Métodos In Vitro para Avaliação da
Permeabilidade de Fármacos
Sílvia Storpirtis
Professora Associada
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
Universidade de São Paulo
07.10.2013
Fármaco:
Solubilidade, Permeabilidade e Absorção
Forma Farmacêutica:
Absorção Oral de Fármacos*
absorção do fármaco
transporte através
de membranas
Liberação e
dissolução
do
fármaco
Solubilidade
em água
intestino
delgado
intestino
grosso
Permeabilidade
intestinal
*Adaptado de Amidon, G. – Dissolution in vitro and ex-vivo: implicatios for BE standards.
Como Avaliar os Parâmetros da Absorção?
Como Determinar a Biodisponibilidade?
Como Avaliar a Influência da Formulação
sobre a Biodisponibilidade?
Ensaios In Vivo em Humanos - “Padrão Ouro”
Ética em Pesquisa com Seres Humanos:
Realizar Ensaios In Vivo somente quando
não há um Ensaio In Vitro que possa ser
empregado satisfatoriamente
Alternativa:
Métodos In Vitro
(Correlação com os
Métodos In Vivo)
Como Selecionar um
Método In Vitro?
Mecanismos de
Transporte
Como ocorre a
absorção?
efluxo
influxo
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
Passivo Transcelular
Transportadores de Membrana (Influxo)
Passivo Paracelular
Transportadores de Efluxo
Enzimas Metabolizadoras - Eliminação Pré-sistêmica
(BALIMANE et al., 2005, modificado).
Sistema de Classificação Biofarmacêutica
(SCB)
Solubilidade
Classe I:
Classe II:
 Solubilidade
 Solubilidade
 Permeabilidade
 Permeabilidade
Classe III:
Classe IV:
 Solubilidade
 Solubilidade
 Permeabilidade
 Permeabilidade
Amidon et al., 1995
Modelos para Avaliação da Permeabilidade
Intestinal de Fármacos

Físico-Químicos

In Situ

In Silico

In Vitro
 Limitações
 Vantagens
 Desvantagens
Métodos Físico-Químicos
Consistem em prever a absorção de fármacos a partir de
suas propriedades físico-químicas.
Em geral, a permeabilidade dos fármacos é o principal
fator para determinar sua absorção intestinal por
transporte passivo.






Peso molecular
pKa
Lipofilicidade
Carga / Ionização
Solubilidade
Tamanho ou porção molecular
Métodos In Situ
BONLOKKE, L.; HOVGAARD, L.; KRISTENSEN, H.G.; KNUSTON, L.; LENNERNÄS, H.
Direct estimation of the in vivo dissolution of spironolactone, in two particle size ranges,
using the single-pass difusion technique (Loc-I-Gut®) in humans.
European Journal of Pharmaceutics, v.12, p.239-250, 2.001.
Métodos In Situ
Frog intestinal sac: a new in vitro method for the
assessment of intestinal permeability.
Trapani G. et al.
Dipartimento Farmaco-Chimico
Facoltà di Farmacia,
Università degli Studi di Bari, Italy.
J Pharm Sci. 2004 Dec;93(12):2909-19.
The aim of this study was to evaluate a new experimental
protocol utilizing isolated frog intestinal sacs for the assessment
of intestinal drug permeability in humans.
Segments of approximately 5.0 cm in length were used for these
experiments.
Métodos In Silico
Métodos computacionais usados para
prever a permeabilidade da membrana aos
compostos.
Baseiam-se em:





Lipofilicidade do composto
Capacidade de formar ligações de hidrogênio
Tamanho molecular
Área superficial polar
Propriedades quânticas
Métodos In Vitro
Membranas artificiais
PAMPA
Tecido animal
Intestino “invertido”
Segmentos intestinais
Vesículas isoladas de membranas
Cultivos celulares
Caco-2 (adenocarcinoma de cólon
MDCK (células de rim canino)
humano)
PAMPA - Parallel Artificial Membrane Permeability Assay
Membrana sintética formada por fosfolipídios
depositados em um suporte poroso.
Simula a composição da membrana celular.
Previsão da permeabilidade transcelular passiva.
Técnica rápida e de baixo custo.
Células Caco-2
São células de adenocarcinoma de cólon humano.
Cultivadas em filtros permeáveis e porosos se
diferenciam espontaneamente em enterócitos.
Monocamada celular com microvilosidades, sistemas de
transportes ativos e passivos, sistemas enzimáticos.
Possibilitam a avaliação das diferentes vias de
absorção (paracelular e transcelular).
Limitações ao Emprego de Células Caco-2
• Variação do número de transportadores.
• A baixa permeabilidade de compostos
hidrofílicos com baixo peso molecular.
• A presença de co-solventes (metanol, etanol,
propilenoglicol e polietilenoglicol).
• A aderência física de fármacos de alta
lipossolubilidade aos materiais do suporte de
cultivo celular.
• Tempo de crescimento das células Caco-2.
• Variabilidade entre diferentes laboratórios levam
à necessidade de padronização da técnica.
• Variabilidade dependente das condições de
cultivo.
Cultivo de Células Caco-2 - Laboratório de
Estudos de Permeabilidade de Fármacos
Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP
São Paulo, Brasil
Manutenção do cultivo de células
em condições assépticas
Utensílios estéreis, apirogênicos:
Filtros esterilizantes, pipetas ,
garrafas de cultivo (descartáveis)
Manutenção do Banco Celular
Cultivo em garrafas 75cm2
Meio DMEM suplementado com
10% soro fetal bovino + 1% a.a.
não essenciais + 1% glutamina
+ penicilina/estreptomicina
Mantidas em incubadora de CO2
37º C
5% CO2
90% Umidade Relativa
Acompanhamento do Crescimento Celular
Células em
garrafa
de cultivo
Cultivo celular atinge
mais que 90% de
cobertura da área da
garrafa
Necessidade de
repique
( 3 a 4 dias)
Microscópio invertido
Repique
Cultura em garrafa
com, no mínimo, 90%
cobertura da área de
crescimento
Solução de
Tripsina/EDTA
Células em
suspensão
Diluição
1:4
Experimento de Permeabilidade com Células
Caco-2
Placas Transwell® - suporte permeável de policarbonato, polietileno,
polietilenoftalato, policarbonato revestido com colágeno.
Placas com 6, 12, 24 ou 96 poços.
Contagem celular para transferência às
placas Transwell®
Suspensão celular (10uL) + Triptan Blue
(10uL)
Células em
suspensão
Solução de
Tripsina/EDTA
Microscópio biológico
Determinação do número de células viáveis
Transferência de Células para Placas
Suspensão celular
com número de
células viáveis
determinada
Transferência de
volume adequado
de suspensão
celular para poços
da placa
Densidade celular utilizada:
5 x 104 cél/cm2
Incubação do Cultivo em Placas do
Experimento de Permeabilidade
Placa contendo as células Caco-2
Meio DMEM suplementado com 10%
soro fetal bovino + 1% a.a. não
essenciais + 1% glutamina +
penicilina/estreptomicina
Mantidas em incubadora de CO2
37º C
5% CO2
90% Umidade Relativa
Tempo de cultivo: 21 dias
Manutenção do Cultivo nas Placas
Substituição do meio de cultivo a cada 48 horas
Após 21 dias de cultivo, as células estão
diferenciadas para realização do experimento
Avaliação da integridade da membrana por
meio da medida da resistência elétrica
transepitelial (RET)
Diferença do potencial elétrico entre
compartimentos apical e basolateral
Minivoltímetro Millicell ERS®
Coleta das amostras em tempos
determinados.
Agitador Orbital Termostatizado
Experimento realizado sob
agitação moderada 25 a 50 rpm a
37ºC
Experimento realizado em meio de
solução balanceada de Hanks.
Os valores do pH do meio variam
entre 5,0 a 7,4 ( faixa fisiológica)
Quantificação das Amostras Provenientes dos
Experimentos de Permeabilidade
HPLC - UV-Vis
HPLC - FL
HPLC - MS/MS
Células Caco-2
Cálculo do Coeficiente de Permeabilidade
aparente
Papp = (V/ A*. Co) (dC/dT)
V = Volume da câmara receptora
A = Área de tecido exposta
Co = Concentração inicial do fármaco na câmara
doadora
dC/dT = É a mudança da concentração do fármaco
na câmara receptora em função do tempo
Valores de Papp - Relação entre a
Permeabilidade e a Fração Absorvida
YEE, S. - In vitro Permeability Across Caco-2 Cells
(Colonic) Can Predict In Vivo (Small Intestinal)
Absorption in Man - Fact or Myth? Pharm. Res., v.
14, p. 763 – 766, 1.997.
Valor da
Permeabilidade
(x 10-6) cm/s
< 1
1 a 10
> 10
Magnitude da
Permeabilidade
Baixa
Intermediária
Alta
Fração
Absorvida
(%)
0 a 20
20 a 70
70 a 100
Empregos Potenciais - Células Caco-2
•
•
•
•
•
•
•
AVALIAÇÃO DE:
Permeabilidade e Citotoxidade de fármacos em
desenvolvimento.
Funções das células epiteliais do intestino.
Estratégias de formulações (dendrímeros,
nanoencapsulamento).
Efeito tóxico potencial de determinados
compostos.
Metabolismo de pré-sistêmico fármacos.
Possíveis interações entre fármacos no
processo de absorção.
Bioisenções.
www.fip.org
Monografías – Bioexenciones
Journal of Pharmaceutical Sciences
www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/jhome/68503813
Biowaiver Monographs for Immediate Release Solid
Oral Dosage Forms: Levofloxacin
MARCELLE O. KOEPPE, RODRIGO CRISTOFOLETTI, EDUARDO F.
FERNANDES, SILVIA STORPIRTIS, HANS E. JUNGINGER, SABINE
KOPP,4 KAMAL K. MIDHA, VINOD P. SHAH, SALOMON
STAVCHANSKY, JENNIFER B. DRESSMAN, DIRK M. BARENDS
American Pharmacists Association
J Pharm Sci 100:1628–1636, 2011
Keywords: levofloxacin; absorption; Biopharmaceutics
Classification System (BCS); permeability; regulatory science;
solubility
Absorption and BA
The pharmacokinetics of levofloxacin is well described
by a linear two-compartment open model with firstorder elimination.
Plasma concentrations in healthy volunteers reach a mean
peak drug plasma concentration (Cmax ) of approximately
2.8 and 5.2 mg/L within 1–2 h after oral administration of
levofloxacin 250 and 500 mg tablets, respectively.
The BA of oral levofloxacin is very rapid and approaches
100% and is little affected by administration with food.
Permeability
In Caco-2 cells the apical influx clearance value at pH 6
was much greater than the basolateral influx clearance
value, suggesting uptake across the apical membrane
in Caco-2 cells to be mediated by a specific transport
system.
A good correlation was found between the expression
levels of organic anion transporting polypeptide 1A2
(OATP 1A2) and levofloxacin influx clearance in Caco-2
cells.
The in vitro permeability of levofloxacin was evaluated
using a suitable Caco-2 assay according to the criteria
in the Biopharmaceutics Classification System (BCS)
Guidance.
Metoprolol, labetalol, and atenolol served as high
permeability and low permeability reference standards
and an apparent permeability coefficient (Papp )
of levofloxacin of 28.36 1.93 10−6 cm/s was reported.
In the same study, metoprolol, labetalol, and
atenolol showed Papp values of 29.88 3.17 10−6
cm/s, 18.05 1.90 10−6 cm/s, and 1.86 0.47 10−6
cm/s, respectively; hence, levofloxacin was classified as
highly permeable.
CONCLUSION
A biowaiver for IR solid oral dosage forms containing
levofloxacin is scientifically justified, provided that
(a) the test product contains only excipients present in IR
levofloxacin drug products approved in ICH or
associated countries in the same dosage form;
(b) both the test and comparator dosage form are very
rapidly dissolving or rapidly dissolving with similarity of
the dissolution profiles demonstrated at pH 1.2, 4.5, and
6.8; and
(c) if the test product contains polysorbates, it
should be both qualitatively and quantitatively identical
to its comparator in terms of polysorbate content.
CORRELAÇÕES IN VITRO - IN VIVO (CIVIV)
MOTZ, S.A. et al - Permeability assessment for solid
oral drug formulations based on Caco-2 monolayer in
combination with a flow through dissolution cell.
Eur. Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics,
v. 66, p. 286-295, 2007.
Desenvolvimento de um sistema integrado para avaliar
dissolução e permeabilidade visando à previsão do
desempenho in vivo de formas farmacêuticas.
Comprimidos de Cloridrato de Propanolol:
Liberação Imediata e Modificada (Extended release).
FTPC = Flow through permeation cell
D = Sampling port dissolution
AP = Sampling port apical
BL = Sampling port
basolateral
D
USP
Apparatus
4
BL
AP
STREAM
SPLITTER
FTPC
Dissolution module
Permeation module
• Observou-se relação linear entre a quantidade
permeada e as três diferentes dosagens de
propranolol avaliadas.
• O efeito da liberação retardada sobre a
permeabilidade foi detectado por meio dos
dados de dissolução e de permeabilidade
obtidos.
• Sistema promissor para avaliar a influência
da forma farmacêutica (formulação e processo)
sobre a permeabilidade.
ESTRATÉGIA DE FORMULAÇÕES
ABERTURA DAS
JUNÇÕES E PASSAGEM
DO FÁRMACO
STORPIRTIS, S.; GONÇALVES, J.E.; CHIANN, C.; GAI, M.N. Biofarmacotécnica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2009.
STORPIRTIS, S.; GAI, M.N.; CAMPOS, D.R.; GONÇALVES, J.E. Farmacocinética básica e aplicada. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2011. GONÇALVES, J.E.; STORPIRTIS, S. O Sistema de Classificação Biofarmacêutica: Conceitos,
Determinação da Solubilidade e Permeabilidade e Aplicações na Área Farmacêutica – In: VIEIRA e CAMPOS, Manual de
Bioequivalência – Série Pesquisa Clínica – Ed Dendrix, 2011, p. 137- 169.
AMIDON, G.L.; LENNERNAS, H.; SHAH, V.P.; CRISON, J.R. A theoretical basis for a biopharmaceutic drug classification: the
correlation of in vitro drug product dissolution and in vivo bioavailability, Pharm. Res., v.12, p. 413-420, 1995.
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Seção 1. [A Agência Nacional de Vigilância Sanitária aprova o guia de correlação para estudos in vitro – in vivo (CIVIV)].
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UPPOOR, V.R.S. Regulatory perspectives on in vitro (dissolution)/ in vivo (bioavailability) correlations. J. Controlled Release.
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YASIR, M.; ASIF, M; AMMEDUZAFAR; CHAUHAN, I; SINGH, A.P. In vitro- in vivo correlation: a review. Drug Intention Today. n.2,
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ZHAO, L.; LI, Y.; FANG, L.; HE, Z.; LIU, X.; WANG, L.; XU, Y.; REN, C. Transdermal delivery of tolterodine by O-acymenthol: in
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