UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
CURSO DE FARMÁCIA
AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA
DE NANOPARTÍCULAS
Prof. Rilton Alves de Freitas
Centro e Ciência da Saúde, Universidade do
Vale do Itajai, Itajai-S.C., Brasil
Aula curso Second Brazilian School on Nanobiotechnology-Itajai-S.C.
4-10 de Novembro 2007 (rede de nanobiotecnologia-NANOBIOTEC
ASPECTOS GERAIS DE
NANOPARTÍCULAS
• Fatores de toxicidade de nanopartículas (Nighswonger, 1999;
Oberdörster et al., 2005; Smart et al. 2005)::
- Como citado anteriormente a razão área superficial pela massa, pois
uma grande área superficial gera partículas com uma maior área de
contato com membranas células, assim como uma grande capacidade
de absorção e transporte de substâncias tóxicas.
- O Tempo de retenção da partícula, pois quanto maior o tempo de
contato da mesma com a membrana celular, maior a chance de dano.
Este fator incorpora o conceito de mobilidade de partícula, ou pelo
clearance ou migração para tecidos adjacentes.
- Reatividade ou toxicidade inerente do composto químico contido com a
partícula.
ASPECTOS GERAIS DE
NANOFIBRAS
•
Tamanho da fibra x respirabilidade (capacidade de penetrar na região
centro-acinar do pulmão).
–
Fibras com comprimento maior que 15 um apenas são respiráveis se
apresentam uma espessura menor que 5 um.
– Fibras longas (>17 um) tornam difícil a fagocitose por macrófagos,
promovendo uma resposta crônica que contribui para a fibrose pulmonar.
– Fibras curtas, menores que 7 um, são por outro lado facilmente
fagocidadas, e removidas por macrófagos alveolares (DONALDSON e
TRAN, 2004; YE et al., 1999; DONALDSON et al., 1992).
•
A Biopersistência: partículas longas são dificilmente fagocitadas por
macrófagos.
– Fibras biosolúveis são capazes de se difundir reduzindo e serem
fagocitadas mas facilmente, gerando uma baixa biopersistência e
reduzindo assim a toxicidade de fibras longas longas (maiores que 20 um).
•
Reatividade ou toxicidade inerente, dependendo basicamente dos
componentes químicos da nanopartículas.
REGULAMENTAÇÃO DA
NANOTOXICOLOGIA
• AVALIAÇÃO COMPLETA DO RISCO DE
PRODUÇÃO DE NANOPARTÍCULAS
(Friedrichs, Schulte, 2007)
– Identificação do risco
– Caracterização do risco
– Avaliação do risco
– Prevenção e controle o risco
– Avaliação das medidas de controle do
Obs:. Royal Society and the Royal Academy of Engineering of UK government,
Recommend nanoparticulate materials to be treated as new substances.
Tempo para desenvolver um medicamento
5.0000 a 10.000
selecionados
Invenção e desenvolvimento
Testes pré-clínicos (testes
laboratoriais em animais)
Fase II – 100 a 300 voluntários
para determinar eficácia e efeitos
colaterais
Fase I – 20 a 80 voluntários saudáveis
para determinar segurança e dosagem 250 entram em
teste pré-clínico
Fase III – 1.000 a 20.000 pacientes
voluntários para monitorar reações
adversas em uso de longa duração
5 entram
em testes
Aprovação do Governo
Fase IV – Teste adicional pós-comercialização
Anos
0
Patente
clínicos
2
4
Patente
solicitada concedida
6
8
10
12
14
15
Apenas 1 chega ao
mercado
Avaliação toxicológica – Estudos Pré- clínicos
Estudos Agudos
•
•
•
•
•
•
DL50 Oral
DL50 Dérmica
CL50 Inalatória
Irritação / Corrosão Ocular
Irritação / Corrosão Dérmica
Sensibilização Cutânea
Avaliação de perigo
Classificação toxicológica
Avaliação toxicológica
Estudos sobre mutagenicidade
• Mutação gênica (procariontes)
• Mutação cromossômica (eucariontes)
Proibição do
Registro
Estudos sobre carcinogenicidade
• Camundongo (18 meses)
• Rato (24 meses)
Estudos sobre teratogenicidade
• Coelho
• Rato
Avaliação toxicológica
Estudos de curto prazo
• Roedor (90 dias)
• Não roedor (1 ano)
Estudos de longo prazo e carcino
• Camundongo (18 meses)
• Rato (24 meses)
Estudos de neurotoxicidade
Estudos de reprodução e prole
Estudos dos efeitos teratogênicos
NOAEL
Definições importantes
Ingestão Diária Aceitável (IDA)
- quantidade máxima que,
ingerida diariamente durante
toda a vida, parece não
oferecer risco apreciável à
saúde, à luz dos
conhecimentos atuais
Avaliação toxicológica
Dose 3X
Dose 2X
Dose X
Controle
NOAEL
Avaliação toxicológica
NOAEL
IDA = NOAEL
Fator de incerteza
Fatores de incerteza
TESTES PRÉ-CLÍNICOS:
MÉTODOS TOXICOLOGICOS “IN
VITRO”
Azul de tripan
QUANTIFICAÇÃO DE CRESCIMENTO
MTT
(3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)
http://www.ib.amwaw.edu.pl/home/dslado/video/mtt.html
Alaranjado de Acridina
Apoptosis
Necrosis
AO stains DNA
Small intense spots
Diffuse spots
Processos necróticos:
Lactato desidrogenase
NAD+
LACTATO
NADH
PIRUVATO
QUANTIFICAÇÃO APOPTOSE
• Processos terminais
– Nucleases: Fragmentação do DNA
– Morfologia (nuclear)
• Processos iniciais
– Fosfatidilserina
– Caspases
BROMETO DE ETIDIO
DAPI
ALARANJADO DE ACRIDINA
TUNEL/IODETO PROPIDIO
• Células saudáveis
– Membrana polarizada
– Sistema de transporte ativo
DAPI
(Azul 460 nm)
• Células vitais
– Membrana polarizada
– Sem sistema de transporte ativo
BROMETO DE ETIDIO
(Vermelho 602 nm)
• Células intactas
– Membrana despolarizada
– Sem sistema de transporte ativo
BROMETO DE ETIDIO
(Vermelho 602 nm)
• Células mortas
– Membrana despolarizada
– Sem sistema de transporte ativo
BROMETO DE ETIDIO
IODETO PROPIDIO
(Vermelho 603 nm)
-
-
-
early
-
Annexine-FITC
+ PI
-
-
normal
late
-
Citometria de Fluxo
Espalhamento (Forma, Granulos)
size
Fluorescence Verde (FITC)
Fluorescence Vermelho (PI)
Dados Típicos
Side scatter
Espalhamento lateral
Side scatter
Forward scatter
Espalhamento frontal
Forward scatter
Early apoptotic
100
Viable
101
FL3-Height
102
?
Late apoptotic
Necrotic
103
PI
104
PI vs. Annexin-FITC)
100
101
102
FL1-Height
103
104
Annexine-FITC
Ciclo celular + corantes
Propidium iodide = DNA
BRdU = Sintese DNA
M G1
G2
S=DNA synthesis
M=cell divides
G = gap
Apoptose
S
Losing
DNA
G1 G2/M
O
Green
Green
O
S
S
G1
G2/M
Red fluorescence
Red fluorescence
Lower dilution rate
Higher death
Higher dilution rate
Lower death
CASPASE -3
WESTERN BLOT OU IMMUNOBLOT
FRAGMENTAÇÃO DNA
MÉTODOS
DE AVALIAÇÃO
Células
Caco-2 DA
BIODISPONIBILIDADE “IN VITRO” DE
NANOPARTÍCULAS
Basolateral medium
insert
culture dish
apical medium
Caco-2 cell
monolayer
Permeação aparente (Papp)
200.000 células/mL
Matriz
extracelular
Célula Caco-2
Meio E-MEM
10% SFB
Baso
Lateral
Porção
apical
Incubação
14 – 28 dias
37oC/5%CO2
Tempos
0 – 24 horas
Intervalo 2h
TEER 350 *cm2
CLASSIFICAÇÃO BIOFARMACÊUTICA
Solubilidade e Permeabilidade são os parâmetros chaves
que controlam a absorção de fármacos (AMIDON, 1995)
Classe I: Fármacos de alta solubilidade e alta permeabilidade;
Classe II: Fármacos de baixa solubilidade e alta
permeabilidade;
Classe III: Fármacos de alta solubilidade e baixa
permeabilidade;
Classe IV: Fármacos de baixa solubilidade e baixa
permeabilidade
Manitol
> 300 cm2
< 300 cm2
TEER: Resistência Elétrica Transepitelial
Apical
enterocito
Basal
APICAL
*
enterocito
CYP3A4
BASAL
APICAL
enterocito
*
X
CYP3A4
BASAL
APICAL
enterocito
*
BASAL
APICAL
Pgp
OAT
P
enterocito
CYP3A4
BASAL
BIODISPONIBILIDADE
Conc.
Basal
tg
TEMPO (h)
Classificação do fármaco segundo o Sistema de Classificação Biofarmacêutico.
Papp
Razão
dose/solubilidade
1 Altamente solúveis e altamente
permeáveis
> 10-5
< ou = 0,5
2 Baixa solubilidade e alta
permeabilidade
> 10-5
> 0,5
3 Alta solubilidade e baixa
permeabiliade
< 2 x 10-6
< ou = 0,5
4 baixa solubilidade e baixa
permeabilidade
< 2 x 10-6
>1
Classe
• Papp > 10-6 cm/s: 100% absorvido
• 10-7 < Papp < 10-6 cm/s: 1 – 99% absorção
• Papp < 10-7 cm/s: < 1 % absorção
Bioequivalência:
• Alta permeabilidade Papp > 10-5 cm/s
• Baixa permeabilidade Papp < 10-5 cm/s
TESTES PRÉ-CLÍNICOS: TESTES
TOXICOLÓGICOS “IN VIVO”
4. MUTAGÊNESE (GENOTOXICIDADE) E CARCINOGÊNESE
Acridinas = intercalantes
Levam a mudança de fase de leitura
Dímero de pirimidina
Lesão mais comum do UV curto
(fotoliase)
Nem sempre a droga é mutagênica
Aflatoxina do fungo do amendoim
é ativada perto do núcleo
Reparo de erros de pareamento
“Mismatch repair”
Expansão de repetições
Huntintina expande de 6-31 rep.
para 36-82
Teste de AMES
10 bilhões de Salmonella hisUma reversão de mutação torna-as his+
GENOTOXICIDADE
Lavar com PBS gelado
Remoção das
epífises
Camundongo
Fêmur
1) Contagem
câmara de Neubauer
2) Viabilidade 85%
3) 1.000.000 cel/mL
Lâminas Jateadas
Agarose
1%
Agarose
Low melting
0,75%
Incubar 1h 37C/5%CO2
Controles
DMSO
MMS ou H2O2
Tampão de lise
Tampão de corrida
25 V
300 mA
30 min
Tampão de Neutralização
Brometo de etídeo
DMSO: Núcleo íntegro (controle NEGATIVO de Genotoxicidade)
MMS: Fragmentação nuclear (controle POSITIVO de Genotoxicidade)
Método de classificação de Kobayashi et al. (1995); Miyamae et al. (1998)
1)sem cauda
2) cometas com pequenas caudas (caudas com comprimento < 25% da cabeça)
3) Cometas com caudas de tamanho médio (caudas com comprimento entre 25% e 100% da cabeça)
4) Cometas com caudas longas (comprimento da cauda > que a cabeça)
5) Cometas mal definidos ou com cabeça pequena.