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Métodos de estudo das proteínas
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Como estudar uma proteína?
1. Separá-la e purificá-la.
2. Determinar a sua massa molecular.
3. Determinar a sua composição e
sequência de aminoácidos.
4. Elucidar a sua estrutura tridimensional.
5. Caracterizá-la funcionalmente.
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1. SEPARAÇÃO DAS PROTEÍNAS
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- antes de mais, é necessário destruir a
estrutura do tecido que contém a proteína ou
proteínas a estudar
Métodos de disrupção
homogenizador
tipo Potter
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misturador
comercial
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RUPTURA DO TECIDO/CÉLULAS
CRIA ALGUNS PROBLEMAS:
libertação de ácidos
e outras substâncias
acumuladas nalguns
organelos
Solução
tampão
mantém pH
oxidações
(>O2,
oxidases)
Incluir
substâncias
antioxidantes
(ex.c/SH:DTT
ou cisteína)
desnaturação
libertação de proteica
proteases
(ex.dos
lisossomas)
realizar todo o
processo a baixa
temperatura (≈ 4ºC)
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6
3
PARA SEPARAR AS PROTEÍNAS
- Exploram-se diferenças em propriedades fisicoquímicas das proteínas, resultantes das
diferentes sequências primárias de aminoácidos:
1. Tamanho
2. Solubilidade
3. Carga
4. Afinidade de ligação
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Técnicas de separaç
separação e purificaç
purificação de
proteíínas:
prote
1. Diálise, ultrafiltração, centrifugação,
precipitação
2. Cromatografia de exclusão molecular
3.Cromatografia de troca iónica e de fase
reversa
4. Cromatografia de afinidade
5. Electroforese
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4
– Princí
Princípio: ≠ dimensão/forma molecular
Diálise
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Ultrafiltração
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Ultracentrifugação
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- gradientes de densidade
inicial
aumento
da
densidade
do meio
força centrífuga
final
partículas
menos densas
partículas de
densidade
intermédia
partículas
mais densas
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6
– Princí
Princípio: ≠ solubilidade (precipitaç
(precipitação)
A solubilidade das proteínas varia com:
- pH
- temperatura
- forç
força ió
iónica
- constante dielé
dieléctrica do solvente
Técnicas baseadas em diferenças de solubilidade:
1. Precipitação isoeléctrica (variação de pH)
2. ‘Salting in’ / ‘salting out’ (variação da força iónica)
3. Precipitação por solventes orgânicos
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Solubilidade
1. Precipitaç
Precipitação isoelé
isoeléctrica:
ctrica:
pI
pH
• em geral, a solubilidade é menor no pI
porque há menos interacç
interacções electrostá
electrostáticas
com o solvente
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7
Solubilidade
2. Precipitaç
Precipitação por soluç
soluções salinas:
Salting in
Salting out → depende de:
- hidrofobicidade da proteína
- força iónica do sal
- temperatura
- pH (se pH=pI ↓ solubilidade)
[sal]
• Salifica
Salificaçção (salting in): a solubilidade aumenta até certo
ponto, com o aumento da [sal]
Dessalificaçção (salting out): os sais, a concentração muito
• Dessalifica
elevada, retiram a H2O de hidratação da proteína ⇒ 15as
moléculas de proteína precipitam
-Exemplo: utilização do (NH4)2SO4
- Utiliza-se frequentemente o sulfato de amónio,
(NH4)2SO4 devido à sua grande solubilidade em água
- a precipitação com (NH4)2SO4 não desnatura as proteínas
- diferentes proteínas têm diferente solubilidade ⇒
precipitam a diferentes concentrações de (NH4)2SO4
ex: proteínas da clara de ovo
Proteí
Proteína
Precipita à [(NH4)2SO4 ] de:
de
ovomucina
50% da saturação
ovoglobulina
50% da saturação
ovalbumina
100% saturada
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3. Precipitaç
Precipitação por solventes orgânicos:
Ex. Etanol, acetona
Precipitaç
ção proteica por ↓ solubilidade
Precipita
Solvente orgânico: ↓ solvataç
solvatação e ↓ constante dielé
dieléctrica (D)
Sendo,
D=
F atracção entre 2 cargas no vazio
F atracção entre as cargas no meio
F=
q1 q2
D r2
Lei de Coulomb
Então,
Se ↓ D e ↑ F :
Agregação proteica Precipitação ↓ Solubilidade
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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS DE SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS
Diferentes tipos:
- exclusão molecular
- troca iónica
- afinidade
- fase reversa
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CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO MOLECULAR – volume/forma
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20
10
CROMATOGRAFIA DE TROCA IÓ
IÓNICA – carga
Trocadores aniónicos (+)
e catiónicos (-)
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CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE – selectividade de ligaç
ligação
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Material de partida (células)
- um esquema de
purificação
possível:
Disrupção celular
Centrifugação
Precipitação fraccionada
(Sais, polihydroxiálcoois)
Diálise (para eliminar os sais)
Cromatografia de troca iónica
Cromatografia de exclusão molecular
Cromatografia de afinidade
Proteína purificada
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2. DETERMINAÇÃO DA MASSA
MOLECULAR
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- métodos diversos, tais como:
Electroforese:
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Espectrometria de massa MALDIMALDI-TOF:
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Ultracentrifugaç
Ultracentrifugação em gradientes de densidade:
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3. DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO
E SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS
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DETERMINAÇ
DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇ
COMPOSIÇÃO DE AMINOÁ
AMINOÁCIDOS
DE UMA PROTEÍ
PROTEÍNA
Ex: determinação da composição de aminoácidos do fragmento
ala-gly-asp-phe-arg-gly
1º Hidrólise ácida (HCl 6N, 110ºC, 24 horas)
2º Reacção de ‘revelação’ dos aminoácidos
(ex., ninidrina, cloreto de dansilo)
3º
Separação
e
quantificação
aminoácidos (ex. cromatográfica)
dos
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Reagentes utilizados para “revelação” e quantificação dos aminoácidos:
Ninhidrina, 1-fluoro-2,4-dinitrobenzeno, fenilisotiocianato, cloreto de dansilo
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Separação e quantificação dos aminoácidos por
cromatografia (HPLC
HPLC - ‘High pressure liquid chromatography)
- Matriz de separação (tirando partido das diferentes
propriedades físicas de cada um dos aminoácidos)
- Eluente (variação controlada das condições do meio)
- Partição de cada aminoácido entre o meio e a matriz
(de acordo com as suas propriedades fisico-químicas,
ex carga, forma, hidrofobicidade)
- Detecção após a sua derivatização)
Fase reversa, eluição com eluente de baixa força
iónica em gradiente
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- resultado duma cromatografia de aminoá
aminoácidos:
Integrando os picos, determina-se a quantidade relativa
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cada aminoácido (mas não a sequência!!!)
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USO DA CROMATOGRAFIA DE AMINOÁ
AMINOÁCIDOS EM
DIAGNÓ
DIAGNÓSTICO CLÍ
CLÍNICO
- Recém-nascido – parto e peso (3 Kg) normais, alimentação com leite materno
- Ao 5º dia de vida – inicia recusa alimentar, vómitos, hipotonia, prostração
- Agravamento progressivo e internalização ao 7º dia – quadro clínico anterior +
hipoglicémia, gasometria normal e cetonúria (corpos cetónicos)
- Suspeita de sepsis (infecção generalizada). Tratamento com antibióticos, soro
glicosilado c/ iões e pausa alimentar
- Evolução, 9º dia – melhoria. Leite administrado por sonda nasogástrica
- 10-11º dia – agravamento (prostação, coma com apneia)
- Suspeita de doença metabólica, baseada em:
- período de intoxicação
- cetonúria (cetoácidos derivados de aminoácidos ?)
- ‘maple syrup urine disease’ (MSUD, urina com cheiro a caramelo)
Cromatografia de aminoácidos
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USO DA CROMATOGRAFIA DE AMINOÁ
AMINOÁCIDOS NO
DIAGNÓ
DIAGNÓSTICO CLÍ
CLÍNICO
NORMAL
LEUCINOSE
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18
USO DA CROMATOGRAFIA DE AMINOÁ
AMINOÁCIDOS NO
DIAGNÓ
DIAGNÓSTICO CLÍ
CLÍNICO
Cromatografia de aminoácidos aumento de leucina, isoleucina e valina
Cromatografia de ácidos orgânicos cetoácidos ramificados derivados de
leucina, isoleucina e valina
LEUCINOSE
(defeito da desidrogenase dos α-cetoácidos ramificados ou
α-cetovalerato desidrogenase)
Tratamento:
Soro com glucose, dieta com restrição proteica (< 1 g/Kg/dia) com mistura de
aminoácidos não-ramificados e diálise peritoneal ou hemodiálise
(com o objectivo de aumentar o anabolismo, reduzir o catabolismo e remover tóxicos)
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DETERMINAÇ
DETERMINAÇÃO DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁ
AMINOÁCIDOS
DE UMA PROTEÍ
PROTEÍNA +3HN-Ala-Thr-Gly-Ile-Asp-COO1- marca-se o resíduo N-terminal do péptido com feniltioisocianato(⊗):
⊗-Ala-Thr-Gly-Ile-Asp-COO2- hidrolisa-se o aminoácido N-terminal marcado, em
condições suaves
⇒ fica ⊗-Ala e +3HN-Thr-Gly-Ile-Asp-COO3- identifica-se cromatograficamente o resíduo N-terminal e
hidrolisado, ⊗-Ala
4- Repete-se o ciclo 1-3 até à total determinação da
sequência.
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19
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DEGRADAÇ
DEGRADAÇÃO DE EDMAN – Derivatizaç
Derivatização com fenilisotiocianato
SEQUENCIAÇ
SEQUENCIAÇÃO DE PÉ
PÉPTIDOS ‘PEQUENOS’
PEQUENOS’
. Marcaç
Marcação do AA NNterminal
. Hidró
Hidrólise do AA
‘marcado’
marcado’
. Identificaç
Identificação do AA
‘marcado’
marcado’
. Iní
Início de um novo ciclo
de marcaç
marcação, hidró
hidrólise
e identificaç
identificação do AA
N-terminal seguinte
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20
DEGRADAÇ
DEGRADAÇÃO DE EDMAN
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SEQUENCIAÇ
SEQUENCIAÇÃO DE PÉ
PÉPTIDOS ‘LONGOS’
LONGOS’ – CLIVAGEM ENZIMÁ
ENZIMÁTICA
Tripsina
Quimotripsina
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ESTRATÉGIA
TRADICIONAL DE
SEQUENCIAÇÃO
DE PÉPTIDOS
‘LONGOS’
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4. ELUCIDAÇÃO DA ESTRUTURA 3D
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DETERMINAÇ
DETERMINAÇÃO DA ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DE PROTEÍ
PROTEÍNAS
DIFRACÇ
Ç
ÃO
DE
RAIOS
X
DIFRAC
Necessidade de
cristalização de
alguns grupos
‘invisiveis’
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DETERMINAÇ
DETERMINAÇÃO DA ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DE PROTEÍ
PROTEÍNAS
RESONÂNCIA MAGNÉ
MAGNÉTICA NUCLEAR
Espectros essencialmente
para pequenas proteí
proteínas
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