ATIVIDADE DE FITASES MICROBIANAS EM
DIFERENTES CONDIÇÕES DE
ARMAZENAMENTO, pH, TEMPERATURA E
PROCESSAMENTO TÉRMICO
LUCIANA DE PAULA NAVES
2009
LUCIANA DE PAULA NAVES
ATIVIDADE DE FITASES MICROBIANAS EM DIFERENTES
CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO, pH, TEMPERATURA E
PROCESSAMENTO TÉRMICO
Dissertação apresentada à Universidade Federal de
Lavras como parte das exigências do Programa de
Pós-Graduação em Agroquímica, para a obtenção
do título de “Mestre”.
Orientadora
Profa. Angelita Duarte Corrêa
LAVRAS
MINAS GERAIS - BRASIL
2009
Ficha Catalográfica Preparada pela Divisão de Processos Técnicos da
Biblioteca Central da UFLA
Naves, Luciana de Paula.
Atividade de fitases microbianas em diferentes condições de
armazenamento, pH, temperatura e processamento térmico /
Luciana de Paula Naves. – Lavras : UFLA, 2009.
60 p. : il.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Lavras, 2009.
Orientador: Angelita Duarte Corrêa.
Bibliografia.
1. Ácido fítico. 2. Fitato. 3. Atividade enzimática. 4. Frango de
corte. 5. Suplementação. 6. Hexafosfato de mio-inositol fosfohidrolase. I. Universidade Federal de Lavras. II. Título.
CDD – 636.5085
LUCIANA DE PAULA NAVES
ATIVIDADE DE FITASES MICROBIANAS EM DIFERENTES
CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO, pH, TEMPERATURA E
PROCESSAMENTO TÉRMICO
Dissertação apresentada à Universidade Federal
de Lavras como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em Agroquímica,
para a obtenção do título de “Mestre”.
APROVADA em 26 de fevereiro de 2009.
Prof. Paulo Borges Rodrigues
UFLA
Prof. Matheus Puggina de Freitas
UFLA
Profa. Angelita Duarte Corrêa
UFLA
(Orientadora)
LAVRAS
MINAS GERAIS – BRASIL
A Deus,
À minha mãe Maria Lucia e ao meu pai José Augusto,
pelo amor, apoio e compreensão.
Ao meu irmão Fernando, pelo carinho,
amizade e companheirismo.
Ao Rodrigo, pelo amor, incentivo e
compreensão.
DEDICO
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela vida e força espiritual.
À minha família e meu noivo, que sempre me apoiaram.
À Universidade Federal de Lavras e ao Departamento de Química, pela
oportunidade concedida para a realização do curso e das análises.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), pela concessão da bolsa de estudos.
À Profa. Angelita Duarte Corrêa, pela orientação, amizade e por tudo
que me ensinou.
Ao Prof. Antônio Gilberto Bertechini pelo apoio, amizade e sugestões.
Aos professores Custódio Donizete dos Santos e Celeste Maria Patto de
Abreu pelas sugestões e amizade.
Ao Dr. Jerônimo Ávito Brito pela amizade, sugestões e apoio.
Aos professores das disciplinas cursadas, pelo conhecimento e amizade
transmitidos.
A todos do Laboratório de Bioquímica do Departamento de Química,
em especial Juliana Arriel Torres, Pricila M. Batista Chagas e Suelen Ribas pela
ajuda na realização das análises.
Aos funcionários do Departamento de Química e aos colegas de pósgraduação, em especial Gislaine Aparecida Carvalho pela amizade.
Aos funcionários da Biblioteca/UFLA, pela atenção e presteza com que
sempre me atenderam.
Enfim, a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a
realização deste trabalho.
SUMÁRIO
Página
RESUMO...................................................................................................
i
ABSTRACT...............................................................................................
iii
LISTA DE SIGLAS...................................................................................
v
LISTA DE FIGURAS................................................................................
vi
LISTA DE TABELAS...............................................................................
vii
1 INTRODUÇÃO......................................................................................
1
2 REFERENCIAL TEÓRICO...................................................................
3
2.1 O substrato: fitato.................................................................................
3
2.2 A enzima: fitase....................................................................................
6
2.2.1 Aspectos gerais..................................................................................
6
2.2.2 Fontes de origem...............................................................................
8
2.2.2.1 Fitases de origem vegetal e animal................................................
8
2.2.2.2 Fitases de origem microbiana........................................................
9
2.2.3 Propriedades moleculares, catalíticas e classificação das fitases......
10
2.2.4 Local de ação.....................................................................................
14
2.2.5 Fatores físicos e químicos que afetam a estabilidade e a atividade
da fitase.............................................................................................
16
2.2.5.1 pH...................................................................................................
17
2.2.5.2 Temperatura...................................................................................
18
2.2.5.3 Glicosilação e íons metálicos.........................................................
19
2.2.5.4 Agentes redutores e inibidores.......................................................
19
2.2.5.5 Armazenamento.............................................................................
20
2.2.6 Considerações...................................................................................
21
3 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................
22
3.1 Procedimentos experimentais e fitases utilizadas................................
22
3.2 Extração da fitase e determinação da atividade enzimática.................
23
3.3 Primeira etapa......................................................................................
23
3.3.1 Armazenamento das fitases...............................................................
23
3.3.2 Formulação do núcleo.......................................................................
24
3.3.3 Incorporação das fitases ao núcleo de vitaminas, minerais e
aminoácidos......................................................................................
25
3.4 Segunda etapa.......................................................................................
26
3.4.1 Efeito do pH e da temperatura na atividade das fitases.....................
26
3.5 Terceira etapa.......................................................................................
26
3.5.1 Formulação das rações......................................................................
26
3.5.2 Incorporação das fitases às rações.....................................................
27
3.5.3 Rações suplementadas com fitase, processamento térmico e
armazenamento.................................................................................
28
3.5.4 Determinação da umidade.................................................................
28
3.6 Análises estatísticas..............................................................................
29
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................
31
4.1 Primeira etapa: armazenamento...........................................................
31
4.2 Segunda etapa: pH e temperatura.........................................................
35
4.2.1 pH......................................................................................................
35
4.2.2 Temperatura......................................................................................
38
4.3 Terceira etapa: processamento térmico das rações e armazenamento.
41
5 CONCLUSÕES.......................................................................................
46
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................
47
ANEXOS....................................................................................................
56
RESUMO
NAVES, Luciana de Paula. Atividade de fitases microbianas em diferentes
condições de armazenamento, pH, temperatura e processamento térmico.
2009. 60p. Dissertação (Mestrado em Agroquímica) - Universidade Federal de
Lavras, Lavras, MG1.
O uso de fitase na nutrição das aves é cada vez mais frequente e
promissor. Entretanto, há várias fitases disponíveis no mercado e poucos estudos
científicos sobre a influência da forma e tempo de armazenamento, pH,
temperatura e processamento térmico na atividade da enzima em questão.
Portanto, este experimento foi realizado com três fitases de diferentes origens
(Aspergillus oryzae, Aspergillus niger e Saccharomyces cerevisae) e dividido
em três etapas com os objetivos de: (1) avaliar o efeito de duas formas de
armazenamento sobre a atividade das fitases; (2) avaliar os efeitos do pH e
temperatura, in vitro, sobre a atividade das fitases; e (3) avaliar o efeito de três
tempos de exposição ao calor sobre a atividade das fitases incorporadas a dois
tipos de rações para frangos de corte, durante um período máximo de
armazenamento de 60 dias em temperatura ambiente (TA). Na primeira etapa, as
fitases foram armazenadas nas seguintes formas, em quatro repetições cada: a)
original (como adquirida) com atividade catalítica determinada após 0; 60; 90;
120; 150 e 180 dias de armazenamento em TA; e b) incorporada a um núcleo
contendo vitaminas, macro e microminerais e aminoácidos, com determinação
da atividade a cada 30 dias de armazenamento em TA, durante 180 dias. Na
segunda, a atividade foi determinada, em quatro repetições, em valores de pH de
2,0 a 9,0 e em temperaturas de 20 a 90°C. A última etapa foi dividida em dois
experimentos, com três repetições cada. Experimento 1: avaliou-se o efeito de
dois tipos de ração para frangos de corte (fase inicial e final) e quatro
tratamentos (ração controle e submetidas a três tempos de exposição ao calor)
sobre a atividade das fitases. Experimento 2: a ração de fase inicial submetida
aos quatro tratamentos citados anteriormente teve a atividade de fitase
determinada após 0; 15; 30; 45 e 60 dias de armazenamento em TA. As
determinações da atividade da fitase de S. cerevisae não apresentaram padrões
de repetibilidade durante a primeira etapa, portanto, essa enzima foi avaliada
apenas na segunda etapa. Houve perda linear de atividade enzimática, durante o
armazenamento, em ambas as formas avaliadas. A fitase de A. niger foi a enzima
com menor perda de atividade nas duas formas de armazenamento. O
1
Comitê Orientador: Dra Angelita Duarte Corrêa (Orientadora), Dr. Antônio Gilberto
Bertechini, Dr. Custódio Donizete dos Santos e Dra. Celeste Maria
Patto de Abreu (co-orientadores) − UFLA.
i
armazenamento, em TA, das fitases na forma original é o mais indicado.
Variações no pH e temperatura acarretaram em alterações na atividade das três
fitases. A fitase de A. oryzae teve maior atividade no pH 4,0 enquanto as outras
fitases apresentaram pH ótimo entre 4,5 e 5,0. A fitase de A. oryzae apresentou
maior atividade a 40°C e a 50oC estava inativa, enquanto que a fitase de A. niger
teve maior atividade próximo a 45°C, estando inativa a 60oC. A fitase de S.
cerevisae foi a mais termoresistente, pois estava ativa a 60°C, com atividade
máxima entre 50 e 60°C. Os resultados obtidos nos experimentos 1 e 2 da
terceira etapa mostraram que a atividade enzimática não foi alterada pelo tipo de
ração, processamento térmico das rações nem pelo armazenamento das mesmas,
em TA, durante 60 dias.
ii
ABSTRACT
NAVES, Luciana de Paula. Activity of microbial phytases in different
conditions of storage, pH, temperature and thermic processes. 2009. 60p.
Dissertation (Master in Agrochemistry) - Universidade Federal de Lavras,
Lavras, MG1.
The use of phytase in poultry nutrition is progressively more frequent
and promising. However, there are many available phytases in the market and
few scientific studies about the influence of form and period of storage, pH,
temperature and thermic process on the enzyme activity in question. Therefore,
this experiment was carried out with three phytases from different sources
(Aspergillus oryzae, Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisae) and
divided into three stages, whose objectives are: (1) evaluate the effect of two
forms of storage on the phytases activity; (2) evaluate the effects of the pH and
temperature, in vitro, on the phytases activity; and (3) evaluate the effect of three
times of exhibition to the heat on the phytases activity incorporated in two types
of feed for broiler chickens, during a maximum period of storage of 60 days at
the room temperature (RT). In the first stage, the phytases were stored in the
following manners, with four repetitions each: a) original (as acquired) with the
catalytic activity determinated after 0; 60; 90; 120; 150 and 180 days of storage
at RT; and b) incorporated to a nucleus containing vitamins, macro and
microminerals and aminoacids, with activity determination every 30 days of
storage at RT, during 180 days. In the second, the activity was determined, using
four repetitions, in pH values ranging from 2.0 to 9.0 and in temperatures from
20 to 90°C. The last stage was divided into two experiments, with three
repetitions each. Experiment 1: the effect of two types of feeds for broiler
chickens (initial phase and final phase) and four treatments (control feed and
feed submitted at three times of exhibition to the heat) on the phytases activity,
was evaluated. Experiment 2: the phytase activity of the initial phase feed
submitted to the four treatments cited was determined after 0; 15; 30; 45 and 60
days of storage at RT. Determinations of activity of the S. cerevisae phytase
didn’t show any repeatibilily standard during the first stage; therefore, this
enzyme was evaluated only in the second stage. There was linear loss of
enzymatic activity, during the storage, in both forms evaluated. The A. niger
phytase was the enzyme with the lowest loss of activity in both forms of storage.
The storage, at RT, of phytases in the original form is the more indicated.
1
Guidance Committee: Dra. Angelita Duarte Corrêa (Adviser), Dr. Antônio Gilberto
Bertechini, Dr. Custódio Donizete dos Santos e Dra. Celeste
Maria Patto de Abreu − UFLA.
iii
Variation in pH and temperature caused changes in the activity of the three
phytases. The A. oryzae phytase exhibited the largest activity at pH 4.0, while
the other phytases showed optimum pH between 4.5 and 5.0. The A. oryzae
phytase showed the largest activity at 40°C and, at 50°C, it was inactive; while
the A. niger phytase presented the largest activity near to 45°C, being inactive at
60°C. The S. cerevisae phytase was the most thermae-resistent enzyme since it
was active at 60°C with maximum activity between 50 and 60°C. According to
the results obtained in the experiments 1 and 2 of the third stage, the enzymatic
activity wasn’t dependent on the type of feed, thermic process and storage of
feeds, at RT, during 60 days.
iv
LISTA DE SIGLAS
FAP
Fosfatase ácida “purple”
FBH
Fitase ß-hélice
FTU
Unidades de atividade de fitase
HFA
Histidina fosfatase ácida
MM
Massa molecular
MS
Matéria seca
Pi
Fósforo inorgânico
TA
Temperatura ambiente
v
LISTA DE FIGURAS
Página
FIGURA 1
Estrutura do ácido fítico completamente desprotonado......
4
FIGURA 2
Exemplos de possíveis ligações entre o ácido fítico e
alguns nutrientes..................................................................
6
FIGURA 3
Estrutura do mio-inositol.....................................................
14
FIGURA 4
Atividade das fitases de A. oryzae e A. niger, nas formas
originais, em função do tempo de armazenamento.............
32
Atividade das fitases de A. oryzae e A. niger, incorporadas
ao núcleo, em função do tempo de armazenamento............
33
Atividade das fitases de A. oryzae, A. niger e S. cerevisae,
em função do pH.................................................................
36
Atividade enzimática em função da temperatura................
39
FIGURA 5
FIGURA 6
FIGURA 7
vi
LISTA DE TABELAS
Página
TABELA 1 Composição percentual dos ingredientes presentes no núcleo
24
TABELA 2 Composição dos suplementos vitamínico e mineral...............
25
TABELA 3 Composição das rações de acordo com as fases
estudadas................................................................................
27
TABELA 4 Atividade das fitases de A. oryzae e A. niger, em FTU kg-1
MS, incorporadas a dois tipos de rações e submetidas a
quatro tratamentos...................................................................
42
TABELA 5 Umidade, em g 100g-1, das rações de fase inicial e final
suplementadas com as fitases de A. oryzae e A. niger............
43
TABELA 6 Atividade da fitase de A. oryzae, em FTU kg-1 MS,
incorporada à ração para frangos de corte na fase inicial,
submetida a quatro tratamentos e armazenada durante
período máximo de 60 dias.....................................................
44
TABELA 7 Atividade da fitase de A. niger, em FTU kg-1 MS,
incorporada à ração para frangos de corte na fase inicial
submetida a quatro tratamentos e armazenada durante
período máximo de 60 dias.....................................................
45
vii
1 INTRODUÇÃO
O fitato é a principal forma de armazenamento de fósforo (P) em
sementes e grãos comumente presentes nas rações para aves. Entretanto, como
os frangos de corte apresentam baixa atividade de fitase endógena, o P fítico
presente na ração é praticamente não aproveitado e acumula-se nas excretas dos
frangos constituindo um sério problema ambiental por causar eutrofização de
corpos d’água. Devido ao baixo aproveitamento natural do P fítico, P de origem
inorgânica (Pi) precisa ser adicionado à ração aumentando significativamente os
custos de produção e, além disso, há indícios de crise futura no suprimento de Pi
já que as jazidas de fosfatos são recursos naturais não-renováveis. O fitato
também pode atuar como antinutriente, diminuindo a biodisponibilidade de
nutrientes. Diante disso, fitases exógenas têm sido adicionadas a rações de
frangos de corte para minimizar esses problemas.
A fitase (hexafosfato de mio-inositol fosfo-hidrolase) atua sobre o
substrato fitato, hidrolisando-o em ésteres fosfatos de mio-inositol menores por
meio de uma série de reações de desfosforilação liberando, consequentemente,
Pi .
Grandes avanços têm ocorrido na avicultura durante as últimas décadas
tornando-a mundialmente um dos segmentos
mais desenvolvidos
da
agropecuária. A inclusão de fitases na dieta dos frangos de corte tem se tornado
cada vez mais comum, entretanto há várias fitases disponíveis no mercado e
poucos estudos científicos sobre a influência da forma e tempo de
armazenamento, pH, temperatura e processamento térmico na atividade da
enzima em questão. Portanto, este experimento foi realizado com três fitases
microbianas de diferentes origens e está dividido em três etapas com os
objetivos de: (1) avaliar o efeito de duas formas de armazenamento sobre a
atividade das fitases, durante o período máximo de 180 dias em temperatura
1
ambiente (TA); (2) avaliar os efeitos do pH e temperatura, in vitro, sobre a
atividade das fitases; e (3) avaliar o efeito de três tempos de exposição ao calor
sobre a atividade das fitases incorporadas a dois tipos de rações para frangos de
corte, durante um período máximo de armazenamento de 60 dias em TA.
2
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 O substrato: fitato
O termo fitato refere-se ao sal do ácido fítico (hexafosfato de mioinositol; IP6) com um único tipo de mineral (Selle & Ravindran, 2007). O fitato
foi identificado pela primeira vez há mais de um século (Hartig, 1855). É a
principal forma de armazenamento de fósforo (P) durante o desenvolvimento de
cereais, legumes e sementes. Sua concentração no vegetal pode variar de 1 a 5%
(Lei & Porres, 2003).
A localização do fitato nas sementes é variada. Em grãos pequenos, é
observado principalmente na camada de aleurona, testa e pericarpo, e no caso do
milho é encontrado principalmente no embrião. Em sementes de leguminosas é
acumulado no cotilédone, entretanto na soja está localizado nos corpos protéicos
distribuídos por toda semente (Baker, 1991).
Assim, o fitato está naturalmente presente em sementes e grãos
comumente usados nas formulações de rações. Normalmente, as dietas das aves
contêm de 2,5 a 4,0g de P fítico kg-1 de ração (Ravindran et al., 1995). Todavia,
o P fítico é pobremente absorvido pelos monogástricos devido à ausência, ou
quantidade
insuficiente,
de
enzimas
que
hidrolisam
fitato
no
trato
gastrointestinal desses animais.
Portanto, fósforo inorgânico (Pi) - um mineral caro e não-renovável precisa ser adicionado à dieta de aves, suínos e peixes para atender as exigências
de P desses animais. O P fítico não absorvido e o Pi adicionado à dieta em
excesso são excretados no solo podendo poluir o ambiente em áreas de intensa
criação animal. O P acumulado no solo pode ser carreado com as chuvas para
corpos d’água causando a eutrofização destes, estimulando o crescimento
desordenado de microrganismos produtores de neurotoxinas e culminando na
morte de diversas espécies aquáticas. Além disso, o ácido fítico carregado
3
negativamente tem ação quelante com cátions, diminuindo a absorção desses
íons no intestino delgado (Lei & Porres, 2003).
Estruturalmente, o ácido fítico consiste em um anel de mio-inositol
completamente
fosforilado
disposto
na
conformação
de
cadeira
(energeticamente mais estável) contendo, no total, 12 locais de dissociação de
próton (Johnson & Tate, 1969) (Figura 1).
2
O PO32-
5
O3P O
OPO32-
3
4
1
2
O3P O
6
2
2
O3P O
OPO32FIGURA 1 Estrutura do ácido fítico completamente desprotonado (Johnson &
Tate, 1969).
A molécula de ácido fítico tem alto conteúdo de P (28,2%) e potencial
quelante para formar grande variedade de complexos insolúveis com cátions em
pH neutro e básico. Em pH ácido, a protonação parcial ou total do ácido fítico
diminui sua capacidade de complexar-se com minerais catiônicos. A ordem
correspondente à diminuição da estabilidade do complexo formado é a seguinte:
Zn2+, Cu2+, Ni2+, Co2+, Mn2+, Ca2+ e Fe2+ (Cheryan, 1980). Segundo Pallauf &
Rimbach (1995), o Zn é o elemento traço mais influenciado pelo ácido fítico, o
que está de acordo com os resultados obtidos por Oberleas & Harland (1996) os
quais relataram que o fitato foi um fator significante no desenvolvimento de
deficiência de zinco por tornar tal mineral indisponível.
O
ácido
fítico
também
pode
4
exercer
influência
negativa na
disponibilidade de proteínas e aminoácidos presentes na dieta. Os grupos
fosfatos do ácido fítico podem complexar-se com grupos amino de aminoácidos
como a lisina, histidina e arginina. Além disso, grupos carboxila da cadeia
lateral de aminoácidos ácidos podem ligar-se ao ácido fítico por meio de
minerais di ou tri-valentes. Os complexos, proteína-ácido fítico ou proteínamineral-ácido fítico, podem reduzir a utilização da proteína. Esses complexos
podem ocorrer naturalmente nos alimentos ou podem ser formados durante sua
passagem pelo trato gastrointestinal (Kornegay, 2001).
O ácido fítico também pode complexar-se com carboidratos como, por
exemplo, o amido. Durante a incubação in vitro do amido de trigo e de feijão
com saliva humana observou-se que a hidrólise foi retardada quando fitato de
sódio foi adicionado e que, quando o cálcio foi adicionado ao ensaio, a digestão
do amido foi restabelecida (Thompson et al., 1987). Ravindran et al. (2000)
realizaram estudos com frangos de corte que mostraram claramente que a
utilização da energia metabolizável aparente aumentou quando dietas com altos
níveis de fitato foram suplementadas com fitase. Segundo esses pesquisadores, o
ácido fítico pode exercer seu efeito no amido de uma ou mais maneiras: (i) por
ligar-se a α-amilase ou por quelar Ca2+, o qual é necessário para a atividade
normal da α-amilase; e/ou (ii) pela ligação direta ao amido e por meio de
proteínas de acoplamento. Exemplos de possíveis ligações entre o ácido fítico e
alguns nutrientes estão apresentados na Figura 2.
A concentração do fitato no alimento é decisiva na sua atuação como
antinutriente. Todavia, as respostas para a atividade da fitase são melhoradas
com o aumento dos níveis de fitato na dieta e indicações disto têm sido
documentadas para aves (Ravindran et al., 2000) e suínos (Selle et al., 2003).
Assim, diante da variedade de complexos insolúveis que podem ser
formados e da diminuição da disponibilidade dos nutrientes complexados, a
importância da atividade da fitase é clara já que, se o fitato é hidrolisado, seus
5
O
OH
Ca2+
OH
P
-
P
O
-
O
O
O
O
O
O
H
H
O-
O
Ca2+
-
O
C
CH2
O
proteína
OH
Amido
O
proteína
CH2
H
P
NH3
O
+
-
O
P
P
O-
Zn2+
O
H
H
O
-
O
H
O
-
O
P
O
OH
HOH2C
Amido
FIGURA 2 Exemplos de possíveis ligações entre o ácido fítico e alguns
nutrientes (Kornegay, 2001).
efeitos inibitórios são reduzidos (Kornegay, 2001).
2.2 A enzima: fitase
2.2.1 Aspectos gerais
O fósforo é um nutriente essencial para o desenvolvimento adequado dos
animais. Participa na formação e mineralização óssea, metabolismo celular,
síntese de proteínas, constitui membranas celulares e desempenha função
tamponante mantendo o equilíbrio ácido-básico no organismo (Ciofalo et al.,
2003). As recomendações diárias de P para frangos de corte variam entre os
trabalhos disponíveis na literatura e ainda não há um único valor para mensurar
tal exigência.
6
Embora a atividade da fitase tenha sido detectada pela primeira vez em
farelo de arroz há aproximadamente um século atrás (Suzuki et al., 1907),
tentativas para desenvolver tal enzima só começaram a partir de 1962 na
América do Norte (Wodzinski & Ullah, 1996). Contudo, apenas em 1991 a
primeira fitase tornou-se comercialmente disponível em resposta à legislação
dos países baixos, a qual estabeleceu limites para as quantidades de P lançados
no ambiente (Selle & Ravindran, 2007).
A fitase tem sido amplamente utilizada na alimentação de monogástricos
para melhorar a disponibilidade de P, reduzir a poluição ambiental causada pelo
acúmulo desse mineral nas excretas e diminuir custos de produção (Cromwell et
al., 1995; Lei & Porres, 2003). Assim, a redução da excreção de P fítico pelas
aves associada à diminuição da taxa de inclusão de Pi na ração são benéficas
tanto no aspecto ambiental como por favorecer uma produção sustentável.
O valor de equivalência de P é definido como a quantidade de Pi que não
precisa ser adicionado à dieta em função da quantidade de fitase presente na
ração via suplementação (Kornegay, 2001). Estima-se que 500 a 1.000FTU
substituem, aproximadamente, 1g de Pi (Yi et al., 1996; Selle & Ravindran,
2007). Em estudos com frangos de corte, Paik (2003) combinou a redução do
nível de P não-fítico de dietas iniciais (4,5−3,5g kg-1) e finais (3,5−2,5g kg-1)
com a suplementação (ou não) de fitase com atividade de 500FTU kg-1 ração. A
diminuição do P não-fítico na ausência da fitase reduziu a excreção de P em
14,8%, mas o ganho de peso dos animais foi depreciado. A inclusão da fitase nas
rações acarretou redução na excreção de P em 29,6% e não comprometeu o
desempenho de crescimento dos frangos.
Em experimentos com pintos de corte na fase inicial, Tejedor et al.
(2001) concluíram que rações à base de milho e soja suplementadas com fitase
nas taxas de 500 e 750FTU kg-1 aumentaram o ganho de peso em 3,4 e 2,8%,
respectivamente. Além disso, melhoraram a conversão alimentar em 3% nas
7
duas taxas de suplementação avaliadas.
Em outra linha de pesquisa atual, as fitases são utilizadas para o
desenvolvimento de estudos cinéticos e fisiológicos dos produtos da sua ação
catalítica, pois tem sido proposto que determinados fosfatos de mio-inositol
apresentam efeitos metabólicos de interesse como prevenção de formação de
pedra renal (Ohkawa et al., 1984), controle da hipercolesterolemia e
arteriosclerose (Potter, 1995), e redução dos riscos de câncer de colo
(Shamsuddin et al., 1997).
2.2.2 Fontes de origem
As fitases são enzimas amplamente encontradas nos microrganismos,
plantas e certos tecidos animais, entretanto as fontes microbianas são as mais
adequadas para a produção de fitase em escala comercial (Vats & Banerjee,
2004).
2.2.2.1 Fitases de origem vegetal e animal
Provavelmente, todos os vegetais superiores contêm alguma atividade de
fitase. Todavia, a concentração dessa enzima e sua significância na hidrólise do
fitato variam consideravelmente entre as plantas (Maenz, 2001).
Os níveis de controle da degradação do fitato nas sementes têm sido
discutidos. Durante a germinação, a atividade da fitase pode ser controlada pela
ação do ácido giberélico e fosfato; entretanto, esses mecanismos ainda não estão
completamente entendidos (Konietzny & Greiner, 2002).
De um modo geral, baixa atividade de fitase tem sido determinada em
ampla variedade de sementes tais como arroz, trigo, cevada, milho, centeio, soja
e oleaginosas (Eeckhout & Paepe, 1994). Embora as rações contenham sementes
com certa atividade de fitase, o processo de peletização (usado no
processamento da maioria das rações) acarreta em perda de atividade catalítica
8
desencadeada pela desnaturação térmica da fitase (Kornegay, 2001). Segundo
Jongbloed & Kemme (1990), as fitases de origem vegetal são mais termolábeis
que as de origem microbiana.
Em comparação com as fitases de microrganismos e plantas,
investigações sobre as fitases de origem animal são muito limitadas e, portanto,
não serão discutidas neste trabalho.
2.2.2.2 Fitases de origem microbiana
Dois fatores importantes conduziram ao desenvolvimento da fitase
microbiana tornando-a economicamente viável para ser usada em escala
comercial nas dietas das aves e suínos: o avanço da biotecnologia e o
aperfeiçoamento das técnicas de fermentação (Kornegay, 2001).
Em geral, as fitases de origem microbiana são mais estáveis a variações
no pH e temperatura do que as fitases de plantas (Konietzny & Greiner, 2002).
Eeckhout & Paepe (1991) concluíram que a resposta obtida in vivo (em
suínos) para a fitase microbiana (500U kg-1) foi 74% mais eficiente do que a
observada, em ensaios in vitro, para a fitase do trigo (500U kg-1). Eles
demonstraram que a fitase presente no trigo é ativa cataliticamente em estreito
espectro de pH e é menos efetiva no intestino. Além disso, é mais susceptível à
desnaturação em baixo pH e à digestão proteolítica do que a fitase de
Aspergillus niger (Phillippy, 1999).
A sensibilidade da fitase ao calor deve ser considerada para qualquer
processamento térmico realizado após a aplicação da enzima. As fitases
extracelulares de origem microbiana são moderadamente estáveis ao calor.
Fitases termoestáveis foram isoladas do Bacillus sp. DS11 (Kim et al., 1998) e
A. fumigatus. A enzima de A. fumigatus tem atividade em ampla variação de pH
e pode resistir a temperaturas extremas de 100°C por 20 minutos ou 90°C por
120 minutos. O gene que codifica esta enzima tem sido clonado e super-
9
expresso em A. niger. A fitase de A. fumigatus é um exemplo de enzima com
alto potencial comercial, já que pode resistir às condições de peletização da
ração sem perdas significativas de atividade (Pasamontes et al., 1997).
Entretanto, esse é um caso particular de fitase com alta resistência à
desnaturação térmica.
Várias fitases microbianas distintas estão atualmente disponíveis no
mercado. As três fitases mais comuns são derivadas de A. niger, que é uma 3fitase; Peniophora lycii e Escherichia coli, que são 6-fitases (Garrett et al.,
2004).
2.2.3 Propriedades moleculares, catalíticas e classificação das fitases
A primeira fitase caracterizada (phy A), sintetizada pelo microrganismo
A. niger, é codificada por um fragmento de DNA de 1,4kb, possui massa
molecular (MM) de 80kDa e 10 locais de N-glicosilação (Han & Lei, 1999).
O valor descrito para mensurar a MM das fitases é variado. Segundo
Choi et al. (2001), a MM de fitases bacterianas é menor do que a observada para
as fitases fúngicas (40−55 versus 80−120kDa). Konietzny & Greiner (2002)
estimam valores, para as fitases em geral, entre 40 e 70kDa. De acordo com
Greiner (2002), a MM de três fitases isoladas de sementes de tremoço (Lupinus
albus var. Amiga) variou de 57 a 64kDa. Todavia, Vats & Banerjee (2004)
relataram que as fitases têm MM estimada entre 35−700kDa dependendo da sua
origem.
A fitase (hexafosfato de mio-inositol fosfo-hidrolase) catalisa a reação de
desfosforilação do ácido fítico ou fitato em ésteres de fosfato de mio-inositol
menores e Pi (Lei & Porres, 2003).
Apresentam a cinética clássica de Michaelis-Menten, ou seja, a liberação
de Pi é dependente da concentração do substrato (Vats & Banerjee, 2004). A
atividade da fitase é, normalmente, expressa em unidades de fitase (FTU), sendo
10
que uma FTU é a quantidade de Pi liberado (µmol) durante um minuto de reação
em uma solução de fitato de sódio 5,1mmol L-1 em pH 5,5 e temperatura de
37°C (Engelen et al., 1994). Algumas outras abreviações incluindo FYT, U e
PU, têm sido usadas para indicar a atividade de diferentes fitases microbianas
comerciais, embora estas siglas tenham sido definidas sob condições in vitro
similares às definidas para FTU.
O número de fitases descritas aumentou durante a última década
(Konietzny & Greiner, 2002). Entretanto, nem todas são estruturalmente
semelhantes nem liberam o grupo fosfato pelo mesmo mecanismo (Mullaney &
Ullah, 2003). A ação catalítica da fitase sobre o fitato pode resultar em
diferentes isômeros de posição, dependendo da origem da enzima. Como a
hidrólise enzimática do fitato é um processo serial, em que cada fosfato de mioinositol menor pode ser o substrato para a hidrólise seguinte, acredita-se que a
liberação de ortofosfato tenha limitações (Konietzny & Greiner, 2002).
As fitases são divididas em duas categorias, de acordo com o local do
anel de mio-inositol onde a hidrólise se inicia. A 3-fitase (E.C. 3.1.3.8;
hexafosfato de mio-inositol 3-fosfo-hidrolase) libera preferencialmente o fosfato
da posição C3, enquanto a 6-fitase (E.C. 3.1.3.26; hexafosfato de mio-inositol 6fosfo-hidrolase) inicia a hidrólise na posição C6 do anel de mio-inositol. De um
modo geral, as 6-fitases são comumente encontradas nas plantas, enquanto as 3fitases são produzidas por microrganismos, em especial os fungos (Dvrøáková,
1998; Konietzny & Greiner, 2002). Entretanto, as fitases de Escherichia coli e
Peniophora lycii são exceções, pois são 6-fitases (Greiner et al., 1993; Lassen et
al., 2001).
As 3 e 6-fitases possuem distintas especificidades pelo substrato e
liberam diferentes fosfatos de mio-inositol menores (Wyss et al., 1999). Esses
dois tipos de fitases diferem na estrutura, propriedades físico-químicas e
catalíticas (Ullah & Sethumadhavan, 1996).
11
Segundo Zyla et al. (2004), a 3-fitase (A. ficuum) foi mais efetiva do que
a 6-fitase (P. lycii) na desfosforilação e na liberação do cálcio sob condições que
simulavam a digestão no trato intestinal dos frangos de corte. A 6-fitase
apresentou atividade em estreita variação de pH e foi menos estável, em meio
ácido, que a 3-fitase. Igbasan et al. (2000) relataram que a fitase de P. lycii é
menos termoestável e menos resistente à digestão pela pepsina e pancreatina que
a fitase de A. niger. Entretanto, quanto à performance de crescimento,
mineralização óssea e retenção de P, não houve diferença significativa entre os
dois tipos de fitase.
Para uma enzima ser uma fitase ela deve exibir atividade de fosfatase.
Dependendo do perfil pH x atividade e do pH ótimo de catálise, as fitases são
classificadas como fosfatase ácida, neutra ou alcalina (Mullaney & Ullah, 2003).
As fitases ácidas normalmente apresentam pH ótimo entre 4,5 e 6,0 e as
alcalinas em pH próximo a 8,0 (Konietzny & Greiner, 2002).
A maioria dos estudos atuais compreende as fosfatases ácidas com alta
especificidade pelo substrato ácido fítico. Dentro da divisão “fosfatase ácida”,
três classes são descritas de acordo com diferenças estruturais e variações em
suas propriedades catalíticas. São elas: histidina fosfatases ácidas (HFA), fitases
ß-hélice (FBH) e fosfatases ácidas “purple” (FAP) (Mullaney & Ullah, 2003).
A primeira classe é a que possui maior número de representantes, sendo
caracterizada pela presença de uma sequência conservada no sítio ativo
composta por sete aminoácidos (RHGXRXP) e um dipeptídeo cataliticamente
ativo (His361Asp362). Entre as enzimas que pertencem a essa classe, a atividade
específica pelo ácido fítico é variada. Wyss et al. (1999) compararam as
propriedades catalíticas de várias fitases fúngicas e propuseram duas subclasses
HFA. Uma subclasse contempla as fosfatases com ampla especificidade de
substrato, ou seja, aquelas que atuam sobre vários substratos fosfatados, mas
possuem baixa atividade específica pelo ácido fítico. A outra, contém aquelas
12
enzimas com estreita especificidade de substrato, mas com alta atividade
específica por fitato. A fitase phy A de A. niger NRRL 3135, comercializada
como Natuphos, é amplamente conhecida por sua alta atividade específica pelo
ácido fítico (Wodzinski & Ullah, 1996).
As demais classes (FBH e FAP) não possuem a sequência específica do
heptapeptídeo e/ou o dipeptídeo cataliticamente ativo (Ostanin & Etten, 1993).
A FBH é uma classe recentemente descoberta representada pela fitase
phy C de Bacillus subtilis e TS-Phy de Bacillus amyloliquefaciens. Buscas no
banco de dados de proteínas (Protein Data Bank) revelaram não haver nenhuma
outra fosfatase, disponível no banco de dados, com estrutura semelhante à
apresentada pelas phy C e TS-Phy. Essas duas fitases são dependentes de Ca2+
para serem ativas e termoresistentes (Oh et al., 2001).
As fosfatases classificadas como FAP são metaloenzimas. Dentre as
enzimas que representam essa classe apenas a GmPhy, recentemente isolada do
cotilédone de soja (Glycine max L. Merr.) (Hegeman & Grabau, 2001), é a que
apresenta atividade de fitase significativa (Mullaney & Ullah, 2003).
Teoricamente, a hidrólise enzimática completa do fitato gera uma série e
ésteres fosfatos de mio-inositol menores (IP6 → IP5 → IP4 → IP3 → IP2 → IP1)
por meio de uma série de reações de desfosforilação, para produzir o mioinositol (Figura 3) e seis Pi.
É importante notar, entretanto, que as fitases são estereoespecíficas e
apresentam forte preferência pelos grupos fosfatos ligados equatorialmente ao
anel de mio-inositol, sendo o grupo fosfato disposto axialmente no C2 resistente
à hidrólise enzimática (Lei & Porres, 2003). Consequentemente espera-se que a
hidrólise do fitato pela fitase libere como produtos o monofosfato de mioinositol (IP1) e cinco Pi. Todavia, a hidrólise do fitato por fitases exógenas em
frangos de corte não prossegue usualmente nesta dimensão (até IP1) (Wodzinski
& Ullah, 1996; Maenz, 2001).
13
H
OH
OH
H
H
OH
H
H
OH OH
H
OH
FIGURA 3 Estrutura do mio-inositol.
Independente da origem (bacteriana, fúngica ou vegetal) as fitases ácidas
conhecidas hidrolisam, no máximo, 5 dos 6 grupos fosfatos presentes no fitato.
Assim, o mio-inositol fosforilado no C2 + 5Pi têm sido identificados como
produtos finais. Somente em raros casos traços de mio-inositol livre foram
identificados (Wyss et al., 1999). Já a fitase alcalina de B. subtilis, por exemplo,
não é capaz de utilizar como substrato o mio-inositol fosfatado com 3 ou menos
grupos fosfatos presentes no anel. Desta forma, o trifosfato de mio-inostiol + 3Pi
são os produtos finais da hidrólise do fitato pela fitase de B. subtilis (Kerovuo et
al., 2000b).
Até o momento, a elucidação do mecanismo de hidrólise do fitato pela
fitase é conhecida apenas em raros casos (Konietzny & Greiner, 2002).
2.2.4 Local de ação
Comercialmente, a avicultura é um importante segmento da agropecuária
e a necessidade de diminuir os custos de produção tem impulsionado diversas
pesquisas com rações suplementadas com fitase (Bertechini, 2006). Todavia, o
local de atividade da fitase no trato gastrointestinal desses animais tem recebido
14
pouca atenção. Porém, é provável que a maior parte da hidrólise se inicie no
papo tendo continuidade no proventrículo e moela, onde o pH favorece a
atividade das fitases ácidas. O papo é, provavelmente, o local primário da
degradação do fitato pelas fitases exógenas (Kerr et al., 2000). Liebert et al.
(1993) relataram, em estudos com galinhas, que 69-86% da atividade da fitase
microbiana adicionada à ração foi detectada no papo e 31-38% no proventrículo.
Nenhuma atividade foi detectada no intestino delgado. Entretanto, há evidências
de que a fitase derivada de E. coli seja mais ativa no intestino delgado do que a
derivada de P. lycii (Onyango et al., 2005), o que pode ser atribuído à grande
resistência da fitase derivada de E. coli frente às enzimas proteolíticas endógenas
(Igbasan et al., 2000).
Avaliações no íleo e no trato total indicam que a degradação do fitato é
incompleta nos frangos de corte alimentados com rações suplementadas com
fitase. A hidrólise do fitato por fitase de A. niger com atividade de 500FTU kg-1
de ração foi determinada no íleo em dois estudos separados, nos quais as aves
receberam dietas a base de milho e soja. Camden et al. (2001) descreveram que a
fitase degradou 29,3% do fitato presente na dieta, enquanto Tamim et al. (2004)
relataram um valor de 33,5%. Deste modo, esses dois estudos sugerem que a
fitase microbiana não degrada todo fitato presente na dieta de frangos de corte.
Leske & Coon (1999) determinaram a dimensão da hidrólise do fitato em
variadas dietas suplementadas com fitase de A. niger. A suplementação de sete
dietas para frangos de corte com 600FTU kg-1 degradou, em média, 25,4% do
fitato. Já em poedeiras, quando 300FTU kg-1 foi adicionado a três distintas
dietas, o resultado foi de 37,7%.
A forma na qual o fitato residual está presente no intestino é de interesse.
Resultados obtidos in vitro (Frolich et al., 1986) e em suínos (Rapp et al., 2001)
indicam que o fitato residual permanece em grande parte intacto (IP6) com
quantidades relativamente pequenas de ésteres de fosfato mio-inositol menores.
15
Isto é importante porque a capacidade quelante desses ésteres menores é
desproporcionalmente menor que a do IP6. Tem sido mostrado in vitro que, em
relação ao Zn e Cu, as forças de ligação do IP4 e IP3 são menores do que as do
IP6 e IP5 (Persson et al., 1998). Além do mais, a capacidade (in vitro) do fitato
em inibir a pepsina da digestão da caseína e albumina soro bovina é mais
pronunciada para IP5 e IP6, enquanto o IP1 e IP2 não inibiram a atividade da
pepsina (Knuckles et al., 1989).
Há poucas informações descrevendo a hidrólise do fitato durante a
passagem pelo intestino. Após o consumo de uma refeição, é provável que o
ácido fítico fique parcialmente protonado tornando-se susceptível à hidrólise
durante sua residência no estômago ou no papo. Normalmente, o pH ótimo para
a atividade da fitase é próximo a 5,0 estando abaixo do pH efetivo na formação
de complexos ácido fítico-mineral resistentes a fitase. Nas regiões superiores ao
intestino delgado, o pH aumenta favorecendo a formação desses complexos. De
acordo com o anteriormente exposto, Maenz et al. (1999) concluíram, em
estudos in vitro, que a adição de solução de Ca2+ 0,5M não inibiu a fitase
microbiana em pH 5,0. Todavia, observaram uma inibição completa com a
adição de uma concentração bem menor (Ca2+ 0,005M) quando o pH aumentou
para 7,5. Embora de forma indireta, a vitamina D pode interferir positivamente
na atividade da fitase por aumentar a absorção do Ca2+ e, consequentemente,
limitar a formação de complexos insolúveis resistentes à hidrólise enzimática
(Pointillart, 1993).
2.2.5 Fatores físicos e químicos que afetam a estabilidade e a atividade da
fitase
A fitase ideal é aquela que mantém atividade nas diferentes condições
encontradas no trato gastrointestinal e nas condições usadas no processamento
dos alimentos. A ação catalítica de qualquer enzima é determinada por suas
16
estruturas primária, secundária, terciária e quaternária (quando houver).
Alterações de fatores físico-químicos alteram sua estrutura o que pode acarretar
em redução da atividade. Em casos severos, a atividade pode ser totalmente
anulada.
Os benefícios adquiridos com a adição de enzimas exógenas nas dietas
de aves são amplamente documentados (Maenz, 2001; Bertechini, 2006; Selle &
Ravindran, 2007). Entretanto, fatores físicos e químicos podem interferir na
atividade das fitases, conforme descrito a seguir.
2.2.5.1 pH
Mudanças no pH afetam o caráter iônico dos grupos ionizáveis dos
aminoácidos que compõem as fitases alterando sua conformação tridimensional
e, consequentemente, sua atividade catalítica.
Uma segunda fitase (phy B) foi isolada de A. niger NRRL 3135 (Ullah &
Cummins, 1987). Suas propriedades catalíticas diferem da phy A. Quando a phy
B foi isolada pela primeira vez e teve sua atividade de fitase determinada, o
ensaio foi conduzido em pH 5,0 (pH ótimo observado para a phy A). Entretanto,
o pH ótimo para a phy B é menor (pH 2,5) e pouca, ou nenhuma, atividade foi
observada em pH 5,0. Essa baixa atividade no pH 5,0 pode ser entendida
analisando o sítio de especificidade pelo substrato (SES). Kostrewa et al. (1999)
identificaram que o SES da phy B é diferente do SES da phy A. O SES da phy B
é eletrostaticamente mais neutro e, portanto, pode acomodar maior variedade de
substratos que a fitase phy A. Isso também significa que no pH 2,5 o SES da phy
B não está carregado e aceita substratos carregados negativamente; entretanto,
em pH 5,0 está negativamente carregado e repele o substrato carregado
negativamente.
17
2.2.5.2 Temperatura
Outra diferença entre a phy A e phy B de A. niger é que a forma ativa da
phy A é um monômero, enquanto que a forma ativa da phy B é um tetrâmero
(Wyss et al., 1998). Essa estrutura tetramérica inicialmente confere
termoestabilidade à phy B, mas também torna a enzima incapaz de retornar à sua
conformação original depois de ter sido desnaturada pelo calor, diferente do que
acontece com a phy A. Os protômeros individuais são aparentemente incapazes
de reassociar-se à forma ativa depois do tetrâmero phy B ter sido desnaturado.
A peletização das rações (processo mecânico durante o qual há
aglomeração de pequenas partículas por meio de calor úmido entre 70−90°C e
pressão exercida por uma prensa de pelete) melhora a palatabilidade e o valor
nutricional dos alimentos aumentando o consumo e consequentemente, o ganho
de peso e eficiência alimentar das aves em crescimento. Assim, fitases podem
ser acrescentadas à ração antes da peletização (o que permite melhor
homogeneização), mas é necessário que sejam termoresistentes às condições
desse processo. O revestimento químico de fitases tem sido usado para melhorar
sua estabilidade térmica; entretanto, pode comprometer sua atividade no local de
ação. Fitases em meio líquido podem ser adicionadas às rações após a
peletização, mas isso torna o trabalho laborioso e necessita de equipamentos
caros. Assim, pesquisas objetivando aumentar a termoresistência das fitases
utilizam técnicas de biotecnologia (mutações direcionadas, técnicas de
recombinação genética, busca por organismos termofílicos produtores de fitase,
etc) as quais tem se mostrado uma excelente ferramenta para melhorar a
termoresistência de fitases potencias para a utilização na alimentação animal A
termoestabilidade de uma enzima é dada por sua capacidade de resistir à
desnaturação térmica e/ou à habilidade de retornar a sua conformação
tridimensional original depois do processamento térmico (Lei & Porres, 2003).
18
2.2.5.3 Glicosilação e íons metálicos
Várias fitases fúngicas e de origem vegetal são glicosiladas. A manose e
galactose ligadas à extremidade N-terminal da enzima nativa de A. niger NRRL
3135 correspondem a 27,3% de sua massa molecular (Ullah, 1988). A
glicosilação (ou desglicosilação) pode afetar as propriedades catalíticas,
estabilidade e ponto isoelétrico das fitases (Konietzny & Greiner, 2002).
Algumas fitases podem ser inibidas por íons metálicos, mas é difícil
determinar se a inibição é resultado da ligação do metal à enzima ou à formação
de complexo ácido fítico-íon pobremente solúvel. A formação de precipitado
pela adição de Fe2+ ou Fe3+ no ensaio enzimático sugere que há redução na
concentração de substrato ativo pela formação de complexo ácido fítico-Fe
pobremente solúvel (Konietzny et al., 1995). Segundo Konietzny & Greiner
(2002), a maioria das fitases é inibida por Cu2+ e Zn2+.
Maenz et al. (1999) avaliaram o potencial inibitório, em pH neutro, de
diferentes minerais sobre a atividade de fitases microbianas e descreveram a
seguinte ordem de inibição: Zn2+>>Fe2+>Mn2+>Fe3+>Ca2+>Mg2+. Diminuições
no pH acarretaram em redução considerável destes efeitos, pois a protonação dos
grupos fosfatos desloca o mineral convertendo o fitato que estava na forma de
complexos resistentes para formas suscetíveis à fitase (Maenz, 2001).
Por outro lado, certas fitases dependem de certos íons metálicos para
exercerem atividade catalítica. Segundo Kerovuo et al. (2000a), a fitase de B.
subtilis é dependente de Ca+2 e, portanto, a presença de EDTA diminui a
atividade enzimática.
2.2.5.4 Agentes redutores e inibidores
Reagentes redutores tais como 2-mercaptoetanol, ditiotreitol e glutationa
reduzida podem romper ligações dissulfeto. A atividade catalítica é dependente
da conformação tridimensional da enzima assim, a presença de agentes redutores
19
pode reduzir ou até mesmo anular a atividade enzimática. Ullah & Mullaney
(1996) concluíram que as ligações dissulfeto na fitase de A. niger desempenham
importante papel no seu dobramento tridimensional característico.
O fluoreto pode agir como inibidor competitivo em fitases, assim como o
ortofosfato resultante da hidrólise (inibição pelo produto). O molibdato e
vanadato são também conhecidos inibidores de fitases. Acredita-se que esses
derivados de metais de transição exerçam seu efeito inibitório por formarem
complexos que se assemelham à geometria de bi-pirâmide trigonal do estado de
transição (Zhang et al., 1997).
2.2.5.5 Armazenamento
O armazenamento pode acarretar redução da atividade da fitase.
Todavia, praticamente não há relatos na literatura sobre a perda de atividade
enzimática em diferentes formas e durante o período de armazenamento. Além
disso, como há várias fitases disponíveis no mercado não se sabe se todas
perdem atividade, durante o armazenamento, da mesma maneira. Pesquisas com
esses objetivos são importantes, pois permitem que a indústria assegure ao
produtor por quanto tempo e de que forma tal produto pode ser armazenado sem
que haja perdas significativas dos benefícios promovidos pela fitase.
Pizzolante et al. (2002a) determinaram a atividade da fitase de A. niger,
na forma original (como adquirida), em três tipos de armazenamento: no
congelador a 0°C, no refrigerador a 4°C e em temperatura ambiente (TA). A
atividade foi determinada a cada 14 dias durante o período máximo de
armazenamento de 112 dias. Concluíram que o armazenamento da fitase a 0°C
acarretou a maior atividade média durante o período do experimento (5.177FTU
g-1), entretanto, esse valor foi apenas 4,9% maior do que a média observada para
a fitase armazenada em TA (4.935FTU g-1).
Além disso, relataram que a
atividade enzimática da fitase armazenada em TA reduziu em até 7,7% durante o
20
período de armazenamento.
2.2.6 Considerações
O uso da fitase em dietas das aves é uma realidade atual e vem ao
encontro das necessidades de otimização dos custos das rações bem como a
produção animal com responsabilidade ambiental (Bertechini, 2006).
As pesquisas até então realizadas indicam boa eficácia da fitase. Por
outro lado, ainda faltam informações comparativas entre as fitases quanto à
manutenção da atividade em situações químicas e físicas diferentes.
21
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Procedimentos experimentais e fitases utilizadas
O
presente
trabalho
foi
conduzido
no
Laboratório
de
Bioquímica/Departamento de Química/Universidade Federal de Lavras−UFLA,
em três etapas. Na primeira etapa, a atividade enzimática foi determinada em
duas formas de armazenamento das fitases, durante o período máximo de 180
dias. Na segunda, avaliou-se o efeito do pH e temperatura na atividade das
fitases. A última etapa constou de dois experimentos para avaliar o efeito de três
tempos de exposição ao calor sobre a atividade das fitases incorporadas a dois
tipos de rações para frangos de corte, durante um período máximo de
armazenamento de 60 dias em temperatura ambiente.
Foram utilizadas as seguintes enzimas:
a) 6-fitase E.C. 3.1.3.26 (sintetizada pelo microrganismo Aspergillus
oryzae geneticamente modificado pela adição do gene do fungo Peniophora
lycii) com atividade de 5.000FTU g-1, segundo o fabricante.
b) 3-fitase E.C. 3.1.3.8 (produzida por A. niger modificado geneticamente
pela adição do gene que codifica fitase de A. ficuum) com atividade de
10.000FTU g-1, segundo o fabricante.
c) 6-fitase E.C. 3.1.3.26 (sintetizada pela levedura Saccharomyces
cerevisae, sendo que as bactérias Citrobacter brakii e Escherichia coli foram
usadas como microrganismos bases − seleção genética) com atividade de
10.000FTU g-1, segundo o fabricante.
A temperatura e a umidade relativa mínima e máxima do local de
armazenamento foram registradas com o uso de termo-higrômetro digital, a cada
sete dias, durante o período do experimento.
22
3.2 Extração da fitase e determinação da atividade enzimática
A extração da fitase foi feita em tampão acetato 0,25mol L-1 [contendo
0,05% de Triton X-100 (p/v) e 0,05% de albumina do soro bovino (p/v)], em pH
5,0 sob agitação horizontal por 30 minutos na presença de gelo. Após a extração,
a amostra foi centrifugada (2.000 x g por 10 minutos a 4°C) e o sobrenadante
recolhido. A determinação da atividade no sobrenadante baseou-se na ação da
fitase sobre o substrato fitato de sódio 7,5mmol L-1 (C6H6O24P6Na12 − SigmaAldrich), em meio tamponado (tampão acetato 0,25mol L-1; pH 5,0), a 37°C por
quatro diferentes tempos de incubação (máximo de 20 minutos para a
determinação da atividade nas fitases originais; e máximo de 60 minutos no
núcleo e nas rações suplementadas com as fitases). A reação foi interrompida
por uma mistura de três soluções (ácido nítrico 21,67%, molibdato de amônia
0,081mol L-1 e vanadato de amônia 0,02mol L-1) nas proporções de 2:1:1,
respectivamente, com formação de produto amarelo o qual possui absorção
máxima no comprimento de onda de 415nm. O fosfato de potássio foi usado
como padrão (Engelen et al., 1994). O cálculo da atividade foi feito utilizando-se
a inclinação da reta resultante do ensaio com a amostra (absorbância/min) e a
inclinação da reta da curva padrão (absorbância/µmol de P). A atividade da
fitase foi expressa em unidades de FTU, sendo que uma FTU é a quantidade de
Pi liberado (em µmol) em 1 minuto de reação em uma solução de fitato de sódio
7,5mmol L-1; pH = 5,0 e a 37°C.
3.3 Primeira etapa
3.3.1 Armazenamento das fitases
As fitases foram armazenadas em recipientes hermeticamente fechados,
à temperatura ambiente e em quatro repetições cada, nas seguintes formas:
original (como adquirida) e incorporada a um núcleo contendo mistura de
vitaminas, minerais e aminoácidos. A atividade das fitases nas formas originais
23
foi determinada após 0; 60; 90; 120; 150 e 180 dias de armazenamento e
expressa em FTU g-1 de enzima, enquanto que nas formas incorporadas a
atividade foi determinada a cada 30 dias, durante um período máximo de 180
dias de armazenamento, e expressa em FTU kg-1 de núcleo.
3.3.2 Formulação do núcleo
Os componentes do núcleo foram adquiridos separadamente e, em
seguida, misturados com uso de sacos plásticos. A composição percentual dos
ingredientes presentes no núcleo consta na Tabela 1.
TABELA 1 Composição percentual dos ingredientes presentes no núcleo.
Descrição do ingrediente
(%)
Suplemento vitamínico
4,00
Suplemento mineral
4,00
DL- metionina 99%
4,00
Fosfato bicálcico
48,20
Calcário calcítico
20,10
L-lisina 99%
3,45
Cloreto de colina 70%
2,00
Fitase
0,40*
Sal
13,85**
*Taxa de inclusão baseada na fitase com 10.000FTU g-1. **A taxa de inclusão
de sal varia em função da taxa de inclusão da fitase de forma que a taxa de
inclusão final, destes dois componentes, seja igual a 14,25%.
A composição detalhada dos suplementos vitamínico e mineral está
descrita na Tabela 2.
24
TABELA 2 Composição dos suplementos vitamínico e mineral.
Composição do suplemento
vitamínico
Vitaminas
Níveis kg-1
Composição do suplemento
mineral
Minerais
mg kg-1
Vitamina A
12.000.000 UI
Ferro
50.000
Vitamina D3
2.200.000 UI
Cobre
8.500
Vitamina E
30.000 mg
Zinco
70.000
Vitamina K
2.500 mg
Manganês
75.000
Niacina
53.000 mg
Iodo
1.500
Ácido fólico
1.000 mg
Cobalto
Ácido pantotênico
13.000 mg
Biotina
200
110 mg
Vitamina B1
2.200 mg
Vitamina B2
6.000 mg
Vitamina B6
3.300 mg
Vitamina B12
16 µg
Selênio (mineral)
250 mg
3.3.3 Incorporação das fitases ao núcleo de vitaminas, minerais e
aminoácidos
As fitases foram adicionadas ao núcleo na forma em pó com teor de
inclusão de 40.000FTU kg-1 de núcleo. Para assegurar que cada tratamento fosse
suplementado com a mesma atividade de fitase kg-1 de núcleo, cada enzima teve
sua atividade determinada assim que foi adquirida, sendo a resposta (em FTU g-1
de enzima) considerada como a atividade inicial. Assim, o cálculo da quantidade
de fitase adicionada ao núcleo foi feito a partir da atividade inicial de cada
enzima. Portanto, a taxa de inclusão média da fitase de A. oryzae foi de 11,76g
kg-1 de núcleo, enquanto que para a fitase de A. niger foi de 3,74g kg-1 de núcleo.
25
3.4 Segunda etapa
3.4.1 Efeito do pH e da temperatura na atividade das fitases
A determinação da curva de pH foi feita por meio da incubação da fitase
com o fitato de sódio 7,5mmol L-1 a 37°C variando-se os valores de pH (2, 3, 4,
5, 6, 7, 8 e 9), em quatro diferentes tempos de incubação, a fim de se determinar
o pH ótimo que é aquele no qual a enzima apresenta maior atividade catalítica.
Inicialmente, foram utilizados os seguintes tampões: HCl-KCl (pH 2,0); glicinaHCl (pH 2,0 e 3,0); citrato (pH 3,0; 4,0; 5,0 e 6,0); maleato (pH 6,0 e 7,0) e trisHCl (pH 7,0; 8,0 e 9,0). Todavia, não foi determinada atividade em nenhum pH
do tampão citrato, para as três enzimas avaliadas. Assim, o tampão citrato foi
substituído pelo tampão acetato (pH 3,0; 4,0; 5,0 e 6,0), mantendo-se os demais
tampões. Todos os tampões usados nesta etapa foram preparados na
concentração de 0,1mol L-1.
Os ensaios de temperatura foram realizados no pH ótimo préestabelecido para cada fitase com concentração do substrato fixa (7,5mmol L-1),
em quatro diferentes tempos de incubação, nas seguintes temperaturas: 20, 30,
40, 50, 60, 70, 80 e 90°C.
3.5 Terceira etapa
Nem sempre é possível interromper o ciclo de produção normal de
indústrias de ração para que as amostras de experimentos sejam peletizadas.
Portanto, simulações em escalas laboratoriais são necessárias para que seja
possível quantificar as perdas de atividade enzimática após determinados
processamentos térmicos, além de serem importantes para contribuir com a
padronização de metodologias cada vez mais eficientes e próximas da realidade.
3.5.1 Formulação das rações
Na Tabela 3 está descrita a composição das rações.
26
TABELA 3 Composição das rações de acordo com as fases estudadas.
Fases
Inicial
(1 a 7 dias)
588,35
Final
(36 a 42 dias)
658,25
Farelo de soja
360,00
284,00
Óleo de soja
19,40
33,50
Fosfato bicálcico
13,00
8,50
Calcário calcítico
6,00
5,00
Sal
4,40
3,70
DL-metionina 99%
3,60
2,10
L-lisina 99%
2,50
2,20
Suplemento vitamínico
1,00
1,00
Suplemento mineral
1,00
1,00
Cloreto de colina 70%
0,50
0,50
Bacitracina de zinco 10%
0,25
0,25
1.000g
1.000g
Ingredientes
Milho
TOTAL
3.5.2 Incorporação das fitases às rações
As fitases foram adicionadas às rações na forma em pó com teor de
inclusão de 3.000FTU kg-1 de ração. Cada tratamento foi suplementado com a
mesma atividade de fitase, pois o cálculo da quantidade de fitase adicionada à
ração foi feito a partir da atividade determinada na forma original momentos
antes da suplementação, que foi de 1.410FTUg-1 para a fitase de A. oryzae e de
7.946FTU g-1 para a fitase de A. niger. Portanto, a taxa de inclusão média da
fitase de A. oryzae foi de 2,128g kg-1 de ração, enquanto que para a fitase de A.
niger foi de 0,378g kg-1 de ração.
27
3.5.3 Rações suplementadas com fitase, processamento térmico e
armazenamento
Experimento 1: Conduzido com dois tipos de rações para frangos de
corte (fase inicial e fase final − subitem 3.5.1) suplementadas com as fitases
(subitem 3.5.2) sendo estabelecidos quatro tratamentos, com três repetições
cada: rações sem processamento térmico (controle) e submetidas à estufa
ventilada entre 80°C e 85°C por três tempos de exposição ao calor: 4, 8 e 12
minutos. Para cada repetição, 100g de cada ração foram espalhadas sobre uma
bandeja de alumínio (30 x 20cm). Antes da exposição ao calor, as rações (exceto
as do grupo controle) foram umidificadas em 8% (p/p) com o uso de dispersor
de água na tentativa de simular a umidade do processo de peletização no qual há
exposição da ração ao calor úmido. Posteriormente, todas as rações tiveram a
atividade de fitase determinada.
Experimento 2: As rações de fase inicial foram armazenadas em
recipientes hermeticamente fechados à temperatura ambiente, sendo a atividade
das fitases determinada a cada 15 dias, durante um período máximo de 60 dias
de armazenamento.
Como controle de qualidade do experimento, as rações controle e
submetidas a três tempos de exposição ao calor tiveram o teor de umidade
determinado. A atividade das fitases, em ambos os experimentos, foi corrigida
em relação ao teor de umidade e expressa em FTU kg-1 de matéria seca − MS.
3.5.4 Determinação da umidade
O teor de umidade nas rações suplementadas com as fitases foi
determinado por aquecimento em estufa, em temperatura entre 100oC e 105oC,
até peso constante (Association of Official Analytical Chemistry - AOAC,
2000).
28
3.6 Análises estatísticas
Todas as três etapas foram conduzidas em delineamento inteiramente
casualizado (DIC). Na primeira etapa, a estatística foi aplicada de forma
independente para cada enzima. Para cada fitase armazenada na forma original
obteve-se seis tratamentos (0; 60; 90; 120; 150 e 180 dias de armazenamento)
em quatro repetições. Já para as fitases incorporadas ao núcleo, um total de sete
tratamentos (0; 30; 60; 90; 120; 150 e 180 dias de armazenamento), com quatro
repetições cada.
Na segunda etapa, a estatística foi utilizada de forma a analisar o efeito
do pH e da temperatura de forma independente entre si e de forma independente
para cada fitase. Portanto, essa parte do experimento foi realizada inicialmente
com oito tratamentos e quatro repetições. Entretanto, a análise de variância dos
resultados obtidos do ensaio de pH foi feita com 5 valores de pH, excluindo-se 3
em que a atividade foi zero, sem comprometimento da qualidade da pesquisa.
Isso foi feito porque a inclusão desses dados gera equações de regressão de 4o ou
maior grau, as quais não correspondem ao perfil geral de 3o grau (pH x
atividade) observado para a maioria das enzimas. Já a análise de variância dos
resultados obtidos do ensaio do efeito da temperatura foi feita com 5 diferentes
temperaturas para a fitase de A. oryzae; 6 para a de A. niger e 7 para a de S.
cerevisae, excluindo-se apenas valores de atividade iguais a zero, pelo mesmo
motivo citado anteriormente, e também sem comprometimento da qualidade da
pesquisa. Em ambas as etapas, quando a análise de variância foi significativa, se
empregou modelos de regressão para as fontes de variação, a 5% de
probabilidade.
O experimento 1 da terceira etapa foi analisado estatisticamente em
esquema fatorial 2x4, ou seja, dois tipos de ração (fase inicial e fase final) e
quatro tratamentos (ração controle e submetidas a três tempos de exposição ao
calor), com três repetições cada. Os dados foram submetidos à análise de
29
variância, e quando significativa, o teste de Tukey, a 5% de probabilidade, foi
usado para as comparações das médias entre os tratamentos e entre os tipos de
ração de forma independente para cada uma das duas fitases avaliadas (nesse
momento não houve influência do tempo de armazenamento das rações, pois a
determinação da atividade foi feita no mesmo dia em que as rações foram
suplementadas com as enzimas). O experimento 2 desta mesma etapa, foi
conduzido apenas com a ração de fase inicial em parcelas divididas no tempo,
sendo a parcela constituída por 4 tratamentos (ração controle e submetidas a três
tempos de exposição ao calor) e a sub-parcela por 5 tempos de armazenamento
(0; 15; 30; 45 e 60 dias), com três repetições cada. Os dados foram submetidos à
análise de variância e, quando significativa, o teste de Tukey foi usado para as
comparações das médias entre os tratamentos, a 5% de probabilidade. A fonte de
variação tempo de armazenamento foi analisada estatisticamente empregando-se
modelos de regressão (Pimentel Gomes, 1990).
Todas as análises estatísticas foram realizadas com o uso do software
SISVAR (Sistema de Análise de Variância para Dados Balanceados) versão 5.1.
30
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Primeira etapa: armazenamento
A temperatura e a umidade relativa mínima e máxima do local de
armazenamento foram, respectivamente, 18 ± 2°C e 26 ± 2°C; 42 ± 11% e 75 ±
8%.
As determinações da atividade da fitase de S. cerevisae não apresentaram
padrões de repetibilidade, ou seja, a atividade diminuiu e aumentou várias vezes
durante o período de armazenamento avaliado. Portanto, essa etapa está descrita
com as fitases de A. oryzae e A. niger.
A análise de variância da atividade das fitases de A. oryzae e A. niger nas
formas originais, em função do tempo de armazenamento, foi significativa
(P<0,01) (Tabela 1A, Anexos). De um modo geral, foi observado que o aumento
do tempo de armazenamento acarretou diminuição da atividade de ambas as
fitases avaliadas (Figura 4), com redução máxima de até 64,8% para a fitase de
A. oryzae e até 25,7% para a fitase de A. niger.
Neste trabalho, a atividade da fitase de A. niger diminuiu linearmente (R2
de 0,9836) em 16,28% durante os primeiros 112 dias de armazenamento em
temperatura ambiente (TA). Em pesquisa semelhante, Pizzolante et al. (2002a)
relataram uma redução de 7,7% para a mesma fitase e no mesmo período de
armazenamento, entretanto, essa redução foi explicada por uma equação
quadrática com R2 de 0,9491. A perda linear de atividade durante o
armazenamento, provavelmente, é a que melhor representa a realidade, pois
indica que o efeito do tempo sobre a desnaturação enzimática é o mesmo de 1 a
112 dias de armazenamento das fitases.
Adotando a perda de atividade em 20% como tolerável, as fitases de A.
oryzae e A. niger podem ser armazenadas, em TA, nas formas originais por
aproximadamente até 53 e 135 dias, respectivamente.
31
12.000
atividade (FTU g-¹)
y = -15,959x + 10754
10.000
2
R = 0,9836
8.000
6.000
y = -14,546x + 3864,1
4.000
2
R = 0,9811
2.000
0
0
30
60
90
120
150
180
tempo de armazenamento (dias)
A. oryzae
Regressão A. oryzae
A. niger
Regressão A. niger
FIGURA 4 Atividade das fitases de A. oryzae e A. niger, nas formas originais,
em função do tempo de armazenamento.
O armazenamento também acarretou perda de atividade nas duas fitases
incorporadas ao núcleo (P<0,01) (Tabela 2A, Anexos). As curvas e equações
representativas da atividade das fitases incorporadas ao núcleo, em função do
tempo de armazenamento, são apresentadas na Figura 5.
Observou-se que a atividade diminuiu linearmente com o decorrer do
tempo de armazenamento, havendo perda de até 56,06% para a fitase de A.
oryzae e de até 47,50% para a fitase de A. niger.
Desde o início do período de armazenamento, a atividade determinada
no núcleo foi menor do que a esperada (40.000FTU kg-1), provavelmente,
devido à interferência de minerais e/ou vitaminas presentes no núcleo. O núcleo
reduziu a atividade inicial em 16,66% e 17,10% para as fitases de A. oryzae e A.
niger, respectivamente. Como o núcleo contém vários componentes, não é
32
atividade (FTU kg-¹)
40.000
35.000
30.000
y = -84,112x + 32206
25.000
R = 0,9819
2
20.000
15.000
10.000
y = -98,923x + 33139
5.000
R = 0,9858
2
0
0
30
60
90
120
tempo de armazenamento (dias)
A. oryzae
Regressão A. oryzae
150
180
A. niger
Regressão A. niger
FIGURA 5 Atividade das fitases de A. oryzae e A. niger, incorporadas ao
núcleo, em função do tempo de armazenamento.
possível indicar o(s) responsável(eis) pela diminuição da atividade e a
possibilidade de que pode ter ocorrido um somatório de efeitos inibitórios
acarretados por vários componentes do núcleo não pode ser descartada. Além
disso, é difícil determinar se a inibição foi resultado da ligação do composto à
fitase ou à formação (durante o ensaio enzimático) de complexo ácido
fítico−composto indisponível para a catálise enzimática e, portanto, estudos
posteriores são necessários para entender tais questões. Todavia, segundo Wyss
et al. (1999), é provável que os efeitos inibitórios de minerais catiônicos
ocorram, de um modo geral, devido à complexação desses com o substrato ácido
fítico. De acordo com Cheryan (1980), a ordem correspondente à diminuição da
estabilidade do complexo formado (ácido fítico-mineral) de alguns minerais é a
seguinte: Zn2+, Cu2+, Ni2+, Co2+, Mn2+, Ca2+, Fe2+. Dentre esses sete cátions,
apenas o Cu2+ não está presente no núcleo, portanto os demais podem ter
33
complexado com o ácido fítico durante o ensaio para determinação da atividade.
Entretanto, é importante ressaltar que a inibição observada nesta
pesquisa pode ter ocorrido devido ao fato dos componentes estarem presentes,
de um modo geral, em altas concentrações e não se pode afirmar que as fitases
avaliadas não dependem de cofator, pois não apresentaram nenhuma atividade
catalítica quando colocadas na presença de tampão citrato 0,1mol L-1, como será
discutido posteriormente na segunda etapa desta pesquisa.
Pizzolante et al. (2002a) incorporaram, de forma independente, a fitase
de A. niger em suplemento mineral e vitamínico, e determinaram a atividade
enzimática a cada 14 dias, durante 112 dias de armazenamento em TA.
Concluíram que as perdas de atividade foram de até 43,11 e 37,49% para a fitase
armazenada no suplemento mineral e vitamínico, respectivamente. Entretanto, a
média geral da atividade enzimática (durante 112 dias) determinada no
suplemento mineral (3.954FTU g-1) foi semelhante à observada no suplemento
vitamínico (3.841FTU g-1). No presente trabalho, a fitase de A. niger
incorporada ao núcleo teve redução na atividade de 29,25% durante 112 dias de
armazenamento em TA. Essas diferenças nas taxas de redução da atividade
podem ser devido à composição do núcleo usado neste trabalho ser diferente dos
suplementos utilizados por Pizzolante et al. (2002a).
Adotando a perda de atividade em 20% como aceitável e baseando-se na
taxa de suplementação de 40.000FTU kg-1, as fitases de A. oryzae e A. niger
podem ser armazenadas, em TA, nas formas incorporadas ao núcleo por
aproximadamente até 12 e 2 dias, respectivamente.
No geral, a fitase de A. niger foi a enzima que teve menor perda de
atividade, durante 180 dias de armazenamento, em ambas as formas avaliadas.
Para as duas fitases em questão, o armazenamento em TA na forma original é o
mais indicado porque acarreta menor perda de atividade enzimática já que, se as
fitases são armazenadas no núcleo, há redução na atividade provocada pelo
34
tempo de armazenamento e também há perda de atividade inicial acarretada pela
composição do núcleo.
4.2 Segunda etapa: pH e temperatura
4.2.1 pH
Não foi detectada atividade enzimática em nenhum pH do tampão citrato
0,1mol L-1, para as três enzimas avaliadas. Provavelmente, o tampão citrato teve
ação quelante sobre algum cofator. Estudos posteriores são necessários para
confirmar se essas fitases exigem algum cofator e, em caso positivo, determinar
qual molécula desempenha essa função.
É o que demonstra o estudo realizado com a fitase de Bacillus subtilis
VTT E-68013 (Kerovuo et al., 2000a), dependente de cálcio. A enzima foi
completamente inativada quando colocada na presença de EDTA, entretanto, a
atividade foi parcialmente restabelecida quando a enzima foi incubada com
cálcio.
A análise de variância da atividade das três fitases, em função do pH, foi
significativa a 1% de probabilidade (Tabela 3A, Anexos). Assim, como já
esperado, alterações no pH acarretaram variações na atividade enzimática.
A fitase de A. oryzae teve atividade nos tampões acetato (pH 3,0; 4,0 e
5,0) e maleato (pH 6,0), enquanto que a de A. niger foi ativa nos tampões glicina
(pH 3,0), acetato (pH 3,0; 4,0 e 5,0) e maleato (pH = 6,0). Já a enzima de S.
cerevisae apresentou atividade enzimática nos tampões glicina (pH 2,0 e 3,0) e
acetato (pH 3,0; 4,0 e 5,0). Nos casos em que foi determinada atividade
enzimática em dois diferentes tampões, para um mesmo valor de pH, adotou-se a
média entre os dados dos dois tampões (Figura 6).
A fitase de A. oryzae teve maior atividade no pH 4,0, enquanto que as de
A. niger e S. cerevisae apresentaram pH ótimo entre 4,5 e 5,0. Esses resultados
estão coerentes com pesquisas nas quais há relatos de que a maioria das fitases
35
8500
y = -670,25x3 + 6791,4x2 - 20421x + 22883
atividade (FTU g-¹)
7500
R2 = 0,9887
6500
y = -501,23x3 + 4994,6x2 - 13296x + 10733
R2 = 0,9684
5500
4500
3500
2500
1500
y = 250,33x3 - 3981,7x2 + 19750x - 28982
36
R2 = 0,9855
500
-500
0
1
2
3
4
5
6
7
8
pH
A. oryzae
Regressão A. oryzae
A. niger
Regressão A. niger
S. cerevisae
Regressão S. cerevisae
FIGURA 6 Atividade das fitases de A. oryzae, A. niger e S. cerevisae, em função do pH.
conhecidas tem pH ótimo entre 4,0 e 6,0 (Lei & Porres, 2003; Vats & Banerjee,
2004).
O pH ótimo determinado neste trabalho para a fitase de A. oryzae (pH
4,0) foi inferior ao valor de 5,5 descrito na literatura (Shimizu, 1993;
Dvrøáková, 1998). Essa diferença provavelmente é devida a modificações
genéticas (recombinação genética, mutação direcionada, entre outros) que a
fitase de A. oryzae tenha sofrido recentemente, seja no microrganismo produtor
em questão ou no microrganismo doador do gene alterando, consequentemente,
o perfil de pH.
Alguns trabalhos sobre as propriedades catalíticas da fitase de A. niger
relatam dois valores de pH nos quais a enzima apresenta alta atividade: 2,5 e
entre 5,0 − 5,5 sendo o segundo valor de pH o de maior atividade. Ou seja, no
gráfico que representa o perfil da influência do pH, a atividade diminui após o
pH 2,5 e aumenta após pH 4,0 atingindo atividade máxima entre 5,0 − 5,5. Após
esse valor, a atividade reduz com o aumento do pH até perder atividade
totalmente quando o pH é próximo a 7,5 (Wyss et al., 1999; Tomschy et al.,
2000). Esse comportamento pode ser considerado particular, pois a maioria das
enzimas apresenta perfil de pH relativamente simétrico com apenas um pH
ótimo. A explicação para o relatado provavelmente está no fato de que na época
dessas pesquisas, o ensaio enzimático foi feito não com apenas uma única fitase,
mas sim com duas fitases distintas. Essa hipótese é sustentada pelo fato de que o
microrganismo A. niger pode sintetizar duas fitases diferentes, sendo uma
conhecida como phy A (pH ótimo próximo a 5,0) e a outra nomeada como phy
B (pH ótimo de 2,5). Segundo Mullaney & Ullah (2003) a fitase de A. niger
amplamente comercializada trata-se da fitase phy A e a fitase phy B não é
comercializada. Sendo assim, o pH ótimo observado neste trabalho para a fitase
de A. niger (próximo a 5,0) está de acordo com o valor de pH ótimo descrito por
diversos pesquisadores (Maenz, 2001; Mullaney & Ullah, 2003).
37
O pH ótimo determinado nesta pesquisa para a fitase de S. cerevisae
(próximo a 4,5) é semelhante ao pH ótimo determinado em fitase de Citrobacter
braakii (pH 4,0) (Kim et al., 2003) e de E. coli (entre 4,0 e 4,5) (Wyss et al.,
1999; Igbasan et al., 2000).
É provável que o papo e o proventrículo sejam os principais locais de
atividade da fitase (Liebert et al., 1993). O pH no papo dos frangos de corte está
entre 4,0 e 5,0; enquanto que no proventrículo está em torno de 2,5 e 3,5. Além
disso, em pH baixo, há a protonação dos grupos fosfato do ácido fítico
facilitando a hidrólise enzimática (Maenz, 2001). As três fitases deste trabalho
apresentaram pH ótimo menor que 5,0; portanto, abaixo do pH efetivo em
formar complexos ácido fítico-mineral resistentes à hidrólise.
Tendo em vista que os principais locais de ação da fitase são no papo e
proventrículo, quanto maior a atividade enzimática em valores de pH menores
que 5,0 maior será a probabilidade de a fitase exercer, in vivo, significativa ação
catalítica nesses segmentos do trato gastrointestinal. Assim, a fitase de S.
cerevisae foi a que apresentou maior atividade residual em baixos pH, ou seja,
considerando a maior atividade determinada como 100%, a fitase de S. cerevisae
apresentou 92,47; 69,79 e 53,39% da atividade máxima nos pH 4,0; 3,0 e 2,0
respectivamente, ressaltando-se que foi a única das três enzimas que apresentou
atividade no pH 2,0. A fitase de A. oryzae teve 55,39 e 47,69% da atividade
máxima nos pH 5,0 e 3,0; enquanto que a de A. niger atuou com 68,35 e 39,18%
da atividade máxima nos pH 4,0 e 3,0.
4.2.2 Temperatura
Variações na temperatura acarretaram alterações na atividade das três
fitases (P<0,01) (Tabela 4A, Anexos). A fitase de A. oryzae apresentou atividade
crescente até 40°C e a 50°C estava inativa (Figura 7A). Já a de A. niger teve
atividade crescente até aproximadamente 45°C, estando inativa a 60°C. A fitase
38
de S. cerevisae foi a enzima mais termoresistente, pois estava ativa a 60°C,
atividade (FTU g-¹)
sendo sua temperatura ótima de ação observada entre 50 e 60°C (Figura 7B).
3
2
1600
y = -0,297x + 26,188x - 695,11x + 6408,5
1400
R = 0,9998
2
1200
1000
800
600
400
200
0
0
10
20
30
40
50
60
temperatura (°C)
16000
3
14000
atividade (FTU g-¹)
2
y = -0,5537x + 60,587x - 1789,9x + 18309
3
2
R = 0,9938
2
y = -1,2996x + 130,6x - 3785,2x + 37720
12000
2
R = 0,9959
10000
8000
6000
4000
2000
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
temperatura (°C)
A. niger
S. cerevisae
Regressão A. niger
Regressão S. cerevisae
FIGURA 7 Atividade enzimática em função da temperatura. A) A. oryzae e B)
A. niger e S. cerevisae.
39
Ullah et al. (2000) realizaram a caracterização bioquímica da fitase
produzida por Pichia pastoris (geneticamente modificado pelo gene que codifica
fitase de A. fumigatus) e usaram a fitase de A. niger como referência. Segundo
os referidos pesquisadores, ambas fitases não são cataliticamente eficientes em
temperaturas acima de 60°C.
Investigando a influência da temperatura sobre a atividade de fitases
sintetizadas por fungos do gênero Aspergillus, Wyss et al. (1998) relataram que
as fitases de A. fumigatus e A. niger T213 apresentaram temperatura ótima de 50
e 55°C, respectivamente. Além disso, observaram que a partir de 65°C as duas
fitases perderam totalmente a atividade catalítica.
A fitase isolada de C. braakii exibiu temperatura ótima à 50°C (Kim et
al., 2003), enquanto que a temperatura ótima da fitase de E. coli está entre 55 e
60°C (Greiner et al., 1993; Wyss et al., 1999; Igbasan et al., 2000). Portanto, o
valor de temperatura ótima determinado para essas fitases é próximo ao exibido
pela fitase de S. cerevisae neste trabalho (entre 50 e 60°C).
Outro parâmetro que pode ser observado é a variação de temperatura na
qual a fitase tem atividade catalítica. A fitase de S. cerevisae foi a enzima que
apresentou a maior amplitude de ação catalítica em função da temperatura,
estando ativa de 20°C até temperaturas que variam entre 60 e 70°C. Já a fitase
de A. oryzae mostrou-se a enzima com menor amplitude de variação térmica;
enquanto que a fitase de A. niger teve tolerância térmica intermediária entre as
outras duas fitases avaliadas.
Segundo Vats & Banerjee (2004), as fitases geralmente apresentam alta
atividade em temperaturas de 50 a 70°C, embora a temperatura ótima da maioria
dessas enzimas esteja entre 45−60°C. Essa temperatura ótima relativamente alta
faz com que a atividade das fitases não seja máxima no trato gastrointestinal das
aves e suínos (37−40°C). Normalmente, as fitases apresentam baixa atividade
em temperatura ambiente porque adotam uma conformação tridimensional rígida
40
e, portanto, pouco flexível (Lei & Porres, 2003). A fitase de A. oryzae foi a que
mostrou maior atividade residual a 37°C, ou seja, considerando a maior
atividade determinada como 100%, apresentou 98,21% da atividade máxima em
temperatura de 37°C. As fitases de A. niger e S. cerevisae apresentaram,
respectivamente, 79,44 e 58,98% da atividade máxima a 37°C.
4.3 Terceira etapa: processamento térmico das rações e armazenamento
Devido à falta de repetibilidade observada na primeira etapa desta
pesquisa para a fitase de S. cerevisae, esta etapa foi realizada com as enzimas de
A. oryzae e A. niger.
Experimento 1: Fitases incorporadas as rações de frango e submetidas à
processamento térmico.
Não houve diferença significativa tanto para as fontes de variação tipo de
ração e tratamentos, quanto para a interação entre as mesmas (P<0,05) (Tabela
5A, Anexos). Portanto, os dois tipos de rações testados e os diferentes
tratamentos aplicados às rações, de forma independente para cada enzima, não
influenciaram a atividade das fitases de A. oryzae e A. niger (Tabela 4).
Comparando a composição das duas rações para frangos de corte (Tabela
3, subitem 3.5.1), as rações para fase final têm menor percentual de Ca, P e
aminoácidos/proteínas; e maior conteúdo energético (carboidrato/lipídeo).
Portanto, essa variabilidade na composição não acarretou alteração na atividade
das fitases. É importante ressaltar que diferenças no percentual de fitato entre os
dois tipos de rações não interferem nos resultados, pois a determinação da
atividade foi feita com fitato de sódio em concentração alta o suficiente para que
não faltasse substrato durante todo o tempo de incubação com a fitase.
Os diferentes tempos de exposição ao calor avaliados neste experimento
não acarretaram redução na atividade das fitases incorporadas às rações. Já
Pizzolante et al. (2002b) avaliaram o efeito da peletização em ração para frangos
41
TABELA 4 Atividade das fitases de A. oryzae e A. niger, em FTU kg-1 MS*,
incorporadas a dois tipos de rações e submetidas a quatro
tratamentos.
A. oryzae
A. niger
Controle
Ração fase
inicial
3.412
Ração fase
final
3.446
Ração fase
inicial
2.905
Ração fase
final
3.016
4 minutos
3.390
3.344
2.929
3.075
8 minutos
3.499
3.294
2.961
3.131
12 minutos
3.206
3.248
3.208
3.330
Tratamentos
Médias
3.355
3.069
*MS = matéria seca.
de corte, suplementada com a fitase de A. niger e concluíram que a atividade
reduziu em até 56,44%. Entretanto, os detalhes do processo de peletização
(temperatura, tempo) não foram citados.
Embora pouco pertinente, há a hipótese de que os diferentes tempos de
exposição ao calor tenham acarretado desnaturação térmica branda das fitases
permitindo que retornassem à sua conformação tridimensional original quando
submetidas às condições do ensaio de determinação da atividade. Isso foi
reportado por Wyss et al. (1998) os quais suplementaram ração comercial para
frangos de cortes com fitases de A. fumigatus e de A. niger T213 e, em seguida,
peletizaram as rações a 75 e 80°C. Consideraram a atividade determinada a
37°C, antes da peletização, como 100%. Observaram que a recuperação da
atividade enzimática foi mais elevada para a fitase de A. fumigatus (70% na
ração peletizada a 75°C e 50% na peletizada a 80°C) do que para a fitase de A.
niger T213 (60% na ração peletizada a 75°C e 30 % na peletizada a 80°C).
Concluíram que a maior recuperação de atividade determinada na fitase de A.
fumigatus pode ser explicada pela capacidade que a enzima apresenta de retornar
42
à sua conformação tridimensional ativa após a desnaturação térmica.
Além disso, tem-se que antes da exposição ao calor seco as rações foram
umidificadas em 8% (p/p) na tentativa de simular o processo de peletização no
qual há exposição da ração ao calor úmido. Assim, esperava-se que a umidade
determinada nas rações processadas termicamente fosse resultado da umidade
determinada no controle (sem adição de água) + 8 gramas. Entretanto, isso não
foi observado conforme apresentado na Tabela 5.
TABELA 5 Umidade*, em g 100g-1, das rações de fase inicial e final
suplementadas com as fitases de A. oryzae e A. niger.
Tratamentos
A. oryzae
A niger
Controle
11,24 ± 0,79
11,92 ± 0,62
4 minutos
11,76 ± 1,16
12,40 ± 0,76
8 minutos
7,74 ± 0,29
11,63 ± 0,54
12 minutos
7,62 ± 0,34
9,50 ± 0,27
*Média de seis repetições (três referentes às rações de fase inicial e três
referentes às de fase final) ± desvio padrão.
Portanto, durante o processamento térmico a água adicionada e parte da
água presente naturalmente nas rações foram evaporadas. Assim, as rações não
foram submetidas ao calor úmido durante o tempo integral de exposição
indicando que, provavelmente, as fitases avaliadas não são lábeis ao calor seco.
Experimento 2: Fitases incorporadas à ração de fase inicial submetida a
processamento térmico e armazenada
Como o tipo de ração não influenciou a atividade das fitases de A. oryzae
e A. niger, o experimento 2 foi realizado apenas com rações para frangos de
corte na fase inicial.
A temperatura e a umidade relativa mínima e máxima do local de
43
armazenamento foram, respectivamente, 21 ± 1°C e 27 ± 2°C; 52 ± 10% e 78 ±
6%.
Não houve diferença significativa tanto para as fontes de variação
tratamentos e tempo de armazenamento, quanto para a interação entre as
mesmas (P<0,05) (Tabela 6A, Anexos).
A atividade média determinada nas rações de fase inicial suplementadas
com as fitases de A. oryzae e A. niger consta nas Tabelas 6 e 7, respectivamente.
TABELA 6 Atividade da fitase de A. oryzae, em FTU kg-1 MS*, incorporada à
ração para frangos de corte na fase inicial, submetida a quatro
tratamentos e armazenada durante período máximo de 60 dias.
Tempo de armazenamento (dias)
Tratamentos
0
15
30
45
60
Médias
Controle
3.412
3.080
3.007
3.046
2.995
3.108
4 minutos
3.390
2.985
3.111
3.063
3.002
3.110
8 minutos
3.499
3.260
3.097
2.997
3.216
3.214
12 minutos
3.206
3.085
3.111
3.250
3.045
3.139
Médias
3.377
3.103
3.082
3.089
3.065
*MS = matéria seca. Cada valor representa a média de três repetições.
Conforme observado no experimento 1, os diferentes tempos de
exposição ao calor também não acarretaram perda de atividade no experimento
2. Observou-se também que o armazenamento das fitases incorporadas à ração
de frango de corte na fase inicial não acarretou redução da atividade
enzimática.
Verifica-se que as rações suplementadas e submetidas a três tempos de
exposição, deste trabalho, mostraram comportamento semelhante as rações
suplementadas e não peletizadas avaliadas por Pizzolante et al. (2002b),
indicando que o processamento térmico avaliado não simulou o processo de
44
TABELA 7 Atividade da fitase de A. niger, em FTU kg-1 MS, incorporada à
ração para frangos de corte na fase inicial, submetida a quatro
tratamentos e armazenada durante período máximo de 60 dias.
Tempo de armazenamento (dias)
Tratamentos
0
15
30
45
60
Médias
Controle
2.905
3.137
3.078
2.915
3.006
3.008
4 minutos
2.929
2.817
2.956
2.902
3.045
2.930
8 minutos
2.961
2.924
3.035
2.913
3.063
2.979
12 minutos
3.208
2.989
3.084
2.900
2.900
3.016
Médias
3.001
2.967
3.038
2.908
3.004
*MS = matéria seca. Cada valor representa a média de três repetições.
peletização. Esses autores avaliaram, a cada 7 dias, o efeito do armazenamento
(56 dias em TA) sobre a atividade de fitases incorporadas a rações peletizadas e
não peletizadas. Concluíram que as perdas máximas de atividade foram de
7,38% para a ração suplementada com fitase e 18,54% para a ração
suplementada com fitase e posteriormente peletizada, portanto, a redução de
atividade nas rações não suplementadas foi baixa.
De acordo com os resultados deste experimento, as fitases de A. oryzae e
A. niger foram resistentes ao processamento térmico avaliado e o
armazenamento da ração de fase inicial suplementada com as fitases, durante 60
dias em TA, não reduziu a atividade dessas enzimas.
45
5 CONCLUSÕES
O armazenamento das fitases na forma incorporada ao núcleo não é
recomendado. A fitase de Aspergillus niger pode ser armazenada na forma
original, em temperatura ambiente (TA), por 135 dias mantendo 80% da
atividade.
A fitase de A. oryzae apresenta atividade ótima em pH 4,0 e a 40°C; e
maior atividade residual a 37°C. A fitase de A. niger tem pH e temperatura ótima
em pH próximo a 5,0 e 45oC, respectivamente. A fitase de Saccharomyces
cerevisae apresenta maior atividade em pH próximo a 4,5 e em temperaturas
entre 50 e 60°C; tem maior atividade residual em baixos pH e maior amplitude
de ação catalítica em função da temperatura.
As fitases de A. oryzae e A. niger podem ser incorporadas às rações (fase
inicial e final) e ser submetidas a temperaturas de 80 a 85°C, em estufa
ventilada, por até 12 minutos sem perda da atividade enzimática. A ração para
frangos de corte de fase inicial suplementada com as fitases e submetida ao
processamento térmico avaliado pode ser armazenada, em TA, durante 60 dias
sem comprometer a atividade dessas fitases.
46
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55
ANEXOS
Página
TABELA 1A Resumo da análise de variância da atividade das fitases de
A. oryzae e A. niger armazenadas nas formas
originais...............................................................................
57
TABELA 2A Resumo da análise de variância da atividade das fitases de
A. oryzae e A. niger armazenadas nas formas incorporadas
ao núcleo..............................................................................
57
TABELA 3A Resumo da análise de variância da atividade das fitases de
A. oryzae, A. niger e S. cerevisae em função do pH...........
58
TABELA 4A Resumo da análise de variância da atividade das fitases de
A. oryzae, A. niger e S. cerevisae em função da
temperatura.........................................................................
58
TABELA 5A Resumo da análise de variância da atividade das fitases de
A. oryzae e A. niger incorporadas a dois tipos de rações
submetidas a quatro tratamentos.........................................
59
TABELA 6A Resumo da análise de variância da atividade das fitases de
A. oryzae e A. niger incorporadas à ração de fase inicial
submetida a quatro tratamentos e armazenadas durante o
período máximo de 60 dias.................................................
60
56
TABELA 1A Resumo da análise de variância da atividade das fitases de A. oryzae e A. niger armazenadas nas formas
originais.
Quadrado médio
Fonte de variação
Grau de liberdade
A. oryzae
A. niger
Tempo de armazenamento
5
3622360,60**
4350122,54**
Erro
18
55484,50
160898,57
9,78%
4,38%
Coeficiente de variação
**Teste de F significativo a 1% de probabilidade.
57
TABELA 2A Resumo da análise de variância da atividade das fitases de A. oryzae e A. niger armazenadas nas formas
incorporadas ao núcleo.
Quadrado médio
Fonte de variação
Grau de liberdade
A. oryzae
A. niger
Tempo de armazenamento
6
166770585,06**
121064019,40**
Erro
21
2850732,60
1775417,15
6,97%
5,41%
Coeficiente de variação
**Teste de F significativo a 1% de probabilidade.
TABELA 3A Resumo da análise de variância da atividade das fitases de A. oryzae, A. niger e S. cerevisae em função do
pH.
Grau de liberdade
Quadrado médio
FV
A. oryzae
A. niger
S. cerevisae
A. oryzae
A. niger
S. cerevisae
pH
4
4
4
3619968,92**
27447348,90**
31874831,81**
Erro
15
19
19
2154,23
26915,13
329509,44
4,37%
5,07%
12,64%
CV
FV = fonte de variação; CV = coeficiente de variação. **Teste de F significativo a 1% de probabilidade.
58
TABELA 4A Resumo da análise de variância da atividade das fitases de A. oryzae, A. niger e S. cerevisae em função da
temperatura.
Grau de liberdade
FV
Quadrado médio
A. oryzae
A. niger
S. cerevisae
A. oryzae
A. niger
S. cerevisae
Temperatura
4
5
6
1644483,05**
100775971,27**
64758522,24**
Erro
15
18
21
15368,05
36176,94
65491,71
13,17%
2,49%
4,25%
CV
FV = fonte de variação; CV = coeficiente de variação. **Teste de F significativo a 1% de probabilidade.
TABELA 5A Resumo da análise de variância da atividade das fitases de A. oryzae e A. niger incorporadas a dois tipos de
rações submetidas a quatro tratamentos.
Quadrado médio
Fonte de variação
59
Grau de liberdade
A. oryzae
A. niger
Tipo de ração
1
11484,38NS
113025,38NS
Tratamento
3
47262,49NS
113515,93NS
Tipo de ração X tratamento
3
19702,82NS
1055,15NS
Erro
16
130652,54
83417,08
10,77%
9,41%
Coeficiente de variação
NS = não-significativo.
TABELA 6A Resumo da análise de variância da atividade das fitases de A. oryzae e A. niger incorporadas à ração de fase
inicial submetida a quatro tratamentos e armazenadas durante o período máximo de 60 dias.
Quadrado médio
Fonte de variação
60
GL
A. oryzae
A. niger
Tratamento
3
36532,20NS
22731,79NS
Erro a
8
89826,37
61387,90
Tempo de armazenamento
4
207557,63NS
29163,36NS
Tratamento X tempo de armazenamento
12
31240,38NS
29088,17NS
Erro b
32
81892,49
51993,25
9,54% e 9,11%
8,31% e 7,64%
Coeficiente de variação
GL = grau de liberdade. NS = não-significativo.