UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E BIOQUÍMICA
Correlação da função antioxidante com a energia de
ligação O-H em compostos fenólicos.
Ana Rita Raimundo Gomes
Dissertação
Mestrado em Química
Química
2012
UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E BIOQUÍMICA
Correlação da função antioxidante com a energia de
ligação O-H em compostos fenólicos.
Ana Rita Raimundo Gomes
Dissertação orientada por
Prof. Doutor Benedito José Costa Cabral
Prof. Doutora Maria Tereza Neves Fernandez
Mestrado em Química
Química
2012
Agradecimentos
Agradecimentos
Este trabalho resultou graças ao apoio que um conjunto de pessoas que estiveram
comigo não só ao longo da execução do mesmo, mas também ao longo da minha vida.
Por isso, em primeiro lugar, gostaria de agradecer à Professora Doutora Maria Tereza
Fernandez e ao Professor Doutor Benedito Cabral, por terem confiado em mim para a
realização deste trabalho e por toda ajuda e motivação que me deram durante estes longos
meses.
No grupo de Espectrometria de Massa, agradeço especialmente ao Paulo por ter sido
um terceiro orientador. Tenho também que agradecer ao Pedro, Tiago e à Kristina por todas
as músicas, todos os intervalos, por todos os cafés e pelas piadas que me animaram nas
alturas de desespero.
No grupo de Química Computacional, agradeço em especial ao Nuno Galamba, mas
também à Margarida, à Sílvia e ao Hugo por me ajudarem a ultrapassar todos os pânicos.
Um agradecimento especial aos meus pais e à minha família que sempre tentou
compreender tudo o que eu estava a fazer.
Por fim, tenho que agradecer a todas as pessoas que me acompanharam durante
estes anos. Assim, agradeço em especial, às minhas amigas e aos meus amigos que
estiveram sempre comigo ao longo destes meses que me fizeram rir.
i
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Resumo
Resumo
Um grande número de antioxidantes são compostos fenólicos que têm a capacidade
de neutralizar e inibir a acção oxidativa dos radicais livres. Existem vários mecanismos de
acção antioxidante que têm o mesmo resultado final, a transferência do átomo de
hidrogénio do grupo O-H para o radical livre, inactivando-o. Assim, a função antioxidante
está relacionada com a energia de dissociação da ligação O-H. Relacionando a energética, a
estrutura e a reactividade de compostos fenólicos podemos obter informação útil na síntese
de novos antioxidantes. Este estudo, experimental e teórico, incidiu sobre três antioxidantes
fenólicos, o ácido cafeico, o trolox e o α-tocoferol.
A entalpia de dissociação da ligação O-H (BDE) pode ser determinada através da
afinidade protónica (ΔacH) do anião fenóxido, da afinidade electrónica (EA) do radical
fenoxílo e da energia de ionização (IE) do átomo de hidrogénio, que é conhecida.
Experimentalmente, determinou-se o valor de ΔacH, utilizando o método cinético de
Cooks, na sua forma restrita e a estendida. Para tal foi necessário implementar o método
cinético estendido em dois espectrómetros de massa diferentes.
Teoricamente, foi possível determinar afinidade protónica (ΔacH) do anião fenóxido, a
afinidade electrónica do radical fenoxílo (EA) e a entalpia de dissociação da ligação O-H.
Neste estudo teórico, recorreu-se a um método DFT/B3LYP associado a uma base cc-pVTZ.
Concluíu-se que o composto com menor acidez é o α-tocoferol e com maior é o ácido
cafeico, sendo que neste último, o protão fenólico que se encontra em posição para é o mais
acídico. No trolox, a desprotonação deverá ocorrer no grupo carboxílico. O α-tocoferol deve
ser o antioxidante mais activo, pois dos três compostos fenólicos estudados é o que
apresenta os valores mais baixos de BDE’s.
Palavras-chave: Compostos Fenólicos, Entalpia de dissociação da ligação O-H, Espectrometria de
massa, Método Cinético de Cooks, Cálculos DFT’s.
iii
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Abstract
Abstract
A great number of antioxidants are phenolic compounds which are able to inhibit
oxidative action of free radicals. The final result, of various antioxidant mechanisms, is the
inactivation of free radicals by hydrogen atom transfer from the O-H group. Thus, the
antioxidant action is related with the O-H bond dissociation enthalpy. The information
obtained from the energetics, structure and reactivity correlation, in phenolic compounds,
can give insights for new antioxidant synthesis. In the present study three phenolic
antioxidant, caffeic acid, trolox and α-tocopherol, were investigated.
The O-H bond dissociation enthalpy (BDE) can be determined with three
thermodynamic functions, the phenoxide anion proton affinity (ΔacH), the phenoxyl radical
electron affinity (EA) and the ionization energy (IE) of the hydrogen atom which is known.
ΔacH values were determined experimentally with the Cooks kinetic method, using
both the restricted and extended versions. Furthermore, the extended kinetic method was
implemented in two distinct mass spectrometers (ion trap and FTICR).
In order to complement the experimental data, the phenoxide anion proton affinity
(ΔacH), the phenoxyl radical electron affinity (EA) and the O-H bond dissociation enthalpy
(BDE) were determined using the DFT/B3LYP method in association with the cc-pVTZ basis
set.
α-tocopherol was found to have the lowest gas-phase acidity while caffeic acid had
the highest. For caffeic acid it was found that the phenolic proton in para position is more
acidic, and that deprotonation in trolox should occur at the carboxylic group. Of the three
compounds under study, α-tocopherol is expected to be the most active antioxidant since it
has the lowest BDE value.
Keywords: Phenolic Compounds, Bond Dissociation Enthalpy, Mass Spectrometry, Cooks
Kinetic Method, DFT calculations.
v
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Lista de Abreviaturas
Lista de Abreviaturas
ArOH
Compostos fenólicos
RH
Composto de Referência
∆H°
Variação de entalpia padrão
∆G°
Variação de energia de Gibbs padrão
∆S°
Variação de entropia padrão
GB
Basicidade em fase gasosa
PA
Afinidade Protónica
∆acG
Acidez em fase gasosa
ΔacH
Afinidade protónica de anião
PTR
Reacções de Transferência Protónica
IE
Energia de Ionização
EA
Afinidade electrónica
ETE
Entalpia de transferência electrónica
Do (ArOH)
Entalpia de dissociação da ligação OH
BDE
Entalpia de dissociação da ligação
HAT
Transferência do átomo de hidrogénio
SPLET
Perda sequêncial de um protão e de transferência de electão
SEP-PT
Transferência de um electrão seguido pela transferência do protão
k
Constante de velocidade
R
Constante dos gases perfeitos = 8,314 J/K.mol
T
Temperatura (K)
Keq
Constante de Equilíbrio
Teff
Temperatura Efectiva
m/z
Razão massa/carga
vii
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Lista de Abreviaturas
MS
Espectrometria de massa ou 1ª análise de massa (full scan)
MS2
2ª Análise de massa (MS/MS)
MSn
Espectrometria de massa tandem
CID
Dissociação Induzida por Colisão
ESI
Ionização por electrospray
ES
Electrospray
CI
Ionização Química
EI
Electroionização
API
Ionização à pressão atmosférica
APCI
Ionização Química à pressão atmosférica
APPI
Fotoionização à pressão atmosférica
TOF
Tempo de Vôo
FAB
Bombardeamento com átomos/iões rápidos
MALDI
Ionização/Desadsorção Laser Assistida por Matriz
FTICR
Ressonância Ciclotrónica de Iões com Transformada de Fourier
AC
Corrente Alterna
Rf
Radiofrequências
NCE
Energia de Colisão Normalizada
Vp-p
Voltagem pico a pico
DFT
Teoria do funcional da densidade
HF
Hartree-Fock
viii
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Índice Geral
Índice Geral
Agradecimentos
i
Resumo
iii
Abstract
v
Lista de Abreviaturas
vii
Índice Geral
ix
Índice de Tabelas
xi
Índice de Figuras
xiii
1. Introdução
1
1.1. Antioxidantes
1
1.1.1. Compostos Fenólicos
2
1.1.2. Entalpia de dissociação da ligação O-H em fase gasosa
5
1.2. Método Cinético de Cooks
7
1.3. Espectrometria de Massa
12
2. Parte Experimental
21
2.1. Reagentes
21
2.2. Procedimento Experimental
24
2.2.1. Preparação das soluções
24
2.2.2. Condições Experimentais para aplicação do Método Cinético
25
3. Apresentação e Discussão de Resultados Experimentais
3.1. Ácido Cafeico
29
29
3.1.1. Aplicação do Método Cinético Restrito
29
3.1.2. Aplicação do Método Cinético Estendido
37
3.1.2.1.
Aplicação do Método Cinético Estendido na Ion Trap
39
3.1.2.2.
Aplicação do Método Cinético Estendido na célula do ICR
41
ix
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Índice Geral
3.1.3. Comparação dos Resultados obtidos entre o Método Cinético Restrito
e o Estendido
3.2. Trolox
43
45
3.2.1. Aplicação do Método Cinético Restrito
45
3.2.2. Aplicação do Método Cinético Estendido
48
3.2.2.1.
Aplicação do Método Cinético Estendido na Ion Trap
48
3.2.2.2.
Aplicação do Método Cinético Estendido na célula do ICR
50
3.2.3. Comparação dos Resultados obtidos entre o Método Cinético Restrito
e o Estendido
3.3. α-Tocoferol
4. Química Teórica e Computacional
52
53
57
4.1. Introdução
57
4.2. Detalhes computacionais
61
5. Apresentação e Discussão de Resultados Teóricos
63
5.1. Cálculo da acidez em fase gasosa, ΔacHᵒ
66
5.2. Cálculo da afinidade electrónica, EA
67
5.3. Cálculo da entalpia de dissociação da liagação O-H, BDE
69
6. Comparação dos Resultados Experimentais com os Resultados Teórico
71
6.1. Ácido Cafeico
71
6.2. Trolox
72
6.3. α-Tocoferol
73
7. Conclusão e Perspectivas Futuras
75
8. Bibliografia
77
Anexos
x
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Índice de Tabelas
Índice de Tabelas
Tabela 2.1 – Características dos compostos em estudo.
21
Tabela 2.2 – Características dos compostos de referência utilizados neste estudo.
22
Tabela 3.1 – Compostos de Referência utilizados com o respectivo valor de ∆acH e
∆acG.
31
Tabela 3.2 – Valores da razão das intensidades entre a referência e o ácido cafeico,
para cada referência.
36
Tabela 3.3 – Valores da razão das intensidades entre a referência e o ácido cafeico,
para cada referência, a uma determinada voltagem pico a pico (Vp-p).
39
Tabela 3.4 – Valores obtidos através das 1ª representações gráficas.
40
Tabela 3.5 – Valores da razão das intensidades entre a referência e o ácido cafeico,
para cada referência, a uma determinada frequency Offset.
41
Tabela 3.6 – Valores de m e b, obtidos através das 1ª representações gráficas.
42
Tabela 3.7 – Valores de ΔacH obtidos através da aplicação das diferentes formas do
método cinético.
43
Tabela 3.8 – Referências utilizadas com o respectivo valor de ∆acH e ∆acG.
45
Tabela 3.9 – Valores da razão das intensidades entre a referência e o trolox, para
cada referência, utilizando o método cinético restrito.
46
Tabela 3.10 – Valores obtidos através da razão das intensidades entre a referência e
o trolox.
48
Tabela 3.11 – Valores de m e b, obtidos através das 1ª representações gráficas.
49
Tabela 3.12 – Valores da razão das intensidades entre a referência e o ácido cafeico,
para cada referência, a uma determinada frequency Offset.
50
Tabela 3.13 – Valores de m e b, obtidos através das 1ª representações gráficas.
51
xi
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Índice de Tabelas
Tabela 3.14 – Valores de ∆acH obtidos através da aplicação das diferentes formas do
método cinético.
52
Tabela 3.15 – Referências utilizadas com o respectivo valor de acidez relativa em
função do fenol.
54
Tabela 5.1 – Valores de teóricos de ΔacHᵒ, EA e a BDE para o fenol.
63
Tabela 5.2 – Comparação entre os resultados experimentais e teóricos para o fenol.
64
Tabela 5.3 – Valores de afinidade protónica (ΔacHᵒ).
66
Tabela 5.4 - Valores de afinidade electrónica (EA).
67
Tabela 5.5 - Valores da entalpia de dissociação da ligação (BDE).
69
Tabela 6.1 – Comparação entre os resultados experimentais e teóricos para o ácido
cafeico
71
Tabela 6.2 - Comparação entre os resultados experimentais e teóricos para o trolox
72
xii
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Índice de Figuras
Índice de Figuras
Figura 1.1 – Estrutura molecular da quercitina.
3
Figura 1.2 – Estrutura molecular do α-tocoferol.
3
Figura 1.3 – Estrutura do ácido 4-hidroxibenzóico (a), estrutura do ácido 4hidroxicinâmico (b).
4
Figura 1.4 – Estrutura molecular do Ácido Cafeico.
4
Figura 1.5 – Estrutura molecular do Trolox.
4
Figura 1.6 – Gráfico ln [BH+/BiH+] vs ΔH(Bi), que permite a determinação da afinidade
protónica do composto desconhecido através do método cinético restrito.
9
Figura 1.7 – 2ª Representação gráfica do método cinético estendido, ΔGapp/RTeff vs
1/RTeff, que permite a determinação da afinidade protónica do composto
desconhecido.
10
Figura 1.8 – Diagrama Esquemático de um espectrómetro de massa comum.
12
Figura 1.9 – Diagrama Esquemático de uma fonte de ionização de um electrospray
(ESI).
14
Figura 1.10 – Modelo de carga residual.
15
Figura 1.11 – Modelo de evaporação iónica.
15
Figura 1.12 – Representação Esquemática de uma ion trap.
16
Figura 1.13 – Representação Esquemática de um FTICR.
17
Figura 1.14 – Movimentos naturais do ião, onde νm é a frequência do magnetrão, νc é a
frequência ciclotrónico e νT é a frequência por aprisionamento.
18
Figura 1.15 – Três forma de aplicar a excitação. Esquerda: aceleração dos iões até uma
trajectória espacialmente coerente e detectável. Centro: Aumento da energia cinética
acima do limite para a dissociação activada por colisão ou reacção. Direita: ejecção dos
iões de uma dada razão massa/carga.
18
xiii
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Índice de Figuras
Figura 3.1 – Espectro MS da solução 10-4 de ácido cafeico, obtido em modo negativo.
29
Figura 3.2 – a) Espectro ESI-MS2 do ião do ácido cafeico (m/z 179) à energia de
colisão normalizada de 20% b) Espectro ESI-MS3 do fragmento m/z 135 do ácido
cafeico à energia de colisão normalizada de 30%.
30
Figura 3.3 – Esquema de fragmentação do ácido cafeico.
30
Figura 3.4 - a) Espectro ESI-MS do heterodímero do ácido cafeico com ácido 2,5dihidróxibenzóico (m/z 333) b) Espectro ESI-MS2 do heterodímero m/z 333 à energia de
colisão normalizada de 7,50%.
33
Figura.3.5 - Espectros MS2 dos diferentes heterodímeros formados pelo ácido cafeico e
as respectivas referências.
35
Figura 5.1 - Estruturas do ácido cafeico optimizadas. a) Ião/Radical A – desprotonação do
grupo fenólico em posição meta. b) Ião/Radical B – desprotonação do grupo fenólico em
posição para. c) Ião/Radical C – desprotonação do grupo carboxílico.
64
Figura 5.2 - Estruturas do trolox optimizadas. a) Ião/Radical A – desprotonação do grupo
fenólico. b) Ião/Radical B – desprotonação do grupo carboxílico.
65
Figura 5.3 - Estrutura do α-tocoferol optimizada.
65
xiv
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
1. Introdução
1.1. Antioxidantes
1. Introdução
1.1. Antioxidantes
Os antioxidantes estão presentes numa grande variedade de alimentos, como as
hortaliças, frutas, cereais, ovos, carnes, legumes e frutos secos. O termo antioxidante
significa “que inibe os efeitos da oxidação”, foi primeiramente observado por Claude
Berthollet em 1797, sendo depois esclarecido por Humphry Davy em 1817.[1] Os
antioxidantes impedem o efeito prejudicial dos radicais livres que surgem nas reacções
metabólicas do nosso organismo ou que se formam através de factores exógenos, como as
radiações ionizantes.[2]
O termo radical livre refere-se a um átomo ou molécula altamente reactivo, que
contém número impar de electrões na última camada electrónica. É este nãoemparelhamento de electrões na última camada que confere alta reactividade a esses
átomos ou moléculas.[3] Os radicais livres (OH, ROO,R) formados numa cadeia de reacções
(1-3) são responsáveis por várias doenças crónicas e degenerativas como o Alzheimer, o
Parkinson, a diabetes e doenças cardiovasculares.[4, 5]
RH → R•
R• + O2 → ROO•
ROO• + RH → ROOH + R•
(1)
(2)
(3)
O stress oxidativo é causado pelo desequilíbrio entre os mecanismos de defesa
antioxidante e o aumento da produção de radicais livres.[6] A produção contínua de radicais
livres (1-3), durante os processos metabólicos, levou ao desenvolvimento de mecanismos de
defesa antioxidante para limitar os níveis intracelulares e impedir a indução de danos. [7] De
seguida, vamos apresentar alguns destes mecanismos.
Os metais, como o cobre e o ferro, têm um papel importante na formação dos
radicais livres, formações essas que são descritas nas reacções de Fenton (4-6) e de HaberWeiss. [8, 9]
Fe2+ + O2 → Fe3+ + O2- (4)
2 O2- + 2H+ → O2 + H2O2
(5)
Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH- +OH
(6)
1
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
1. Introdução
1.1. Antioxidantes
Embora o cobre possa também catalisar as reacções de Haber-Weiss, o ferro é o
metal pesado mais abundante no organismo e está biologicamente mais capacitado para
catalisar as reacções de oxidação de biomoléculas. Assim, um mecanismo de defesa contra
os radicais livres baseia-se na complexação do ferro e do cobre que participam nas reacções
em cadeia (4-6).[3] Esta complexação pode ser efectuada por determinados antioxidantes
como por exemplo os flavonoides. [10]
Grande número de compostos fenólicos (ArOH) desempenham um papel muito
importante na intercepção e reacção com os radicais livres (ROO e R), gerados pelo
metabolismo celular ou fontes exógenas, a uma taxa mais rápida do que o substrato, neste
caso o lípido RH. Desta forma, levam à inactivação dos radicais livres formados na reacção
(1) ou nas reacções (2 e 3) do stress oxidativo, iniciação e propagação, respectivamente.
Através da transferência do átomo de hidrogénio do grupo fenólico (mecanismo HAT) a
estas moléculas, a reacção em cadeia é interrompida.
ROO + ArOH → ROOH + ArO
(7)
R + ArOH → RH + ArO
(8)
O átomo de hidrogénio activo do antioxidante é capturado pelos radicais livres (ROO
e R) com maior facilidade do que dos hidrogénios alílicos das moléculas insaturadas. Assim,
formam-se espécies inactivas para a reacção em cadeia e um radical (ArO) procedente do
antioxidante. Este radical, estabilizado por ressonância, não tem a capacidade de iniciar ou
propagar as reacções oxidativas por ser muito menos reactivo.[2,
5, 11]
Será sobre este
mecanismo que vai incidir o presente estudo.
Finalmente, existem ainda outros antioxidantes cuja acção se manifesta por
reparação das lesões causadas pelos radicais.[12] É de realçar a ocorrência de efeitos
sinergísticos resultantes da acção de diferentes agentes antioxidantes.
1.1.1. Compostos Fenólicos
As propriedades antinflamatórias, antialérgicas, antiosteoporóticas, anticancerígenas
e antienvelhecimento dos compostos fenólicos resultam das suas propriedades
antioxidantes. A actividade antioxidante dos compostos fenólicos manifesta-se através de
vários mecanismos, sendo o mais importante a inactivação de radicais livres e de outras
espécies oxidantes.
2
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
1. Introdução
1.1. Antioxidantes
Os antioxidantes fenólicos (ArOH) dividem-se em: flavonóides, tocoferóis e ácidos
fenólicos. Os flavonóides são constituídos por dois anéis aromáticos (um grupo benzoil e um
grupo cinanoil) e uma pirona. A figura 1.1. representa um exemplo de um flavonóide, a
quercetina.
Figura 1.1 – Estrutura molecular da quercetina.
A vitamina E encontra-se em grande quantidade nos lípidos, sabe-se que esta
vitamina impede ou minimiza os danos provocados pelos radicais livres, tendo a capacidade
de impedir a propagação das reações em cadeia induzidas por esses radicais nas membranas
biológicas e na peroxidação lipídica em sistemas biológicos. [12, 13] A vitamina E é constituída
por um grupo de oito compostos lipossolúveis que incluem os tocoferóis e tocotrienóis.[14]
Podem-se apresentar em quatro formas diferentes α, β, γ e δ-tocoferol (tal como os
tocotrienóis), sendo o α-tocoferol (α-TOH – figura 1.2) a forma antioxidante amplamente
distribuída nos tecidos e no plasma. In vivo, o radical α-tocopheroxyl (α-TO•) é regenerado
por reacção com a vitamina C, de modo a que a reacção em cadeia causada pela peroxidação
lipídica seja quebrada e que exista continuamente uma fonte regenerada de α-TOH
disponível. O α-TOH reage com os radicais peroxilo mais depressa que os radicais peroxilo
reagem com os lipídios (RH).[15]
Figura 1.2 – Estrutura molecular do α-tocoferol .
Os ácidos fenólicos apresentam um grupo funcional carboxilo e são divididos em duas
classes: os ácidos hidroxibenzóicos e os ácidos hidroxicinâmicos.[16] Na figura 1.3, estão
representadas duas estruturas químicas pertencentes a cada classe o ácido 4hidroxibenzóico (figura 1.3.a) e o ácido 4-hidroxicinâmico (figura 1.3.b).[17]
3
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
1. Introdução
1.1. Antioxidantes
a)
b)
Figura 1.3 – Estrutura do ácido 4- hidroxibenzóico (a), do ácido 4-hidroxicinâmico (b).
Os ácidos hidroxicinâmicos e os seus derivados são ingredientes alimentares
bioactivos das plantas, exibindo actividade antioxidante in vitro. O ácido cafeico, ácido 3,4dihidroxicinâmico (figura 1.4), é um antioxidante natural existente no café. Além de actuar
como um inibidor cancerígeno, também actua em sinergismo na protecção das células e
tecidos, pois foi demonstrado ser um protector do α-tocoferol em lipoproteínas de baixa
densidade (LDL).[18, 19]
Figura 1.4 – Estrutura molecular do Ácido Cafeico.
Os ácidos hidroxibenzóicos são componentes das complexas estruturas dos taninos
hidrolisáveis e são menos abundantes nos vegetais consumidos pelos humanos. Assim, têm
sido realizados estudos para pesquisar, desenvolver e substituir esses antioxidantes de
origem natural por antioxidantes sintéticos, como é o caso do trolox (figura 1.5). O trolox é
um antioxidante sintético, que deriva da vitamina E (figura 1.3). Sendo que trolox é o nome
comercial para o ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametiloxano-2-carboxílico.[20]
Figura 1.5 – Estrutura molecular do Trolox.
Para utilizar os antioxidantes na indústria alimentar e farmacêutica é necessário
avaliar a sua actividade antioxidante. O mecanismo antioxidante mais relevante é aquele em
que radicais livres são inactivados por doação de um átomo de hidrogénio. A actividade
antioxidante está relacionada, portanto, com a energia da ligação O-H que pode determinarse, em fase gasosa, por medição da acidez de fenóis e das afinidades electrónicas dos
respectivos radicais fenoxilo. Recorrendo às equações 7 e 8, verifica-se facilmente que
4
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
1. Introdução
1.1. Antioxidantes
quanto menor for a energia da ligação O-H, maior será o potencial para neutralizar os
radicais livres.[15, 21]
Assim, neste trabalho propõe-se a determinação experimental e teórica da acidez,
em fase gasosa, de alguns fenóis substituídos, como o trolox, ácido cafeico e a vitamina E,
bem como da afinidade electrónica teórica de radicais fenoxilo correspondentes. O objectivo
final é a determinação da entalpia de dissociação da ligação O-H, DHᵒ (ArO-H), naqueles
compostos.
1.1.2. Entalpia de dissociação da ligação OH em fase gasosa
A transferência do átomo de hidrogénio para o radical livre é o mecanismo principal
de inactivação dos radicais livres e tem sido associado ao mecanismo (HAT). [22] No entanto
este resultado também pode ser conseguido através do mecanismo da perda sequêncial de
um protão e de transferência de electrão (mecanismo SPLET) ou pelo o mecanismo da
transferência de um electrão seguido pela transferência do protão (mecanismo SET-PT). No
mecanismo SPLET, os termos energéticos relevantes são a afinidade protónica do anião
fenóxido, ΔHᵒ (ArO-), variação de entalpia da reacção 9, e a afinidade electrónica do radical
fenoxílo, EA (ArO). No segundo, o SET-PT, os termos energéticos relevantes são a energia de
ionização do composto fenólico, IE (ArOH) e a afinidade protónica do radical fenoxílo, PA
(ArO). [23]
Neste trabalho, considerou-se o mecanismo SPLET para a determinação de DHᵒ
(ArOH). Para essa determinação necessitamos da afinidade protónica do anião fenóxido e da
afinidade electrónica da radical fenoxilo como se vê abaixo (9-12). A variação da energia de
Gibbs (ΔG°) da reacção (9) é definida como a acidez em fase gasosa de ArOH. Na verdade
tanto ΔacHᵒ(ArOH) como ΔacG°(ArOH), que são variações da entalpia e da energia Gibbs da
reacção (9), estão relacionadas com a acidez de ArOH e são frequentemente usadas
indistintamente na literatura como acidez de ArOH.
ArOH → ArO – + H +
ΔacHᵒ (ArOH)
(9)
ArO –→ ArO + e –
EA (ArO)
(10)
IE (H)
(11)
H + + e – → H
ArOH → H + ArO
DHᵒ (ArOH)
(12)
5
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
1. Introdução
1.1. Antioxidantes
Neste ciclo termoquímico de iões negativos, podemos relacionar a entalpia de
dissociação da ligação OH (12), DHᵒ(ArOH), em fase gasosa, com os seguintes parâmetros
termodinâmicos, a energia de ionização (IE) do átomo de hidrogénio, a afinidade electrónica
(EA) do ArO e a afinidade protónica (ΔacHᵒ) de ArO-.[24-27]
DHᵒ (ArO-H) = ΔacHᵒ (ArOH) + EA (ArO) – IE (H)
(13)
A energia de ionização (IE) do átomo de hidrogénio (11) é conhecida, tendo o valor
de 1312 kJ/mol. Para determinar a afinidade electrónica (EA) do radical fenoxílo (10) recorrese usualmente à espectroscopia de fotoelectrões de iões negativos [28, 29], mas também pode
ser determinada por espectrometria de massa. A entalpia da reacção de desprotonação
(ΔacH) do neutro (9) pode ser determinada através da espectrometria de massa.[24]
A determinação da entalpia de dissociação da ligação O-H (BDE) em compostos
fenólicos estruturalmente diferentes, pode ajudar-nos a compreender como é que a força de
ligação O-H e a sua actividade antioxidante são afectadas pela natureza, a posição, e o
número de substituintes.[30, 31] Este aspecto é importante na orientação da síntese de novos
antioxidantes.
Apesar da maioria dos estudos sobre a actividade antioxidante serem realizados em
solução, os estudos em fase gasosa são importantes pois permitem-nos explorar a
reactividade das moléculas e dos iões sem os efeitos do solvente. Além disso, a diferença
que existe entre as entalpias de dissociação da ligação O-H, em fase gasosa e em solução é
menor que 5 kJ/mol para um grande número de fenóis substituídos.[32] Anteriormente, neste
grupo de investigação, já foram realizados estudos de compostos fenólicos: flavonóides,
fenóis dissubstituídos e cromanol, em que se determinou a sua acidez em fase gasosa.[23, 3234]
Assim, existem vários métodos para determinar estas grandezas termodinâmicas em
fase gasosa, podendo ser utilizados os métodos de equilíbrio, de bracketing ou cinético.[35] O
método escolhido para esta determinação foi o último.
6
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
1. Introdução
1.2. Método Cinético de Cooks
1.2. Método Cinético de Cooks
O interesse nas propriedades fundamentais e na reactividade dos iões tem
aumentado, principalmente nas biomoléculas. De entre os dados termoquímicos que
descrevem essas propriedades dos iões salientam-se a basicidade em fase gasosa (GB) e a
afinidade protónica (PA). São propriedades intrínsecas por serem determinadas na ausência
do solvente.[36-38] GB e PA são definidas como o negativo da variação de energia de Gibbs (ΔGro) e da variação de entalpia (-ΔHro), respectivamente, na seguinte reacção
+ → GB = - ΔGro
PA = - ΔHr0
(14)
Estas propriedades começaram por determinadas através do método de bracketing.
Considerava-se que as reacções de transferência protónica (PTR) eram exotérmica (ΔGro˂0).
Assim, se quisessemos determinar a basicidade do composto B e usassemos duas bases de
referência A e C, se a reacção 15 ocorresse
+ → + (15)
+ →
(16)
e a 16 não, obtinhamos um intervalo para o valor de GB(B), isto é, GB(C) ˃ GB(B) ˃ GB(A).[39]
Este método ainda é útil quando, por exemplo, as medições de equílibrio da transferência
protónica não pode ser aplicada. O método de equilíbrio baseia-se na medição de
constantes de equilibrio (Keq) para equações reversíveis de transferência protónica (17).[35, 38]
+ + (17)
Este método é de limitada aplicação, pois não se pode utilizar amostras impuras ou não
voláteis, necessitando de instrumentos especializados, enquanto que no método cinético
podemos utilizar os espectrómetros de massa comerciais desde que estes sejam capazes de
fazer MS2.[40]
O método cinético, introduzido por Cooks, começou por ser deduzido para a
determinação de basicidade e afinidades protónicas de compostos e portanto
apresentaremos essa versão. Este método baseia-se nas velocidades de dissociação
competitiva de um heterodímero. Como o formalismo do método foi feito para determinar a
basicidade e afinidade protónica de compostos, o heterodímero tem de ser formado por um
composto (B), que tem uma basicidade desconhecida (GB), e outro (Bi), que tem uma
basicidade conhecida, ligados por um protão (18).[37, 38, 41]
7
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
1. Introdução
1.2. Método Cinético de Cooks
+ ← … … → + (18)
A fragmentação do heterodímero vai originar bases protonadas individuais pela
clivagem da ligação de hidrogénio, sendo que o monómero que tiver maior basicidade em
fase gasosa vai ficar com o protão. Na equação 18, k e ki são as constantes de velocidade
para a dissociação competitiva de um ião comum, o heterodímero, que leva à formação de
BH+ e BiH+, respectivamente.[35] Considerando a teoria das velocidades absolutas[42], pode
relacionar-se as constantes de velocidade com as grandezas termodinâmicas de interesse.
Assim estabelece-se o formalismo do método, onde o logaritmo da razão das constantes de
velocidade pode ser expresso em [35, 43]
= ln ≈ +
∆
(19)
!"##
onde Q≠ e Qi≠ são as funções de partição do estado de transição dos dois canais de
dissociação, termo ∆$% é a diferença entre as energias de activação para os dois canais de
dissociação e o termo Teff é a temperatura efectiva. Existe uma discussão contínua em volta
do termo Teff, pois apesar de ser chamada uma temperatura, não é uma verdadeira
temperatura termodinâmica, pois depende não só da energia interna do sistema como
também depende das condições experimentais no espectrómetro de massa.[44,
45]
Apesar
disso, este termo contínua a ser utilizado, pois representa a temperatura da fracção de iões
heterodímeros activados, que sofrem fragmentações competitivas na janela de tempo dos
instrumentos.[40, 46]
Na sua forma mais simples, o método cinético é baseado num conjunto de condições
experimentais:
Não existam energias de activação das reacções inversas (ou a diferença entre
ela é desprezável);
Não existam reacções competitivas;
Ambos os compostos, B e Bi, sejam estruturalmente semelhantes (Δ(ΔS) = 0);
Não ocorram formas isoméricas do heterodímero.[35, 38, 47]
Não existindo energias de activação das reacções inversas, o termo ln(Q≠/Qi≠) é o
equivalente à variação de entropia, Δ(ΔS), entre os dois canais de dissociação e o termo ∆$%
pode ser substituido por Δ(ΔH). Desta forma, convertemos a equação 19 em
8
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
1. Introdução
1.2. Método Cinético de Cooks
= = −
∆'∆()
+
∆'∆)
!"##
= −
∆'∆()
+
∆')
!"##
−
∆' )
!"##
(20)
Onde é ∆H(Bi) são as afinidades protónicas conhecidas, ∆H(B) é a afinidade protónica
(PA) do desconhecido e Teff é a temperatura efectiva. Se ambas as espécies (a referência e a
desconhecida) forem estruturalmente semelhantes, o termo entrópico, Δ(ΔS), pode ser
cancelado. Logo, se o termo Δ(ΔS) for igual a zero, então Δ(ΔH) vai ser igual a Δ(ΔG). E assim,
chegamos à forma restrita do método cinético (21), que relaciona a razão das abundâncias
iónicas com a variação das afinidades protónicas (ΔPA = Δ(ΔH)).
= =
∆'∆)
!"##
=
∆'∆*)
(21)
!"##
Traçando um gráfico de ln [BH+/BiH+] vs PA(Bi), Bi conjunto de referências, vamos
obter uma relação linear
+
,' )
,' )
- = ./'0) + 1
(22)
onde o declive (m) vai ser de - 1/RTeff e a intercepção (b) vai ser PA(B)/RTeff (figura 1.6).[35, 47]
Assim, podemos determinar o valor da afinidade protónica, PA(B)= ΔH(B), do composto
desconhecido (B).
ln[BH+/BiH+]
1
0
1373
-1
PA(Bi)
1378
1383
1388
1393
-2
-3
-4
+
+
Figura 1.6 – Gráfico ln [BH /BiH ] vs ΔH(Bi), que permite a determinação da afinidade protónica do composto
desconhecido através do método cinético restrito.
Quando os compostos de referência (Bi) escolhidos são estruturalmente diferentes
do composto desconhecido (B), o termo entrópico (Δ(ΔS)) não desprezável e a aproximação
usada na versão restrita do método não é válida. Nesta situação, para determinarmos estas
grandezas termodinâmicas, temos de aplicar o método cinético estendido (20). Para tal,
9
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
1. Introdução
1.2. Método Cinético de Cooks
define-se uma basicidade aparente, ∆Gapp, para o composto desconhecido (23). Reconhecese que o termo entálpico ΔH(B)/RTeff = PA(B)/RTeff resultante do gráfico da Figura 1.6 não é
realmente uma entalpia mas uma energia de energia de Gibbs visto que o termo entrópico
não é desprezável. Considerando
∆*233 ')
!"##
=
∆')
!"##
−
∆'∆()
(23)
Para se obter um verdadeiro valor de ΔH(B), a partir da equação 23, fez-se uma
representação gráfica de ∆Gapp(B)/RTeff vs 1/RTeff. Primeiramente, através de um conjunto de
gráficos, do tipo do gráfico 1.6, conseguímos obter os vários valores de basicidade aparente
(∆Gapp(B)) com várias temperaturas efectivas (Teff) associadas. Para tal, foi necessário realizar
uma série de experiências em diferentes condições, como por exemplo, a diferentes
energias de colisão para termos diferentes Teff.
Um segundo gráfico, ∆Gapp(B)/RTeff vs 1/RTeff, é construído a partir do negativo os
declives (m) vs as intercepções (b), que resultaram do primeiro gráfico (figura 1.6). O valor
de afinidade protónica do desconhecido, ∆H(B), correspondem ao declive, m’ (figura 1.7). A
variação de entropia, Δ(ΔS), vai ser obtida através do valor da ordenada na origem (b’) da
mesma figura. [47]
450
∆Gapp/RTeff
425
400
375
350
325
300
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
1/RTeff
Figura 1.7 – 2ª Representação gráfica do método cinético estendido, ΔGapp/RTeff vs 1/RTeff, que permite a
determinação da afinidade protónica do composto desconhecido.
O método cinético tem-se mostrado uma alternativa ao método de equilíbrio e de
bracketing na determinação de um grande número de grandezas termoquímicas em fase
gasosa como a acidez, basicidade, energia de ionização, afinidades protónica e electrónica,
10
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
1. Introdução
1.2. Método Cinético de Cooks
bem como a afinidade para iões metálicos. Para cada caso o formalismo tem sofrido as
adaptações necessárias.
Este método tem sido bastante utilizado, pois:
é sensível a pequenas variações nos valores termodinâmicos.
pode ser aplicado em qualquer espectrómetro de massa com capacidade de realizar
experiências de espectrometria de massa tandem.[35]
pode ser aplicado a compostos não-voláteis e termicamente instáveis.
Neste trabalho, como se utiliza um ciclo termoquímico de iões negativos (13)
necessitamos do valor da acidez em fase gasosa (∆acH), para determinar a energia de
dissociação de ligação OH (12), que é decisivo para conhecer o valor da acidez dos
compostos fenólicos e relacionar-lo com a sua função antioxidante.[15,
24]
Assim, o
heterodímero é constituído a partir de um composto fenólico que tem uma acidez
desconhecida (ArOH) e outro que tem uma acidez conhecida (RH).[23, 33, 34]
45 + 0 6 ←45 … … 06 → 456 + 0
(24)
A acidez em fase gasosa de ArOH, ΔacG(ArOH) e afinidade protónica de ArO-,
ΔacH(ArO-), podem ser obtidas experimentalmente através da aplicação do método cinético
recorrendo à espectrometria de massa tandem (MS/MS).
11
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
1. Introdução
1.3. Espectrometria de Massa
1.3. Espectrometria de Massa
A espectrometria de massa é uma técnica que envolve a produção de iões em fase
gasosa a partir dos compostos a analisar, sendo depois separados de acordo com a sua razão
massa/carga (m/z). Esta análise pode fornecer-nos informação qualitativa, estrutural e
quantitativa sobre as moléculas de analito.[48] Os espectrómetros de massa, em geral, são
constituídos pelo sistema de introdução de amostra, fonte de ionização, analisador de massa
e detector (Figura 1.8).[49]
Fonte de
Ionização
Analisador
Sistema de
Introdução da
Amostra
Detector
Sistema de dados
(Tratamento de
dados)
Figura 1.8 – Diagrama esquemático de um espectrómetro de massa comum.
O aparelho é mantido sob vácuo de modo a aumentar o número de iões que
conseguem atravessar o instrumento sem qualquer interferência.[50] No esquema da figura
1.8, a fonte está incluída no sistema de vácuo mas isso não acontece nas técnicas de
ionização que operam à pressão atmosférica, como por exemplo ESI, APCI e APPI. Os iões
produzidos na fonte de ionização são transferidos posteriormente para o analisador do
espectrómetro de massa onde são separados de acordo com m/z.[51] Existem vários tipos de
analisadores de massa:
•
quadrupolo (englobando os quadrupolos simples e triplos)[52];
•
ion trap[53];
•
orbitrap[54];
•
sectores (magnético e electrostático)[50];
•
tempo de vôo (TOF);
•
ressonância ciclotrónica de iões com transformada de Fourier (FTICR)[49].
12
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
1. Introdução
1.3. Espectrometria de Massa
O detector é o último elemento do espectrómetro de massa e consiste geralmente
num multiplicador de electrões.
1.3.1. Ionização
Existem vários métodos de ionização, sendo que os mais utilizados são a ionização
electrónica (EI), a ionização química (CI), a ionização por electrospray (ESI), a ionização
química à pressão atmosférica (APCI), o bombardeamento com átomos/iões rápidos (FAB) e
a ionização/desadsorção laser assistida por matriz (MALDI).[51, 55] Para cada amostra e tipo de
estudo existe um método de ionização adequado, onde o sistema de introdução da amostra
pode variar. [56]
1.3.1.1. Ionização por Electrospray
A ionização por electrospray (ESI) é uma técnica de ionização suave que permite a
preservação, em fase gasosa, das interacções não-colaventes entre moléculas que existem
em solução.[57] Existem quatro tipos normalmente referidos de interações não-covalentes
que são as ligações de hidrogénio, as ligações iónicas, as forças de van der Waals e as
interações hidrofóbicas. Neste trabalho a técnica de ionização utilizada foi o electrospray
(ES), pois esta técnica permite estudar um heterodímero, que se trata de um ião constituido
por dois aniões resultantes de compostos diferentes, neste caso, do composto em estudo e
da referência ligados por um protão.[33]
A ESI distingue-se por:
•
Ter a capacidade de produzir iões multiplamente carregados com um número de
carga elevado, reduzindo a razão m/z, tornando possível analisar compostos de
elevada massa molecular, mesmo em espectrómetros de massa com um mass
range limitado.
•
As amostras a analisar devem ser introduzidas em solução, o que faz com que
seja possível o acoplamento com muitas técnicas de separação.
•
Como a técnica de ionização é suave permite que as interacções não-colaventes
entre moléculas que existem em solução sejam preservadas em fase gasosa.[58]
13
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
1. Introdução
1.3. Espectrometria de Massa
A ionização por electrospray (ESI) é compatível com todos os tipos de cromatografia,
mas neste estudo não foi necessário aplicar uma técnica hifenada, fazendo-se a injecção
directa da solução em estudo.
No caso da ionização por electrospray (ESI), a fonte encontra-se à pressão
atmosférica e a evaporação do solvente é potenciada por um fluxo contra corrente de um
gás (azoto). Os iões gerados à pressão atmosférica são depois transferidos para o analisador
de massa que se encontra em vácuo.[59]
A produção de iões em electrospray divide-se essencialmente em dois passos, na
dispersão de gotas altamente carregadas e na evaporação da gota. Inicialmente, a amostra é
introduzida em solução através de um capilar de aço inoxidável. A ponta do capilar, onde o
analíto em solução é introduzido e pulverizado, é mantido a um potencial relativamente
elevado em relação a um contra-eléctrodo, levando à formação de gotas pequenas e
altamente carregadas (figura 1.9). Posteriormente, as moléculas do analíto são separadas do
solvente, na forma de iões.[57, 59, 60]
Figura 1.9 – Diagrama esquemático de uma fonte de ionização de um electrospray (ESI).
A formação de iões é provavelmente a parte menos compreendida do processo de
electrospray.[59] Existem alguns modelos propostos para a formação de iões, sendo os
principais o modelo de carga residual e modelo de evaporação iónica.[59, 61]
No modelo de carga residual, os iões são formados a partir de gotas carregadas, este
modelo envolve três passos: (1) a densidade de carga aumenta com a evaporação do
solvente, levando (2) a que as forças de repulsivas de Coulomb entre as cargas superficiais
14
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
1. Introdução
1.3. Espectrometria de Massa
ultrapassem a tensão superficial, originando (3) a divisão da gota inicial. Este processo
continua até que cada gota contenha apenas uma única molécula, que terá parte da carga
inicial, formando os iões (figura 1.10).
Figura 1.10 – Modelo de carga residual.
No modelo de evaporação iónica, os iões formam-se em três passos: (1) a dispersão
de um spray fino de gotículas carregadas, seguidas pela (2) a evaporação do solvente e (3) a
ejecção de iões a partir das gotículas altamente carregadas. Este mecanismo foi aplicado por
Fenn (figura 1.11).
Figura 1.11 – Modelo de evaporação iónica.
Assim, a solução que emerge do capilar é dispersa num aerossol com gotículas
carregadas por acção do campo eléctrico acima referido e de um gás nebulizador (azoto). As
gotículas diminuem a sua dimensão através da evaporação assistida pelo gás de secagem ou
contra-corrente. Sendo a amostra convertida maioritariamente em iões livres de solvente.
Os iões passam por um skimmer(s) para uma zona de pressão inferior à pressão atmosférica.
O(s) skimmer(s) são cone(s) com um orifício pequeno (figura 1.9), que permitem estabelecer
um gradiente de pressão entre a fonte iónica e o analisador.[59] O skimmer actua também
como um separador de momento, separando os iões amostra, mais pesados, das moléculas,
mais leves, do solvente e do gás. Posteriormente, os iões são transferidos para o analisador
onde são medidas as razões m/z.
1.3.2. Analisador
Os analisadores utilizados neste estudo foram a ion trap e o FTICR (Ressonância
Ciclotrónica de Iões com Transformada de Fourier).
15
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
1. Introdução
1.3. Espectrometria de Massa
1.3.2.1. Ion trap
A ion trap é constituída por três eléctrodos aos quais são aplicados potenciais,
formando uma rede de captura que aprisiona as partículas carregadas ou os iões gasosos.
Dois desses eléctrodos são os eléctrodos endcap, que apresentam uma geometria
hiperbólica (figura 1.12). Um dos eléctrodos endcap tem pequenos orifícios através dos
quais os iões passam periodicamente para o analisar, enquanto que o outro tem vários
orifícios pequenos que estão dispostos centralmente e pelos quais os iões passam em
direcção ao detector. O terceiro eléctrodo é um eléctrodo anelar, que está posicionado
entre os dois eléctrodos endcap.[62, 63]
Figura 1.12 – Representação esquemática de uma ion trap.
Assim, os iões produzidos na fonte entram na ion trap, onde são aplicadas várias
voltagens entre os eléctrodos, de modo a aprisionar e ejectar os iões de acordo com as suas
razões massa/carga (m/z).[49]
As voltagens aplicadas têm duas componentes, a corrente alterna (AC) e as
radiofrequências (rf). Ao entrarem num campo eléctrico, os iões oscilam e, a uma
determinada radiofrequência, os iões de uma determinada massa estão num estado de
oscilação que os leva a descrever uma trajectória estável que lhes permite atravessar a ion
trap e chegar ao detector. Dentro destas condições nem todas as massas alcançam um
estado de oscilação que lhe permita ter uma trajectória estável, ficando retidas nas paredes
da ion trap, permitindo que haja separação de massas.[51, 53, 62]
A voltagem da AC é alterada para variar a resolução. Se a voltagem AC estiver
desligada, a ion trap opera apenas em modo rf.[52] Neste caso, a ion trap não está a ser
16
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
1. Introdução
1.3. Espectrometria de Massa
utilizada como analisador, mas antes como célula de colisão, permitindo a execução de
espectrometria de massa tandem.[53, 64]
1.3.2.2. FTICR
O FTICR (Ressonância Ciclotrónica de Iões com Transformada de Fourier) envolve a
acção simultânea do campo eléctrico e magnético para confinar os iões numa região finita
do espaço e aí os analisar e detectar. Toda a experiencia de FTICR ocorre numa célula de
confinamento de iões formada por três pares de pratos em oposição que têm funções
específicas de confinamento, excitação e detecção dos iões a serem analisados (figura
1.13).[49, 65, 66]
Figura 1.13 – Representação esquemática de um FTICR.
A célula está colocada na zona homogénea do campo magnético confinando cada ião
radialmente, obrigando-o a descrever um movimento ciclotrónico com uma frequência que
é função da respectiva razão massa/carga, enquanto o campo eléctrico gerado por um
potencial electrostático é aplicado nos pratos de confinamento mantendo o ião num fosso
de potencial na direcção de z, que corresponde ao campo magnético da figura 1.13.[46, 67]
Os três movimentos naturais do ião são o movimento ciclotrónico, o movimento do
magnetrão e a movimento por aprisionamento (figura 1.14). No entanto, as frequências do
magnetrão e do movimento por aprisionamento são muito mais baixas que as frequências
ciclotrónicas, não sendo geralmente detectadas.[65, 67]
17
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
1. Introdução
1.3. Espectrometria de Massa
Figura 1.14 – Movimentos naturais do ião, onde νm é a frequência do magnetrão, νc é a frequência ciclotrónico
e νT é a frequência por aprisionamento.
O movimento ciclotrónico só por si não é muito útil. Deste modo, todas as aplicações
se baseiam na excitação por aplicação de um campo eléctrico espacialmente uniforme com
frequência igual, ou próxima, à frequência ciclotrónica dos iões de uma dada razão
massa/carga. A excitação em FTICR é usada de três formas (figura 1.15):
•
para acelerar coerentemente os iões até trajectórias com raios maiores, tornando
possível a sua detecção;
•
para aumentar a energia cinética do ião acima do limite de dissociação iónica
e/ou para a reacção ião-molécula;
•
para acelerar os iões até trajectórias com raio superior ao raio da célula de modo
a removê-los (ejecção).[46, 67, 68]
Figura 1.15 – Três forma de aplicar a excitação. Esquerda: aceleração dos iões até uma trajectória
espacialmente coerente e detectável. Centro: Aumento da energia cinética acima do limite para a dissociação
activada por colisão ou reacção. Direita: ejecção dos iões de uma dada razão massa/carga.
Desta forma, os iões presentes na célula, são sujeitos a um campo eléctrico oscilante
de radiofrequências (rf), transmitido através dos pratos de excitação. Quando as
radiofrequências entram em ressonância com as frequências de ciclotrão dos iões, há
absorção de energia que obriga os iões a deslocarem-se para uma órbita com maior raio,
aproximando-se dos pratos de detecção, induzindo aí uma corrente.[65, 67] Essa corrente é
18
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
1. Introdução
1.3. Espectrometria de Massa
uma sobreposição das frequências de ciclotrão dos diferentes iões sujeitos a excitação, com
amplitudes que são proporcionais ao número de iões. O sinal trasiente é convertido numa
voltagem, digitalizado e sujeito a uma transformada de Fourier, a qual revela as frequências
e intensidades que são depois convertidas em massas e abundâncias iónicas (figura 1.13).[65,
69]
O FTICR-MS foi acoplado a todos os tipos de fontes iónicas, onde se observou que a
maioria funcionava melhor fora do campo magnético. Assim, foram desenvolvidos vários
métodos para conduzir os iões, gerados externamente, para a célula.
Tal como na ion trap é possível realizar experiências de espectrometria de massa
tandem, na célula do ICR.[46, 70]
Como pudemos observar ambos usaram a mesma técnica de ionização, sendo ela, o
electrospray (ES). A distinção entre os dois espectrómetros, foi o analisador, sendo que um
tinha a ion trap e o outro o FTICR. Apesar dos dois analisadores serem diferentes, ambos são
capazes de funcionar como câmaras de colisão permitindo realizar espectrometria de massa
tandem, que foi vital para efectuarmos a determinação experimental dos parâmetros
termoquímicos, em fase gasosa, descritos em capítulos anteriores.
1.3.3. Detectores
O detector é o último elemento do espectrómetro de massa, onde se converte a
corrente iónica em electrões ou fotões. Existem vários tipos de detectores, sendo um dos
mais comuns o multiplicador electrónico ou o fotomultiplicador.[48]
O detector da ion trap utilizada neste trabalho é um multiplicador de electrões.[71] O
multiplicador de electrões utiliza uma tensão de aceleração sobre os iões levando-os a
embater num dínodo de conversão produzindo uma emissão secundária de electrões, que
sofre multiplicação por embate nos estágios seguintes do multiplicador. A corrente iónica é,
assim, convertida em corrente eléctrica que é amplificada e susceptível de ser medida.
1.3.4. Espectrometria de massa tandem com dissociação induzida por colisão (CID)
A espectrometria de massa tandem consiste na activação de um ião primário, “ião
percursor”, que é dissociado ou reage, dando origem a um ião ou mais iões secundário que
são analisados, “iões produto”. Para realizar espectrometria de massa tandem, um
19
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
1. Introdução
1.3. Espectrometria de Massa
espectrómetro de massa deve ser constituído, normalmente, por dois ou mais analisadores.
No primeiro analisador, selecciona-se e isola-se um ião com uma razão m/z, que é
transferido para uma câmara de colisões onde é excitado e sofre posterior fragmentação. A
fragmentação é realizada habitualmente através de dissociação induzida por colisão (CID)
com um gás. Seguidamente, faz-se a análise de massa dos iões fragmento num segundo
analisador de massa.[49, 72, 73]
Neste trabalho experimental, utilizaram-se equipamentos com um único analisador,
uma ion trap e um FTICR, que pode funcionar como célula de colisões e realizar várias
análises de massa sucessivas. Estes passos ocorrem com separação temporal. Na ion trap, a
CID é realizada, geralmente, na própria ion trap que funciona como câmara de colisões, onde
um gás inerte (hélio ou outro) presente na célula de colisão, bombardeia os iões
seleccionados da amostra, causando a sua fragmentação. No FTICR, a CID é realizada,
geralmente, na célula do ICR funcionado como câmara de colisões colidindo com um gás,
onde é aplicada uma frequência que vai excitar os iões seleccionados, causando a sua
fragmentação. A CID de uma espécie iónica isolada, tanto na ion trap como no FTICR, é uma
técnica poderosa para a determinação da estrutura de iões.[73] No entanto, neste estudo,
esta técnica, CID, irá permitir o estudo da decomposição do heterodímero, para aplicação do
método cinético.[23, 34]
Uma das vantagens da espectrometria de massa tandem é que podemos utilizar
compostos sem purificação prévia, pois podemos selecionar e isolar o ião de interesse.
Como foi referido anteriormente, para além da determinação experimental da acidez
em fase gasosa de alguns fenóis substituídos, também se fez o estudo teórico desses
mesmos compostos. A termoquímica de fase gasosa utiliza os cálculos teóricos na
confirmação dos valores obtidos e também na informação estrutural que é dificilmente
obtida por espectrometria de massa.
O objectivo final é determinar da entalpia de dissociação da ligação O-H, DHᵒ (ArO-H),
nesses mesmos compostos. Assim, este estudo vai dividir-se em duas partes, num estudo da
acidez e num estudo das afinidades electrónicas. O estudo teórico da acidez vai
complementar o trabalho experimental, pois vamos obter um valor que deve confirmar o
valor obtido experimentalmente, para além de esclarecer o grupo funcional em que ocorre a
desprotonação. O estudo teórico das afinidades electrónicas foi feito apenas teóricamente,
dada a dificuldade de o obter experimentalmente.
20
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
2. Parte Experimental
2.1 Reagentes
2. Parte Experimental
2.1. Reagentes
Os compostos em estudo foram o 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)propenoic acid (ácido
cafeico) e o (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (trolox), que foram
obtidos na Sigma-Aldrich e utilizado sem purificação prévia. Também o α,α,α-tocopherol
(vitamina E), obtido na Acros Organics, foi objecto de estudo e utilizado sem purificação
prévia. As principais características dos compostos em estudo encontram-se descritas na
tabela seguinte (tabela 2.1).
O solvente escolhido foi o metanol, obtido no VWR com uma pureza de 99,8%. A
selecção do solvente é importante, pois tem que ser capaz de dissolver a amostra
completamente, caso contrário, a amostra pode precipitar e bloquear o capilar da fonte de
ionização utilizada.
Tabela 2.1 – Características dos compostos em estudo.
Composto
Fórmula estrutural
Fornecido
Massa
Razão m/z da
por (grau
Molecular
molécula
de pureza)
(Da)
desprotonada [R-]
250,29
249
180, 16
179
430,71
429
SigmaTrolox
Aldrich
(C14H18O4)
(97,0%)
Ácido
Sigma-
Cafeico
Aldrich
(C9H8O4)
(98,0%)
α,α,α-
Acros
tocopherol
Organics
(C29H50O2)
(98,0%)
Os compostos utilizados como referências para este estudo foram o fenol, o 4fluorofenol,
o
4-clorofenol,
o
ácido
benzóico,
o
3-(Trifluorometil)fenol,
o
4-
(Trifluorometil)fenol, o ácido nicotínico, a 4-hidroxiacetofenona, o ácido 4-hidroxibenzóico, o
4-hidroxibenzoato de metilo, o ácido 4-cianobenzóico, o ácido 2-hidroxibenzóico, o ácido
21
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
2. Parte Experimental
2.1. Reagentes
2,5-dihidroxobenzóico, o ácido 2,4,6-trihidroxiacetofenona e o ácido pícrico. Estas
referências foram obtidas de diferentes fornecedores (tabela 2.2), tendo sido utilizadas sem
qualquer purificação.
Tabela 2.2– Características dos compostos de referência utilizadas neste estudo.
Compostos de
Referência
Fornecido por
Massa
(grau de
Molecular
pureza)
(Da)
Fórmula
∆acH
∆acG
(kJ/mol)
(kJ/mol)
122,16
1467
1436
108,14
1465
1437
221,13
1465
1434
122,16
1463
1435
154,16
1462
1431
94,11
1462
1431
112,10
1451
1422
128,56
1435
1407
estrutural
3,4-Dimetilfenol
Sigma-Aldrich
(C8H10O)
(98,0%)
4-Metilfenol
Sigma-Aldrich
(C7H8O)
(98,0%)
Cromanol
Sigma-Aldrich
(C14H20O)
(99,0%)
4-Etilfenol
Sigma-Aldrich
(C8H10O)
(98,0%)
3,4Sigma-Aldrich
Dimetóxidofenol
(98,0%)
(C8H10O3)
Fenol
Sigma-Aldrich
(C6H6O)
(98,0%)
4-Fluorofenol
Sigma-Aldrich
(C6H5OF)
(99,0%)
4-Clorofenol
Sigma-Aldrich
(C6H5OCl)
(99,0%)
22
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
2. Parte Experimental
2.1. Reagentes
Tabela 2.2 – Continuação das características dos compostos de referência utilizadas neste estudo.
Composto de
Referência
Fornecido por
Massa
(grau de
Molecular
pureza)
(Da)
Fórmula
∆acH
∆acG
(kJ/mol)
(kJ/mol)
162,11
1419
1391
152,15
1410
1382
162,11
1410
1381
138,12
1405
1376
136,15
1404
1375
123,15
1399
1370
147,13
1372*
1342
138,12
1362
1330
154,12
1360*
1329
estrutural
3-(Trifluorometil)
Sigma-Aldrich
fenol
(99,0%)
(C7H5F3O)
4-Hidroxibenzoato
Panrec
de metilo (C8H8O3)
(99,8%)
4-(Trifluorometil)
Sigma-Aldrich
fenol
(99,0%)
(C7H5F3O)
Ácido 4Acros Organics
hidroxibenzóico
(99,8%)
(C7H6O3)
4-hidroxiAcros Organics
acetofenona
(99,8%)
(C8H8O2)
Ácido Nicotínico
Acros Organics
(C6H5NO2)
(99,8%)
Ácido 4Acros Organics
cianobenzóico
(99,0%)
(C8H5NO2)
Ácido 2Sigma-Aldrich
hidroxibenzóico
(99,0%)
(C7H6O3)
Ácido 2,5Fluka
dihidroxibenzóico
(98,0%)
(C7H6O4)
* Valores calculados utilizando uma relação da literatura.
[23]
23
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
2. Parte Experimental
2.2. Procedimento Experimental
Tabela 2.2 – Continuação das características dos compostos de referência utilizadas neste estudo.
Composto de
Referência
Fornecido por
Massa
(grau de
Molecular
pureza)
(Da)
Fórmula
∆acH
∆acG
(kJ/mol)
(kJ/mol)
154,12
1360*
1329
212,07
1354
1325
168,15
1353
1324
229,10
1298
1267
estrutural
Ácido 2,5Fluka
dihidroxibenzóico
(98,0%)
(C7H6O4)
Ácido pentafluoro
Sigma-Aldrich
Benzóico
(99,0%)
(C8H8O4)
Ácido 2,4,6Acros Organics
trihidroxibenzóico
(98,0%)
(C8H8O4)
Ácido Pícrico
Sigma-Aldrich
(C6H3N3O7)
(99,0%)
* Valores calculados utilizando uma relação da literatura.
[23]
2.2. Procedimento Experimental
2.2.1. Preparação das soluções
Neste estudo de compostos fenólicos em fase gasosa recorreu-se ao uso de soluções
com concentração de 10-4 M. Para tal, começou-se por pesar o composto em estudo (por
exemplo 0,02519g de trolox, ou 0,01801g de ácido cafeico ou 0,04301g de vitamina E) numa
balança Sartorius CP225D, que foi dissolvido em 1000 µl de metanol, originando uma
solução de 10-1 M. Essa solução sofreu diluições sucessivas até originar uma solução de 10-3
M. Para a preparação da referência utilizou-se o mesmo método, alterando-se apenas a
massa de composto de acordo com a referência a utilizar.
Deste modo, preparou-se uma solução de 10-3 M do composto em estudo e da
referência. De seguida, retirou-se uma alíquota de 100 µl de cada solução, que se juntaram,
formando uma solução com 200 µl que foi completa com metanol para originar uma solução
de 1000 µl com uma concentração da ordem dos 10-4 M.
24
Correlação da função antioxidante a com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
2. Parte Experimental
2.2. Procedimento Experimental
Depois de preparadas as soluções, introduziram-se no espectrómetro de massa com
o fim de serem analisadas.
2.2.2. Condições Experimentais para aplicação do Método Cinético
Quando introduzimos a solução no espectrómetro temos de selecionar as condições
experimentais de modo observar os iões na forma aniónica ou catiónica. Para estudar a
acidez necessitamos que se formem aniões, para tal o modo que vai se empregue neste
estudo vai ser o modo negativo. Com este modo, é possível observar os aniões resultantes
da dissociação do ácido em estudo, originando o ião do ácido (AcO-) e o protão (H+), isto é,
75 → 756 + (25)
Após as soluções serem preparadas, contendo o composto em estudo e uma
referência, injectaram-se directamente no espectrómetro de massa, através de uma bomba
de seringa (a velocidade constante de 5 µl/min). Os espectrómetros de massa utilizados para
aplicar o método cinético foram o LCQ Duo Thermoquest da Finnigan e o FTICR (Ressonância
Ciclotrónica de Iões com Transformada de Fourier) da Bruker Daltonic.
O LCQ Duo Thermoquest da Finnigan é constituído por um analisador de massa ion
trap e equipado com uma fonte de ionização electrospray, estando acoplado a um
computador equipado com o software Xcalibur, que permite o controlo do aparelho e a
aquisição, armazenamento e processamento de dados.[71] Neste espectrómetro de massa,
foi aplicado o método cinético restrito e o método cinético estendido.
Para aplicar o método cinético, todos os parâmetros do espectrómetro de massa
foram optimizados para cada experiência para melhorar as razões sinal/ruído para os iões de
interesse. Assim, houve parâmetros que se mantiveram constantes em todas as experiências
como a voltagem aplicada ao spray na fonte que foi de 4,5 kV e a temperatura que foi de
200ᵒC. De modo a maximizar a abundância do heterodímero, optimizou-se a voltagem
aplicada no capilar e no tube lens offset.
O gás nebulizador e o gás auxiliar utilizado foi em ambos os casos o azoto. A pressão
medida durante as experiências no skimmer foi de 1,21 Torr e a pressão no ion trap com a
adição de hélio foi de 2,33x10-5 Torr.
Fez-se um estudo do comportamento dos compostos em estudo (trolox, ácido
cafeico e α-tocoferol) em modo negativo e positivo, observando os iões mais abundantes
25
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
2. Parte Experimental
2.2. Procedimento Experimental
em cada caso. Também se fez um estudo da concentração e do solvente a utilizar, para obter
o melhor sinal para os iões em estudo.
Finalmente, fez-se a determinação da acidez em fase gasosa dos mesmos compostos
em modo negativo, logo na sua forma aniónica. Para tal, variaram-se as energias de colisão
aplicadas, após isolarmos o ião heterodímero. Variaram-se as energias de colisão
normalizada no intervalo de 5 a 20%, tendo sido feito em média 5 ensaios a cada energia de
colisão normalizada.[74] Como se pode observar, estas energias de colisão normalizadas
(NCE) vêm expressas em percentagem, logo têm de ser transformadas em voltagens pico a
pico (Vp-p), através da seguinte equação
:;<
8969 = =%
× ? × '.⁄@) + 1
(26)
Onde m/z é a razão massa/carga, a e b são pârametros experimentais.[75, 76]
O FTICR tem a capacidade de aplicar dois métodos de ionização distintos, a ionização
por electrospray (ES) e por MALDI (Ionização/ Desadsorpção da Matrix Assistida por Laser),
sendo que nesta experiência utilizou-se a ionização por electrospray (ES). O analisador de
massa deste espectrómetro é a célula de ICR (Ressonância Ciclotrónica de Iões), onde foram
realizadas as experiências de SORI-CID (Irradiação Fora de Ressonância Sustentada Dissociação Induzida por Colisão). O FTICR-MS está acoplado a um computador equipado
com o software Apex , que permite o controlo do aparelho e a aquisição, armazenamento e
processamento de dados.[77] Neste espectrómetro de massa, foi realizado apenas o método
cinético estendido.
Todos os parâmetros do FTICR-MS foram optimizados para cada experiência de modo
a melhorar as razões sinal/ruído para os iões de interesse. Assim, houve parâmetros que se
mantiveram constantes em todas as experiências como as voltagens aplicada no capilar que
foram de 4,5 / 4 kV e a temperatura do gás de secagem que foi de 200ᵒC. Mas para aplicar o
método cinético estendido e maximizar a abundância do heterodímero foi necessário alterar
certos parâmetros. Para aplicar o método cinético estendido na célula de ICR, foram
realizadas as experiências de SORI-CID (Irradiação Fora de Ressonância Sustentada Dissociação Induzida por Colisão). No SORI, o ião percursor (o ião heterodímero) é excitado a
uma frequência ligeiramente superior à sua frequência ciclotrónica. Deste modo, os iões
sofrem múltiplos ciclos de aceleração/desacelaração, que dão origem a um grande número
de colisões com o gás inerte, o Argon. Este fenómeno, faz com que o ião percursor (o ião
26
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
2. Parte Experimental
2.2. Procedimento Experimental
heterodímero) absorva cada vez mais energia, até causar sua dissociação e formar os iões
produto. Para tal, tem que se alterar certos parâmetros.[77,
78]
Primeiramente, tem-se de
ajustar a pressão do gás de colisões através de um conjunto de válvulas, até chegar aos 8
mbar de pressão. Depois, fez-se o isolamento do ião na célula de ICR. Ao isolarmos o ião na
célula de ICR, vão aparecer novos parâmetros que têm de ser optimizados. Finalmente,
fragmenta-se o ião seleccionado através do SORI-CID, sendo necessário ajustar parâmetros
como a frequency offset, a duração do pulso rf e a potência de SORI a aplicar. Ao utilizar
diferentes valores para frequency offset e a potência de SORI, vamos influenciar a oscilação
do ião. Variou-se a frequency offset de 0Hz a 300Hz e a variou-se a potência de SORI de 0 a
0,03 %.
27
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.1.Ácido Cafeico
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.1. Ácido Cafeico
3.1.1. Aplicação do Método Cinético Restrito
Inicialmente, o ácido cafeico (figura 1.4), foi analisado em modo negativo, para se
observar o ião correspondente ao ácido cafeico desprotonado (ACa-) de m/z de 179.
? → ?6 + (27)
Ao introduzir a amostra no espectrómetro de massa obteve-se o seguinte espectro
(figura 3.1), onde se pode verificar que o ião mais abundante é o ácido cafeico desprotonado
(m/z 179).
-4
Figura 3.1 - Espectro MS da solução 10 M de ácido cafeico, obtido em modo negativo.
Para além do ião do ácido cafeico (m/z 179), também podemos observar o ião
homodímero do ácido cafeico (m/z 359) e um ião de m/z 135 que corresponde a um
fragmento do ácido cafeico. Tendo o ião do ácido cafeico (m/z 179) com uma intensidade
relativa elevada, fez-se o seu isolamento, seguido de uma dissociação induzida por colisão
(CID), obtendo-se os iões mais característicos da sua fragmentação (figura 3.2). Nesta análise
verificou-se que o ião do ácido cafeico (m/z 179) perde uma massa de 44 Da (perda do grupo
carbonilo) originando um fragmento de m/z 135. Posteriormente, ainda se fez um MS3 ao
29
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.1.Ácido Cafeico
ião de m/z 135, queoriginou dois fragmentos que correspondem à perda de 18 Da (uma
molécula de água) e à perda de 28 Da (C2H4) (Figura 3.3). Para ter a certeza desta
fragmentação teria de se recorrer à determiação de massas exactas.
2
Figura 3.2 - a) Espectro ESI-MS do ião do ácido cafeico (m/z 179) à energia de colisão normalizada de 20% b)
3
Espectro ESI-MS do fragmento m/z 135 do ácido cafeico à energia de colisão normalizada de 30%.
OH
O
- 44 Da
O
OH
(CO2)
OH
O
m/z 135
m/z 179
- 28 Da
- 18 Da
(H2O)
(C2H4)
O
O
OH
m/ z 117
m/ z 107
Figura 3.3 – Esquema de fragmentação do ácido cafeico.
30
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.1.Ácido Cafeico
Após o estudo referido passou-se à determinação da acidez em fase gasosa do ácido
cafeico. Para essa determinação, utilizou-se o método cinético restrito, onde se associou o
ácido cafeico com vários compostos de referência (tabela 3.1), que têm uma acidez
conhecida para formar um heterodímero, que é constituído pelo anião ácido cafeico e o
anião de um dos compostos de referência ligados por um protão. Assim, espera-se que
apareçam três iões no espectro de massa MS2 do heterodímero, o heterodímero e cada um
dos iões presentes na sua composição.
Tabela 3.1 – Referências utilizadas com o respectivo valor de ∆acH e ∆acG.
Razão m/z da molécula
∆acH
∆acG
desprotonada [R-]
(kJ/mol)
(kJ/mol)
Ácido Benzóico (C7H6O)
121
1423
1394
Ácido 4-hidroxibenzóico (C7H6O3)
137
1405
1376
4-hidroxiacetofenona (C8H8O2)
135
1404
1375
Ácido Nicotínico (C6H5NO2)
122
1399
1370
Ácido 4-cianobenzóico (C8H5NO2)
146
1372*
1342
Ácido 2-hidroxibenzóico (C7H6O3)
137
1362
1330
Ácido 2,5-dihidroxibenzóico (C7H6O4)
153
1360*
1329
Ácido pentafluorobenzóico (C8H8O4)
211
1354
1325
Ácido 2,4,6-trihidroxibenzóico (C8H8O4)
167
1353
1324
Ácido Pícrico (C6H3N3O7)
228
1298
1267
Compostos de Referência
* Valores calculados utilizando uma relação da literatura.
[23]
No projecto de licenciatura, fez-se a determinação da acidez em fase gasosa para
outro composto fenólico, o trolox (figura 1.5).[79] Nesse trabalho, concluímos que o trolox era
um antioxidante bastante ácido comparando com outros compostos fenólicos estudados. O
trolox para além do grupo fenólico também tinha um grupo ácido carboxílico na sua
estrutura, o que poderia influenciar a sua acidez. Assim, como o ácido cafeico também tem
um grupo ácido carboxílico na sua estrutura suspeitou-se que este poderia ter uma acidez da
mesma ordem de grandeza.
31
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.1.Ácido Cafeico
Como o ácido benzóico foi uma das referências utilizadas no estudo da acidez em
fase gasosa do trolox, este foi escolhido como primeiro composto de referência a utilizar no
estudo do ácido cafeico. Ao fazer uma solução de ácido cafeico com o ácido benzóico, seria
de esperar que se obtivesse um heterodímero de m/z 301, mas não aparece qualquer pico
para essa razão massa/carga. Como no espectro (Anexo B), apenas aparece o ião
correspondente ao ácido cafeico (m/z 179), conclui-se que a desprotonação está a ocorrer
apenas no ácido cafeico, levando a que o heterodímero não se forme. Logo o ácido cafeico
deve ter uma acidez muito maior que o ácido benzóico, o que impossibilita a determinação
experimental da acidez em fase gasosa, para a aplicação do método cinético com esta
referência. Quando as espécies que formam o heterodímero têm uma diferença de acidez
(ΔacH) igual ou superior a 10 kJ/mol, entre elas, podem originar espectros de massa (MS2)
com apenas dois iões, aparecendo o heterodímero e a espécie mais ácida. O ião que
corresponde à espécie menos ácida, vai receber o protão, tornado-se neutra, não
aparecendo no espectro de massa (MS2).
Assim, escolheu-se uma referência que tivesse um valor de acidez mais elevado como
o ácido 2,5-dihidróxibenzóico (tabela 3.1). Quando se analisou essa solução de ácido cafeico
com ácido 2,5-dihidróxibenzóico, era de esperar que se forma-se um heterodímero a m/z
333. Através da análise desse espectro (Anexo B), pode-se concluir que o heterodímero se
forma, mas tem um sinal muito fraco que impossibilita o seu isolamento.
Posteriormente, utilizou-se como referência o ácido nicotínico, cuja acidez se
encontra entre as duas referências anteriores (tabela 3.1). O ácido nicotínico juntamente
com o ácido cafeico formou o heterodímero (m/z 302), que tinha também um sinal muito
fraco impossibilitando o seu isolamento.
Os resultados que se estavam a obter não eram os esperados, visto que não se
conseguia um bom heterodímero com referências de diferentes zonas da escala de acidez.
Resolveu-se então fazer uma experiência com um sistema já conhecido, como é o caso do
trolox associado com a 4-hidroxiacetofenona, que foi estudado no projecto de licenciatura
na determinação da acidez em fase gasosa do trolox. Assim, utilizando este sistema
poderemos detectar se existia algum problema instrumental ou se as condições
instrumentais precisavam de ser optimizadas para melhorar o sinal do heterodímero.
Concluiu-se que as condições instrumentais tinham de ser optimizadas para valores
32
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.1.Ácido Cafeico
diferentes dos valores utilizados em estudos anteriores, como é o caso da temperatura que
passou de 200ᵒC para 150ᵒC.
Após alterar essas condições instrumentais, resolveu-se juntar o ácido cafeico e a 4hidroxiacetofenona, que deveria formar um heterodímero de m/z 315. Apesar do
heterodímero ter uma intensidade baixa procedeu-se ao seu isolamento e fragmentação.
Como é possível observar (Anexo B), quando o hélio (gás de colisão) colidia com o
heterodímero, independentemente da energia aplicada, apenas apareciam dois iões: o
heterodímero e o ião produto do ácido cafeico. Como foi referido, esta situação leva-nos a
concluir que o ácido cafeico é muito mais ácido que o 4-hidroxiacetofenona.
Sabendo que temos todas as condições instrumentais estão optimizadas prosseguiuse com o estudo para a determinação da acidez do ácido cafeico. Assim, utilizou-se
novamente o ácido nicotínico e o ácido 2,5-dihidróxibenzóico como compostos de
referência. Quando se emparelhou o ácido cafeico com o ácido 2,5-dihidróxibenzóico,
observou-se a formação do heterodímero de m/z 333 (figura 3.4). Posteriormente, isolou-se
e fragmentou-se esse ião com diferentes energias de colisão, originando mais dois iões, o do
ácido cafeico e o ácido 2,5-dihidróxibenzóico.
Figura 3.4 - a) Espectro ESI-MS do heterodímero do ácido cafeico com ácido 2,5-dihidróxibenzóico (m/z 333) b)
2
Espectro ESI-MS do heterodímero m/z 333 à energia de colisão normalizada de 7,50%.
Como podemos observar no espectro (figura 3.4), a abundância relativa do ácido
cafeico desprotonado é maior que a abundância relativa do ácido 2,5-dihidróxibenzóico
33
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.1.Ácido Cafeico
desprotonado, logo podemos concluir que o ácido cafeico é mais ácido que o ácido 2,5dihidróxibenzóico.
Desta forma, obteve-se o primeiro resultado para a determinação da acidez em fase
gasosa do ácido cafeico através do método cinético restrito. Tendo este resultado, também
se repetiu a análise da solução de ácido cafeico com ácido nicotínico, e de ácido cafeico com
ácido 4-hidroxibenzóico, nas novas condições experimentais, onde se formaram os
heterodímero de m/z 302 e 317, respectivamente. O isolamento e fragmentação destes iões,
deram origem a espectros só com um ião produto, o ácido cafeico desprotonado.
Confirmou-se que estas referências não eram adequadas, mesmo depois das alterações das
condições experimentais.
Assim, dado que as referências utilizadas eram menos ácidas que o ácido cafeico
foram-se procurar referências que seriam muito ácidas de maneira a encontrar um limite
superior. Por isso, fez-se uma solução de ácido cafeico com ácido pícrico (tabela 3.1), dando
origem ao heterodímero de m/z 408, mas verificou-se que o ácido cafeico desprotonado não
aparecia, concluindo-se que o ácido pícrico era um composto muito mais ácido que o ácido
cafeico. Estava encontrado um limite superior.
Até este momento, o único composto de referência que tinha dado um resultado
positivo era o ácido 2,5-dihidróxibenzóico. Para continuarmos o estudo, escolheram-se
várias referências com uma acidez próxima do ácido 2,5-dihidróxibenzóico e acima do ácido
pícrico (tabela 3.1). Esses compostos foram o ácido 2-hidroxibenzóico (também conhecido
como ácido salicílico), o ácido 2,4,6-trihidroxibenzóico, o ácido 4-cianobenzóico e o ácido
pentafluorobenzóico.
Ao emparelharmos o ácido cafeico com as referências anteriores, formaram-se os
respectivos heterodímeros de m/z 317, 347, 326 e 391. Depois dos heterodímeros serem
isolados e fragmentados, através de diferentes energias de colisão, obtivemos espectros MS2
dos respectivos heterodímeros (figura 3.5). Através destas referências pudemos definir um
intervalo de acidez para o ácido cafeico em fase gasosa, sendo esse intervalo entre 1372
kJ/mol e 1353 kJ/mol.
34
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.1.Ácido Cafeico
2
Figura 3.5– Espectros MS dos diferentes heterodímeros formados pelo ácido cafeico e as respectivas
referências.
Na tabela 3.2, apresenta-se um resumo dos resultados experimentais obtidos com a
aplicação do formalismo do método cinético restrito, onde se relaciona o valor da acidez das
referências com o logaritmo da razão das abundâncias iónicas.
35
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.1.Ácido Cafeico
Tabela 3.2 – Valores da razão das intensidades entre a referência e o ácido cafeico, para cada referência.
Compostos de Referência
ΔacG (kJ/mol)
ΔacH (kJ/mol)
Ln [ArO-/R-]
Ácido 2,4,6-trihidroxibenzóico
1324
1353
0,54
Ácido pentafluorobenzóico
1325
1354
-0,68
Ácido 2,5-dihidroxibenzóico
1329
1360
-1,47
Ácido 2-hidroxibenzóico
1330
1362
-2,21
Ácido 4-cianobenzóico
1342
1372
-7,33
Recordando a equação 24 e a figura 1.6, é possível fazer uma representação
semelhante para determinar a acidez em fase gasosa. Assim, fazendo um gráfico (gráfico 3.1)
do logaritmo da razão das abundâncias iónicas em função dos valores de acidez das
referências, ΔacG(RH), pudemos determinar a acidez do ácido cafeico através da seguinte
equação.
+
,'BCDE )
,' E )
- = .∆FG H'0) + 1
(28)
Onde m = - 1/RTeff e b = ΔacG (ArOH) /RTeff.
4,00
Ln [ArO-/R-]
2,00
0,00
1315
-2,00
ΔacG (kJ/mol)
1320
1325
1330
1335
1340
1345
1350
-4,00
-6,00
-8,00
y = -0,4188x + 554,72
R² = 0,9867
-10,00
-
-
Gráfico 3.1 – Representação gráfica de ln (ArO /R ) vs ΔacG (RH), que permite a determinar o valor de
acidez do ácido cafeico.
Através desta representação gráfica, determinámos o valor de acidez em fase gasosa,
ΔacG, do ácido cafeico. Dividindo b por -m, obtivemos o valor de ΔacG(ArOH), que foi de 1325
± 9 kJ/mol. Como nesta versão do método, se considera que ∆(∆S) =0, então ∆(∆acG) =
36
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.1.Ácido Cafeico
∆(∆acH), por isso em vez de utilizarmos os valores de ΔacG(RH), podemos utilizar o valor de
ΔacH(RH), para determinar a afinidade protónica do anião do ácido cafeico (tabela 3.2).
Fazendo um gráfico (gráfico 3.2) do logaritmo da razão das abundâncias iónicas em
função dos valores de acidez das referências, ΔacH(RH), pudemos determinar a afinidade
protónica do anião do ácido cafeico através da seguinte equação.
+
,'BCDE )
,' E )
- = .∆FG '0) + 1
(29)
Onde m = - 1/RTeff e b = ΔacH (ArOH) /RTeff.
4,00
Ln [ArO-/R-]
2,00
0,00
1345
-2,00
ΔacH (kJ/mol)
1350
1355
1360
1365
1370
1375
1380
-4,00
-6,00
-8,00
y = -0,3856x + 522,33
R² = 0,9458
-10,00
-
-
Gráfico 3.2 – Representação gráfica de ln (ArO /R ) vs ΔacH (RH), que permite a determinar o valor de
afinidade protónica do anião do ácido cafeico.
Através desta representação gráfica, determinámos que o valor de afinidade
protónica em fase gasosa, ΔacH, do anião do ácido cafeico. O valor obtido corresponde ao
valor da ordenada na origem, b (ΔacH(ArOH)/RTeff), que posteriormente é dividida pelo
negativo do declive, - m (1/RTeff), originando assim, o valor de ΔacH(ArOH), que foi de 1355 ±
10 kJ/mol.
3.1.2. Aplicação do Método Cinético Estendido
O ácido cafeico, para além de ser estudado pelo método cinético restrito, também foi
estudado pelo método cinético estendido. Como foi referido, o método cinético estendido,
deve se aplicar quando o termo entrópico (Δ(ΔS)) não é desprezável. Isto acontece quando
os compostos de referência escolhidos são diferentes estruturalmente do composto em
estudo.
37
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.1.Ácido Cafeico
Para a sua aplicação é necessário variar a temperatura efectiva na célula da ion trapp.
Uma forma de variar a temperatura efectiva, era variar o gás de colisões, que inicialmente
era o hélio. Dessa forma, tentou-se acoplar uma garrafa de Argon ao LCQ Duo Thermoquest
da Finnigan, mas verificou-se que o aparelho perdia a corrente iónica quando se mudava o
gás de colisão.
Posteriormente, concluiu-se que a utilização de diferentes energias de colisão na ion
trap era suficiente para variar a temperatura efectiva. Assim, em cada experiência, com o
composto em estudo e uma das referências, variaram-se as energias de colisão aplicadas,
num intervalo de 5 a 20%, após isolarmos o ião.
Antes de chegarmos a esta conclusão e visto que não conseguíamos alterar as
condições experimentais na ion trap de forma a variar a temperatura efectiva, por esta via,
decidímos recorrer ao FTICR.
Na célula do FTICR conseguimos variar certos pârametros experimentais que nos
permitiram variar a temperatura efectiva do sistema em estudo. Para tal, aplicámos uma
técnica de excitação dos iões chamada SORI (Irradiação Fora de Ressonância Sustentada)
onde variamos o valor da frequency Offset. Esta frequência trata-se de uma diferença entre
a frequência ciclotrónica do ião isolado (heterodímero) e a frequência de excitação. Está
descrito na literatura que variando este parâmetro verifica-se a variação da temperatura
efectiva.[80]
Concluíu-se que ao utilizar diferentes valores de frequency Offset, iríamos variar a
temperatura efectiva. Desta forma, após isolarmos o ião heterodímero, variaram-se essas
frequências num intervalo de 0 a 300 Hz.
Para além das diferentes condições experimentais, o tratamento dos resultados
obtidos para o método cinético estendido também é diferente. Primeiramente, temos de
fazer uma série de gráficos do logaritmo da razão das abundâncias iónicas em função dos
valores de acidez em fase gasosa das referências, ΔacH(RH). Cada gráfico foi obtido em
condições experimentais diferentes, de modo a variar a temperatura efectiva, dando origem
à seguinte equação
+
,'BCDE )
,' E )
- = .∆FG '0) + 1
Onde o declive (m) e a ordenada na origem (b) são
38
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
(30)
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.1.Ácido Cafeico
.=−
I
!"##
1 =
∆*233 'BCD)
!"##
=
∆'BCD)
!"##
−
∆'∆()
(31)
Como foram construídos diversos gráficos, são obtido vários valores de m (- 1/RTeff) e
b (ΔGapp(RH)/RTeff), um para cada gráfico construído. Com esses vários valores de m e b,
fizemos a segunda representação gráfica, que nos permite obter o valor da afinidade
protónica do anião do ácido cafeico (ΔacH(ArOH)) e o valor do termo entrópico (Δ(ΔS)/R),
pois correspondem respectivamente a m’ e a b’.
.′ = ∆'45)1′ =
∆'∆()
(32)
Assim, obtemos o valor de ΔacH(ArOH), de Δ(ΔS) e o de Teff.
3.1.2.1. Aplicação do Método Cinético Estendido na Ion Trap do LCQ Duo
Na tabela 3.3, aparece a relação entre a acidez em fase gasosa, ΔacH(RH), com o
logaritmo da razão das abundâncias iónicas, a uma determinada voltagem (Vp-p).
Tabela 3.3 – Valores da razão das intensidades entre a referência e o ácido cafeico, para cada referência, a
uma determinada voltagem pico a pico (Vp-p).
Ln [ArO-/R-]
Compostos de Referência
Amplitude de
excitação (Vp-p)
ΔacH (kJ/mol)
0,2
0,17
0,15
Ácido 2,4,6-trihidroxibenzóico
1353
0,69
0,54
0,90
Ácido pentafluorobenzóico
1354
-0,71
-0,76
-0,83
Ácido Dihidroxibenzóico
1360
-0,72
-0,71
-0,71
Ácido 2-hidroxibenzóico
1362
-1,74
-1,72
-1,84
Ácido 4-cianobenzóico
1372
-6,86
-6,72
-6,80
Com estes valores, fizemos um gráfico (gráfico 3.3) para cada conjunto de valores, do
logaritmo da razão das abundâncias iónicas em função dos valores de acidez das referências,
ΔacH(RH).
39
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.1.Ácido Cafeico
4,00
Ln [ArO-/R-]
2,00
0,00
1345
-2,00
ΔacH (kJ/mol)
1350
1355
1360
1365
1370
1375
1380
-4,00
-6,00
-8,00
y = -0,3639x + 493,18
R² = 0,8966
-10,00
-
-
Gráfico 3.3 – 1ª regressão linear - Representação gráfica de ln (ArO /R ) vs ΔacH (RH), para cada referência a
0,15 Vp-p.
Desta forma, obtivemos um conjunto de representações gráficas, um gráfico para
cada voltagem pico a pico (Vp-p), onde retiramos o valor de ΔH(ArOH) na versão restrita.
Como nos encontramos no método cinético estendido, o Δ(ΔS) é diferente de zero, logo
ΔH(ArOH) é verdadeiramente um ΔGapp(ArOH). Assim, os valores obtidos através desta
representação gráfica, m (-1/RTeff) e b (ΔGapp(ArOH)/RTeff), serão utilizados na segunda
representação gráfica (gráfico 3.4) e estão sumarizados na tabela 3.4.
Tabela 3.4 – Valores obtidos através das 1ª representações gráficas.
Amplitude de excitação
0,15
0,17
0,20
-1/RTeff (m)
0,364
0,349
0,363
ΔGapp(ArOH)/RTeff (b)
493,176
473,427
491,768
R2
0,897
0,892
0,898
Teff
330,491
344,210
331,424
Através desta representação gráfica, determinámos que o valor da afinidade
protónica em fase gasosa, ΔacH, do anião do ácido cafeico corresponde a 1361 ± 9,6 kJ/mol e
o valor da variação de entropia a 18,04 J/mol.
40
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.1.Ácido Cafeico
505
ΔGapp(RH)/RTeff
500
495
y = 1361,04x - 2,17
R² = 1,00
490
485
480
475
470
465
0,34
0,345
0,35
0,355
0,36
0,365
0,37
1/RTeff
Gráfico 3.4 – 2ª regressão linear - Representação gráfica de 1/RTeff vs ΔGapp(ArOH)/RTeff.
3.1.2.2. Aplicação do Método Cinético Estendido na célula do FTICR
Na tabela 3.5, aparece a relação entre a acidez em fase gasosa, ΔacH(RH), com o
logaritmo da razão das abundâncias iónicas, a um determinada frequency Offset (Hz).
Tabela 3.5 – Valores da razão das intensidades entre a referência e o ácido cafeico, para cada referência, a
uma determinada frequency Offset.
Ln [ArO-/R-]
Compostos de Referência
Amplitude de
excitação
(frequency Offset)
ΔacH (kJ/mol)
0 Hz
100 Hz
200 Hz
300 Hz
Ácido 2,4,6-trihidroxibenzóico
1353
0,40
0,90
1,26
1,60
Ácido 2,5-Dihidroxibenzóico
1360
-0,79
-0,68
-0,58
-0,48
Ácido 2-hidroxibenzóico
1362
-1,29
-1,22
-1,09
-0,97
Ácido 4-cianobenzóico
1372
-1,79
-1,33
-0,90
-1,15
Ácido pentafluorobenzóico*
1354
0,81
0,86
-
-
-
* O composto de referência, ácido pentafluorobenzóico, não foi contabilizado para os valores de Ln [ArO /R ].
Como podemos observar na tabela 3.5, não existem valores de ln [ArO-/R-] para todas
as frequency Offset aplicadas. Verificou-se que o heterodímero, quando foi sujeito à
dissociação por CID, após ser isolado, formava mais iões para além dos esperados, sendo
41
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.1.Ácido Cafeico
que os esperados eram o ião do heterodímero, o anião do ácido cafeico e o anião ácido
pentafluorobenzóico. Concluiu-se que o heterodímero ao dissociar-se, estava a sofrer mais
fragmentações, originando o aparecimento de mais iões do que o esperado,
impossibilitando a determinação da razão ln (ArO-/R-) (Anexo C).
Assim, com os valores apresentados na tabela anterior (tabela 3.5), construiu-se um
gráfico (gráfico 3.5) para cada conjunto de valores, do logaritmo da razão das abundâncias
iónicas em função dos valores de acidez das referências, ΔacH(RH).
1,50
y = -0,1126x + 152,45
R² = 0,8854
1,00
Ln [ArO-/R-]
0,50
0,00
1345
-0,50
∆acH (kJ/mol)
1350
1355
1360
1365
1370
1375
1380
-1,00
-1,50
-2,00
-2,50
-
-
Gráfico 3.5 – 1ª regressão linear - Representação gráfica de ln (ArO /R ) vs ΔacH(RH), para cada referência a 0Hz.
Desta forma, obtivemos um conjunto de representações gráficas, um gráfico para
cada frequency Offset, onde retiramos o valor de m (-1/RTeff) e b (ΔGapp(ArOH)/RTeff),
coeficiente de correlação e o de Teff e organizamos na tabela 3.6.
Tabela 3.6 – Valores de m e b, obtidos através das 1ª representações gráficas.
Amplitude de excitação
0 Hz
100 Hz
200 Hz
300 Hz
-1/RTeff (m)
0,113
0,112
0,105
0,137
ΔGapp(ArOH)/RTeff (b)
152,454
151,526
142,917
185,771
R2
0,885
0,727
0,588
0,716
Teff
1068,261
1076,789
1143,431
880,485
(frequency Offset)
Com os valores da tabela 3.6, pudemos contruir a segunda representação gráfica
(gráfico 3.6). Neste gráfico, determinámos que o valor da afinidade protónica em fase gasosa,
42
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.1.Ácido Cafeico
ΔacH, do anião do ácido cafeico corresponde a 1370 ± 13 kJ/mol e a valor da variação de
entropia a 12,55 J/mol.
200
ΔGapp(RH)/RTeff
180
160
140
y = 1370,34x - 1,51
R² = 1,00
120
100
0,1
0,11
0,12
0,13
0,14
0,15
1/RTeff
Gráfico 3.6 – 2ª regressão linear – Reperesentação gráfica de 1/RTeff em função de ΔGapp(ArOH)/RTeff .
3.1.3. Comparação dos resultados obtidos entre o método cinético restrito e estendido
Neste trabalho, aplicámos o método cinético em três diferentes formas, utilizámos o
método cinético restrito, método cinético estendido na ion trap e o método cinético
estendido no FTICR. Assim, obtivemos três valores de ∆acH para o ácido cafeico (tabela 3.7).
Tabela 3.7 – Valores de ∆acH obtidos através da aplicação das diferentes formas do método cinético.
Método Cinético Aplicado
ΔacH (kJ/mol)
Δ(ΔS) (J/mol)
Restrito
1354,73 ± 9,6
0
Estendido na Ion Trap
1361,72 ± 9,2
18,04
Estendido no FTICR
1370,34 ± 13
12,55
Como podemos observar na tabela 3.7, os valores obtidos estão dentro da mesma
ordem de grandeza e se considerarmos o erro experimental associado, os valores são
bastante semelhantes.
O valor obtido para o método cinético restrito é um pouco mais baixo que os outros
dois, mesmo assim é dentro das respectivas barras de erro. Dado que as referências utilizadas
eram diferentes estruturalmente do composto estudado era expectável que Δ(ΔS) fosse
43
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.1.Ácido Cafeico
diferente de zero. Assim, ao aplicar o método cinético estendido, pudemos verificar que
existe uma pequena variação entrópica.
Apesar do FTICR ser um espectrómetro de massa mais sensível e terem sido feitas mais
experiências, é interessante de observar que ao aplicar o método cinético estendido em dois
analisadores diferentes os valores obtidos para ∆acH, não são substancialmente diferentes.
Para completar e complementar este estudo experimental do ácido cafeico, também
foi feito um estudo teórico. Através desse estudo, vamos poder comparar estes três valores
com o valor teórico e prever de onde sai o protão.
44
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.2. Trolox
3.2. Trolox
3.2.1. Aplicação do Método Cinético Restrito – Consolidação de resultados
Até ao projecto de licenciatura, a maioria dos compostos estudados no grupo de
espectrometria de massa, tinha sido a acidez relativa em flavonóides e a acidez absoluta em
fenóis dissubstituído, dimetoxifenóis e o cromanol.[23, 33, 34]
Escolheu-se para o projecto de licenciatura, um composto fenólico antioxidante que
tivesse uma estrutura diferente para prosseguir o estudo da acidez. Esse composto foi o
trolox (figura 1.5), que para além do grupo fenólico também tinha o grupo carboxílico como
grupo funcional. A escolha do trolox foi feita com base na sua estrutura, pois se
substituirmos o grupo ácido carboxílico por uma cadeia alifática saturada, podemos ter o αtocoferol (figura 1.2) que é um antioxidante natural muito activo.
No estudo da acidez do trolox, utilizaram-se várias referências, o ácido nicotínico, a 4hidroxiacetofenona, o ácido 4-hidroxibenzóico e o 4-hidroxibenzoato de metilo. Na tabela
3.8, vêm as características dessas referências utilizadas na determinação da acidez em fase
gasosa nesse projecto de licenciatura.
Tabela 3.8 – Referências utilizadas com o respectivo valor de ∆acH e ∆acG.
Razão m/z da molécula
∆acH
∆acG
desprotonada [R-]
(kJ/mol)
(kJ/mol)
3-Trifluorometilfenol (C7H5F3O)
161
1419
1391
4-Hidroxibenzoato de metilo (C8H8O3)
151
1410
1382
4-Trifluorometilfenol (C7H5F3O)
161
1410
1381
Ácido 4-hidroxibenzóico (C7H6O3)
137
1405
1376
4-Hidroxiacetofenona (C8H8O2)
135
1404
1375
Ácido Nicotínico (C6H5NO2)
122
1399
1370
Compostos de Referência
Posteriormente, já fora do projecto de licenciatura, escolheram-se mais dois
compostos de referências para consolidar os resultados obtidos, essas referências foram
seleccionadas tendo em conta o valor de acidez do trolox encontrado. Assim, optou-se
utilizar o 3-trifluorometilfenol e o 4-trifluorometilfenol (tabela 3.8) como novas referências.
45
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.2. Trolox
Quando se analisaram essas soluções, de trolox com 3-trifluorometilfenol ou de
trolox com 4-trifluorometilfenol, observou-se a formação do mesmo heterodímero, m/z 411,
pois estes compostos só diferem pela posição em que se encontra o grupo trifluorometilo.
Isolou-se o heterodímero e da sua posterior decomposição utilizando a dissociação induzida
por colisão (CID), obteve-se um espectro MS2 (Anexo E), onde pudemos concluir-se que têm
uma acidez relativamente próxima, o que torna a sua razão mensurável experimentalmente.
Na tabela 3.9, apresenta-se um resumo dos resultados experimentais obtidos com a
aplicação do formalismo do método cinético restrito.
Tabela 3.9 – Valores da razão das intensidades entre a referência e o trolox, para cada referência, utilizando o
método cinético restrito.
-
-
Compostos de Referência
ΔacG (kJ/mol)
ΔacH (kJ/mol)
Ln [ArO /R ]
Ácido Nicotínico
1370
1399
1,94
4-hidroxiacetofenona
1375
1404
1,06
Ácido 4-hidroxibenzoico
1376
1405
0,99
4-(trifluorometil)fenol
1381
1410
-0,75
4-hidroxibenzoato de metilo
1382
1410
-0,62
3-(trifluorometil)fenol
1391
1419
-3,50
Recordando a equação 24 e a figura 1.6, é possível fazer uma representação
semelhante para determinar a acidez em fase gasosa. Assim, fazendo um gráfico (gráfico 3.7)
do logaritmo da razão das abundâncias iónicas em função dos valores de acidez das
referências, ΔacG (RH), pudemos determinar a acidez em fase, ΔacG, do trolox através da
equação 28, onde m = - 1/RTeff e b = ΔacG (ArOH) /RTeff.
46
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.2. Trolox
4
3
Ln [ArO-/R-]
2
1
ΔacG (kJ/mol)
0
-11365
1370
1375
1380
1385
1390
1395
1400
-2
-3
-4
y = -0,2659x + 366,55
R² = 0,9813
-5
-
-
Gráfico 3.7 – Representação gráfica de ln (ArO /R ) vs ΔacG (RH), que permite a determinar o valor de acidez do
trolox.
O valor de acidez em fase gasosa obtido corresponde a 1379 ± 8,7 kJ/mol. Fazendo
um gráfico do logaritmo da razão das abundâncias iónicas em função dos valores de acidez
das referências, ΔacH (RH), pudemos determinar a afinidade protónica do anião do trolox
(gráfico 3.8).
3,00
2,00
Ln [A-/B-]
1,00
0,00
1390
-1,00
ΔacH (kJ/mol)
1395
1400
1405
1410
1415
1420
1425
-2,00
-3,00
y = -0,2811x + 395,56
R² = 0,9811
-4,00
-5,00
-
-
Gráfico 3.8 – Representação gráfica de ln (ArO /R ) vs ΔacH (RH), que permite a determinar o valor de afinidade
protónica do anião do trolox.
Através desta representação gráfica, determinámos que o valor de afinidade protónica
em fase gasosa, ΔacH, do anião do trolox foi de 1407 ± 9 kJ/mol. Concluímos que após
utilizarmos mais duas referências, foi superior ao obtido no projecto de licenciatura (1402 ±
9,4 kJ/mol), mas afastado do valor teórico (1422 kJ/mol). Dado que o trolox é
estruturalmente diferentes das referências utilizadas, fez o estudo do mesmo utilizando o
método cinético estendido.
47
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.2. Trolox
3.2.2. Aplicação do Método Cinético Estendido
O trolox foi, então, estudado pelo método cinético estendido. Como foi referido,
neste método, reconhecemos que a variação de entropia (Δ(ΔS)/R) não é desprezável.
3.2.2.1. Aplicação do Método Cinético Estendido na Ion Trap do LCQ Duo
Na tabela 3.10, aparece a relação entre a acidez em fase gasosa, ΔacG (RH), com o
logaritmo da razão das abundâncias iónicas, a uma determinada voltagem pico a pico (Vp-p).
Tabela 3.10 – Valores obtidos através da razão das intensidades entre a referência e o trolox.
-
-
Ln [ArO /R ]
Compostos de Referência
Amplitude de
excitação (Vp-p)
ΔacH (kJ/mol)
0,20
0,18
0,17
0,16
0,14
0,10
Ácido Nicotínico
1399
-
-
-
-
1,46
1,79
4-hidroxiacetofenona
1404
-
-
-
-
1,12
1,10
Ácido 4-hidroxibenzoico
1405
1,00
1,01
0,98
0,99
1,04
1,04
4-hidroxibenzoato de metilo
1410
-0,61
-0,65
-0,61
-0,59
-0,59
-0,57
4-(trifluorometil)fenol
1410
-0,84
-0,82
-0,80
-0,81
-0,77
-0,76
3-(trifluorometil)fenol
1419
-3,50
-3,53
-3,50
-3,51
-3,52
-3,52
Com estes valores, fizemos um gráfico (gráfico 3.9) para cada conjunto de valores, do
logaritmo da razão das abundâncias iónicas em função dos valores de ΔacH(RH) das
referências. Como podemos reparar na tabela 3.10, não existem valores para a razão das
abundâncias iónicas (ln [ArO-/R-]) obtidos para quando o heterodímero, tinha como
composto de referência o ácido nicotínico e 4-hidroxiacetofenona, pois ao utilizar energias
de colisão normalizadas superiores a 10 % deixa-se de observar o heterodímero. Logo, o
gráfico 3.9 é constituído apenas pelas outras quatro referências.
48
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.2. Trolox
3,00
Ln [ArO-/R-]
2,00
1,00
ΔacH (kJ/mol)
0,00
1400
-1,00
1405
1410
1415
1420
1425
-2,00
y = -0,32x + 456,51
R² = 1,00
-3,00
-4,00
-5,00
Gráfico 3.9 – 1ª regressão linear - Valores obtidos através da razão o logaritmo da razão das intensidades para
cada referência a 0,1 Vp-p.
Desta forma, obtivemos um conjunto de representações gráficas, um gráfico para
cada voltagem pico a pico (Vp-p), onde retiramos valores de m (1/RTeff) e b (ΔGapp(RH)/RTeff),
coeficiente de correlação e o de Teff e organizamos na tabela 3.11.
Tabela 3.11 – Valores de m e b, obtidos através das 1ª representações gráficas.
Amplitude de excitação
0,20
0,18
0,17
0,16
0,14
0,10
-1/RTeff (m)
0,319
0,322
0,318
0,320
0,324
0,324
ΔGapp(ArOH)/RTeff (b)
449,288
453,151
448,186
450,263
456,093
456,514
R2
0,998
0,998
0,997
0,998
0,997
0,996
Teff
376,911
373,697
377,840
376,102
371,322
370,985
(Vp-p)
Com os valores da tabela 3.11, pudemos contruir a segunda representação gráfica
(gráfico 3.9). Neste gráfico, pudemos determinar o valor da afinidade protónica em fase
gasosa, ΔacH, do anião do trolox correspondeu a 1416 ± 11,3 kJ/mol e a valor da variação de
entropia foi de 20,49 J/mol.
49
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.2. Trolox
460
ΔGapp(RH)/RTeff
458
456
454
452
y = 1415,63x - 2,46
R² = 1,00
450
448
446
0,316
0,318
0,32
0,322
0,324
0,326
1/RTeff
Gráfico 3.9 – 2ª regressão linear - Valores obtidos através de 1/RTeff em função de ΔGapp(ArOH)/RTeff .
3.2.2.2. Aplicação do Método Cinético Estendido na célula do FTICR
Na tabela 3.12, aparece ΔacH (RH) das referências, os logaritmos da razão das
abundâncias iónicas, a uma determinada frequency Offset (Hz). Podemos também observar
na tabela 3.12, que para a referência 3-trifluorometilfenol não foi possível determinar os
valores de Ln [ArO-/R-] para todas as frequency Offset aplicadas, porque o heterodímero ao
dissociar-se, estava a sofrer fragmentações, que originavam o aparecimento de mais iões
além dos de interesse.
Tabela 3.12 – Valores da razão das intensidades entre a referência e o ácido cafeico, para cada referência, a
uma determinada frequency Offset.
-
-
Ln [ArO /R ]
Compostos de referência
Amplitude de
excitação
(frequency Offset)
ΔacH (kJ/mol)
0 Hz
100 Hz
200 Hz
300 Hz
Ácido Nicotínico
1399
-2,61
-2,55
-2,48
-2,40
4-hidroxiacetofenona
1404
1,26
1,25
1,23
1,21
Ácido 4-hidroxibenzoico
1405
0,87
0,23
-0,49
-1,16
4-hidroxibenzoato de metilo
1410
-0,13
-0,22
-0,29
-0,38
4-(trifluorometil)fenol
1410
-1,04
-1,29
-1,42
-1,63
3-(trifluorometil)fenol
1419
-
-
-
-
50
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.2. Trolox
Com estes valores, fizemos um gráfico (gráfico 3.10) para cada conjunto de valores,
do logaritmo da razão das abundâncias iónicas em função dos valores de ΔacH(RH) das
referências.
2,00
1,50
Ln [ArO-/R-]
1,00
0,50
0,00
1400
-0,50
-1,00
-1,50
ΔacH (kJ/mol)
1402
1404
1406
1408
1410
1412
1414
y = -0,301x + 423,81
R² = 0,8691
-2,00
Gráfico 3.10 – 1ª regressão linear - Valores obtidos através da razão o logaritmo da razão das intensidades para
cada referência a 0 Hz.
No gráfico 3.10, não foram utilizados os valores da razão das abundâncias iónicas
(ln[ArO-/R-]) obtidos para quando o composto de referência era o ácido nicotínico, pois este
tinha um comportamento completamente diferente, que o desenquadrava dos restantes
compostos de referência. No Anexo I, pode-se verificar o que aconteceria se incluíssemos os
valores de ln[ArO-/R-] quando temos como composto de referência o ácido nicotínico.
Desta forma, obtivemos um conjunto de representações gráficas, um gráfico para
cada frequency Offset, onde retiramos o valor de -m (1/RTeff) e b (ΔGapp(RH)/RTeff) e
organizamos na tabela 3.13.
Tabela 3.13 – Valores de m e b, obtidos através das 1ª representações gráficas.
Amplitude de excitação
0 Hz
100 Hz
200 Hz
300 Hz
1/RTeff (-αm)
0,301
0,283
0,247
0,222
ΔGapp(ArOH)/RTeff (b)
423,806
398,049
347,834
312,576
R2
0,869
0,745
0,521
0,327
Teff
399,615
425,222
486,280
540,659
(frequency Offset)
51
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.2. Trolox
Com os valores descritos na tabela, contruímos a segunda representação gráfica
(gráfico 3.11). Através desta representação gráfica, determinámos que o valor da afinidade
protónica em fase gasosa, ΔacH, do anião do trolox corresponde a 1416 ± 11,3 kJ/mol e a
valor da variação de entropia é de 20,45 J/mol.
ΔGapp(RH)/RTeff
500
450
y = 1416,10x - 2,46
R² = 1,00
400
350
300
250
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
1/RTeff
Gráfico 3.11 – 2ª regressão linear - Valores obtidos através de 1/RTeff em função de ΔGapp(RH)/RTeff .
3.2.3. Comparação dos resultados obtidos entre o método cinético restrito e estendido
Neste trabalho, aplicámos o método cinético em três diferentes formas, utilizámos o
método cinético restrito, método cinético estendido na ion trap e o método cinético
estendido no FTICR. Assim, obtivemos três valores de ∆acH para o trolox (tabela 3.14).
Tabela 3.14 – Valores de ∆acH obtidos através da aplicação das diferentes formas do método cinético.
Método Cinético Aplicado
ΔacH (kJ/mol)
Δ(ΔS) (J/mol)
Restrito
1407,32 ± 8,7
0
Estendido na Ion Trap
1415,63 ± 11,3
20,49
Estendido no FTICR
1416,10 ± 11,3
20,45
Como podemos observar na tabela 3.14, que os valores obtidos são semelhantes, isto
é, estão dentro da mesma ordem de grandeza, considerando os erros associados. No entanto,
o valor obtido com o método cinético restrito afasta-se mais dos outros dois, como era
esperado.
52
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.2. Trolox
Dado que os compostos de referências utilizados eram diferentes estruturalmente do
trolox, era pouco provável que o Δ(ΔS) fosse zero. É interessante de observar que ao aplicar o
método cinético estendido em dois analisadores diferentes os valores obtidos, tanto para
∆acH como para ∆(∆S), vão ser muito semelhantes, apesar do FTICR ser um espectrómetro de
massa mais sensível e sofisticado.
Para completar e complementar este estudo experimental do trolox, também foi feito
um estudo teórico, para confirmar o valor 1416 kJ/mol e ter informação estrutural quanto ao
grupo funcional doador do protão.
53
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.3. α -Tocoferol
3.3. α -Tocoferol
O α-tocoferol (figura 1.2), como já foi referido (capítulo 1), é a forma da vitamina E
mais amplamente distribuída nos tecidos e no plasma, tendo uma grande acção
antioxidante. Por isso, o α-tocoferol, tem sido alvo de muitos estudos, inclusivé dentro do
grupo de espectrometria de massa.
Neste trabalho, inicialmente, um dos compostos alvo era o α-tocoferol. Este foi
analisado em modo negativo e modo positivo, estudando os principais iões, bem como as
principais fragmentações. Posteriormente, passou-se para determinação da acidez em fase
gasosa do α-tocoferol pelo método cinético restrito, assim associou-se α-tocoferol com vários
compostos referência (tabela 3.15), que têm uma acidez conhecida.
Tabela 3.15 – Referências utilizadas com o respectivo valor de acidez relativa em função do fenol.
Razão m/z da molécula
∆acH
∆acG
desprotonada [R-]
(kJ/mol)
(kJ/mol)
3,4-Dimetilfenol (C8H10O)
121
1467
1436
4-Metilfenol (C7H8O)
107
1465
1437
Cromanol (C14H20O)
220
1465
1434
4-Etilfenol (C8H10O)
121
1463
1435
3,4-Dimetoxidofenol (C8H10O3)
153
1462
1431
Fenol (C6H6O)
93
1462
1431
4-fluorofenol (C6H5OF)
111
1451
1422
4-clorofenol (C6H5OCl)
127
1435
1407
Compostos de Referência
Estes compostos de referência foram escolhidos de acordo com a estrutura do αtocoferol e com o conhecimento apreendido em trabalhos anteriores. O α-tocoferol foi um
dos primeiros compostos a ser estudado no grupo, onde foi aplicado o método de
bracketing, tendo sido obtido um intervalo de acidez para α-tocoferol, entre o fenol e 4fluorofenol ( 1459 ± 10 kJ/mol). Como foi referido, este método não dá um valor de acidez,
mas antes um intervalo. De seguida, fez-se um estudo com fenóis dissusbstituído para
observar a influência dos grupos metilo na acidez do fenol, para tentar relacionar com o α54
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.3. α-Tocoferol
tocoferol, que possui estes substituintes. Finalmente, através de estudos teóricos realizados,
também no grupo
[81]
, tínhamos informação de que a acidez do α-tocoferol deveria
encontrar-se entre o 3,4-dimetoxidofenol e o 4-fluorofenol. Para além desta informação,
decidiu-se incluir o cromanol nas referências pois tem a estrutura semelhante ao α-tocoferol,
exceptuando a cadeia alifática.
Assim, emparelhando o α-tocoferol com todos os composto de referência, verificouse que o único ião de interesse que aparece é o α-tocoferol desprotonado (m/z 429). Nos
vários sistemas estudados, o heterodímero não foi observado (Anexo G).
Além disso, fizeram-se outros estudos, nomeadamente um estudo da concentração,
um estudo do solvente e ainda um estudo comparativos entre duas amostras de α-tocoferol.
Começou-se pelo estudo da concentração a utilizar, onde verificou-se que a melhor
concentração seria de 10-4 M.
De seguida, fez-se um estudo do solvente. Primeiramente, injectou-se o α-tocoferol
em água, o que deu origem a um espectro mais limpo, tendo o ião do α-tocoferol muito
intenso. Sendo assim, preparam-se várias soluções de α-tocoferol com fenol em diferentes
solventes (água, acetonitrilo e DMSO). Começou-se por analisar o α-tocoferol com fenol em
água. Ao contrário do que tinha acontecido anteriormente, este espectro tinha mais ruído e
os iões característicos desta solução estavam pouco intensos. Quando se alterou para o
acetonitrilo, o ruído diminuiu mas também o sinal dos iões. Em DMSO, o ruído era quase
nulo, mas não existia sinal dos iões nem mesmo do ião do α-tocoferol (Anexo H). Assim,
concluímos que o melhor solvente era mesmo o metanol.
Finalmente, decidiu-se comparar as duas amostras de α-tocoferol, pois tínhamos uma
amostra de α-tocoferol com cerca de 15 anos (que tinha sido usado anteriormente pelo
grupo) e outra nova. Os resultados obtidos para o α-tocoferol foram bastante semelhantes,
tanto para a amostra nova como para a velha, onde o ião mais intenso era o do α-tocoferol
desprotonado (m/z 429).
Apesar de usar estas referências com valores distintos de acidez o resultado foi
sempre o mesmo, isto é, não se observa a formação do heterodímero, nem mesmo quando
se utilizam concentrações diferentes, sendo o composto de referência mais concentrado já
que o sinal do α-tocoferol desprotonado é muito intenso.
55
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
3. Apresentação e Discussão dos Resultados Experimentais
3.3. α -Tocoferol
Este insucesso levou-nos a supor que a longa cadeia alifática possa causar um
impedimento esteroquímico, impedindo a formação do heterodímero. Suspeitamos que é
devido a essa cadeia, pois é possível determinar experimentalmente a acidez do cromanol,
que é igual ao α-tocoferol, mas sem essa cadeia alifática saturada.
Como não conseguimos resultados experimentais, recorremos aos cálculos teóricos
para fazer a determinação da acidez em fase gasosa, como também da afinidade electrónica,
para posteriormente se poder determinar a enegia de ligação O-H.
56
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
4. Química Teórica e Computacional
4.1. Introdução
4. Química Teórica e Computacional
4.1. Introdução
No ínicio do século XX, cientistas como Planck, Einstein, Bohr, Heisenberg, De Broglie,
Born e Dirac, revolucionaram os conceitos fundamentais e as teorias da Física, levando ao
desenvolvimento da Mecânica Quântica. Posteriormente, associaram-se conceitos químicos
no estudo mecânico-quântico da estrutura molecular, surgindo a Química Quântica. Esta
última combinada com a Termodinâmica Estatística, permitiu interpretação de propriedades
macroscópicas com fundamento a nível atómico-molecular e define um domínio que é a
Química Teórica.[82] O principal objectivo da Química Teórica é estudar as propriedades
estruturais, electrónicas, termodinâmicas e cinéticas dos sistemas químicos.[83, 84]
Nos últimos 50 anos, assistiu-se a um grande desenvolvimento dos computadores,
nomeadamente o aumento da performance, da memória e do espaço em disco, tornando
possível, através do desenvolvimento do software adequado, “solucionar” equações
complexas. Dessa forma, apareceu a Química Computacional, que utiliza fundamentos da
Química Teórica, incorporados em método numéricos, para calcular as estruturas e as
propriedades moléculares em diferentes estados termodinâmicos. A sua crescente utilização
na determinação das propriedades moleculares veio generalizar e ampliar o conceito de
experiência química, pois os métodos computacionais da Química Teórica definem, hoje em
dia, uma alternativa de investigação comparável as outras tantas técnicas experimentais à
disposição de um químico.[82]
Actualmente, através da Química Computacional, podemos estudar a estrutura
electrónica de moléculas, determinar as energias de ligação de moléculas, determinar
propriedades termoquímicas, prever a estrutura molecular de moléculas complexas com
uma precisão comparável à de técnicas experimentais. Por isso, tem-se tornado uma
ferramenta indispensável em diferentes áreas, sendo amplamente utilizada no desenho de
novos fármacos e materiais.[84]
Para tal, existem diferentes métodos de química computacional que podem ser
aplicados apenas para sistemas pequenos como também podem ser apropriados para
sistemas grandes. Entre os diferentes métodos destacam-se os métodos ab initio, semiempíricos, mecânica molecular, dinâmica molecular e os DFT’s (teoria do Funcional da
Densidade). Este último, tem sido bastante utilizado, pois além de ser capaz de resolver
57
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
4. Química Teórica e Computacional
4.1. Introdução
problemas com elevada precisão, os recursos computacionais necessários para a sua
aplicação são semelhantes aos utilizados em cálculos com um nível de teoria Hartree-Fock
(HF), que é o método ab initio menos dispendioso.[85-87]
Presentemente, os químicos teóricos e experimentais estão interessados em grandes
sistemas moleculares com implicações biológicas, como é o caso, dos antioxidantes (capítulo
1.1). Entre os antioxidantes, destacam-se os antioxidantes fenólicos (ArOH),[88]
ROO + ArOH → ROOH + ArO
(7)
Estes inactivam o radical livre (ROO) pela transferência do átomo de hidrogénio
fenólico, formando um novo radical mais estável, o ArO. Assim, existe uma entalpia
associada a essa dissociação da ligação O-H, que é descrita através de um mecanismo de
acção antioxidante, o HAT (transferência do átomo de hidrogénio). Para além deste
mecanismo, existem mais dois, o SET-PT (transferência de um electrão seguido pela
transferência de protão) e o SPLET (perda sequencial de um protão seguido pela
transferência de electrão). Tanto o SET-PT e no SPLET, envolvem vários passos de reacção
até chegarem à inactivação do radical livre. Cada um desses passos está associado a uma
entalpia de reacção, que vai contribuir para a determinação da entalpia de dissociação da
ligação O-H (BDE). [23, 88, 89]
Do ponto de vista da acção antioxidante, o resultado final dos três mecanismos é o
mesmo, a transferência de um átomo de hidrogénio para um radical livre. Mesmo assim, as
entalpias de reacção relacionadas com os três mecanismos são importantes para a avaliação
de outros critérios na acção antioxidante, incluindo a solubilidade, a biodisponibilidade e a
toxicidade, que não são consideradas aquando da concepção de um antioxidante eficaz e
seguro.[88]
Devido ao desenvolvimento recente das técnicas experimentais e de métodos de
química quântica, o conhecimento da entalpia dissociação da ligação (BDE) foi acumulado
substancialmente nos últimos 15 anos. Neste trabalho, considerou-se o SPLET (9-12) para
determinar a BDE (DHᵒ (ArOH)). Assim, recorreu-se à química computacional para estudar o
mesmo mecanismo.
ArOH → ArO – + H +
ΔacHᵒ (ArOH)
(9)
ArO – → ArO + e –
EA (ArO)
(10)
H + + e – → H
IE (H)
(11)
ArOH → H+ ArO
DHᵒ (ArOH)
(12)
58
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
4. Química Teórica e Computacional
4.1. Introdução
Através desse mecanismo podemos relacionar a entalpia de dissociação da ligação
OH (12), DHᵒ(ArOH), em fase gasosa, com os seguintes parâmetros termodinâmicos, a
energia de ionização (IE) do átomo de hidrogénio, a afinidade electrónica (EA) do ArO e a
afinidade protónica (ΔacHᵒ) de ArO-.[34, 88]
DHᵒ (ArO-H) = BDE = ΔacHᵒ (ArOH) + EA (ArO) – IE (H)
(13)
Utilizando os métodos da química computacional podemos determinar as
propriedades que definem da equação 13 e relacionarmos com os valores experimentais.
A afinidade protónica (ΔacHᵒ) ou acidez em fase gasosa (9) do anião fenóxido (ArO-),
está associado a uma dissociação heterolítica, onde a molécula neutra, o composto fenólico
(ArOH), dissocia-se num anião e num catião, que neste estudo, foi o anião fenóxido e um
protão, respectivamente. ΔacHᵒ pode ser determinado teoricamente através da seguinte
equação
ΔacHᵒ = PA = H(ArO–) + H(H +) - H(ArOH)
(33)
Assim, temos de relacionar a entalpia do composto fenólico (ArOH), a entalpia do anião
fenóxido (ArO–) e a entalpia do protão (H +). Este último, tem valor conhecido de 6,197
kJ/mol.[90] Posteriormente, ΔacHᵒ, vai ser comparada com o valor experimental que foi
determinado através da espectrometria de massa, como foi referido anteriormente.
A afinidade electrónica (EA) do radical fenoxilo (ArO) ou a entalpia de transferência
electrónica (ETE), equação 10, como diz o nome, está associada à transferência electrónica
para o radical livre (ROO), formando o radical fenoxilo (ArO).[88] Teoricamente, a
determinação de EA é feita através da equação 34, onde se relaciona as seguintes entalpias,
a entalpia do radical fenoxilo (ArO), a entalpia do anião fenóxido (ArO–) e a entalpia do
electrão (e -). Este último, tem valor conhecido de 3,145 kJ/mol.[88, 90]
EA = ETE = H(ArO) + H(e -) - H(ArO–)
(34)
EA também pode ser obtida experimentalmente através da espectrometria de massa,
mas dado que não tinhamos compostos de referência em número suficiente para realizar
essa determinação, apenas se fez o estudo teórico.
59
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
4. Química Teórica e Computacional
4.1. Introdução
Tendo ΔacHᵒ e EA, para completar o mecanismo SPLET, apenas nos falta valor da
energia de ionização (IE) do átomo de hidrogénio. Este útimo é conhecido e tem o valor de
1312 kJ/mol. Assim, podemos determinar teoricamente a BDE, utilizando todos os
parâmetros termoquímicos descritos pelo mecanismo SPLET (ΔacHᵒ , EA e IE ). Este
mecanismo representa uma via alternativa ao HAT, que tem sido amplamente estudado.
Este último mecanismo, também foi estudado através de cálculos téoricos.
Através do HAT, podemos determinar directamente a BDE, pois neste mecanismo
ocorre uma dissociação homolítica da ligação O-H (35), formando-se dois radicais, após a
dissociação de ArOH.[91]
ArOH → ArO + H
(35)
Para conhecermos a entalpia de dissociação da ligação O-H, necessitamos da entalpia
do composto fenólico (ArOH), a entalpia do radical fenoxilo (ArO) e a entalpia do radical do
átomo de hidrogénio (H).
BDE = D° (ArOH) = H(ArO) + H(H) - H(ArOH)
(36)
Desta forma, vamos ter dois valores teóricos de BDE’s, um pelo mecanismo SPLET e
outro pelo mecanismo HAT, que vão ser posteriormente comparados.
Neste estudo, investigou-se teoricamente a entalpia de dissociação da ligação O-H
(BDE) em alguns compostos, que incluem o trolox, o ácido cafeico e o α-tocoferol. Assim,
calculou-se a acidez em fase gasosa (ΔacHᵒ) do composto fenólico (ArOH) e a afinidade
electrónica (EA) do radical fenoxilo (ArO), utilizando cálculos DFT/B3LYP. O estudo teórico
da acidez vai complementar o trabalho experimental, pois vamos obter um valor que é
relacionável com o valor obtido experimentalmente, para além de esclarecer o grupo
funcional em que ocorre a desprotonação. Dado que são escassos os valores de afinidades
electrónicas referência para determinar experimentalmente as EA’s por espectrometria de
massa para os diferentes compostos fenólicos em estudo, esta grandeza termoquímica
apenas foi determinada teoricamente. Logo, a determinação destes dois parâmetros vão
contribuir para a determinação da entalpia de dissociação da ligação O-H nesses mesmos
compostos.
60
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
4. Química Teórica e Computacional
4.1. Introdução
4.2. Detalhes Computacionais
A geometria de cada composto, neutro, radical e anião, foi optimizado utilizando
método DFT com o funcional B3LYP. As optimizações das geometrias foram realizadas com
uma base cc-pVDZ e cc-pVTZ. As estruturas optimizadas foram confirmadas serem mínimos
locais pelo cálculo das frequências (não existiam frequências imaginárias). Os cálculos de
single point foram realizados utilizando a base cc-pVTZ. As geometrias das moléculas neutras
e do seu respectivo anião foram optimizadas e calculadas a nível B3LYP restrito, enquanto
que os radicais foram optimizadas e calculadas a nível B3LYP não restrito. Todos os cálculos
foram realizados utilizando o conjunto de programas GAUSSIAN 03.[87]
61
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
5. Apresentação e Discussão dos Resultados Teóricos
5. Apresentação e Discussão de Resultados Teóricos
Antes de determinar a entalpia de dissociação da ligação O-H para os compostos
presentes neste estudo, o ácido cafeico, o trolox e o α-tocoferol, começou-se por estudar o
fenol. Este foi escolhido, pois é um composto em que se conhecesse todos os parâmetros
termoquímicos necessários a este estudo, tanto experimentalmente como teoricamente.
Desta forma, pudemos experimentar diversas metodologias e diferentes bases até obter um
valor que fosse próximo do experimental. Concluíu-se que o método DFT/B3LYP e a base ccpVTZ foram os que reportaram resultados teóricos mais próximos dos experimentais. Na
tabela 5.1, apresenta-se um resumo dos resultados téoricos, obtidos para o fenol. Para
determinar ΔacHᵒ, EA, BDE (SPLET) e BDE (HAT), recorreu-se as equações 34, 35, 13 e 36,
respectivamente.
Tabela 5.1 – Valores de teóricos de ΔacHᵒ, EA e a BDE para o fenol.
Grandeza Termodinâmica
ΔacHᵒ
EA
BDE (SPLET)
BDE (HAT)
Entalpia, H (T) (a.u.)
ΔH (a.u.)
ΔH (kJ/mol)
0,561162
1473,33
0,086385
226,80 *
H(ArOH)
-307,4747161
H(ArO–)
-306,9159114
H(H +)
0,0023576
H(ArO–)
-306,9159114
H(ArO)
-306,8415043
H(e -)
0,0119780
ΔacHᵒ
-
0,561162
EA
-
0,086385
IE
-
0,499714
H(ArOH)
-307,4747161
H(ArO)
-306,8415043
H(H)
-0,4997140
0,133498
388,14
350,50
* Os valores de EA costumam vir em eV, mas para facilitar a apresentação dos resultados aqui aparecem em
kJ/mol. Para converter kJ/mol em eV, basta multiplicar por 0,01.
63
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
5. Apresentação e Discussão dos Resultados Teóricos
Na tabela 5.2, podem-se observar os valores experimentais de ΔacHᵒ, EA e a BDE do
fenol, como também os valores calculados do fenol, utilizando o método DFT/B3LYP e a base
cc-pVTZ.[92]
Tabela 5.2 – Comparação entre os resultados experimentais e teóricos para o fenol.
Grandeza Termoquímica
Experimental
Teórico
ΔacHᵒ
1463 ± 10 kJ/mol [93]
1473 kJ/mol
EA
2,17 ± 0,06 eV[94]
2,27 eV
BDE (SPLET)
368 ± 10 kJ/mol
388 kJ/mol
Comparando estas entalpias de dissociação da ligação O-H (SPLET), com o valor
experimental recomendado de 371 ± 2,3 kJ/mol[32] e com o valor teórico (HAT), de 351
kJ/mol, podemos concluir que o mecanismo HAT parece subestimar o valor de BDE.
Depois de se optimizar a metodologia e a base a aplicar, passou-se para o estudo
teórico da ΔacHᵒ, da EA e da BDE no ácido cafeico, no trolox e no α-tocoferol (figura 5.1-5.3).
a)
b)
c)
Figura 5.1 – Estruturas do ácido cafeico optimizadas . a) Ião/Radical A – desprotonação do grupo carboxílico.do
b) Ião/Radical B – desprotonação do grupo fenólico em posição para. c) Ião/Radical C – desprotonação do
grupo fenólico em posição meta.
64
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
5. Apresentação e Discussão dos Resultados Teóricos
Figura 5.2 – Estruturas do trolox optimizadas. a) Ião/Radical A – desprotonação do grupo fenólico. b)
Ião/Radical B – desprotonação do grupo carboxílico.
Figura 5.3 – Estrutura do α-tocoferol optimizadas.
É importante referir que, estas grandezas termodinâmicas foram estimadas para
todos os possíveis locais de desprotonação, já que o ácido cafeico e o trolox tinham mais de
um grupo funcional (figura 5.1 e 5.2).
65
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
5. Apresentação e Discussão dos Resultados Teóricos
5.1. Cálculo da acidez em fase gasosa, ΔacHᵒ
5.1. Cálculo da acidez em fase gasosa, ΔacHᵒ
Este estudo teórico da acidez em fase gasosa foi realizado para completar o trabalho
experimental. Assim, investigou-se os locais de desprotonação mais prováveis de ocorrer nos
compostos fenólicos estudados, isto é, no ácido cafeico, trolox e α-tocoferol. Recordando a
equação 9 e 34, podemos determinar a ΔacHᵒ. Na tabela 5.3, apresenta-se um resumo dos
resultados teóricos obtidos para o trolox, ácido cafeico e α -tocoferol, aplicando B3LYP/ccpVTZ.
Tabela 5.3 – Valores de afinidade protónica (ΔacHᵒ).
Entalpia, H (T)
Composto
Ião
em estudo
ΔacHᵒ
ΔacHᵒ
H(ArO–) (a.u.)
H(H +) (a.u.)
H(ArOH) (a.u.)
(a.u.)
(kJ/mol)
A
-648,1942604
0,0023576
-648,7374869
0,5455841
1432,43
B
-648,2214985
0,0023576
-648,7374869
0,5183460
1360,92
C
-648,2113881
0,0023576
-648,7374869
0,5284564
1387,46
A
-844,7003914
0,0023576
-845,2460342
0,5480004
1438,78
B
-844,7067929
0,0023576
-845,2460342
0,5415989
1421,97
-
-1284,824314
0,0023576
-1285,3821262 0,5601697
1470,73
Ácido
Cafeico
Trolox
α-Tocoferol
Começando por analisar o ácido cafeico, podemos observar que a acidez é diferente
para cada ião. O ião A, que foi desprotonado no grupo carboxílico, tem o valor mais elevado
de ΔacHᵒ, de 1432 kJ/mol. De seguida, encontra-se o ião C, com 1387 kJ/mol, onde a
desprotonação ocorre no grupo fenólico, quando este se encontra em posição meta.
Finalmente, temos o ião B, que foi desprotonado no grupo fenólico, quando este se encontra
em posição para, com um valor de 1361 kJ/mol, é o mais ácido. É interessante de observar
que o local mais provável de desprotonação é o grupo fenólico em posição para, já que se
pensava que o grupo ácido carboxílico fosse o mais ácido. Este acontecimento pode ser
explicado pela deslocalização da carga que ocorre quando o grupo fenólico está em posição
para. Posteriormente, estes valores serão comparados com os experimentais.
66
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
5. Apresentação e Discussão dos Resultados Teóricos
5.2. Cálculo da afinidade electrónica, EA
Passando agora para o trolox, podemos observar que os dois valores de acidez em fase
gasosa são diferentes, em que o ião A tem um valor de ΔacHᵒ mais elevado que o ião B. Dado
que a desprotonação está a ocorrer no grupo carboxílico, já era esperado que o ião B fosse o
mais ácido. Através destes resultados teóricos, concluímos que o local mais provável de
ocorrer a desprotonação no trolox é no grupo ácido carboxílico. Posteriormente, estes valores
serão comparados com os experimentais.
Finalmente, temos o α-tocoferol com um valor de acidez em fase gasosa de 1471
kJ/mol. Comparando com o valor de acidez do fenol, obtido teoricamente, podemos concluir
que o α-tocoferol tem uma acidez próxima do fenol, diferenciando apenas 2 ou 3 kJ/mol.
5.2. Cálculo da afinidade electrónica, EA
Na tabela 5.4, apresenta-se um resumo dos resultados teóricos de EA (35) obtidos
para o trolox, ácido cafeico e α-tocoferol, aplicando B3LYP/cc-pVTZ.
Tabela 5.4 – Valores de afinidade electrónica (EA).
Entalpia, H (T)
Composto
Ião /
EA
EA
EA
em estudo
Radical
H(ArO) (a.u.)
H(e -) (a.u.)
H(ArO–) (a.u.)
(a.u.)
(kJ/mol)
(eV)
A
-648,0781562
0,0119780
-648,1942604
0,128082
336,28
3,36
B
-648,1210118
0,0119780
-648,2214985
0,112465
295,28
2,95
C
-648,1185526
0,0119780
-648,2113881
0,104814
275,19
2,75
A
-844,6276398
0,0119780
-844,7003914
0,084730
222,46
2,22
B
-844,6270031
0,0119780
-844,7067929
0,091768
240,94
2,41*
-
-1284,769911
0,0119780
-1285,3821262 0,066381
174,28
1,74*
Ácido
Cafeico
Trolox
α-Tocoferol
*Até a este momento, cálculo destas afinidades electrónicas ainda não estava concluído. Assim, não
conseguímos obter o valor das correcções das grandezas termodinâmicas para o cálculo com um nível de teoria
B3LYP/cc-pVTZ. Por isso, utilizaram-se as correcções obtidas no cálculo com um nível de teoria B3LYP/cc-pVDZ.
67
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
5. Apresentação e Discussão dos Resultados Teóricos
5.2. Cálculo da afinidade electrónica, EA
Como foi referido, para determinar a entalpia de dissociação da ligação O-H,
necessitamos dos valores das afinidades electrónicas (EA) e dado que não foi possível obtêlas experimentalmente neste trabalho, recorreu-se aos cálculos teóricos para determinar os
seus valores, de maneira a completar o ciclo termoquímico descrito pelo mecanismo SPLET.
As afinidades electrónicas do ácido cafeico foram as primeiras a serem analisadas. O
radical A, radical formado no grupo carboxílico, tem o valor mais elevado de EA, de 3,36 eV.
De seguida, encontra-se o radical B, com 2,95 eV, onde o radical é formado no grupo fenólico,
quando este se encontra em posição para. Finalmente, o radical C, que se forma no grupo
fenólico, quando este se encontra em posição meta tem o valor mais baixo de afinidade
electrónica, com um valor de 2,75 eV. Os radicais B e C, formados nos grupos fenólicos, são os
que têm a afinidade electrónica mais próxima do fenol, tendo o valor experimental de 2,17
eV, onde o radical C é o que mais se aproxima mais desse valor. Como era esperado o radical
A é o que se afasta mais desse valor, dado que este é formado no grupo carboxilíco.
Comparando com os valores obtidos para a ΔacHᵒ, podemos concluir que a ordem das EA é
diferentes da ordem da a ΔacHᵒ.
No caso do trolox, podemos observar que os dois valores de EA são diferentes, em que
o radical A tem uma EA inferior ao radical B. O radical A, que se forma no grupo fenólico, tem
uma EA de 2,22 eV e o radical B, radical formado no grupo carboxílico, tem uma EA de 2,41eV.
Comparando com os valores obtidos para a ΔacHᵒ, podemos concluir que a EA tem a mesma
ordem da ΔacHᵒ, sendo a estrutura B a mais estável.
O último composto a ser analisado é o α-tocoferol, que tem uma EA de 1,74 eV. É
interessante verificar que de todos os valores de EA, o do α-tocoferol é o mais baixo,
principalmente quando comparamos este valor com o dos outros radicais também formados
no grupo fenólico.
68
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
5. Apresentação e Discussão dos Resultados Teóricos
5.3. Cálculo da Entalpia de dissociação da ligação O-H, BDE
5.3. Cálculo da entalpia de ligação O-H, BDE (HAT)
Um dos objectivos deste trabalho é a determinação da entalpia de dissociação da
ligação O-H para relacionarmos com a função antioxidante. Como foi referido, a BDE pode
ser determinada tericamente por duas vias, pelo mecanismo SPLET ou pelo mecanismo HAT,
equação 13 e 36, respectivamente.
Na tabela 5.5, apresenta-se um resumo dos resultados teóricos de BDE determinado
para o mecanismo HAT. Estes valores foram obtidos para o trolox, ácido cafeico e αtocoferol, aplicando B3LYP/cc-pVTZ.
Tabela 5.5 – Valores da entalpia de dissociação da ligação (BDE).
Entalpia, H (T)
Composto
BDE
BDE
(a.u.)
(kJ/mol)
Radical
em estudo
H(ArO) (a.u.)
H(H) (a.u.)
H(ArOH) (a.u.)
A
-648,0781562
-0,4997140
-648,7374869
0,1596167
419,07
B
-648,1210118
-0,4997140
-648,7374869
0,1167611
306,56
C
-648,118553
-0,4997140
-648,7374869
0,1192203
313,01
A
-844,6276398
-0,4997140
-845,2460342
0,1186804
311,60
B
-844,627003
-0,4997140
-845,2460342
0,1193171
313,27*
-
-1284,769911
-0,4997140
-1285,3821262 0,1125011
295,37*
Ácido
Cafeico
Trolox
α-Tocoferol
*Até a este momento, cálculo destas afinidades electrónicas ainda não estava concluído. Assim, não
conseguímos obter o valor das correcções das grandezas termodinâmicas para o cálculo com um nível de teoria
B3LYP/cc-pVTZ. Por isso, utilizaram-se as correcções obtidas no cálculo com um nível de teoria B3LYP/cc-pVDZ.
No caso do ácido cafeico, podemos observar que o radical A, radical formado no grupo
carboxílico, tem o valor mais elevado de BDE, de 419 kJ/mol. De seguida, encontra-se o radical
C, com 313 kJ/mol, onde o radical é formado no grupo fenólico, quando este se encontra em
posição meta. Finalmente, temos o radical B, que se forma no grupo fenólico, quando este se
encontra em posição para, com um valor de 306 kJ/mol. Podemos supor que a estrutura mais
69
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
5. Apresentação e Discussão dos Resultados Teóricos
5.3. Cálculo da Entalpia de dissociação da ligação O-H, BDE
provável a doar o átomo de hidrogénio é o B, pois tem o menor valor de BDE e está em
concordância com os valores teóricos de ΔacHᵒ.
Depois de analisar os resultados do ácido cafeico, passamos agora para o trolox. O
radical A, radical formado no grupo fenólico, tem uma BDE de 311 kJ/mol, enquanto que o
radical B, que se forma no grupo fenólico, tem uma BDE de 313 kJ/mol. Apesar de estes dois
radicais serem formados em grupos funcionais bastante diferentes, o valor de BDE não é
muito distante. Comparando o valor do radical B do trolox e o radical A do ácido cafeico,
pudemos concluir que os seus valores de BDE são bastante diferentes, apesar de ambos os
radicais serem formados no grupo carboxílico de cada molécula. Assim, pudemos supor que
podem existir influências estruturais no valor da BDE.
A BDE obtida para o α-tocoferol tem um valor de 295 kJ/mol. Mais uma vez, o
resultado obtido para o α-tocoferol é o mais baixo de todos os valores calculados para as
BDE’s pelo mecanismo HAT, principalmente quando comparamos este valor com o dos outros
radicais também formados no grupo fenólico.
Posteriormente, estas entalpias de dissociação da ligação O-H (HAT), serão
comparadas com as BDE’s (SPLET) as que vão ser compostas pelos valores experimentais de
ΔacHᵒ, os valores teóricos de EA e a energia de ionização do átomo de hidrogénio que é
conhecida.
70
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
6. Comparação dos Resultados Experimentais e Teóricos
6.1. Ácido Cafeico
6. Comparação dos Resultados Experimentais e Teóricos
Depois de analisarmos e discutirmos os resultados experimentais e teóricos, vamos
passar agora à sua comparação.
6.1. Ácido Cafeico
Como foi referido e podemos observar na figura 5.1, o ácido cafeico tem três
possíveis locais de desprotonação. Através da aplicação do método cinético estendido na
célula de ICR, determinámos a acidez em fase gasosa do ácido cafeico, tendo o valor de 1370
± 13 kJ/mol. No estudo teórico da acidez, obtivemos três valores, 1432, 1387 e 1361 kJ/mol.
Dado que o valor mais baixo de ΔacHᵒ corresponde à estrutura mais estável, considerou-se o
valor teórico de acidez foi 1361 kJ/mol do ião B, que é comparável ao valor experimental
dentro do erro associado. Assim, concluímos que o grupo funcional em que ocorre a
desprotonação no ácido cafeico é no grupo fenólico que se encontra em posição para.
Considerando o valor teórico e experimental de ΔacHᵒ do ião B e conhecendo a
afinidade electrónica teórica para o radical B, de 2,95 eV, e a energia de ionização do átomo
de hidrogénio, de 1312 kJ/mol, pudemos determinar a entalpia de dissociação da ligação OH (tabela 6.1).
Tabela 6.1 – Comparação entre os resultados experimentais e teóricos para o ácido cafeico.
Grandeza Termoquímica
Experimental
Teórico
ΔacHᵒ
1370,34 ± 13 kJ/mol
1360,92 kJ/mol
EA
2,95 eV
2,95 eV
BDE (SPLET)
353,63 ± 11 kJ/mol
344,21 kJ/mol
71
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
6. Comparação dos Resultados Experimentais e Teóricos
6.2. Trolox
Analisando os valores de BDE obtidos para o mecanismo SPLET, podemos verificar
são bastante semelhantes. Por outro lado, o valor teórico de BDE (HAT), é 306,56 kJ/mol.
Comparando este útimo com os dois valores de BDE’s (SPLET), podemos concluir que o
primeiro se afasta muito dos outros dois.
6.2. Trolox
No caso do trolox (figura 5.2), temos dois possíveis locais de desprotonação. A
determinação da acidez em fase gasosa do trolox, foi realizada através da aplicação do
método cinético estendido na célula de ICR, tendo o valor de 1416 ± 11,3 kJ/mol. No estudo
teórico da acidez, obtivemos dois valores, 1439 e 1422 kJ/mol. O valor que corresponde à
estrutura mais estável é a ião B, de 1422 kJ/mol. Assim, consideramos que o grupo funcional
em que ocorre a desprotonação no trolox é no grupo carboxílico. Com esta consideração e
conhecendo a afinidade electrónica teórica para o radical B, de 2,41 eV, e a energia de
ionização do átomo de hidrogénio, de 1312 kJ/mol, pudemos determinar a entalpia de
dissociação da ligação O-H (tabela 6.2).
Tabela 6.2 – Comparação entre os resultados experimentais e teóricos para o trolox.
Grandeza Termoquímica
Experimental
Teórico
ΔacHᵒ
1416,10 ± 11 kJ/mol
1421,97 kJ/mol
EA
2,41 eV
2,41 eV
BDE (SPLET)
345,04 ± 11 kJ/mol
350,91 kJ/mol
Utilizando o mecanismo SPLET, vamos obter dois valores de BDE’s, que apenas têm
uma diferença de cerca 5 kJ/mol. Podemos determinar a do mecanismo HAT, recorrendo à
equação 36. Nesse caso, a BDE tem o valor de 313,27 kJ/mol. Comparando os três valores de
BDE’s, podemos concluir que este último se afasta dos outros dois, como aconteceu para o
ácido cafeico.
72
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
6. Comparação dos Resultados Experimentais e Teóricos
6.3. α-tocoferol
6.3. α-Tocoferol
Neste estudo do α-Tocoferol (figura 5.3), como foi explicado no capítulo 3.3, não foi
possível determinar experimentalmente a acidez em fase gasosa. Podemos referir, que já se
conseguiu chegar a um valor experimental de ΔacHᵒ, utilizando o método de bracketing, de
1459 ± 10 kJ/mol.[95] Comparando com o valor teórico de ΔacHᵒ, de 1470 kJ/mol, podemos
concluir que estão muito próximos.
Como, apenas conseguímos obter resultados teóricos e só tem um local de
desprotonação, o grupo fenólico, vamos fazer uma pequena discussão sobre esses
resultados. A entalpia de dissociação da ligação O-H, pode ser conseguida de duas formas,
através do mecanismo HAT e SPLET. No caso do primeiro mecanismo, o valor de BDE (HAT) é
de 295,37 kJ/mol. No segundo mecanismo, utilizando a equação 13 e os valores teóricos de
ΔacHᵒ (1470,73 kJ/mol), EA (1,74 eV) e o valor conhecido de IE do átomo de hidrogénio (1312
kJ/mol), determinamos que o valor de BDE é de 333,01 kJ/mol. Assim, verificamos que existe
uma diferença de cerca 40 kJ/mol entre os dois valores de BDE’s obtidos teoricamente. Tal
como no fenol, o mecanismo HAT determina um valor BDE inferior ao do SPLET.
73
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
7. Conclusões e Perspectivas Futuras
7. Conclusões e Perspectivas Futuras
Neste trabalho, da determinação da entalpia de dissociação da ligação O-H em
compostos fenólicos, podemos concluir que se conseguiu alcançar o seu objectivo, já que se
obteve o valor da BDE’s no ácido cafeico, no trolox e no α-tocoferol.
No trabalho experimental, determinou-se a acidez em fase gasosa (∆acH) no ácido
cafeico e no trolox, para tal, recorreu-se à espectrometria de massa aplicando dois
formalismos diferentes do método cinético de Cooks. Para aplicar estes dois formalismos foi
necessário implementar a versão estendida do método cinético, em dois espectrómetros de
massa, o FTICR e a ion trap.Em paralelo, fizeram-se os cálculos teóricos, utilizando métodos
DFT’s, mais precisamente, com o funcional B3LYP, associado a uma base cc-pVTZ. Depois de
comparar os resultados experimentais com teóricos, pudemos esclarecer o grupo funcional
em que ocorre a desprotonação.
Dado que o objectivo deste trabalho é a determinação das BDE’s e
experimentalmente era difícil obter as afinidades electrónicas (EA), recorreu-se aos cálculos
teóricos para sua determinação. Combinando os valores experimentais de ∆acH (ArOH), os
teóricos de EA (ArO) e o conhecido de IE(H), pudemos determinar as
entalpias de
dissociação da ligação O-H nos compostos fenólicos em estudo pelo mecanismo SPLET.
Teóricamente foi possível determinar as BDE’s por dois mecanismos, o HAT (dissociação
homolítica) e o SPLET (dissociação heterolítica).
No estudo do ácido cafeico, obteve-se experimentalmente três valores de ∆acH.
Considerou-se que o valor de ∆acH foi de 1370 ± 13 kJ/mol, que realizado no FTICR através
da aplicação do método cinétco estendido. O resultado teórico escolhido foi o 1361 kJ/mol
para o ião B. Assim, pudemos concluir que a desprotonação ocorreu no grupo fenólico,
quando este se encontra em posição para. Com estas considerações e conhecendo a
afinidade electrónica teórica para o radical B (2,95 eV) e a energia de ionização do átomo de
hidrogénio (1312 kJ/mol), encontrou-se o valor de 354 ± 11 kJ/mol para a entalpia de
dissociação da ligação O-H para o ácido cafeico.
O estudo da acidez em fase gasosa do trolox começou num projecto de licenciatura,
tendo sido obtido um valor de 1402 ± 9 kJ/mol. Neste trabalho, inserimos mais duas
referências e aplicámos outro formalismo do método cinético, de modo, a consolidar esse
resultado. Assim, obtivemos uma ∆acH de 1416 ± 11 kJ/mol. Comparando, com os cálculos
75
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
7. Conclusões e Perspectivas Futuras
teórico realizados, esclarecemos que o protão saiu do grupo carboxílico desta molécula,
tendo sido considerado o valor teórico de 1422 kJ/mol do ião B. Posteriormente, com o
valor de ΔacHᵒ, da EA e da IE, determinámos a entalpia de dissociação da ligação O-H para o
trolox, que foi de 345 ± 11 kJ/mol.
Um dos objectivos deste trabalho era o estudo experimental e teórico do αtocoferol. Através da espectrometria de massa, pretendia-se determinar experimentalmente
a acidez em fase gasosa, mas não fora possível formar o heterodímero que permitia esse
estudo. Essa impossibilidade pode dever-se a impedimentos estereoquímicos causados pela
longa cadeia alifática, já que anteriormente foi possível estudar o cromanol, sendo que este
é igual ao α-tocoferol, mas sem a longa cadeia alifática. Assim, realizou-se o estudo teórico
do α-tocoferol, onde se conseguiu obter os valores de ∆acH (ArOH), de EA (ArO) e BDE, que
foram respectivamente, de 1470 kJ/mol, de 1,74 eV e de 333 kJ/mol. Sendo o α-tocoferol
menos ácido que os outros compostos em estudo e apresentando resultados teóricos de EA
e BDE inferiores em relação ao ácido cafeico e trolox, podemos concluir que a afinidade
electrónica deve ter uma grande influência no valor da entalpia de dissociação da ligação OH.
Sabe-se que a função antioxidante está relacionada com o baixo valor de BDE’s em
compostos fenólicos. Assim, podemos concluir que o α-tocoferol com valores mais baixos de
entalpia de dissociação da ligação O-H do que os outros dois compostos será o antioxidante
mais activo dos três.
Futuramente, concluir-se-á um estudo teórico do α-tocoferol, onde se tentará
compreender a influência da cadeia alifática na formação do heterodímero. Também,
concluir-se-á a análise dos resultados de ∆acH para o trolox e o ácido cafeico, obtidos na
célula de colisões situada entre o quadrupolo e a célula de ICR, aplicando o método cinético
estendido.
76
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
8. Bibliografia
8. Bibliografia
1.
Houaiss, A., Dicionário Houaiss da Língua Portuguesa, 2001.
2.
Os Antioxidantes, in Food Ingredients Brasik2009. p. 16-30.
3.
Ferreira, A.L.A.e Matsubara, L.S., Radicais livres: conceitos, doenças relacionadas, sistema
de defesa e estresse oxidativo. Revista da Associação Médica Brasileira, 1997. 43: p. 6168.
4.
Sousa, C.M.d.M.S., Hilris Rocha ;Vieira-Jr., Gerardo Magela;;Ayres, Mariane Cruz C.;Costa,
Charllyton Luis S. da; Araújo, Delton Sérvulo;Cavalcante, Luis Carlos D.;Barros, Elcio
Daniel S.;Araújo, Paulo Breitner de M.;Brandão, Marcela S.;Chaves, Mariana H., Fenóis
totais e atividade antioxidante de cinco plantas medicinais. Química Nova, 2007. 30: p.
351-355.
5.
Surveswaran, S., Cai, Y.Z., Xing, J., Corke, H.e Sun, M., Antioxidant properties and
principal phenolic phytochemicals of Indian medicinal plants from Asclepiadoideae and
Periplocoideae. Nat Prod Res, 2010. 24(3): p. 206-21.
6.
Chandrasekara, A.e Shahidi, F., Content of insoluble bound phenolics in millets and their
contribution to antioxidant capacity. J Agric Food Chem, 2010. 58(11): p. 6706-14.
7.
Sies, H., Strategies of antioxidant defense. Eur J Biochem, 1993. 215(2): p. 213-9.
8.
Halliwell, B., Superoxide-dependent formation of hydroxyl radicals in the presence of iron
chelates: Is it a mechanism for hydroxyl radical production in biochemical systems? FEBS
Letters, 1978. 92(2): p. 321-326.
9.
McCord, J.M.e Day Jr, E.D., Superoxide-dependent production of hydroxyl radical
catalyzed by iron—EDTA complex. FEBS Letters, 1978. 86(1): p. 139-142.
10.
Fernandez, M.T., Mira, M.L., Florêncio, M.H.e Jennings, K.R., Iron and copper chelation by
flavonoids: an electrospray mass spectrometry study. Journal of Inorganic Biochemistry,
2002. 92(2): p. 105-111.
77
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
8. Bibliografia
11.
Matos, M.A.R., Miranda, M.S.e Morais, V.M.F., Thermochemical study of the methoxyand dimethoxyphenol isomers. Journal of Chemical and Engineering Data, 2003. 48(3): p.
669-679.
12.
Bianchi, M.d.L.P.A., Lusânia Maria Greggi, Radicais livres e os principais antioxidantes da
dieta. Revista de Nutrição, 1999. 12(2).
13.
van Acker, S.A., Koymans, L.M.e Bast, A., Molecular pharmacology of vitamin E: structural
aspects of antioxidant activity. Free Radic Biol Med, 1993. 15(3): p. 311-28.
14.
Vitamin
E.
2012
[acedido
2012,
04
de
Junho];
Available
from:
http://en.wikipedia.org/wiki/Vitamin_E.
15.
Wright, J.S., Johnson, E.R.e DiLabio, G.A., Predicting the activity of phenolic antioxidants:
theoretical method, analysis of substituent effects, and application to major families of
antioxidants. J Am Chem Soc, 2001. 123(6): p. 1173-83.
16.
Oliveira, D.M.d.e Bastos, D.H.M., Biodisponibilidade de ácidos fenólicos. Química Nova,
2011. 34: p. 1051-1056.
17.
Degáspari, C.H.W., N. , Antioxidants Properties of Phenolic Compounds. Visão Acadêmica,
2004. 5(1): p. 33-40.
18.
W., A. What Is Caffeic Acid? 2012
[acedido 2012, 04 de Junho]; Available from:
http://www.wisegeek.com/what-is-caffeic-acid.htm.
19.
Gulcin, I., Antioxidant activity of caffeic acid (3,4-dihydroxycinnamic acid). Toxicology,
2006. 217(2-3): p. 213-20.
20.
Trolox.
2012
[acedido
2012,
4
de
Junho];
Available
from:
http://en.wikipedia.org/wiki/Trolox.
21.
Chandra, A.e Uchimaru, T., The O-H Bond Dissociation Energies of Substituted Phenols
and Proton Affinities of Substituted Phenoxide Ions: A DFT Study. International Journal of
Molecular Sciences, 2002. 3(4): p. 407-422.
78
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
8. Bibliografia
22.
Leopoldini, M., Marino, T., Russo, N.e Toscano, M., Antioxidant properties of phenolic
compounds: H-atom versus electron transfer mechanism. Journal of Physical Chemistry A,
2004. 108(22): p. 4916-4922.
23.
Madeira, P.J., Costa, P.J., Fernandez, M.T., Simoes, J.A.e Leal, J.P., Determination of gasphase acidities of dimethylphenols: combined experimental and theoretical study. J Am
Soc Mass Spectrom, 2008. 19(11): p. 1590-9.
24.
DeTuri, V.F.e Ervin, K.M., Competitive threshold collision-induced dissociation: Gas-phase
acidities and bond dissociation energies for a series of alcohols. Journal of Physical
Chemistry A, 1999. 103(35): p. 6911-6920.
25.
Eyet, N., Villano, S.M.e Bierbaum, V.M., Anchoring the gas-phase acidity scale: From
formic acid to methanethiol. International Journal of Mass Spectrometry, 2009. 283(1-3):
p. 26-29.
26.
Ervin, K.M.e DeTuri, V.F., Anchoring the Gas-Phase Acidity Scale†. The Journal of Physical
Chemistry A, 2002. 106(42): p. 9947-9956.
27.
Eyet, N.e Bierbaurn, V.A., Gas-phase acidities of thiocarboxylic acids. International
Journal of Mass Spectrometry, 2007. 265(2-3): p. 267-270.
28.
Opitz, J., Electron-impact ionization of benzoic acid, nicotinic acid and their n-butyl esters:
An approach to regioselective proton affinities derived from ionization and appearance
energy data. International Journal of Mass Spectrometry, 2007. 265(1): p. 1-14.
29.
Wang, X.-B., Fu, Q.e Yang, J., Electron Affinities and Electronic Structures of o-, m-, and pHydroxyphenoxyl Radicals: A Combined Low-Temperature Photoelectron Spectroscopic
and Ab Initio Calculation Study. The Journal of Physical Chemistry A, 2010. 114(34): p.
9083-9089.
30.
Brigati, G., Lucarini, M., Mugnaini, V.e Pedulli, G.F., Determination of the substituent
effect on the O-H bond dissociation enthalpies of phenolic antioxidants by the EPR radical
equilibration technique. J Org Chem, 2002. 67(14): p. 4828-32.
79
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
8. Bibliografia
31.
Matos, M.A.R., Miranda, M.S.e Morais, V.M.F., 3,4,5-Trimethoxyphenol: A combined
experimental and theoretical thermochemical investigation of its antioxidant capacity.
The Journal of Chemical Thermodynamics, 2008. 40(4): p. 625-631.
32.
dos Santos, R.M.B.e Simoes, J.A.M., Energetics of the O--H Bond in Phenol and
Substituted Phenols: A Critical Evaluation of Literature Data. Journal of Physical and
Chemical Reference Data, 1998. 27(3): p. 707-739.
33.
Martins, H.F., Leal, J.P., Fernandez, M.T., Lopes, V.H.e Cordeiro, M.N., Toward the
prediction of the activity of antioxidants: experimental and theoretical study of the gasphase acidities of flavonoids. J Am Soc Mass Spectrom, 2004. 15(6): p. 848-61.
34.
Madeira, P.J., Faddoul, M., Afonso, M.B., Vaz, P.D., Fernandez, M.T.e Leal, J.P., On the
way to understand antioxidants: chromanol and dimethoxyphenols gas-phase acidities.
Journal of Mass Spectrometry, 2011. 46(7): p. 640-8.
35.
Cooks, R.G.e Wong, P.S.H., Kinetic method of making thermochemical determinations:
Advances and applications. Accounts of Chemical Research, 1998. 31(7): p. 379-386.
36.
Holmes, J.L., Aubry, C.e Mayer, P.M., Proton Affinities of Primary Alkanols: An Appraisal
of the Kinetic Method. The Journal of Physical Chemistry A, 1999. 103(6): p. 705-709.
37.
Afonso, C., Modeste, F., Breton, P., Fournier, F.e Tabet, J.C., Proton affinity of the
commonly occuring L-amino acids by using electrospray ionization-ion trap mass
spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry, 2000. 6(1): p. 443.
38.
Harrison, A.G., The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides.
Mass Spectrom Rev, 1997. 16(4): p. 201-217.
39.
Fernandez, M.T.N., Thermodynamics of proton transfer reactions in the gas phase, 1986,
University of Warwick.
40.
Madeira, P.J.A., Energética/Estrutura/Reactividade de fenóis substituídos em fase gasosa,
in Departamento de Química e Bioquímica2005, Universidade de Lisboa.
80
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
8. Bibliografia
41.
Caprioli, R.M., Special feature - Commentary - The kinetic method. Journal of Mass
Spectrometry, 1999. 34(2): p. 73-73.
42.
KHolbrook, K.A.P., M. J.; Robertson, S.H., Unimolecular Reactions. 2ª ed1996: John Wiley
& Sons, Ltd
43.
Majumdar, T.K., Clairet, F., Tabet, J.C.e Cooks, R.G., Epimer distinction and structural
effects on gas-phase acidities of alcohols measured using the kinetic method. Journal of
the American Chemical Society, 1992. 114(8): p. 2897-2903.
44.
Armentrout, P.B., Is the kinetic method a thermodynamic method? Journal of Mass
Spectrometry, 1999. 34(2): p. 74-78.
45.
Drahos, L.e Vekey, K., Special feature: Commentary - How closely related are the effective
and the real temperature. Journal of Mass Spectrometry, 1999. 34(2): p. 79-84.
46.
Madeira, P.J.A., A Mass Spectrometry Study of Compounds with Enviromental and
Biological Interest, in Departamento Química e Bioquímica2010, Universidade de Lisboa:
Faculdade de Ciências.
47.
Zheng, X.e Cooks, R.G., Thermochemical Determinations by the Kinetic Method with
Direct Entropy Correction†. The Journal of Physical Chemistry A, 2002. 106(42): p. 99399946.
48.
Skoog, A.D.L.J.J., Principles of Instrumental Analysis. fourth ed1992, Saunders College:
Harcourt Brace College.
49.
Madeira, P.J.A.A., P.A.; Borges, C.M., High Resolution Mass Spectrometry Using FTICR and
Orbitrap Instruments - Materials Analysis, Salih Mohammed Salih (Ed.)2012: InTech.
50.
Hoffman, E.S., V., Mass Spectrometry - Prnciples and Applications 2ª ed2001: Wiley.
51.
Ashcroft, A.E., Ionization Methods in Organic Mass Spectrometry. 1ª ed1997.
52.
Douglas, D.J., Frank, A.J.e Mao, D., Linear ion traps in mass spectrometry. Mass Spectrom
Rev, 2005. 24(1): p. 1-29.
81
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
8. Bibliografia
53.
Wong, P.S.H.C., R. Graham Ion Trap Mass Spectrometry. 2000.
54.
Hu, Q., Noll, R.J., Li, H., Makarov, A., Hardman, M.e Graham Cooks, R., The Orbitrap: a
new mass spectrometer. Journal of Mass Spectrometry, 2005. 40(4): p. 430-43.
55.
Cody, R.B., Tamura, J.e Musselman, B.D., Electrospray Ionization Magnetic-Sector MassSpectrometry - Calibration, Resolution, and Accurate Mass Measurements. Analytical
Chemistry, 1992. 64(14): p. 1561-1570.
56.
Boyd, R.K.B., C.; Bethem, R.A., Trace Quantitative Analysis by Mass Spectrometry. 1ª
ed2008: John Wiley & Sons, Ltd.
57.
CS Ho, C.L., MHM Chan, RCK Cheung, LK Law, LCW Lit, KF Ng, MWM Suen, and HL Tai,
Electrospray Ionisation Mass Spectrometry Principles and Clinical. 2003.
58.
Manil, B., Ntamack, G.E., Lebius, H., Huber, B.A., Duft, D., Leisner, T., Chandezon, F.e
Guet, C., Charge emission and decay dynamics of highly charged clusters and microdroplets. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam
Interactions with Materials and Atoms, 2003. 205(0): p. 684-689.
59.
Duarte, M.F., Espectrometria de Massa de Electrospray - Técnica do Presente e do Futuro.
Soc. R. Química, 2001. 80 p. 36 - 42.
60.
M., W., Principles of Electrospray Ionization. Mol Cell Proteomics, 2011.
61.
Nemes, P., Marginean, I.e Vertes, A., Spraying mode effect on droplet formation and ion
chemistry in electrosprays. Anal Chem, 2007. 79(8): p. 3105-16.
62.
March, E.R., Quadrupolo Ion trap Mass Spectrometry. Encyclopedia of Analytical
Chemistry, 2000: p. 1-25.
63.
quadrupole Ion Trap. 2012
[acedido 2012, 4 de Junho]; Available from:
http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/qit-massspec.html.
64.
Madeira, P.J.A.F., M.H., Applications of Tandem Mass Spectrometry: From Strutural
Analysis to Fundamental Studies. 1ª ed2012: InTech.
82
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
8. Bibliografia
65.
Marçalo, J.A., Espectrometria de Massa de Ressonância Ciclotrónica de Iões com
Transformada de Fourier. Boletim da Sociedade Portuguesa de Química, 1997. 66: p. 3438.
66.
FTICR.
2012
[acedido
2012,
4
de
Junho];
Available
from:
http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/fticr-massspec.html.
67.
Marshall, A.G., Hendrickson, C.L.e Jackson, G.S., Fourier transform ion cyclotron
resonance mass spectrometry: a primer. Mass Spectrom Rev, 1998. 17(1): p. 1-35.
68.
Grosshans, P.B.e Marshall, A.G., General-Theory of Excitation in Ion-Cyclotron Resonance
Mass-Spectrometry. Analytical Chemistry, 1991. 63(18): p. 2057-2061.
69.
Shi, S.D.H., Drader, J.J., Freitas, M.A., Hendrickson, C.L.e Marshall, A.G., Comparison and
interconversion of the two most common frequency-to-mass calibration functions for
Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. International Journal of
Mass Spectrometry, 2000. 195(0): p. 591-598.
70.
Kanawati, B.e Wanczek, K.P., Characterization of a new open cylindrical ICR cell for ion–
ion collision studies. International Journal of Mass Spectrometry, 2008. 269(1-2): p. 1223.
71.
ThermoScientifc, Hardware Manual - Finnigan LCQ Duo1999: ThermoQuest.
72.
Tian, Q.e Schwartz, S.J., Mass spectrometry and tandem mass spectrometry of citrus
limonoids. Anal Chem, 2003. 75(20): p. 5451-60.
73.
Jennings, K.R., The changing impact of the collision-induced decomposition of ions on
mass spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry, 2000. 200(1–3): p. 479493.
74.
104, T.S.P.S.B. Normalized Collision Energy Technology. [acedido 2012, 3 de Setembro];
Available
from:
http://www.thermo.com/eThermo/CMA/PDFs/Articles/articlesFile_21418.pdf.
83
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
8. Bibliografia
75.
Lopez, L.L., Tiller, P.R., Senko, M.W.e Schwartz, J.C., Automated strategies for obtaining
standardized collisionally induced dissociation spectra on a benchtop ion trap mass
spectrometer. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 1999. 13(8): p. 663-668.
76.
Madeira, P.J.A., Morais, T.S., Silva, T.J.L., Florindo, P.e Garcia, M.H., Gas-phase behaviour
of Ru(II) cyclopentadienyl-derived complexes with N-coordinated ligands by electrospray
ionization mass spectrometry: fragmentation pathways and energetics. Rapid
Communications in Mass Spectrometry, 2012. 26(15): p. 1675-1686.
77.
BrukerDaltonics, User Manual - Apex Qe series2008.
78.
Laskin, J.e Futrell, J.H., Activation of large lons in FT-ICR mass spectrometry. Mass
Spectrom Rev, 2005. 24(2): p. 135-167.
79.
Gomes, A.R.e Fernandez, M.T., Determinação da acidez em fase gasosa de compostos
fenólicos. Contribuição para o esclarecimento da função antioxidante(trabalho não
publicado), in Departamento de Química e Bioquímica2010, Universidade de Lisboa.
80.
Schnier, P.D., Jurchen, J.C.e Williams, E.R., The Effective Temperature of Peptide Ions
Dissociated by Sustained Off-Resonance Irradiation Collisional Activation in Fourier
Transform Mass Spectrometry. The Journal of Physical Chemistry B, 1999. 103(4): p. 737745.
81.
Nunes, J.M.A.S.e Vaz, P., Previsão da acidez, de compostos fenólicos por métodos
computacionais. COntribuição para o esclarecimento da função antioxidante (trabalho
não publicado), 2012, Universidade de Lisboa.
82.
Teixeira Dias, J.J.C., Química Quântica - Fundamentos e Métodos1982: Fundação
Calouste Gulbenkian.
83.
Atkins, P.W.F.S., Molecular Quantum Mechanics. 3rd ed1999: Oxford University Press.
545.
84.
Truhlar, D.G. Theoretical Chemistry. 2012 [acedido 2012, Setembro]; Available from:
http://www.chemistryexplained.com/Te-Va/Theoretical-Chemistry.html.
84
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
8. Bibliografia
85.
Argaman, N.e Makov, G., Density functional theory: An introduction. American Journal of
Physics, 2000. 68(1): p. 69-79.
86.
Gomes, J.R.B.e Ribeiro da Silva, M.A.V., Gas-Phase Thermodynamic Properties of
Dichlorophenols Determined from Density Functional Theory Calculations. The Journal of
Physical Chemistry A, 2003. 107(6): p. 869-874.
87.
Foresman, J.B.F., A., Exploring Chemistry with Electronic Struture Methods. 2nd ed1996,
Pittsburg, PA, USA.
88.
Najafi, M., Zahedi, M.e Klein, E., DFT/B3LYP study of the solvent effect on the reaction
enthalpies of homolytic and heterolytic OH bond cleavage in mono-substituted chromans.
Computational and Theoretical Chemistry, 2011. 978(1–3): p. 16-28.
89.
Klein, E.e Lukeš, V., DFT/B3LYP study of O–H bond dissociation enthalpies of para and
meta substituted phenols: Correlation with the phenolic C–O bond length. Journal of
Molecular Structure: THEOCHEM, 2006. 767(1–3): p. 43-50.
90.
Bartmess, J.E., Thermodynamics of the Electron and the Proton. The Journal of Physical
Chemistry, 1994. 98(25): p. 6420-6424.
91.
Cabral, B.J.C.e Canuto, S., The enthalpy of the O–H bond homolytic dissociation: Basis-set
extrapolated density functional theory and coupled cluster calculations. Chemical Physics
Letters, 2005. 406(4–6): p. 300-305.
92.
Guedes, R.C.C.C., B. J.;Martinho Simões, J. A.;Diogo, H. P., Thermochemical Properties
and Structure of Phenol−(H2O)1-6 and Phenoxy−(H2O)1-4 by Density Functional Theory.
The Journal of Physical Chemistry A, 2000. 104(25): p. 6062-6068.
93.
Standard Reference Data, N. Gas phase ion energetics data. 2012; Available from:
http://webbook.nist.gov/cgi/cbook.cgi?ID=C108952&Units=SI&Mask=20#Ion-Energetics.
94.
Gunion, R.F., Gilles, M.K., Polak, M.L.e Lineberger, W.C., Ultraviolet photoelectron
spectroscopy of the phenide, benzyl and phenoxide anions, with ab initio calculations.
International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes, 1992. 117(0): p. 601-620.
85
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
8. Bibliografia
95.
Fernandez, M.T., Determinação da acidez em fase gasosa da vitamina E (trabalho não
publicado), 2000.
86
Correlação da função antioxidante com energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Anexos
Anexo A – Espectros MS das misturas de ácido cafeico com as várias referências – Ion Trap
a) Espectro MS do ácido cafeico com o ácido benzóico.
b) Espectro MS do ácido cafeico com ácido 4-hidroxibenzóico.
c) Espectro MS ácido cafeico com o 4-hidroxiacetofenona.
d) Espectro MS do ácido cafeico com o ácido nicotínico.
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
e) Espectro MS do ácido cafeico com o ácido 4-cianobenzóico.
f) Espectro MS do ácido cafeico com o ácido 2-hidroxibenzóico.
g) Espectro MS do ácido cafeico com o ácido 2,5-dihidroxibenzóico.
h) Espectro MS do ácido cafeico com o ácido pentafluorobenzóico.
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
i) Espectro MS do ácido cafeico com o ácido 2,4,6-trihidroxibenzóico.
j) Espectro MS do ácido cafeico com o ácido pícrico.
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Anexo B – Espectros MS2 - Estudo da acidez do ácido cafeico – Ion Trap
a) Espectro MS2 do heterodímero formado pelo ácido cafeico e o ácido benzóico.
b) Espectro MS2 do heterodímero formado pelo ácido cafeico e o ácido 4-hidroxibenzóico.
c) Espectro MS2 do heterodímero formado pelo ácido cafeico e o 4-hidroxiacetofenona.
d) Espectro MS2 do heterodímero formado pelo ácido cafeico e o ácido nicotínico.
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
e) Espectro MS2 do heterodímero formado pelo ácido cafeico e o ácido 4-cianobenzóico.
f) Espectro MS2 do heterodímero formado pelo ácido cafeico e o ácido 2-hidroxibenzóico.
g) Espectro MS2 do heterodímero formado pelo ácido cafeico e o ácido 2,5dihidroxibenzóico.
h) Espectro MS2 do heterodímero formado pelo ácido cafeico e o ácido pentafluorobenzóico.
i) Espectro MS do heterodímero formado pelo ácido cafeico e o ácido 2,4,6trihidroxibenzóico.
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Anexo C – Espectros MS2 - Estudo da acidez do ácido cafeico– FTICR
*Os iões 300,9 e 299,9 são frequências fantasmas.
a) Espectro MS2 do heterodímero formado pelo ácido cafeico e o ácido 4-cianobenzóico.
b) Espectro MS2 do heterodímero formado pelo ácido cafeico e o ácido 2-hidroxibenzóico.
c) Espectro MS2 do heterodímero formado pelo ácido cafeico e o ácido 2,5dihidroxibenzóico.
d) Espectro MS2 do heterodímero formado pelo ácido cafeico e o ácido pentafluorobenzóico.
e) Espectro MS do heterodímero formado pelo ácido cafeico e o ácido 2,4,6trihidroxibenzóico.
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Anexo D – Espectros MS das misturas do Trolox com várias referências – Ion Trap
a) Espectro MS do trolox com o 3-trifluorometilfenol.
b) Espectro MS do trolox com o 4-hidroxibenzoato de metilo.
c) Espectro MS do trolox com o 3-trifluorometilfenol.
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
d) Espectro MS do trolox com o ácido 4-hidroxibenzóico.
e) Espectro MS do trolox com a 4-hidroxiacetofenona.
f) Espectro MS do trolox com o ácido nicotínico.
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Anexo E – Espectros MS2 – Estudo da acidez do Trolox – Ion Trap
a) Espectro MS2 do heterodímero formado pelo trolox e o 3-trifluorometilfenol.
b) Espectro MS2 do heterodímero formado pelo trolox e o 4-hidroxibenzoato de metilo.
c) Espectro MS2 do heterodímero formado pelo trolox e o 3-trifluorometilfenol.
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
d) Espectro MS2 do heterodímero formado pelo trolox e o ácido 4-hidroxibenzóico.
e) Espectro MS2 do heterodímero formado pelo trolox e o 4-hidroxiacetofenona.
f) Espectro MS2 do heterodímero formado pelo trolox e o ácido nicotínico.
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Anexo F – Espectros MS – Estudo da acidez do trolox– FTICR
a) Espectro MS2 do heterodímero formado pelo trolox e o 4-hidroxibenzoato de metilo.
b) Espectro MS2 do heterodímero formado pelo trolox e o 3-trifluorometilfenol.
c) Espectro MS2 do heterodímero formado pelo trolox e o ácido 4-hidroxibenzóico.
d) Espectro MS2 do heterodímero formado pelo trolox e o 4-hidroxiacetofenona.
e) Espectro MS2 do heterodímero formado pelo trolox e o ácido nicotínico.
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Anexo G – Espectros MS das misturas do α-tocoferol com as várias referências – Ion Trap
a) Espectro MS do α-tocoferol com o 3,4-dimetilfenol.
b) Espectro MS do α-tocoferol com o 4-metilfenol.
c) Espectro MS do α-tocoferol com o cromanol.
d) Espectro MS do α-tocoferol com o 4-etilfenol.
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
e) Espectro MS do α-tocoferol com o 3,4-dimetoxidofenol.
f) Espectro MS do α-tocoferol com o fenol.
g) Espectro MS do α-tocoferol com o 4-fluorofenol.
h) Espectro MS do α-tocoferol com o 4-clorofenol.
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Anexo H – Espectros MS – Estudo do solvente no α-tocoferol – Ion Trap
a) Espectro MS do α-tocoferol em metanol.
b) Espectro MS do α-tocoferol em água.
c) Espectro MS do α-tocoferol em água.
d) Espectro MS do α-tocoferol em acetonitrilo.
e) Espectro MS do α-tocoferol em DMSO.
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
Anexo I – Resultados da acidez em fase gasosa do trolox, incluíndo os valores obtidos para
o ácido nicotínico
Com estes valores da tabela 3.12, fizemos um gráfico (I.1) para cada conjunto de
valores, do logaritmo da razão das abundâncias iónicas em função dos valores de ΔacH(RH)
das referências.
3,00
Ln [ArO-/R-]
2,00
1,00
0,00
1395
-1,00
ΔacH (kJ/mol)
1400
1405
1410
1415
-2,00
y = 0,1124x - 158,38
R² = 0,1108
-3,00
-4,00
Gráfico I.1 – 1ª regressão linear - Valores obtidos através da razão o logaritmo da razão das intensidades para
cada referência a 0 Hz.
Desta forma, obtivemos um conjunto de representações gráficas, um gráfico para
cada frequency Offset, onde retiramos o valor de -m (1/RTeff) e b (ΔGapp(RH)/RTeff) e
organizamos na tabela I.1.
Tabela I.1 – Valores de m e b, obtidos através das 1ª representações gráficas.
Amplitude de excitação
0 Hz
100 Hz
200 Hz
300 Hz
1/RTeff (-m)
158,38
133,80
118,69
96,12
ΔGapp(ArOH)/RTeff (b)
0,112
0,095
0,084
0,068
R2
0,1108
0,0904
0,0789
0,0516
Teff
1070,10
1268,77
1431,89
1774,03
(frequency Offset)
Com os valores descritos na tabela, contruímos a segunda representação gráfica
(gráfico I.2). Através desta representação gráfica, determinámos que o valor da afinidade
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.
protónica em fase gasosa, ΔacH, do anião do trolox corresponde a 1396 ± 10,3 kJ/mol e a
valor da variação de entropia é de 12,06 J/mol.
ΔGapp(RH)/RTeff
200
150
y = 1396,07x + 1,45
R² = 1,00
100
50
0
0,05
1/RTeff
0,1
0,15
Gráfico I.2 – 2ª regressão linear - Valores obtidos através de 1/RTeff em função de ΔGapp(RH)/RTeff .
Comparando este valor com o valor experimental, de 1416 ± 11,3 kJ/mol, e com o
valor teórico, de 1422 kJ/mol, verificamos que existe uma diferença de 20 kJ/mol ou mais.
Correlação da função antioxidante com a energia de ligação O-H em compostos fenólicos.