UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA Avaliação de diferentes células apresentadoras de antígeno em vacinas de DNA – Papel da célula B nesse modelo Luciana Previato de Almeida Ribeirão Preto 2008 LUCIANA PREVIATO DE ALMEIDA Avaliação de diferentes células apresentadoras de antígeno em vacinas de DNA – Papel da célula B nesse modelo Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para a obtenção do título de Mestre em Ciências – Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada. Orientadora: Profa. Dra. Arlete A. M. Coelho-Castelo Ribeirão Preto 2008 Trabalho realizado no Laboratório de Imunoterapia Gênica, Departamento de Bioquímica e Imunologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, com auxílio financeiro da FAPESP (05/03087-3) AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO PARA FINS DE ESTUDO OU PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE. FICHA CATALOGRÁFICA Preparada pela Biblioteca Central do Campus Administrativo de Ribeirão Preto/USP Almeida, Luciana Previato Avaliação de diferentes células apresentadoras de antígeno em vacinas de DNA – Papel da célula B nesse modelo Analysis of different APC in DNA Vaccines and the main role of B cells in this vaccine model Ribeirão Preto, 2008 90 pp. 28cm Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP – Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada Orientadora: Prof. Dra. Arlete A. M. Coelho-Castelo 1. Vacina de DNA 2. Linfócitos B 3. Apresentação de antígeno Para podermos confiar em nossa intuição é preciso examiná-la através da razão. Luiz Alberto Py Dedico aos meus pais, pelo apoio em todos os momentos de minha vida e exemplos de dedicação. Obrigada! AGRADECIMENTOS À minha orientadora, Profa. Dra Arlete A. M. Coelho-Castelo, pela dedicação e pelo exemplo de pesquisadora e ser humano, além da intensa contribuição para minha formação científica e acadêmica; Aos Professores Dr. Célio Lopes Silva e Dra. Vânia Luiza D. Bonato Martins, pelo apoio científico e estrutural em diversas fases deste trabalho; Aos Professores Dr. Luis Carlos de Souza Ferreira (ICB-USP) e Dr. João Santana da Silva (FMRP-USP) pela atenção, sugestões e participação na banca de defesa desta dissertação; À Dra. Ana Paula Trombone pela atenção, apoio e amizade desde o primeiro momento; À Ana Flávia Gembre, Izaíra Tincani Brandão e Ana Paula Masson, pelo apoio técnico e amizade; Ao Valter Turato, pelo apoio indispensável na aquisição e análise dos dados de citometria de fluxo; Aos demais colegas de laboratório: Alan, Carolina, Isabela, José Eduardo, Júlio César, Renata, Ricardo, Thiago, William, Cássia, Carlos Rodrigo, Deison, Denise, Fábio, Giovanna, Juliana, Liliana, Luis Henrique, Marina, Marininha, Paola, Patrícia, Pryscilla, Rodrigo, Rogério, Rosiane, Rubens, Sheila e Wendy, pelo apoio e amizade; Às minhas amigas Ana, Lia, Léia e Paula, pela amizade duradoura e pelos momentos de descontração; Aos todos os docentes da área de pós-graduação em Imunologia Básica e Aplicada que, direta ou indiretamente, contribuíram para minha formação; Aos secretários Ana Cristine e Ronaldo pela competência e ajuda dispensada a todos; A todos os outros funcionários que contribuem para o bom funcionamento estrutural do departamento; À FAPESP, CNPq, FAEPA e Rede TB pelo apoio financeiro para a realização do projeto de pesquisa e à FAPESP pela concessão da bolsa de mestrado (processo 05/03087-3). ÍNDICE ABREVIATURAS...................................................................................................i RESUMO...............................................................................................................iii ABSTRACT............................................................................................................v 1 – INTRODUÇÃO............................................................................................ 1 1.1 – Vacinas de DNA ........................................................................................ 1 1.2 – Apresentação de antígenos em vacinas de DNA....................................... 7 1.3 – Participação dos linfócitos B na apresentação antigênica ..................... 10 2 – OBJETIVOS .............................................................................................. 14 3 - MATERIAL E MÉTODOS........................................................................ 15 3.1 – Animais.................................................................................................... 15 3.2 – Extração e purificação da vacina pcDNA3-HSP65 ................................ 15 3.3 - Quantificação e avaliação da integridade dos plasmídeos purificados .. 16 3.4 – Análise da pureza da vacina gênica........................................................ 17 3.5 – Obtenção da proteína HSP65 recombinante .......................................... 19 3.6 – Imunizações ............................................................................................. 20 3.7 – Separação dos linfócitos T CD4 e T CD8 ............................................... 20 3.8 – Obtenção de células apresentadoras de antígeno................................... 21 3.8.1 – Obtenção de células dendríticas provenientes de baço......................... 21 3.8.2 – Obtenção de macrófagos peritoniais e linfócitos B.............................. 22 3.9 – Ensaios de apresentação de antígenos .................................................... 23 3.9.1 – Eletroporação das células apresentadoras de antígeno......................... 23 3.9.2 – Ensaio de linfoproliferação por CFSE................................................. 23 3.10 – Determinação do perfil de citocinas por Reação em cadeia da polimerase em tempo real (“Real-time PCR”)................................................ 24 3.10.1 – Co-cultura de células apresentadoras de antígeno e linfócitos T ........ 24 3.10.2 – Extração de RNA total...................................................................... 24 3.10.3 – Obtenção do DNA complementar (cDNA) ....................................... 25 3.10.4 – Reação em cadeia da polimerase em tempo real (“Real-time PCR”).. 25 3.11 – Imunização de animais deficientes de linfócitos B com células eletroporadas com pcDNA3-HSP65 ................................................................ 26 3.11.1 – Transferência adotiva de linfócitos B eletroporados .......................... 26 3.11.2 – Imunofenotipagem das células do baço............................................. 27 3.11.3 – Preparo do inóculo de Mycobacterium tuberculosis .......................... 28 3.11.4 – Desafio com Mycobacterium tuberculosis ........................................ 29 3.11.5 – Coleta, digestão e obtenção de células do pulmão ............................. 30 3.11.6 – Obtenção do lisado de M. tuberculosis.............................................. 31 3.11.7 – Ensaio imunoenzimático (ELISA) para a dosagem de citocinas no lisado pulmonar após transferência adotiva e desafio com M. tuberculosis. .... 31 3.11.8 – Ensaio imunoenzimático para a dosagem de Fator de Necrose Tumoral-alfa (TNF- ) no sobrenadante do lisado pulmonar ........................... 33 3.11.9 – Determinação do número de unidades formadoras de colônia (UFC) de M. tuberculosis .............................................................................................. 33 3.11.10 – Análise histológica ......................................................................... 34 3.12 – Análise estatística .................................................................................. 34 4 - RESULTADOS ........................................................................................... 35 4.1 – Avaliação do perfil dos linfócitos T induzidos pelas diferentes APCs, após vacinação com DNA plasmideal.............................................................. 35 4.2 – Ensaios de apresentação de antígenos por células eletroporadas.......... 35 4.3 – Análise do perfil de citocinas induzido nas células T CD4 e T CD8 frente a diferentes APCs............................................................................................. 39 4.4 – Ensaios de transferência celular para animais deficientes de linfócitos B........................................................................................................................ 42 4.4.1 – Imunofenotipagem de células de memória .......................................... 42 4.4.2 – Proteção contra infecção experimental por M. tuberculosis................. 45 5 - DISCUSSÃO ............................................................................................... 53 6 - CONCLUSÕES........................................................................................... 65 7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................... 66 ABREVIATURAS - AIDS: Acquired Immunodeficiency Syndrome – Síndrome da Imunodeficiência Adquirida - APC: célula apresentadora de antígeno - BKO: camundongo deficiente de linfócitos B - Breg: célula B reguladora - CFSE: carboxifluoresceína diacetato succinimidil éster - CpG: dinucleotídeos citosina guanina - DMT: dimicolato de trealose - DNA: ácido desoxirribonucléico - ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay - ensaio imunoenzimático - GM-CSF: fator estimulador de colônias de granulócitos e monócitos - HSP65: proteína de choque térmico de 65 kDa de Mycobacterium leprae - IFN- : interferon gama - IL: interleucina - MHC: complexo de histocompatibilidade principal - MyD88: myeloid differentiation primary respose gene 88 - PBS: solução fosfato tamponada - pcDNA3: DNA plasmideal utilizado como vetor da vacina de DNA -pcDNA3-HSP65: DNA plasmideal contendo o gene da HSP65 utilizado como vacina de DNA - PCR: reação em cadeia da polimerase - PLGA: co-polímero derivado dos ácidos lático e glicólico i - RNA: ácido ribonucléico - SBF: soro bovino fetal - TGF- : fator transformador de crescimento beta - Th: resposta imune de linfócito T "helper" (auxiliar) - TNF- : fator de necrose tumoral alfa - TLR9: receptor tipo Toll 9 - Treg: célula T reguladora - UFC: unidades formadoras de colônia ii RESUMO Embora as células B sejam importantes células apresentadoras de antígeno, ainda é desconhecido seu papel em modelo de vacinação com DNA. Nesse trabalho foi demonstrado que células B podem atuar como apresentadoras de antígenos in vitro e in vivo após a vacinação com DNA, usando como modelo o plasmídeo pcDNA3-hsp65. Após a imunização intramuscular, a ativação das subpopulações de linfócitos T CD4 e T CD8 com perfil de Th1, Th2 ou regulatória apresentaram uma cinética que está relacionada ao tempo após o final do processo de vacinação e também com a APC em questão. Desse modo quinze dias após o termino da vacinação as principais APCs são células dendríticas e linfócitos B. As células dendríticas ativaram linfócitos TCD4 FoxP3+ enquanto os linfócitos B ativaram ambas populações com perfil diferente T CD8 GATA3+ e TCD4 FoxP3+. Trinta dias após, as principais células apresentadoras são macrófagos que induzem uma população de linfócitos TCD4 FoxP3+ , enquanto os linfócitos B ativam TCD8 que expressam t-bet. Para verificar a importância das células B nesse modelo, realizou-se a transferência adotiva de linfócitos B eletroporados com o plasmídeo ou vetor para animais deficientes ou não de células B. A transferência dos linfócitos B eletroporados com plasmideo HSP65 induziu a ativação de linfócitos T CD8 de memória com fenótipo CD44hi CD62hi. Esses animais mostraram uma redução no número de UFC após o desafio com M. tuberculosis quando comparados as selvagens, sugerindo a importância dessas células na indução de células T CD8 e o clearance da bactéria. Por outro lado, a análise histológica do pulmão desse grupo de animais mostrou intenso infiltrado iii inflamatório em relação aos demais grupos. Como o processo de obtenção de células B a serem transferidas exclui o pool de células B com atividade regulatória. Esse dado nos permite inferir que o resultado observado foi devido a ausência das células B regulatórias que, se presentes, apresentariam papel imunomodulador no controle dos linfócitos B. Assim, embora as células B sejam importantes para indução de proteção após vacinação com DNA plasmideal, também necessitam de controle, para evitar resposta imune exacerbada. Os dados sobre a cinética de ativação de linfócitos T após a vacinação intramuscular são inéditos e, em conjunto, abrem perspectivas para diferentes intervenções vacinais. iv ABSTRACT Analysis of different APC in DNA Vaccines and the main role of B cells in this vaccine model Although B cells are important as antigen presenting cells (APC), their role in DNA vaccination models is unknown. In the current study, we demonstrated that B cells can present antigens in vitro and in vivo after DNA vaccination with pcDNA3 constructed with 65 kDa-heat shock protein gene from M. leprae (pcDNA3-HSP65). After intramuscular immunization, different APC such as dendritic cells (DC), B cells, and macrophages was cocultured with CD4 and CD8 T lymphocytes subsets from immunized mice to determine their ability in antigen presentation. Fifteen days after DNA immunization, DC and B cells, but not macrophages, induced activation of T cells. DC activated mainly CD4 regulatory T cells (Treg, FoxP3+), whereas B cells activated both CD4 T helper (Th) 2 cells (GATA3+) and CD8 Treg (FoxP3+). Thirty days after immunization, macrophages and B cells activated CD4 Treg and CD8 T (T-bet+) cells, respectively, whereas no cells was activated by dendritic cells. To evaluate if pcDNA3-HSP65-transfected B cells induced immune activation and memory, we carried out adoptive transfer of transfected B cells to B cell-deficient mice (Bko). Bko reconstituted with pcDNA3-hsp65-transfected B cells produced memory CD8 T cells (CD44hi and CD62hi). Moreover, mice challenged with virulent Mycobacterium tuberculosis on day seven after adoptive transfer presented, on the day 30 postinfection, fewer number of colony-forming units (CFU) than WT mice, suggesting that B cells play important role in the induction of CD8 T cells v and bacterial clearance. On the other hand, histopathology analysis of reconstituted Bko mice showed more severe inflammation than control mice. Since the B cell isolation protocol eliminated B regulatory (Breg) cells, we hypothesized that Breg absence could increase the lung damage. Altogether, our data demonstrate that B cells can play a crucial role in the success of DNA vaccination and immunomodulation. vi 1 – INTRODUÇÃO 1.1 – Vacinas de DNA O campo da vacinologia, de modo geral, tem avançado muito nos últimos anos. As vacinas começaram a ser utilizadas como estratégia terapêutica e não apenas como profilaxia. Além disso, o desenvolvimento e as novas pesquisas buscam, além do controle de doenças infecciosas, intervenções contra câncer, uso como contraceptivos, entre outros. A busca de novas estratégias e adjuvantes também tem sido um alvo constante para obtenção de vacinas eficazes contra diversas patologias como malária, síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), leischimaniose, esquistossomose, etc. (Poland, Murray et al., 2002). Uma das estratégias mais recentes em vacinologia são as chamadas vacinas de DNA (ácido desoxiribonucleico). Embora o antígeno possa ser veiculado por vetores virais, classicamente o termo é adotado para se referir a antígenos veiculados por DNA plasmideal. Em geral, as vacinas de DNA são formadas quando um gene de interesse é clonado em um plasmídeo bacteriano engenheirado para expressá-lo de maneira eficiente em células eucarióticas. A expressão do antígeno in vivo age na ativação do sistema imune com o intuito de conferir proteção contra o antígeno em questão ou contra o parasita ao qual pertença. Para ser funcional, o plasmídeo deve conter uma origem de replicação bacteriana que permita seu crescimento em bactérias, um gene de resistência a antibióticos para seleção das bactérias transformadas, um 1 promotor de atuação forte para expressão em células de mamíferos - em geral os promotores virais são os escolhidos - e seqüências de poliadenilação para a estabilização dos RNA (ácido ribonucléico) mensageiros transcritos (Gurunathan, Klinman et al., 2000). A transferência de material genético para a expressão gênica in vivo data de 1950, quando Stasney e col injetaram cromatina de células tumorais em ratos e estes desenvolveram tumor (Stasney, Cantarow et al., 1950). Porém, foi só em 1990 que a expressão de DNA nu no local de injeção foi demonstrada pela primeira vez. Logo depois, foi demonstrada a produção da proteína codificada por material genético in vivo, após a injeção de microgramas de DNA ou RNAm (Wolff, Malone et al., 1990). O uso de DNA plasmideal como vacina pode ser considerado uma estratégia recente. A partir dos anos 90, com os trabalhos de Tang et al. (1992) Fynan et al. (1993) e Ulmer et al. (1993), essa estratégia ganhou evidência e credibilidade, desde que com o uso de genes repórteres esses pesquisadores demonstraram a expressão in vivo da proteína, com conseqüente indução da resposta imune humoral e celular. Essa estratégia foi demonstrada através da proteção contra o vírus influenza em camundongos utilizando-se uma vacina de DNA (Ulmer, Donnelly et al., 1993). Um dos mecanismos que chamou a atenção para esse tipo de imunização foi baseado no fato da vacinação com DNA plasmideal mimetizar o efeito de vacinas vivas atenuadas, pois gera antígenos endógenos, sem a necessidade de se introduzir um microorganismo atenuado e com menor custo de produção e armazenamento (Gurunathan, Klinman et al., 2000), além de poder ser utilizada em indivíduos imunocomprometidos (Huygen, 2 2005). Assim, estava consolidada a estratégia de vacinas de DNA visando a aplicação clínica. Na verdade, por fornecer apenas genes que codificam antígenos contra os quais a resposta imune é desejada, uma vacina de DNA pode induzir respostas imunes mais específicas e favorecer a construção de vacinas múltiplas contendo moduladores imunológicos como citocinas, quimiocinas etc. Outra manipulação bastante atraente é a construção com diferentes antígenos para diferentes patógenos, tornando-a uma vacina multifuncional (Srivastava, 2002). As vacinas gênicas veiculadas por vírus apresentam eficiência na primeira imunização, no entanto, a resposta imune gerada contra as proteínas do capsídeo viral, em geral, inviabiliza novos desafios ou booster (Gurunathan, Klinman et al., 2000). Do ponto de vista da resposta imune, as vacinas de DNA têm se mostrado um método eficiente para a geração de uma resposta imune humoral e celular protetora (Huygen, 1998), com estimulação de células T CD8+ citotóxicas (Silva, Silva et al., 1996) e células T CD4+ de padrão T ”helper” tipo 1 (Th1), ambas produtoras de interferon-gama (IFN- ) (Bonato, Lima et al., 1998). A vacina que utiliza a proteína de choque térmico de 65 kD de Mycobacterium leprae (HSP65), codificada pelo plasmídeo pcDNA3-HSP65, foi desenvolvida no atual Núcleo de Pesquisa em Tuberculose (NPT). Em modelos experimentais murinos, a vacina se mostrou capaz de induzir proteção contra infecção desafio com uma cepa virulenta de M. tuberculosis, levando a um padrão de resposta imune do tipo Th1, com produção de IFN- e linfócitos T CD8+ citotóxicos específicos ao antígeno. Por outro lado, o padrão de anticorpos sugeria a presença de citocinas também do 3 padrão T ”helper” tipo 2 (Th2), mesmo que em baixas doses. Isso deve ter contribuído para a ausência de lesão pulmonar (Lowrie, Silva et al., 1997; Bonato, Lima et al., 1998; Lima, Dos Santos et al., 2003). Além do efeito profilático, também apresentou efeito terapêutico isoladamente ou combinada a quimioterapia, o que parece levar à eliminação dos bacilos (Lowrie, Tascon et al., 1999). Os dados obtidos em murinos também foram confirmados em cobaias (De Paula, Silva et al., 2007). Esse estudo culminou com o uso da vacina em testes clínicos em pacientes com tumor de cabeça e pescoço. Embora o ensaio ainda esteja em fase I e II já foi possível observar uma melhora significativa no tempo de vida dos pacientes (dados não publicados). A ação da vacina nesse caso seria terapêutica, atuando como imunoestimulante. Cabe lembrar, no entanto, que por se tratar de material genético e antígenos diferentes os resultados não podem ser generalizados, cabendo uma análise para cada construção a ser utilizada. Por serem de origem procariótica, os plasmídeos utilizados em vacinação possuem uma propriedade adjuvante inerente em sua estrutura. Esta propriedade imunoestimulante é atribuída a seqüências palindrômicas específicas, contendo motivos citosina-guanina (CpG) não metilados (Yamamoto, Yamamoto et al., 1992). Essas seqüências são reconhecidas por receptores do tipo Toll e ativam a resposta imune inata, desde o início da imunização. Assim, quando sequências contendo CpG são internalizadas pelas células em repouso, ligam-se aos receptores do tipo Toll 9 (TLR9) presentes, principalmente, em vesículas intracelulares. A migração para um compartimento celular rico em CpG parece ser através de um processo de fusão à membrana plasmática no local de formação do endossomo (Latz, Schoenemeyer et al., 2004). A ligação entre TLR9 e sequências 4 CpG leva a uma polarização da resposta imune para o padrão Th1, passando pela sinalização de MyD88 com produção de interleucina (IL) 12 e IFN- em linfócitos T citotóxicos e CD4+ (Krieg, 2002; Tudor, Dubuquoy et al., 2005). Oligonucleotídeos contendo essas seqüências têm sido utilizados como adjuvantes no tratamento de asma em estudos clínicos (Simons, Shikishima et al., 2004). Além da injeção intramuscular do DNA “nu”, que é o tipo mais simples de imunização, as vacinas gênicas podem ser administradas por outras vias, como intradérmica, intranasal, oral e por diversos métodos mecânicos, elétricos e químicos, com objetivo de favorecer a ativação da resposta imune ou diminuir a dose utilizada (Luo e Saltzman, 2000). A injeção intramuscular seguida de eletroporação está sendo largamente utilizada atualmente e com resultados bastante promissores (Rizzuto, Cappelletti et al., 1999; Capone, Zampaglione et al., 2006; Onodera, Ohshima et al., 2007; Zhang, Divangahi et al., 2007). Dentre os métodos mecânicos destaca-se o bombardeamento intradérmico de partículas de ouro recobertas com o material genético, chamado de gene gun, capaz de gerar resposta imune humoral e celular em modelos animais. Essa estratégia já foi utilizada com diferentes construções vacinais, incluindo o pcDNA3-HSP65 (Pertmer, Eisenbraun et al., 1995; Leutenegger, Boretti et al., 2000; Lima, Dos Santos et al., 2003). Outra estratégia visando à diminuição da doses de DNA que tem sido abordada pelo nosso grupo, inclui o uso de formulações lipossomais veiculadas pela rota intranasal (Rosada, 2006) e de microesferas de polímeros de ácidos lático e glicólico (PLGA) contendo DNA encapsulado juntamente com dimicolato de trealose (DMT). Ambas as estratégias visam a liberação de forma 5 controlada do DNA plasmideal por mais tempo (Luo e Saltzman, 2000; Lima, Santos et al., 2003). Dentro desse conceito, um ponto importante a ser considerado com relação às vacinas de DNA diz respeito a sua biossegurança. Em geral, as doses utilizadas para imunização e terapia são relativamente elevadas: 300 g em modelos murinos e 1000 g ou mais em seres humanos. Assim, a chance de ocorrer uma integração genômica é um risco a ser considerado (Gurunathan, Klinman et al., 2000). A liberação para uso clínico inclui, então, a checagem da não integração genômica e outras variáveis como o não desenvolvimento de doenças autoimunes, principalmente em nosso modelo, já que utilizamos uma proteína de choque térmico de M. leprae que apresenta similaridade antigênica com proteínas eucarióticas. Análise de nosso laboratório mostrou que após a injeção intramuscular de 100 g de pcDNA3-HSP65 ocorria uma vasta biodistribuição, sendo que o plasmídeo podia ser recuperado de diversos órgãos até seis meses após a inoculação. Porém, o RNA mensageiro permanecia detectável até o décimo quinto dia após o inóculo. A avaliação do perfil de metilação do plasmídeo mostrou que o mesmo, embora presente nos órgãos por seis meses, não havia se replicado nem se integrado ao genoma do hospedeiro (Coelho-Castelo, Trombone et al., 2006). Também foi demonstrado, em modelos de diabetes auto-imunes, que a vacinação com pcDNA3-HSP65 não leva ao agravamento do quadro (SantosJunior, Sartori et al., 2005). Em conjunto esses dados mostram a biossegurança da vacina pcDNA3-HSP65. Porém, um dos pontos chaves no desenvolvimento de vacinas é o entendimento da geração de memória, para que possíveis intervenções possam 6 melhorar a eficácia da mesma. Do ponto de vista das vacinas de DNA, pouco se conhece sobre as células envolvidas na geração de memória. Dados obtidos da literatura mostram que, após a vacinação intramuscular com o DNA nu, o mesmo pode ser detectado em células dendríticas CD11c+ e macrófagos CD11b+ (Liu, Wahren et al., 2006). No entanto, dados de nosso laboratório mostraram que, além das células CD11c+ e CD11b+, os linfócitos B da medula óssea ou linfonodos também eram capazes de capturar o plasmídeo e expressar o antígeno, usando duas construções plasmideais diferentes (Coelho-Castelo, Santos Junior et al., 2003). Quando a vacinação era veiculada por microesferas de PLGA observou-se uma biodistribuição ampla, contudo com ativação principalmente de células CD11c+ (Trombone, Silva et al., 2007), sugerindo que o modo de oferecer o DNA plasmidial ao sistema imune pode influenciar na captura do antígeno e, por conseqüência, no tipo de resposta imunitária a ser desenvolvida. Outro aspecto importante e pouco explorado, diz respeito a influência e células T reguladoras nesses modelos (Toka, Suvas et al., 2004). 1.2 – Apresentação de antígenos em vacinas de DNA Uma das hipóteses para explicar a ativação da resposta imunitária, após injeção intramuscular, é baseada na ação das células musculares como apresentadoras do antígeno. Essas células são multinucleadas, portanto prováveis produtoras de alta taxa da proteína em questão, porém, por não possuírem moléculas co-estimulatórias, essas células não são consideradas como clássicas células apresentadoras de antígeno (Corr, Lee et al., 1996; Gurunathan, Klinman 7 et al., 2000). Além disso, se o local da injeção intramuscular for retirado logo após a imunização não há diferenças nos níveis de anticorpos nem na resposta citolítica, sugerindo a dispersão das moléculas quer via sangüínea ou linfática. Por outro lado, a injeção no músculo leva a um aumento da pressão hidrostática, o que favorece o recrutamento de células apresentadoras para o local. Essas células, então, capturariam o antígeno liberado em vesículas ou como proteína nativa (Torres, Iwasaki et al., 1997). Após a injeção intramuscular de DNA marcado, este pode ser observado até vinte e quatro horas, entre as fibras musculares ou em pequenas vesículas dentro de células mononucleares. Neste período, também pode ser detectado vesículas em células CD11b+ dos linfonodos drenantes (Dupuis, Denis-Mize et al., 2000). Uma outra hipótese aventada propõe que a resposta imunitária só seja ativada após o DNA plasmidial ser capturado por células do fenótipo CD11c+ ou CD11b+. Nesse caso, o plasmídeo, após ser capturado por uma célula em questão, levaria a produção da proteína podendo ativar linfócitos T diretamente, ou por mecanismos de cross priming (Doe, Selby et al., 1996). De qualquer modo, os modelos explicam apenas o início da resposta e não a ativação celular e ou geração de células de memória, bem como não esclarecem a contribuição de cada célula apresentadora de antígeno (APC) nesse modelo vacinal. A transfecção direta de células leva à apresentação do antígeno via complexo principal de histocompatibilidade de classe I (MHC I) e é importante para primar linfócitos T citotóxicos. Os antígenos sintetizados endogenamente são degradados no citossol por proteases e os peptídeos gerados são transportados para o retículo endoplasmático, onde se juntam as moléculas de classe I e migram 8 para a superfície celular. Antígenos expressos por outras células podem levar à apresentação via MHC de classe II (MHC II). O processamento desses antígenos ocorre no fagolisossomo, após sofrerem endocitose ou macropinocitose (Howarth e Elliott, 2004). Trombone e col, usando baixas doses de DNA plasmideal, demonstraram que a captura do DNA plasmidial em células dendríticas e/ou macrófagos ocorre independente de TLR9, dados que outros autores também já haviam demonstrado com doses mais elevadas (Latz, Schoenemeyer et al., 2004; Trombone, 2007). No trabalho de Trombone e col, embora independente de Toll 9, o recrutamento da molécula de MyD88 para a vesícula lisossomal dá inicio a sinalização para indução da produção de citocinas do padrão Th1, como IFN-γ e IL-12. Como já descrito, o processamento de antígenos internalizados que escapam para o citossol ocorre por degradação pelo proteassoma e apresentação cruzada via MHC de classe I. A ativação de linfócitos T CD4 se daria pelo mecanismo de apresentação direta via MHC de classe II (Gurunathan, Klinman et al., 2000). No modelo das vacinas de DNA, dependendo da dose usada esse paradigma pode ser alterado. Assim, avaliando o tráfego intracelular do DNA plasmidial percebe-se que a forma de veiculação da molécula de DNA pode levar a ativar preferencialmente um dos mecanismos. Isso tem conseqüência direta no design de vacinas e na rota principal da resposta imune que se deseja ativar. Curiosamente, trabalhando com baixas doses de DNA para avaliar o tráfego intarcelular do plasmídeo, observamos que baixas doses do DNA plasmidial o mantém dentro de vesículas, e de um modo ainda não entendido, impede a acidificação das mesmas. Dentro dessas vesiculas que não chegam a lisosomas, a 9 molécula de DNA atinge a membrana perinuclear (Trombone, 2007). Por outro lado, a veiculação em microesferas contendo PLGA, provavelmente libera DNA no citossol, por alterar a bomba de sódio potássio como ocorre com veiculação de lipossomas ou pelo próprio tamanho que apresentam (Trombone, Silva et al., 2007; Trombone, 2007). Com relação às células apresentadoras de antígenos, a participação dos linfócitos B em vacinas de DNA tem sido restrita a alguns modelos. Foi mostrado que essas células podem participar do processo de apresentação cruzada, apenas após a imunização por gene-gun (Hon, Oran et al., 2005). A apresentação cruzada para linfócitos T citotóxicos também pode se observada usando antígeno proteico conjugado com DNA contendo seqüências CpG (Heit, Huster et al., 2004). Por outro lado, Zanetti e col mostram a importância da participação de células B como APC, após a vacinação intraesplênica (Zanetti, Castiglioni et al., 2004). 1.3 – Participação dos linfócitos B na apresentação antigênica Na indução da resposta imunitária, classicamente, os macrófagos e principalmente as células dendríticas são consideradas as principais células envolvidas na ativação de linfócitos T naive. Isso, em parte, é decorrente de duas de suas principais propriedades que são a eficiência de endocitose/ macropinocitose e da apresentação antigênica, sendo capazes de capturar e apresentar antígenos mesmo quando em concentrações extremamente baixas (Watts e Amigorena, 2000). A captura de antígeno é particularmente eficiente em células dendríticas, devido ao seu elevado nível de macropinocitose, podendo 10 capturar uma área correspondente ao seu próprio volume em uma hora (Sallusto, Cella et al., 1995). A capacidade de apresentação de antígenos em células dendríticas é modificada durante seu processo desenvolvimento. Enquanto células imaturas apresentam uma alta capacidade de macropinocitose e ineficiência do ponto de vista de apresentação antigênica, as células maduras praticamente não realizam macropinocitose, mas são excelentes apresentadoras de antígeno. Assim, a eficiência na apresentação de antígeno pelas células dendríticas está relacionada à sua alta capacidade de capturar antígenos quando imatura em sítios periféricos e a sua alta capacidade de apresentar antígenos em órgãos linfóides quando madura, devido a um aumento de expressão, em sua superfície, de moléculas de MHC e co-estimulatórias durante o processo de maturação (Cella, Engering et al., 1997). A participação dos linfócitos B na apresentação antigênica e proliferação de linfócitos T foi demonstrada utilizando-se camundongos deficientes desse tipo celular. Neste modelo, a presença de linfócitos B para apresentação antigênica mostrou-se necessária para a expansão de linfócitos T CD4 (Crawford, Macleod et al., 2006). Através da reconstituição desses animais, foi mostrado que a captura do antígeno ocorre pelo receptor de linfócito B (BCR) específico, levando a um aumento da expressão de moléculas co-estimulatórias, processamento e apresentação do antígeno (Rivera, Chen et al., 2001). O processo de endocitose mediada por receptor permite às células B concentrar quantidades pequenas de antígeno específico e apresentá-lo eficientemente, já que a sinalização do BCR favorece a apresentação de antígenos internalizados por essa via (RodriguezPinto, 2005). Além do reconhecimento do antígeno pelo receptor específico, a 11 estimulação primária de linfócitos T CD4 pelos linfócitos B é dependente da ligação entre CD40 e seu ligante CD154 (Rodriguez-Pinto e Moreno, 2005). O reconhecimento de antígenos apresentados por células B por linfócitos T CD8 parece ser um mecanismo mais complexo. O auxílio de células T CD4 previamente ativadas, por meio de liberação de citocinas ou através da ligação CD40/CD40L e OX40L/OX40 entre linfócitos B e T, parece ser necessário para a ativação primária de linfócitos T CD8 in vitro (Castiglioni, Gerloni et al., 2005). Porém, já foi demonstrado também que células B ativadas com CD40 ligante são capazes de induzir resposta primária de linfócitos T citotóxicos (Von BergweltBaildon, Vonderheide et al., 2002). Outra maneira de aumentar a expressão de CD40 e moléculas co-estimulatórias é através do uso de motivos CpG como adjuvantes, que atuam nos receptores do tipo Toll 9, ativando os linfócitos B (Wheeler, Cortez-Gonzalez et al., 2006). Recentemente, uma subpopulação de células B reguladoras, denominadas Breg, tem sido relacionada com controle da reposta imunitária, semelhante ao que ocorre com as T reguladoras (Treg). Essas células, no contexto de inflamação crônica parecem exercer papel imunomodulador através da produção de IL-10 ou fator tranformador de crescimento beta (TGF- ) (Mizoguchi e Bhan, 2006). A importância do linfócito B em vacinas de DNA é ressaltada em modelos de imunização intra-esplênica, usando-se vetores que apresentam promotores de imunoglobulinas que visam a expressão seletiva do antígeno em linfócitos B (Xiong, Gerloni et al., 1997). Quando esse modelo foi aplicado em animais deficientes de células dendríticas, houve indução normal da resposta imunitária após a vacinação com DNA plasmideal, sugerindo a participação de células B 12 como apresentadoras de antígeno (Langlade-Demoyen, Garcia-Pons et al., 2003). Além disso, através da transgenese espontânea de esplenócitos in vitro (Filaci, Gerloni et al., 2004) com plasmídeos codificando proteínas do vírus influenza demonstrou-se, em um modelo de imunização endovenosa, a capacidade dos linfócitos B em gerar resposta T CD4 e CD8 específica e protetora contra posterior desafio contra o vírus influenza (Gerloni, Rizzi et al., 2004). Essa resposta protetora é mediada por células T CD8 de memória central, eficientemente gerada por células B manipuladas geneticamente (Castiglioni, Gerloni et al., 2004), reafirmando a participação dessas células na apresentação antigênica em modelos vacinais. Porém os modelos citados utilizam vacinas de DNA com promotores dos genes de imunoglobulina, o que favorece a expressão em células B. Além disso o mecanismo de imunização intra-esplênica é um mecanismo invasivo, difícil de ser usado em larga escala. Assim a vacinação convencional por via intramuscular para a avaliação do papel das células B e demais apresentadoras de antígenos in vitro, bem como o padrão de linfócitos T de memória ativado, poderá nos fornecer dados mais completos sobre os mecanismos de atuação dessas vacinas. 13 2 – OBJETIVOS O presente trabalho teve como objetivos: Geral: Avaliar a participação de células apresentadoras de antígenos in vitro, representadas por macrófagos, células dendríticas e linfócitos B, na resposta imune induzida por vacinas de DNA, usando como modelo a vacina pcDNA3HSP65 contra tuberculose experimental. Específicos: Determinar o perfil fenotípico das células T ativadas in vitro pelas diferentes APCs e avaliar a participação de células B como APC e na proteção contra a tuberculose experimental. 14 3 - MATERIAL E MÉTODOS 3.1 – Animais Foram utilizados camundongos C57BL/6 deficientes ou não de células B, [cadeia µ-/- (Jackson laboratories)], do mesmo background, SPF (Specific Patogen Free), com seis a oito semanas de idade, provenientes do Biotério de Animais Isogênicos da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP. Os animais foram mantidos em isoladores de animais, com temperatura, umidade, fluxo de ar e ciclo de luz /escuro controlados, com livre acesso à água e ração. 3.2 – Extração e purificação da vacina pcDNA3-HSP65 Os plasmídeos recombinante pcDNA3-HSP65 e o parental pcDNA3 (Invitrogen Corporation, Carsbad, CA, USA), gentilmente cedidos pelo Prof Dr Célio Lopes Silva, foram purificados por cromatografia de troca iônica, utilizando-se colunas da QIAGEN Giga Plasmid Purification Kit (Qiagen Inc., Santa Clarita, CA, USA). Bactérias E. coli DH5-α, transformadas com cada plasmídeo em questão, foram plaqueadas em meio LB Agar (Sigma Chemical Corporation, Saint Louis, MO, USA) contendo 100 µg/mL de ampicilina, por 16 horas a 37ºC. Após esse período, uma colônia foi inoculada em 5,0 mL de meio LB líquido (USB Corporation, Cleveland, OH, USA) contendo ampicilina (100 µg/mL) e incubada 15 durante 8 horas, com agitação de 250 rpm a 37°C. A seguir, essa cultura foi diluída 1/500 em 2,5 litros de LB líquido (USB), contendo ampicilina (100 µg/mL), e incubada novamente a 37ºC sob agitação (250 rpm) durante 16 horas. Após esse período, o material foi centrifugado a 6.650 g por 15 minutos a 4ºC, o sobrenadante desprezado e cerca de sete gramas do precipitado foi ressuspendido em 125 mL de tampão P1 (Tris-HCl 50 mM pH 8,0; EDTA 10 mM e RNAse 100 µg/ml). Logo após, foram adicionados 125 mL de tampão P2 (NaOH 200 mM; SDS1%) e esperou-se 5 minutos para a completa lise da parede bacteriana. Em seguida, adicionou-se 125 mL do tampão P3 (acetato de potássio 3,0 M pH 5,5), o material foi filtrado e mantido no gelo por 30 minutos após adição de tampão para remoção de endotoxinas. O filtrado foi aplicado em uma coluna de cefarose (Qiagen) previamente equilibrada com tampão QBT (NaCl 750 mM; MOPS 50 mM pH 7,0; etanol 15% e Triton X-100 0,15 %). Após a aplicação do filtrado, a resina foi lavada com 600 mL de tampão QC (NaCl 1,0 M; MOPS 50 mM pH 7,0; etanol 15 %) e o DNA plasmidial foi eluído com 30 mL de tampão QN (NaCl 1,25 M; MOPS 50 mM pH 7,0; etanol 15 %). O DNA eluído foi precipitado com isopropanol e centrifugado a 20.600 g por 45 minutos a 4°C. Finalmente o sedimento foi ressuspendido em cerca de 1,0 mL de água estéril livre de endotoxinas. 3.3 - Quantificação e avaliação da integridade dos plasmídeos purificados Após a purificação dos plasmídeos foi realizada a quantificação e a avaliação da integridade dos produtos purificados. A quantificação dos plasmídeos se fez em espectrofotômetro GeneQuant IITM (Amershan-Pharmacia, 16 BioSciences, USA), usando a razão obtida entre os comprimentos de onda de 260 e 280nm. A caracterização dos plasmídeos pcDNA3 e pcDNA3-HSP65 foi realizada por padrão de restrição, utilizando-se as enzimas de restrição BamHI e NotI (Invitrogen). Aproximadamente 1µg de cada plasmídeo foi incubada a 37°C por 4 horas com as enzimas (1U/µg) e seus tampões. Os produtos da digestão de cada amostra, bem como os plasmídeos não digeridos, foram submetidos a eletroforese em gel de agarose 1%. As amostras foram ressuspendidas em tampão de eletroforese seis vezes concentrado (0,25% azul de bromofenol; 40% de sacarose em água) e o material submetido a eletroforese em tampão TAE (Trisacetato 40mM; EDTA 1mM pH 8,3). O padrão 1Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen) foi utilizado como marcador de peso molecular; o gel foi corado com 0,5mg/mL de brometo de etídio (Sigma) e a visualização das bandas foi feita em luz ultravioleta no aparelho Image Master® VDS (Pharmacia Biotech, NJ, USA). 3.4 – Análise da pureza da vacina gênica A determinação da presença de endotoxinas bacterianas no DNA plasmidial foi realizada através do teste cromogênico usando o lisado de amebócito de Limulus polyphemus (LAL), que é um teste quantitativo para mensuração de endotoxinas de bactérias gram-negativas. Foi utilizado o “QCL1000 LAL kit - Quantitative Cromogenie” (Cambrex Bioscience Walkersville Inc., Walkersville, MD, USA). Primeiramente, a endotoxina foi reconstituída através da adição de 1 mL de água fornecida pelo próprio kit seguido de agitação vigorosa e homogeneização em vórtex (Ika Works Inc., Wilmington, NC, USA) por 15 min. Com o auxílio de uma seringa de 10 mL, foi reconstituído o substrato 17 cromogênico com a adição de 6,5 mL de água. O frasco foi protegido da luz e posteriormente incubado em placa de 96 poços, a 37ºC, até o momento do uso. A seguir, o LAL foi reconstituído pela adição de 1,4 mL de água com auxílio de uma seringa. Uma vez com os reagentes reconstituídos, retirou-se a placa da estufa e preparou-se a curva padrão através de diluições sucessivas da endotoxina partindo de uma concentração 1 Unidade de Endotoxina por mL (UE/mL) até 0,1 UE/mL. Posteriormente as amostras foram depositadas na placa, adicionados 50 µL do LAL e incubada a 37ºC por 10 min. Com auxílio de uma micropipeta, foram depositados 100 L do substrato cromogênico em todos os poços (amostras e curva), seguidos de homogeneização e incubação a 37ºC por 6 min. Posteriormente foram acrescentados 100 L de uma solução de ácido acético 25% para interrupção da reação. Finalmente foi feita a determinação das densidades ópticas (D.O.) em espectrofotômetro Shimadzu UV 1650-PC (Shimadzu Corporation, Hong Kong, Japan) a 405 nm. Os resultados foram obtidos pela correlação da curva padrão com as diluições das amostras, levando-se em consideração a absorbância e a concentração de endotoxina para cada uma das amostras, em relação à curva padrão. A fórmula aplicada para calcular a quantidade de LPS por micrograma de DNA foi: UE/mL X diluição UE/µg DNA = ________________________ amostra µg/mL Consideram-se amostras livres de endotoxina, aquelas que apresentam valores menores a 0,1 UE/µg DNA. 18 3.5 – Obtenção da proteína HSP65 recombinante Bactérias E. coli ER2566 transformadas com o plasmídeo pET28a (Novagen, USA) contendo o gene da HSP65 seguido por cauda de histina, foram cultivadas em 2,5L de meio LB líquido (USB) contendo kanamicina na concentração de 100 g/mL e 300 mM do indutor Isopropiltio- -D-Galactosídeo IPTG (Invitrogen), a 37°C sob agitação de 250 rpm por 18 h. Após incubação, as bactérias foram coletadas por centrifugação a 5000g por 15 minutos em centrífuga J2HS em rotor JS-7.5 (Beckman, Coulter, Inc, CA, USA), ressuspensas em 20 mL de tampão fosfato e lisadas em gelo por ultassom, utilizando a sonda Vibra cell™ (Sonics & Materials Inc., Danbury, CT, EUA), com cinco pulsos de 30 segundos a 60 Hz. Após centrifugação a 20600g por 20 minutos, o sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspenso em 30mL de tampão fosfato contendo uréia a 2M. A suspensão foi então centrifugada a 20600g por mais 20 min e o sobrenadante coletado e submetido à cromatografia de afinidade utilizando-se a coluna HiTrap Chelating HP (Amersham Pharmacia), conforme o protocolo especificado pelo fornecedor. A amostra de proteína foi eluída da coluna por concentrações crescentes de imidazol. Após eluição a proteína foi dialisada contra solução de fosfato tamponada (PBS) durante 16 h a 4°C. Para a quantificação da proteína HSP65 recombinante utilizou-se Coomassie® Protein Assay Reagent (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) e para a quantificação de endotoxinas o teste QCL-1000 LAL kit – Quantitative Cromogenie (CAMBREX Bioscience). 19 3.6 – Imunizações Os animais C57BL/6 foram imunizados com 3 doses de plasmídeo pcDNA3-HSP65 (100 µg/dose, com intervalos de 15 dias cada). O DNA plasmidial foi diluído em sacarose 25%. As injeções foram feitas em dois sítios (músculos quadríceps), usando 50 µL por injeção. Quinze ou trinta dias após a última imunização, os animais foram sacrificados para obtenção de células T CD4 e CD8 HSP65 específicas. 3.7 – Separação dos linfócitos T CD4 e T CD8 Os animais C57BL/6, imunizados como descrito acima, foram eutanasiados e seus baços retirados de maneira estéril. Os órgãos foram macerados em meio RPMI 1640 (GIBCO™ Invitrogen Corporation, Grand Island, NY, USA) e as hemácias foram lisadas com tampão contendo TRIS-base (0,17M pH 7,65) e 0,16M de cloreto de amônio, estéril e livre de endotoxinas. Cada órgão foi mantido em cultura com macrófagos peritoniais do próprio animal e 50 g de HSP65 recombinante em RPMI 1640 (GIBCO), suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF) (GIBCO), penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 mg/mL), gentamicina (10 mg/mL) (GIBCO) polimixina (30 g/mL) (Sigma) e 50mM de 2-mercaptoetanol (Sigma) por cinco dias a 37oC e 5% de CO2. Após a coleta das células não aderentes, foi feita a determinação do número de células viáveis em câmara de Neubauer (corante azul de tripan). Foram, então, ressuspendidas em tampão fosfato livre de cálcio e magnésio contendo 2mM de EDTA e 0,5% de soro bovino fetal, e incubadas com o anticorpo anti-CD8a ligado a beads magnéticas (MACS MicroBeads system - 20 Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). As células marcadas magneticamente ficam presas na coluna dentro de um campo magnético e a fração livre de linfócitos CD8 é coletada para posterior marcação. Após a retirada da coluna do campo magnético, obtivemos apenas as células CD8 positivas. A fração restante é incubada posteriormente com beads ligadas ao anticorpo anti CD4. Da mesma maneira as células marcadas ficam presas na coluna e as CD4 negativas são eluídas. As células CD4 positivas são obtidas após a retirada do campo magnético. Todo o processo foi feito seguindo-se o protocolo recomendado pelo fabricante. 3.8 – Obtenção de células apresentadoras de antígeno 3.8.1 – Obtenção de células dendríticas provenientes de baço Células totais de baço de camundongos C57BL/6 normais foram maceradas e filtradas em filtros apropriados de nylon de 70 µm em meio RPMI 1640 (GIBCO) contendo 10% de soro fetal bovino (GIBCO). As células foram lavadas com meio de cultura duas vezes a 400 g por 5 minutos (rotor 5810R – Eppendorf, Hamburg, Germany) para eliminação dos debris celulares. Por fim, foram ressuspendidas em 12 mL de meio RPMI com 10% de soro fetal bovino, suplementado com piruvato, aminoácidos essenciais, 10 ng/mL de fator estimulador de colônias de granulócitos e monócitos (GM-CSF) murino (BD Pharmingen™, San Diego, CA, USA) e 1 ng/mL de TGF- (R&D System, Minneapolis, MN, USA). Foram distribuídas em placas de seis poços de baixa aderência (Costar® Corning Incorporated, Corning, NY, USA) e mantidas em 21 estufa de CO2 5% a 37º C. Após quatro dias adicionou-se a cada poço 1 mL de meio RPMI completo contendo as duas citocinas. Três dias após foram removidos 2 mL do meio e adicionou-se 2 mL de meio novo. Esse passo foi repetido a cada dois dias, a partir de então. Após 14 dias as células dendríticas imaturas estavam prontas para uso. A caracterização do fenótipo das células foi realizada por FACSort™, usando o programa Cell Quest (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA). A figura 1 mostra a caracterizacão fenotípica das células obtidas. 26.5% 64.5% Figura 1- Análise fenotípica das células dendríticas do baço por citometria de fluxo. As células foram marcadas com anticorpos monoclonais anti-CD11c conjugado com FITC e anti-I-Ab conjugado com PE (BD PharMingen). A análise foi feita no aparelho FACSort (BD Biosciences). 3.8.2 – Obtenção de macrófagos peritoniais e linfócitos B Os macrófagos foram obtidos da cavidade peritonial por lavagem com salina gelada e os linfócitos B por seleção negativa de células do baço. Rapidamente, após a lise das hemácias (descrito anteriormente), as células do baço foram incubadas com o anticorpo anti-CD43 ligado a beads magnéticas (MACS MicroBeads system – Miltenyi Biotec). A fração não marcada é 22 constituída por linfócitos B em repouso e é coletada seguindo-se o protocolo do fabricante. 3.9 – Ensaios de apresentação de antígenos 3.9.1 – Eletroporação das células apresentadoras de antígeno As células apresentadoras obtidas foram eletroporadas no GenePulser Xcell™ (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA), a 300 V, 150 F e 100 , em meio Opti-MEM (GIBCO), com 10 g de pcDNA3-HSP65 ou vetor para cada 1x106 células (5x106/mL) e plaqueadas na concentração de 1x105 em placas de 96 poços com fundo em U. As células foram mantidas em cultura a 37oC em meio RPMI 1640 com 10% de SBF inativado, 2-mercaptoetanol e antibióticos (completo) por três dias. Após esse período foram colocadas em contato por mais três dias com 1x106 linfócitos T CD4 ou CD8 provenientes de animais imunizados e sacrificados quinze ou trinta dias após a última dose. Como controles foram utilizadas células eletroporadas somente com meio de cultura (mock) e linfócitos T tratados com concanavalina A (4 g/mL). 3.9.2 – Ensaio de linfoproliferação por CFSE A proliferação dos linfócitos T CD4 e CD8, obtidos como descrito acima, foi medida utilizando-se o corante citoplasmático carboxifluoresceína diacetato succinimidil éster (CFSE) (Sigma). Os linfócitos T foram marcados com 2,5 M do corante diluído em tampão fosfato estéril e livre de endotoxinas na concentração de 5-10 x106 células/mL por cinco minutos a temperatura ambiente 23 com agitação periódica. O processo de marcação foi interrompido adicionando-se 5% de SBF, posteriormente as células foram lavadas com PBS e centrifugadas a 400 g por cinco minutos. Após serem ressuspendidas em meio RPMI completo as células foram incubadas com as células apresentadoras de antígeno por três dias e coletadas em PBS para a análise por citometria de fluxo (FACSort™ - BD Bioscience) 3.10 – Determinação do perfil de citocinas por Reação em cadeia da polimerase em tempo real (“Real-time PCR”) 3.10.1 – Co-cultura de células apresentadoras de antígeno e linfócitos T Após a eletroporação, as células apresentadoras foram cultivadas na densidade de 2x105 em placas de 24 poços por três dias a 37o C em meio RPMI completo. Posteriormente, foram adicionados os linfócitos T CD4 e CD8 (obtidos como descrito anteriormente, item 3.7) na concentração de 2x106 e deixados em cultura por mais três dias. Após esse período o sobrenadante da cultura foi coletado e as células foram congeladas em 1 mL de TriZol® (Invitrogen) para análise de expressão gênica. 3.10.2 – Extração de RNA total As células mantidas em TriZol® foram descongeladas e mantidas na temperatura ambiente por cinco minutos para dissociação dos complexos nucleoproteicos. Foram adicionados 200 L de clorofórmio com agitação manual e posterior incubação de três minutos à temperatura ambiente. Após centrifugação 24 a 12000 g por quinze minutos a 4ºC, a fase aquosa foi separada e adicionada de 700 L de isopropanol gelado. As amostras foram incubadas a -70º C durante no mínimo 16 horas para a precipitação do RNA. Posteriormente foi feita uma nova centrifugação a 12000 g por quinze minutos a 4ºC, lavagem do precipitado com etanol 75% gelado e secagem por dez minutos no gelo. O RNA foi ressuspendido em 20 L de água livre de RNAses (GIBCO) e estocado a -70º C. 3.10.3 – Obtenção do DNA complementar (cDNA) Todo o RNA obtido foi tratado com DNase I amplification grade (Invitrogen) segundo o protocolo do fabricante. O DNA complementar foi sintetizado a partir do primer oligo (dT)12-18 (Invitrogen) com a enzima transcriptase reversa Superscript II (Invitrogen) em solução contendo tampão da enzima, DTT, cloreto de magnésio e dinucleotídeos sintéticos (adenina, guanina, citosina e timidina). O produto foi dosado por espectrofotometria nos comprimentos de onda de 260 a 280nm utilizando-se o aparelho GeneQuant II (Amershan-Pharmacia). 3.10.4 – Reação em cadeia da polimerase em tempo real (“Real-time PCR”) Em cada reação foram utilizados 200 ng de cDNA, 0,1 g/ L de cada primer (sense e anti-sense) e Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen) em um volume final de reação de 25 L. A temperatura de anelamento utilizada foi de 58ºC, e os genes amplificados e os primers utilizados estão descritos na Tabela 1. 25 Tabela 1. Primers utilizados nas reações de PCR em tempo real -actina sense AGC TGC GTT TTA CAC CCT TT -actina anti-sense AAG CCA TGC CAA TGT TGT CT GATA-3 sense AGG AGT CTC CAA GTG TGC GAA GATA-3 anti-sense TTG GAA TGC AGA CAC CAC CT T-bet sense CCC CTG TCC AGT CAG TAA CTT T-bet anti-sense CTT CTC TGT TTG GCT GGC T Foxp3 sense ACA ACC TGA GCC TGC ACA AGT Foxp3 anti-sense GCC CAC CTT TTC TTG GTT TTG As reações foram feitas no aparelho Rotor-gene (Corbett Life Science, Mortlake, NSW, Australia) e a expressão relativa de cada gene nas amostras de APCs eletroporadas com vetor ou vacina foi feita relação às eletroporadas com meio de cultura, utilizando-se o programa Rotor-gene 6000. A amplificação da beta-actina foi usada apenas como controle da integridade das amostras. 3.11 – Imunização de animais deficientes de linfócitos B com células eletroporadas com pcDNA3-HSP65 Para transferência adotiva de células B foram utilizados camundongos nocautes da cadeia µ de imunoglobulina (deficientes de linfócitos B) e C57BL/6, SPF (Specific Patogen Free), com 6 a 8 semanas de idade. 3.11.1 – Transferência adotiva de linfócitos B eletroporados Os linfócitos B foram eletroporados, como descrito anteriormente, e injetados por via endovenosa pelo plexo retro-orbital de cada animal, deficiente 26 ou não de células B, na concentração de 1x106 por animal em salina. Os grupos experimentais foram: animais que receberam linfócitos B eletroporados apenas com meio de cultura (mock), eletroporados com o vetor pcDNA3 e eletroporados com a vacina pcDNA3-HSP65. 3.11.2 – Imunofenotipagem das células do baço Sete dias após a imunização os animais foram eutanasiados e o baço retirado e macerado. Após determinação do número de células, estas foram distribuídas em tubos de poliestireno, 1x106 células em 100 L por tubo, e incubadas durante 30 min, a 4ºC, com anticorpo anti-CD16/CD32 (Fc BlockTMBD PharMingen), na concentração de 0,5 g/106 células. Esta incubação visa minimizar as ligações inespecíficas. Posteriormente, essas células foram incubadas com os respectivos anticorpos monoclonais de interesse, de acordo com a Tabela 2 (0,5 – 0,75 g de anticorpo/1x106 células), durante 30 min, a 4ºC, no escuro. Após o tempo de incubação as células foram lavadas com 2mL de PBS contendo 2% de SFB, centrifugadas a 400 g, por 10 min a 4ºC e ressuspensas em 300 l de PBS contendo 1% de formol tamponado para a fixação das células. As preparações celulares foram adquiridas no aparelho FACSortTM (BD Bioscience). Foram adquiridas 10.000 células por tubo, de acordo com parâmetros de tamanho (foward side scatter - FSC), granularidade (side scatter - SSC) e intensidade de fluorescência dos anticorpos marcados com ficoeritrina (PE), isotiocianato de fluoresceína (FITC) e CyChrome 5 (Cy5). Inicialmente, foi determinada a população de linfócitos, baseada nos parâmetros FSC e SSC, para detecção das porcentagens de linfócitos T (CD4+ e 27 CD8+). A expressão de CD44hi e CD62Llo ou CD62Lhi foi analisada nas populações de linfócitos CD4+ ou CD8+ pelo programa CellQuest® (BD Biosciences). Tabela 2. Anticorpos utilizados para imunofenotipagem celular de células do baço. FITC Cy5 PE Controle IgG2a de rato Controle IgG2a de rato Controle IgG2b de rato CD4 CD8 CD62L CD44 CD4 CD62L CD44 CD8 3.11.3 – Preparo do inóculo de Mycobacterium tuberculosis A suspensão de Mycobacterium tuberculosis, linhagem H37Rv (ATCC 27294) foi obtida a partir de uma alíquota congelada a -70º C, na qual foi observada viabilidade superior a 85%. O volume total da alíquota (1 mL) foi semeado em 2,5 mL de meio Middlebrook 7H9 (DIFCO Laboratories, Detroit, MI, USA). A cultura foi incubada por sete dias, a 37º C. Após este período, a cultura foi centrifugada a 2200 g por 20 minutos, o sedimento foi ressuspendido em 1 mL de solução salina estéril e em seguida transferido para tubo contendo pérolas de vidro. Esta suspensão foi agitada em vórtex (Ika Works Inc.) por 2 a 3 minutos até adquirir aspecto homogêneo. Adicionou-se salina estéril a esta suspensão até que a mesma atingisse a turbidez equivalente à Escala de Mc Farland no 1, o que equivale a uma concentração de 1x107 bacilos/mL. Para o preparo do inóculo de infecção, diluiu-se a suspensão com turbidez equivalente à escala numa proporção de dez vezes, obtendo-se assim uma suspensão com a 28 concentração de 1x106 bacilos/mL. A viabilidade da cultura foi verificada, de acordo com a metodologia descrita por McDonough & Kress, incubando-se por 10 minutos a 37ºC, cerca de 100 L desta suspensão de bactérias com 100 L de diacetato de fluoresceína a 2 g/mL (Acros Organics, New Jersey, USA) e 100 L de brometo de etídeo a10 g/mL (Sigma). A seguir, a suspensão de micobactérias foi observada em microscópio de fluorescência modelo Aristoplan (Leitz Wetzlar, Germany). As bactérias viáveis apresentam coloração verde enquanto as bactérias mortas coram-se com a solução de brometo, apresentando-se com uma coloração avermelhada. Outros controles realizados foram: coloração de Ziehl-Neelsen, contagem de bacilos presentes por mililitro de inóculo por meio da semeadura de várias diluições do mesmo em meio 7H11 e a semeadura da cultura original em ágar-sangue. Todos os procedimentos de cultura da micobactéria, preparo do inóculo e desafio dos animais foram realizados em laboratório de biossegurança nível III. 3.11.4 – Desafio com Mycobacterium tuberculosis Sete dias após a imunização com a construção vacinal ou com vetor, cada animal foi desafiado com 100µL da suspensão contendo 1x105 bacilos de M. tuberculosis H37Rv por via intranasal. Como controle experimental, foi acrescentado um grupo não imunizado que recebeu solução salina por via intranasal ao invés do desafio com a bactéria. 29 3.11.5 – Coleta, digestão e obtenção de células do pulmão Os lóbulos destinados aos ensaios de UFC (unidades formadoras de colônia) e cultura de células, foram pesados, cortados em pequenos fragmentos e transferidos para um tubo de fundo cônico de poliestireno de 50mL contendo 15 mL de solução de digestão estéril. Essa solução foi preparada em meio de cultura RPMI-1640 incompleto contendo 0,5 µg/mL de Liberase (Liberase Blendzymez – Roche, Basel, Switzerland) e 25 U/mL de Desoxiribonuclease I (GIBCO). Após a adição da solução de digestão, os tubos foram incubados a 37ºC, sob agitação constante, durante 30 minutos. Após a digestão as células foram dispersas com auxílio de uma seringa de 10mL e centrifugadas a 400 g por 10 min, a 4ºC. O sedimento foi ressuspenso em 1mL de RPMI-1640 incompleto. Uma alíquota de 100µL dessa suspensão foi retirada para o protocolo de UFC e o restante foi novamente centrifugado e o sedimento ressuspenso em 5mL de meio RPMI-1640 contendo 10% de SFB para inibir a atividade da enzima liberase. As células presentes foram separadas do restante da matriz digerida utilizando-se organza estéril, seguida de lavagem da malha com mais 10mL de meio RPMI-1640 completo. As células obtidas foram centrifugadas a 400 g por 10 min, a 4ºC, ressuspensas em 1mL de meio RPMI-1640 completo e contadas em câmara de Neubauer. A concentração final foi acertada para 1x106 células/mL. Essas células foram plaqueadas em placas de 24 poços (1ml por poço) e estimuladas com 10 g/ml de HSP65 recombinante ou lisado de micobactéria. Como controle negativo um poço não recebeu estímulo e como controle positivo foi utilizada a concanavalina A (40 g/ml). Após 48 horas o sobrenadante foi coletado para a dosagem de citocinas por ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay). 30 3.11.6 – Obtenção do lisado de M. tuberculosis Para a preparação do lisado de Mtb, foi utilizada uma alíquota de M. tuberculosis da cepa H37RV (ATCC 27294) congelada a –70ºC (com viabilidade superior a 85%). Cerca de 200 L dessa alíquota foram distribuídos em 10mL de meio Middlebrook 7H9 (DIFCO Laboratories, USA) enriquecido com Middlebrook ADCTM (BD Biosciences, USA), e incubado por 7 dias a 37ºC. A suspensão de micobactérias obtida foi centrifugada a 2200 g por 20 minutos e o sedimento ressuspenso em 1mL de PBS estéril e agitado vigorosamente por 2 a 3 min em tubo contendo pérolas de vidro, até adquirir aspecto homogêneo. Após serem homogeneizadas, as micobactérias foram mortas a 80ºC por 2 h, lisadas pelo sonicador Vibra cell™ (Sonics & Materials), com aproximadamente 3 pulsos de 60 Hz de 15 min cada, e filtradas em filtro 0,22 m (Corning Incorporated). A quantificação da quantidade de proteína foi feita por Coomassie® Protein Assay Reagent (Pierce) e para a quantificação de endotoxinas o teste QCL-1000 LAL kit – Quantitative Cromogenie (CAMBREX Bioscience). 3.11.7 – Ensaio imunoenzimático (ELISA) para a dosagem de citocinas no lisado pulmonar após transferência adotiva e desafio com M. tuberculosis Placas de 96 poços de poliestireno (Maxisorp Nunc-Immuno Plates, Rochester, NY, USA) foram sensibilizadas com 100 L da solução de anticorpo monoclonal purificado específico para interleucina 5 (IL-5), interleucina 10 (IL10), IL-12 ou IFN- ( BD PharMingen) diluído em tampão de ligação (Na2HPO4 0,1M pH 9,0) numa concentração final de 1mg/mL. As placas foram incubadas à 4ºC por 16h. Após sucessivas lavagens com solução PBS contendo 0,05% de 31 Tween 20 (Vetec, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) as placas foram incubadas com 200 L/poço da solução de bloqueio, constituída de PBS contendo 10% de soro bovino fetal, durante 1 hora, a temperatura ambiente. As placas foram novamente lavadas e foram adicionadas 100 L/poço das amostras juntamente com a curva padrão de das respectivas citocinas recombinantes, diluídas em PBS/SBF 10%/Tween 0,05% e incubadas por 16h a 4°C. Após lavagem, foi feita incubação por 1h a temperatura ambiente com os anticorpos monoclonais adequados conjugados com biotina (BD Pharmingen), adicionando-se 100 L/poço do anticorpo diluído em PBS / SBF 10%/Tween 20 0,05% numa concentração final de 0,5mg/mL. Após lavagem, adicionou-se 100 L/poço de solução de avidina biotina peroxidase StrepAB kitTM (Dako, Carpinteria, CA, USA) sendo incubada por 30 minutos a temperatura ambiente. As placas foram reveladas pela adição do substrato OPD (Sigma) após novo procedimento de lavagem. A reação foi interrompida pela adição de 50 L/poço de ácido sulfúrico 16% (Merck, Germany). A leitura da absorbância foi realizada em espectrofotômetro de placa (µQuant, Bio-Tek Instruments Inc., Winooski, VT, USA) a 490 nm. A determinação das concentrações de citocinas nas amostras foi feita por interpolação dos resultados de absorbância obtidos em relação aos da curva padrão. 32 3.11.8 – Ensaio imunoenzimático para a dosagem de Fator de Necrose Tumoralalfa (TNF- ) no sobrenadante do lisado pulmonar A dosagem de TNF foi feita utilizando-se o kit BD OptEIA™ Set (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) seguindo-se o protocolo do fabricante. As placas fornecidas são sensibilizadas pelo anticorpo de captura e incubadas a à 4ºC por 16h. Após lavagem com solução PBS contendo 0,05% de Tween 20 (Vetec), foi realizado o bloqueio por uma hora e adição das amostras e curva padrão. Após incubação por duas horas a temperatura ambiente, foi adicionado o anticorpo biotinilado juntamente com a solução de detecção fornecida. Uma hora depois a placa é lavada e a solução com o substrato tetrametilbenzidina (TMB) é adicionada. A reação é interrompida pela adição de ácido sulfúrico 2N. A leitura da absorbância foi realizada em espectrofotômetro de placa ( Quant Bio-Tek Instruments Inc.) a 450 nm. A determinação das concentrações de citocinas nas amostras foi feita por interpolação dos resultados de absorbância obtidos em relação aos da curva padrão. 3.11.9 – Determinação do número de unidades formadoras de colônia (UFC) de M. tuberculosis A partir da alíquota de 100 L do pulmão digerido (item 3.11.5), foram feitas diluições em PBS 1X de 10, 100, 1000 e 10000 vezes. As diluições (100 L) foram plaqueadas em meio sólido 7H11, 7H9 (Difco™ BD, Sparks, MD, USA) acrescido de ágar bacteriológico (Difco™ BD). Foram adicionados 100 L de cada diluição sobre as placas, as quais foram vedadas e incubadas a 37ºC por 30 dias. Após o período de incubação, as colônias de micobactérias foram contadas, o 33 número de colônias foi corrigido de acordo com as diluições e o peso dos pulmões e expresso em Log10 do número de UFC por pulmão. 3.11.10 – Análise histológica Para a análise histológica do pulmão dos animais desafiados, imunizados ou não, o lóbulo superior direito do pulmão de cada animal foi coletado e fixado em formol tamponado com fosfato. O material foi processado e foram realizados os cortes histológicos (5 m). As lâminas obtidas foram coradas com Hematoxilina e Eosina e analisadas em microscópio de luz (Nikon Eclipse, Japan). As análises foram realizadas pela Prof Dra Simone Gusmão Ramos do Departamento de Patologia, da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP. 3.12 – Análise estatística Para realização da análise estatística utilizou-se o programa GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Software Inc.) e foi empregado o teste ANOVA seguido do teste de Tukey. 34 4 - RESULTADOS 4.1 – Avaliação do perfil dos linfócitos T induzidos pelas diferentes APCs, após vacinação com DNA plasmidial Para avaliarmos a capacidade de apresentação de antígenos após o estímulo com DNA vacinal optamos, inicialmente, por transfectar as APCs utilizadas, células B, macrófagos e células dendríticas, com 20 ug de DNA plasmideal pcDNA3-HSP65, irradiar as APCs e, após diferentes tempos, avaliar a proliferação celular por incorporação de timidina a e produção de IL-2. Os resultados obtidos não foram conclusivos apresentando muita variação (dados não mostrados). Partimos então para uma nova estratégia envolvendo eletroporação. 4.2 – Ensaios de apresentação de antígenos por células eletroporadas Quinze dias após a terceira imunização com pcDNA3-HSP65, os animais foram eutanasiados e células totais do baço foram reestimuladas in vitro com a proteina HSP65 recombinante, durante cinco dias. Após esse período, os linfócitos T CD4 e T CD8 específicos foram purificados, marcados com CFSE, e colocados frente a células apresentadoras de antígeno, previamente eletroporadas com o plasmídeo pcDNA3-HSP65. Após três dias de co-cultivo os linfócitos foram recuperados e analisados por citometria de fluxo para verificar a linfoproliferação. Como mostra a figura 2, nenhuma das APCs utilizadas foi capaz de induzir proliferação estatisticamente significativa, nem na população CD4, nem CD8. Assim, nosso próximo passo foi avaliar a linfoproliferação 30 dias após o processo de imunização, utilizando o mesmo delineamento. A figura 3 mostra 35 que tanto os macrófagos quanto os linfócitos B, eletroporados com pcDNA3HSP65, foram capazes de induzir proliferação, estatisticamente significante, dos linfócitos T CD4 e T CD8 HSP65 específicos, quando comparado aos controles. No entanto, as células dendríticas mostraram apenas uma pequena porcentagem de indução apenas na população CD8, que não foi estatisticamente significante, em relação aos demais grupos. A indução da proliferação da população CD4 foi mínima. 36 CD8 % proliferação 40 30 M e io p cD NA 3 20 p c D N A 3 -H S P 6 5 10 0 Macrófagos Linfócitos B Células dendríticas c é lu la s a p r e s e n t a d o r a s d e a n t íg e n o CD4 %proliferação 40 30 20 10 0 Macrófagos Linfócitos B Células dendríticas c é lu la s a p r e s e n t a d o r a s d e a n t íg e n o Figura 2. Proliferação de linfócitos T CD8 e T CD4 obtidos 15 dias após a imunização com pcDNA3-HSP65. As células T CD4 e CD8 foram isoladas do baço dos animais 15 dias após a última dose da vacina e incubadas por três dias junto às células apresentadoras de antígeno previamente submetidas a eletroporação com o vetor pcDNA3 ou pcDNA3-HSP65. Eletoporação controle foi feita apenas na presença de meio. A porcentagem de proliferação foi avaliada por citometria de fluxo usando o corante CFSE. O gráfico representa a média e desvio padrão de dados de três animais induviduais. Os resultados foram repetidos duas vezes. 37 CD8 % proliferação 30 * M e io * 20 pcD NA 3 p c D N A 3 -H S P 6 5 10 0 macrófagos linfócitos B células dendríticas C é lu la s a p r e s e n t a d o r a s CD4 % proliferação 30 20 * * 10 0 macrófagos linfócitos B células dendríticas C é lu la s a p r e s e n t a d o r a s Figura 3. Proliferação de linfócitos T CD8 e T CD4 obtidos 30 dias após a imunização com pcDNA3-HSP65. As células T CD4 e CD8 foram isoladas do baço dos animais 15 dias após a última dose da vacina e incubadas por três dias junto às células apresentadoras de antígeno previamente submetidas a eletroporação com o vetor pcDNA3 ou pcDNA3-HSP65. Eletoporacão controle foi feita apenas na presença de meio. A porcentagem de proliferação foi avaliada por citometria de fluxo usando o corante CFSE como descrito na figura 2. * p< 0,05 em relação aos demais estímulos (ANOVA seguido de Tukey). 38 4.3 – Análise do perfil de citocinas induzido nas células T CD4 e T CD8 frente a diferentes APCs. Para determinar o perfil de citocinas dos linfócitos T CD4 e T CD8 induzidos pelas diferentes APCs realizamos PCR em tempo real para detecção de GATA-3, T-bet e Foxp3 (Figuras 4 e 5). Os linfócitos B induziram a expressão de GATA-3 e T-bet nos linfócitos T CD8 e, principalmente, de Foxp3 nos linfócitos T CD4 obtidos quinze dias após a última imunização (Figura 4A). Nesse período, os linfócitos estimulados pelos macrófagos não mostraram padrão fenotípico definido (Figura 4B). As células dendríticas também induziram a expressão de Foxp3 apenas nos linfócitos T CD4, como observado para os linfócitos B (Figura 4C e 4A, respectivamente). No entanto,quando a análise foi realizada após trinta dias, a expressão de T-bet nas células T CD8 estimuladas pelos linfócitos B apresentou aumento relativo de expressão, enquanto que com GATA 3 isso não ocorreu (Figura 5A). Com relação aos linfócitos CD4 as células B não mantiveram a expressão observada aos 15 dias para nenhum dos marcadores (Figura 5A). Por outro lado, nesse período, os macrófagos passaram a induzir a expressão de Foxp3 e também de T-bet apenas na população de linfócitos T CD4 (Figura 5B). Curiosamente as células dendriticas, por sua vez, também alteraram drasticamente a indução na expressão dos marcadores 30 dias após. A Figura 5C mostra que nem os linfócitos T CD4 nem T CD8 mostraram expressão dos marcadores avaliados. 39 quantidade relativa A 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 GATA-3 T-bet Foxp3 Linfócitos B + T CD8 quantidade relativa B 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 quantidade relativa 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 T-bet Foxp3 Linfócitos B + T CD4 pcDNA3-HSP65 pcDNA3 GATA-3 T-bet Foxp3 Macrófagos + T CD8 C GATA-3 GATA-3 T-bet Foxp3 células dendríticas + T CD8 GATA-3 T-bet Foxp3 Macrófagos + T CD4 GATA-3 T-bet Foxp3 céulas dendríticas + T CD4 Figura 4. Quantidade relativa de expressão de GATA-3, T-bet e Foxp3 em linfócitos TCD4 e CD8 estimulados com diferentes APCS. Linfócitos T CD4 e CD8 obtidos de baço de animais 15 dias após a imunização com três doses de pcDNA3-HSP65 foram incubados como descrito anteriormente e colocados em cultura com as células apresentadoras de antígeno, previamente eletroporadas na presença apenas de meio, de pcDNA3 ou de pcDNA3-HSP65. As células foram coletadas para a extração de RNA e avaliação da expressão gênica. O aumento de expressão está representado considerando-se a célula eletroporada somente com meio de cultura como padrão. 40 30 dias 2.0 quantidade relativa A 1.5 1.0 GATA-3 T-bet Foxp3 Linfócitos B + T CD8 Foxp3 Linfócitos B + T CD4 pcDNA3-HSP65 pc DNA3 1.5 1.0 GATA-3 T-bet Foxp3 Macrófagos + T CD8 GATA-3 T-bet Foxp3 Macrófagos + T CD4 2.0 quantidade relativa C T-bet 2.0 quantidade relativa B GATA-3 1.5 1.0 GATA-3 T-bet Foxp3 células dendríticas + T CD8 GATA-3 T-bet Foxp3 céulas dendríticas + T CD4 Figura 5. Quantidade relativa de expressão de GATA-3, T-bet e Foxp3 em linfócitos TCD4 e CD8 estimulados com diferentes APCS. Linfócitos T CD4 e CD8 obtidos de baço de animais 30 dias após a imunização com três doses de pcDNA3-HSP65 foram incubados como descrito anteriormente e colocados em cultura com as células apresentadoras de antígeno, previamente eletroporadas na presença apenas de meio, de pcDNA3 ou de pcDNA3-HSP65. As células foram coletadas para a extração de RNA e avaliação da expressão gênica. O aumento de expressão está representado considerando-se a célula eletroporada somente com meio de cultura como padrão. 41 4.4 – Ensaios de transferência celular para animais deficientes de linfócitos B 4.4.1 – Imunofenotipagem de células de memória Baseados nos dados da proliferação, onde as células B se mostraram mais efetivas na ativação principalmente de linfócitos T CD8 e nos dados de real time, onde 30 dias após a vacinação as células B eram capazes de induzir população de célula T CD8 T-bet +, optamos por avaliar a real importância de linfócitos B in vivo, usando modelos de transferência adotiva, em animais deficientes de células B (BKO). Além disso, é o único modelo disponível para avaliar APC nesse sentido. Desse modo, células B foram eletroporadas com pcDNA3-HSP65 e transferidas para os animais deficientes de linfócitos B. Após sete dias da injeção das células, avaliamos o fenótipo das populações T CD4 e T CD8. Podemos observar, pela análise da figura 6, que após a transferência das células B transfectadas com HSP65, houve aumento da população TCD8 CD44hi no baço dos animais deficientes de células B, quando comparados aos animais selvagens (WT). Por outro lado, a porcentagem de células T CD4 com fenótipo CD44hi não mostrou diferença entre os animais WT e animais deficientes de células B. Quando analisamos a expressão de CD62L em células CD44hi notamos também que apenas as células T CD8 apresentaram alta expressão desse marcador nos animais BKO que receberam linfócitos B eletroporados com pcDNA3-HSP65 em relação aos animais selvagens que receberam o mesmo tratamento, ou mesmo quando as células foram eletroporadas com o vetor sem inserto (Figura 7). 42 CD8 CD44 h i 60 * % células 50 C57Bl/6 KO Linfócitos B 40 30 20 10 0 mock pcDNA3 pcDNA3-HSP65 CD4 CD44 h i C57Bl/6 60 % células 50 KO Linfócitos B 40 30 20 10 0 mock pcDNA3 pcDNA3-HSP65 Figura 6. Análise fenotípica de células do baço. Fenotipagem por citometria de fluxo de células do baço de animais sete dias após a transferência adotiva de linfócitos B (1x 106) previamente eletroporados com pcDNA3-hsp65, com o vetor ou apenas meio (mock). p< 0,05 em relação ao animal selvagem (ANOVA seguido de Tukey) 43 B KO + Linfo B B KO + Linfo B pcDNA3 BKO + Linfo B pcDNA3-HSP65 WT + Linfo B WT + Linfo B pcDNA3 WT + Linfo B pcDNA3-HSP65 CD8 % células 15 10 * 5 0 CD44 hi CD62L lo CD44 hi CD62L hi CD4 % células 15 10 5 0 CD44 hi CD62L lo CD44 hi CD62L hi Figura 7. Análise fenotípica de células de memória após transferência adotiva de células B transfectadas com vacina. Fenotipagem por citometria de fluxo de células do baço de animais que receberam transferência adotiva de linfócitos B (1x 106) previamente eletroporados com pcDNA3-hsp65, com o vetor ou apenas meio (mock).*p< 0,05 em relação ao animal selvagem que recebeu linfócitos B eletroporados com pcDNA3 ou pcDNA3-HSP65 (ANOVA seguido de Tukey). 44 4.4.2 – Proteção contra infecção experimental por M. tuberculosis Diante dos resultados obtidos, decidimos testar a capacidade de linfócitos B transfectados in vitro com o pcDNA3-HSP65 em conter a infecção, tanto em animais selvagens como nos deficientes de células B. Comparando-se com os animais selvagens, os animais deficientes de células B que receberam transferência adotiva de linfócitos B transfectados com a vacina, mostraram redução de unidades formadoras de colônia (UFC). Os animais deficientes, reconstituídos com as células eletroporadas com vetor ou o mock, mostraram número de unidades formadoras de colônia (UFC) semelhante ao animal “knockout” que recebeu as células transfectadas com pcDNA3-HSP65. Entre os animais selvagens não houve diferença. (Figura 8). 45 log10 CFU/pulmão 7 6 * 5 4 3 2 1 sp O 65 -B +p cD N B A K 3 O -B +M ei o a 3H K B D N A -S al in B K O -B +p c B K O -V et or O B K B K O -H sp 6 5 0 Figura 8. Determinação das unidades formadoras de colônia (UFC) de Mycobacterium tuberculosis no pulmão dos animais após a transferência adotiva de células B. Animais selvagens ou deficientes de células B receberam, por via endovenosa, 1x 106 células B eletroporados apenas com meio, pcDNA3 ou pcDNA3-HSP65. Sete dias após foram desafiados com 1x 105 micobacterias e após 30 dias foram eutanasiados para retirada do pulmão e detecção da UFC.*p< 0,05 em relação aos grupos de animais selvagens tratados com linfócitos B apenas ou com transfectados pela vacina. 46 Nosso próximo passo foi avaliar o perfil de citocinas das células pulmonares nos animais que receberam ou não a transferência adotiva de linfócitos B e que foram, posteriormente, desafiados com Mtb. Assim optamos por avaliar as principais citocinas do padrão Th1 e Th2, na tentativa de correlacionar esses dados com a proteção observada pela UFC. Após 30 dias, o perfil de citocinas mostra que a produção de IL-12 pelos animais deficientes de células B e selvagens não mostrou diferença estatisticamente significante entre si, quando estimulados com o lisado de Mtb ou com proteína HSP65 (Figuta 9A). Interessantemente, a produção de IFN- γ , (Figura 9A) e TNF-α (Figura 9B) só foi observada nas células pulmonares dos animais selvagens em resposta ao em estímulo ao lisado de Mtb. A produção após a transferência de células B eletroporadas não mostrou significância quando comparado ao estímulo de micobatéria ou animais selvagens. A produção de IL10 também se mostrou semelhante em ambos os grupos, após o estímulo com lisado de Mtb (Figura 9B), embora, novamente, a transferência de linfócitos B não levou a procudução significativa das citocinas avaliadas. Não foi possível a detecção de IL-5 em nenhumas das amostras (dados não mostrados). 47 IL-12 2250 * 2000 1750 * pg/ml 1500 * 1250 1000 750 500 250 0 BKO meio BKO vetor BKO hsp65 WT meio WT vetor WT hsp65 WT branco meio rHSP65 Mtb IFN-γγ 45000 * 40000 * * 35000 pg/ml 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 BKO meio BKO vetor BKO hsp65 WT meio WT vetor WT hsp65 WT branco Figura 9A. Produção de IL-12 e IFN-γγ no sobrenadante de cultura de células do pulmão, que receberam células B e foram desafiados com M. tuberculsois. Os animais foram imunizados com linfócitos B eletroporados apenas com meio, pcDNA3 ou pcDNA3-HSP65 e transferidos, por via endovenosa, para animais defecientes ou não de células B. Após sete dias foram desafiados com M. tuberculosis e eutanasiados trinta dias após a infecção para retirada do pulmão. As células pulmonares foram colocadas em cultura na presença de proteína HSP65 recombinante (rHSP65) ou lisado de micobactéria (Mtb). Após 48 horas o sobrenadante foi coletado para dosagem de citocinas. * p< 0,05 em relação as células que não receberam estímulo (meio) em cada grupo. 48 IL-10 1200 1100 * * * 1000 900 pg/ml 800 * 700 * 600 500 400 300 200 100 0 BKO meio BKO vetor BKO hsp65 WT meio WT vetor WT hsp65 WT branco meio rHSP65 Mtb TNF-α α 55 50 45 40 pg/ml 35 30 25 20 15 10 5 0 BKO meio BKO vetor BKO hsp65 WT meio WT vetor WT hsp65 WT branco Figura 9B. Detecção de IL-10 e TNF-α α no sobrenadante de cultura de células do pulmão, que receberam células B e foram desafiados com M. tuberculsois. Os animais foram imunizados com linfócitos B eletroporados apenas com meio, pcDNA3 ou pcDNA3-HSP65 e transferidos, por via endovenosa, para animais defecientes ou não de células B. Após sete dias foram desafiados com M. tuberculosis e eutanasiados trinta dias após a infecção para retirada do pulmão. As células pulmonares foram colocadas em cultura na presença de proteína HSP65 recombinante (rHSP65) ou lisado de micobactéria (Mtb). Após 48 horas o sobrenadante foi coletado para dosagem de citocinas. * p< 0,05 em relação as células que não receberam estímulo (meio) em cada grupo. 49 A análise histológica do pulmão, realizada no mesmo dia da retirada de células para avaliação das citocinas, mostrou uma nítida diferença do padrão inflamatório dos animais selvagens e os deficientes de linfócitos B. Os animais selvagens apresentaram uma inflamação mais localizada, sem grandes diferenças entre os três grupos experimentais (Figura 10). Já os animais deficientes de células B apresentaram um maior infiltrado inflamatório e de aspecto mais difuso, principalmente os animais que receberam linfócitos B transfectados com a vacina pcDNA3-HSP65, com aproximadamente 90% do parênquima comprometido. A transferência de céulas B transfectadas apenas com o vetor também causou infiltrado inflamatório, enquanto que os linfócitos B não transfectados induziram menos inflamação (50-60%), com uma tendência de reação multifocal mais parecida com os animais selvagens. (Figura 11) 50 WT – B+pcDNA3-HSP65 WT – B+pcDNA3 WT – B+meio Não infectado Figura 10. Cortes histológicos de pulmão de animais selvagens após a transferência adotiva e desafio com micobactéria. Após obtenção dos pulmões, os mesmos foram submetidos a tratamento adequado e os cortes corados por hematoxilina-eosina e analisados em microscópio óptico. Foto com aumento 100x. 51 BKO – B+pcDNA3-HSP65 BKO – B+pcDNA3 BKO – B+meio Não infectado Figura 11. Cortes histológicos de pulmão de animais deficienetes de células B, após transferência adotiva e desafio com micobacteria. Após obtenção dos pulmões, os mesmos foram submetidos a tratamento adequado e os cortes corados por hematoxilina-eosina e analisados em microscópio óptico. Foto com aumento 100x. 52 5 - DISCUSSÃO Os resultados apresentados nesse trabalho mostram que após a vacinação com DNA plasmidial, pela via intramuscular, ocorre ativação de linfócitos T CD4 e T CD8 antígeno específicos, cuja cinética se altera no decorrer do processo de vacinação. Baseado nos ensaios in vitro, o tipo de célula apresentadora de antígeno envolvida na estimulação desse linfócito parece desempenhar papel crucial no seu desenvolvimento. Além disso, esse trabalho mostra a importância dos linfócitos B nesse tipo de estratégia vacinal, quer seja como APC ou com ação de imunorregulação. A resposta imune induzida após a vacinação com DNA plasmidial, de modo geral, pressupõe que após a entrada do plasmídeo em uma célula eucariótica, o mesmo seja transcrito e traduzido. Do ponto de vista imunológico, a indução da resposta imune ocorreria de forma eficiente se o DNA plasmidial fosse capturado, principalmente, por células apresentadoras de antígeno profissionais (Gurunathan, Klinman et al., 2000). Dessa forma, optamos por avaliar in vitro, inicialmente, a influência da APC na ativação de linfócitos T CD4 e T CD8 préestimulados in vivo, após o processo de vacinação. Em nossos primeiros experimentos, as diferentes células apresentadoras de antígeno foram estimuladas in vitro com DNA plasmidial e, após diferentes tempos, irradiadas e colocadas frentes a linfócitos TCD4 ou TCD8 provenientes dos animais vacinados, cuja última dose ocorrera quinze dias antes. A capacidade de apresentação antigênica foi avaliada por linfoproliferação medida pela incorporação de timidina tritiada e produção de interleucina 2. No entanto, em 53 todos ensaios realizados, não houve proliferação dos linfócitos induzida por nenhuma célula apresentadora. Como a viabilidade celular dos linfócitos T CD4 e T CD8 foi checada antes da incubação, excluímos a possibilidade que a morte dos mesmos pudesse ser responsável pela ausência de proliferação. Por outro lado, os lotes de timidina muitas vezes apresentam problemas, ou mesmo o processo de irradiação pode ter interferido com os resultados. Acreditamos que alguma alteração nesse sentido foi responsável pelos dados negativos obtidos (dados não mostrados). Optamos, então, pelo ensaio usando a coloração com CFSE. Quinze dias após a terceira imunização com pcDNA3-HSP65, os animais foram eutanasiados para obtenção dos linfócitos T CD4 e CD8 HSP65 específicos. Esses linfócitos T, quando colocados frente a células apresentadoras de antígeno, eletroporadas com o plasmídeo contendo o gene para HSP65, não foram capazes de proliferar (Figura 2), sugerindo que nessa fase ainda não há um número substancial de células T CD4 ou CD8 HSP65 específicas para reestímulo in vitro. A hipótese de que a não responsividade das células T poderia ser decorrente da não expressão da HSP65 pelas APCS pode ser descartada, desde que nos experimentos de 30 dias observou-se a proliferação de células T (Figura 3). Ao analisarmos o padrão de expressão de marcadores nessas células, observamos que tanto linfócitos B como células dendríticas induziram preferencialmente a ativação de uma população de linfócitos T CD4 com marcador para Foxp3, porém um menor numero de células também estava comprometida com a expressão de GATA 3 e T-bet (quando a APC foi célula B) (Figura 4). Assim, curiosamente, podemos inferir que nessa fase pós vacinação, as células T CD4 predominantes são do tipo T reguladoras (Treg), o que poderia 54 explicar a ausência da linfoproliferação observada na figura 2. Interessantemente, nessa fase, a população de T CD8 foi mais ativada por células B e exibiram maior expressão do fator GATA3. Macrófagos nessa fase não induziram a expressão de nenhum dos marcadores usados (Figura 4). Em conjunto, nossos resultados sugerem um cenário oposto ao esperado, após 15 da ultima dose vacinal. Nesse período, pelos dados de literatura, esperava-se que a maioria das células T ativadas apresentassem um padrão de resposta do tipo Th1, no entanto, nossos dados mostram que nessa fase os linfócitos TCD4 HSP65 específicos mostram populações comprometidas com o padrão Th2 e Th1 (GATA 3 e T-bet, respectivamente), podendo ser caracterizado como um padrão misto de resposta, o que muitas vezes se reflete nos isotipos de imunoglobulinas encontrados. No entanto, surpreendentemente, a maior população de células T CD4 parece ser do tipo regulatória, ou Treg. O aumento de células Treg foi vista nessa fase, principalmente, quando estimulada por células B. Embora não tenhamos dados suficientes, podemos sugerir que a presença de altas doses de DNA, com motivos CpGs, leva a uma estimulação inespecífica, cuja ação das células Treg seria necessária. Do ponto de vista da vacinologia esses fatos trazem implicações importantes, principalmente quando o desafio é feito 15 dias depois. No cenário que mostramos a chance de uma resposta imune efetora eficiente fica comprometida se a intenção é a proteção conferida por um padrão Th1. Nesse caso, um tempo maior entre a última imunização pode ser preferencial. Trinta dias após o processo de imunização, tanto os macrófagos quanto os linfócitos B, foram capazes de induzir proliferação dos linfócitos T CD4 e CD8. 55 Porém, um fato que nos chamou a atenção foi que as células dendríticas não foram eficientes em induzir a linfoproliferação das células específicas, obtidas nesse período (Figura 3). Embora o processo de eletroporação possa ser mais drástico para um tipo celular do que para outro, acreditamos que a ausência de linfoproliferação não seja devido a tal fato. As evidências que suportam nossa hipótese são: a) embora não estatisticamente significante, houve indução proliferação células T CD8 (Figura 3) e indução de marcadores celulares (Figura 4); b) o protocolo de eletroporação é o mesmo usado em diferentes trabalhos (Ribas, 2005; Artusio, Hathaway et al., 2006; Landi, Babiuk et al., 2007). Desse modo, a partir de nossos dados in vitro podemos inferir que, 30 dias após a vacinação, as principais células envolvidas na apresentação de antígeno são as células B e macrófagos, induzindo a linfoproliferação de ambas as populações de linfócitos T. Além disso, os dados da figura 5 mostram que aos 30 dias após a vacinação os linfócitos HSP65 específicos, quando estimulados por linfócitos B, in vitro, apresentavam um compromentimento com padrão Th1, devido a expressão de T-bet, enquanto os linfócitos T CD4 quando estimulados por macrófagos apresentavam aumento relativo na expressão de Foxp3, possivelmente atuando como célula T reguladora nesse período também. As células dendríticas nessa fase parecem não participar efetivamente da manutenção da população de células T. Esses dados podem servir como base para delineamentos experimentais em vacinologia, onde a alteração da data de desafio pode comprometer toda a resposta imune protetora. Do ponto de vista vacinal, esses resultados mostram dados inéditos e que podem esclarecer alguns mecanismos em vacinas de DNA e/ou levar a 56 intervenções mais eficazes, com uso de menores doses desafio, uso de sistemas de liberação controlada ou mesmo o tempo decorrido entre o final da vacinação e o desafio. Assim, extrapolando nossos resultados para outros modelos de vacinas de DNA, quando o desafio é dado após sete ou 14 dias após a última dose, o microambiente não estará propício para o desenvolvimento de uma resposta imunitária, pois a população de células T CD4 seria do tipo T reguladora, quer seja estimulada por uma célula B ou por uma célula dendrítica. Como as células Tregs estão associadas ao controle da resposta imune, alguns autores têm mostrado a presença de Treg regulando a população de células T CD8 de memória contra o vírus do herpes simples (Toka, Suvas et al., 2004). Além disso, no período citado, as células dendríticas ativam populações T CD4 que apresentam a expressão de GATA-3+ e Foxp3, comprometidas com a repsota Th2 e regulatória, o que culminaria num microambiente mais regulador do que indutor da resposta imune. Assim, como já comentado, essa fase não seria a ideal para se verificar a eficácia de uma vacina de DNA para microorganismos que precisam de ação de Th1 para controle. Por outro lado, após 30 dias, o microambiente embora continue apresentando células T CD4 com perfil de T reguladoras após estímulo com macrófago, apresentam também células T CD8 induzidas por linfócitos B (Figura 5). A presença de células Treg nessa fase pode tanto inibir a eficácia da vacina, como controlar uma resposta imune exacerbada. Interessantemente, como a maioria dos desafios são realizados 30 dias ou mais após a ultima dose, é possível que a presença de linfócitos TCD8-Tbet+ atue como efetores da resposta Th1. No entanto, a presença de linfócitos TCD4 Foxp3+, nessa mesma fase, deve ser levada em consideração tanto do ponto de vista do controle de uma resposta 57 exacerbada, como na inibição da ação das células Th1. Assim, somente após um delineamento experimental com o uso da construção vacinal em questão, poderá se estabelecer o melhor esquema vacinal. Nos dados apresentados até o momento, três fenômenos chamam a atenção: a) após a vacinação com DNA plasmidial, pela via intramuscular, o padrão ou fenótipo da célula T proveniente do baço a ser ativada parece depender da APC que o ativará; b) diferentes APCs participam mais ativamente em determinadas fase pós- vacinação e c) linfócitos B podem fazer apresentação cruzada (cross priming ), ativando linfócitos T CD8+. A ativação por cross priming é um fenômeno comum em células dendríticas (Brode e Macary, 2004), e também foi observada em nossos dados após 30 dias da vacinação, mas não aos 15 dias. Assim, durante a ativação da resposta imune por vacinas de DNA, veiculadas nu e por via intarmuscular, parece que todas as APCS são capazes de desempenhar o cross priming, amplificando a resposta imunitária. Aqui cabe ressaltar que o antígeno utilizado é uma proteína de choque térmico e esse tipo de antígeno tem envolvimento direto com crosspriming (Srivastava, 2002). Assim, não podemos excluir que tais características de apresentação cruzada sejam ligadas apenas à vacinação de DNA e a rota e dose utilizadas. Do ponto de vista das células B, elas são as únicas que participam da indução dos linfócitos quer seja aos 15 ou 30 dias após a vacinação, sugerindo um envolvimento efetivo nesse tipo de vacinação. Coelho-Castelo et al (2003) mostraram que após a imunização intramuscular, o DNA poderia ser capturado e expresso também por linfócitos B. Na época levantou-se a hipótese de que células 58 B pudessem participar como APC após a vacinação com DNA plasmideal. Os dados mostrados nesse trabalho comprovam a hipótese aventada e, além disso, mostram que as células B podem também participar de mecanismos de apresentação cruzada desde que foi capaz de estimular in vitro células T CD8. Esse resultado é interessante, pois até o momento as células envolvidas em apresentação cruzada nesse modelo, eram macrófagos e células dendríticas (Gurunathan, Klinman et al., 2000; Liu, Wahren et al., 2006) Os linfócitos B participam ativamente durante a indução da ativação de linfócitos T e, aos 30 dias, pode-se perceber que como APC induz células do padrão Th1, sendo assim um componente importante na indução da resposta imunitária, após a vacinação com DNA plasmidial. Em geral, a ativação de célula CD8 é dependente de CD4 (Castiglioni, Gerloni et al., 2005). No caso específico das vacinas de DNA é de se esperar uma ativação maior de linfócitos T CD8, uma vez que o antígeno é endógeno. No entanto, mesmo nesse modelo, a ativação de CD4 também ocorre, conforme revisto por Guranathan et al. (2000). A linfoproliferação observada em nossos experimentos demonstra que os macrófagos levam a indução de um maior número de células CD8, quando comparada à proliferação de células CD4. O mesmo ocorreu com linfócitos B e células dendríticas (Figura 3). Assim esse mecanismo não parece ser decorrente apenas da APC envolvida, mas ser uma característica das vacinas de DNA. Esses dados são importantes pois sugerem que a vacinação gênica pode apresentar eficácias distintas de proteção em função do patógeno em questão ser intracelular ou extracelular. Além disso a construção da vacina de DNA também pode levar a resultados distintos dos aqui obtidos, uma vez que a 59 estrutura da molécula de DNA plasmidial ativa a resposta imune inata que vai ser refletida na resposta imune adaptativa. Desde que as células B estavam envolvidas na indução de linfoproliferação nos dois períodos avaliados, optamos por avaliar a sua participação como APC in vivo, usando animais deficientes de células B. Desse modo, as células B foram eletroporadas, como já descrito nos ensaios de apresentação de antígeno no item 3.9.1, e transferidas para animais deficientes ou não de células B. Pela análise da figura 6, podemos observar que não houve diferença na porcentagem de células T CD4 com fenótipo CD44hi entre os animais selvagens e animais deficientes de células B, sete dias após a transferência adotiva. O mesmo não foi observado para as células CD8, onde se observa um aumento da porcentagem de linfócitos TCD8 CD44hi no baço dos animais deficientes de células B, após a transferência adotiva, quando comparados aos animais selvagens (Figura 6). Quando analisamos a expressão de CD62L nessa população, notamos também que apenas as células T CD8 apresentaram alta expressão desse marcador nos animais “knockout” que receberam linfócitos B eletroporados com pcDNA3-HSP65 em relação aos animais selvagens que receberam o mesmo tratamento (ou mesmo quando as células foram eletroporadas com o vetor sem inserto) (Figura 7). Esses resultados sugerem que a transferência de células B agindo como APCs in vivo apresentam antígeno preferencialmente para linfócitos T CD8, induzindo, principalmente, a geração de uma população de memória antígeno específica contra o antígeno em questão. Assim, podemos aventar a hipótese de que os linfócitos B atuem como APC após processos de vacinação com DNA plasmideal. No entanto, como os linfócitos já estavam transfectados, favorecendo sua atuação como APC, durante o 60 curso da vacinação normal, outras células podem capturar o antígeno e agir como APCs, contudo esse fato não invalida a sugestão de que in vivo, linfócitos B atuem como APC no modelo de vacinas gênicas, contribuindo para a modulação de linfócitos T observada. A geração de células TCD8 com fenótipo de memória de 3 a 7 dias após a imunização também tem sido observada por outros autores (Joshi, Cui et al., 2007; Kedzierska, Stambas et al., 2007). Isso indica que, como visto com outras APCs e desafios, células B e vacinação com DNA plasmideal podem gerar microambiente propício para indução da proteção. Nossos resultados de memória estão de acordo com os de Castiglioni e col. (2004) que mostraram a indução de células CD8 de memória após transferência de linfócitos B trangênicas para epítopo do citomegalovirus. O aumento de células TCD4 e TCD8 nos animais que receberam apenas células B eletroporadas (mock) nos chamou a atenção desde o início e, atualmente, pode ser considerado como um artefato da técnica. Recentemente foi demonstrado que o cultivo das células, a serem transferidas adotivamente, em meio contendo soro fetal bovino levava a indução de células T responsivas aos antígenos contidos no soro fetal bovino e que, provavelmente, eram ativadas in vivo, por reconhecimento específico ou de reação cruzada (Rubakova, Petrovskaya et al., 2007). Rubakova e col. mostraram ainda que a manutenção das células a serem eletroporadas em soro de camundongo normal diminuía o efeito de linfoproliferação vistos nos animais que recebiam apenas as células mock. Dessa forma os resultados obtidos em nossos experimentos com as células mock não 61 invalidam os obtidos com as células transfectadas e transferidas para os animais deficientes ou não de células B. Com base nos dados da transferência adotiva de células B eletroporadas na geração de células de memória, optamos por avaliar a participação indireta dessa memória após o desafio com M. tuberculosis. A participação de células B na proteção contra a tuberculose experimental tem se mostrado controversa na literatura (Taylor, Ordway et al., 2005; Maglione, Xu et al., 2007). Um dos desafios em conciliar os dados obtidos é decorrente dos modelos utilizados, usando diferentes cepas e/ou vias de infecção, o que dificulta uma comparação mais acurada. Assim, lançando mão do nosso modelo, onde observávamos a indução de células T CD8 de memória por linfócitos B, realizamos os experimentos de profilaxia contra a tuberculose experimental. A figura 8 mostra que quando os animais selvagens receberam células B transfectadas ou não com pcDNA3-HSP65 o número de UFC não se alterou. Por outro lado, quando os animais deficientes de células B receberam células transfectadas com pcDNA3-HSP65 houve uma redução estatisticamente significante no numero de UFC recuperado, sugerindo que a as células CD8 de memória induzidas por esses linfócitos estariam lisando a micobactéria. Infelizmente, nossos ensaios de citotoxicidade não se mostraram conclusivos (dados não mostrados). Utilizamos um kit colorimétrico da Roche baseado na ação da lactato desidrogenase. Seguindo o protocolo do kit não nos foi possível obter um resultado claro, desde que o meio já induzia lise. A substituição do soro fetal bovino por BSA 1% nas culturas reduziu, mas não eliminou o backgroud. 62 No entanto, se analisarmos em conjunto apenas os animais deficientes que receberam a transferência adotiva nas diferentes situações e posteriormente foram desafiados, eles apresentaram redução da UFC. Embora paradoxal, esses resultados sugerem a importância das células B reguladoras (Bregs) nos resultados obtidos. O papel destas células reguladoras tem sido debatido mais recentemente, podendo agir como reguladoras por diferentes mecanimos. A ação final, no entanto, é o controle da inflamação (Mizoguchi e Bhan, 2006; Lin, Peacock et al., 2007). Interessantemente, como a purificação de células B foi realizada por seleção negativa usando anticorpo anti-CD43, não purificamos células B com fenótipo de regulatórias, desde que esse tipo celular expressa esse marcador (Mizoguchi e Bhan, 2006). Desse modo, ao transferirmos as células B transfectadas, estávamos transferindo apenas a população de linfócitos B destituída das células que poderiam apresentar um papel imuorregulador in vivo. Isso é evidenciado pelas análises histológicas, no grupo que recebeu células transfectadas com HSP65. Embora o número de UFC esteja reduzido, o pulmão estava com 90% de lesão inflamatória (Figura 11). Comparado aos animais selvagens, cuja UFC não diminui significativamente, a lesão nesses últimos foi bem mais restrita com aproximadamente 50 a 70 % (Figura 10). Esperávamos uma diminuição da UFC também nos animais selvagens, a despeito dessa cepa de camundongo ser mais resistente a infecção com M. tuberculosis. Não observamos diminuição nas UFC dos animais selvagens que receberam células B transfectadas com gene da HSP65. Uma hipótese para explicar esses resultados pode ser atribuída ao fato de que, ao fazermos a transferência adotiva de células B eletroporadas, em animais com o pool de 63 células B normais, a ação das transfectadas podia ficar diluído e não levar ao efeito desejado. Além disso, para equilibrar o pool normal de células é provável que ocorra uma homeostase com lise de células em excesso. Contudo, esses dados nos permitem inferir que nos animais selvagens, onde a população de linfócitos B estava completa, as células Bregs conseguiram conter parcialmente a inflamação, o que não ocorria no grupo knockout, como pode ser evidenciado nas análises histológicas (Figuras 10 e 11). No entanto, novas abordagens se fazem necessárias para confirmar tal hipótese. Embora, na maioria dos casos, a análise de citocinas após a infecção com M. tuberculosis se mostre de difícil interpertação, optamos por avaliar algumas citocinas chaves no modelo da transferência adotiva com posterior desafio. Embora os dados histológicos mostrem quadros de lesão inflamatória em maior ou menor grau, as dosagens das citocinas não mostraram um perfil que pudéssemos associar aos dados já obtidos (Figura 9). Os animais responderam preferencialmente ao lisado de M. tuberculosis, indicando que a infecção per si, mascara os dados que poderiam ser obtidos após transferência adotiva. Nossos dados com relação a participação de B e a cinética de ativação de células T após a imunização intramuscular são inéditos e servem como base para novas abordagens bem como para delineamentos experimentais que resultem em proteção mais efetiva contra o patógeno em questão. 64 6 - CONCLUSÕES Esse trabalho nos permite concluir que: - Durante a vacinação intramuscular com a vacina de DNA pcDNA-HSP65, ocorre uma cinética de ativação de células T CD4 e T CD8 com fenótipos diferentes dependendo do tempo após a última imunização; - in vitro, diferentes populações de APCs foram capazes de induzir populações de linfócitos T HSP65 específicas, sugerindo que, in vivo, a participação da APC desempenha papel importante na ativação ou modulação da resposta imune; - Células B participam como apresentadoras de antígeno in vitro e in vivo, induzindo preferencialmente a ativação de linfócitos T CD8 com fenótipo de memória; - A transferência adotiva de células B eletroporadas com a vacina para animais deficientes de células B reduziu o numero de UFC, porém levou a um aumento na lesão inflamatória do pulmão. 65 7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Artusio, E., B. Hathaway, et al. Transfection of human monocyte-derived dendritic cells with native tumor DNA induces antigen-specific T-cell responses in vitro. Cancer Biol Ther, v.5, n.12, Dec, p.1624-31. 2006. Bonato, V. L., V. M. Lima, et al. Identification and characterization of protective T cells in hsp65 DNA-vaccinated and Mycobacterium tuberculosis-infected mice. Infect Immun, v.66, n.1, Jan, p.169-75. 1998. Brode, S. e P. A. Macary. Cross-presentation: dendritic cells and macrophages bite off more than they can chew! Immunology, v.112, n.3, Jul, p.345-51. 2004. Capone, S., I. Zampaglione, et al. Modulation of the immune response induced by gene electrotransfer of a hepatitis C virus DNA vaccine in nonhuman primates. J Immunol, v.177, n.10, Nov 15, p.7462-71. 2006. Castiglioni, P., M. Gerloni, et al. CD8 T cell priming by B lymphocytes is CD4 help dependent. Eur J Immunol, v.35, n.5, May, p.1360-70. 2005. Castiglioni, P., M. Gerloni, et al. Genetically programmed B lymphocytes are highly efficient in inducing anti-virus protective immunity mediated by central memory CD8 T cells. Vaccine, v.23, n.5, Dec 16, p.699-708. 2004. Cella, M., A. Engering, et al. Inflammatory stimuli induce accumulation of MHC class II complexes on dendritic cells. Nature, v.388, n.6644, Aug 21, p.782-7. 1997. Coelho-Castelo, A. A., R. R. Santos Junior, et al. B-lymphocytes in bone marrow or lymph nodes can take up plasmid DNA after intramuscular delivery. Hum Gene Ther, v.14, n.13, Sep 1, p.1279-85. 2003. 66 Coelho-Castelo, A. A., A. P. Trombone, et al. Tissue distribution of a plasmid DNA encoding Hsp65 gene is dependent on the dose administered through intramuscular delivery. Genet Vaccines Ther, v.4, p.1. 2006. Corr, M., D. J. Lee, et al. Gene vaccination with naked plasmid DNA: mechanism of CTL priming. J Exp Med, v.184, n.4, Oct 1, p.1555-60. 1996. Crawford, A., M. Macleod, et al. Primary T cell expansion and differentiation in vivo requires antigen presentation by B cells. J Immunol, v.176, n.6, Mar 15, p.3498-506. 2006. De Paula, L., C. L. Silva, et al. Comparison of different delivery systems of DNA vaccination for the induction of protection against tuberculosis in mice and guinea pigs. Genet Vaccines Ther, v.5, p.2. 2007. Doe, B., M. Selby, et al. Induction of cytotoxic T lymphocytes by intramuscular immunization with plasmid DNA is facilitated by bone marrow-derived cells. Proc Natl Acad Sci U S A, v.93, n.16, Aug 6, p.8578-83. 1996. Dupuis, M., K. Denis-Mize, et al. Distribution of DNA vaccines determines their immunogenicity after intramuscular injection in mice. J Immunol, v.165, n.5, Sep 1, p.2850-8. 2000. Filaci, G., M. Gerloni, et al. Spontaneous transgenesis of human B lymphocytes. Gene Ther, v.11, n.1, Jan, p.42-51. 2004. Fynan, E. F., H. L. Robinson, et al. Use of DNA encoding influenza hemagglutinin as an avian influenza vaccine. DNA Cell Biol, v.12, n.9, Nov, p.785-9. 1993. Gerloni, M., M. Rizzi, et al. T cell immunity using transgenic B lymphocytes. Proc Natl Acad Sci U S A, v.101, n.11, Mar 16, p.3892-7. 2004. 67 Gurunathan, S., D. M. Klinman, et al. DNA vaccines: immunology, application, and optimization*. Annu Rev Immunol, v.18, p.927-74. 2000. Heit, A., K. M. Huster, et al. CpG-DNA aided cross-priming by cross-presenting B cells. J Immunol, v.172, n.3, Feb 1, p.1501-7. 2004. Hon, H., A. Oran, et al. B lymphocytes participate in cross-presentation of antigen following gene gun vaccination. J Immunol, v.174, n.9, May 1, p.5233-42. 2005. Howarth, M. e T. Elliott. The processing of antigens delivered as DNA vaccines. Immunol Rev, v.199, Jun, p.27-39. 2004. Huygen, K. DNA vaccines: application to tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis, v.2, n.12, Dec, p.971-8. 1998. Huygen, K. Plasmid DNA vaccination. Microbes Infect, v.7, n.5-6, May, p.932-8. 2005. Joshi, N. S., W. Cui, et al. Inflammation directs memory precursor and short-lived effector CD8(+) T cell fates via the graded expression of T-bet transcription factor. Immunity, v.27, n.2, Aug, p.281-95. 2007. Kedzierska, K., J. Stambas, et al. Location rather than CD62L phenotype is critical in the early establishment of influenza-specific CD8+ T cell memory. Proc Natl Acad Sci U S A, v.104, n.23, Jun 5, p.9782-7. 2007. Krieg, A. M. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects. Annu Rev Immunol, v.20, p.709-60. 2002. Landi, A., L. A. Babiuk, et al. High transfection efficiency, gene expression, and viability of monocyte-derived human dendritic cells after nonviral gene transfer. J Leukoc Biol, v.82, n.4, Oct, p.849-60. 2007. 68 Langlade-Demoyen, P., F. Garcia-Pons, et al. Role of T cell help and endoplasmic reticulum targeting in protective CTL response against influenza virus. Eur J Immunol, v.33, n.3, Mar, p.720-8. 2003. Latz, E., A. Schoenemeyer, et al. TLR9 signals after translocating from the ER to CpG DNA in the lysosome. Nat Immunol, v.5, n.2, Feb, p.190-8. 2004. Leutenegger, C. M., F. S. Boretti, et al. Immunization of cats against feline immunodeficiency virus (FIV) infection by using minimalistic immunogenic defined gene expression vector vaccines expressing FIV gp140 alone or with feline interleukin-12 (IL-12), IL-16, or a CpG motif. J Virol, v.74, n.22, Nov, p.10447-57. 2000. Lima, K. M., S. A. Dos Santos, et al. Efficacy of DNA-hsp65 vaccination for tuberculosis varies with method of DNA introduction in vivo. Vaccine, v.22, n.1, Dec 8, p.49-56. 2003. Lima, K. M., S. A. Santos, et al. Single dose of a vaccine based on DNA encoding mycobacterial hsp65 protein plus TDM-loaded PLGA microspheres protects mice against a virulent strain of Mycobacterium tuberculosis. Gene Ther, v.10, n.8, Apr, p.678-85. 2003. Lin, S. J., C. D. Peacock, et al. Programmed death-1 (PD-1) defines a transient and dysfunctional oligoclonal T cell population in acute homeostatic proliferation. J Exp Med, v.204, n.10, Oct 1, p.2321-33. 2007. Liu, M. A., B. Wahren, et al. DNA vaccines: recent developments and future possibilities. Hum Gene Ther, v.17, n.11, Nov, p.1051-61. 2006. Lowrie, D. B., C. L. Silva, et al. Protection against tuberculosis by a plasmid DNA vaccine. Vaccine, v.15, n.8, Jun, p.834-8. 1997. Lowrie, D. B., R. E. Tascon, et al. Therapy of tuberculosis in mice by DNA vaccination. Nature, v.400, n.6741, Jul 15, p.269-71. 1999. 69 Luo, D. e W. M. Saltzman. Synthetic DNA delivery systems. Nat Biotechnol, v.18, n.1, Jan, p.33-7. 2000. Maglione, P. J., J. Xu, et al. B cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis. J Immunol, v.178, n.11, Jun 1, p.7222-34. 2007. McDonough, K. A. e Y. Kress. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun, v.63, n.12, Dec, p.4802-11. 1995. Mizoguchi, A. e A. K. Bhan. A case for regulatory B cells. J Immunol, v.176, n.2, Jan 15, p.705-10. 2006. Onodera, S., S. Ohshima, et al. A novel DNA vaccine targeting macrophage migration inhibitory factor protects joints from inflammation and destruction in murine models of arthritis. Arthritis Rheum, v.56, n.2, Feb, p.521-30. 2007. Pertmer, T. M., M. D. Eisenbraun, et al. Gene gun-based nucleic acid immunization: elicitation of humoral and cytotoxic T lymphocyte responses following epidermal delivery of nanogram quantities of DNA. Vaccine, v.13, n.15, p.1427-30. 1995. Poland, G. A., D. Murray, et al. New vaccine development. Bmj, v.324, n.7349, Jun 1, p.1315-9. 2002. Ribas, A. Genetically modified dendritic cells for cancer immunotherapy. Curr Gene Ther, v.5, n.6, Dec, p.619-28. 2005. Rivera, A., C. C. Chen, et al. Role of B cells as antigen-presenting cells in vivo revisited: antigen-specific B cells are essential for T cell expansion in lymph nodes and for systemic T cell responses to low antigen concentrations. Int Immunol, v.13, n.12, Dec, p.1583-93. 2001. 70 Rizzuto, G., M. Cappelletti, et al. Efficient and regulated erythropoietin production by naked DNA injection and muscle electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A, v.96, n.11, May 25, p.6417-22. 1999. Rodriguez-Pinto, D. B cells as antigen presenting cells. Cell Immunol, v.238, n.2, Dec, p.67-75. 2005. Rodriguez-Pinto, D. e J. Moreno. B cells can prime naive CD4+ T cells in vivo in the absence of other professional antigen-presenting cells in a CD154-CD40dependent manner. Eur J Immunol, v.35, n.4, Apr, p.1097-105. 2005. Rosada, R. S. Vacina de DNA pVAX-HSP65 contra a tuberculose experimental, veiculada por diferentes construções lipossomais, apresenta proteção dependente da dose e rota de administração. Dissertação de mestrado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Ribeirão Preto, 2006. Rubakova, E., S. Petrovskaya, et al. Specificity and efficacy of dendritic cellbased vaccination against tuberculosis with complex mycobacterial antigens in a mouse model. Tuberculosis (Edinb), v.87, n.2, Mar, p.134-44. 2007. Sallusto, F., M. Cella, et al. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocompatibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. J Exp Med, v.182, n.2, Aug 1, p.389-400. 1995. Santos-Junior, R. R., A. Sartori, et al. Immunomodulation and protection induced by DNA-hsp65 vaccination in an animal model of arthritis. Hum Gene Ther, v.16, n.11, Nov, p.1338-45. 2005. Silva, C. L., M. F. Silva, et al. Characterization of T cells that confer a high degree of protective immunity against tuberculosis in mice after vaccination with tumor cells expressing mycobacterial hsp65. Infect Immun, v.64, n.7, Jul, p.24007. 1996. 71 Simons, F. E., Y. Shikishima, et al. Selective immune redirection in humans with ragweed allergy by injecting Amb a 1 linked to immunostimulatory DNA. J Allergy Clin Immunol, v.113, n.6, Jun, p.1144-51. 2004. Srivastava, P. Interaction of heat shock proteins with peptides and antigen presenting cells: chaperoning of the innate and adaptive immune responses. Annu Rev Immunol, v.20, p.395-425. 2002. Stasney, J., A. Cantarow, et al. Production of neoplasms by injection of fractions of mammalian neoplasms. Cancer Res, v.10, n.12, Dec, p.775-82. 1950. Tang, D. C., M. Devit, et al. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature, v.356, n.6365, Mar 12, p.152-4. 1992. Taylor, J. L., D. J. Ordway, et al. Factors associated with severe granulomatous pneumonia in Mycobacterium tuberculosis-infected mice vaccinated therapeutically with hsp65 DNA. Infect Immun, v.73, n.8, Aug, p.5189-93. 2005. Toka, F. N., S. Suvas, et al. CD4+ CD25+ T cells regulate vaccine-generated primary and memory CD8+ T-cell responses against herpes simplex virus type 1. J Virol, v.78, n.23, Dec, p.13082-9. 2004. Torres, C. A., A. Iwasaki, et al. Differential dependence on target site tissue for gene gun and intramuscular DNA immunizations. J Immunol, v.158, n.10, May 15, p.4529-32. 1997. Trombone, A. P., C. L. Silva, et al. Tissue distribution of DNA-Hsp65/TDMloaded PLGA microspheres and uptake by phagocytic cells. Genet Vaccines Ther, v.5, n.1, Sep 20, p.9. 2007. Trombone, A. P. F. Endocytosis of DNA-Hsp65 Alters the pH of the Late Endosome/Lysosome and Interferes with Antigen Presentation. PLoS ONE, v.2, n.9, p.e923. 2007. 72 Tudor, D., C. Dubuquoy, et al. TLR9 pathway is involved in adjuvant effects of plasmid DNA-based vaccines. Vaccine, v.23, n.10, Jan 26, p.1258-64. 2005. Ulmer, J. B., J. J. Donnelly, et al. Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein. Science, v.259, n.5102, Mar 19, p.1745-9. 1993. Von Bergwelt-Baildon, M. S., R. H. Vonderheide, et al. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood, v.99, n.9, May 1, p.3319-25. 2002. Watts, C. e S. Amigorena. Antigen traffic pathways in dendritic cells. Traffic, v.1, n.4, Apr, p.312-7. 2000. Wheeler, M., X. Cortez-Gonzalez, et al. Ex vivo programming of antigenpresenting B lymphocytes: considerations on DNA uptake and cell activation. Int Rev Immunol, v.25, n.3-4, May-Aug, p.83-97. 2006. Wolff, J. A., R. W. Malone, et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science, v.247, n.4949 Pt 1, Mar 23, p.1465-8. 1990. Xiong, S., M. Gerloni, et al. In vivo role of B lymphocytes in somatic transgene immunization. Proc Natl Acad Sci U S A, v.94, n.12, Jun 10, p.6352-7. 1997. Yamamoto, S., T. Yamamoto, et al. Unique palindromic sequences in synthetic oligonucleotides are required to induce IFN [correction of INF] and augment IFNmediated [correction of INF] natural killer activity. J Immunol, v.148, n.12, Jun 15, p.4072-6. 1992. Zanetti, M., P. Castiglioni, et al. B lymphocytes as antigen-presenting cell-based genetic vaccines. Immunol Rev, v.199, Jun, p.264-78. 2004. 73 Zhang, X., M. Divangahi, et al. Intramuscular immunization with a monogenic plasmid DNA tuberculosis vaccine: Enhanced immunogenicity by electroporation and co-expression of GM-CSF transgene. Vaccine, v.25, n.7, Jan 26, p.1342-52. 2007. 74