Polimorfismos dos genes das enzimas
glutaniona S-Transferase MU1 e TETA1
Resumo
Carlos Roberto Escrivão Grignoli, André Luiz Rè, Adão Carlos Bertoncin
O objetivo deste trabalho foi estudar e identificar os
polimorfismos dos genes da GSTM1, e GSTT1 e suas
freqüências na população de Araras e região, comparando
três grupos: a população da região de Araras, indivíduos
fumantes sem relação com o tempo de tabagismo e indivíduos
que fumam há mais de dez anos. Foram analisados 84
indivíduos do Laboratório de Análises Clínicas da Uniararas,
dos quais 31 são fumantes e 12 são fumantes há mais de
dez anos. O DNA foi extraído dos leucócitos pelo método
DNAzol e utilizado na Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR) para amplificação dos genes GSTT1 e GSTM1
(fragmento de 480 pb e 270 pb, respectivamente). O gene
da β-globina foi amplificado para controle da reação,
originando um fragmento de 630 pb. Os fragmentos foram
observados em eletroforese em gel de agarose 1,5 %. A maior
freqüência constatada foi do genótipo +/+ para GSTM1 e
GSTT1 (53,4%) e a menor, para o genótipo +/0 (5%). O
genótipo 0/0 foi mais encontrado em fumantes há mais de
dez anos que na população (25% e 8,3%, respectivamente),
e o mesmo ocorreu para os alelos nulos de GSTT1 (42% e
13% respectivamente; p < 0,005). Esses dados demonstram
uma maior incidência de certos alelos nulos nos indivíduos
fumantes há mais de dez anos, podendo ser prejudicial, pois
leva a uma deficiência na atividade de detoxificação do
organismo, provocando o acúmulo de substâncias reativas
que podem levar a mutações no DNA e, conseqüentemente,
modulando a susceptibilidade para o desenvolvimento de
cânceres relacionados ao tabagismo.
Palavras-chave
Polimorfismos, Xenobióticos, Tabagismo, Glutationa.
Autores
Carlos Roberto Escrivão Grignoli
Mestre em Farmacologia pela Faculdade de Ciências Médicas (UNICAMP),
Professor Adjunto do Centro Universitário Hermínio Ometto – UNIARARAS
e-mail:
[email protected];
André Luiz Rè
Mestre em Saneamento Ambiental – Universidade Presbiteriana Mackenzie, Professor Adjunto
da Anhanguera Educacional
e-mail:
[email protected]
Adão Carlos Bertoncin
Mestre em Ciências Médicas
(UNICAMP), Professor do Centro
Universitário das Faculdades Associadas de Ensino -FAE; Professor da
Anhanguera Educacional e Técnico
Especializado do Centro Universitário Hermínio Ometto – UNIARARAS
e-mail:
[email protected]
Recebido em 29/outubro/2008
Aprovado em 19/novembro/2008
Pensamento Plural: Revista Científica do
, São João da Boa Vista, v.3, n.1, 2009
23
GRIGNOLI, C. R. E. RÈ, A. L. e BERTONCIN, A. C.
1.
Introdução
Xenobióticos são compostos químicos estranhos ao organismo tais como drogas, aditivos alimentares e poluentes ambientais. Sua metabolização é feita em duas fases,
sendo a primeira uma hidroxilação pelo citocromo P450
e a segunda a transferência de grupos eletrofólicos para
a proteína Glutationa através das enzimas Glutationa Stransferase. Esse processo transforma compostos lipofílicos
em hidrossolúveis, facilitando sua excreção pelo organismo
através da bile e da urina (MURRAY et al, 1998; SÓLEO &
STRZELCZYK, 2003; WHALEN & BOYER, 1998) Isso impede a ligação de compostos eletrofílicos com macromoléculas intracelulares tais como DNA, RNA e proteínas evitando,
assim, o surgimento de mutações. (RESKA & WARSOWICS,
2001; SÓLEO & STRZELCZYK, 2003).
As enzimas GSTs envolvem uma grande família multigênica de proteínas diméricas. Duas famílias supergênicas
codificam proteínas com atividade GST: a família de enzimas solúveis, que compreende pelo menos 16 genes, e a
família separada das enzimas microssomais, que compreende pelo menos 6 genes. (HAYES & STRANGE, 2000)
Baseada primariamente na similaridade da seqüência
protéica, as Gluationa S-transferases solúveis foram divididas em cinco famílias de proteínas: classes Alfa, Mu, Pi,
Sigma e Teta. (XU et al, 1998; HAYES & PULFORD, 2005)
As enzimas GST são distribuídas pelos órgãos de forma
não uniforme e de acordo com seu subtipo, havendo prevalência de certas isoformas em determinados tecidos. Os
testículos apresentam os maiores níveis de GSTs, e concentram a maioria dos seus subtipos (HAVES et al, 2005).
Por serem altamente polimórficas na população as
classes Mu e Teta têm sido alvo de muitos estudos, e seus
genótipos nulos vêm sendo associados a diferentes patologias resultantes de uma ação diminuída na detoxificação
do organismo.
Na região 1p13.3 do cromossomo 1 existe um cluster
da classe GSTM, sendo que os genes GSTM1, GSTM2,
GSTM4 e GSTM5 que o constituem, encontram-se separados por cerca de 20 Kb, ou seja, 20mil pares de bases
(XU et al, 1998)
A prevalência do genótipo nulo da GSTM1 entre diferentes grupos étnicos do Brasil ocorre em grande escala,
estando presente em 55% dos caucasianos, 33% dos negros brasileiros e 20% dos índios amazonenses. (ARRUDA
et al, 1998)
Este polimorfismo leva a uma atividade enzimática menor se comparada ao produto original do gene. (GRUBBEN et al, 2001) Isso acontece porque o polimorfismo é
resultado de uma deleção total do gene da GSTM1, que
pode ser homozigótica ou heterozigótica. É provável que
esta deleção seja o produto de um crossing-over desigual
entre os genes da GSTM1 e GSTM2 nos cromossomos homólogos, já que a semelhança entre eles é de cerca de
99%. (XU et al, 1998)
O gene GSTT1 está localizado na região 22q11.2 do
cromossomo 22 (GEISLER & OLSHAN, 2001) e seu alelo
nulo encontra-se presente em cerca de 20% da população
em geral, não havendo grandes variações entre os grupos
étnicos. (ARRUDA et al, 1998)
A GSTT é considerada a mais antiga entre as GSTs, e
similares são encontradas em mamíferos, peixes, insetos,
plantas, algas unicelulares e bactérias. Acredita-se que um
gene ancestral Teta penetrou nas duplicações primitivas
antes da divergência dos fungos e animais, e duplicações
posteriores geraram a variação das outras classes de GSTs.
(LANDI, 2000).
24
O genótipo nulo para GSTT1 representa uma deleção
parcial ou total deste gene, e a combinação do genótipo
positivo e negativo resulta em três diferentes fenótipos: conjugadores (GSTT1 +/+), conjugadores fracos (+/-) e nãoconjugadores (-/-). (SÓLEO & STRZELCZYK, 2003)
As células mais ricas em GSTT1 são os eritrócitos e,
apesar das GSTs atuarem removendo substâncias eletrofílicas, como os epóxidos, elas também atuam como um
ativador metabólico para compostos halogenados, produzindo uma variedade de intermediários potencialmente
perigosos para o DNA e para as células. (LANDI, 2000)
O alelo nulo para GSTT1 é menos freqüentemente
encontrado que para GSTM1, variando em menor escala dentro dos grupos étnicos. Este alelo foi encontrado na
população brasileira em 18,5% dos caucasóides, 19% dos
negros e 11% dos índios. O alelo nulo combinado para
GSTM1 e GSTT1 foi encontrado em 11% dos caucasóides,
5% dos negros e 5% dos índios. (ARRUDA et al, 2001)
2.
As Enzimas Glutationa
s-transferase e sua Relação com o
Câncer e outras Patologias
Como anteriormente descrito, as enzimas Glutationa
S-transferase podem prevenir a ligação de compostos químicos prejudiciais (xenobióticos) a moléculas como o DNA
e RNA, reduzindo assim mutações no genoma das células.
(RESKA & WARSOWICS, 2001; SÓLEO & STRZELCZYK,
2003). Conseqüentemente, indivíduos que apresentam o
genótipo nulo para GSTM1 ou para GSTT1 têm sua capacidade diminuída na metabolização destes compostos,
gerando o acúmulo de substâncias reativas nas células.
Vários estudos documentaram a associação do polimorfismo de GSTM1 com diversos tipos de doenças, o que
indica que indivíduos homozigotos para a o alelo GSTM1*0
podem apresentar risco aumentado para alguns tipos de
câncer de pulmão, câncer de estômago, câncer de bexiga
(ABDEL-RAHMAN et al, 1998), fibrose cística (KORYTINA
et al, 2004) e aterosclerose (PESSAH-RASMUSSEN et al,
2002). A grande freqüência do alelo GSTM1*0, apesar de
sua associação com algumas doenças, poderia ser explicada pelo fato de que a maioria delas se manifesta na idade
madura, quando indivíduos homozigotos GSTM1 0/0, em
sua grande parte, já transmitiram o genótipo nulo para os
seus descendentes (HAVES et al, 2005). Também foi observado que em indivíduos com câncer gastrointestinal, cerebral e câncer de pele, o genótipo GSTM1 é menos comum
que em controles (HEAGERTY et al, 1994), sugerindo que
este polimorfismo passa por um algum tipo de seleção que
é favorável para heterozigotos para GSTM1 e desfavorável
para indivíduos homozigotos para a deleção desta enzima.
(LI et al, 2001).
Estudos realizados em mulheres com câncer de mama
identificaram que, isoladamente, o único achado significante foi entre o genótipo nulo da GSTM1 e o câncer de
mama pós-menopausal. Porém estes estudos demonstraram que, especialmente em certas combinações alélicas,
os genótipos das GSTs contribuem para o risco individual
de câncer de mama. (MITRUNEN et al, 2001)
O genótipo nulo para GSTM1 e GSTT1 foi associado
ao aumento no risco de neoplasias do trato gastrointestinal, pele, pulmão e bexiga urinária (ORTEGA et al, 2000).
Também foi verificado maior freqüência deste genótipo em
pacientes portadores de Leucemia Mielóide Aguda e Anemia Aplástica (ARRUDA et al, 2001)
Certos alelos, principalmente aqueles que prejudicam a atividade catalítica das enzimas, como GSTM1(*)0
Pensamento Plural: Revista Científica do
, São João da Boa Vista, v.3, n.1, 2009
Polimorfismos dos genes das enzimas glutaniona S-Transferase MU1 e TETA1
e GSTT1(*)0 devem estar associados com o aumento da
sensibilidade a compostos tóxicos e também ao risco de
câncer de laringe em fumantes (Li et al, 2001).
Desta forma , para uma série de compostos quimioprotetores, a proteção é gerada por um aumento na quantidade de enzimas como as Glutationa S-transferases. (UCHIDA, 2000)
3.
Objetivo
O objetivo foi estudar e identificar os polimorfismos
dos genes da GSTM1 e GSTT1 e suas freqüências na população de Araras e região, comparando três grupos: a
população da região de Araras, indivíduos fumantes sem
relação com o tempo de tabagismo e indivíduos que fumam há mais de dez anos.
4.
Materiais e Métodos
Foram utilizadas 84 amostras sanguíneas obtidas do
Laboratório de Análises Clínicas do Centro Universitário
Hermínio Ometto, de forma acidental (não probabilística),
com prévio consentimento e anamnese dos pacientes. Foram utilizados para a coleta tubos a vácuo contendo o anticoagulante ácido etileno-diamino-tetracético (EDTA).
As amostras foram classificadas em três grupos, sendo:
população da região de Araras (84 indivíduos), fumantes
sem correlação com o tempo de tabagismo (31 indivíduos)
e fumantes há mais de dez anos (12 indivíduos).
Após obtenção das amostras, foi realizada a extração
de DNA dos leucócitos do sangue periférico pelo método
DNAzol, utilizando-se 2,5 mL de sangue total. As amostras
foram estocadas para a análise em freezer a 20oC negativos.(DNAzol, 2002)
Os genes GSTM1 e GSTT1 foram amplificados pela
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) na mesma reação,
incluindo a amplificação do gene da β-globina como um
controle das amostras de DNA e da reação de PCR. Não
foi possível amplificar os alelos nulos utilizando esta técnica, já que estes representam uma deleção do gene. O PCR
multiplex foi realizado em uma mistura de 5 μL de Tampão
Taq DNA polimerase, 3 μL de MgCl2, 1 μL de cada nucleosídeo trifosfato, 3μL de DNA genômico e 50μL de Taq DNA
polimerase. A reação envolverá 30 ciclos de incubação no
termociclador a 95oC (1 min.), 60 oC (1 min.) e 72 oC (1
min.), respectivamente.
Para a amplificação do gene GSTM1, obteve-se um
fragmento de 273 pb utilizando-se 1μL de cada primer
GSTM1 sense (5`- CTGCCCTACTTGATTGATGGG-3`) e
GSTM1 antisense (5`- CTGGATTGTAGCAGATCATGC-3`).
Um fragmento de 480 pb do gene GSTT1 foi observado
utilizando-se os primers : GSTT1 sense (5`- TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC–3`) e GSTT1 antisense (5`- TCACCGGATCATGGCCAGCA – 3`). O fragmento de 630 pb
corresponde ao fragmento do gene da β-globina incluindo
o exon 3 e seqüência do intron 2 (ARRUDA et al, 1998)
Após eletroforese em gel de agarose 1,5% contendo 5
μL de Brometo de Etídio, os fragmentos foram visualizados
sob luz ultravioleta e fotografados com a câmera Polaroid
(figura 1).
Figura 1 – Eletroforese em gel de agarose 1,5%.
5.
RESULTADOS
Após análise dos fragmentos, calculou-se por porcentagem a freqüência gênica dos alelos nulos presentes nas amostras utilizadas, podendo-se observar na Tabela 1:
AMOSTRA
GSTM1 NULO
População da região de Araras
43%
GSTT1 NULO
13%
Fumantes sem correlação com o tempo de tabagismo
32%
16%
Fumantes há mais de dez anos
58%
42%
Tabela 1 – Freqüência gênica dos alelos nulos para GSTM1 e GSTT1 nos três grupos estudados
Pensamento Plural: Revista Científica do
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GRIGNOLI, C. R. E. RÈ, A. L. e BERTONCIN, A. C.
Fazendo-se a comparação entre os três grupos obtiveram-se os seguintes gráficos para GSTM1 (Gráfico 1) e
GSTT1 (Gráfico 2):
Gráfico 4 - Distribuição dos genótipos de GSTM1 e GSTT1 em
fumantes sem correlação com o tempo de tabagismo.
Gráfico 1 – Comparação da distribuição gênica para GSTM1
nulo nos três grupos estudados.
No grupo de fumantes há mais de dez anos, a freqüência genotípica encontrada para GSTM1 e GSTT1 foi de:
+/+ 25%; +/- 17%; -/+ 33% e -/- 25% (Gráfico 5).
Gráfico 2 – Comparação entre a freqüência gênica para GSTT1
nulo nos três grupos estudados.
Considerando-se a freqüência genotípica desses alelos
somente na população da região de Araras, os resultados
obtidos para GSTM1 e GSTT1 foram, respectivamente,
+/+ 53,40%; +/- 5%; -/+ 33,30% e -/- 8,30% (Gráfico
3).
Devido a esses resultados, pode-se afirmar que genótipo mais freqüente entre a população da região de Araras e os indivíduos fumantes sem correlação com o tempo de tabagismo, é o positivo tanto para GSTM1 quanto
para GSTT1 (+/+) e que o menos freqüente em todos os
grupos é o positivo para GSTM1 e negativo para GSTT1
(+/-). O genótipo nulo para ambos os genes (-/-) encontrou-se significativamente aumentado (p<0,05) no grupo
de indivíduos fumantes há mais de dez anos, igualando-se
à porcentagem de +/+.
6.
Gráfico 3 - Distribuição dos genótipos de GSTM1 e GSTT1 na
população da região de Araras.
Para o grupo de fumantes sem correlação com o tempo
de tabagismo, a distribuição dos genótipos para GSTM1
e GSTT1 foi de: +/+ 61,30%; +/- 6,45%; -/+ 22,58% e
-/- 9,67% (Gráfico 4).
26
Discussão e Conclusão
Os alelos nulos para GSTM1 e GSTT1 variam significativamente de acordo o grupo étnico, sexo, idade, localização geográfica, etc. Para a população da região de
Araras e para o grupo de fumantes sem correlação com
o tempo de tabagismo, as freqüências gênicas e genotípicas encontradas para ambas as enzimas se enquadram
nos valores esperados, já que não houve padronização
entre as diferentes variáves. Os dados obtidos entre esses
dois grupos tiveram uma pequena diferença, porém nãosignificativa, o que pode se dever ao fato de que grande
parte deste grupo de fumantes sem correlação com o tempo (19 dos 31 pacientes) são indivíduos jovens (abaixo de
30 anos) e que fumam há menos de 5 anos.
Com relação aos fumantes há mais de dez anos, observou-se uma freqüência aumentada tanto para o genótipo nulo de GSTT1 (+/-) quanto para a combinação dos
dois genótipos nulos (-/-), com conseqüente diminuição do
genótipo positivo para ambas as enzimas (+/+).
O acúmulo de substâncias tóxicas ao organismo no
meio intracelular pode levar a mutações devido à sua li-
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Polimorfismos dos genes das enzimas glutaniona S-Transferase MU1 e TETA1
Notas
em diversos órgãos devido à grande variedade de substâncias tóxicas e eletrofílicas que o compõem. Dessa forma,
pode-se sugerir que o tabagismo leva a mutações no DNA
podendo resultar, de acordo com a quantidade e o tempo de consumo, na deleção dos genes GSTM1 e GSTT1.
A associação entre o tabagismo e os alelos nulos para
GSTM1, GSTT1 ou ambas, aumenta significativamente
a susceptibilidade individual para o desenvolvimento de
cânceres, principalmente aqueles relacionados ao uso do
cigarro, como câncer de pulmão, laringe, faringe e traquéia.
Agradecimentos aos professores Vagner Luis da Silva pela contribuição no tratamento estatístico dos dados e
Pablo Pulz pela revisão do abstract.
Referências
gação a moléculas como o DNA. Essas mutações podem
resultar na deleção de genes e cromossomos inteiros, bem
como na sua inserção. Mutações no DNA são as causas
básicas que levam ao desenvolvimento de neoplasias.
Indivíduos com atividade catalítica prejudicada em
qualquer das enzimas que atuam no processo de eliminação destes compostos, como as Glutationa-Stransferase,
tendem a reter maior quantidade de substâncias reativas
e, conseqüentemente, apresentar maior susceptibilidade a
mutações e ao câncer.
O cigarro é um dos principais causadores de cânceres
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Abstract
WHALEN, R.; BOYER, T.D. Human Glutathione S-transferases. Semin Liver Dis. v.18, n.4, p.345-58, 1998
The aim of this work was to study and identify the polymorphisms of the GSTM1 and GSTT1 genes and its
frequencies in the population of Araras region, comparing three groups: the population of the Araras region,
smoker individuals without relation with the tobaccoism time and individuals that smoke it has ten years more
than. 84 individuals of the Uniararas Laboratory of Clinical Analyses had been analyzed, of which 31 are smokers
and 12 are smokers have ten years more than. The DNA was extracted from the leukocytes by DNAzol method
and had been used in the Polymerase Chain Reaction (PCR) for amplification of GSTT1 and GSTM1 genes
(fragments up of 480 pb and 270 pb, respectively). The β-globin gene was amplified for the reaction control
having originated one breaks up of 630 pb. The fragments had been observed by electrophoresis in agarose
gel 1.5%. The major frequency evidenced was of genotype +/+ for GSTM1 and GSTT1 (53.4%) and, the minor
(5%), for genotype +/0. Genotype 0/0 more was found in smokers more than ten years in the population (25%
and 8.3%, respectively), and the same occurred for the null alleles of GSTT1 (42% and 13% respectively; p <
0,005). These data demonstrate a big incidence of certain null alleles in smoker individuals have ten years more
than, being able to be harmful, because it takes to a deficiency in the organism detoxification activity, producing
accumulation of reactive substances that can take the mutations in the DNA and, consequently, modulating the
susceptibility for the development of cancers related to the tobaccoism.
Key words
Xenobiotics, Polymorphism, Tobaccoism, Glutathione
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