UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE CURSO DE FARMÁCIA AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA DE NANOPARTÍCULAS Prof. Rilton Alves de Freitas Centro e Ciência da Saúde, Universidade do Vale do Itajai, Itajai-S.C., Brasil Aula curso Second Brazilian School on Nanobiotechnology-Itajai-S.C. 4-10 de Novembro 2007 (rede de nanobiotecnologia-NANOBIOTEC ASPECTOS GERAIS DE NANOPARTÍCULAS • Fatores de toxicidade de nanopartículas (Nighswonger, 1999; Oberdörster et al., 2005; Smart et al. 2005):: - Como citado anteriormente a razão área superficial pela massa, pois uma grande área superficial gera partículas com uma maior área de contato com membranas células, assim como uma grande capacidade de absorção e transporte de substâncias tóxicas. - O Tempo de retenção da partícula, pois quanto maior o tempo de contato da mesma com a membrana celular, maior a chance de dano. Este fator incorpora o conceito de mobilidade de partícula, ou pelo clearance ou migração para tecidos adjacentes. - Reatividade ou toxicidade inerente do composto químico contido com a partícula. ASPECTOS GERAIS DE NANOFIBRAS • Tamanho da fibra x respirabilidade (capacidade de penetrar na região centro-acinar do pulmão). – Fibras com comprimento maior que 15 um apenas são respiráveis se apresentam uma espessura menor que 5 um. – Fibras longas (>17 um) tornam difícil a fagocitose por macrófagos, promovendo uma resposta crônica que contribui para a fibrose pulmonar. – Fibras curtas, menores que 7 um, são por outro lado facilmente fagocidadas, e removidas por macrófagos alveolares (DONALDSON e TRAN, 2004; YE et al., 1999; DONALDSON et al., 1992). • A Biopersistência: partículas longas são dificilmente fagocitadas por macrófagos. – Fibras biosolúveis são capazes de se difundir reduzindo e serem fagocitadas mas facilmente, gerando uma baixa biopersistência e reduzindo assim a toxicidade de fibras longas longas (maiores que 20 um). • Reatividade ou toxicidade inerente, dependendo basicamente dos componentes químicos da nanopartículas. REGULAMENTAÇÃO DA NANOTOXICOLOGIA • AVALIAÇÃO COMPLETA DO RISCO DE PRODUÇÃO DE NANOPARTÍCULAS (Friedrichs, Schulte, 2007) – Identificação do risco – Caracterização do risco – Avaliação do risco – Prevenção e controle o risco – Avaliação das medidas de controle do Obs:. Royal Society and the Royal Academy of Engineering of UK government, Recommend nanoparticulate materials to be treated as new substances. Tempo para desenvolver um medicamento 5.0000 a 10.000 selecionados Invenção e desenvolvimento Testes pré-clínicos (testes laboratoriais em animais) Fase II – 100 a 300 voluntários para determinar eficácia e efeitos colaterais Fase I – 20 a 80 voluntários saudáveis para determinar segurança e dosagem 250 entram em teste pré-clínico Fase III – 1.000 a 20.000 pacientes voluntários para monitorar reações adversas em uso de longa duração 5 entram em testes Aprovação do Governo Fase IV – Teste adicional pós-comercialização Anos 0 Patente clínicos 2 4 Patente solicitada concedida 6 8 10 12 14 15 Apenas 1 chega ao mercado Avaliação toxicológica – Estudos Pré- clínicos Estudos Agudos • • • • • • DL50 Oral DL50 Dérmica CL50 Inalatória Irritação / Corrosão Ocular Irritação / Corrosão Dérmica Sensibilização Cutânea Avaliação de perigo Classificação toxicológica Avaliação toxicológica Estudos sobre mutagenicidade • Mutação gênica (procariontes) • Mutação cromossômica (eucariontes) Proibição do Registro Estudos sobre carcinogenicidade • Camundongo (18 meses) • Rato (24 meses) Estudos sobre teratogenicidade • Coelho • Rato Avaliação toxicológica Estudos de curto prazo • Roedor (90 dias) • Não roedor (1 ano) Estudos de longo prazo e carcino • Camundongo (18 meses) • Rato (24 meses) Estudos de neurotoxicidade Estudos de reprodução e prole Estudos dos efeitos teratogênicos NOAEL Definições importantes Ingestão Diária Aceitável (IDA) - quantidade máxima que, ingerida diariamente durante toda a vida, parece não oferecer risco apreciável à saúde, à luz dos conhecimentos atuais Avaliação toxicológica Dose 3X Dose 2X Dose X Controle NOAEL Avaliação toxicológica NOAEL IDA = NOAEL Fator de incerteza Fatores de incerteza TESTES PRÉ-CLÍNICOS: MÉTODOS TOXICOLOGICOS “IN VITRO” Azul de tripan QUANTIFICAÇÃO DE CRESCIMENTO MTT (3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) http://www.ib.amwaw.edu.pl/home/dslado/video/mtt.html Alaranjado de Acridina Apoptosis Necrosis AO stains DNA Small intense spots Diffuse spots Processos necróticos: Lactato desidrogenase NAD+ LACTATO NADH PIRUVATO QUANTIFICAÇÃO APOPTOSE • Processos terminais – Nucleases: Fragmentação do DNA – Morfologia (nuclear) • Processos iniciais – Fosfatidilserina – Caspases BROMETO DE ETIDIO DAPI ALARANJADO DE ACRIDINA TUNEL/IODETO PROPIDIO • Células saudáveis – Membrana polarizada – Sistema de transporte ativo DAPI (Azul 460 nm) • Células vitais – Membrana polarizada – Sem sistema de transporte ativo BROMETO DE ETIDIO (Vermelho 602 nm) • Células intactas – Membrana despolarizada – Sem sistema de transporte ativo BROMETO DE ETIDIO (Vermelho 602 nm) • Células mortas – Membrana despolarizada – Sem sistema de transporte ativo BROMETO DE ETIDIO IODETO PROPIDIO (Vermelho 603 nm) - - - early - Annexine-FITC + PI - - normal late - Citometria de Fluxo Espalhamento (Forma, Granulos) size Fluorescence Verde (FITC) Fluorescence Vermelho (PI) Dados Típicos Side scatter Espalhamento lateral Side scatter Forward scatter Espalhamento frontal Forward scatter Early apoptotic 100 Viable 101 FL3-Height 102 ? Late apoptotic Necrotic 103 PI 104 PI vs. Annexin-FITC) 100 101 102 FL1-Height 103 104 Annexine-FITC Ciclo celular + corantes Propidium iodide = DNA BRdU = Sintese DNA M G1 G2 S=DNA synthesis M=cell divides G = gap Apoptose S Losing DNA G1 G2/M O Green Green O S S G1 G2/M Red fluorescence Red fluorescence Lower dilution rate Higher death Higher dilution rate Lower death CASPASE -3 WESTERN BLOT OU IMMUNOBLOT FRAGMENTAÇÃO DNA MÉTODOS DE AVALIAÇÃO Células Caco-2 DA BIODISPONIBILIDADE “IN VITRO” DE NANOPARTÍCULAS Basolateral medium insert culture dish apical medium Caco-2 cell monolayer Permeação aparente (Papp) 200.000 células/mL Matriz extracelular Célula Caco-2 Meio E-MEM 10% SFB Baso Lateral Porção apical Incubação 14 – 28 dias 37oC/5%CO2 Tempos 0 – 24 horas Intervalo 2h TEER 350 *cm2 CLASSIFICAÇÃO BIOFARMACÊUTICA Solubilidade e Permeabilidade são os parâmetros chaves que controlam a absorção de fármacos (AMIDON, 1995) Classe I: Fármacos de alta solubilidade e alta permeabilidade; Classe II: Fármacos de baixa solubilidade e alta permeabilidade; Classe III: Fármacos de alta solubilidade e baixa permeabilidade; Classe IV: Fármacos de baixa solubilidade e baixa permeabilidade Manitol > 300 cm2 < 300 cm2 TEER: Resistência Elétrica Transepitelial Apical enterocito Basal APICAL * enterocito CYP3A4 BASAL APICAL enterocito * X CYP3A4 BASAL APICAL enterocito * BASAL APICAL Pgp OAT P enterocito CYP3A4 BASAL BIODISPONIBILIDADE Conc. Basal tg TEMPO (h) Classificação do fármaco segundo o Sistema de Classificação Biofarmacêutico. Papp Razão dose/solubilidade 1 Altamente solúveis e altamente permeáveis > 10-5 < ou = 0,5 2 Baixa solubilidade e alta permeabilidade > 10-5 > 0,5 3 Alta solubilidade e baixa permeabiliade < 2 x 10-6 < ou = 0,5 4 baixa solubilidade e baixa permeabilidade < 2 x 10-6 >1 Classe • Papp > 10-6 cm/s: 100% absorvido • 10-7 < Papp < 10-6 cm/s: 1 – 99% absorção • Papp < 10-7 cm/s: < 1 % absorção Bioequivalência: • Alta permeabilidade Papp > 10-5 cm/s • Baixa permeabilidade Papp < 10-5 cm/s TESTES PRÉ-CLÍNICOS: TESTES TOXICOLÓGICOS “IN VIVO” 4. MUTAGÊNESE (GENOTOXICIDADE) E CARCINOGÊNESE Acridinas = intercalantes Levam a mudança de fase de leitura Dímero de pirimidina Lesão mais comum do UV curto (fotoliase) Nem sempre a droga é mutagênica Aflatoxina do fungo do amendoim é ativada perto do núcleo Reparo de erros de pareamento “Mismatch repair” Expansão de repetições Huntintina expande de 6-31 rep. para 36-82 Teste de AMES 10 bilhões de Salmonella hisUma reversão de mutação torna-as his+ GENOTOXICIDADE Lavar com PBS gelado Remoção das epífises Camundongo Fêmur 1) Contagem câmara de Neubauer 2) Viabilidade 85% 3) 1.000.000 cel/mL Lâminas Jateadas Agarose 1% Agarose Low melting 0,75% Incubar 1h 37C/5%CO2 Controles DMSO MMS ou H2O2 Tampão de lise Tampão de corrida 25 V 300 mA 30 min Tampão de Neutralização Brometo de etídeo DMSO: Núcleo íntegro (controle NEGATIVO de Genotoxicidade) MMS: Fragmentação nuclear (controle POSITIVO de Genotoxicidade) Método de classificação de Kobayashi et al. (1995); Miyamae et al. (1998) 1)sem cauda 2) cometas com pequenas caudas (caudas com comprimento < 25% da cabeça) 3) Cometas com caudas de tamanho médio (caudas com comprimento entre 25% e 100% da cabeça) 4) Cometas com caudas longas (comprimento da cauda > que a cabeça) 5) Cometas mal definidos ou com cabeça pequena.
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