada em todos os locais activos de catálise, pelo que,
nem mesmo aumentando a área é evidenciado o aumento dos produtos de degradação. A
degradação enzimática não depende directamente da massa mas da área exposta à
degradação, já que para materiais com a mesma massa mas com áreas diferentes a
percentagem de glucose em solução é diferente. A reacção enzimática é um processo lento,
atribuído à limitação difusional de substrato durante a reacção.
Nas Figura 7.5 e Figura 7.6 não se notam diferenças significativas no valor final de glucose
libertado para a solução em provetes e filmes. O processo é mais rápido inicialmente para
maior concentração enzimática em solução mas tende para um limite comum, devido à
limitação estrutural do material e número de locais activos da enzima.
Na quantificação de cada um dos oligómeros de glucose libertados para a solução por acção
enzimática na fase amorfa de amido, foi utilizada cromatografia líquida, tendo sido
encontrados em solução glucose, maltose e maltotriose, comprovando a degradação das
moléculas de amido. As Figura 7.7 a Figura 7.9 mostram a percentagem de maltotriose
libertada nos ensaios com 50 e 100 unid/l para o provete e filmes SEVA-C.
massa maltotriose libertada/massa
inicial provete (%)
RESULTADOS E DISCUSSÃO |226
3
2
1
0
0
10
20
30
40
50
Tempo de imersão (dias)
60
70
80
massa maltotriose libertada/massa
inicial (%)
Figura 7.7 Massa de maltotriose libertada para a solução com 50 (□) e 100 (■) unid/l de enzima, por
massa inicial de provete SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As
barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo
com a distribuição t Student.
6
5
4
3
2
1
0
0
20
40
60
Tempo de imersão (dias)
80
100
Figura 7.8 Massa de maltotriose libertada para a solução com 50 (□) e 100 (■) unid/l de enzima, por
massa inicial de 2 filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As
barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo
com a distribuição t Student.
massa maltotriose libertada/massa
inicial (%)
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO UTILIZANDO FILMES DE DIFERENTES ESPESSURAS |227
8
6
4
2
0
0
20
40
60
80
100
Tempo de imersão (dias)
Figura 7.9 Massa de maltotriose libertada para a solução com 50 (□) e 100 (■) unid/l de enzima, por
massa inicial de 4 filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As
barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo
com a distribuição t Student.
A percentagem de maltotriose libertada é superior no ensaio com 100 unid/l de enzima. O
número de locais activos e de união da enzima aumenta, pelo que a quantidade de
maltotriose em solução também aumenta. Na comparação entre as diferentes curvas é
também evidenciada a diferença de percentagem entre o provete e 4 filmes, variando a
percentagem entre 3 e 6% no máximo. A fase inicial da curva corresponde à fase mais rápida,
tendendo para um valor limite diferente para cada uma das concentrações de enzima. Não se
verificam diferenças significativas nos resultados das curvas correspondentes a 2 e 4 filmes.
No provete não é notória a estabilização no final, devido ao efeito da limitação de substrato,
mais pronunciado neste caso.
Nas Figura 7.10 a Figura 7.12 são apresentados os resultados obtidos da percentagem de
maltose em solução, para as concentrações de 50 e 100 unid/l de enzima.
RESULTADOS E DISCUSSÃO |228
massa maltose libertada/massa
inicial provete (%)
5
4
3
2
1
0
0
20
40
60
Tempo de imersão (dias)
80
100
massa maltose libertada/massa inicial
(%)
Figura 7.10 Massa de maltose libertada para a solução com 50 (□) e 100 (■) unid/l de enzima, por
massa inicial de provete SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As
barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo
com a distribuição t Student.
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0
20
40
60
80
100
Tempo de imersão (dias)
Figura 7.11 Massa de maltose libertada para a solução com 50 (□) e 100 (■) unid/l de enzima, por
massa inicial de 2 filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As
barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo
com a distribuição t Student.
massa maltose libertada/massa inicial
(%)
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO UTILIZANDO FILMES DE DIFERENTES ESPESSURAS |229
15
10
5
0
0
20
40
60
Tempo de imersão (dias)
80
100
Figura 7.12 Massa de maltose libertada para a solução com 50 (□) e 100 (■) unid/l de enzima, por
massa inicial de 4 filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As
barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo
com a distribuição t Student.
Tanto no provete como nos filmes a percentagem de maltose detectada em solução é
superior para 100 unid/l de enzima, pelo aumento dos sítios activos efectivos e de união da
enzima ao material. Comparando as figuras é evidenciada a diferença de percentagem entre
o provete e os filmes, entre 5 e 15% no máximo, devido ao aumento da área exposta
superficial, aumentando assim a quantidade de produtos degradados em solução. A
degradação deve encontrar-se limitada pela área superficial exposta e não pela massa total.
Quando se aumenta a área dos filmes para o dobro (Figura 7.11 e Figura 7.12) não é
evidenciado o aumento dos compostos (maltose e maltotriose) em solução. A percentagem
de sacarídeos em solução para 2 e 4 filmes é semelhante.
Por comparação com as figuras anteriores relativamente à percentagem de maltotriose em
solução (Figura 7.7 a Figura 7.9), a quantidade de maltose é bastante superior, a enzima
deve provocar cisão das cadeias nos terminais redutores, dando origem a oligómeros mais
pequenos. A digestão degrada a amilose em maltose e glucose, aumentando a libertação de
substratos de oligómeros de cadeia curta. No provete, a curva de maltose tende a aumentar
ao longo de todo o tempo de imersão, não sendo evidenciada a estabilização no final do
ensaio, ao contrário dos filmes, o que está associado provavelmente à limitação de substrato.
A estabilização da percentagem de compostos em solução para tempos de imersão mais
longos, pode estar associada à estrutura e à porosidade do material, encontrando-se o amido
RESULTADOS E DISCUSSÃO |230
rodeado de cadeias do copolímero cujas unidades repetitivas etilénicas são menos
susceptíveis à degradação enzimática.
7.2.3 Quantificação dos açúcares totais em solução
Na quantificação dos açúcares totais libertados nas soluções de degradação foi utilizado o
método Dubois, baseado na redução ácida forte de todos os açúcares em monossacarídeos
de glucose simples.
As Figura 7.13 e Figura 7.14 mostram os resultados obtidos para os polissacarídeos totais
g polissacarídeos/g inicial (%)
nos ensaios utilizando 50 e 100 unid/l de enzima.
100
80
60
40
20
0
0
20
40
60
80
100
Tempo de imersão (dias)
SEVAC
2 filmes
4 filmes
Amido
Figura 7.13 Massa de polissacarídeos totais libertados para a solução com 50 unid/l de enzima, por
massa inicial de provetes SEVA-C e amido, 2 e 4 filmes (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do
tempo de imersão. As barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada
valor médio, de acordo com a distribuição t Student.
g polissacarídeos/g inicial (%)
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO UTILIZANDO FILMES DE DIFERENTES ESPESSURAS |231
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Tempo de imersão (dias)
SEVAC 2 filmes 4 filmes
Figura 7.14 Massa de polissacarídeos totais libertados para a solução com 100 unid/l de enzima, por
massa inicial de provete, 2 e 4 filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de
imersão. As barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor
médio, de acordo com a distribuição t Student.
A percentagem de polissacarídeos totais libertados para a solução aumentou em ambos os
ensaios, sendo evidenciado o efeito da enzima na velocidade de degradação. O aumento da
velocidade de degradação ao longo do tempo, pode ser atribuído ao aumento do número de
terminais redutores de cadeia, resultantes do processo de degradação enzimática. A
estabilização da percentagem de massa libertada para tempos de imersão mais longos,
resulta da limitação por difusão interna dos açúcares que se encontram no interior do
material.
No ensaio realizado com 50 unid/l de enzima é visível a grande diferença na percentagem de
polissacarídeos totais entre o provete e os filmes SEVA-C e o provete de amido. O provete de
amido quando em solução é reduzido completamente a oligómeros de glucose por acção
enzimática. É também evidenciada a diferença de resultados entre o provete e os filmes, pelo
aumento da área efectiva disponível à degradação (aumenta praticamente para o dobro). No
entanto, quando se aumenta a área dos filmes para o dobro (2 e 4 filmes), não se reflecte no
aumento proporcional dos polissacarídeos totais em solução. Ao aumentar a concentração de
enzima para o dobro (100 unid/l), a percentagem de produtos em solução não aumenta na
mesma proporção, associado provavelmente à limitação estrutural do amido no interior do
material. Não se registam diferenças significativas nos resultados obtidos entre 50 e 100
RESULTADOS E DISCUSSÃO |232
unid/l de enzima para o provete e filmes SEVA-C, tendo sido libertado apenas parte dos
açúcares em solução, aproximadamente 20% em massa, relativamente à massa inicial.
Comparou-se a curva de polissacarídeos totais com o somatório de todos os açúcares
quantificados nas soluções de degradação nos 2 ensaios com 50 e 100 unid/l de α-amílase,
massa sacarídeos libertados/massa
inicial provete (%)
sendo os resultados apresentados nas Figura 7.15 a Figura 7.18.
20
15
10
5
0
0
20
40
60
80
100
Tempo de imersão (dias)
polissacarídeos maltotriose+maltose+glucose
Figura 7.15 Massa de polissacarídeos totais libertados para a solução com 50 unid/l de enzima, por
massa inicial de provete SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As
barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo
com a distribuição t Student.
massa sacarídeos
libertados/massa inicial
provete (%)
100
80
60
40
20
0
0
20
40
60
80
100
Tempo de imersão (dias)
polissacarídeos
maltotriose+maltose+glucose
Figura 7.16 Massa de polissacarídeos totais libertados para a solução com 50 unid/l de enzima, por
massa inicial de provete amido (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As
barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo
com a distribuição t Student.
massa sacarídeos libertados/massa
inicial (%)
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO UTILIZANDO FILMES DE DIFERENTES ESPESSURAS |233
40
30
20
10
0
0
20
40
60
80
100
Tempo de imersão (dias)
polissacarídeos glucose+maltose+maltotriose
massa sacarídeos libertados/massa
inicial (%)
Figura 7.17 Massa de polissacarídeos totais libertados para a solução com 50 unid/l de enzima, por
massa inicial de 2 filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As
barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo
com a distribuição t Student.
40
30
20
10
0
0
20
40
60
Tempo de imersão (dias)
polissacarídeos
80
100
maltose+maltotriose+glucose
Figura 7.18 Massa de polissacarídeos totais libertados para a solução com 50 unid/l de enzima, por
massa inicial de 4 filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As
barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo
com a distribuição t Student.
Foi obtida uma boa correlação entre o somatório de todos os açúcares quantificados em
solução e os polissacarídeos totais, aumentando desde o início e estabilizando no final do
ensaio. As pequenas diferenças que se registam entre ambas as curvas poderão ser
atribuídas à não quantificação de pequenas cadeias de amido pelo método Dubois.
RESULTADOS E DISCUSSÃO |234
É também evidenciada a grande diferença de resultados entre os provetes e os filmes. O
provete de amido foi completamente reduzido pela acção enzimática, perfazendo um total de
100% de massa em solução, relativamente à massa inicial. A percentagem de massa de
açúcares totais libertados no provete SEVA-C é praticamente metade dos filmes, sendo mais
uma vez evidenciado o efeito do aumento da área superficial na degradação enzimática. A
quantidade total de fase amorfa que se encontra no interior do material é no máximo 42%,
pelo que nos filmes, grande parte do amido terá sido libertado e convertido em açúcares
mais pequenos por degradação enzimática.
Nas Figura 7.19 a Figura 7.21 apresentam-se os resultados obtidos no ensaio com 100
massa sacarídeos libertados/massa
inicial provete (%)
unid/l de enzima.
25
20
15
10
5
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Tempo de imersão (dias)
polissacarídeos
maltotriose+maltose+glucose
Figura 7.19 Massa de polissacarídeos totais libertados para a solução com 100 unid/l de enzima, por
massa inicial de provete SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As
barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo
com a distribuição t Student.
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO UTILIZANDO FILMES DE DIFERENTES ESPESSURAS |235
massa sacarídeos
libertados/massa inicial (%)
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Tempo de imersão (dias)
polissacarídeos maltotriose+maltose+glucose
massa sacarídeos
libertados/massa inicial (%)
Figura 7.20 Massa de polissacarídeos totais libertados para a solução com 100 unid/l de enzima, por
massa inicial de 2 filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As
barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo
com a distribuição t Student.
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
Tempo de imersão (dias)
polissacarídeos
60
70
80
maltotriose+maltose+glucose
Figura 7.21 Massa de polissacarídeos totais libertados para a solução com 100 unid/l de enzima, por
massa inicial de 4 filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As
barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo
com a distribuição t Student.
A correlação obtida entre o somatório de todos os açúcares em solução e os polissacarídeos
totais com 100 unid/l de enzima não foi tão boa quanto a obtida no ensaio com 50 unid/l.
Para tempos de imersão mais longos, existe uma certa tendência para que o somatório de
todos os açúcares em solução seja superior aos polissacarídeos, uma possível explicação
pode ser atribuída ao método de quantificação de polissacarídeos totais. Durante o processo
de degradação ácida há libertação de uma molécula de água durante a reacção, não sendo
RESULTADOS E DISCUSSÃO |236
contabilizada pelo método, pelo que a quantidade quantificada em solução pode
corresponder a menor percentagem, sendo esta diferença mais pronunciada para tempos de
imersão superiores. Mais uma vez é evidenciada a grande diferença de resultados entre o
provete e os filmes. Nos filmes, não existe diferença na percentagem de açúcares libertados
pelo aumento da área para o dobro (2 e 4 filmes). Comparando os resultados obtidos entre
50 e 100 unid/l, não existem diferenças significadas na percentagem de produtos libertados.
Ao aumentar a concentração de enzima para o dobro, a quantidade de fase amorfa disponível
para hidrólise mantém-se constante, não aumentando assim a percentagem de subprodutos
libertados em solução.
Em qualquer um dos ensaios foram libertados somente parte dos sacarídeos da fase amorfa
interna total do material (aproximadamente 42%). A baixa porosidade do material contribui
para a diminuição da acessibilidade das enzimas.
7.2.4 Quantificação do glicerol em solução e na mistura termoplástica de SEVA-C
Durante as análises em cromatografia líquida para quantificação dos principais sacarídeos
em solução foi também identificado glicerol, como plasticizador da mistura termoplástica.
As Figura 7.22 a Figura 7.24 mostram os resultados obtidos para ambos os ensaios com 50
e 100 unid/l α-amílase, por cromatografia líquida.
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO UTILIZANDO FILMES DE DIFERENTES ESPESSURAS |237
massa glicerol libertado/massa inicial
provete (%)
10
8
6
4
2
0
0
20
40
60
Tempo de imersão (dias)
80
100
massa glicerol libertado/massa inicial
(%)
Figura 7.22 Massa de glicerol libertado para a solução com 50 (□) e 100 (■) unid/l de enzima, por
massa inicial de provete SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As
barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo
com a distribuição t Student.
8
6
4
2
0
0
20
40
60
80
100
Tempo de imersão (dias)
Figura 7.23 Massa de glicerol libertado para a solução com 50 (□) e 100 (■) unid/l de enzima, por
massa inicial de 2 filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As
barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo
com a distribuição t Student.
massa glicerol libertado/massa inicial
(%)
RESULTADOS E DISCUSSÃO |238
8
6
4
2
0
0
20
40
60
80
100
Tempo de imersão (dias)
Figura 7.24 Massa de glicerol libertado para a solução com 50 (□) e 100 (■) unid/l de enzima, por
massa inicial de 4 filmes SEVA-C (1.6 g) em 50 ml de solução, em função do tempo de imersão. As
barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo
com a distribuição t Student.
O glicerol liberta-se rapidamente nos primeiros dias de imersão, mantendo-se constante até
ao final do ensaio.
No ensaio com 100 unid/l de α-amílase a percentagem de glicerol libertado é superior
(aproximadamente 6%), comparativamente ao ensaio com 50 unid/l (aproximadamente 2%).
Apesar do glicerol (plasticizador) se libertar por um fenómeno físico, sendo completamente
solúvel em solução, pode libertar-se maior percentagem ao aumentar a concentração de
enzima, devido à maior percentagem de degradação do material. Ao libertar-se maior
percentagem de massa para a solução, o glicerol pode libertar-se mais rapidamente pelo
efeito do aumento da porosidade, e não pela acção directa da enzima sobre este composto. A
enzima α-amílase actua apenas nos terminais redutores do amido, não actuando sobre os
grupos hidroxilo do glicerol. A libertação do plasticizador pode também ser compensada pelo
efeito lubrificante da água na estrutura do material.
Não existem diferenças significativas na quantidade de glicerol libertado entre o provete e os
filmes, já que se trata do mesmo material, variando apenas a forma física do material.
Para quantificar a percentagem de glicerol presente na mistura termoplástica sem qualquer
tratamento e após degradação enzimática (50 unid/l de α-amílase) em solução fisiológica, foi
efectuada uma extracção total em sohxlet para remoção de toda a matéria solúvel, utilizando
água como meio extractor, tal como descrito no capítulo de Materiais e Métodos. A Tabela
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO UTILIZANDO FILMES DE DIFERENTES ESPESSURAS |239
7.1 mostra os resultados das extracções finais ao material, resultantes da degradação
enzimática e sem qualquer tratamento.
Tabela 7.1 Massa de glicerol libertado por extracção total em soxhlet, por massa inicial de provete, 2
e 4 filmes (%), sem qualquer tratamento e após degradação enzimática (50 unid/l), (ensaios em
triplicado).
Provete
2 Filmes
4 Filmes
Massa glicerol
libertado/massa inicial sem
tratamento (%)
Média
8.02
8.01
10.42
8.82
9.05
8.2
7.8
8.35
10.26
10.10
10.10
10.15
Massa glicerol
libertado/massa inicial após
degradação (%)
Média
4.51
8.4
6.03
6.31
3.79
5.59
4.19
4.52
3.57
5.09
4.03
4.23
Pela Tabela 7.1 verifica-se que, inicialmente a percentagem de glicerol no material é
semelhante para o provete e 2 filmes (aproximadamente 8.5%), aumentando ligeiramente
para 4 filmes (10%). Esta diferença pode estar relacionada com as diferentes condições de
processamento do material por extrusão. No final do processo de degradação enzimática os
filmes apresentam uma percentagem residual semelhante, aproximadamente 4%. O provete
tem maior percentagem residual (6%), provavelmente porque se encontra menos degradado.
A maior degradação do material pode afectar o processo de libertação de glicerol pelo
aumento da porosidade e quebra de ligações covalentes, o que facilita a dissolução e
libertação hidrolítica do glicerol.
A extracção total em sohxlet não garante que todo o glicerol tenha sido extraído, dado que se
trata de um ensaio normalizado realizado durante 24 h.
A diferença entre a percentagem de glicerol presente inicialmente no material e a
percentagem residual após degradação, corresponde aproximadamente à percentagem
quantificada nas soluções de degradação (Figura 7.22 a Figura 7.24).
RESULTADOS E DISCUSSÃO |240
7.2.5 Avaliação da actividade enzimática
Para avaliar da melhor forma o processo de degradação enzimática, é importante conhecer
as principais propriedades da enzima, e se se encontra activa no início e ao longo dos
ensaios de degradação do material. Os processos de desactivação enzimática podem
comprometer o processo degradativo, pelo que se torna fundamental determinar se a enzima
se encontra activa/inactiva durante todo o ensaio.
Antes da realização dos ensaios de degradação enzimática, foi determinada inicialmente a
actividade enzimática, de acordo com o procedimento descrito no capítulo de Materiais e
Métodos.
Também se determinou a actividade específica ao longo dos ensaios de degradação,
utilizando amido como substrato da reacção e contabilizando a velocidade de decomposição
Actividade enzimática específica
(mg gluc/unid/min)
em açúcares redutores formados, de acordo com as Figura 7.25 e Figura 7.26.
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
20
SEVAC
40
60
Tempo de imersão (dias)
Amido
2 filmes
80
100
4 filmes
Figura 7.25 Actividade enzimática (em mg glucose/unid/min) para o ensaio com 50 unid/l de αamílase em provetes de SEVA-C e amido e filmes SEVA-C, em função do tempo de imersão. As barras
de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com a
distribuição t Student.
Actividade enzimática específica
(mg gluc/unid/min)
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO UTILIZANDO FILMES DE DIFERENTES ESPESSURAS |241
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
10
20
30
40
50
60
Tempo de imersão (dias)
provete
2 filmes
4 filmes
70
80
Figura 7.26 Actividade enzimática (em mg glucose/unid/min) para o ensaio com 100 unid/l de
enzima em provetes e filmes SEVA-C, em função do tempo de imersão.
A enzima mantém-se activa durante os 2 ensaios, para os provetes e filmes, mas inferior à
teórica (0.35 mg glucose/unid/min). A actividade específica média nos 2 ensaios é
semelhante para os diferentes materiais (provete e filmes), tal como foi validado pelo teste t
de Student aplicado aos resultados experimentais.
7.2.6 Análise térmica de misturas termoplásticas de SEVA-C
Tal como descrito no capítulo de Materiais e Métodos foi utilizada a análise térmica por
termogravimetria, para quantificação da percentagem de absorção de água durante o
processo de degradação, e perda de massa de água durante o condicionamento das
amostras em condições controladas, para diferentes tempos de imersão.
As Figura 7.27 e Figura 7.28 referem-se aos resultados do ensaio realizado com diferentes
filmes e 50 unid/l de enzima.
RESULTADOS E DISCUSSÃO |242
Absorção água (%)
20
15
10
5
0
0
20
40
60
Tempo de imersão (dias)
SEVAC
2 Filmes
80
100
4 filmes
Figura 7.27 Percentagem de absorção de água de SEVA-C, com 50 unid/l de enzima, para provete e
filmes, em função do tempo de imersão, em TGA (média de pelo menos 3 resultados em cada
amostra). As barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor
médio, de acordo com a distribuição t Student.
Perda de água (%)
60
40
20
0
0
20
40
60
Tempo de imersão (dias)
SEVAC
2 filmes
80
100
4 filmes
Figura 7.28 Percentagem de perda de massa de água de SEVA-C, com 50 unid/l de enzima, para
provete e filmes, em função do tempo de imersão (valores obtidos durante o pré-condicionamento das
amostras). As barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor
médio, de acordo com a distribuição t Student.
Durante o ensaio em TGA (Figura 7.27), o provete SEVA-C tem maior percentagem de
absorção de água ao longo de todo o tempo de imersão. Antes da realização dos ensaios em
TGA, as amostras são estabilizadas e condicionadas em condições constantes, perdendo
água que se encontra na estrutura molecular ou entre as cadeias do polímero, como
resultado do aumento da degradação e porosidade superficial. Nestas condições, e de acordo
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO UTILIZANDO FILMES DE DIFERENTES ESPESSURAS |243
com a Figura 7.28 o provete perde menos água, associada à microestrutura interna deste
material. Consequentemente, quando se realizada o ensaio em TGA a temperatura mais
elevada, o provete perde a restante água que se encontra em níveis mais internos, dado que
os processos são sequenciais. O aumento da percentagem final de absorção de água que se
verifica na Figura 7.27 em todos os materiais a partir de 60 dias, pode ser atribuído à
libertação de água da estrutura mais interna, e que durante o processo de degradação se
tornou mais acessível para ser libertada, pela degradação e aumento da porosidade
superficial.
Durante o processo de condicionamento, os filmes apresentam sempre maior percentagem
de perda de massa de água, porque a água libertada se encontra mais acessível (água livre),
ao contrário do ensaio em TGA, em que a água libertada faz parte da microestrutura interna
do material. A percentagem de perda de massa de água em 4 filmes é superior a 2 filmes, o
que pode estar associado à degradação e forma física do material, sendo o material mais
fino, perde mais facilmente água nestas condições. Em qualquer um dos materiais, a
percentagem de perda de massa de água durante o processo de condicionamento é sempre
superior à percentagem de absorção de água durante o ensaio em TGA, significando que a
maior parte da água perdida se encontra nas camadas exteriores, mais facilmente libertada.
Nas Figura 7.29 a Figura 7.31 são comparadas as curvas de percentagem de perda de
massa de água durante o processo de pré-condicionamento, e o somatório de todos os
sacarídeos quantificados em solução no ensaio com 50 unid/l de α-amílase, ao longo do
tempo de imersão.
Massa libertada/massa inicial
provete (%)
RESULTADOS E DISCUSSÃO |244
20
15
10
5
0
0
20
40
60
80
100
Tempo de imersão (dias)
%perda - glicerol - %absorção
polissacarídeos
Massa libertada/massa inicial
(%)
Figura 7.29 Comparação entre a massa de polissacarídeos totais libertados para a solução, por
massa inicial de provete (1.6 g) em 50 ml de solução, e a percentagem de perda de massa de água,
em função do tempo de imersão. As barras de erro são os intervalos de confiança de 95%
correspondentes a cada valor médio, de acordo com a distribuição t Student.
40
30
20
10
0
0
20
40
60
Tempo de imersão (dias)
mg água - glicerol - %absorção
80
100
polissacarídeos
Figura 7.30 Comparação entre a massa de polissacarídeos totais libertados para a solução, por
massa inicial de 2 filmes (1.6 g) em 50 ml de solução, e a percentagem de perda de massa de água,
em função do tempo de imersão. As barras de erro são os intervalos de confiança de 95%
correspondentes a cada valor médio, de acordo com a distribuição t Student.
Massa libertada/massa inicial (%)
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO UTILIZANDO FILMES DE DIFERENTES ESPESSURAS |245
40
30
20
10
0
0
20
40
60
80
100
Tempo de imersão (dias)
mg água - glicerol - %absorção
polissacarídeos
Figura 7.31 Comparação entre a massa de polissacarídeos totais libertados para a solução, por
massa inicial de 4 filmes (1.6 g) em 50 ml de solução, e a percentagem de perda de massa de água,
em função do tempo e imersão. As barras de erro são os intervalos de confiança de 95%
correspondentes a cada valor médio, de acordo com a distribuição t Student.
Na comparação entre os derivados de açúcares libertados para a solução e a percentagem
de perda de massa de água libertada durante o processo de condicionamento das amostras,
foi descontada a percentagem de glicerol libertado e a percentagem de absorção de água em
provete e filmes. A percentagem de absorção de água em provetes e filmes foi determinada
mergulhando o provete e os filmes em solução HBSS, e quantificando a percentagem de
absorção de água até não ocorrerem variações de massa. Os resultados da percentagem de
absorção para o provete e os filmes são os seguintes:
Tabela 7.2 Percentagem de absorção de água em provete e filmes SEVA-C em 2 ensaios realizados e
respectiva média.
Provete
2 Filmes
4 Filmes
5.80
5.74
5.77
5.58
5.03
5.30
4.15
4.72
4.44
A percentagem máxima de absorção de água em 4 filmes é inferior. É provável que estes
resultados estejam correlacionados com o método de processamento das amostras,
RESULTADOS E DISCUSSÃO |246
alterando a superfície externa, podendo o material absorver mais ou menos solução, dependo
da “camada” que reveste a superfície.
Como a percentagem de polissacarídeos totais libertados para a solução é resultante apenas
do processo de degradação enzimática, foi descontada a percentagem de glicerol
(plasticizador) libertado e a capacidade máxima de absorção deste material, dado que se
trata de uma mistura termoplástica de carácter hidrofílico, que deforma facilmente quando
imersa em solução.
Para os filmes foi obtida uma boa correlação entre os polissacarídeos totais e a percentagem
de perda de massa de água. No provete, a correlação não foi tão boa, porque o processo de
quantificação da percentagem de perda de massa de água está sujeito a erros mais elevados,
dada a dificuldade de amostragens reprodutivas de massa semelhante.
A libertação de parte da fase amorfa da microestrutura interna do material conduziu a um
aumento da porosidade, permitindo a absorção de crescentes quantidades de água,
mostrando uma boa correlação entre o grau de hidratação e a quantidade de produtos
degradados em solução, ao longo do tempo de imersão.
Para além dos programas descritos anteriormente em TGA, foi também efectuada uma
queima total a cada um dos materiais ao longo do tempo de imersão, de acordo com o
programa de Pirólise descrito no capítulo de Materiais e Métodos. O objectivo destas análises
foi quantificar a percentagem de cada um dos compostos libertados durante o processo de
queima, admitindo que os valores termogravimétricos podem ser usados para estimar a
composição da mistura, uma vez que a temperatura de decomposição de cada um dos
componentes não se sobrepõe. A perda de peso da mistura multicomponente a temperatura
fixa é dada assim pela sobreposição das perdas de peso dos componentes puros
correspondentes à mesma temperatura. Foram realizados ensaios para cada um dos padrões
puros (glicerol, amido, polivinilálcool e SEVA-C), de forma a identificar cada uma das fases de
decomposição. A Figura 7.32 mostra os resultados obtidos de cada um dos componentes.
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO UTILIZANDO FILMES DE DIFERENTES ESPESSURAS |247
Perda de massa (%)
100
80
60
40
20
0
0
100
200
300
400
500
600
Temperatura (ºC)
Figura 7.32 Resultados obtidos por termogravimetria da percentagem de perda de massa em amido
(■), glicerol (□), SEVA-C (▲) e polivinilálcool (Δ) , em função da temperatura (média de pelo menos 3
resultados em cada amostra).
De acordo com o comportamento da Figura 7.32 foi possível distinguir cada uma das fases
de decomposição dos compostos puros, correspondentes à temperatura de velocidade
máxima de perda de massa: a decomposição do glicerol ocorre até 230ºC, a libertação de
amido entre 230 e 345ºC, e finalmente o componente sintético de EVOH decompõe-se a
temperaturas superiores a 345ºC.
Foram obtidos termogramas para o provete e filmes, de acordo com o programa de Pirólise
em TGA, sendo apresentados nas Figura 7.33 e Figura 7.34 o comportamento para
diferentes tempos de imersão (2, 30 e 60 dias).
RESULTADOS E DISCUSSÃO |248
100
2 dias
Perda de massa (%)
30 dias
80
60 dias
60
40
20
0
0
100
200
300
400
500
600
Temperatura (ºC)
Figura 7.33 Resultados obtidos por termogravimetria da percentagem de perda de massa no provete
SEVA-C para diferentes tempos de imersão, em função da temperatura (média de pelo menos 3
resultados em cada amostra).
Perda de massa (%)
100
2 dias
30 dias
80
60 dias
60
40
20
0
0
100
200
300
400
500
600
Temperatura (ºC)
Figura 7.34 Resultados obtidos por termogravimetria da percentagem de perda de massa em 4 filmes
SEVA-C para diferentes tempos de imersão, em função da temperatura (média de pelo menos 3
resultados em cada amostra).
Ao comparar os termogramas dos compostos puros com as Figura 7.33 e Figura 7.34, no
provete notam-se diferenças na libertação da fase amorfa (amido) ao fim de 60 dias de
imersão, enquanto para 2 e 30 dias não se verificam diferenças significativas na curva entre
230 e 345ºC, correspondente à decomposição de amido. Nos filmes (Figura 7.34), ao fim de
30 dias grande parte do amido já teria sido libertado, pela diminuição da percentagem de
massa libertada nesta zona da curva, semelhante à curva para 60 dias de imersão. O glicerol
liberta-se inicialmente, tanto no provete como nos filmes, mantendo-se o componente
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO UTILIZANDO FILMES DE DIFERENTES ESPESSURAS |249
sintético sem alterações (temperatura superior a 345ºC). Foram construídas curvas da
percentagem de degradação de glicerol e amido para os respectivos intervalos de
temperatura, em provete e filmes, ao longo do tempo de imersão, que se encontram nas
Figura 7.35 e Figura 7.36.
35
ED de amido (%)
30
25
20
15
10
5
0
0
10
20
30
40
Tempo de imersão (dias)
SEVA-C
2 Filmes
50
60
70
4 Filmes
Figura 7.35 Percentagem da extensão de degradação (ED) de amido no provete e filmes, ao longo do
tempo de imersão (média de pelo menos 3 resultados em cada amostra).
ED de glicerol (%)
15
10
5
0
0
10
20
30
40
Tempo de imersão (dias)
SEVA-C
2 Filmes
50
60
70
4 Filmes
Figura 7.36 Percentagem da extensão de degradação (ED) do glicerol no provete e filmes, ao longo do
tempo de imersão (média de pelo menos 3 resultados em cada amostra).
A composição da mistura foi obtida a partir da perda de peso parcial correspondente a cada
um dos compostos puros, uma vez que a temperatura de degradação de cada um dos
componentes é bem definida.
RESULTADOS E DISCUSSÃO |250
O provete tem maior percentagem de amido (aproximadamente 25%), sendo menos
degradado que os filmes. Nos filmes, não existem diferenças significativas na percentagem
de amido presente no material, tendendo a estabilizar num valor próximo de 10%. A diferença
de área disponível entre o provete e filmes conduz à diferença na percentagem de fase
amorfa entre provete e filmes. Em nenhum dos casos foi libertada toda a fase amorfa,
permanecendo uma percentagem residual no interior.
A percentagem de glicerol no provete e filmes tem comportamento semelhante ao longo de
todo o tempo de imersão. No entanto, o provete demora mais tempo a libertar o glicerol, mas
no final todos os materiais apresentam uma percentagem residual semelhante de
aproximadamente 5%. Estes resultados são semelhantes aos valores obtidos nas extracções
totais em Sohxlet, para quantificação da percentagem de glicerol no início e fim dos ensaios
de degradação (Tabela 7.1).
7.2.7 Morfologia e alterações superficiais de SEVA-C
Durante o processo de degradação enzimática é importante estudar as alterações na
superfície do material, dado que a superfície é o primeiro contacto que a enzima estabelece
com o material, tendo grande influência no processo de degradação, de acordo com os
ensaios efectuados em filmes de diferente espessura. Um dos métodos disponíveis que
permite avaliar o grau de molhabilidade e portanto da diferença de tensão superficial é o
método da gota séssil. Foram efectuadas determinações do ângulo de contacto nas
superfícies do provete e filmes SEVA-C, utilizando 3 líquidos de polaridade diferente (água,
formamida e di-iodometano), de acordo com o procedimento descrito no capítulo de Materiais
e Métodos.
O efeito da degradação enzimática nas superfícies SEVA-C ao longo do tempo de imersão, foi
seguido pela medição do ângulo de contacto em cada um dos líquidos de diferente
polaridade, avaliando o grau de molhabilidade da superfície, de acordo com as Figura 7.37 a
Figura 7.39.
Ângulo contacto com água (º)
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO UTILIZANDO FILMES DE DIFERENTES ESPESSURAS |251
90
80
70
60
50
0
20
40
60
Tempo de imersão (dias)
SEVAC
2 filmes
80
100
4 filmes
Ângulo contacto com formamida
(º)
Figura 7.37 Variação do ângulo de contacto em superfícies SEVA-C, em função do tempo de imersão,
utilizando água como líquido de medição (medições efectuadas em amostras secas). As barras de
erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com a
distribuição t Student.
90
80
70
60
50
40
0
20
40
60
Tempo de imersão (dias)
SEVAC
2 filmes
80
100
4 filmes
Figura 7.38 Variação do ângulo de contacto em superfícies SEVA-C, em função do tempo de imersão,
utilizando formamida como líquido de medição (medições efectuadas em amostras secas). As barras
de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo com a
distribuição t Student.
RESULTADOS E DISCUSSÃO |252
Ângulo contacto com diiodometano (º)
90
80
70
60
50
40
0
20
40
60
Tempo de imersão (dias)
SEVAC
2 filmes
80
100
4 filmes
Figura 7.39 Variação do ângulo de contacto em superfícies SEVA-C, em função do tempo de imersão,
utilizando di-iodometano como líquido de medição (medições efectuadas em amostras secas). As
barras de erro são os intervalos de confiança de 95% correspondentes a cada valor médio, de acordo
com a distribuição t Student.
Pela análise da Figura 7.37, os ângulos de contacto medidos com água como líquido são
superiores a 50º, significando que se trata de superfícies SEVA-C hidrofóbicas. A superfície do
provete é mais hidrofóbica pois apresenta valores de ângulo de contacto com água superiores
aos filmes. Como os filmes foram mais degradados durante os ensaios de degradação, o
ângulo formado pode ser menor, devido a vários factores: superfícies mais rugosas, menor
fase amorfa de amido na superfície por degradação e maior porosidade (confirmado pelas
análises em SEM e AFM). O processo de processamento dos filmes por extrusão pode
também afectar o valor dos ângulos, pelo que as superfícies poderão apresentar valores de
ângulo de contacto diferentes. Ao longo do tempo de imersão registam-se algumas variações
no ângulo de contacto com água, que tendem a diminuir, possivelmente devido à perda de
grupos e alteração da porosidade e rugosidade superficiais, que tornaram as superfícies mais
hidrofílicas.
As medições com os restantes líquidos mais apolares complementam os resultados obtidos
com água. No provete, as medições com formamida e di-iodometano (Figura 7.38 e Figura
7.39) apresentam valores de ângulos de contacto menores. Tal como foi confirmado com
água como líquido de medição, esta superfície tem carácter mais apolar. É natural que não
se registem grandes variações no ângulo de contacto entre provete e filmes, dado que se
trata do mesmo material, varia apenas a forma física.
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO UTILIZANDO FILMES DE DIFERENTES ESPESSURAS |253
A partir do valor dos ângulos de contacto medidos com diferentes líquidos foi possível
determinar o valor das componentes da tensão e energia hidrofóbica superficial, associados
ao provete e filmes, em função do tempo de imersão. Para melhor comparação dos
parâmetros foram construídos gráficos dos componentes γ+ e γ-, em provetes e filmes SEVA-
Tensão superficial (mJ/m 2)
C, ao longo do tempo de imersão.
30
25
20
15
10
5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Tempo de imersão (dias)
γ−
γ+
Tensão superficial (mJ/m 2)
Figura 7.40 Parâmetros da tensão superficial γ+ e γ- em mJ/m2, determinados na superfície de
provetes SEVA-C, ao longo do tempo de imersão.
30
20
10
0
10
20
30
40
50
60
Tempo de imersão (dias)
γ−
70
80
90
γ+
Figura 7.41 Parâmetros da tensão superficial γ+ e γ- em mJ/m2, determinados na superfície de 4
filmes SEVA-C, ao longo do tempo de imersão.
Os resultados das Figura 7.40 e Figura 7.41 vêm confirmar o carácter hidrofóbico em todas
as superfícies SEVA-C, γ s− ≤ 25.5 mJ/m2. As superfícies são predominantemente aceitadoras
RESULTADOS E DISCUSSÃO |254
de electrões, pela grande diferença de resultados entre γ s− e γ s+ . Também se notam
diferenças entre os resultados de γ s+ em provete e filmes, sendo superior nos filmes,
evidenciando maiores trocas de electrões na superfície por efeito da degradação, alterando a
capacidade aceitadora de electrões. Ao longo do tempo de imersão registam-se algumas
variações em γ s+ , principalmente em filmes SEVA-C, com tendência para diminuir, o que está
possivelmente associado ao processo de estabilização final da degradação.
TOT
O cálculo da energia hidrofóbica de atracção ( ΔG sws
) permite quantificar a hidrofobicidade
das superfícies. É possível estimar o carácter hidrofóbico ou hidrofílico dos materiais a partir
LW
das suas componentes da tensão superficial. As componentes apolar ( ΔGsws
) e polar
AB
( ΔG sws
) da energia livre interfacial ΔGsws foram também determinadas e representadas
graficamente nas Figura 7.42 e Figura 7.43.
Tempo de imersão (dias)
Energia livre interfacial (mJ/m 2)
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0
-10
-20
-30
apolar
polar
LW
LW
Figura 7.42 Valores das componentes apolar ( ΔG sws
) e polar ( ΔG sws
) em mJ/m2 da energia livre
de atracção hidrofóbica, determinados na superfície de provetes SEVA-C, em função do tempo de
imersão.
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO UTILIZANDO FILMES DE DIFERENTES ESPESSURAS |255
Energia livre interfacial (mJ/m 2)
10
20
30
Tempo de imersão (dias)
40
50
60
70
80
90
10
0
-10
-20
-30
apolar
polar
LW
LW
Figura 7.43 Valores das componentes apolar ( ΔG sws
) e polar ( ΔG sws
) em mJ/m2 da energia livre
de atracção hidrofóbica, determinados na superfície de 4 filmes SEVA-C, em função do tempo de
imersão.
Em qualquer uma das superfícies SEVA-C a componente polar é superior em valor absoluto à
componente apolar, a interacção entre a superfície do sólido e o líquido é efectuada por
partículas polares. É também notória a oscilação de valores ao longo do tempo de imersão,
mais pronunciada nos filmes, provavelmente associado ao processo degradativo. A
hidrofilicidade das superfícies, atribuída ao valor da componente polar decresce na
sequência: provete > 2 filmes > 4 filmes.
As alterações morfológicas na superfície SEVA-C por efeito da solução fisiológica enzimática
ao longo do tempo de imersão, foram também analisadas em SEM. A Figura 7.44 mostra as
micrografias em provetes e filmes SEVA-C, ao longo do tempo de imersão.
RESULTADOS E DISCUSSÃO |256
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)
(j)
(l)
(m)
Figura 7.44 Micrografias SEM das superfícies SEVA-C do controlo, após 10, 50 e 90 dias de imersão,
respectivamente (x 1500). (a), (b), (c), (d) provete; (e), (f), (g), (h) 2 filmes e (i), (j), (l), (m) 4 filmes.
Todos os materiais foram secos antes da análise SEM.
A microestrutura superficial do provete é completamente diferente dos filmes. Além do
provete se apresentar menos degradado, os controlos (amostras não degradadas) do provete
e filmes são bastantes diferentes. É provável que o processamento por extrusão na
preparação dos filmes possa afectar significativamente a superfície dos materiais.
A porosidade e rugosidade superficiais aumentaram ao longo do tempo de imersão, devido à
grande diferença na microestrutura e textura superficial entre o controlo e a amostra mais
degradada (90 dias), sendo mais pronunciado o efeito da degradação nos filmes. Confirma-se
assim que a enzima actua na superfície do material, aumentando o número e tamanho dos
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO UTILIZANDO FILMES DE DIFERENTES ESPESSURAS |257
poros, dado que as superfícies encontram-se progressivamente mais destruídas. O aumento
da porosidade pode facilitar a difusão externa e interna dos produtos para a solução,
aumentando a perda de massa do material.
Para melhor caracterização da microestrutura interna dos materiais, provete e filmes SEVA-C
foram fervidos em água destilada com agitação durante 5 horas, para diferentes tempos de
degradação enzimática, de forma a simular condições extremas de degradação. Os materiais
de degradação foram observados em SEM, de acordo com o procedimento descrito no
capítulo de Materiais e Métodos. Pretendeu-se assim avaliar as alterações na microestrutura
interna após destruição total, para diferentes tempos de degradação.
RESULTADOS E DISCUSSÃO |258
(a)
(b)
(c)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)
(j)
(l)
(m)
(d)
Figura 7.45 Micrografias SEM dos materiais de degradação de SEVA-C fervidos em água destilada
durante 5 h no controlo, após 20, 50 e 90 dias de imersão, respectivamente (x 1500). (a), (b), (c), (d)
provete; (e), (f), (g), (h) 2 filmes e (i), (j), (l), (m) 4 filmes. As soluções de degradação foram liofilizadas
antes de analisadas.
Nas micrografias anteriores é visível o efeito da solução na degradação dos materiais,
notando-se grandes diferenças ao longo do tempo de imersão e entre o provete e os filmes.
No provete, ao fim de 50 dias, é já visível a degradação da microestrutura, sendo observados
grandes poros resultantes da destruição da fase amorfa. Na amostra mais degradada,
correspondente a 90 dias de imersão, é possível observar zonas degradadas mais porosas,
resultantes da degradação enzimática anterior e zonas granulares não degradadas,
semelhantes ao controlo. Nos filmes, o processo de degradação é mais rápido, encontrando-
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO UTILIZANDO FILMES DE DIFERENTES ESPESSURAS |259
se as superfícies mais lisas e desprovidas de fase amorfa ao fim de 20 dias de imersão. Em
4 filmes, após 20 dias de imersão, não existe praticamente fase amorfa no material,
apresentando-se a superfície mais ou menos lisa e sem grânulos. Nos filmes, o amido deve
encontrar-se mais acessível à actividade enzimática, encontrando-se a microestrutura mais
destruída. Aliás, as suspensões de degradação, após a fervura dos filmes para maiores
tempos de degradação, encontravam-se praticamente transparentes, sem sinal de
degradação.
Pela análise dos controlos do material, os grânulos observados nas diferentes amostras
devem corresponder a grânulos de amido, que após degradação se encontram rodeados de
cadeias de material sintético (EVOH), formando uma microdispersão de agregados de
microesferas. A estrutura granular é atribuída à capacidade do amido estabelecer interacções
hidrofóbicas com o copolímero de EVOH.
Foi também analisada uma amostra de amido puro após degradação em água a ferver, para
confirmar se os grânulos são efectivamente de amido.
Figura 7.46 Micrografia SEM da solução de degradação de amido após ferver em água destilada
durante 5 h (x 1500). A solução de degradação foi liofilizada antes de analisada.
A micrografia do amido após fervura mostra uma morfologia lisa completamente destruída,
ao contrário da estrutura granular em SEVA-C. Isto deve-se ao facto de não existir o
copolímero de EVOH, que rodeia as moléculas de amido e que impede a sua destruição.
Foi também utilizada microscopia de força atómica para caracterização das propriedades
superficiais em provetes e filmes SEVA-C, ao longo do tempo de imersão.
RESULTADOS E DISCUSSÃO |260
(a)
(b)
(c)
(d)
(l)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)
(j)
(l)
(l)
Figura 7.47 Imagens AFM em “tapping mode”das superfícies SEVA-C do controlo, após 30, 60 e 90
dias de imersão, respectivamente (x 1500). (a), (b), (c), (d) provete; (e), (f), (g), (h) 2 filmes e (i), (j),
(l), (m) 4 filmes (scan 10 μm). Todos os materiais foram secos antes da análise em AFM.
As imagens topográficas em AFM mostram grandes alterações morfológicas entre o controlo
e as amostras mais degradadas (90 dias) em todos os materiais, o que está associado
principalmente ao aumento da rugosidade e porosidade superficial, por efeito da solução na
degradação dos materiais. Aparentemente, o provete tem uma superfície mais rugosa. No
entanto, é necessário considerar que no provete a escala em Z é de 500 nm e nos filmes de
1500 nm. A escala em Z é superior nos filmes, de forma a visualizar a toda a estrutura
superficial, devido à grande diferença de rugosidade, dando um efeito mais “atenuado” na
superfície, apesar das grandes diferenças de níveis, evidenciadas pelas fendas e vazios
estruturais na superfície.
Para complementar o estudo da rugosidade nas superfícies, foram determinadas as medidas
mais comuns de rugosidade: rugosidade média (Ra) e rugosidade máxima (Rmax) dadas pelo
software do aparelho. A Figura 7.48 mostra os resultados da rugosidade máxima (nm) em
provetes e filmes SEVA-C.
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO UTILIZANDO FILMES DE DIFERENTES ESPESSURAS |261
2300
Rmax (nm)
1800
1300
800
300
0
20
40
60
80
100
Tempo de imersão (dias)
provete 2 filmes 4 filmes
Figura 7.48 Rugosidade máxima (nm) em superfícies de provete e filmes SEVA-C, em função
do tempo de imersão.
A Figura 7.48 vem confirmar a diferença de rugosidade demonstrada entre provete e filmes.
A diferença varia entre 500 nm para o provete e 2000 nm em 4 filmes. Ao longo do tempo de
imersão existem oscilações, mais acentuadas nos filmes, associadas às alterações na
microestrutura superficial e ao maior efeito da degradação.
7.3 Conclusões
Das experiências realizadas com SEVA-C de diferentes espessuras (diferentes áreas de
exposição) e maior concentração em α-amílase, a análise analítica das soluções de
degradação permitiu retirar algumas conclusões, relevantes para os estudos da degradação
deste tipo de materiais quando imersos em solução fisiológica simulada.
Na comparação da quantidade total de fase amorfa libertada para a solução em SEVA-C de
diferentes espessuras, a percentagem de amido e outras moléculas de açúcares mais
pequenas (maltotriose, maltose, glucose) em solução é superior no ensaio com 100 unid/l,
relativamente ao ensaio realizado com 50 unid/l. O aumento da concentração de enzima
aumenta o número de locais activos e de ligação, aumentando a quantidade de sacarídeos
libertados em solução. Ao aumentar a concentração de enzima (100 unid/l), o processo de
libertação de açúcares inicial é mais rápido, tendendo para um limite comum em qualquer
um dos casos.
CONCLUSÕES |262
O provete constituído apenas por amido foi totalmente fragmentado inicialmente por acção
enzimática, libertando a maior parte da fase amorfa, sendo também uma evidência da
actividade da α-amílase.
A limitação devida à área superficial exposta entre provete e filmes SEVA-C, foi confirmada
pela diferença na percentagem de glucose e polissacarídeos em solução. O aumento da área
superficial nos filmes para o dobro, não conduziu a um aumento proporcional da
percentagem de glucose e polissacarídeos totais, pela limitação do número de locais
disponíveis para catálise enzimática, mantendo sempre a massa total constante e igual a 1.6
g. A saturação é atingida em filmes de 0.5 mm de espessura (2 filmes).
A percentagem de maltotriose e maltose em solução é superior nos filmes,
comparativamente ao provete, pelo aumento da área superficial exposta. No entanto, não
existem diferenças significativas nas curvas correspondentes a 2 e 4 filmes.
A degradação enzimática não depende directamente da massa mas da área exposta à
degradação, já que para materiais com a mesma massa mas com áreas diferentes a
percentagem de sacarídeos em solução é diferente.
A enzima degrada as macromoléculas de amilose da fase amorfa de amido em SEVA-C,
provocando cisão das cadeias nos terminais redutores dando origem a maltose e glucose,
pela maior percentagem de maltose encontrada em solução relativamente à maltotriose.
Não se registam diferenças significativas nos resultados obtidos na percentagem de produtos
totais libertados entre 50 e 100 unid/l de enzima para provete e filmes SEVA-C, apesar da
percentagem pontual de cada um dos produtos para cada uma das concentrações
enzimáticas ser diferente. Ao aumentar a concentração de enzima para o dobro, a quantidade
de fase amorfa disponível para hidrólise mantém-se constante, não aumentando assim a
percentagem de subprodutos libertados em solução no final do ensaio, associado também à
limitação estrutural do amido no interior do material. O processo inicial de libertação de
açúcares é mais rápido, mas tende para um limite comum.
Foram libertados apenas parte dos açúcares em solução, aproximadamente 20% em massa,
relativamente à massa inicial nos filmes, por degradação enzimática. Os restantes açúcares
devem encontrar-se retidos no interior do material, sabendo que no máximo a percentagem
total de fase amorfa no interior do material é 42%.
A decomposição do amido do interior do material está também condicionado pelo facto de
este se encontrar no interior da microestrutura rodeado de cadeias do copolímero não
DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO UTILIZANDO FILMES DE DIFERENTES ESPESSURAS |263
hidrolisadas, dificultando a transferência de massa por difusão externa e interna do amido do
interior e acesso das enzimas. Confirma-se assim a limitação estrutural do material. Por outro
lado, a baixa concentração enzimática em solução, que corresponde ao teor normal de αamílase no organismo é outro factor limitativo da velocidade de degradação.
O glicerol utilizado como plasticizador do material liberta-se rapidamente nos primeiros dias
de imersão, mantendo-se constante até ao final do ensaio.
No ensaio com 100 unid/l de α-amílase a percentagem de glicerol libertado é superior
(aproximadamente 6%), comparativamente ao ensaio com 50 unid/l (aproximadamente 2%).
A maior percentagem de glicerol libertado no ensaio com maior concentração enzimática,
está associada à maior degradação do material, que conduz a um aumento da porosidade
superficial e à acção lubrificante da água na estrutura de material.
O provete SEVA-C tem maior percentagem de absorção de água ao longo de todo o tempo de
imersão, de acordo com os resultados obtidos em TGA, perdendo menos água durante o
processo de pré-condicionamento das amostras.
A percentagem de perda de massa de água durante o processo de condicionamento é
superior à percentagem de absorção de água durante o ensaio em TGA, em todos os
materiais.
Existe uma boa correlação entre o grau de hidratação e a percentagem de produtos
degradados em solução, ao longo do tempo de imersão. A libertação de parte da fase amorfa
da microestrutura interna do material conduziu a um aumento da porosidade superficial tal
como foi confirmado em SEM e AFM, permitindo a absorção de crescentes quantidades de
água.
As superfícies SEVA-C são hidrofóbicas, pois as medições do ângulo de contacto efectuadas
com água são superiores a 50º em todas as superfícies. O ângulo de contacto formado nos
filmes é inferior, podendo ser atribuído a vários factores: superfícies mais rugosas, menor
fase amorfa de amido na superfície por degradação e maior porosidade superficial
(confirmado pelas análises em SEM e AFM).
Todas as superfícies são predominantemente aceitadoras de electrões.
A porosidade e rugosidade superficiais aumentaram ao longo do tempo de imersão, sendo
mais pronunciado o efeito da degradação nos filmes, por efeito da dissolução hidrolítica
superficial. A rugosidade variou entre 500 nm para provetes e 2000 nm para 4 filmes. A
enzima actua na superfície do material, aumentando o número e tamanho dos poros, dado
BIBLIOGRAFIA |264
que as superfícies se encontram progressivamente mais destruídas. O aumento da
porosidade facilita a difusão externa e interna dos produtos para a solução, aumentando a
perda de massa do material.
A optimização e controlo das principais propriedades físicas do material mais adequadas aos
processos de degradação enzimáticos em aplicações específicas, estão assim condicionadas
pela espessura do material (área exposta), porosidade e rugosidade superficiais e pela
concentração enzimática em solução, limitando o processo de ressorção in vivo. No entanto,
todos os produtos libertados e identificados podem ser metabolizados e excretados pelos
mecanismos normais do organismo, sendo necessária a realização de alguns ensaios in vivo
para confirmação da ressorção destas partículas.
7.4 Bibliografia
Araujo, A., Cunha, A. M., Mota, M. (2004a) Changes in morphology of starch-based prothestic
thermoplastic material during enzymatic degradation. Journal of Biomaterials Science-Polymer Edition,
15, 1263-1280.
Araujo, M. A., Cunha, A. M., Mota, M. (2004b) Enzymatic degradation of starch-based
thermoplastic compounds used in protheses: identification of the degradation products in solution.
Biomaterials, 25, 2687-2693.
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DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO UTILIZANDO FILMES DE DIFERENTES ESPESSURAS |265
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CAPITULO 8
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS DE
TRABALHO FUTURO
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
8. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS DE TRABALHO FUTURO
SUMÁRIO
Neste último capítulo são referidas as principais conclusões, sendo uma discussão integradora de
todos os ensaios de degradação realizados. São ainda sugeridas algumas perspectivas de trabalho
futuro nesta área de investigação.
8.1
CONCLUSÕES
271
8.2
PERSPECTIVAS DE TRABALHO FUTURO
275
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS DE TRABALHO FUTURO |271
8.1 Conclusões
O trabalho realizado e apresentado nesta dissertação pretende dar resposta aos principais
mecanismos de degradação em misturas termoplásticas à base de amido de milho com
EVOH (SEVA-C). Estas misturas termoplásticas tem sido propostas em várias aplicações
biomédicas, tendo sido efectuados diversos estudos in vitro e in vivo sobre a sua
bicompatibilidade, citotoxicidade, propriedades mecânicas e capacidade de osteossíntese.
Apesar dos resultados promissores, nenhum destes estudos tem sido inteiramente dedicado
aos efeitos dos produtos de degradação e lixiviados no organismo. O conhecimento dos
principais mecanismos de degradação e seu possível controlo, são importantes no
processamento de materiais com propriedades mecânicas e de degradação mais adequadas
às aplicações biomédicas específicas. O principal objectivo desta Tese pretende assim dar
resposta à caracterização da cinética de degradação destas misturas termoplásticas, quando
imersas em meio fisiológico simulado com e sem actividade enzimática e com diferentes
configurações (provete e filmes).
Foi demonstrado que estas misturas termoplásticas quando imersas em meio fisiológico sem
actividade enzimática pouco degradam, podendo ser identificadas 3 fases distintas. A
primeira, entre 0 e 3-4 dias está associada à difusão rápida simples do plasticizador (glicerol)
e outras cadeias poliméricas de baixo peso molecular para a solução, assim como o aumento
da percentagem de água estrutural, devido à acção lubrificante da água. A lubrificação da
mistura é resultante da perda de plasticizador, conduzindo a um aumento da porosidade, por
efeito da solução de imersão. Após este período existe uma fase, entre 4 e 30 dias sem perda
de peso significativa, sendo estabilizada a libertação do plasticizador. Na fase final e para
períodos de imersão superiores a 60 dias existe uma estabilização da taxa de degradação,
atribuída possivelmente ao ataque do complexo amilose-EVOH, menos susceptível à
degradação. Do ponto de vista físico-químico, a degradação está associada principalmente à
libertação de glicerol, não foram detectados monossacarídeos e seus derivados resultantes da
fase amorfa de amido, ao longo de todo o tempo de imersão. A não degradação da fase
amorfa do amido para o exterior da matriz, está condicionada pela “dificuldade” de difusão
hidrolítica das cadeias longas de carboidratos para o exterior da matriz e pela baixa
porosidade do material.
CONCLUSÕES | 272
O processo de degradação está directamente associado a alterações de porosidade e
rugosidade superficiais, tal como confirmado por SEM em amostras degradadas.
Mediante os resultados de não degradação da mistura termoplástica nos ensaios realizados
em solução fisiológica, pretendeu-se quantificar a difusão dos principais compostos em
solução, glicerol e pequenas cadeias de glucose, variando a espessura dos materiais em
solução. A quantificação foi baseada na determinação dos coeficientes de difusão dos
compostos referidos, calculados pela resolução da equação diferencial parcial de difusão,
aplicando transformada de Laplace. Pretendeu-se também testar a aplicabilidade do modelo
no cálculo dos parâmetros cinéticos de difusão.
Foi confirmada mais uma vez a não degradação da mistura, não ocorrendo libertação da
matriz polimérica para a solução, associado a problemas de difusão interna e externa. O
único composto libertado foi o glicerol, utilizado como plasticizador na mistura. A degradação
da matriz polimérica está assim limitada pela difusão, não ocorrendo degradação na ausência
de reacção (enzimática).
À medida que a espessura do material aumenta o coeficiente de difusão do glicerol também
aumenta, devido à maior quantidade de glicerol em solução.
O modelo proposto é válido, devido ao bom ajuste obtido entre os valores calculados e os
valores medidos (R2≈1), para elevadas espessuras de material.
A acção das enzimas na velocidade de degradação de SEVA-C foi evidenciado nos ensaios de
degradação em solução fisiológica simulada com actividade enzimática, sendo a quantidade
de açúcares redutores quantificados em solução cerca de 100 vezes superior, relativamente
aos ensaios na ausência de enzimas.
A percentagem de perda de massa total em solução foi de 35%, tendendo a estabilizar
durante 100 dias de imersão. A libertação da fase amorfa foi compensada pelo aumento da
percentagem de absorção de água estrutural, devido à boa correlação estabelecida entre o
grau de hidratação e a percentagem de perda de massa total de compostos libertados, ao
longo do tempo de imersão.
Os principais sacarídeos encontrados nas soluções de degradação, resultantes da
degradação enzimática da fase amorfa de amido de SEVA-C foram a glucose, a maltose e a
maltotriose.
Foi libertada apenas parte da fase amorfa da mistura SEVA-C para a solução. A restante fase
permaneceu interligada na estrutura interna, devido à especificidade da estrutura da mistura
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS DE TRABALHO FUTURO |273
termoplástica em que o amido se encontra no interior da matriz do copolímero de EVOH,
dificultando a ligação das enzimas aos domínios interiores, fortemente ligados ao
componente sintético insolúvel.
A cinética de degradação depende da concentração enzimática para os períodos iniciais,
tendendo para um valor constante, diferente para cada uma das concentrações enzimáticas.
O processo de degradação enzimática deve ocorrer na superfície dos materiais, devido ao
aumento da porosidade e rugosidade superficiais evidenciados ao longo do tempo de
imersão.
O principal plasticizador, glicerol, libertou-se rapidamente durante os primeiros dias de
imersão.
O trabalho realizado com SEVA-C de diferentes espessuras (diferentes áreas de exposição) e
maior concentração em α-amílase, permitiu confirmar a limitação da área superficial entre
provete e filmes e a saturação do número de locais activos e de ligação enzimática, pela
baixa concentração enzimática em solução. Esta limitação foi evidenciada pela diferença na
percentagem de glucose e polissacarídeos em solução entre provete e filmes, no entanto, o
aumento da área superficial nos filmes, não conduziu a um aumento proporcional da
percentagem de açúcares, pela saturação do número locais activos e de ligação enzimática
na superfície dos materiais.
A degradação enzimática não depende directamente da massa total de material mas da área
superficial exposta à degradação, já que para materiais com a mesma massa mas com áreas
diferentes (provete e filmes), a percentagem de sacarídeos em solução é diferente.
O aumento da concentração enzimática em solução para o dobro, conduziu a um aumento
da percentagem de amido e outras moléculas de açúcares mais pequenas em solução,
associado ao maior número de locais activos e de ligação enzimática. No entanto, não se
registaram diferenças significativas nos resultados da percentagem de produtos totais
libertados entre 50 e 100 unid/l de enzima para provete e filmes SEVA-C, tendendo para um
limite comum em qualquer um dos casos, apesar do processo de libertação inicial ser mais
rápido para maior concentração enzimática. Como a quantidade de fase amorfa disponível
para hidrólise mantém-se constante, ao aumentar a concentração de enzima em solução, a
quantidade de subprodutos libertados não aumenta, associado também à limitação estrutural
da fase amorfa de amido no interior do material.
CONCLUSÕES | 274
A percentagem de produtos libertados em solução permitiu maior absorção de água na
estrutura polimérica. A maior parte da água libertada situa-se nas camadas mais exteriores,
tal como confirmado pelos ensaios em termogravimetria.
A enzima actua na superfície dos materiais, aumentando a porosidade e rugosidade
superficiais, pelo número e tamanho de poros, mais pronunciado nos filmes SEVA-C,
encontrando-se as superfícies progressivamente mais destruídas. O aumento da porosidade
facilita os processos de difusão interna e externa dos produtos em solução, incrementando a
perda de massa total do material.
A degradação do amido é influenciada por um conjunto de factores: tipo de processamento
nomeadamente à superfície, grau de encapsulamento do amido e extensão da superfície de
exposição, a degradação é tanto maior quanto maior é a superfície exposta.
É previsível que, em vez de uma mistura homogénea de SEVA-C, se obtenham melhores
resultados de biodegradação com um material multicamadas: o núcleo interno do material
seria constituído exclusivamente por amido, havendo um revestimento externo de 0.5 mm de
espessura (limite de espessura crítico) constituído por material sintético.
Os processos de degradação enzimática in vitro estão assim condicionados pela espessura
dos materiais (área exposta), porosidade e rugosidade superficiais e pela concentração
enzimática em solução. Os produtos identificados e libertados em solução podem ser
metabolizados e excretados pelos mecanismos normais de excreção do organismo, devido à
sua semelhança com as moléculas naturais presentes no organismo.
Na Tabela 8.1 estão resumidos os resultados analíticos dos produtos libertados durante os
ensaios de degradação in vitro. Não foram comparados os resultados do ensaio de difusão, já
que serviram apenas para quantificar os coeficientes de difusão dos principais compostos em
solução, glicerol e glucose.
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS DE TRABALHO FUTURO |275
Tabela 8.1 Percentagem de compostos libertados em solução durante os ensaios de degradação in
vitro, realizados em diferentes condições.
Dimensões SEVA-C
(área superficial)
Meio de
degradação
Provetes 10 cm2
NaCl = 9 g/l
Provetes 10 cm2
HBSS + 50
unid/l enzima
Provetes 10 cm2
HBSS + enzima
(50, 100 e 150
unid/l)
Percentagem
sacarídeos em
solução
% Absorção
de água
% Glicerol
0.15%
10%
10%
25%
9%
5%
_
_
15% (provete)
12% (2filmes)
12% (4filmes)
4% (provete)
4% (2filmes)
4% (4filmes)
_
8% (provete)
6% (2filmes)
6% (4filmes)
13% (50 unid/l)
15% (100 unid/l)
18% (150 unid/l)
Provetes 10 cm2
2 Filmes 95 cm2
4 Filmes 190 cm2
HBSS + 50
unid/l enzima
18% (provete)
35% (2 filmes)
35% (4 filmes)
Provetes 10 cm2
2 Filmes 95 cm2
4 Filmes 190 cm2
HBSS + 100
unid/l enzima
15% (provete)
30% (2 filmes)
30% (4 filmes)
8.2 Perspectivas de trabalho futuro
O trabalho realizado permitiu responder aos principais mecanismos de degradação em
materiais SEVA-C simples quando imersos em solução fisiológica simulada, mas muitas
questões ficaram por resolver, referindo-se as seguintes sugestões em trabalhos futuros:
-
Tendo em conta que a principal função destes materiais é a sua aplicação na área
biomédica, é necessária a incorporação de enchimentos inorgânicos semelhantes ao
osso, tais como HA ou vidros biactivos, e agentes de ligação, para assegurar o seu
comportamento bioactivo ao osso. Seria assim interessante estudar os mecanismos
de degradação utilizando SEVA-C com diferentes materiais de reforço e sua
interferência no processo de degradação.
-
Acompanhar os processos de degradação pela perda de propriedades mecânicas e
termomecânicas, nomeadamente na resistência dos biomateriais ao desgaste e
fadiga, principais causas da degradação de materiais em implantologia.
-
Estimar o peso molecular médio das cadeias de polímero ou compostos libertados
para a solução por SEC (size exclusion chromatography).
PERSPECTIVAS DE TRABALHO FUTURO | 276
-
Estabelecer a relação entre a composição da mistura e a cinética de degradação de
misturas termoplásticas à base de amido, testando diferentes formulações de amido
(trigo, milho waxy e amilomilho), variando a razão amilose/amilopectina.
-
Comparar o processo de degradação em diferentes misturas termoplásticas à base
de amido (SCA, SPLA e SPCL) e diferentes composições na mistura.
-
Acompanhar as modificações da fase cristalina e amorfa do material por degradação
em WAXS (wide angle X-ray scattering) e DSC. A taxa de degradação está
directamente associada à distribuição e tamanho das camadas semi-cristalina e
cristalina.
-
Utilizar TEM (transmission electron microscopy) na separação das fases cristalina e
amorfa entre as variedades de amido e EVOH ou outros polímeros sintéticos, durante
o processo de degradação in vitro, com marcadores específicos (por exemplo iodo).
-
Acompanhar as alterações morfológicas na superfície e na interface sólido/líquido
dos materiais por AFM em meio líquido.
-
Introduzir um medidor de pH nas soluções de degradação, registando as variações
on-line ao longo de todo o tempo de imersão.
-
Testar diferentes razões superfície/volume na taxa de degradação de compósitos.
-
Avaliar o efeito dos parâmetros de processamento, nomeadamente o efeito termomecânico, na degradação de misturas termoplásticas à base de amido,
-
Comparar a taxa de degradação de misturas termoplásticas em condições estáticas,
de mistura e de fluxo.
-
Utilizar uma solução simulada contendo para além da concentração em sais
inorgânicos semelhante ao plasma sanguíneo, um meio mais complexo, contendo
todas as substâncias constituintes do sangue humano, como proteínas, aminoácidos,
outras enzimas, lípidos e células brancas, e sua interferência no processo de
degradação de compostos à base de amido.
-
Utilizar enzimas imobilizadas em matrizes poliméricas, sendo possível controlar a
taxa de degradação neste tipo de conformação.
-
A partir da avaliação e identificação dos lixiviados em solução, testar a toxicidade dos
produtos de degradação, utilizando células primárias relevantes para a aplicação
biomédica, reconhecendo potenciais materiais citotóxicos,
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS DE TRABALHO FUTURO |277
-
Ajustar os processos de degradação de biomateriais biodegradáveis e de absorção
equivalentes à taxa de crescimento do novo tecido, alterando as formulações de
material.
APÊNDICE
A. VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA
DE ANÁLISE EM TGA
AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE DEGRADAÇÃO DE MISTURAS TERMOPLÁSTICAS À BASE DE AMIDO DE MILHO
MARIA ALBERTA PEREIRA DAS NEVES DA FONSECA ARAÚJO
APÊNDICE - VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA DE ANÁLISE EM TGA |281
APÊNDICE - VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA DE ANÁLISE
EM TGA
Conforme referido no capítulo 3, Materiais e Métodos, subcapítulo 3.5.1.1. desta tese foi
utilizada a análise termogravimétrica (TGA), como método de análise da percentagem de
absorção de água e velocidade de evaporação do material SEVA-C. No entanto, esta técnica
depende de várias variáveis, incluindo as variáveis inerentes ao próprio processo de análise
(programa de temperaturas escolhido e caudal de gás de arrasto), e à própria amostra
(massa de amostra e processo de libertação/absorção de água). Os registos termográficos
são assim afectados pelas condições de análise, nomeadamente: da amostra, metodologia de
preparação, taxa de aquecimento e atmosfera de análise.
Neste apêndice, pretende-se apresentar os resultados obtidos da optimização de cada
variável de processo, até à escolha do programa final de análise apresentado no capítulo de
Materiais e Métodos.
A.1 Massa de amostra inicial
A selecção da metodologia mais apropriada é essencial à qualidade dos resultados obtidos e
depende essencialmente da amostra. Os resultados são afectados pelas condições de análise
da amostra: massa, volume, forma física e metodologia de preparação (corte).
Nas misturas termoplásticas estudadas (SEVA-C) a preparação das amostras para análise
apresenta algumas dificuldades, nomeadamente na escolha de amostragens de massa
semelhante e forma regular do material. Teoricamente, a massa de amostra deve ser o
menor possível (até 10 mg), de forma a diminuir a transferência de massa, calor e limitações
difusionais, melhorando assim a reprodutividade final.
Foram realizadas algumas experiências com o material SEVA-C utilizando pequenas massas
de amostra (aproximadamente 3 mg) e massas maiores (aproximadamente 13 mg), tal como
mostrado na Figura A.1.
A.1 MASSA DE AMOSTRA INICIAL | 282
mg água/mg provete seco
0,2
(A)
0,15
0,1
0,05
0
0
10
20
30
40
50
Tempo (minutos)
3 mg
3.2 mg
3.5 mg
mg água/mg provete seco
0,15
(B)
0,1
0,05
0
0
10
20
30
Tempo (minutos)
14.1 mg
13.3 mg
40
50
13.8 mg
Figura A.1 Perda de massa de água adsorvida pelo provete com 3 mg de massa (A) e 13 mg (B).
Condições de análise: 5ºC/min, Tf = 160ºC, tfinal = 30 minutos.
Pela observação da figura A.1 conclui-se que, utilizando massas de provetes maiores (B) a
linha de base é mais estável, melhorando a reprodutividade dos ensaios (menor coeficiente
de variação). Neste último caso, a taxa de aquecimento também deve ser diminuída para
compensar o aumento dos gradientes de temperatura na amostra, e evitar a interferência
térmica devido às correntes de convecção que circulam no recipiente. É também importante
considerar que, ao aumentar a massa de amostra, diminuem também as perturbações
térmicas no interior do cadinho, limitando a transferência de massa e calor e minimizando o
número de vazios entre as partículas da amostra e o cadinho (menor área livre). O contacto
térmico entre a amostra e o cadinho é optimizado, reduzindo as diferenças térmicas. Quando
APÊNDICE - VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA DE ANÁLISE EM TGA |283
a massa de amostra é demasiado pequena, pode não ser representativa da totalidade da
massa de amostra, aumentando a instabilidade da linha de base, devido ao espaço vazio
entre a amostra e o cadinho.
A reprodutividade é também melhorada pelo maior número de réplicas na obtenção da média
dos resultados.
A.2 Estudos de reversibilidade da velocidade de secagem
Pretendeu-se com este estudo averiguar se a velocidade de secagem em determinadas
condições de análise era um processo destrutivo, ou se pelo contrário, ao efectuar ensaios de
reversibilidade mergulhando novamente o provete em solução, a velocidade de perda de
massa seguia o mesmo perfil. Foram assim realizadas análises mergulhando o provete para
diferentes tempos de imersão, após o ensaio de TGA. O resultado obtido está representado
na figura A.2.
mg água/mg provete
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
10
20
30
Tempo (minutos)
normal
1 hora
1 dia
40
50
5 dias
Figura A.2. Perda de massa de água adsorvida pelo provete para diferentes tempos de imersão após
ensaio TGA (normal). Condições de análise: 5ºC/min, Tfinal=160ºC,tfinal=20 minutos.
Observando a figura A.2. verifica-se que durante a análise em TGA no programa de
temperatura indicado (normal), ocorrem duas velocidades de secagem, antes e após vinte
minutos, a que corresponde um ponto de inflexão situado a 130ºC, aproximadamente. São
A.2 ESTUDOS DE REVERSIBILIDADE DA VELOCIDADE DE SECAGEM | 284
visíveis dois patamares distintos de perda de massa, com declives aparentemente diferentes,
na análise normal do provete.
Após mergulhar novamente o provete em solução verifica-se que este ponto de inflexão
desaparece, sendo a velocidade de perda de massa linear (processo simples de absorção e
libertação de água). Para as condições de análise e durante o processo de secagem, é
provável que se tenha libertado não apenas água. Ao repetir a análise mergulhando
novamente o provete em solução, o processo é irreversível. É provável que se tenha libertado
além da água, outros voláteis, ou a amostra seja degradada termicamente nas condições de
análise (Tf=160ºC). Após imersão, a percentagem de variação de massa ocorre por
mecanismos diferentes, no entanto, a percentagem de massa total final é semelhante.
Verifica-se também que a quantidade de massa final após o ensaio em TGA e para tempos de
imersão superiores (5 dias) aumentou ligeiramente, este facto pode ser devido ao aumento
do número de ligações livres disponíveis, aumentando assim a percentagem de absorção de
água para tempos de imersão superiores. No entanto, a análise passa a ser reversível, sendo
o mecanismo de velocidade de perda de massa e percentagem de perda de massa
semelhantes (absorção/libertação de água).
Uma outra conclusão a retirar da figura A.2 é que uma hora não é suficiente para que a
amostra estabilize o seu conteúdo em água, pelo processo de absorção característico deste
tipo de materiais.
A temperatura de 130ºC indica assim uma perda de massa máxima, tal como demonstrado
na figura A.3.
APÊNDICE - VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA DE ANÁLISE EM TGA |285
0,01
dm/dt(mg/s)
0,008
0,006
0,004
0,002
0
0
50
100
150
200
Temperatura (ºC)
Figura A.3. Velocidade de secagem em função da temperatura.
Condições de análise: 5ºC/min, Tfinal1=60ºC, tfinal=20 minutos.
Pela figura A.3 confirma-se a ocorrência de duas velocidades de secagem, antes e após
130ºC, tendo como ponto máximo a temperatura de 130ºC. A velocidade de secagem pode
assim indicar dois fenómenos: libertação de água ou desorção de água das zonas mais
internas. A diminuição de dm/dt acima de 130ºC, pode ser devido ao aumento das
resistências difusionais, e menor quantidade de água livre disponível, o que dificulta a sua
deslocação até à superfície.
A.3 Optimização da temperatura final
A nível experimental, uma amostra pode ser estudada numa ampla gama de temperaturas,
sendo possível aplicar uma variedade de programas de temperaturas.
De forma a avaliar a influência da temperatura final na velocidade de secagem do material,
foram efectuadas experiências variando a temperatura entre 100 e 160ºC. Os resultados
obtidos encontram-se na figura A.4.
A.4 EFEITO DO TEMPO DE IMERSÃO NA PERDA DE MASSA DE ÁGUA | 286
mg água/mg provete
0,3
0,2
0,1
0
0
10
20
30
Tempo (minutos)
100ºC
120ºC
125ºC
40
50
160ºC
Figura A.4. Perda de massa de água adsorvida pelo provete a diferentes temperaturas finais de
estabilização (100, 120, 125 e 160ºC). Condições de análise: 5ºC/min e tfinal=20 minutos.
Mais uma vez é evidenciada a mudança do perfil de variação de perda de massa acima de
125ºC. É provável que a partir desta temperatura ocorram modificações estruturais do
material. O mecanismo de libertação de água é diferente para temperaturas superiores a
125ºC, no entanto, a percentagem de absorção/libertação de água no final em todos os
ensaios é semelhante. Abaixo de 120ºC o processo é reversível e semelhante sem pontos de
inflexão, após esta temperatura pode ocorrer um mecanismo diferente de velocidade de
secagem, associado provavelmente a um processo de degradação ou interacção química do
material. Pela análise da figura A.4 verifica-se também que, ao aumentar a temperatura final,
a percentagem de massa final associada ao material também aumenta, provavelmente
porque se libertam outros compostos para além da água por efeito da temperatura.
A.4 Efeito do tempo de imersão na perda de massa de água
Como o objectivo da aplicação da técnica de TGA nos estudos de degradação do material é
avaliar o efeito do tempo de imersão na percentagem de absorção de água pelo material, foi
efectuado um estudo prévio avaliando a perda de massa de água adsorvida por provetes a
diferentes tempos de imersão. Os resultados obtidos após trinta e quatro dias de imersão
encontram-se na figura A.5:
APÊNDICE - VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA DE ANÁLISE EM TGA |287
mg água/mg provete
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
10
20
30
40
Tempo (minutos)
14 dias
20 dias
29 dias
34 dias
Figura A.5. Perda de massa de água adsorvida pelo provete a diferentes tempos de imersão (14, 20,
29 e 34 dias). Condições de análise: 5ºC/min, Tfinal=120ºC, tfinal=20 minutos.
A figura A.5 confirma que, à medida que aumenta o tempo de imersão em solução, a
percentagem de massa de água absorvida também aumenta, provavelmente devido ao
aumento do número de ligações livres disponíveis, por efeito da degradação do material. O
material SEVA-C apresenta grupos hidrofílicos e à medida que vai degradando aumenta a
quantidade destes grupos, a que corresponde um aumento da percentagem de água
absorvida durante a análise em TGA. A água “ocupa” o espaço vazio dos poros formados por
efeito de degradação.
A.5 Avaliação do tempo de estabilização do ensaio
Para a contabilização correcta da quantidade de água absorvida pelos provetes é necessário
confirmar que no final da análise não ocorrem variações adicionais de massa, de forma a
estabelecer uma análise comparativa e precisa entre amostras imersas em diferentes tempos
de imersão. A figura A.6 mostra os resultados obtidos num ensaio de degradação efectuado
durante 67 dias, tendo sido obtido um tempo de estabilização final de aproximadamente 330
minutos, altura em que a perda de massa é nula.
A.5 AVALIAÇÃO DO TEMPO DE ESTABILIZAÇÃO DO ENSAIO | 288
mg água/mg provete
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
50
100
150
200
250
300
350
Tempo (minutos)
9 dias
13 dias
27 dias
31 dias
67 dias
Figura A.6. Perda de massa de água adsorvida pelo provete para diferentes tempos de imersão (9,
13, 27, 31 e 67 dias). Condições de análise: 5ºC/min, Tfinal=120ºC, tfinal=330 minutos.
Após vários ensaios realizados verificou-se que, para tempos finais de análise de 300 minutos
(aproximadamente), a perda de massa final é nula. Mais uma vez se confirma que,
aumentando o tempo de imersão a percentagem de massa de água também aumenta.
No final destes ensaios foram escolhidos os programas de análise que se encontram no
capítulo 3, Materiais e Métodos, subcapítulo 3.5.1.1. Foram também realizados alguns
ensaios para a escolha do caudal de arrasto, tendo sido escolhido um caudal de 30 ml/min,
pela melhor estabilidade obtida na linha de base.