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INTRODUÇÃO
Embora conhecido a muitos séculos, somente nas últimas décadas o
câncer vem ganhando uma dimensão maior, convertendo-se em um grave
problema de saúde pública mundial. Depois das doenças cardiovasculares, o
câncer é a segunda principal causa de morte nos países desenvolvidos e contribui
também significativamente, para as taxas de mortalidade em adultos, nos países
em desenvolvimento. Embora as taxas totais da doença variem pouco em todo
mundo, os tipos de câncer observados mundialmente são dramaticamente
diferentes (Willett, 2000).
Nos Estados Unidos, o câncer é a segunda causa de morte sendo
responsável por um em cada quatro casos. Segundo estimativa da Sociedade
Americana do Câncer para o ano de 2002, aproximadamente 1.284.900
americanos iriam receber um novo diagnóstico e 555.500 americanos iriam morrer
desta doença (EUA/PNCR, 2002).
No Brasil, o câncer se configura e se consolida como um problema de
saúde pública. Devido a heterogeneidade cultural, demográfica, sócio-econômica e
política de suas regiões geográficas, a população brasileira está submetida a
fatores de riscos diferentes. A partir dos anos 60, as doenças infecciosas e
parasitárias deixaram de ser a principal causa de morte, sendo substituída pelas
doenças do aparelho circulatório e pelas neoplasias. Mais recentemente, com o
incremento da mortalidade por causas externas, o câncer deixou de ser a segunda
causa de morte na população brasileira e passou a ocupar o terceiro lugar
(Ministério da Saúde/INCA, 2000).
2
O câncer perde, pouco a pouco, seu caráter fatal graças sobretudo
aos constantes progressos científicos. Continua sendo, entretanto, uma gravíssima
doença para qual é necessário esforçar-se para preveni-la e mesmo tratá-la de
forma adequada o mais precoce possível (Bingan,1991).
A terapêutica do câncer depende basicamente do tipo e do
estadiamento do tumor. Dentre as
modalidades de tratamento antineoplásico,
destaca-se a radioterapia (RT) que consiste na utilização de dois tipos
fundamentais de radiação: foton (raioX e radiação gama) e o feixe de elétrons
(Filho e Ferreira, 1991; Lima et al, 1999).
A radioterapia é freqüentemente usada como tratamento primário ou
adjuvante de tumores pélvicos e abdominais (Craighead e Young, 1998; Keys et al,
1999). Este tratamento apresenta efeitos adversos sobre o trato gastrointestinal,
especialmente no intestino delgado e grosso. O efeito da radiação pode resultar em
vários sintomas como: anorexia, perda de peso, desordens abdominais, diarréia,
má-absorção e vômitos, podendo causar ainda problemas graves como obstrução
intestinal intermitente, fístula, sangramento, perfuração com formação de abcesso
ou peritonite que podem necessitar de tratamento cirúrgico (Beer et al, 1985;
Regimbeau et al, 2001).
O efeito da radiação ionizante no trato gastrointestinal pode ser
causado por um efeito direto na própria mucosa ou por uma vasculite obliterativa
que pode produzir
problemas intestinais isquêmicos
anos após o tratamento
radioterápico, levando à estenose e necrose das alças intestinais (Yeoh et al, 1993;
Nguyen et al, 2002).
A injúria da mucosa intestinal que está associada com a radioterapia
abdominal, enterite por radiação, é caracterizada por destruição das células
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proliferativas das criptas, diminuição da altura das vilosidades, ulceração da
mucosa do trato gastrointestinal e aumento da permeabilidade intestinal, com
conseqüente translocação bacteriana (Maza et al, 2001; Chun et al, 1997 ; Souba
et al, 1990a). Tem sido demonstrado que a suplementação com glutamina durante
o período pré e pós-radioterapia abdominal, parece prevenir lesões , acelerar a
cicatrização do intestino irradiado e diminuir as complicações da enteropatia
provocada pela radioterapia, em animais experimentais (Campos et al, 1996a
Klimberg et al 1990a).
A glutamina
constitui um importante substrato metabólico para as
células de replicação rápida, sendo uma importante fonte energética
para os
enterócitos, principalmente em períodos que podem ocorrer danos à barreira da
mucosa intestinal (Palanch, 2000).
Estudos realizados em animais mostraram que a suplementação de
glutamina melhorou a resposta intestinal de adaptação a irradiação abdominal.
Ratos que receberam dieta enriquecida com glutamina antes da irradiação
apresentaram significativo aumento no número e na altura das vilosidades e
aumento no número de mitoses por cripta, indicando portanto que a glutamina
apresenta um efeito protetor preventivo da mucosa intestinal (Counter et al 1990;
Klimberg,1990a).
Em um outro estudo recente, com ratos recebendo dieta rica em
glutamina e arginina antes e após a irradiação, foi demonstrado que ambos os
nutrientes apresentaram um efeito protetor sobre a mucosa intestinal no período
pós-radiação. Os benefícios foram a aceleração da cicatrização e prevenção da
translocação bacteriana assim como diminuição da perda de peso. Entretanto a
administração conjunta pré e pós-radiação não promove efeito superior quando
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comparados a administração pós-radiação somente, demonstrando assim a
importância da glutamina como efeito terapêutico (Ersin et al, 2000).
Pacientes com câncer apresentam alta incidência de desnutrição e
mais de 66% deles apresentam inanição durante o curso da doença causado por
diferentes fatores inerentes a doença, incluindo anorexia, distúrbios metabólicos,
fatores mecânicos ou toxicidade do tratamento capazes de causar má-absorção e
disfagia (Capra, 2000). A desnutrição e a perda de peso pré-tratamento têm sido
considerados como sendo fatores de prognóstico ruim para a sobrevida e resposta
ao tratamento anti-neoplásico (Mercadante,1998).
Tannuri et al. (2000) demonstraram que uma dieta rica em glutamina
administrada por 15 dias foi eficaz na promoção do ganho do peso e no trofismo da
mucosa jejunal em ratos desnutridos aos 21 dias de idade em comparação ao
grupo controle.
Apesar das evidências demonstrando a ação benéfica da glutamina
como efeito trófico e protetor na mucosa gastrointestinal após radiação abdominal,
não foi encontrado na literatura estudos mostrando o efeito da glutamina sobre a
mucosa intestinal de ratos desnutridos submetidos à radiação abdominal.
O modelo experimental de desnutrição já vem sendo utilizado em
nosso laboratório desde 1997. Nossos estudos têm demonstrado alterações na
função tireóidea das mães e dos filhotes quando a desnutrição protéica é
provocada durante a lactação (Ramos et al, 1997; Ramos et al, 2000; Passos et al,
2001a; Passos et al, 2001b). Além disso, demonstramos que a desnutrição em
animais adultos afeta a biodistribuição de radiofármacos (Passos et al, 2000b).
Os efeitos benéficos da glutamina nesta condição de associação entre
irradiação e desnutrição é difícil de ser investigada em seres humanos por razões
5
éticas. Assim, o objetivo do presente estudo é investigar os efeitos terapêuticos e
profiláticos da glutamina sobre a mucosa intestinal em ratos adultos desnutridos
submetidos à radiação abdominal.
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REVISÃO DE LITERATURA
Câncer
As estimativas, incidência e mortalidade por câncer no Brasil, como
parte do sistema de vigilância do câncer, fornece um conjunto de informações que
permite
um
melhor
entendimento
do
cenário
brasileiro
(Ministério
da
Saúde/INCA2000).
Estimou-se que no ano de 2002 haveria 337.535 casos novos e
122.600 óbitos por câncer em todo o Brasil.
O principal tipo de câncer que
acometeria a população brasileira seria o de pele (tipo não melanócito), com
62.190 casos, seguido por 36.090 casos novos de neoplasia da mama feminina,
25.600 casos novos de próstata, 21.425 casos novos de neoplasia de pulmão e
20.420 casos de neoplasia maligna do estômago (Kligerman, 2002).
A análise da mortalidade, expressa como taxa bruta por 100.000
habitantes, mostrou que em 2002 a primeira causa de morte no sexo masculino foi
o câncer de pulmão (13), seguido do câncer de próstata (9,1), de esôfago (4,94) e
de cólon e reto (4,1). Por seu lado, o câncer de mama (10,3 ) manter-se-ia como a
primeira causa de morte por câncer entre as mulheres, seguido pelo câncer de
pulmão (5,3), de cólon e reto (4,6), do colo de útero (4,5) e do estômago (4,2).
Estes dados fornecem um conjunto de informações, que além de permitir o
entendimento do cenário brasileiro, fornece subsídios para o planejamento de
ações sob a ótica da prevenção e controle da doença (Kligerman, 2002).
O dogma atual em oncologia molecular está construído sobre a
premissa de que o câncer é
o resultado final de um acúmulo de alterações
genéticas, algumas das quais podem ser adquiridas e outras herdadas. Os genes
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que são alterados são aqueles envolvidos nos processos celulares normais e
fundamentais, como regulação, sinalização e
diferenciação do ciclo celular
Acredita-se que muitos agentes ambientais possam causar as referidas
anormalidades genéticas. Estes agentes incluem vírus, agentes químicos, fatores
dietéticos e radiações (Savage, 2000).
A regulação do ciclo celular é um equilíbrio entre os produtos dos
genes que induzem uma célula a replicar-se e outros produtos dos genes que
impedem sua replicação. Em muitos tipos de câncer ocorrem defeitos nesses
sistemas reguladores, fazendo com que as células sejam impelidas a uma
replicação descontrolada. Os genes que podem fazer com que as células em
repouso se dividam estão incluídos na classe de genes referidos como oncogenes,
enquanto que os genes que podem impedir a divisão celular são membros da
família dos genes supressores de tumor. O câncer freqüentemente resulta, em
parte, da ausência de atividade supressora de tumor ou de uma atividade
exacerbada dos oncogenes ou de ambas (Savage, 2000).
Embora o desenvolvimento do câncer seja caracterizado por
alterações no DNA e algumas destas mudanças possam ser hereditárias, essas
mutações herdadas não podem explicar as diferenças dramáticas nas taxas de
câncer observadas em todo o mundo. As variações significativas nas taxas de
câncer entre os diferentes países fornecem
uma evidência adicional da
importância dos fatores ambientais (Willet, 2000; Amorim et al, 2001).
Há fortes razões para suspeitar que fatores dietéticos e nutricionais
possam ser responsáveis por muitas destas variações observadas nas taxas de
câncer (Steinmtz e Potter, 1991; Ziegler et al, 1991). Os hábitos alimentares são
responsáveis por aproximadamente 35% de todos os canceres (Doll e Peto, 1981).
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Os carcinógenos presentes em alimentos específicos podem causar
dano direto ao DNA e fatores dietéticos podem bloquear a síntese endógena de
carcinógenos ou induzir enzimas envolvidas na ativação ou desativação de
substâncias carcinógenas exógenas (Willet, 1994). O dano oxidativo ao DNA é,
provavelmente, uma causa importante de mutações e pode ser potencialmente
aumentado por alguns fatores dietéticos, como a presença de gorduras
poliinsaturadas, ou reduzido por antioxidantes dietéticos e nutrientes que sejam cofatores de enzimas antioxidantes, como selênio e cobre (Willet, 2000Ferrari e
Torres, 2002).
As evidências indicam que ao longo da vida, o consumo excessivo de
energia e gordura em relação às necessidades aumenta o risco de câncer (Ferrari,
1998; Le Marchand et al, 1997). A
maior ingestão de vegetais e frutas foi
associada a menor risco de muitos tipos de câncer (Goodman, 1997; Weisburger,
2000).
Ainda há muitas questões a serem elucidados, e faz-se necessário
maiores estudos epidemiológicos nacionais e regionais para apontar o caminho a
ser seguido, no sentido de melhor conhecer a realidade da incidência e mortalidade
por câncer (Ferrari e Torres, 2002).
Tratamento Radioterápico
A escolha da terapêutica do câncer depende basicamente do tipo e do
estadiamento do tumor. Existem três principais modalidades de terapêuticas para
o câncer: a cirurgia, a quimioterapia e a radioterapia (Simone, 1997). A cirurgia
oncológica consiste na remoção curativa ou paliativa do tumor através de
ressecções ampliadas e este tratamento é considerado preferencial para grande
parte dos tumores sólidos (Cameron, 1994). A quimioterapia (QT) foi o primeiro
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tratamento sistêmico para qualquer câncer e consiste na administração de drogas
via venosa ou oral com objetivo de causar morte tumoral (Mclauglin, 1994).
A radioterapia (RT) tem sido usada na terapia do câncer desde 1896 e
recentemente apresenta um importante papel no tratamento de alguns tipos de
câncer. Embora a radioterapia signifique terapia por rádio, na realidade, é o termo
que designa vasta especialidade que utiliza diversos tipos de radiação ionizantes
(neutrons, prótons e partículas alfa) principalmente no tratamento de
lesões
malignas (Oliveira et al, 1994). Estas radiações ionizantes especializadas têm o
objetivo de causar dano ao DNA e conseqüente morte celular (Poen et al, 1994).
Este tratamento apresenta boa indicação para tumores que não possam ser
ressecáveis. A dose de radiação é baseada numa estimativa da dose absorvida
pelo tumor, medida em unidades equivalentes denominadas centigrays (cGy) ou
rads (Simone, 1997).
As radiações convencionais exercem o seu maior efeito ao nível de
DNA determinando alterações químicas em sua molécula de forma direta ou
indireta. No efeito direto, a radiação atinge a molécula de DNA causando alteração
química e ruptura da cadeia. No efeito indireto, há uma interação dos elétrons com
a água celular e induz a formação de radical hidroxila. Outros radicais também são
gerados, porém, o radical hidroxila é o principal componente do efeito radioativo
devido a abundante quantidade de água presente nas células. Os radicais livres
são altamente reagentes, e se combinam quimicamente com o DNA para
determinar a ruptura dupla ou simples de sua cadeia (Nguyen et al, 2002). O
mecanismo indireto é responsável por mais de 90% do efeito da radiação, ambos
tornam as células incapazes de se reproduzirem. A célula estéril pela radiação
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pode parecer histologicamente normal e fisiologicamente ativa, porém incapaz de
reproduzir-se (Filho e Ferreira, 1991).
A radiosensibilidade celular depende da fase do ciclo celular. As
células ficam mais vulneráveis ao efeito letal da radiação durante a fase G2 e fase
M. Consequentemente, tecidos de proliferação rápida, como as células das criptas
do intestino delgado são particularmente sensíveis a radiação. Elas sofrem
apoptose e são desprendidas das vilosidades intestinais. Um dos efeitos agudos da
enterite por radiação, como a diarréia, ocorre nesta fase (Nguyen et al, 2002).
Existem dois métodos de administração de radiação: teleterapia e
braquiterapia. A teleterapia utiliza uma fonte radiação externa com ação na área do
tumor, em contraste, a braquiterapia utiliza uma fonte de radiação diretamente no
tumor, é freqüentemente combinada com a teleterapia e promove um reforço da
dose no tumor (Poen et al, 1994; Oliveira et al, 1999).
O tempo de resposta clínica em qualquer tecido normal ou maligno é
determinado pela taxa de turnover do tecido. Tecidos de rápida replicação e o
tumor geralmente exibem perdas celulares em dias ou semanas. A probabilidade
de controle do tumor está diretamente relacionada à dose de radiação e
inversamente proporcional ao número de células tumorais. O maior fator limitante
da dose de radiação é a tolerância de tecidos normais ao volume irradiado (Poen et
al, 1994).
A radioterapia apresenta um importante papel no tratamento de
tumores pélvicos e abdominais como: tumores ginecológicos, de próstata,
gastrointestinais, linfomas e outros (Shwartzman, 1980). A dose usual de radiação
pode variar de 4000 a 6000 cGy. (Lima et al, 1999), sendo tóxica para as células
tumorais
e
também
para
células
sadias
localizadas
na
área
irradiada.
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Recentemente a combinação com a QT têm sido empregada no tratamento de
tumores pélvicos e abdominais com objetivo de aumentar a taxa de cura e
sobrevida (Keys et al, 1999).
As complicações causadas pela radioterapia vêm sendo estudadas
desde a década de 70, quando iniciou a utilização de maiores doses de radiação
(Donaldson,1977). Essas complicações continuam sendo um fator complicador e
limitador da terapêutica, uma vez que os sintomas adversos podem ser motivo de
interrupção do tratamento (Scolapio, et al, 2001). Pacientes submetidos a
tratamento radioterápico de tumores em região cervical, abdominal e pélvica
apresentam maior incidência de alterações que dificultam ingestão alimentar
adequada, sendo necessário implementação de terapia nutricional especializada
(Dias et al, 1996; Amdur et al, 1990). Em aproximadamente 20% dos pacientes
submetidos a radioterapia pélvica, a diarréia severa leva a uma interrupção do
tratamento planejado e pode reduzir a chance de cura da doença (Fyles et al,
1992).
A severidade e extensão dos efeitos induzidos pela radioterapia
dependem do local do tumor, duração do tratamento e da dose empregada.
Durante o curso da radioterapia abdominal e pélvica desordens gastrointestinais e
conseqüente perda de peso são quase inevitáveis (Capra et al , 2000). O íleo
terminal, cólon sigmóide e reto são os locais que mais freqüentemente apresentam
danos causados pela radioterapia pélvica, enquanto que o jejuno e íleo proximal
raramente estão envolvidos (Maza et al, 2001).
Enterite Induzida por Radiação
A enterite induzida pela RT, também conhecida por enterite actínica, é
uma desordem da função intestinal resultante do tratamento radioterápico de
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tumores pélvicos e abdominais (Yeoh e Horowitz, 1987). A enterite por radiação
pode ocorrer de 1 mês a 20 anos após a radiação (Hadad et al, 1983). Esta doença
é caracterizada por diarréia, dor abdominal, má absorção de nutrientes, estenose
intestinal, fístula e sangramento. Quando estes sintomas ocorrem durante ou até 6
meses pós tratamento radioterápico chama-se de enterite aguda e quando ocorre 6
meses após o término do tratamento denomina-se enterite crônica (Cosnes et al,
1988; Maza et al, 2001). Alguns fatores podem predispor ao desenvolvimento da
enterite induzida por radioterapia como: combinação entre radioterapia externa e
interna, tratamento concomitante de RT e QT, doença inflamatória intestinal prévia
e cirurgia abdominal prévia (Regimbeau, 2001).
A incidência das lesões induzidas pela RT varia entre 0,5 a 15% para
as lesões crônicas e 40 a 75% para as lesões agudas entre pacientes irradiados
(Yeoh et al, 1993; Cosnes et al, 1985). A enterite aguda é autolimitada e apresenta
sintomas leves, já a enterite crônica é menos freqüente, porém apresenta maior
gravidade devido a presença de complicações severas e letais. A enterite crônica
apresenta gravidade particular necessitando por vezes de tratamento cirúrgico ou
nutrição parenteral prolongada (Craighead & Young, 1998; Beer et al, 1985).
A patogênese da enterite induzida por radiação é complexa e pouco
compreendida. A enterite aguda está diretamente relacionada à destruição das
células da mucosa intestinal, apoptose da cripta intestinal, encurtamento das
vilosidades, atrofia e infiltração da lâmina própria com células plasmáticas e
leucócitos, estes danos podem ser responsáveis pela má-absorção e diarréia, além
destes sintomas também pode ocorrer dor abdominal, anorexia, náuseas, vômitos
e depleção da massa livre de gordura (Maza et al, 2001; Beer et al, 1985).
13
Progressos recentes na biologia molecular têm proporcionado maior
entendimento sobre a patogênese da enterite por radiação. Segundo Nguyen, et al
(2002) a produção de radicais livres causa hiperestimulação do fator de
crescimento transformador β1 (TGF-β1) que leva a fibrose aumentada e
conseqüente falência do órgão.
A enterite crônica é causada por alterações vasculares (endardite
obliterativa de pequenos vasos), fibrose da submucosa e dilatação linfática.
Histologicamente, é caracterizada pelo progressivo depósito de colágeno difuso e
vasculite oclusiva, que resulta no estreitamento da luz intestinal. A injúria do tecido
conectivo e endotelial na parede intestinal pode permanecer subclínica por muitos
anos e estas lesões iniciais podem levar a isquemia progressiva da parede
intestinal (Nguyen et al, 2002; Yeoh e Horowitz, 1987). Os sintomas mais comuns
são obstrução intestinal, fístulas, sangramentos, diarréia e perda de peso. O risco
para enterite crônica está relacionado com a severidade da enterite aguda, mas a
ausência da enterite aguda certamente não exclui o desenvolvimento da enterite
crônica (Craighead and Young, 1998). Tanto os comprometimentos da mucosa
intestinal agudos quanto os crônicos estão associados com má-absorção de
lactose e sacarose, diarréia, esteatorréia, intolerância à lactose e supercrescimento
bacteriano (Beer et al, 1985).
A perda de peso e a
desnutrição progressiva são freqüentes em
pacientes com enterite actínica crônica e quanto mais grave a desnutrição pior a
resposta ao tratamento da enterite (Capra et al, 2001). O comprometimento do
estado nutricional parece estar relacionado com a presença de dor e obstrução do
trato gastrointestinal, provavelmente por estes fatores interferirem na ingestão oral
(Cosnes et al, 1988).
14
Aproximadamente um terço (1/3) dos pacientes com enterite crônica
induzida por radioterapia necessitam de tratamento cirúrgico, porém
as
complicações pós-operatórias são freqüentes e a reoperação é necessária em
aproximadamente 40% dos pacientes (Regimbeau et al., 2001) .
A enterite actínica é uma causa freqüente de falência intestinal e
consequentemente requer indicação de nutrição parenteral total (NPT). Um quarto
dos pacientes que recebem nutrição parenteral domiciliar por falência intestinal
apresentam o diagnóstico de enterite actínica (Wolf et al, 1983). A nutrição
parenteral é considerada como uma terapia alternativa ao tratamento cirúrgico,
além de ser benéfica no período pré e pós-operatório do tratamento da enterite
(Scolapio et al, 2002; Pezner e Archambeau, 1985).
Segundo Beer et al (1985) a eficácia de uma dieta com baixo teor de
gordura, baixo resíduo e sem lactose pode ser eficaz no controle dos sintomas da
enterite em seres humanos. Suplementos orais do tipo elementar, fórmulas para
nutrição enteral contendo nutrientes hidrolizados, são bem tolerados quando
ingeridos no curso da RT pélvica e causam menos diarréia, mesmo após o término
da RT. Pacientes que receberam suplementos orais elementares apresentaram
ausência de enterite no período de um ano de seguimento, sugerindo que a
redução do grau de enterite aguda pode influenciar o aparecimento da enterite
crônica (Craighead and Young, 1998; Penzer and Archambeau, 1985).
Tem sido demonstrado que a suplementação de glutamina durante o
período pré e pós radioterapia abdominal, parece prevenir lesões , acelerar a
cicatrização do intestino irradiado e diminuir as complicações da enteropatia
provocada pela radioterapia (Souba et al, 1990).
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Glutamina
A glutamina é um aminoácido neutro e gliconeogênico podendo ser
sintetizado por todos os tecidos. O principal local de síntese é o músculo
esquelético, onde é liberada de acordo com as necessidades para utilização
corporal (Curi, 2000). No músculo esquelético a glutamina representa mais de 60%
do total de aminoácidos (Savy, 1997). A glutamina representa cerca de 20% do
total de todos os aminoácidos livres do plasma com concentrações que variam de
0,5 a 0,9 mM. É considerado um aminoácido não essencial, porém pode tornar-se
indispensável em situações especiais catabólicas como trauma, septicemia e
câncer (Gianotti et al, 1995, Ziegler, 1996). Desta forma quando a demanda é
maior que a produção estabelece-se um quadro de deficiência de glutamina, e por
esta razão este aminoácido foi recentemente reclassificado como condicionalmente
essencial (Curi, 2000).
Em 1965, foi demonstrado que porções intestinais incubadas com
glutamina produzem grandes quantidades de CO2, provenientes desta (Neptune,
1965). Tendo sido demonstrado nas décadas de 1970 e 1980, que o intestino
delgado é o sítio mais importante de metabolização da glutamina (Windmueller,
1975; Souba et al, 1990b).
Eagle (1955) demonstrou que a glutamina é importante para o
crescimento e manutenção de células em cultura. Posteriormente este mesmo
autor demonstrou que este aminoácido é precursor de nucleotídeos, participando
como doador de átomos de nitrogênio durante a síntese de purinas, pirimidinas e
aminoaçúcares, além de ser substrato energético para proliferação celular .
Nos rins, a glutamina participa do controle ácido-básico como o mais
importante substrato para a amoniogênese e no fígado pode servir como substrato
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gliconeogênico (Curi, 2000). Este aminoácido
é um importante substrato
energético para células de replicação rápida, como as da mucosa intestinal,
fibroblastos, linfócitos e outros (Curi, 2000; Klimberg, 1990; Ardawi, 1988).
A glutamina sintetase é uma enzima chave na regulação do
metabolismo do nitrogênio, ela catalisa a conversão de glutamato em glutamina,
usando amônio como fonte de nitrogênio (Calleone et al, 2000), conforme
demonstrado no esquema abaixo:
Glutamato + NH3 + ATP
Glutamina + ADP + P
A hidrólise da glutamina é o primeiro passo na sua utilização. A
glutaminase é a enzima que catalisa a hidrólise de glutamina em glutamato e íon
amônio. A partir da geração do glutamato por esta reação, outras reações podem
ocorrer , principalmente na via que permite que a glutamina seja consumida pelo
ciclo do ácido tricarboxílico. Nestes casos, a reação catalisada pela glutaminase
limita o fluxo pela via glutaminolítica, de modo que há uma correlação entre a
presença de glutaminase e a utilização de glutamina por certo tipo celular
(Pompéia, 2000).
Glutamina
+ H2O
→ glutamato +
NH4
A Glutaminase é modulada por diversos agentes , que atuam na sua
transcrição. Alguns estudos, no
tecido gastrointestinal, evidenciam modulação
positiva por glicocorticóides, indução da diarréia, nutrição enteral , aminoácidos de
cadeia ramificada e alanil glutamina (Sarantos, 1992; Haque et al, 1996), e
modulação negativa por insulina, estados de jejum e desnutrição (Ardawi e
Majzoub, 1988; Ardawi, 1987). A glutaminase é inibida pós-traducionalmente por
glutamato, seu produto, que pode se ligar ao mesmo sítio da glutamina. O íon
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amônio inibe esta enzima, o que significa que o metabolismo seja modulado por
um mecanismo de retroalimentação negativa (Pompéia, 2000).
Ao longo no trato gastrointestinal existe uma alta concentração de
glutaminase, esta apresenta maior atividade no intestino delgado, que consome
84% da glutamina intestinal (James, 1998). Parece que a glutamina não atravessa
a mucosa intestinal para a circulação, praticamente toda glutamina é consumida
pelos enterócitos (Windemueller, 1982)
O trato gastrintestinal é o principal órgão de utilização da glutamina e
a sua captação ocorre fundamentalmente pelas células epiteliais dos vilos do
intestino delgado (luz intestinal) assim como da corrente sangüínea (Savy, 1887). A
glutamina é convertida em glutamato na mitocôndria das células intestinais, em
seguida em alfa cetoglutarato, que é utilizado pelo ciclo de Krebs para produção de
ATP (Miller, 1999 )
O intestino delgado é revestido por uma camada de epitélio prismático
simples aderido a uma lâmina própria de tecido conjuntivo frouxo, sendo este
conjunto denominado de mucosa intestinal. Essa camada constitui uma superfície
limitante entre o organismo e o meio externo, impedindo a entrada de diversos
antígenos alimentares e microrganismos. O revestimento intestinal é caracterizado
por invaginações (criptas) e evaginações (vilosidades), as vilosidades aumentam a
área absortiva (Miller, 1999). O enterócito é o tipo celular predominante,
constituindo 80% da população da mucosa. Também são observados linfócitos
intraepiteliais, principalmente linfócitos do tipo T, que estão em íntima associação
com as células epiteliais (Poussier e Julius, 1994).
Os enterócitos são células de proliferação rápida, com ciclo celular de
aproximadamente onze horas, em ratos. Na cripta intestinal alojam-se as células
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progenitoras relacionadas à rápida e intermitente renovação celular. Os enterócitos
diferenciam-se durante o processo de migração que se inicia na cripta e termina no
topo das vilosidades (Palanch, 2000 ).
A alta taxa de proliferação e turnover é geralmente regulada pela
disponibilidade de nutrientes, gastrina, hormônio de crescimento, flora bacteriana e
atividade neuro-regulatórias. A presença de alimento passando no trato
gastrointestinal parece ser o estímulo primário na regulação da resposta
proliferativa (Wilmore, 1997).
A glutamina apresenta importante papel na integridade da mucosa
intestinal. Atrofia da mucosa ocorre freqüentemente em pacientes recebendo NPT
e adição deste aminoácido na solução de NPT reverte esta atrofia (O’Dwyer et al.,
1989). Uma potencial conseqüência da permeabilidade intestinal aumentada é a
translocação bacteriana, que consiste na passagem de bactérias, fungos e suas
toxinas através da mucosa para a corrente sangüínea e reage com o sistema
retículo-endotelial. Citocinas produzidas por esta reação estimula o eixo
hipotálamo-pituitária-adrenal, resultando na liberação de cortisol pelas adrenais. O
cortisol aumenta a atividade da glutaminase nos enterócitos, estimulando sua
quebra e utilização pelo intestino delgado. Este hormônio também causa aumento
da proteólise em outros tecidos e libera glutamina a partir do músculo esquelético.
Esta resposta adaptativa auxilia na cicatrização dos danos da mucosa, porém o
estresse prolongado pode depletar o estoque de glutamina muscular e
consequentemente privar o enterócito de seu vital aporte de glutamina (Miller,
1999).
Estudos demonstram que animais com permeabilidade intestinal
aumentada recebendo suplementação de glutamina apresentam melhora na função
19
da barreira mucosa, atividade imunológica do intestino e redução da translocação
bacteriana (Chun et al., 1997; Foitzik et al, 1997).
Glutamina e Enterite Induzida por Radiação
As complicações intestinais causadas pela radioterapia pélvica
ocorrem principalmente por lesões vasculares, estenoses e necroses das alças
intestinais (Klimberg & Mc Clellan, 1996). Estas alterações seriam provocadas pela
deficiência de glutation intracelular, ocasionado pelo decréscimo importante dos
níveis de glutamina (Souba et al, 1985). O glutamato é precursor da síntese de
glutation, que é um potente antioxidante de defesa intracelular (Newsholme et al,
2003).
Alguns estudos experimentais
indicam que a suplementação de
glutamina melhora a resposta intestinal de adaptação a irradiação abdominal.
Ratos
recebendo
dieta
enriquecida
com
glutamina
antes
da
irradiação
apresentaram significativo aumento no número e na altura das vilosidades,
aumento no número de mitoses por cripta, manutenção da barreira mucosa
intestinal e redução da translocação bacteriana, indicando portanto que a glutamina
apresenta um efeito protetor preventivo da mucosa intestinal (Klimberg,1990;
Campos et al, 1996; Chun et al, 1997).
Em um estudo experimental recente, com ratos recebendo dieta rica
em glutamina antes e após a radiação, foi demonstrado que este nutriente
promoveu efeito protetor sobre a mucosa intestinal no período pós-radiação. Os
benefícios foram a aceleração da cicatrização e prevenção da translocação
bacteriana assim como diminuição da perda de peso. Entretanto a administração
conjunta, pré e pós-radiação, não promove efeito superior quando comparados a
20
administração pós-radiação somente, demonstrando assim também a importância
da glutamina como efeito terapêutico (Ersin et al, 2000).
Em outros estudos experimentais, utilizando metodologias diferentes,
não foi demonstrado o efeito protetor da glutamina sobre a mucosa intestinal
irradiada (Scott e Moellman, 1992; Carrol et al, 1994). Tanto a suplementação, via
NPT, durante 5 dias pós-radioterapia (Scott e Moellman, 1992) quanto a
suplementação via oral, durante 7 dias pré e 7 dias pós-radioterapia abdominal
(Carrol et al ; 1994) não resultaram em efeito benéfico da glutamina.
Bozzeti (1997) demonstrou que a suplementação com glutamina não
proporcionou efeito significativo na resposta ao tumor e/ou nos efeitos adversos da
quimioterapia. Por outro lado, Santoso et al (1998) avaliaram o efeito da glutamina
na taxa de crescimento tumoral e na radiossensibilidade de células tumorais, in
vitro, e demonstraram que células tumorais que requerem um mínimo de glutamina
e concentrações suprafisiológicas não aumentaram o crescimento tumoral ou a
radioresistência. Portanto, a glutamina pode ser avaliada como um potencial
protetor intestinal.
Apesar das controvérsias sobre os efeitos da glutamina, existem um
número maior de estudos mostrando uma forte evidência em relação ao seu efeito
protetor da mucosa intestinal em animais submetidos à radioterapia abdominal,
determinando necessidade constante de estudos com objetivo de elucidar
mecanismos explicativos e aproximar modelos experimentais à situações clínicas,
como a desnutrição e radioterapia.
Câncer e Desnutrição
O Ibranutri (Inquérito Brasileiro de Avaliação e Nutricional Hospitalar
(1996) analisou 4.000 doentes e encontrou uma taxa de 48,1% de desnutrição nos
21
pacientes internados nos hospitais públicos brasileiros e esta desnutrição progride
a medida em que aumenta o período de internação. Foi demonstrado que
pacientes com câncer apresentavam 3,6 vezes mais chance de apresentar
desnutrição do que pacientes com outras doenças (Waitzberg et al, 1999).
Pacientes com câncer apresentam alta incidência de desnutrição e
mais de 66% deles apresentam inanição durante o curso da doença causado por
diferentes fatores inerentes a doença, incluindo anorexia, distúrbios metabólicos,
fatores mecânicos, ou toxicidade do tratamento capazes de causar má-absorção e
disfagia (Nitenberg e Raynard, 2000).
A desnutrição é o diagnóstico secundário mais comum nos pacientes
com câncer e pode ser um indicador prognóstico ruim para resposta ao tratamento
anti-neoplásico e menor tempo de sobrevivência (Wilson, 2000).
A etiologia da desnutrição em pacientes com câncer é multifatorial e
estas causas podem ser agrupadas em 3 categorias, ingestão alimentar reduzida;
alterações metabólicas e resposta inflamatória e humoral (Nitenberg & Raynard,
2000; Capra et al, 2001).
A perda do apetite ou anorexia é o fator mais freqüente e mais
importante na deterioração nutricional entre os pacientes com câncer e resulta de
mecanismos
psicopatológicos.
Alterações
no
olfato
e
paladar
têm
sido
correlacionadas com diminuição da ingestão alimentar. Redução no tempo da
digestão leva possivelmente à saciedade precoce. Disfagia e odinofagia ocorrem
freqüentemente em pacientes com tumor de cabeça e pescoço e esôfago. Tumores
de TGI levam a obstrução total ou parcial, vômitos e saciedade precoce (Nitenberg
& Raynard, 2000).
22
Outros fatores anoréticos têm sido relacionados com a redução da
ingestão, tais como hiporesponsividade a insulina, aumento do lactato circulante
secundário ao metabolismo anaeróbio, aumento nos níveis de ácidos graxos livres,
aminoácidos, citocinas e serotonina (Puccio, 1997) .
Tratamentos anti-neoplásicos, como QT e RT também podem ser
uma das principais causas de desnutrição. A QT pode causar náuseas, vômitos ,
dor abdominal, mucosite e má-absorção. Agentes antineoplásicos como fluoracil,
adrimicina, metrotexate e cisplatina podem induzir a complicações gastrointestinais
severas. Ambos os tratamentos são responsáveis por lesões erosivas em vários
locais do tubo digestivo, como ulceração na língua, mucosite e esofagite que
marcadamente impedem a ingestão alimentar (Capra et al, 2001).
Uma variedade de desordens associadas ao câncer afetam tanto o
gasto energético quanto o metabolismo de proteínas, carboidratos e lipídeos. A
perda protéica de massa magra e visceral é característica no paciente com
caquexia, esta depleção pode estar associada com menor sobrevivência (Nixon et
al, 1980). O local de maior perda protéica é a musculatura esquelética. A taxa de
síntese protéica reduzida e o aumento da degradação tem sido observados em
biópsias musculares de pacientes com câncer e perda de peso (Lundholm et al,
1976). O TNF-α parece estar envolvido com o aumento da degradação protéica,
entretanto não parece estar relacionado com a perda de peso (Llova et al, 1993).
Um outro mediador recentemente descoberto é o fator mobilizador de proteína
(PMF), a administração deste em ratos sem tumor induziu um estado de caquexia e
perda de peso sem afetar a ingestão alimentar e hídrica (Todorov, 1996).
Intolerância à glicose e resistência periférica à insulínica têm sido
caracterizadas em pacientes com câncer e perda de peso. O alto turnover de
23
glicose pode ser devido, em parte,
pela aumento do ciclo de Cori, que está
envolvido no metabolismo periférico de glicose a lactato pelas células tumorais
(Albrecht e Todd, 1996).
Aumento na mobilização de lipídeo periférico e oxidação excessiva de
ácidos graxos são muito freqüentes em pacientes com câncer (Nitenberg &
Raynard, 2000). Uma observação comum em pacientes com câncer e perda de
peso é a hiperlipidemia. Esta pode ser causada pela redução da atividade da lipase
lipoprotéica (Albrecht e Todd, 1996).
Glutamina no Jejum e estresse
Durante o jejum ocorrem ajustes fisiológicos com finalidade de manter
a glicemia e o aporte adequado de nutrientes para todo o organismo. Existe um
aumento da proteólise muscular e possivelmente pulmonar , liberando desta forma
aminoácidos, que por desaminação e transaminação, fornecem nitrogênio para
que seja incorporado em oxoglutarato e glutamato, formando glutamina. A
glutamina serve como um sistema carreador de amômio até o fígado, para
formação de uréia e ao rim para formação de sais de amônio (Ardawi, 1990). Além
disso o esqueleto de carbono resultante da desaminação é utilizado para síntese
de glicose a partir da gliconeogênese (Newsholme et al, 1989).
Quando instala-se uma infecção no organismo, ocorre ativação da
função imunológica, causando elevação no consumo de glutamina pelas células do
sistema imunológico, isso leva a maior produção da glutamina pelo músculo
esquelético, sem reduzir significativamente a sua oferta para outros tecidos (Souba
e Austgen, 1990).
A glutamina apresenta efeito positivo no balanço de nitrogênio
corporal e no metabolismo protéico, porém poucos estudos demonstram os efeitos
24
da glutamina sobre o ganho de peso corporal (Curi, 2000). Ratos submetidos à
jejum de 3 dias, e conseqüente perda de peso de 14,6%, apresentaram menores
níveis de glutamina muscular e menor conteúdo protéico na mucosa intestinal.
Além disso, a realimentação por 3 dias não foi capaz de normalizar estes níveis
(Boza et al, 1999).
Tannuri et al. (2000) estudaram a regeneração da mucosa intestinal,
utilizando um modelo de desnutrição em ratos em fase de crescimento (21 dias de
idade) com objetivo de determinar se a glutamina exercia efeito trófico sobre a
mucosa intestinal, e demonstraram que a ração enriquecida com glutamina,
administrada por 15 dias, promoveu significativo ganho do peso e trofismo da
mucosa jejunal em comparação ao grupo controle.
Como
citado
anteriormente,
poucos
estudos
associam
a
suplementação com a glutamina com recuperação do estado nutricional. Assim, no
presente estudo avaliaremos o efeito da suplementação de glutamina antes e após
a radiação sobre o estado nutricional de ratos adultos previamente desnutridos.
25
OBJETIVOS
Geral:
-
Avaliar os efeitos profilático e terapêutico da suplementação com glutamina
sobre a mucosa intestinal em ratos adultos desnutridos submetidos à
radiação.
Específicos:
-
Investigar o efeito da desnutrição sobre o conteúdo protéico e estrutura da
mucosa intestinal de ratos adultos submetidos à radiação;
-
Avaliar o efeito da suplementação de glutamina antes e após a radiação sobre
o conteúdo protéico e estrutura da
mucosa intestinal em ratos adultos
desnutridos;
-
Avaliar o efeito da suplementação de glutamina antes e após a radiação sobre
o estado nutricional de ratos adultos previamente desnutridos.
26
MATERIAL E MÉTODOS
Animais e Dieta
Foram estudados 45 ratos Wistar adultos machos obtidos no Biotério
do laboratório de Fisiologia Endócrina/IBRAG/UERJ, mantidos a uma temperatura
de 23ºC, com umidade relativa de 40-60% e com ciclo de luminosidade de 12 horas
(claro e escuro). Inicialmente todos os animais foram mantidos com dieta normal
(ração comercial Nuvilab - Nuvital Nutrientes Ltda, com 23% de proteína) até 4
meses de idade e peso médio de 335,5±32,5g, quando então foram divididos nos
seguintes grupos de tratamento e mantidos com tratamento dietético específico por
21 dias:
-
Grupo Controle (C): dieta normal (ração comercial com 23% de
proteína) e água ad libitum.
-
Grupo Restrição Protéica (RP): dieta hipoprotéica (ração com 8%
de proteína) e água ad libitum.
-
Grupo Restrição Calórica (RC): dieta normal (ração comercial com
23% de proteína), porém com quantidades reduzidas em 60% da ingestão habitual
e água ad libitum.
A dieta hipoprotéica foi preparada no Laboratório de Fisiologia
Endócrina e sua composição está apresentada na tabela 1.
A fonte protéica da dieta hipoprotéica foi extrato vegetal de soja e
farelo de trigo provenientes da ração comercial macerada (Nuvilab – Nuvital
Nutrientes Ltda) e as calorias foram compensadas pela adição de amido de milho
para a obtenção de uma dieta hipoprotéica e isocalórica. As misturas de sais e
vitaminas foram formuladas de acordo com as recomendações do American
27
Institute of Nutrition Rodents Diets, AIN-93G (1993), nas mesmas quantidades da
dieta controle.
Tabela 1- Composição das Dietas utilizadas no grupos controle e experimental.
Contole
Hipoprotéica
Proteína
230.0
80.0
Carboidrato
676.0
826.0
Lipídeo
50.0
50.0
Mistura de vitaminas
4.0
4.0
Misturas de Minerais
40
40
Energia Total - kcal
4070.4
4070.4
Proteína %
23.0
8.0
Carboidrato %
66.0
81.0
Lipídios %
11.0
11.0
Ingredientes - g
Análise:
* De acordo com as recomendações do American Institute of Nutrition Rodents Diets,
AIN-93G (1993)
Com a finalidade de reproduzir experimentalmente o suporte
nutricional, aos quais os pacientes desnutridos são submetidos antes da RT, após
os 21 dias de restrição (protéica e calórica) os animais foram mantidos com ração
normal ad libitum e juntamente com o grupo controle foram divididos nos seguintes
grupos:
1 - CCGlutA, RPGlutA ou RCGlutA: recebendo suplementação oral
de L-Glutamina (Resource glutamin ®, Novartis, SP, BR) na dose de 125 mg/100g
de peso corporal, por 5 dias antes da RT.
2 - CGlic, RPGlic ou RCGlic recebendo suplementação oral de glicina
(Glycina ® Sygma, MO, EUA) no período pré RT.
A dose de glutamina foi determinada através de dados de estudos em
animais que utilizaram 1,0 a 1,5 mg/100g de peso corporal (Okabe, et al, 1976;
28
Klimberg et al, 1992). Nossa dose administrada também estão de acordo com uma
outra recomendação em que este aminoácido corresponde a 2% do conteúdo
calórico da ração (Campos et al, 1996; Chun et al, 1997).
Foi preparada solução aquosa de aminoácido na concentração 20% e
administrada via oral em bolus, com auxílio de seringa, uma vez ao dia.
A glicina, que é um aminoácido alifático e não essencial, foi utilizada
nos grupos que não receberam glutamina apenas para manter o mesmo aporte de
aminoácido entre os grupos. Alguns trabalhos que estudaram o efeito da glutamina
relatam que utilizaram a glicina como aminoácido controle (Yeh et al, 2001;
Klimberg et al, 1990). Isso permite comparações com o presente estudo. A glicina
seguramente não apresenta as mesmas funções da glutamina, não está envolvida
no metabolismo intestinal deste aminoácido e diferente de alguns aminoácidos não
é um precursor do glutamato, transaminação reversível do glutamato (Santos et al,
1997).
Após radioterapia os grupos CGlutA, RPGlutA ou RCGlutA foram
subdivididos em:
1
-
CGlutA+GlicP,
RPGlutA+GlicP
e
RC
GlutA+GlicP:
que
corresponde aos animais que receberam glutamina antes da RT e glicina após a
RT;
2 - CGlutAP, RPGlutAP e RCGlutAP que corresponde aos animais
que receberam glutamina antes e após RT. O esquema a seguir resume o desenho
experimental utilizado.
29
FIGURA 2 - MODELO EXPERIMENTAL
Desnutrição 21
dias
Pré RT- 5 dias
C Glic
n: 5
C
n: 15
RT
Pós RT - 5 dias
C Glic
n: 5
C GlutA+GlicP
n: 5
C Glut A
n: 10
C GlutAP
n: 5
RP Glic
n: 5
RP
n: 15
RP Glut A
n: 10
RP Glic
n: 5
RP GlutA+GlicP
n: 5
RP Glut AP
n: 5
RC
n: 15
RC Glic n:
5
RC Glut A
n: 10
RC Glic
n: 5
RC GlutA+GlicP
n:5
RC GlutAP
n: 5
30
Tratamento Radioterápico
Após 5 dias de suplementação de glutamina ou glicina, os grupos
casos e controles foram transportados para o serviço de radioterapia do INCA,
onde foram anestesiados com pentobarbital® na dose de 0,08ml/100g de peso
corporal e receberam dose única de 1000 cGy de radiação gama Cobalto-60
(Theraton 780C) no abdômen. O tórax, cabeça e extremidades estavam localizados
fora da área de irradiação. A radiação foi centralizada no abdômen, do processo
xifóide ao púbis.
A dose de 1000 cGy foi liberada para cada animal, utilizando a
técnica de par oposto, irradiando anterior-posterior e posterior-anterior, mantendo a
distância fonte eixo (SAD) de 80cm e campo médio de 6x13cm. Como rendimento
do equipamento era de 251,6 cGy por minuto o tempo para irradiação de cada
animal foi em torno de 4,28 minutos.
Procedimento do Estudo
No 6º dia após tratamento radioterápico os animais foram
anestesiados com pentobarbital (0,20ml/100g de peso corporal) para coleta de
sangue e laparotomia. As amostras de sangue foram obtidas por punção cardíaca
e rapidamente centrifugadas a 4°C, por 20 minutos, a 3000 rpm para obtenção do
soro.
Os animais foram submetidos a laparotomia para retirada de 6 cm de
jejuno a 10 cm após o piloro. Este segmento foi aberto longitudinalmente e lavado
com álcool comercial. Para fixação, o tecido foi imediatamente estendido em uma
placa contendo solução de formol tamponado a 10%. Após este corte do tecido
jejunal para avaliação histopatológica e estereológica, um segundo segmento de
31
5cm também foi retirado, lavado com solução salina e congelado a - 70 °C, para
posterior dosagem de proteínas totais.
Processamento Histológico
Após 24 horas de fixação em solução de formol tamponado, o tecido
foi clivado em 3 cortes verticais e 1 longitudinal, sendo posteriormente desidratado
em uma série de álcoois com diluições crescentes e xilol, e incluído em parafina.
Os cortes de jejuno foram incluídos em posição longitudinal perpendicular ao plano
da microtomia.
De cada corte foram obtidos 3 cortes consecutivos, com a espessura
de 5μm, num total de 9 cortes por animal. Em seguida foram corados em HE
(hematoxilina e eosina) e montados entre lâmina e lamínula, com resina sintética.
Avaliação Histopatológica
A avaliação histopatológica foi realizada cegamente por um
patologista com objetivo de diagnosticar a enterite aguda induzida pela RT e
identificar as alterações de mucosa intestinal características desta patologia. A
análise das lâminas foram realizadas com aumento de 400 e somente para
avaliação da relação vilosidade cripta (RVC) foi utilizado um aumento 100 . Os
dados foram fornecidos na forma de laudo subjetivo para cada animal. Os
parâmetros avaliados para diagnóstico da enterite foram, grau do processo
inflamatório, atipia nuclear, apoptose nas células da cripta e distorção da
arquitetura nas vilosidades. Os índices de mucosa indicam a proliferação e
regeneração da mucosa intestinal, neste estudo utilizamos a RVC e número de
mitoses por cripta. O parâmetros de normalidade foi determinado através de dados
encontrados em ratos controles não irradiados de um estudo piloto. Abaixo seguem
a classificação dos índices regeneração e grau de inflamação da mucosa:
32
1 - Grau inflamatório da mucosa: este parâmetro foi avaliado como
sem inflamação, inflamação leve ou inflamação acentuada.
2 - RVC: esta relação foi classificada como normal (relação 3:1 ou
maior), diminuída (relação menor que 3:1).
3 - N° de mitoses por cripta: o número de mitoses por cripta foi
classificado como reduzido (n° menor que 5), normal (número de mitoses de 5-10)
e aumentado (número de mitoses maior que 10).
Estereologia
O objetivo da estereologia é determinar parâmetros quantitativos
tridimensionais de estruturas anatômicas a partir de cortes bidimensionais,
baseando-se na geometria e na estatística (Mandarim-de-Lacerda, 1995).
Os cortes histológicos verticais foram analisados através do sistema
óptico (microscópio óptico Nova 107). A lente objetiva foi acoplado a uma câmera
digital e as imagens obtidas foram transmitidas a um monitor de televisão. A
análise estereológica foi feita através de superposição de um sistema teste do tipo
ciclóide, que permite a contagem de pontos que tocam as vilosidades. Este sistema
teste apresentava 16 arcos, o comprimento de cada arco foi de 37,5μ e a linha
teste (Lt) de 600μ (calibração do sistema).
A densidade de superfície (área) das vilosidades (Sv) foi analizada
com aumento de 100. De cada corte vertical foram analisados 3 campos aleatórios,
totalizando 9 campos para cada animal. Este parâmetro é muito importante, pois
avalia a relação entre a área e o volume de estruturas morfológicas. Esta avaliação
permite discriminar alterações de tamanho das vilosidades.
Para determinação do Sv é necessário aplicar a fórmula abaixo:
33
Sv:
2I
L
Onde: I = número total de interseções, L = comprimento determinado
por um ponto teste.
Dosagem de Proteínas Totais
Processamento do tecido:
O tecido jejunal foi pesado e adicionada a este solução tampão
contendo fosfato (50 mmol/l) e sucrose (300mmol/l) na proporção 1 parte do tecido
para 10 partes da solução tampão (1/10). Para produção do homogenato foi
utilizado o homogeneizador Ultra Turrax e uma amostra de 150 µl foi separada
para a dosagem.
A concentração de proteína total do tecido
foi determinada pelo
método de Peterson (1977). A primeira fase deste método consiste na fase de
precipitação da proteína com DOC e TCA para remoção da maioria das
substâncias interferentes.
Amostras de homogenato foram diluídas com água destilada até o
volume total de 1.0 ml. Foram adicionados em cada tubo de ensaio 100μl de DOC
0,15% (Sigma, MO, USA) e 100μl de TCA 72% (Sigma, MO, USA), em seguida os
tubos foram agitados, mantidos em repouso por 10 min e centrifugados a 3000 rpm
por 40 min. O sobrenadante foi desprezado invertendo-se os tubos sobre papel de
filtro por 10 min. O precipitado foi ressuspenso em 1,0ml de água destilada e
agitado. Foi adicionado 1,0 ml de reativo A (CTC / SDS 10% / NaOH 3,2% / água
destilada na relação 1:1:1:1), agitado e mantido em repouso por 10 min a
temperatura ambiente (20°C). Foi então adicionado 0,5 ml de reativo B (reativo de
Folin) diluído em água destilada (1:5), agitado imediatamente em vórtex e mantido
em repouso por 30 min a temperatura ambiente (20°C).
34
A leitura da absorbância foi realizada em espectrofotômetro à 750nm.
Duas alíquotas de BSA, equivalentes a 10 e 100 mg de proteína foram utilizadas
como padrão. O cálculo das concentrações de proteína nas amostras foi feito a
partir da equação de Stauffer (1975), e os resultados expressos em mg/ml.
Avaliação do Estado Nutricional
Ingestão de ração: a ingestão foi monitorada diariamente em todos os
grupos experimentais, utilizando o método ingestão e resto. Para aferição desta
medida foi utilizada balança digital (Filizola).
Peso Corporal: O peso corporal foi monitorado de 2 em 2 dias no
período de restrição protéica e diariamente na período de suplementação de
glutamina. Para aferição desta medida foi utilizada balança digital (Filizola).
Dosagem de albumina sérica: A concentração sérica de albumina foi
determinada ao final do período de desnutrição através de método colorimétrico,
utilizando Kit comercial (Bioclin, Belo Horizonte, MG).
Análise Estatística
Os dados foram expressos como média ± erro padrão. Para análise
do estado nutricional as diferenças entre os grupos foram determinadas através de
teste-t não pareado de Student, no caso da diferença entre os tratamentos com
glutamina e glicina, e análise de variância univariada associada à teste de
comparação múltipla entre as médias, teste de Newman-Keuls, nos demais casos.
As diferenças do Sv entre os grupos foram testadas com o teste não paramétrico
de Mann-Whitney. O nível de significância de p < 0,05 foi aceito como
estatisticamente significante.
35
RESULTADOS
1 - Peso Corporal e Consumo Alimentar Durante o Período de Desnutrição
A evolução de peso corporal dos animais adultos durante os 21 dias
de desnutrição está mostrada no gráfico 1A. Os animais submetidos à restrição
calórica apresentaram menor peso corporal (14,7%, p< 0,01) em comparação aos
grupos C e RP. Esta diferença de perda de peso no grupo RC foi significativa a
partir do dia 7 de desnutrição e
permaneceu até o final do período. A RC
promoveu uma perda final de 7,25% (24,1g) do peso corporal em comparação ao
peso inicial. A RP não causou nenhuma alteração no peso corporal, no entanto
estes animais apresentaram menores concentrações (p<0,05) de albumina sérica,
como pode ser visto no gráfico 1C.
O
gráfico
1B
demonstra
que
o
consumo
alimentar
foi
significativamente menor (64%, p<0,01) no grupo RC. Este fato pode ter
determinado a perda de peso neste grupo. Não houve diferença no consumo
alimentar entre os grupos C e RP.
36
Peso corporal (g)
Evolução do Peso Corporal, Consumo da Ração Durante Período de 21 dias
de Desnutrição e Concentrações Séricas de Albumina
400
(A)
350
C
RP
RC
300
*p<0,05 vs C e •p<0,05 vs RP
250
0
5
10
15
20
25
(B)
Dias
consumo ração (g)
30
C
RP
RC
20
10
*p<0,05 vs C e • p<0,05 vsRP
0
0
5
10
15
20
25
dias
albumina sérica (g/dl)
(C)
6
5
4
*
3
2
1
0
C
RP
RC
Grupos
Gráfico 1: Evolução do Peso corporal (A), consumo da ração durante período de
21 dias de desnutrição (B) e Concentrações séricas de albumina (C) no d21 em
ratos adultos dos grupos controle (C), restrição protéica (RP) e restrição calórica
(RC). Grupo C- livre acesso à ração com 23% de proteína; Grupo RP - livre acesso
à ração com 8% de proteína; Grupo RC- acesso limitado à 60% da quantidade de
ração ingerida habitualmente, porém com 23% de proteína. Dados expressos como
média ± epm. Os dados experimentais foram obtidos utilizando 15 animais em cada
grupo. * p<0,05 vs C , • p<0,05 vs RP
37
2 - Peso Corporal e Consumo Alimentar no Período Pré-Radioterapia
O peso corporal dos animais no período de 5 dias pré radioterapia
recebendo ração normal (23% ptn) e suplementação de glutamina são mostrados
no gráfico 2. Durante este período os animais não apresentaram alteração
significativa no peso corporal entre os diferentes grupos experimentais. A análise
temporal mostra que somente os grupo RCGlutA e RCGlic apresentaram aumento
significativo de peso corporal (12% e 9,4%, respectivamente) quando comparado o
dia 5 ao dia 1 (p<0,01), porém insuficiente para alcançar os valores do grupo
controle.
Em relação ao consumo alimentar não houve diferença entre os
grupos recebendo glutamina ou glicina no período pré radioterapia, o gráfico 3
mostra estes resultados.
38
Evolução de Peso Corporal de Ratos Durante o Período Pré-Radioterapia
(A)
Peso corporal (g)
425
400
375
C Glic
350
C Glut A
325
300
0
1
2
3
4
5
6
Dias
Peso corporal (g)
425
(B)
400
375
RP Glic
RP Glut A
350
325
0
1
2
3
4
5
6
Dias
Peso corporal (g)
375
(C)
350
+
+
325
RC Glic
RC Glut A
300
275
0
1
2
3
4
5
6
Dias
Gráfico 2: Evolução de peso corporal de ratos durante o período pré radioterapia
(5 dias) nos grupos CGlic (Controle com glicina), CGlutA (Controle com glutamina
antes da RT) (A); Grupos RPGlic (restrição protéica com glicina), RPGlut A
(restrição protéica com glutamina antes da RT) (B); Grupos RCGlic (restrição
calórica com glicina), RCGlut A (restrição calórica com glutamina antes da RT) (C).
Dados expressos como média ± EPM. Os dados experimentais foram obtidos
utilizando 10 animais nos grupos Glut A e 5 animais nos grupos Glic. + p<0,05 vs
dia 1.
39
Consumo de Ração de Ratos Durante o Período Pré-Radioterapia
(A)
consumo ração (g)
25
C Glic
C Glut A
20
15
10
0
1
2
3
4
5
6
dias
(B)
Consumo ração (g)
20.0
17.5
RP Glic
15.0
RPCG
12.5
10.0
0
1
2
3
4
5
6
Dias
(C)
consumo ração (g)
40
RC Glic
RC Glut A
30
20
10
0
0
1
2
3
4
5
6
dias
Gráfico 3: Consumo de ração de ratos durante o período pré-radioterapia (5 dias)
nos grupos experimentais com livre acesso à ração com comercial com 23% ptn e
suplementação de glutamina. Grupos CGlic (Controle com glicina), CGlut A
(Controle com glutamina antes da RT) (A); Grupos RPGlic (restrição protéica com
glicina), RPGlut A (restrição protéica com glutamina antes da RT) (B); Grupos
RCGlic (restrição calórica com glicina), RCGlutA (restrição calórica com glutamina
antes da RT) (C). Dados expressos como média ± epm. Os dados experimentais
foram obtidos utilizando 10 animais nos grupos Glut A e 5 animais nos grupos Glic.
40
3 - Peso Corporal e Consumo Alimentar no Período Pós-Radioterapia
Os dados de peso corporal no período pós-radioterapia podem ser
vistos no gráfico 4. Com relação a evolução temporal do peso corporal pós
radioterapia, todos os grupos apresentaram perda de peso significativa
(aproximadamente 15,3%) quando comparado o dia 5 com o dia 1 pós RT. Os
grupos RPGlic e RPGlutA+GlicP também apresentaram perda de peso significativa
no dia 4 comparado ao dia 1. Já os animais RCGlut A+ GlicAP apresentaram perda
de peso significativa a partir do dia 3 em comparação ao dia 1, e os animais RC
Glic, RCGlut A+ GlicP e RCGlut AP no dia 4 em comparação ao dia 1.
O gráfico 5 monstra os dados do consumo alimentar dos animais após
a radioterapia. O grupo CGlutAP apresentou menor consumo de ração (p<0,05)
comparado ao grupo CGlic nos dias 2 e 5 pós RT. Nos grupos RPGlutA+GlicP e
RPGlutAP a ingestão foi significativamente maior (p<0,05) quando comparado aos
animais do grupo RPGlic. Já os grupos RCGlutA+GlicP e RCGlutAP não
apresentaram diferença significativa em comparação ao RCGlic.
41
Evolução de Peso Corporal de Ratos Durante o Período Pós Radioterapia
Peso corporal (g)
400
350
+
+
+
300
C Glic
C Glut A
+ Glic P
C Glut AP
250
200
0
1
2
3
4
5
6
Dias
Peso corporal (g)
450
400
350
+
+
RP Glic
+
+
+
300
RP Glut A
+ Glic P
RP Glut AP
250
0
1
2
400
Peso corporal (g)
3
4
5
6
Dias
350
RC Glic
RC Glut A
+ Glic P
+
+
+
+
300
+
+
+
250
RC
Glut
200
0
1
2
3
4
5
6
Dias
Gráfico 4: Evolução de peso corporal de ratos durante o período pós radioterapia
(5 dias) nos grupos experimentais com livre acesso à ração comercial com 23%
ptn e suplementação de glutamina. Grupos CGlic (Controle com glicina), CGlut
A+GlicP (Controle com glutamina antes e glicina pós da RT) e CGlutAP (controle
com glutamina antes e pós RT ) (A); Grupos RPGlic (restrição protéica com
glicina), RPGlut A+GlicP (restrição protéica com glutamina antes da RT) (B);
Grupos RCGlic (restrição calórica com glicina), RCGlut A+GlicP (restrição calórica
com glutamina e glicina pós RT) e RCGlutAP (C). Dados expressos como média ±
epm. Os dados experimentais foram obtidos utilizando 5 animais em cada grupo. °
p< 0,05 vs RC Glic e + p<0,05 vs dia 1.
42
consumo ração (g)
Consumo de Ração de Ratos Durante o Período Pós Radioterapia
(A)
14
C Glic
C Glut A
+ Glic P
C Glut AP
12
10
8
6
4
2
0
*
*
0
1
2
3
4
5
6
co nsu mo ração (g)
dias
RP Glic
10
(B)
RP Glut A
+ Glic P
8
6
π
π
4
π
π
2
RP Glut AP
0
0
1
2
4
5
6
dias
25
consumo ração (g)
3
RC Glic
(C)
20
RC Glut A
+ Glic P
15
RC Glut AP
10
5
0
0
1
2
3
4
5
6
dias
Gráfico 5: Consumo de ração de ratos durante o período pós radioterapia (5 dias)
nos grupos experimentais com livre acesso à ração com comercial com 23% ptn e
suplementação de glutamina.Grupos CGlic (Controle com glicina), CGlut A+GlicP
(Controle com glutamina antes e glicina pós RT) e C GlutAP (controle com
glutamina antes e pós RT ) (A). Grupos RPGlic (restrição protéica com glicina), RP
Glut A+Glic P (restrição protéica com glutamina antes da RT e glicina pós RT) (B).
Grupos RC Glic (restrição calórica com glicina), RC Glut A+Glic P (restrição
calórica com glutamina e glicina pós RT) e RC Glut AP (C). Dados expressos como
média ± epm. Os dados foram obtidos utilizando 5 animais em cada grupo. * p< 0,05 vs
C Glic, π p 0,05 vs RP Glic.
43
4 - Concentração de Proteínas na Mucosa Intestinal
Com relação à concentração de proteínas totais no jejuno (gráfico 6)
observamos que o grupo CGlutA+GlicP apresenta maiores concentrações (p<0,01)
de proteínas em comparação aos grupos CGlic e CGlutAP. O grupo RP
GlutA+GlicP apresentou menores concentrações de proteínas em comparação aos
grupos RPGlic e RPGlutAP. E o grupo RCGlutAP apresentou maior concentração
de proteína que o grupo RCGlutA+GlicP, tendo este último apresentado menor
concentração de proteína em comparação ao RCGlic. Comparando os grupos que
não receberam suplementação de glutamina observamos que os grupos RPGlic e
RCGlic apresentaram maiores concentrações de proteínas (p< 0,01) em
comparação ao CGlic e o grupo RPGlic apresentou ainda maior concentração de
proteína (p<0,01) em comparação ao RCGlic. Em relação aos grupos que
receberam glutamina antes da RT e glicina após, observamos que o grupo
RCGlutA+P
apresentou menor concentração de proteína (p< 0,01) em
comparação ao CGlutA. Em relação aos grupos que receberam glutamina antes e
após RT o grupo RPGlutAP apresentou maiores concentrações de proteína (p<
0,01) em comparação aos grupos CGlutAP e RCGlutAP.
44
Concentração de Proteínas Totais no Jejuno nos Grupos Experimentais
Q u an t. d e ptn (m cg /m l)
30
∞ψ
*°
20
*∞
π#
*
°
10
ψƒ
0
C Glic
C GlutA+GlicP
C GlutAP
RP Glic
RP GlutA+GlicP
RP GlutAP
RC Glic
RC GlutA+GlicP
RC GlutAP
Grupos
Gráfico 6: Concentração de proteínas totais no jejuno nos grupos experimentais.
Grupos CGlic (Controle com glicina), CGlut A +Glic P (Controle com glutamina
antes e glicina pós da RT) e C Glut AP (controle com glutamina antes e pós RT )
(A); Grupos RPGlic (restrição protéica com glicina), RPGlut A +Glic P (restrição
protéica com glutamina antes da RT) (B); Grupos RCGlic (restrição calórica com
glicina), RCGlut A+Glic P (restrição calórica com glutamina e glicina pós RT) e
RCGlutAP (C). Dados expressos como média ± epm. Os dados experimentais
foram obtidos utilizando 5 animais em cada grupo. * p< 0,05 vs C Glic, p< 0,05
vs C Glut A+Glic P, ∞ p < 0,05 vs C Glut AP , π p < 0,05 vs RP Glic , # p<0,05 vs
RP Glut AP, ° p < vs RC Glic e ψ p< 0,05 vs RC Glut AP.
45
5 - Análise Estereológica das Vilosidades Intestinais
O gráfico 7 mostra a densidade de superfície das vilosidades (Sv) dos
grupos experimentais. Comparando os grupos de acordo com o estado nutricional
e a mesma suplementação de aminoácidos podemos observar que os animais do
grupo RCGlutAP apresentaram menor Sv comparado aos grupos RPGlutAP e
CGlutAP (p< 0,05). O grupo CGlutAP apresentou maior (p<0,05) densidade de
superfície das vilosidades comparado ao grupo CGlic. Os grupos RPGlutA+GlicP e
RPGlutAP apresentaram maior Sv (p<0,05) comparado aos grupos CGlic e RPGlic.
SV (mm 2/mm 3)
25
20
*π
*
*π
#∞
15
10
5
0
CGlic CGlutA+GlicP CGlutAP
RPGlic
RPGlutA+G RPGlutAP
RCGlic
RCGlutA+G RC GlutAP
Gráfico 7: Sv (área de superfície das vilosidades intestinais) dos grupos Grupos
CGlic (Controle com glicina), CGlutA+GlicP (Controle com glutamina antes e glicina
pós da RT) e CGlutAP (controle com glutamina antes e pós RT ). Grupos RPGlic
(restrição protéica com glicina), RPGlutA+GlicP (restrição protéica com glutamina
antes da RT). Grupos RCGlic (restrição calórica com glicina), RCGlut A+GlicP
(restrição calórica com glutamina e glicina pós RT) e RCGlutAP. Dados expressos
como média ± epm. Os dados experimentais foram obtidos utilizando 5 animais em
cada grupo. * p< 0,09 vs C Glic, ∞ p < 0,05 vs CGlut AP, π p < 0,05 vs RP Glic, #
p<0,09 vs RP Glut AP.
46
6 - Avaliação Histopatológica
Os efeitos da radioterapia na mucosa intestinal que caracterizam a
enterite aguda foram evidenciados na análise histopatológica Os sinais
encontrados em grande parte dos animais foram de alteração nuclear, apoptose
nas células da cripta e distorção da arquitetura nas vilosidades.
6.1 - Relação Vilosidade/Cripta (RVC)
Os resultados obtidos sobre a relação vilosidade/cripta na mucosa
jejunal estão mostrados na tabela 3. Estes dados apontam que nos grupos
CGlutAP, RPGlutAP, RCGlutAP houve maior número de animais com RVC normal
que nos grupos CGlutA+GlicP, RPGlutA+GlicP, RCGlutA+GlicP, estes grupos
apresentaram RVC semelhante a seus respectivos controles (CGlic, RPGlic e
RCGlic). Comparando os grupos com a mesma suplementação de aminoácido e
diferentes estados nutricionais observamos que não houve diferença entres os
animais dos grupos CGlic, RPGlic e RCGlic, assim como entres os grupos
CGlutA+GlicP, RPGlutA+GlicP, RCGlutA+GlicP e também entre os grupos CGlutAP,
RPGlutAP, RCGlutAP.
Tabela 2: Relação vilosidade/cripta (RVC) dos grupos experimentais. Dados
expressos em número (N) e percentual (%).
Grupos/
RVC
RC
C
C
RP
RP
RP
RC
GlutA+
RC
GlutA GlutAP Glic GlutA+ GlutAP Glic
GlicP GlutAP
+GlicP
GlicP
% N % N
% N
% N
% N
% N
% N
% N
%
C
Glic
N
Normal
0
0 0
0
2
40 0
0 1
20 2
40 1
20 1
20 2
40
Reduzida
5 100 5 100 3
60 5
100 4
80 3
60 4
80 4
80 3
60
6.2 - Número de Mitoses por Cripta
47
A tabela 4 mostra os resultados obtidos sobre o número de mitoses
por cripta. Estes dados indicam que os grupos que receberam glutamina antes ou
antes e após a RT (CGlutAP, RPGlutAP, RCGlutAP, CGlutA+GlicP, RPGlutA+GlicP
e RCGlutA+GlicP) apresentaram maior número de animais com número de mitoses
normal ou aumentado do que animais que não receberam glutamina (CGlic, RPGlic
e RCGlic). Sendo que os animais do grupo RCGlic apresentou maior número de
animais com reduzido número de mitoses, enquanto que os RCGlutAP
apresentaram o maior número de mitoses.
Tabela 3: Número de Mitoses por cripta dos grupos experimentais. Dados
expressos em número (N) e percentual (%).
C
Grupos
RP
C
RP
C
RP
RC
RC
RC
Número de Glic GlutA+ GlutAP Glic GlutA+ GlutAP Glic GlutA+ GlutAP
GlicP
mitoses/
GlicP
GlicP
cript
N % N % N
% N
% N
% N
% N % N
% N
%
Reduzido
2 40 0
0 0
0
3
60
1
20
1
20
5
0 3
60
0
0
Normal
3 60 4
80 3
60
2
40
3
60
3
60
0
0 2
40
5
100
20 2
40
0
0
1
20
1
20
0
0 0
0
0
0
Aumentado 0
0 1
5.2 - Grau de Inflamação da Mucosa Intestinal
Como demonstrado na tabela abaixo os animais dos grupos que não
receberam glutamina (CGlic, RPGlic e RCGlic) apresentaram algum grau de
inflamação da mucosa, sendo mais acentuado nos grupos RP e RC. Enquanto, 40
a 60% dos animais dos grupos C e RP que receberam glutamina antes ou antes e
após não apresentaram inflamação. Entretanto o grupo RCGlutAP apresentou um
maior número de animais com inflamação acentuada do que os animais dos grupos
RCGlutA+GlicP, RPGlutAP e CglutAP.
48
Tabela 4: Grau de inflamação dos grupos experimentais. Dados expressos em
número (N) e percentual (%).
Grupos
C
C
C
RP
RP
RP
RC
RC
RC
Número de Glic GlutA GlutAP Glic GlutA+ GlutAP Glic GlutA+ GlutAP
mitoses/
+GlicP
GlicP
GlicP
cripta
N % N % N
% N % N
% N
% N % N
% N
%
Sem
inflamação
Inflamação
leve
Inflamação
acentuada
0
0 2
40 3
60 0
0 2
40 3
60 0
0 0
0 0
0
3 60 2
40 1
20 2
40 2
40 1
20 2
40 3
60 1
20
2 40 1
20 1
20 3
60 1
20 1
20 3
60 2
40 4
80
Figura 1 - Mucosa jejunal de rato controle não irradiado. Aumento 400X. Corado
em HE.
49
Figura 2 - Mucosa jejunal de rato controle irradiado. Aumento 400X. Corado em
HE.
Figura 3 – Efeito da suplementação de glutamina sobre a mucosa intestinal
irradiada: A - CGlic, B- CGlutAP, C – RPGlic, D - RPGlutAP, E - RCGlutAP.
Aumento 100X. Corado em HE.
50
DISCUSSÃO
Estado Nutricional Durante Período de Desnutrição
A desnutrição e a perda de peso ocorrem freqüentemente em
pacientes com câncer e estão associados a menor tolerância ao tratamento e
menor sobrevida (Bauer et al.,2002; O’Gorman et al., 1998; Chlebowski et al,
1996). A desnutrição induzida pela restrição protéico/calórica e pelo jejum severo
em ratos adultos resultam em perda de peso e em alterações na mucosa intestinal,
portanto estes modelos têm sido amplamente utilizados para compreender algumas
situações clínicas associadas a desnutrição (Boza et al.,1999; Bissonette et
al.,1998; Walrand et al, 2000). Nossos resultados do grupo submetido à restrição
calórica reforçam estes estudos, pois observamos uma significativa redução do
peso corporal nestes animais. Em humanos uma perda de 7,25% de peso corporal,
que foi a que encontramos nos animais RC em comparação ao peso inicial, já é
considerada um indicador de risco nutricional (De Wys et al, 1980).
Demonstramos em estudos anteriores que a restrição protéica (8%)
em ratas lactantes promove um distúrbio no comportamento alimentar, diminuindo
em aproximadamente 50% o consumo diário de ração e consequentemente o peso
corporal destes animais (Passos et al, 2000; Passos et al. 2001a; Passos et al.,
2001b). Estas alterações, no entanto, parecem ser específicas da fase de lactação,
uma vez que no presente estudo o consumo de ração e o peso corporal dos
animais adultos submetidos à restrição protéica não se alteraram.
Campana et al (1990) demonstraram que ratos com 3 meses de idade
submetidos à restrição protéica severa (ração com 0% de ptn por 32 dias) também
não apresentaram alteração no consumo alimentar, porém apresentaram perda de
peso. É provável que no presente estudo tanto o menor período (21 dias), quanto a
51
menor restrição protéica não tenham sido suficientes para causar perda de peso,
porém foi observada uma diminuição significativa da concentração de albumina
sérica nesses animais em comparação ao grupo controle, confirmando outros
estudos (Latorra et al, 1998; Walrand et al., 2000; Claeyssens et al, 1990).
Estes resultados revelam que independente da idade e da perda de
peso, a restrição protéica pode comprometer significativamente alguns parâmetros
bioquímicos, tal como a albumina sérica. A hipoalbuminemia indica diminuição da
biossíntese hepática devido ao limitado suprimento de substrato protéico, sendo
utilizado com freqüência na prática clínica como um marcador de desnutrição
protéica
(Carlson et al., 1991; Barrera, 2002), apesar de ser considerado um
parâmetro pouco sensível como instrumento preditivo de complicações clínicas (De
la Hunt et al,1984).
Estado Nutricional e Consumo Alimentar Durante Período Pré-Radioterapia
Abdominal
Em situações de estresse metabólico ocorrem importantes alterações
morfológicas e funcionais nos tecidos, sendo que estas mudanças estão
associadas à proteólise muscular aumentada e balanço nitrogenado negativo
(Padovese et al, 2000). Dentre as várias alterações no metabolismo protéico
destacamos um aumento do consumo de glutamina pelo intestino, pelos linfócitos e
pelo rim, além do aumento da liberação deste aminoácido pelo músculo (Hulsewé
et a, 1997; Lacey e Wilmore, 1990). Estas situações podem chegar ao
esgotamento da glutamina e conseqüente estado de deficiência. Entretanto em
situações normais, a dieta oral é suficiente para suprir as necessidade diárias de
glutamina (Souba et al., 1990).
52
Em
nosso
estudo
a
realimentação
com
ração
normal
e
suplementação oral com Glutamina durante os 05 dias que antecederam a
radioterapia não alteraram a ingestão alimentar de nenhum grupo experimental,
corroborando os estudos de Klimberg et al (1990a) e Ersin et al (1999), apesar
destes autores terem suplementado glutamina adicionada a dieta líquida ad libitum.
Com relação ao peso corporal observamos uma recuperação do
ganho de peso corporal nos grupos RCGlic e RCGlut quando comparamos os
valores do dia 5 com os do dia 1. Os estudos sobre o efeito da glutamina sobre o
ganho de peso são contraditórios, alem disso existem poucas referencias na
literatura. Tannuri et al. (2000), utilizando uma suplementação de glutamina,
durante 15 dias em animais desnutridos em fase de crescimento, demonstraram
aumento do ganho de peso nestes animais. Boza et al (2000) demonstram que
ratos submetidos ao jejum por 3 dias apresentaram maior ganho de peso e
melhora no pool de glutamina plasmática e muscular quando realimentados com
dieta a base de peptídeos em comparação com animais realimentados com dieta a
base de aminoácidos livres, mesmo esta contendo maior quantidade de glutamina.
Como nossos animais foram realimentados com ração oral normal,durante o
período da suplementação com glutamina e também como o grupo que não
recebeu glutamina também ganhou peso, é provável que este ganho de peso
nestes dois grupos seja devido à realimentação e não à suplementação com
glutamina, visto que a dieta oral é suficiente para suprir as necessidade diárias de
glutamina na ausência de injúria.
53
Estado Nutricional e Consumo Alimentar Durante Período Pós Radioterapia
Abdominal
A ingestão alimentar de todos os animais diminuiu cerca de 70%,
caracterizando uma anorexia pós-radioterapia abdominal, como ocorre em seres
humanos (Donaldson, 1982; Cengiz et al, 2001). Este resultado também foi
observado no estudo experimental realizado por Klimberg et al (1990a). Esta
anorexia ocorre principalmente por complicações gastrointestinais, sendo muito
freqüente a ocorrência de diarréia (Yeoh et al, 1993; Maza et al, 2001). Todos os
amimais do presente estudo apresentaram diarréia em grande quantidade a partir
do segundo dia pós radioterapia. A diarréia foi nitidamente observada, apesar de
não ter sido possível quantificá-la. Portanto, a anorexia e a diarréia determinaram a
perda de peso severa (15,3%) observada em todos os grupos estudados.
Os animais dos grupos RP e RC apresentaram perda de peso
significativa mais precoce do que o grupo C, principalmente o grupo RC, apesar
deste último ter recuperado o peso no período pré-radioterapia. Com isso podemos
sugerir que o estado nutricional pré tratamento radioterápico pode tornar o animal
mais susceptível a perda de peso durante o tratamento mesmo apresentando
ingestão alimentar e injúria similares ao grupo controle. Assim, estes dados
confirmam a importância clínica do estado nutricional pré-radioterapia, pois
segundo Capra et al, (2001) o estado nutricional pré tratamento anti-neoplásico
pode interferir na tolerância ao tratamento e na sobrevida do paciente.
Observamos respostas diferentes no consumo alimentar dos grupos
de acordo com estado nutricional pré-radioterapia e suplementação com glutamina.
O grupo controle que recebeu glutamina antes e após a radioterapia (CGlutAP)
apresentou menor consumo de ração
comparado ao grupo controle que não
recebeu glutamina (CGlic), ao contrario, os grupos RP que receberam glutamina
54
antes da RT (RPGlutA+Glic) e antes e após RT (RPGlutAP) apresentaram maior
consumo alimentar comparado ao grupo que não recebeu glutamina (RPGlic). O
grupo RC não apresentou qualquer alteração no consumo alimentar.
Uma possível explicação para a menor ingestão no grupo CGlutAP
seria uma associação do estado de eutrofia com um longo período de
administração de glutamina (antes e após). O
período pós-radioterapia,
caracterizado por um estado hipercatabólico e de resposta de fase aguda (Cengiz
et al, 2001), parece determinar uma maior direcionamento da glutamina para a via
metabólica da neoglicogênese hepática, com objetivo de manutenção da glicemia
(Curi, 2000), isto também pode estar ocorrendo nestes animais de uma forma mais
intensa que nos demais grupos.
Os resultados de maior consumo alimentar dos grupos RP
(RPGlutA+Glic
e
RPGlutAP)
podem
ser
explicados
por
um
mecanismo
comportamental compensatório de animais que sofreram restrição protéica
anteriormente, com objetivo de obter a máxima captação de proteína na fase de
estresse. Mesmo que este maior consumo não resulte em maior ganho de peso ele
poderá ser importante para uma maior tolerância e recuperação do tratamento
radioterápico. Estes resultados sugerem que o efeito da glutamina sobre a ingestão
alimentar responde de maneira diferente de acordo com o estado nutricional
anterior à injúria.
Efeito da suplementação de glutamina sobre a estrutura e conteúdo protéico
da mucosa intestinal de ratos controle submetidos à radioterapia abdominal
O nosso modelo experimental foi capaz de induzir a enterite aguda pela
observação dos sintomas (diarréia e anorexia) e também pela avaliação
histopatológica do tecido jejunal. As alterações histopatológicas da mucosa
intestinal características da enterite induzida pela radioterapia encontradas no
55
nosso estudo estão de acordo com os dados em humanos de Maza et al (2001)
que encontraram distorção na arquitetura das vilosidades. A avaliação da
regeneração das vilosidades intestinais foi realizada através do método de
estereologia Sv (área de superfície), que é um método simples e sem viés, porém
pouco utilizada (Mandarin-de-Lacerda, 1990). Entretanto, Corazza et al (1985)
propôs que esta é a técnica de escolha para avaliação quantitativa da arquitetura
da mucosa intestinal.
O mecanismo pelo qual a glutamina protege a mucosa intestinal ainda
não é bem compreendido, entretanto tem sido demonstrado que a glutamina oral
estimula a captação de glutamina pelo intestino pelo aumento da atividade da
enzima glutaminase aumentando
o transporte através da borda em escova
(Klimberg et al., 1990). Outros fatores, além da glutamina oral, modulam a atividade
da glutaminase no intestino, dentre eles o jejum prolongado, a desnutrição, período
pós-prandial, alimentação enteral e aminoácidos de cadeia ramificada (Zhang et al,
1997; Ardawi e Majzoub, 1998; Mc Cauley et al, 1997; Haque et al, 1996).
A suplementação com glutamina antes da radioterapia nos animais
controles (CGlutA+GlicP) resultou em maiores concentrações de proteína na
mucosa intestinal,
aumento no número de mitoses por cripta e ausência de
inflamação, porém não foram observadas alterações na área de superfície das
vilosidades intestinais. Estes resultados corroboram parcialmente os estudos de
Souba et al (1990a) e Klimberg et al (1990) que demonstraram que a
suplementação com glutamina antes da radioterapia promoveu um aumento na
altura e numero das vilosidades e aumento do numero de mitoses por cripta.
Porém, estes autores, administraram glutamina via oral de forma contínua,
diferente do nosso modelo onde a glutamina foi administrada uma vez ao dia.
56
Sabe-se que o melhor aproveitamento da suplementação da glutamina é quando
está associada com a dieta enteral e administrada pelo menos três vezes ao dia
(Savy, 1997).
A suplementação com glutamina antes e após radioterapia nos
animais controles (CGlutAP) resultou em uma maior área de superfície das
vilosidades intestinais, aumento no número de mitoses por cripta e ausência de
inflamação, demonstrando que este aminoácido promoveu a aceleração da
proliferação celular e conseqüente restauração das vilosidades, porém não alterou
o conteúdo de proteínas na mucosa. Estes resultados estão de acordo com os
estudos realizados em ratos sépticos e suplementados com glutamina antes e após
a radioterapia abdominal (Souba et al, 1990; Chun, et al, 1997; Ersin et al, 2001).
Estes estudos demonstraram que a suplementação com glutamina é capaz de
proteger a mucosa intestinal, acelerar a cicatrização do intestino e evitar a
translocação bacteriana nestes animais.
Os nossos dados de suplementação em animais eutróficos mostram
que a glutamina antes da radioterapia promove maior síntese protéica, porém não
é eficaz para melhorar a estrutura
da mucosa intestinal irradiada, enquanto a
suplementação antes e após promoveu uma restauração das vilosidades, sem
alterar o
conteúdo de proteínas na mucosa. É possível que a glutamina
administrada antes da radioterapia tenha o efeito benéfico apenas de promover
maior síntese protéica porque estes animais recebem uma menor quantidade de
glutamina em comparação ao grupo que recebe antes e após. Esta maior síntese
protéica parece estar associada à habilidade da glutamina em preservar o pool de
aminoácidos livres, a qual regula a síntese protéica, como demonstrado por outros
autores no músculo esquelético (Bergstrom et al., 1974; Jepson et al., 1988).
57
No grupo CGlutAP é possível que a glutamina administrada após a
radiação tenha estimulado a atividade da glutaminase e aumentado a captação
de glutamina para os enterócitos. Além disso, a própria injúria pode ter acelerado o
metabolismo da glutamina no intestino promovendo uma restauração das
vilosidades. Assim, estes dados sugerem que em condições de estado nutricional
adequado a suplementação com glutamina apenas antes da
RT possa ser
suficiente para melhor recuperação, exceto para a recuperação da densidade de
vilosidades.
Efeitos da Desnutrição e da Radioterapia Abdominal sobre a Estrutura e
Conteúdo Protéico da Mucosa Intestinal de Ratos
Restrições dietéticas e desnutrição assim como diversas desordens
intestinais estão associadas à perda de peso, redução da imunocompetência,
podendo ainda afetar negativamente a morfologia e função intestinal.
Os animais desnutridos de ambos os grupos RP e RC, que não
receberam glutamina no período pré e pós radioterapia, apresentaram maior
conteúdo protéico na mucosa intestinal e não apresentaram alteração da área de
superfície de vilosidades em comparação aos animais controles, no entanto a
análise histopatológica no grupo RC mostrou um número de mitoses por cripta
reduzido e maior grau de inflamação. Estes resultados não corroboram os estudos
de Walrand et al (2000) e Boza et al (1990) que avaliaram o efeito da desnutrição
sobre as estruturas da mucosa intestinal. No trabalho de Walrand et al (2000) foi
relatado que a desnutrição protéica e calórica durante 54 dias em animais adultos
acarretou redução na altura das vilosidades e das criptas intestinais. Boza et al
(1990) demonstraram que animais submetidos somente ao jejum, por 3 dias
apresentaram menor conteúdo protéico e maior permeabilidade intestinal. Porém
diferente do nosso trabalho, nestes estudos os animais não foram submetidos à
58
uma injúria adicional, nem a realimentação com dieta normal. No entanto, os
nossos dados com relação ao conteúdo de proteínas na mucosa são similares aos
resultados de Nieto et al (2000) que observaram um aumento na taxa proteína/DNA
da mucosa intestinal de ratos com 21 dias submetidos a desnutrição e diarréia
crônica.
Assim,
não
encontramos
na
literatura
nenhum
estudo
com
metodologia semelhante a nossa, ou seja, associando desnutrição protéica ou
calórica e injúria radioterápica na idade adulta com alterações na mucosa intestinal,
o que torna difícil compararmos os nossos resultados.
Em nosso modelo experimental os animais foram desnutridos por 21
dias e realimentados durante 5 dias antes da radioterapia. É provável que esta
realimentação pré RT tenha recuperado (homeorresis), pelo menos parcialmente, o
estado nutricional destes animais. Além disso, o estresse provocado pela RT num
animal previamente desnutrido pode levar a adaptações hormonais e metabólicas
diferentes do animal controle.
O jejum está associado com um aumento na atividade da proteólise
muscular e possivelmente pulmonar, e conseqüente liberação de glutamina destes
compartimentos (Welbourne et al 1986; Miller, 1999). A injúria à mucosa intestinal
também estimula a liberação de cortisol que causará estímulo para aumentar a
liberação de glutamina pelo músculo e pulmão. Esta glutamina circulante é
consumida preferencialmente pelo rim (combate a acidose), pelos linfócitos
(proliferação) e pelo intestino (reparo e proliferação intestinal) (Saranto et al.,
1992). Assim, apesar destes animais não terem recebido glutamina via oral, tanto a
desnutrição quanto o cortisol elevado pode estar aumentando a liberação de
glutamina de outros tecidos, aumentando a captação da corrente sanguínea para o
59
enterócito, e assim preservando a integridade da mucosa intestinal. A
maior
síntese protéica nestes animais pode estar associada à habilidade da glutamina
em preservar o pool de aminoácidos livres, a qual regula a síntese protéica como
citado acima.
Para comprovarmos esta hipótese torna-se necessário avaliarmos as
concentrações séricas de glutamina e de cortisol, que não foram realizadas no
presente estudo.
Assim a desnutrição associada à radioterapia abdominal pode levar a
alterações adaptativas que aumentam a síntese protéica e preservam parcialmente
a integridade da mucosa intestinal.
Efeito da Suplementação de Glutamina Sobre a Estrutura e Conteúdo
Protéico da Mucosa Intestinal de Ratos Desnutridos Submetidos a Radiação
Abdominal
A suplementação com glutamina antes ou antes e após a radioterapia
no grupo RP (RPGlutA+GlicP e RPGluAP) promoveu aumento da área de
superfície de vilosidades, do número de mitoses por cripta e ausência de
inflamação, porém não obteve melhora na síntese protéica. No entanto, o grupo
RC (RCGlutA+GlicP e RCGluAP) não apresentou aumento da área de superfície de
vilosidades, na síntese protéica, e ainda apresentou uma inflamação mais
acentuada. Não podemos discutir estes resultados baseado em outros estudos,
pois também não encontramos na literatura nenhum estudo avaliando o efeito da
glutamina em animais desnutridos submetidos à injúria radioterápica.
Estes dados mostram que a suplementação com glutamina protege a
mucosa intestinal mesmo no animal submetido previamente à restrição protéica,
uma vez que sugerimos que a própria desnutrição associada à radioterapia
abdominal pode levar a alterações adaptativas
que preservam parcialmente a
60
integridade da mucosa intestinal. Porém, quando os animais são submetidos à
restrição calórica a glutamina não exerce os mesmos efeitos.
As adaptações metabólicas que ocorrem no animal desnutrido como
citado acima parece ser um estado adaptativo da desnutrição. Uma possível
explicação para os resultados do grupo RC que receberam glutamina pode ser
devido a uma redução nos níveis de glutaminase na mucosa intestinal causado
pela desnutrição e consequentemente menor utilização e metabolização da
glutamina, pois o jejum prolongado e a desnutrição estão associados à queda na
atividade desta enzima no trato gastrointestinal (Galanopoulos, 1988). Isto sugere
que a glutaminase é insuficiente para metabolizar uma quantidade suplementar de
glutamina exógena, principalmente na forma de administração realizada nosso
estudo, que consistiu na dose única diária. È provável que, nestes animais
uma
dose contínua de glutamina fosse uma melhor indicação. Assim, o fato de no
grupo RC estar combinado uma restrição protéico-calórica, que não se verifica no
grupo RP, agrava o estado pós radioterapia e a glutamina não exerce nenhum
efeito.
Assim, estes dados sugerem que o estado nutricional deve ser
considerado quando o tratamento com glutamina é indicado, e mostra a
importância de se identificar o tipo de desnutrição na avaliação nutricional realizada
antes do tratamento radioterápico.
61
CONCLUSÕES
1 - A suplementação oral de glutamina parece não exercer efeitos
sobre o ganho de peso corporal e consumo alimentar.
2 - A suplementação oral de glutamina exerce efeitos protetores e
terapêuticos na mucosa intestinal irradiada de animais controles e submetidos à
restrição protéica, não exercendo estes efeitos, na dose utilizada no presente
estudo, quando os animais são submetidos à restrição calórica.
3 - A desnutrição associada à radioterapia abdominal parece levar a
alterações adaptativas que preservam parcialmente a integridade da mucosa
intestinal.
4 - O estado nutricional deve ser considerado quando o tratamento
com glutamina é indicado, pois os dados do presente estudo mostram que ele pode
ser recomendado antes da RT em estado de eutrofia e antes e após em estado de
restrição protéica
5 - Este modelo é adequado para estudar os efeitos da
suplementação com glutamina antes ou após a radioterapia em animais
desnutridos.
6 - Este estudo mostra a importância de se identificar o estado
nutricional e o tipo de desnutrição na avaliação nutricional realizada antes do
tratamento radioterápico.
62
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