PATOLOGIA
O que é Imunohistoquímica: Impacto como Marcador Prognóstico
Vera Luiza Capelozzi
Departamento de Patologia
Faculdade de Medicina - Universidade de São Paulo – Brazil
e-mail: [email protected]
Imunofluorescência
• Técnica precursora IHQ: reações antígeno-anticorpo
• Tecido fresco congelado, microscópio especial, pobre
definição morfológica
• Anos 80-90: IHQ aplicação ampla na Patologia Cirúrgica
• Detecção mais sensível: Acs monoclonais altamente
específicos, idênticos e em abundância
• Cortes inicialmente congelados: fixação em formalina e
embebição em parafina
IHQ: Tipos de Anticorpos
•
Monoclonais e policlonais
– monoclonais: mais específicos
– policlonais: reconhecem diversos epítopos
• injeção de um antígeno peptídico em animais
• após a estimulação de resposta imune secundária
• isolamento dos anticorpos a partir do soro
• Primários e secundários
– primários: antígeno de interesse e são não-marcados
– anticorpos secundários
• produzidos contra anticorpos primários
• reconhecem IGs de uma espécie particular e
– são conjugados : biotina , fosfatase alcalina , peroxidase , Flúor Alexa ou Fluor DyLight
IHQ:
Preparação das Amostras
•Cortes:
• finos
4μm , micrótomo
• lâminas
•Controles
• padronização processamento
e fixação
•“Controles internos”:
• tecido
(ou células) da mesma
secção
• secção do mesmo espécime
da paciente
•“Controles externos”:
• tecidos (ou linhas de células)
de outras fontes
•células negativas e outras
positivas de expressão do
antígeno em questão
IHQ: Direta e Indireta
• Direto (one-step)
– anticorpo marcado (e.g.
Isotiocianato de Fluoresceína
- FITC) conjugado
– reage diretamente com o
antígeno no tecido
– simples e rápido
– baixa sensibilidade: pequena
amplificação de sinal
• Ac primário não-marcado (primeira camada)
– + Ag do tecido
– + Ac secundário marcado (segunda camada)
• contra IgG da espécie animal na qual Ac primário foi produzido
– segunda camada Ac marcada com corante fluorescente ou enzima
•
Método mais sensível:
– amplificação maior: reações Ac secundários com diferentes sítios
antigênicos do Ac primário
– Número pequeno de Ac secundários conjugados (marcados) gerado
• Ex: Ac secundário marcado produzido contra IgG de coelho (comprado sem
encomenda) reage com qualquer Ac primário produzido em coelhos
• Método direto:
– produzir Acs marcados customizados contra cada antígeno de interesse
HE & IHQ
IHQ:
Indicações na Patologia Cirúrgica
•
•
•
•
tecido de origem de uma neoplasia indiferenciada
órgão de origem de uma neoplasia diferenciada
subtipagem de neoplasias (linfomas)
fatores prognósticos, terapêuticos e índices proliferativos
(por exemplo, hormônios)
• identificação de estruturas, organismos e materiais secretados
pelas células
• detecção de células neoplásicas metastáticas
• diferenciação proliferação celular maligna e benigna
IHQ:
Marcadores diagnósticos
• técnica excelente de detecção: local exato da
proteína no tecido
• maior desvantagem
– ao contrário do immunoblotting: coloração
checada contra um peso molecular
– impossível mostrar que a coloração corresponde à
proteína de interesse
– Acs primários devem validados por Western Blot
•
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•
•
Pan Citoqueratina: celulares epiteliais e todos carcinomas; alguns sarcomas
CD45 (LCA): marcador de leucócitos;
HMB45: marcador de melanoma e nevos azul, de Spitz e juncional, angiomiolipoma;
S100: células gliais e de Schwann, melanócitos, células de Langerhans e células reticulares interdigitantes
Vimentina: marcador de células de origem mesenquimal (sarcomas);
Actina: leiomiossarcoma (positivo), câncer papilar de mama (negativo) e outros;
Alfafetoproteína (AFP): tumores de células germinativas (seio endodérmico) e carcinoma hepatocelular;
BCL-2: linfoma folicular x hiperplasia reacional, subtipos de linfomas, carcinomas e sarcomas;
CA 125: ovário, vesícula seminal, colo uterino, endométrio, trato gastrintestinal, tireóide e mama;
Antígeno prostático específico (PSA): para câncer de próstata;
Receptores de estrogênio e progesterona: marcadores prognósticos em câncer de mama;
CD3 (Pan-T): linfomas de células T;
CK7: epitélios glandulares e transicional - subtipos de carcinomas, ductos biliares;
CD10 : células foliculares e linfoblastos, normais e neoplásicas, estroma endometrial e células renais;
CD15: granulócitos maduros, células de Hodgkin e de Reed-Sternberg e diversos adenocarcinomas
CD20 (Pan-B): linfomas de células B;
CD30 (Ki-1): linfoma de Hodgkin, linfoma de grandes células anaplásico e carcinoma embrionário;
CD117 (proto-oncogene c-KIT): estroma gastrointestinal (GIST), carcinomas e leucemias, mastócitos;
CK20: tumores gastrointestinais, carcinoma de células transicionais, tumor de células de Merkel;
Cromogranina A: diferenciação neuroendócrina;
Desmina: células musculares, estriadas ou lisas - tumores musculares lisos e estriados
E-caderina: carcinoma ductal x carcinoma lobular de mama
Erb-B2/Her-neu: mama, ovário e trato-gastrointestinal. Prognóstico e preditivo em carcinoma de mama;
KI-67: marcador de proliferação celular;
Proteína P53: produto do gene supressor tumoral marcador prognóstico
TTF-1: marcador de carcinomas de pulmão e tireóide e neoplasias neuroendócrinas.
CK-7
TTF1
CD56
Bcl-2
MMP-9
P63
Caspase-9
Vimentina
AE1+AE3
IL-4
CD3
CD1a
CD68
Câncer de Pulmão:
Tipos Histológicos
Classificação WHO 2004 – Tipos Maiores1
Outros*
24.0%
LCC
5.0%
SCLC
13.0%
Adenocarcinoma
38.3%
*Inclui
CA adenoescamoso,
CA sarcomatoides,
Carcinoides,
CA glândulas salivares, e
Carcinomas
inclassificáveis
19.7%
SqCC
Percentual distribuido entre casos classificaveis, 2001-20042
1. Brambilla E, et al. Eur Respir J. 2001;18:1059-1068.2. SEER Database. Lung and Bronchus
Cancer (Invasive), 1975-2004.
Carcinoma Não-Pequenas Células (NSCLC):
Tipos Histológicos
19%
38%
14%
Adenocarcinoma
Carc Cels Escamosas
Carc Grandes Células
Não Especificado (NOS)
29%
1. Brambilla E, et al. Eur Respir J. 2001;18:1059-1068.2. SEER Database. Lung and Bronchus Cancer
(Invasive), 1975-2004.
NSLCL:
70% Apresentação
como Doença Avançada
Análise molecular de adenocarcinomas
Sem mutação
AKT1
NRAS
MEK1
MET AMP
HER2
PIK3CA 2%
BRAF 2%
Double
Mutants 3%
EML4-AKL
7%
KRAS
22%
EGFR
17%
 Mutação presente em 54% (280/516) (95% CI: 50% to 59%)
 Referência para tratamento especifico direcionado ao alvo determinado
Kris MG, et al. ASCO 2011. CRA7506. Johnson BE, et al. IASLC WCLC 2011. Abstract O16.01
Alvos moleculares potencialmente “tratáveis”
Alvos emergentes “tratáveis” em
Adenocarcinoma de pulmão
Outro
determinado)
K-ras
EGFR
B-raf
HER2
PIK3CA
ALK
MET
Other
Alvos emergentes “tratáveis” em
CA Celulas Escamosas de pulmão
Gene
Evento
Frequencia, %
FGFR1
Amplificação
20-25
FGFR2
Mutação
5
PIK3CA
Mutação
9
Mutação-deleção
18
Amplificação
8
CDKN2A
Deleção/mutação
45
PDGFRA
Amplificacãomutação
9
EGFR
Amplificação
10
MCL1
Amplificação
10
BRAF
Mutação
3
DDR2
Mutacão
4
ERBB2
Amplificação
2
PTEN
CCND1
Bang Y, et al. ASCO 2010. Abstract 3.
Hammerman P, et al. IASLC WCLC 2011. Abstract PRS.1
IHQ: Marcadores Diagnósticos
Adenocarcinoma
Carc Cels Escamosas
TTF1
Travis WD; USCAP 2012
p63
IHQ, FISH, PCR: Marcadores Preditivos e Diagnósticos
Gene copy number by FISH for
epidermal growth factor receptor
Mutation in epidermal growth
factor receptor
Protein expression by immunohistochemistry for epidermal
growth factor receptor
Huber
Herbst
RS, Hirsch FR. Lancet 373 (2009)
Amsterdam, 26. 9. 2011
Qual Material?
Patologia Cirúrgica: Rotina
•O que o Tipo de Procedimento na Obtenção da Biópsia
pode Oferecer?
- biópsia por agulha em múltiplos pontos ou “core” biópsia
mínima : como definir histologia e análise molecular?
- fatores que influenciam as análises moleculares
•Como Atender ao que o Patologista pode fazer?
Como Facilitar o que quer saber o Oncologista?
Kevin L, USCAP 2012
Kevin L, USCAP 2012
Optimizando o Diagnóstico em Biópsias Pequenas
Histologia:
• grupo de células incluso maligno
• “não pequenas” células
• não favorece adenocarcinoma pela morfologia
Recomendável IHC para confirmar origem pulmonar
Resultados:
• TTF1 neg, CK7 pos
• Tumor insuficiente recortes: Napsin A, CK20, sinaptofisina,
cromogranina, e P40...
Laudo:
• “carcinoma não pequenas células, NOS”,
• clínico pergunta: tumor de uma paciente com
antecedentes de câncer de mama...
... se for, recomendável pesquisa de Her2neu
Se pensarmos:
• mais a favor de adenocarcinoma
• precisamos saber se trata de AIS
Se não:
• como temos certeza da ausência de
diferenciação escamosa
• recomendamos pesquisa de EGFR e ALK
Mudanças na Histologia do Câncer de Pulmão
Pequenas Células (SCLC)
-15% de todo câncer de pulmão
- incidência em declínio
Não-Pequenas Células (NSCLC)
- 80% de todo câncer de pulmão
- tipos de NSCLC :
- células escamosas
- adenocarcinoma
- grandes células
Carcinoma não-pequenas células
Adenocarcinoma
- padrão glandular
-mucina positiva (50%)
- CK7+/CK20- TTF1+ Napsin A
WHO
Comum, mas não 100%
Carcinoma células escamosas
-queratinização celular
-pontes intercelulares
-escamas córneas
- CK7-/CK20- P63+ CK5/6+
WHO
Comum, mas não 100%
NSCLC – NOS – MICROSCOPIA ÓPTICA
NSCLC – FAVORECE ADENOCARCINOMA
TTF1
TTF1
NSCLC- FAVORECE ADENOCARCINOMA
CONFIRMADO PELA MOLECULAR
Travis W, USCAP 2012
NSCLC- DIAGNÓSTICO MICROSCOPIA ÓPTICA
BIÓPSIAS PEQUENAS / CITOLOGIA
Travis W, USCAP 2012
NSCLC- DIAGNÓSTICO MICROSCOPIA ÓPTICA
BIÓPSIAS PEQUENAS / CITOLOGIA
NSCLC- DIAGNÓSTICO MICROSCOPIA ÓPTICABIÓPSIAS PEQUENAS / CITOLOGIA
Travis W, USCAP 2012
MUTAÇÃO EGFR – ANTICORPOS ESPECÍFICOS DE SINALIZAÇÃO
Travis W, USCAP 2012
EGFR – EXON 21 – L858R- ANTICORPO MUTAÇÃO ESPECÍFICA
Brevet M et al. J Mol Diagn 12: 169-76, 2010
EGFR – EXON 19 – DELEÇÃO- ANTICORPO MUTAÇÃO ESPECÍFICA
Brevet M et al. J Mol Diagn 12: 169-76, 2010
Análise molecular de adenocarcinomas
Sem mutação
AKT1
NRAS
MEK1
MET AMP
HER2
PIK3CA 2%
BRAF 2%
Double
Mutants 3%
EML4-AKL
7%
KRAS
22%
EGFR
17%
 Mutação presente em 54% (280/516) (95% CI: 50% to 59%)
 Referência para tratamento especifico direcionado ao alvo determinado
Kris MG, et al. ASCO 2011. CRA7506. Johnson BE, et al. IASLC WCLC 2011. Abstract O16.01
Quantificação da Expressão do EGFR FLEX
Alta EGFR
IHC score ≥200
N=345; 31%
Baixa EGFR
IHC score <200
N=776; 69%
IHC score=0*
IHC score=112
IHC score=270
Aproximadamente 1/3 pacientes estão no grupo EGFR alta expressão
Huber
*This field
Amsterdam, 26. 9. 2011
Pirker, WCLC 2011, Abst O01.06
EGFR-Anticorpo – FLEX
Maintenance
NSCLC
wet IIIB/IV
Chemotherapy +
Cetuximab
EGFRexpressing
Chemotherapy
Chemotherapy (CT)
Cisplatin 80
mg/m2
Vinorelbine 25 (30)
Cetuximab
until PD or
intolerable toxicity
Cetuximab
initial dose 400 mg/m2
day 1
mg/m2
days 1, 8
Every 3 weeks, up to 6 cycles
then 250 mg/m2
weekly
Pirker R et al. J Clin Oncol 2008, 18S (abstract 3), Lancet 2009;373: 1525–31
Huber
Amsterdam, 26. 9. 2011
Huber
FLEX: sobrevida
Median OS
1-year survival
CT + cetuximab
(n=557)
11.3 mo
47%
CT
10.1 mo
42%
(n=568)
No effect of kRAS-Mutation and EGFRFISH
O'Byrne P ea. ASCO 2009
CT, chemotherapy; HR, hazard ratio; OS, overall survival
HuberR ea. ASCO 2008, Lancet 2009;373:
Amsterdam,1525–31
26. 9. 2011
Pirker
Huber
Sobrevida com Alta Expressão EGFR (N=345)
Survival
Median 1-year 2-year
100
90
 CT +
cetuximab
Overall survival (%)
80
 CT
70
60
12.0 mo 50%
9.6 mo
37%
24%
15%
HR*=0.73 [95% CI 0.58–0.93], p=0.011†
50
40
30
20
10
0
0
Number of patients at risk
CT + cetuximab
178
CT
167
Huber
6
12
18
24
30
Months
128
108
86
58
Amsterdam, 26. 9. 2011
61
36
*When adjusted for prognostic factors: HR 0.67 [95% CI 0.52–0.87], p=0.002; †Logrank
24
11
0
0
CONCLUSÃO
Medicina Personalizada do Paciente
Câncer de Pulmão Avançado
deve ser Direcionada
para Histologia e Genética (IHQ, ISH, PCR)
OBRIGADA!!