UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
PROGRAMA DE PÓS -GRADUAÇÃO EM SANEAMENTO,
M EIO AMBIENTE E RECURSOS HÍDRICOS
IMPLICAÇÕES ECOTOXICOLÓGICAS DO CONTROLE QUÍMICO
DE Limnoperna fortunei (Dunker, 1857) (Bivalvia: Mytilidae)
Lângia Colli M ontresor
Belo Horizonte
2014
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
Lângia Colli M ontresor
IMPLICAÇÕES ECOTOXICOLÓGICAS DO CONTROLE QUÍMICO
DE Limnoperna fortunei (Dunker, 1857) (Bivalvia: Mytilidae)
T ese apresentada ao P rograma de P ós-graduação em
Saneamento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos da
Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial
à obtenção do título de Doutor em Saneamento, Meio
Ambiente e Recursos Hídricos.
Área de concentração: Meio Ambiente
Linha de pesquisa: Avaliação de Impact os e Riscos Ambientais
Orientador: Carlos Barreira Mart inez
Co-orientadores: Teofânia H.D.A. Vidigal; Kleber Miranda-Filho
Escola de Engenharia da UFM G
Belo Horizonte
2014
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
AGRADECIMENTOS
Aos meus orientadores Teofânia Vidigal e Carlos Barreira M artinez, por terem acreditado nesta
parceria da biologia e engenharia, a partir da qual surgiu, entre outras coisas, esta tese. Ap rendi
muito com vocês nestes anos de agradável e produtivo convívio! Vocês me deram o sup orte
necessário para realizar as diversas etapas deste trabalho e me apoiaram dentro e fora do
laboratório. Trabalhar com vocês foi uma parceria que deu e continuará dando certo!
À equipe do Lelf (Laboratório de Estudos em Limnoperna fortunei), que está por trás de cada
resultado deste trabalho. Uma equipe coesa e dedicada que comemorou e sofreu junta a cada alegria
e tristeza nos nossos experimentos. E foram muitas... A Dalva Luz, sempre parceira, desde os
primeiros passos do laboratório (e meus também), para o que der e vier. A Nelmara Inês Cordeiro,
que conheci de forma tão conturbada, no meio de tanta estatística, e que para nossa felicidade veio
se somar à equipe. Nossa amizade sobreviveu à calibração do eletrodo de amônia! Juliano M ichel
Araújo, Luciana Gerhard, Cynthia Andrade, Paulo Ricardo Coelho que ajudaram tanto em tantas
etapas importantes deste trabalho. Ao Paulo Roberto de Souza, que foi fundamental durante a
construção do laboratório e que está sempre por perto quando precisamos de socorro! Mesmo que
seja em um final de semana...
A parceria com o Laboratório de Aquacultura da Escola de Veterinária da UFM G foi fundamental
ao desenvolvimento deste trabalho. O professor Kleber M iranda-Filho, que é co-orientador desta
tese, sempre foi muito receptivo ao trabalho em parceria e investiu nesta colaboração e seu aluno de
doutorado M arcio José Silva. Ao amigo e funcionário da Escola de Veterinária, André Almeida
Fernandes, p ela disp onibilidade, apoio e amizade.
A Domingo Rodriguez Fernandez (Itaipu Binacional) por todo o apoio que nos foi oferecido nos
trabalho de campo executados em Itaipu.
A Jairo Pinheiro, professor do Departamento de Biofísica da Universidade Federal Rural do Rio de
Janeiro, pela parceria nos trabalhos com fisiologia de moluscos, e aos seus ex-alunos Victor Tunholi
Alves e Vinícius Tunholi Alves, que ajudaram nos experimentos.
A Adriano Paglia, professor do Departamento de Biologia Geral (ICB/ UFM G), por tudo que tem
me ensinado sobre estatística nos nossos trabalhos em parceria.
A Bruno Rezende de Souza, professor do Departamento de Fisiologia e Biofísica, pela parceria nos
estudos com o peixe zebra. M arco Aurelio Romano-Silva, do Laboratório de Neurociências,
Faculdade de M edicina, UFM G por possibilitar a utilização da infraestrutura do biotério de peixe
zebra de seu laboratório, Daniela Valadão, responsável pelo biotério, e a estudante de mestrado
Erika Kelmer Sacramento, que nos ajudou e ensinou sobre o manejo do peixe zebra... mesmo aos
finais de semana!
A Alfredo H. Wieloch, professor do Departamento de Zoologia, pela parceria nos experimentos
com os p rotistas.
Às amigas e estudantes de pós-graduação do Laboratório de M alacologia (IOC/ Fiocruz) Patrícia
Cantanhede e Aline Schilitz, que identificaram as espécies de Physa e Pomacea utilizadas neste
estudo.
2
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
A todos os integrantes da Rede de Estudos em Limnoperna fortunei, com os quais tenho aprendido
a olhar para o mexilhão dourado sob diferentes perspectivas.
A Iara Melo e Ingrid Coura, da secretaria do PPG-SM ARH, com quem sempre podemos contar.
Ao suporte financeiro Fapemig-Vale (CRA - RDP-00097-10), CNPq e Capes.
E a biodiversidade se resumirá àquelas espécies
mais resistentes... mesmo que comecemos a
mudar de atitude agora.
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Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
RES UMO
O presente trabalho investigou, a partir de uma abordagem ecotoxicológica, o controle químico de
Limnoperna fortunei, o mexilhão dourado. Foram selecionados para serem testados compostos: (1)
que são usados para o controle do mexilhão dourado (M XD-100), (2) considerados eficientes por
outros estudos (NaOH) ou (3) conhecidos por sua ação tóxica para macroinvertebrados límnicos
-
-
(amônia: N-NH 3, nitrito: N-NO 2 , nitrato: N-NO 3 , cloreto de sódio: NaCl). A toxicidade a diferentes
estádios de vida de L. fortunei (larva, recruta e adulto) foi verificada através da concentração letal
mediana (CL50). A resposta comportamental (abertura das valvas) dos adultos também foi avaliada.
Em outra etapa, foi feita uma análise comparativa de dois destes compostos químicos (amônia e
M XD-100) em testes crônicos (21 dias) com recrutas e adultos de L. fortunei, além de testes agudos
em organismos não alvo, incluindo o protista Paramecium caudatum, os moluscos Physa acuta,
Omalonyx matheroni e Pomacea dolioides e os peixes Oreochromis niloticus e Danio rerio.
Esforços devem ser concentrados em busca de alternativas de menor impacto ambiental para o
controle da bioincrustação.
4
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
ABS TRACT
The present research aimed to investigate ecotoxicological aspects of the chemical control of
Limnoperna fortunei, the golden mussel. Among the chemicals chosen to the tests, some are used in
the control of the golden mussel (M XD-100) or were considered effective by other studies (sodium
hydroxide: NaOH), while others are known to have toxic effects on freshwater macroinvertebrates
-
-
(ammonia: NH 3-N, nitrite: NO 2 -N, nitrate: NO 3 -N, sodium chloride: NaCl). Their toxicity to
different life stages of the golden mussel (larvae, juveniles and adults) was tested and the resp ective
LC´s50 were estimated. Behavioral responses (shell gapping) of adult mussels were also evaluated.
Afterwards, two chemicals were selected (ammonia and M XD-100) to a comparative analysis,
including chronic tests (21 days) with juveniles and adults of golden mussel and acute tests with
non-target organisms of different taxa: one protist (Paramecium caudatum), mollusks (Omalonyx
matheroni, Physa acuta and Pomacea dolioides) and fishes (Oreochromis niloticus and Danio
rerio). Efforts should be made in the search for alternatives with lower environmental impacts in
order to control the macrofouling.
5
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
S UMÁRIO
LISTA DE FIGURAS.................................................................................................................8
LISTA DE TABELAS ................................................................................................................9
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍM BOLOS ........................................................10
1
INTRODUÇÃO ................................................................................................................12
1.1
Bioinvasão.................................................................................................................12
1.2
Impactos ecológicos do mexilhão-dourado...............................................................13
1.3
Distribuição geográfica do mexilhão dourado na América do Sul ..........................16
1.4
O controle químico e seus impactos ambientais .......................................................22
2
OBJETIVOS .....................................................................................................................22
2.1
Objetivo geral............................................................................................................22
2.2
Objetivos específicos ................................................................................................23
3
REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................................24
3.1
3.2
3.3
3.4
Biologia do mexilhão dourado .................................................................................24
O p rocesso de invasão: características ambientais e plasticidade fisiológica ...........25
Estudos ecotoxicológicos e proteção ambiental........................................................28
Sensibilidade do mexilhão dourado a compostos químicos......................................30
3.4.1 Sensibilidade do mexilhão dourado ao nitro gênio inorgânico..................................32
3.4.2 Sensibilidade a valores elevados de pH e o uso de NaOH no controle químico do
mexilhão dourado...............................................................................................................34
3.4.3 Sensibilidade do mexilhão dourado a um biocida composto de amônia quaternária e
taninos ..............................................................................................................................34
3.4.4 Sensibilidade do mexilhão dourado ao sal ...............................................................35
3.5 Avaliação das respostas fisiológica em moluscos .............................................................36
3.6 Sobre os outros organismos que foram testados .................................................................37
3.6.1 Ciliados .....................................................................................................................37
3.6.1.1 Paramecium caudatum (Protoctista: Peniculida: Parameciidae) ..................37
3.6.2 M oluscos gastrópodes de diferentes espécies ..........................................................38
3.6.2.1 Physa acuta (Gastropoda: Pulmonata: Phy sidae) .........................................38
3.6.2.2 Pomacea dolioides (Gastropoda: Caenogastropoda: Ampullariidae) ...........39
3.6.2.3 Omalonyx matheroni (Gastropoda: Pulmonata: Succineidae) .....................39
3.6.3 Larvas de peixe ......................................................................................................40
3.6.3.1 Oreochromis niloticus (Linnaeus, 1758) (Perciformes: Cichlidae) ..............40
3.6.3.2 Danio rerio (Hamilton, 1822) (Cyp riniformes:Cyprinidae) .........................41
4
M ETODOLOGIA .............................................................................................................41
4.1 Testes de toxicidade ...........................................................................................................41
4.1.1 Testes com larvas de Limnoperna fortunei ...............................................................43
4.1.2 Testes com recrutas e adultos de Limnoperna fortunei.............................................44
4.1.3 Testes de toxicidade aguda: cálculo da CL50 e estimativa dos limites seguros para
exposição crônica ..............................................................................................................46
4.1.4 Testes de toxicidade aguda: Análise do comportamento evasivo de mexilhão
dourado ..............................................................................................................................46
4.1.5 Testes de toxicidade crônica: Exposição crônica do mexilhão dourado às
concentrações de segurança para a amônia e o MXD-100 e análise do conteúdo de
carboidratos (ênfase glicogênio) .......................................................................................46
6
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
5
4.1.6 Testes de toxicidade aguda com outros organismos .................................................48
4.1.6.1 Testes com protista ciliado Paramecium caudatum...............................................49
4.1.6.2 Testes com juvenis de moluscos gastrópodes (Physa acuta, Pomacea dolioides) 50
4.1.6.3 Testes com desova de molusco gastrópode (Omalonyx matheroni) ......................50
4.1.6.4 Testes com larvas de peixe zebra (Danio rerio) ....................................................51
4.1.6.5 Testes com larvas de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus)...............................52
RESULTADOS.................................................................................................................54
5.1 Ensaios toxicológicos com Limnoperna fortunei...............................................................58
5.2 Exposição crônica do mexilhão dourado às concentrações de segurança para a amônia e o
MXD-100..................................................................................................................................60
5.3 Toxicidade da amônia (N-NH 3) e do MXD-100 a organismos aquáticos ..........................61
6 DISCUSSÃO .....................................................................................................................61
6.1 Toxicidade de diferentes compostos químicos ao mexilhão dourado.................................62
6.2. Resposta comportamental de adultos do mexilhão dourado .............................................69
6.3. Toxicidade da amônia e do M XD-100 a outros organismos aquáticos .............................70
7
8
9
CONCLUSÕES .................................................................................................................61
PERSPECTIVAS ...............................................................................................................61
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................................74
APÊNDICE 01: Artigo em preparação: Invasion history of the golden mussel Limnoperna
fortunei in Brazil inferred from mitochondrial and nuclear DNA (Sari et al. 2014) ................83
APÊNDICE 02: Short-term toxicity of ammonia, sodium Hydroxide and a commercial biocide
to golden mussel Limnoperna fortunei (M ontresor et al. 2013) .............................................124
APÊNDICE 03: M anutenção de Populações Viáveis de Mexilhão Dourado em Laboratório
Visando Estudos de Impacto em Usinas Hidrelétricas (M ontresor et al. 2011) ....................130
APÊNDICE 04: Resultado do cálculo da CL50 do hidróxido de sódio (NaOH) para o mexilhão
dourado (Limnoperna fortunei) .............................................................................................139
APÊNDICE 05: Resultado do cálculo da CL50 do cloreto de sódio (NaCl) para o mexilhão
dourado (Limnoperna fortunei) ..............................................................................................141
APÊNDICE 06: Resultado do cálculo da CL50 do nitrito (N-NO 2-) para o mexilhão dourado
(Limnoperna fortunei) ............................................................................................................143
APÊNDICE 07: Resultado do cálculo da CL50 do nitrato (N-NO 3-) para o mexilhão dourado
(Limnoperna fortunei)............................................................................................................ 146
APÊNDICE 08: Resultado do cálculo da CL50 da Amônia não ionizada (N-NH 3) para o
mexilhão dourado (Limnoperna fortunei) e esp écies não-alvo ..............................................149
APÊNDICE 09: Resultado do cálculo da CL50 do (MXD-100) para o mexilhão dourado
(Limnoperna fortunei) e para espécies não-alvo ....................................................................155
7
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
LIS TA DE FIGURAS
Figura 1. M apa mostrando a cronologia de ocorrência de Limnoperna fortunei no Brasil a partir do
primeiro registro na América do Sul, as p opulações consolidadas e as não consolidadas. As cores no
mapa do Brasil representam as bacias hidrográficas. Fonte: SANTOS et al. (2012) com
modificações.
Ilustração:
Daniel
Coscarelli
18
Figura 2. M apa mostrando a distribuição das usinas hidrelétricas (UHEs) e a potência das mesmas.
A área destacada em amarelo representa a região de ocorrência do mexilhão dourado. Fonte: Atlas
de
Energia
elétrica
do
Brasil
3ª
EDIÇÃO
com
modificações.
www.aneel.gov.br/arquivos/pdf/atlas_p ar2_cap3.pdf
M odificado
de
Aneel,
2008.
20
Figura 3. Porcentagem (IC 95%) de Limnoperna fortunei apresentando as valvas abertas após
serem expostos p or 24 horas a diferentes concentrações de NaOH.
59
Figura 4. Porcentagem (IC 95%) de Limnoperna fortunei apresentando as valvas abertas após
serem expostos p or 24 horas a diferentes concentrações de NaCl.
59
Figura 5. Porcentagem (IC 95%) de Limnoperna fortunei apresentando as valvas abertas após
serem
expostos
por
24
horas
a
diferentes
concentrações
de
N-NO2-.
59
Figura 6. Porcentagem (IC 95%) de Limnoperna fortunei apresentando as valvas abertas após
serem
expostos
por
24
horas
a
diferentes
concentrações
de
N-NO3 .
59
Figura 7. Porcentagem (IC 95%) de Limnoperna fortunei apresentando as valvas abertas após
serem expostos p or 24 horas a diferentes concentrações de N-NH 3.
60
Figura 8. Porcentagem (IC 95%) de Limnoperna fortunei apresentando as valvas abertas após
serem expostos p or 24 horas a diferentes concentrações de M XD-100.
60
8
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
LIS TA DE TABELAS
Tabela 1. As dez maiores usinas em operação no Brasil, região e potência segundo dados da
ANEEL 2008 e a dados sobre a presença do mexilhão dourado. ............................................21
Tabela 2. Limites de tolerância ambiental de Limnoperna fortunei ........................................26
Tabela 3. Características gerais dos testes toxicológicos realizados: organismos testados, número
amostral, duração dos experimentos (h), compostos químicos avaliados e as respectivas
concentrações das soluções-teste ..............................................................................................52
Tabela 4. Concentração letal mediana (CL50) e o intervalo de confiança de 95 % do hidróxido de
sódio (NaOH) para diferentes estádios de vida de Limnoperna fortunei..................................54
Tabela 5. Concentração letal mediana (CL50) e o intervalo de confiança de 95% do cloreto de sódio
(NaCl) para diferentes estádios de vida de Limnoperna fortunei .............................................54
Tabela 6. Concentração letal mediana (CL50) e o intervalo de confiança de 95% do nitrito (N-NO 2-)
para diferentes estádios de vida de Limnoperna fortunei ........................................................55
Tabela 7. Concentração letal mediana (CL50) e o intervalo de confiança de 95 % do nitrato (N-NO 3) para diferentes estádios de vida de Limnoperna fortunei .......................................................55
Tabela 8. Concentração letal mediana (CL50) e o intervalo de confiança de 95% de amônia tóxica
(N-NH3) para diferentes estádios de vida de Limnoperna fortunei e para organismos de outros
táxons ...................................................................................................................................56
Tabela 9. Concentração letal mediana (CL50) e o intervalo de confiança de 95 % de um produto
comercial a base de taninos (M XD-100) para diferentes estádios de vida de Limnoperna fortunei e
para organismos de outros táxons .............................................................................................57
Tabela 10. M edia ± desvio padrão da concentração de carboidratos no tecido de adultos de
Limnoperna fortunei expostos a 0,025 mg/L N-NH 3 e M XD-100 e no tratamento controle.
n=número amostral ..................................................................................................................61
9
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
LIS TA DE ABREVIATURAS , S IGLAS E S ÍMBOLOS
%
°C
µL
µm
‰
ABNT
AES
ANOVA
Ca(OH)2
2+
Ca
CaCO3
CE50
cel/mL
CEMA
CESP
CL50
CL50-24h –
CL50-48h
CL50-72h
CL50-96h
cm
CO2
CONAM A
COPAM
COPEL
DNS
dpf
EPA
EUA
Fisp q
Furnas
g
g.L-¹
g/L
h
HCl 1M .
IBAM A
ind./m2
Itaipu
Porcentagem, partes por cem
Grau Celsius
M icrolitros
M icrômetro
Permilagem, partes por mil
Associação Brasileira de Normas Técnicas
Organização internacional que atua no setor elétrico brasileiro com empresas de
geração, comercialização e distribuição de energia
Análise de variância
Hidróxido de cálcio ou Cal
Íons de Cálcio
Carbonato de Cálcio
Concentração efetiva mediana
Células por mililitro
Conselho Estadual do M eio Ambiente
Companhia energética de São Paulo
Concentração Letal M ediana
Concentração Letal M édia em 24 horas
Concentração Letal M édia em 48 horas
Concentração Letal M édia em 72 horas
Concentração Letal M édia em 96 horas
Centímetros
Dióxido de carbono ou gás carbônico
Conselho Nacional de Meio Ambiente
Conselho Estadual de Política Ambiental
Companhia Paraense de energia
Ácido dinitrosalicilato
Dia após a fertilização
Agência de proteção ambiental – Environmental Protection Agency
Estados Unidos da América
Ficha de informações de segurança de produtos químicos
Usina Hidrelétrica
Gramas
Gramas p or Litro
Gramas p or Litro
Horas
Ácido Clorídrico a um molar
Instituto Brasileiro do M eio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis
Número de indivíduos por metro quadrado
Usina Hidrelétrica binacional
10
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
L
LELf
m
m.s-¹
3
m
MG
mg/L
M in
mL
mm
MW
M XD-100
N
n
NaCl
NaOH
NAT
+
NH 4
NH 4Cl
nm
N-NH 3
N-NO 2
N-NO 3Nº
NO 2
NO 3O
PB
pH
PR
rpm
S
SM A
TCA
UV
UHE
Leste
Laboratório de Estudos de Limnoperna fortunei Centro de Pesquisas
Hidráulicas
M etros
M etros por segundo
M etro cúbico
M inas Gerais
M iligramas por Litro
M inutos
M ililitro
M ilímetros
M egawatt
Nome comercial do Protetor anti-incrustante
Norte
Número amostral
Cloreto de Sódio
Hidróxido de Sódio
Nitrogênio Amoniacal Total
Íon amônio ou amônia ionizada
Cloreto de amônio
Nanômetro
Nitrogênio na forma de amônia
Nitrogênio na forma de nitrito
Nitrogênio na forma de nitrato
Número
Íon nitrito
Íon nitrato
Oeste
Proteína bruta
Potencial hidrogeniônico
Paraná
Rotações por minuto
Sul
Secretaria do M eio Ambiente
Ácido tricloroacético
Radiação Ultravioleta
Usina Hidrelétrica
11
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
1. INTRODUÇÃO
1.1.
Bioinvasão
A biodiversidade vem sofrendo severas alterações devido às atividades humanas que influenciam
diretamente o ambiente - ex. alteração na concentração de CO2 na atmosfera, deposição de
nitrogênio, chuva ácida e outros (SALA et al. 2000). A dispersão de espécies invasoras é um dos
grandes problemas contemporâneos já que estas podem provocar a extinção de espécies nativas,
promover a destruição de habitats, causar danos à saúde humana e animal e comprometer várias
atividades econômicas como a pesca, a agricultura irrigada, os setores elétricos e de abastecimento
de água (M cNEELY 2001, DARRIGRAN & M ANSUR 2009). A bioinvasão gera custos
ambientais e financeiros elevados (SILVA et al. 2004, DARRIGRAN & MANSUR 2009, SOUZA
et al. 2009, DARRIGRAN 2010).
No ambiente aquático, em face ao crescimento do intercâmbio comercial global, considera-se a
descarga de água de lastro a mais importante via de introdução de espécies exóticas em todo o
mundo e uma das grandes ameaças ao equilíbrio ambiental (FERNANDES & LEAL NETO 2006).
SOUZA et al. (2009) ao traçarem um histórico da bioinvasão aquática no Brasil ressaltam pontos
importantes: 1) o aumento no número de eventos de bioinvasão no Brasil nos últimos anos pode ser
resultado do agravamento do problema, ou do aumento das pesquisas sobre o assunto; 2) os dados
existentes para o Brasil não são contínuos e estão mais restritos a determinadas regiões e a
determinadas espécies; 3) embora haja esforços na tentativa de se obter informações sobre as
bioinvasões em águas brasileiras, a maioria das informações sobre bioinvasão são relativas à
América do Norte e a Europa, enquanto outras regiões, como África e América Latina, são pouco
estudadas (SARI et al. 2014 em preparação – APÊNDICE 1). JUNQUEIRA et al. (2009) fizeram
uma revisão sobre a bioinvasão no ambiente marinho no Brasil, levantaram as publicações desde a
década de 80 e indicaram a importância da gestão de espécies invasoras (prevenção, manejo,
detecção precoce, controle e erradicação das espécies já estabelecidas). Estes autores traçaram
diretrizes para a próxima década, como por exemplo: determinação dos efeitos de ordem
econômica, ecológica, social e ambiental relativos à presença de espécies invasoras e estudos sobre
as rotas de invasão. De fato, após o estabelecimento de espécies invasoras em determinado
ambiente, diversos procedimentos de curto, médio e longo prazo, de caráter multidisciplinar, devem
12
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
ser realizados para minimizar os danos causados pela bioinvasão. A complexidade do sistema
“bioinvasão, ambiente e atividade humana” exige uma abordagem científica e tecnológica também
complexa (JUNQUEIRA et al. 2009).
Entre os diferentes grupos de organismos invasores que causam impactos econômicos e ambientais
estão os bivalves de água doce. As recentes invasões de ambientes aquáticos dulcícolas pelos
bivalves Dreissena polymorpha (Pallas, 1835) (Bivalvia: Dreissenidae) conhecido como mexilhãozebra e pelo mexilhão dourado Limnoperna fortunei (Dunker, 1857) (Bivalvia: M ytilidae) colocam
os bivalves entre os invasores que mais causam impactos ecológicos e econômicos (KARATAYEV
et al. 2010). Esforços em diferentes áreas têm sido feitos para entender e controlar estas invasões.
Neste contexto, tem-se enfatizado a conservação dos bivalves nativos (AUGSPURGER et al. 2003,
USEPA 2008) e o controle dos bivalves invasores (M ACKIE & CLAUDI 2010).
1.2. Impactos ecológicos e econômicos do mexilhão-dourado
Limnoperna fortunei é um bivalve de água doce da família M ytilidae, cuja maioria dos
representantes habita o ambiente marinho. Esta espécie, nativa dos rios e estuários do sudeste da
Ásia, invadiu com sucesso a América do Sul, e hoje está distribuída em cinco países: Argentina,
Paraguai, Brasil, Uruguai e Bolívia. Devido à origem marinha da família M ytilidae, L. fortunei
apresenta características reprodutivas (ex. estádios larvais planctônicos) peculiares aos bivalves
marinhos. As larvas são muito pequenas, variando de 80 a 350 µm o que facilita sua dispersão e
transporte (BELZ, et al. 2012). Nas instalações industriais, ainda durante os primeiros estádios de
desenvolvimento, as larvas se fixam, utilizando o filamento de bisso, em praticamente todo tipo de
substrato duro, como rocha, conchas, metal, plástico, vidro, cimento e madeira (SANTOS et al.
2005, DARRIGRAN & M ANSUR 2006, 2009, DARRIGRAN & DAM BORENEA 2011).
A bioincrustação pode ocorrer em diferentes substratos, em decorrência da incrustação de
organismos, que podem pertencer a diversos táxons. O assentamento e crescimento de organismo de
mais de 50 micrômetros de tamanho, sobre qualquer substrato submerso, natural ou artificial é
denominado macrofouling, e pode gerar obstrução de canais e tubulações (DARRIGRAN &
PEREYRA 2011). Em decorrência deste processo, o intervalo de parada de sistemas industriais para
limpeza e para trocas de equipamentos tem diminuído, enquanto a perda de carga nestes sistemas
13
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
tem aumentado. As usinas hidrelétricas (UHEs) têm sofrido diversos prejuízos, o que tem sido
motivo de preocupação, uma vez que estas são as principais geradoras de energia no Brasil.
Devido à sua alta taxa de reprodução, comportamento gregário e capacidade de fixação em,
praticamente, qualquer tipo de substrato ainda quando larva, L. fortunei tem obstruído condutos
forçados (nos quais a pressão é diferente da pressão atmosférica) e livres. Em ambientes naturais
2
(DARRIGRAN, et al., 2005) já foram encontrados em densidades de cerca de 150.000 ind./m e,
em ambientes artificiais, foram encontradas populações com densidades ainda maiores, chegando a
2
aproximadamente 243.000 ind./m (DARRIGRAN et al. 2007).
Entre os problemas relacionados à incrustação por L. fortunei em UHEs pode-se citar a obstrução de
tubulações, filtros, bombas, condensadores e turbinas. Em sistema de abastecimento de água, a
presença de altas densidades do mexilhão dourado confere sabor e odor desagradáveis à água
(RESENDE et al. 2007, DARRIGRAN 2010, SIM EÃO et al. 2011). Em plantas industriais que
utilizam água bruta no sistema de resfriamento, a incrustação de L. fortunei dificulta a troca de
energia térmica, resultando em sup eraquecimento de máquinas. As tubulações de água utilizadas no
resfriamento de máquinas são menores e necessitam constantemente de limpeza. Custos
operacionais, originalmente não previstos, estão entre as consequências geradas pela invasão.
O impacto sobre a fauna local e a alteração das cadeias alimentares também estão entre os
problemas causados por L. fortunei. Os ecossistemas invadidos pelo mexilhão dourado sofrem
diversas modificações físico-químicas e biológicas causadas pela alta taxa de filtração de L.
fortunei, associada à elevada densidade populacional (M ANSUR et al. 2003, DARRIGRAN 2005,
DARRIGRAN & DAM BORENEA 2011). Alterações na composição de espécies têm sido
observadas e incluem o desaparecimento de algumas espécies e o favorecimento de outras. A
alimentação por filtração gera a retirada de partículas da coluna de água e a subsequente deposição
no sedimento em forma de fezes e pseudofezes. A redução da turbidez aumenta a penetração de luz
na coluna de água, causando alterações no plâncton (BOLTOVSKOY et al. 2009). O impacto do
mexilhão dourado na comunidade planctônica, decorrente do hábito filtrador, foi discutido em
FACHINI et al. (2012). Por outro lado, a deposição de matéria orgânica no sedimento favorece a
infauna e prejudica a epifauna endêmica (DARRIGRAN & DAM BORENEA 2011).
14
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
Densas populações de L. fortunei têm causado grande impacto em comunidades de
macroinvertebrados. Estudos em diferentes regiões têm mostrado um aumento da riqueza de
macroinvertebrados, especialmente oligoquetos, hirudíneos e nematódeos. As espécies associadas a
L. fortunei são mais abundantes e, enquanto ocorre um aumento das populações de alguns táxons,
outros táxons claramente declinam (DARRIGRAN & DAM BORENEA 2011). Em um balneário do
Rio do Prata, na Argentina, foi detectado o deslocamento de pelo menos duas espécies de
gastrópodes nativos: Chilina fluminea (M aton, 1809) e Gundlachia concentrica (d’Orbigny, 1835)
(DARRIGRAN, et al. 1998). O mexilhão dourado pode se fixar à concha de outros moluscos,
exercendo assim efeitos deletérios sobre, por exemplo, o gastrópode Pomacea canaliculata
(Lamarck, 1822) e até o bivalve invasor Corbicula fluminea (DARRIGRAN et al. 2000, SANTOS
et al. 2012). Em uma ocasião, foram contabilizados 172 indivíduos de L. fortunei sobre um único
exemplar do bivalve invasor C. fluminea (M ANSUR et al. 2003). A incrustação de L. fortunei sobre
bivalves dificulta a movimentação das valvas e consequentemente a respiração e a alimentação,
levando os organismos incrustados à morte (DARRIGRAN 2005, 2010). A conservação dos
bivalves nativos da América do Sul tem sido motivo de preocupação e diversas espécies estão
ameaçadas (PEREIRA et al. 2014). Os impactos da introdução de L. fortunei e de outros bivalves
invasores no continente é mais um fator que coloca em risco os bivalves nativos (SANTOS et al.
2012, PEREIRA et al. 2014).
Os impactos do mexilhão dourado sobre a ictiofauna também têm sido descritos na literatura.
Devido à ocorrência desta espécie em grandes quantidades em rios e reservatórios, peixes onívoros
têm alterado seus hábitos alimentares passando a se alimentar quase que exclusivamente do
mexilhão dourado (PENCHASZADEH, et al. 2000), o que resulta em modificação de toda a cadeia
trófica destes ecossistemas (DARRIGRAN & DAM BORENEA 2011). No alto do rio Paraguai, o
mexilhão passou a ser utilizado como alimento por peixes pertencentes às famílias Characidae
(Pacu - Piaratus mesopotamicus), Anostomidae (Piau-três-pintas - Leporinus friderici),
Pimelodidae (M andi -Pimelodus maculatus) e Doradidae (Armau - Oxidororas kneri e Armado Ptedoras granulosus), representando de 12% (P. maculatus) até 100% (P. mesopotamicus e L.
friderici) da dieta das espécies estudadas (OLIVEIRA 2003). No reservatório de Itaipu (Rio Paraná)
nos anos de 2005 e 2006, das 36 espécies de peixes analisadas 24 consumiam L. fortunei,
ressaltando o papel dos peixes no controle deste molusco invasor (OLIVEIRA et al. 2010). No caso
da Bacia do Prata, a partir de registros da literatura, foi constatado que 17 esp écies de peixe predam
L. fortunei (DARRIGRAN & DAM BORENEA 2011). Devido à abundância do mexilhão dourado
nos ecossistemas, aqueles peixes que passaram a se alimentar desta espécie, puderam alocar a
15
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
energia que era utilizada para buscar alimento, em outras atividades, como o crescimento e a
reprodução. De fato, a invasão de L. fortunei foi associada ao aumento do estoque de espécies de
importância comercial (BOLTOVSKOY et al. 2006). Além da predação de mexilhões adultos, as
larvas deste molusco também são uma importante fonte de alimento para larvas de 18 espécies de
peixe (BOLTOVSKOY et al. 2014). A presença de mexilhões vivos na porção terminal do sistema
digestório de L. fortunei demonstrou a importância do transporte de peixes vivos, relacionada à
aquicultura, na disp ersão desta esp écie (BELZ 2006; BELZ, et al. 2012).
1.3.
Considerações sobre a distribuição geográfica do mexilhão dourado na América do S ul
A invasão de L. fortunei na América do Sul já foi intensamente discutida (DARRIGRAN &
M ANSUR 2006, 2009; DARRIGRAN 2010). De forma resumida, os principais acontecimentos
foram listados cronologicamente, proporcionando assim uma visão panorâmica deste processo: 1) a
presença da espécie foi detectada pela primeira vez na América do Sul na Argentina, no Rio da
Prata, em 1991 (Balneário Bagliardi, Buenos Aires); 2) a partir daí a espécie invadiu quatro
importantes rios da Bacia do Prata na Argentina; 3) entre 1995-1996 invadiu os rios Paraná e
Paraguai; 4) o primeiro caso de bioincrustação para água doce na América do Sul foi registrado no
final de 1994 na Argentina, sendo sucedido de outros casos em anos seguintes; 5) em 1994 o
mexilhão foi localizado no Rio da Prata em território do Uruguai; 6) em 1996 foi registrado no
Porto de Assunção, no Paraguai; 7) em 1998 na represa de Yacyretá, da usina hidrelétrica (UHE)
binacional, que foi construída no Rio Paraná entre a Argentina e o Paraguai; 8) em 2001 foi
detectado na UHE de Itaipu, que também é uma usina binacional (Brasil-Paraguai) no Rio Paraná;
9) em 2005
foi registrado na UHE binacional de Salto Grande, localizada no Rio Uruguai
(Argentina-Uruguai) e, posteriormente, ainda no mesmo ano, em outras localidades do Uruguai; 10)
em 2002, o mexilhão se dispersou no oeste da Argentina e chegou a plantas nucleares deste país. De
fato, o mexilhão dourado ao final de aproximadamente 10 anos de invasão da América do Sul já
havia alcançado 5 países na seguinte ordem: Argentina (1991), Uruguai (1994), Paraguai (1997),
Brasil (1998) e Bolívia (1998).
No Brasil (Figura 1), considera-se que duas introduções ocorreram praticamente ao mesmo tempo,
uma no M ato Grosso do Sul (Corumbá), devido à intensa navegação fluvial, e outra via água de
lastro, no Rio Grande do Sul (Porto Alegre, no Rio Guaíba) (DARRIGRAN & M ANSUR 2009). A
16
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
figura 1 mostra uma cronologia da invasão na América do Sul, incluindo o Brasil. Até o momento, a
ocorrência de L. fortunei no Brasil está descrita para as bacias dos rios Paraná, Paraguai, Uruguai,
Grande e Lago Guaíba (DARRIGRAN & M ANSUR 2009, SANTOS et al. 2012, AGUDOPADRON 2012). O primeiro registro de L. fortunei no Pantanal ocorreu em 1998 sendo que vários
registros posteriores foram reportados para esta região. A colonização de L. fortunei atingiu o
sistema de bacias hidrográficas Paraná-Uruguai, e atualmente segue expandindo e já se encontra,
por exemplo, na bacia do rio Tietê (São Paulo), na bacia do rio Paranaíba, que faz a divisa dos
Estados de M inas Gerais e Goiás (DARRIGRAN & M ANSUR 2009, SANTOS et al. 2012,
AGUDO-PADRON 2012). Além de afetar várias usinas hidrelétricas (ex. Itaipu e Porto Primavera),
também foram invadidas pelo referido molusco as captações de água do Estado do Rio Grande do
Sul (COLARES et al. 2002, SANTOS et al. 2012). Em algumas usinas instaladas em trechos do
Rio Grande, em M inas Gerais, a presença de L. fortunei também foi documentada (ex. UHE de
Volta Grande). De fato, foram registradas ocorrências em grande parte do Rio Grande, incluindo os
reservatórios das usinas hidrelétricas de Porto Colômbia, M ascarenhas de M oraes e M arimbondo,
na divisa dos estados de M inas Gerais e São Paulo (SANTOS et al. 2012). Em algumas localidades
do país, o mexilhão foi detectado, porém as populações não se estabeleceram (Figura 1) (SANTOS
et al. 2012). Ainda em 2012, a presença de L. fortunei foi notificada no estado de Santa Catarina, no
reservatório entre as UHEs de M achadinho e Barra Grande na Bacia Hidrográfica do Alto do Rio
Uruguai (AGUDO-PADRON 2012). Um ano após o primeiro registro, o mexilhão dourado já
apresenta populações consolidadas nesta localidade, causando problemas nos setores de
refrigeração da UHE de M achadinho, além de continuar avançando na Bacia do Alto do Rio
Uruguai (AGUDO-PADRON
et al. 2012, AGUDO-PADRON &PORTO FILHO 2013,
DARRIGRAN et al. 2012).
http://pt.wikipedia.org/wiki/Rio_Parana%C3%ADba#mediaviewer/Ficheiro:Riodelaplatabasinmap.
png
17
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
Figura 1: M apa mostrando a cronologia de ocorrência de L. fortunei no Brasil a partir do primeiro
registro na América do Sul, as populações consolidadas e não consolidadas. As cores no mapa do
Brasil representam as bacias hidrográficas. Fonte: SANTOS et al. (2012) com modificações e
notificação de AGUDO-PADRON et al. (2012). Ilustração: Daniel Coscarelli.
18
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
No Sul do Brasil foram identificados quatro potenciais vetores de dispersão do mexilhão dourado
(BELZ et al. 2012): 1) o transporte de areia; 2) o deslocamento de embarcações de pesca com
mexilhões incrustados para áreas livres de mexilhão, 3) o transporte de água em barcos de pesca; 4)
em peixes vivos - ex. mexilhões vivos na porção final do intestino de Pterodoras granulosus
(Valenciennes, 1821) (Siluroidei: Doradidae), nome vulgar: abotoado. A intensa navegação fluvial,
o comércio de alevinos e as possibilidades anteriormente citadas, são reportados como as principais
vias de dispersão do mexilhão dourado (FERNANDES et al. 2012). Diante dos p rejuízos causados
por L. fortunei, empresas, principalmente do setor elétrico, tem financiado estudos sobre este
invasor (ex. ITAIPU Binacional, CEMIG, FURNAS, VALE). As modificações ambientais causadas
por uma usina podem favorecer alguns organismos em detrimento de outros. Um ambiente lótico é
transformado em um reservatório, o qual passa a ter múltiplos usos. O avanço do mexilhão dourado
no Brasil coincide com a existência de grandes UHEs. Alguns fatores podem estar relacionados a
esta coincidência:
a) Os reservatórios de UHEs normalmente têm múltiplos usos como, por exemplo, a recreação e a
implantação de ancoradouros para pequenas embarcações. Estas embarcações podem ser oriundas
de diversos locais e através de seu deslocamento, incluindo transporte terrestre, podem carregar os
mexilhões por grandes distâncias. Desta forma o mexilhão dourado pode se estabelecer em novos
ambientes.
b) A formação de reservatórios permite a instalação de um conjunto de eclusas, as quais podem
facilitar o processo de invasão biológica. O mexilhão pode aderir-se ao casco de cargueiros e de
chatas de transporte, os quais têm constituído um importante vetor de transporte na região sudeste
do Brasil. Isso favorece a dispersão do mexilhão dourado ao longo das bacias hidrográficas.
c) O aumento descontrolado do fluxo de pessoas e de materiais de pesca também pode ser um vetor
de entrada de mexilhão nos reservatórios. De fato, existe uma sobreposição da distribuição da
ocorrência de L. fortunei no Brasil (Figura 1) e a existência de grandes UHEs (Figura 2). Pela
análise da Figura 2, pode-se observar no canto sup erior esquerdo, a concentração de UHEs no
Brasil, que tem seu ponto máximo na região compreendida entre os Estados de M inas Gerais,
Goiás, M ato grosso do Sul e São Paulo. Na porção central da Figura 2 (ANEEL 2008), observa-se a
incidência de UHEs com potência instalada sup erior a 4.000 M W. Essas UHEs possuem grandes
19
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
reservatórios, os quais são utilizados em múltiplas atividades. Entre estas, a atividade de recreação é
bastante importante para a movimentação da economia do entorno dos reservatórios.
Figura 2: M apa mostrando a distribuição das UHEs e a potência das mesmas. A área destacada em
amarelo representa a região de ocorrência do mexilhão dourado (SANTOS et al. 2012, AGUDOPADRON & PORTO FILHO 2013). Fonte: Atlas de Energia elétrica do Brasil - 3ª EDIÇÃO com
modificações. www.aneel.gov.br/arquivos/pdf/atlas_p ar2_cap3.pdf - Aneel, 2008.
Considerando que existe uma distribuição coincidente do mexilhão dourado e as UHEs, é
importante enfatizar que o setor energético no Brasil é bastante relevante. No país existem, em
operação, aproximadamente 230 Centrais Geradoras Hidrelétricas (CGHs - com até 1 M W de
potência instalada, com potência total de 120 M W); aproximadamente 320 Pequenas Centrais
Hidrelétricas (PCHs - entre 1,1 M W e 30 M W de potência instalada, totalizando 2,4 mil M W de
potência instalada); e 159 Usinas Hidrelétrica de Energia (UHEs, com mais de 30 M W, com uma
capacidade total instalada de 74, 632 mil M W). A tabela 1 mostra as 10 das maiores UHEs em
operação no Brasil e a situação atual frente ao mexilhão dourado. Até o final de 2008 as UHEs,
independentemente de seu porte, respondiam, por 75,68% da potência total instalada no país
20
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
(ANEEL 2008). O Brasil é o país com maior potencial hidrelétrico do mundo: um total de 260 mil
M W dos quais pouco mais de 30% resultaram em UHEs construídas ou outorgadas. Considerando
dados relacionados ao Plano Nacional de Energia 2030 (ANEEL 2008), o potencial elétrico que
pode ser aproveitado no país é de cerca de 126.000 MW. Desse total, mais de 70% estão associados
às bacias do Amazonas e do Tocantins/Araguaia.
Tabela 1. As dez maiores usinas em operação no Brasil, região e potência segundo dados da
ANEEL 2008 e dados sobre a presença do mexilhão dourado.
Nome
Potência (kW)
Região
Norte
Ano de
notificação da
presença de
L. fortunei
_
Situação
atual da
presença de
L. fortunei
Livre
Tucuruí I e II
8.370.000
Itaipu (parte
brasileira)
6.300.000
Sul
2001
Invadida
Ilha Solteira
3.444.000
Sudeste
2004
Invadida
Xingó
3.162.000
Nordeste
_
Livre
Paulo Afonso IV
2.462.400
Nordeste
_
Livre
Itumbiara
2.082.000
Sudeste
_
Sob ameaça
iminente
São Simão
1.710.000
Sudeste
2003
Invadida
Governador Bento
M unhoz da Rocha
Neto (Foz do Areia)
1.676.000
Sudeste
_
Sob ameaça
iminente
Jup iá (Eng. Souza
Dias)
1.551.200
2004
Invadida
Sudeste
Porto Primavera
1.540.000
Sudeste
2002
Invadida
(Eng. Sérgio M otta)
Fonte: Tabela retirada de ANEEL (2008) com modificações. Dados referentes à presença de L.
fortunei retirados de SANTOS et al. (2012).
21
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
1.4. O controle químico e seus impactos ambientais
A prevenção e o controle de espécies invasoras têm sido um desafio. Diversas alternativas se
mostraram ineficazes ou muito laboriosas e, quando eficientes, com frequência geram impactos
negativos no ecossistema aquático e na biodiversidade local. As metodologias e recursos utilizados
no controle de espécies invasoras em plantas industriais dependentes da captação de água para o seu
funcionamento, quase sempre geram resíduos químicos, os quais, além de serem lançados no
ambiente, ainda podem acelerar a corrosão diminuindo o tempo de vida de equipamentos, bombas e
tubulações. Uma importante revisão sobre métodos de controle dos mexilhões invasores enfatiza
que atualmente o controle químico tem sido utilizado com mais frequência (M ACKIE & CLAUDI
2010). No entanto, estes autores pontuam que, a aplicação destes produtos deve ser cautelosa, pois
pode causar danos aos sistemas hídricos, como por exemplo, a alteração dos padrões de qualidade
de água e a extinção de espécies nativas e, portanto, têm sua utilização ainda muito restrita e em
caráter experimental.
Com a introdução de L. fortunei no Brasil, diversos métodos químicos de controle têm sido
utilizados. Resultados promissores foram alcançados com tratamentos de longo prazo em sistemas
de arrefecimento com hidróxido de sódio (NaOH) e um produto comercial a base de taninos e
amônia quaternária produzido no Brasil (M XD-100 - M axclean Ambiental e Química S.A, Brasil)
(ROLLA & M OTTA 2010, CALAZANS et al. 2012). Neste contexto, a toxicidade do efluente do
sistema de arrefecimento deve ser rotineiramente monitorada, de forma que os padrões exigidos
para efluentes industriais sejam atendidos. No entanto, as implicações ecotoxicológicas do controle
químico do mexilhão dourado no Brasil não têm sido exploradas (M ONTRESOR et al. 2013 –
APÊNDICE 2). A expansão desta espécie no país, bem como em outras áreas da América do Sul e a
consequente expansão do uso de métodos químicos de controle, devem ser cuidadosamente
estudadas, visando à mitigação dos impactos ambientais.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Investigar os efeitos ecotoxicológicos do controle químico de L. fortunei através da análise
comparativa da toxicidade de diferentes compostos ao mexilhão dourado e a organismos não alvo,
22
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visando à mitigação dos impactos ambientais associados ao controle químico desta espécie
invasora.
2.2. Objetivos específicos
Avaliar a toxicidade aguda de alguns compostos químicos (amônia, nitrito, nitrato, hidróxido de
sódio, M XD-100 e cloreto de sódio) ao mexilhão dourado por meio da estimativa da concentração
letal mediana (CL50) para diferentes estádios de vida, em testes com duração de 24 a 96 horas.
Verificar a ocorrência de alterações comportamentais (fechamento de valvas) em adultos de L.
fortunei expostos a diferentes compostos químicos (amônia, nitrito, nitrato, hidróxido de sódio,
M XD-100 e cloreto de sódio).
Análisar comparativamente a sensibilidade de diferentes estádios de vida de L. fortunei aos
químicos testados e avaliar possíveis implicações em estratégias de controle, visando à redução do
impacto ambiental.
Ampliar o conhecimento sobre os limites de segurança de L. fortunei (estimados a partir da CL50
96h) a variáveis físico-químicas da água, visando fornecer subsídios que auxiliem (1) o
desenvolvimento de metodologias de controle, (2) a elaboração de modelos preditivos de expansão
da espécie e (3) o aprimoramento da metodologia de manutenção de L. fortunei em laboratório
através do monitoramento destes parâmetros físico-químicos.
Usar dois químicos selecionados nos testes de toxicidade aguda (M XD-100 e amônia) para testar
possíveis impactos do controle químico do mexilhão dourado em espécies não alvo de diferentes
táxons (o protista ciliado Paramecium caudatum, os moluscos gastrópodes Omalonyx matheroni,
Physa acuta, Pomacea dolioides e os peixes tilápia, Oreochromis niloticus, e peixe zebra, Danio
rerio) a partir de uma abordagem ecotoxicológica comparativa.
Testar os valores de segurança do M XD-100 e da amônia (obtidos na etapa anterior) para L.
fortunei (adultos e jovens) em exposição crônica de 21 dias utilizando como parâmetro a
mortalidade e o conteúdo de carboidratos nos tecidos (dando ênfase aos níveis de glicogênio).
23
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
3. REVIS ÃO DA LITERATURA
3.1. Biologia do mexilhão dourado
Limnoperna fortunei é um bivalve pequeno (2 a 4 cm) que apresenta a concha com o mesmo
formato dos mexilhões marinhos (família M ytilidae). A coloração da concha pode variar de
amarelada até marrom escuro. O formato achatado das valvas e a presença dos filamentos de bisso
favorecem a fixação dos mexilhões e a colonização de substratos duros, com consequente formação
de populações de alta densidade. Estes bivalves epifaunais são dióicos, com machos e fêmeas na
maioria das vezes presentes em proporções bastante semelhantes, no entanto, casos isolados de
hermafroditismo foram reportados (DAM BORENEA & PENCHASZADEH 2006). Os indivíduos
adultos medem aproximadamente 4 cm e vivem cerca de dois a três anos. No primeiro ano de vida
alcançam a maturidade sexual. O comprimento da concha de um animal no primeiro ano de vida é
de aproximadamente 5 mm.
O ciclo de vida do mexilhão inclui um estádio juvenil/adulto bentônico e um estádio larval
planctônico. SANTOS et al. (2005) descrevem as fases do ciclo larval do mexilhão e
resumidamente, os seguintes estádios são reconhecidos: trocófora (comprimento 80-125 µm),
véliger (150-220 µm), pedivéliger (220 a 250 µm) e a pós-larva ou plantígrada (aproximadamente
300 µm), onde a larva inicia a produção dos filamentos de bisso. Ap ós este último estádio larval, os
indivíduos abaixo de 5 mm são denominados recrutas (SANTOS et al. 2008). A fecundação desta
espécie ocorre externamente através de um processo de eliminação de gametas na água
(DARRIGRAN & DAM BORENEA 2006, DAM BORENEA & PENCHASZADEH 2006). A
proximidade de indivíduos machos e fêmeas dentro das rosetas (aglomerados de mexilhões comportamento gregário) facilita o sucesso de fecundação externa. O ciclo de liberação dos gametas
do mexilhão é influenciado pelas condições climáticas e ambientais. A maturação dos gametas sofre
influência de fatores sazonais (DARRIGRAN et al. 1999, DARRIGRAN & DAM BORENEA 2006,
DAM BORENEA & PENCHASZADEH 2006, SANTOS et al. 2012). Desta forma, períodos
contínuos de reprodução são alternados com períodos de repouso. Em localidades diferentes, de
acordo com o clima e com as condições físico-químicas do ambiente, os ciclos reprodutivos do
mexilhão dourado apresentam padrões regionais. De fato, em diferentes localidades estudadas os
ciclos de liberação de gametas e o repouso se alternam de forma característica em cada uma delas
(DARRIGRAN & DAM BORENEA 2006, DAM BORENEA & PENCHASZADEH 2006). O
24
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
estádio larval é o período de maior dispersão e, de acordo com as condições ambientais,
principalmente a temperatura, sua duração pode variar de 30 a 70 dias (DARRIGRAN &
DAM BORENEA 2006, DAM BORENEA & PENCHASZADEH 2006, M ACKIE & CLAUDI
2010). A presença e abundância de larvas em determinado local está associada à densidade das
populações e também as condições químicas (ex. pH, níveis de cálcio), físicas (ex. velocidade da
corrente de água, temperatura) e biológicas (produtividade primária) do ambiente (DARRIGRAN &
DAM BORENEA 2006).
3.2. O processo de invasão: características ambientais e plasticidade fisiológica
O sucesso de uma invasão depende de diversos fatores, alguns deles relacionados ao organismo
(invasiveness), como a plasticidade fisiológica, que confere a algumas espécies a capacidade de
tolerar uma faixa maior de flutuações ambientais. Outros fatores são inerentes ao ambiente a ser
colonizado (invasibility) (DARRIGRAN et al. 2011). No início do processo de invasão do
continente americano, o mexilhão-dourado colonizou regiões temperadas, na foz do Rio da Prata e
posteriormente se expandiu até áreas subtropicais com invernos mais curtos. O mexilhão dourado
pode ser encontrado em águas salinas, com concentrações de sal de até 3‰ (g/L). Os limites de
tolerância da espécie, e as características físico-químicas do ambiente, foram utilizados para (1)
verificar a possibilidade de invasão em tributários Andinos da Bacia do Rio da Prata
(DARRIGRAN et al. 2011), (2) compreender o processo de invasão e as possibilidades de dispersão
em algumas localidades no Rio Uruguai e seus afluentes em uma área de planície de inundação
(Esteros del Iberá) na Argentina (DARRIGRAN et al. 2012), (3) estimar o potencial de dispersão
da espécie na Bacia do Rio Paraguai, onde já ocorre em algumas localidades, para outras bacias
hidrográficas do Brasil e em três grandes bacias norte americanas (OLIVEIRA et al. 2010 b, c, d).
As principais variáveis ambientais que influenciam no estabelecimento de bivalves em ecossistemas
de água-doce são a concentração de cálcio, alcalinidade, pH, oxigênio dissolvido, dureza total,
temperatura, turbidez, condutividade e clorofila a (M ACKIE & CLAUDI 2010). Recentemente, foi
feito um trabalho de revisão sobre os limites de tolerância de L. fortunei (DARRIGRAN et al.
2011), os quais se encontram listados na Tabela 2. No entanto, estes limites foram estabelecidos
com base em observações realizadas em campo. Ensaios em laboratório podem ajudar a melhor
compreender a tolerância ambiental e a sensibilidade do mexilhão dourado a compostos químicos.
25
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
Tabela 2. Limites de tolerância de Limnoperna fortunei
Parâmetros
Salinidade sup erior
Temperatura mais baixa
Temperatura mais alta
Valor
≤ 3 g.L-¹
< 5 g.L-¹
0ºC
5ºC
12°C
31,8°C
33°C
35°C
pH mais elevado
7,22
7,8
pH mais baixo
6,0
6,2
6,3
Cálcio mais elevado
11,60 mg/L
Cálcio mais baixo
1 mg/L
3,96 mg/L
Oxigênio mais baixo
0,2 mg/L
Oxigênio mais elevado
11,33 mg/L
M enor concentração de sólidos
em suspensão
0,0001 g/L
M aior concentração de sólidos
em suspensão
0,214 g/L
Exposição ao ar (ambiente com
umidade elevada)
168 h
72-276 h
Profundidade
40 m
M enor transparência
0,1 m
0,156 m
Velocidade da água sup erior
1,1 m.s-¹
Nota: Dados extraídos de DARRIGRAN et al. (2011).
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Um dos mais importantes parâmetros que limitam a invasão de moluscos é a concentração de
cálcio. Na maioria dos ecossistemas de água-doce as concentrações de Ca2+ são baixas, no entanto,
o cálcio é de grande importância para a formação da concha dos moluscos. O íon cálcio é ainda
necessário em uma série de funções fisiológicas dos moluscos, incluindo a sinalização celular,
regulação ácido-base e contração muscular (BRUSCA & BRUSCA 2003). M oluscos de água-doce
apresentam sofisticados mecanismos de captação, transporte e metabolização do cálcio
(M ACHADO & LOPES-LIMA 2011). Um índice foi criado para indicar a tendência ao equilíbrio
termodinâmico relacionado ao carbonato de cálcio (CaCO3) em uma escala logarítmica na base dez,
considerando a temperatura da água, pH, condutividade, alcalinidade total (GRAN 1952) e cálcio
dissolvido (APHA 2005). Este é denominado índice de saturação da calcita (SIcalcite = calcite
saturation index). Assim, um valor positivo indica um ambiente sup ersaturado e um valor negativo
insaturado (OLIVEIRA et al. 2010 c, d). O p adrão espacial da concentração de cálcio e do potencial
de calcificação foi utilizado por OLIVEIRA et al. (2010c) para construir modelos de nicho
ecológico.
No Brasil, diversos locais apresentam condições favoráveis à colonização por L. fortunei, incluindo
áreas do estuário do Amazonas, e alguns de seus tributários mais ao Sul (Tapajós, Teles Pires,
Araguaia), além da bacia do São Francisco e parte da Bacia do Paraná (Rio Paranaíba) (OLIVEIRA
et al. 2010c). Condições desfavoráveis para o estabelecimento de populações de L. fortunei
incluem, por exemplo, extremos de pH ou temperatura, baixa dureza, alta turbidez, variações físicoquímicas sazonais de grande amplitude, entre outros. Em tributários Andinos da Bacia do Rio da
Prata, as principais barreiras à expansão do mexilhão dourado, segundo DARRIGRAN et al.
(2011), são a salinidade, os sedimentos e as barreiras hidrológicas. Os mesmos fatores citados
acima, além do pH da água, foram utilizados para uma análise de ocorrência e de possibilidade de
dispersão de L. fortunei em tributários dos rios Uruguai e Paraná em uma região de planície de
inundação, na Argentina (DARRIGRAN et al. 2012). O mexilhão dourado apresenta uma amplitude
de tolerância ambiental ainda maior que a do mexilhão-zebra (D. polymorpha), tolerando águas
mais ácidas, de baixa dureza e com altos níveis de poluição (KARATAYEV et al. 2007, 2010).
M odelos preditivos indicam a possibilidade de colonização por L. fortunei nas regiões ao sul e no
centro da América do Norte (KARATAYEV et al. 2007, OLIVEIRA et al. 2010a, DARRIGRAN et
al. 2011), o que causaria perdas econômicas e ecológicas muito maiores do que aquelas já causadas
pelos bivalves invasores D. polymorpha e Corbicula sp . Considerando os impactos econômicos e
ecológicos que podem ser gerados pela expansão da distribuição de L. fortunei, investimentos em
políticas de controle e pesquisa básica e aplicada são bem justificados e urgentes.
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3.3. Estudos ecotoxicológicos e proteção ambiental
A ecotoxicologia estuda diversos aspectos da contaminação ambiental por poluentes naturais ou
artificiais e seus efeitos sobre os organismos vivos (LEBLANC 2004, M AGALHÃES & FERRÃO
FILHO 2008). As pesquisas em ecotoxicologia incluem bioensaios ou testes de toxicidade, nos
quais são avaliadas as respostas, algum dano ou a morte dos organismos testados (M ING-HO
2005). Testes ecotoxicológicos enfocam a relação de causa e efeito entre a concentração de
determinado poluente (ou mistura de poluentes) e os danos a diferentes espécies. Nos testes, os
organismos são expostos a diferentes concentrações de um poluente (químico ou físico) por um
determinado tempo e os efeitos sobre a mortalidade, comportamento, reprodução, crescimento,
morfologia, aspectos fisiológicos e bioquímicos são observados (JAM ES at al. 2000). A
mortalidade e o comportamento são frequentemente utilizados na avaliação da toxicidade de um
composto químico a uma espécie (M AROÑAS & DAM BORENEA 2006; USEPA 2008; SOARES
et al. 2009). Em um cenário global de crescente impacto ambiental, a ecotoxicologia tem se
destacado como um importante campo de estudo, não só para a ampliação do conhecimento
científico, como também para o estabelecimento de medidas regulatórias.
Estudos ecotoxicológicos são essenciais no estabelecimento e no aprimoramento de medidas
preventivas e na determinação dos limites legais para a emissão de efluentes (M ING-HO 2005).
Quanto maior a diversidade de táxons e o número de espécies testadas, melhor o entendimento
sobre os danos causados pelo poluente. Uma vez que organismos distintos apresentam diferentes
níveis de sensibilidade aos compostos químicos, a correta avaliação de risco ambiental resulta do
conhecimento sobre o nível de segurança para diferentes espécies. A escolha, nos testes de
toxicidade, de espécies representativas do ambiente em questão e sensíveis ao poluente testado
assegura que os limites terão efeito protetivo para toda aquela comunidade de organismos
(DOM INGUES & BERTOLETTI, 2006). Para que os testes de toxicidade sejam reprodutíveis e
confiáveis, os métodos para a execução destes devem ser padronizados (ADAM S & ROWLAND
2003, APHA 2005, BERTOLETTI 2009).
A partir de 1970, muitas metodologias foram padronizadas e utilizadas como referência em vários
países. No Brasil, o primeiro procedimento padronizado para execução de testes ecotoxicológicos
com organismos aquáticos foi publicado em 1987, pela Associação Brasileira de Normas Técnicas ABNT (M ARTINS & BIANCHINI 2011). No entanto, até o presente momento, a maior parte dos
testes de toxicidade utiliza os padrões internacionais e, portanto, empregam espécies não nativas. A
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padronização internacional possibilita a comparação de resultados, mas por outro lado, pode gerar
resultados que impliquem em critérios de qualidade de água não protetivos para os organismos e
ecossistemas do Brasil (M ARTINS & BIANCHINI 2011). Entre os organismos utilizados com
maior frequência nos ensaios ecotoxicológicos com efluentes industriais, pode-se citar a bactéria
Vibrio fischeri, as algas Chlorella vulgaris, Scenedesmus subspicatus e Pseudokirchneriella
subcaptata, os microcrustáceos Daphnia similis, Daphnia magna, Ceriodaphnia dubia e
Ceriodaphnia silvestrii, os p eixes Danio rerio e Pimephales promelas (COSTA et al. 2008).
Os limites nacionais para a emissão de efluentes são estabelecidos pela Resolução Nº357/2005 do
Conselho Nacional de M eio Ambiente - CONAM A (BRASIL, 2005). Os testes de toxicidade são
abordados na Resolução Nº 430/2011 (BRASIL, 2011), a qual dispõe sobre as condições e padrões
de lançamento de efluentes; e complementa e altera a Resolução Nº357/2005. Critérios mais
restritivos podem ser adotados nos estados, o que, de fato, ocorre em alguns casos, como, por
exemplo, em São Paulo (Resolução da Secretaria do M eio Ambiente: SM A 03/2000) (SÃO
PAULO, 2000); Paraná (Conselho Estadual do M eio Ambiente: CEMA Resolução N° 081/2010)
(PARANÁ, 2010) e M inas Gerais (Conselho Estadual de Política Ambiental: COPAM Deliberação
Normativa Conjunta Nº01/2008) (M inas Gerais, 2008).
Em relação ao tempo de duração, os ensaios podem ser considerados agudos ou crônicos. Nos testes
de toxicidade aguda, os organismos são expostos por um curto período de tempo (até 96 horas) a,
no mínimo, cinco concentrações da substância tóxica, incluindo concentrações que resultam em 0 a
100% de mortalidade (ADAM S & ROWLAND 2003). Este tipo de teste gera respostas em um
curto intervalo de tempo mediante estimativas do efeito tóxico. Na estimativa da concentração
efetiva mediana (CE50), o valor se refere à concentração capaz de causar alteração comportamental
(usualmente a imobilidade) em 50% dos indivíduos testados. A concentração letal mediana (CL50) é
aquela que causa a mortalidade de 50% dos indivíduos testados. As principais vantagens destes
testes são o curto tempo de duração, o baixo custo e a existência de protocolos amplamente aceitos
e de execução relativamente simples. Por estes motivos estes testes são amplamente difundidos e
fornecem informações que compõem um importante banco de dados ecotoxicológicos.
Em testes de toxicidade crônica, o enfoque é o efeito em longo prazo de concentrações subletais das
substâncias tóxicas investigadas. Nestes casos, busca-se verificar efeitos não letais, os quais são
mais sutis, como alterações na reprodução, no crescimento, no comportamento, em parâmetros
fisiológicos, entre outros (M ING-HO 2005). Testes crônicos abrangendo o ciclo de vida completo
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do organismo são mais complexos e onerosos. Desta forma, são mais difundidos ensaios
abrangendo parte do ciclo de vida ou os estádios iniciais do organismo-teste como embriões, larvas
e juvenis (M cKIM , 1977). Testes de toxicidade crônica de 7 a 21 dias de duração com
microcrustáceos dos gêneros Daphnia e Ceriodaphnia são rotineiramente utilizados na avaliação de
amostras ambientais e para testes de produtos químicos (ARAGÃO & ARAUJO 2006).
3.4. S ensibilidade do mexilhão dourado a compostos químicos e ensaios em laboratório
Ap esar dos impactos causados pelo mexilhão dourado, poucos estudos avaliaram em laboratório a
sensibilidade desta espécie a compostos químicos. O conhecimento sobre a toxicidade de
compostos químicos a esta espécie tem implicações para o controle químico. Devido a sua
semelhança com o mexilhão zebra (D. polymorpha), muitas das alternativas empregadas na
tentativa de solucionar os problemas causados pelo mexilhão dourado, são baseadas nas soluções
aplicadas no combate ao mexilhão zebra. Entretanto, verificou-se que L. fortunei é mais tolerante a
produtos e tratamentos que D. polymorpha (KARATAYEV et al. 2007, M ACKIE & CLAUDI
2010, DARRIGRAN et al. 2011). Com a expansão do mexilhão dourado, é cada vez mais
importante que se conheça sua sensibilidade a compostos químicos que possam ser empregados em
planos de controle. Estes dados podem auxiliar na prevenção da expansão desta espécie e a traçar
estratégias de controle (DARRIGRAN et al. 2011, 2012)
Os testes de toxicidade são uma importante ferramenta na seleção de biocidas. Em principio, testes
toxicológicos podem ser realizados com qualquer espécie aquática, desde que apresente
determinadas características (ex. fácil cultivo e adaptação a condições de laboratório) e que asp ectos
de sua biologia e comportamento sejam conhecidos (COSTA et al. 2008). Experimentos com
bivalves apresentam algumas peculiaridades. Quando ocorre mortalidade não se pode observar
imediatamente uma vez que os animais se fecham dentro das valvas. Em relação ao comportamento,
o repertório dos bivalves é bastante restrito. Recentemente, PEREIRA et al. (2012) fizeram
considerações sobre os procedimentos necessários para os ensaios ecotoxicológicos com bivalves
(especificamente L. fortunei). Estes autores trataram dos critérios de letalidade e de comportamento
que devem ser observados durante os experimentos (como a extensão do sifão e a abertura ou
fechamento das valvas). Critérios para a seleção dos animais que irão compor os grupos
experimentais também foram reportados e validados por diversos autores (COSTELLO et al. 2009,
PEREYRA et al. 2011, 2012, Di FIORI et al. 2012, PEREIRA et al. 2012). Os critérios variam um
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pouco, entretanto, todos visam selecionar exemplares que demonstram estar em boas condições
(como sifão exposto e fixação pelo bisso). Animais que não apresentem sifão exposto, resposta
rápida a estímulo mecânico e que não tenham secretado o bisso, não devem ser utilizados nos
experimentos (COSTELLO et al. 2009, PEREYRA et al. 2011, 2012, PEREIRA et al. 2012).
Os critérios de letalidade variam entre os trabalhos (COSTELLO et al. 2009, PEREYRA et al.
2011). Diante do fechamento total das valvas, para verificar se o animal está morto ou vivo, este
deve ser dissecado. A avaliação da anatomia interna permite verificar o batimento dos filamentos
branquiais (PEREIRA et al. 2012). O critério de letalidade para larvas considera a ausência total de
natação e de atividade interna (verificada por transparência) (PEREYRA et al. 2011,2012). Além
dos critérios de letalidade, o comportamento do mexilhão frente ao componente tóxico é um fator
extremamente importante. O fechamento das valvas na presença de um composto químico foi
denominado de “comportamento evasivo” ( Di FIORI et al. 2012), e visa minimizar o contato do
mexilhão com o toxicante. O comportamento evasivo de L. fortunei frente ao glifosato foi
recentemente avaliado por Di FIORI et al. (2012). Estes autores, no entanto, não detectaram
diferenças significativas entre o comportamento dos animais expostos ao químico e o grupo
controle. Devido ao comportamento evasivo, aplicações intermitentes em baixas concentrações são
geralmente eficientes na prevenção da incrustação de organismos ou bioincrustação, e resultam na
aplicação de menores quantidades de produtos químicos.
No caso de ensaios com larvas de mexilhão, estas devem ser selecionadas de acordo com o estádio
de desenvolvimento em que se encontram. Além disso, deve-se observar se estas apresentam
alguma alteração morfológica ou comportamental (PEREIRA et al. 2012). Estudos sobre o controle
de bivalves invasores indicam que as estratégias de controle voltadas para os estádios larvares
resultam no uso de menores quantidades de biocidas (VERWEEN et al. 2009). Geralmente, os
estádios mais jovens de um organismo são mais sensíveis à toxicidade de compostos químicos. No
caso dos bivalves, indivíduos adultos são relativamente tolerantes a solventes orgânicos e a
pesticidas, e os estádios larvais são muito sensíveis a compostos químicos inorgânicos como cloro,
metais e amônia (AUGSPURGER et al. 2003). Devido à dificuldade de manter estes animais em
laboratório, faltam estudos visando à padronização de testes de toxicidade para os estádios iniciais
de vida de bivalves de água doce.
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A correta manutenção de bivalves em laboratório é um grande desafio técnico. No caso dos ensaios
toxicológicos com mexilhão dourado, para que a confiabilidade dos experimentos seja garantida,
várias medidas tornam-se necessárias, começando pelo constante monitoramento e controle da
qualidade da água até aos cuidados com a produção de alimento (algas unicelulares) e com a
frequência e a quantidade com que este é ofertado durante o período de aclimatação. Assim, a
manutenção em laboratório de populações em boas condições fisiológicas e sanitárias dependerá de
uma série de fatores, que começa pela coleta e transporte dos espécimes até o local de estudo e
envolvem toda uma rotina diária de alimentação e monitoramento da qualidade da água
(M ONTRESOR et al. 2011 – APÊNDICE 03).
Além disso, para que se possa manter uma espécie em cativeiro é essencial que sejam conhecidos
seus limites fisiológicos, de forma que se possa adequar o ambiente do cativeiro para a espécie
estudada. No caso de organismos aquáticos, é essencial que sejam conhecidos os parâmetros ideais
para a manutenção da espécie (ex: pH, temperatura, oxigênio dissolvido, dureza, salinidade,
concentração de amônia, nitrito, nitrato etc.). Ap esar da crescente importância dos estudos em
laboratório com L. fortunei, diversos asp ectos importantes p ara a correta manutenção em laboratório
ainda são desconhecidos.
Os ensaios ecotoxicológicos em laboratório geram resultados que auxiliam também na compreensão
dos limites de tolerância de uma espécie (BERTOLETTI 2009, M ARTINS & BIANCHINI 2011).
No caso de compostos que ocorrem usualmente na água, informações sobre sua toxicidade ao
mexilhão dourado podem auxiliar no desenvolvimento de modelos preditivos da expansão da
espécie e para a padronização e validação de testes de toxicidade. Aspectos físico-químicos afetam
a distribuição desta espécie (ex: temperatura, salinidade, alcalinidade, dureza, pH etc.) e conhecer a
sua faixa de tolerância nos diferentes estádios de vida a compostos químicos auxilia na elaboração
de modelos de predição.
3.4.1. S ensibilidade do mexilhão dourado ao nitrogênio inorgânico
O nitrogênio é um dos elementos químicos mais abundantes do planeta e é um componente
essencial das principais biomoléculas. Nos ecossistemas aquáticos, as formas mais comuns de
nitrogênio inorgânico são os íons NH 4+ , NO 2- e NO3- (amônia ionizada ou amônio, nitrito e nitrato).
A amônia tende a ser oxidada a nitrito e posteriormente a nitrato em um processo oxidante de duas
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etapas (principalmente por bactérias quimioautotróficas) (SHARM A & AHLERT 1977). Nas
últimas décadas, a poluição antrop ogênica tem alterado substancialmente o ciclo do nitrogênio e
resultado em um grande aumento da poluição por nitrogênio orgânico e inorgânico. Os animais
aquáticos são geralmente sensíveis ao nitrogênio inorgânico. Assim, as altas concentrações de
amônia decorrentes das atividades humanas causam impactos ecotoxicológicos diretos e indiretos
sobre os organismos aquáticos (AUGSPURGER et al. 2003; CAM ARGO & ALONSO 2006)
A amônia é uma substância extremamente tóxica para peixes e outros organismos aquáticos
(THURSTON & RUSSO 1981, CAM ARGO & ALONSO 2006). O pH e a temperatura são os
+
principais parâmetros que determinam o equilíbrio químico entre a forma ionizada (NH 4 ) e a não
ionizada (NH 3). Quanto maior o valor destes, maior tendência à formação de NH 3, a qual é mais
solúvel em lipídios e facilmente se difunde pelas membranas celulares, causando efeitos tóxicos
mesmo em baixas concentrações (THURSTON & RUSSO 1981). A toxicidade da amônia varia
amplamente entre os táxons de invertebrados. Estudos de toxicidade à amônia têm revelado que os
bivalves de água doce são particularmente sensíveis a este composto químico (USEPA 2008).
Os efeitos tóxicos de amônia para bivalves de água doce e marinhos têm sido relatados e incluem:
1) redução da quantidade de tempo que as valvas são mantidas abertas para a respiração e
alimentação; 2) secreção prejudicada do fio de bisso e 3) diminuição da ação ciliar e alteração do
metabolismo (REDDY & M ENON 1979, M UMMERT et al. 2003). Além disso, os estádios iniciais
de mexilhões são mais sensíveis do que os adultos ao NH 3, e eles também podem ser mais sensíveis
quando comparados com outros invertebrados e com algumas espécies de peixes (M UM M ERT et
al. 2003, BOARDM AN et al. 2004, CHERRY et al. 2005).
M uitos estudos investigaram os efeitos tóxicos da amônia em espécies de água doce, no entanto, são
relativamente escassos os trabalhos sobre as outras formas comuns de nitrogênio inorgânico, o
nitrito e o nitrato (SOUCEK & DICKNSON 2012). Em ecossistemas de água doce as concentrações
de nitrito e nitrato estão aumentando, em consequência das fontes antrop ogênicas de aporte de
nitrogênio na água. Em locais poluídos, a concentração de nitrito pode exceder 73 mg/L N-NO 2(ALONSO & CAM ARGO 2006), no entanto, a concentração letal mediana (CL50) para diversas
espécies é menor que este valor (SOUCEK & DICKNSON 2012). A partir de dados de toxicidade
aguda foram estabelecidos critérios de qualidade de água adequados à proteção de espécies
sensíveis (ao menos para exposições em curto prazo), segundo os quais, o limite máximo deve estar
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entre 0,08 e 0,35 mg/L N-NO 2- (ALONSO & CAM ARGO 2006). O nitrato é menos tóxico que o
nitrito e que a amônia, assim, seu efeito tóxico é geralmente desconsiderado. No entanto, estudos
-
em laboratório têm mostrado que concentrações de nitrato de 10 mg/L N-NO 3 podem afetar
negativamente espécies sensíveis em exposições crônicas. A partir de estudos com diferentes
-
táxons, o limite máximo recomendado varia entre 2,0 e 3,6 mg/L N-NO 3 (ALONSO &
CAM ARGO 2006).
3.4.2. S ensibilidade a valores elevados de pH e o uso de NaOH no controle químico do
mexilhão dourado
De acordo com DARRIGRAN et al. (2011), L. fortunei ocorre em ambiente com pH entre 6,0 e 7,8.
Valores acima ou abaixo do limite de tolerância podem prevenir o assentamento das larvas
(M ACKIE & CLAUDI 2010). O hidróxido de sódio está sendo considerado como uma ótima opção
para controle do mexilhão dourado em tubulações de sistemas de resfriamento de água. Em relação
a outros métodos de controle químico, o NaOH mostrou-se economicamente mais vantajoso, tendo
demonstrando ainda eficiência na diminuição da bioencrustação causada por outros organismos e na
redução da corrosão química e biológica (LACTEC 2004, M ADER NETTO 2011). A injeção de
NaOH (pH de 8 a 8,5) faz com que os grupos carboxílicos dos ácidos húmicos e compostos
orgânicos sejam ionizados, minimizando a bioincrustação nos sistemas de resfriamento (LACTEC
2004). Em estudos realizados na Usina Hidrelétrica de Salto Caxias, localizada no Estado do
Paraná, M ÄDER NETTO (2011) menciona o controle de 99% da bioincrustação, em 12 meses de
experimento, adicionando ininterruptamente NaOH na tubulação, de forma a manter o pH 9. A
alteração de pH tem sido considerada uma importante estratégia no controle de D. polymorpha e no
tratamento da água de lastro (TENEYEK 2009).
3.4.3. S ensibilidade do mexilhão dourado a um biocida composto de amônia quaternária e
taninos
Alguns compostos a base de taninos têm mostrado uma boa atividade biocida, e baixa toxicidade
ambiental. O M XD-100 é composto por amônia quaternária e taninos e tem sido utilizado no Brasil
para o controle do mexilhão dourado. Os componentes a base de amônia quaternária não são
detectados pelos animais como compostos nocivos. Desta forma, mesmo na presença destes
compostos químicos, os mexilhões continuam com a sua atividade filtradora (sifão exposto)
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(M ACKIE & CLAUDI 2010). O M XD-100 é considerado um biocida biodegradável, não corrosivo
a metais, de baixa toxicidade a seres humanos e à biota aquática (M ÄDER NETTO 2011). Os
resultados do uso do M XD-100 têm sido satisfatórios. Entre os locais onde este biocida foi testado
pode-se citar CESP, Ibitinga da AES Tietê, Governador José Richa da COPEL, Manso de FURNAS
e Itaipu. No entanto, não foi realizada uma avaliação detalhada sobre a eficiência e ou comparação
com outras metodologias (M ÄDER NETTO 2011). Em um estudo comparativo entre o MXD-100 e
o NaOH, este último se mostrou mais eficiente no controle da bioincrustação, além de apresentar
um menor custo, sendo uma boa alternativa de controle químico (M ÄDER NETTO 2011).
Segundo M ÄDER NETTO (2011), é possível manter os sistemas de resfriamento tratados tanto
com M XD-100 quanto com NaOH, operando normalmente em ambientes aquáticos com a presença
de L. fortunei. Em ambos os tratamentos não se observa a redução da vazão do sistema de
resfriamento e nem os aumentos de temperaturas resultantes da bioincrustação pelo mexilhão
dourado. No entanto, o autor ressalta que o uso do NaOH tem um custo menor. A continuidade de
pesquisas avaliando os prós e contras de diferentes estratégias de controle químico irão contribuir
para uma melhor adequação das metodologias de controle em relação aos aspectos econômicos e
ambientais.
3.4.4. S ensibilidade do mexilhão dourado ao sal
Ap esar de ser considerada uma espécie de água doce, o mexilhão dourado ocorre em áreas de
estuário. Estudos em laboratório demonstraram que L. fortunei tem alta tolerância a variações de
salinidade, o que favorece a invasão de novas áreas a partir de água de lastro e a invasão de áreas de
estuário (SYLVESTER et al. 2013). A tolerância a variações de salinidade para vários
invertebrados de água doce tem sido investigada e os níveis de salinidade entre 5 a 8‰ (g/L) têm
sido considerados como o limite sup erior sup ortado por estas espécies, apesar da escassez de
estudos com estes animais (BEREZINA 2003).
Estudos realizados em campo indicam que a sobrevivência e a manutenção do mexilhão dourado
são ameaçadas em salinidades sup eriores a 3‰ (CAPITOLI et al. 2008). Em recente revisão sobre a
tolerância ambiental do mexilhão dourado, foi relatado que para este bivalve, o limite de tolerância
à salinidade foi menor ou igual a 3‰ (DARRIGRAN et al. 2011). Estudos em laboratório indicam
que L. fortunei não consegue sobreviver por mais de quatro dias em salinidades sup eriores a 4‰
(ANGONESI et al. 2008), no entanto, outras variáveis que não foram controladas podem ter
35
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
interferido neste resultado. A capacidade de L. fortunei de sobreviver em ambientes salobros pode
ser evidenciada, por exemplo, pela presença de indivíduos em regiões de água salobra no Rio da
Prata e na Lagoa dos Patos/RS (ANGONESI et al. 2008, SYLVESTER et al. 2013). Em um
trabalho recente, ANGONESI et al. (2008) reforçaram a importância de se estudar a influência da
salinidade na viabilidade de embriões e larvas de L. fortunei.
3.5. Avaliação das respostas fisiológica em moluscos
A avaliação de parâmetros fisiológicos tem sido considerada uma importante ferramenta na
investigação das respostas metabólicas frente ao estresse, inclusive em estudos com moluscos. De
fato, estes organismos apresentam respostas metabólicas mensuráveis quando expostos a condições
estressantes. Dentre as condições de estresse mais estudadas em moluscos, estão as respostas
metabólicas frente a componentes tóxicos como metais traço e compostos naturais (PINHEIRO
2011). Além destas, outras condições de estresse também têm sido avaliadas em bivalves e
gastrópodes, como por exemplo, o parasitismo, jejum severo e alterações na alimentação, no
fotoperíodo e na densidade populacional (PATTERSON et al. 1999, PINHEIRO 2011).
As principais reservas de carboidratos encontradas nos moluscos são o glicogênio e o galactogênio.
As reservas de glicogênio são encontradas nos tecidos moles (musculatura, manto e glândula
digestiva) e sendo as reservas de galactogênio restritas a glândula de albúmen. Como os bivalves
não apresentam glândula de albúmen, em um estudo comparando diferentes dietas, foi mensurado o
conteúdo de glicogênio dos tecidos de L. fortunei (HUDSON 2014). A variação nos níveis de
glicogênio estocado no tecido dos moluscos é um dos parâmetros metabólicos utilizados para
mensurar o estresse nestes animais. Em bivalves, o glicogênio é considerado a fonte primária de
estocagem energética e a quantidade relativa de glicogênio disponível nos tecidos tem sido
considerada um bom indicador da condição do animal (body condition) (PATTERSON et al. 1999).
Como fonte energética, o glicogênio é rapidamente usado quando o organismo é submetido a uma
condição estressante (PINHEIRO 2011). Assim, variações nos níveis de glicogênio têm sido
consideradas um parâmetro que reflete de forma adequada o status energético e de reserva de um
organismo, ou seja, um biomarcador de estresse. Em duas espécies de bivalves de água doce, os
níveis de glicogênio nos tecidos do manto refletiram as alterações metabólicas decorrentes de uma
condição de estivação e de controle alimentar (PATTERSON et al. 1999). Em mexilhões marinhos
(Mytilus edulis) (Bivalvia: M ytilidae), a dosagem de glicogênio em diferentes tecidos foi utilizada
para avaliar as condições fisiológicas em populações deste bivalve, em diferentes condições
36
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
ambientais durante 14 meses (ZWAAN & ZANDEE, 1972). A modificação nos níveis de
glicogênio em diferentes tecidos de Biomphalaria glabrata (Gastropoda: Planorbidae) submetidos
ao estresse químico foi usada com sucesso, validando o uso do glicogênio como biomarcador em
moluscos (ANSALDO et al. 2006).
3.6. S obre os outros organismos que foram testados
Além do mexilhão dourado, espécies pertencentes a outros táxons foram utilizadas como modelo
experimental no presente trabalho. Segue uma descrição sucinta destes táxons e das espécies
utilizadas:
3.6.1. Protistas ciliados
Os ciliados apresentam um importante papel nos ecossistemas, podendo servir de indicador de
mudanças ambientais, além de realizarem funções chave no fluxo de energia e na ciclagem de
elementos (AM ANCHI 2010). Os ciliados, particularmente os paramécios, têm sido utilizados
como modelo há mais de cem anos (M ORANGE 2006). M uitos ciliados planctônicos apresentam
alta taxa reprodutiva, principalmente por reprodução assexuada, são de fácil cultivo e manipulação
em laboratório, características que favorecem sua utilização como organismo teste (WEISSE 2006).
Os ciliados são considerados bons indicadores ou biosensores de poluição ambiental,
principalmente pelo fato de não apresentarem parede celular e de seu genoma ser mais semelhante
ao genoma humano do que outros micro-organismos eucariotos (GUTIERREZ et al. 2003, 2009).
Na ecotoxicologia, ciliados do gênero Paramecium são empregados no estudo dos efeitos da
poluição da água, podendo-se utilizar como parâmetro, o comportamento locomotor, a taxa
reprodutiva, alterações morfológicas e a mortalidade (M IYOSHI et al., 2003; VENKATESWARA
et al. 2006).
3.6.1.1. Paramecium caudatum O.F.Müller, 1786 (Protoctista: Peniculida: Parameciidae)
É uma espécie ubíqua (DRAGESCO & DRAGESCO-KERNÉIS, 1986), de hábito alimentar
bacterívora e algívora, com tolerância à salinidade variando de oligo a meso-eurihalina. Ocorre em
águas estagnadas, correntes e estações de tratamento de esgotos, apresentando boa tolerância a
ambientes eutrofizados, que podem ser alfamesosapróbicos ou polissapróbicos (FOISSNER &
BERGER, 1996). Esta espécie tem sido utilizada em experimentos de toxicologia com solventes
37
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
orgânicos, herbicidas, inseticidas, fungicidas, antibióticos e metais (M IYOSHI et al. 2003;
VENKATESWARA et al. 2006, 2007).
3.6.2. Moluscos gastrópodes de diferentes espécies
Atualmente, moluscos são amplamente utilizados em testes de toxicidade com sedimentos marinhos
(TRAUNSPURGER & DREWS 1996). No entanto, apesar de sua importância ecológica nos
ecossistemas límnicos, poucas espécies são utilizadas em testes de toxicidade (DUCROT et al.
2006). Pesquisas em banco de dados apontam que as esp écies límnicas mais utilizadas em testes são
o gastrópode Lymnaea sp . e o bivalve Dreissena sp . (DUCROT et al. 2006). A relativa simplicidade
dos procedimentos de coleta, transporte e manutenção de gastrópodes, faz com que estes
organismos sejam adequados para estudos em laboratório (MARTINS & BIANCHINI 2011). Além
disso, os moluscos são usualmente abundantes em ecossistemas aquáticos, inclusive no Brasil, o
que reflete sua importância no funcionamento dos ecossistemas. Em um trabalho que avaliou a
tolerância fisiológica relativa a compostos orgânicos e metais a diferentes ordens de
macroinvertebrados, verificou-se que moluscos das classes Bivalvia e Gastropoda estavam entre os
macroinvertebrados mais tolerantes a compostos orgânicos e os menos tolerantes a metais
(WOGRAM & LIEISS 2001).
3.6.2.1. Physa acuta Draparnaud, 1805 (Gastropoda: Pulmonata: Physidae)
Esta espécie de molusco de água doce foi descrita a partir de espécimes coletados na França, mas é
provável que seja originária da América do Norte (DILLON et al. 2002). Acredita-se que as
principais vias de dispersão desta espécie sejam a aquariofilia e a piscicultura. A distribuição
geográfica desta espécie é ampla, podendo ser encontrada em diversos ambientes de água doce,
eutrofizados ou não, em vários continentes como a Europa, Ásia, África, Austrália, América do
Norte, América Central e América do Sul (SANTOS et al. 2012). No Brasil, já foram registradas
ocorrência de P. acuta nas bacias hidrográficas do Atlântico Leste e Sudeste e também do
Tocantins-Araguaia. Estes moluscos toleram ambientes poluídos e existem registros na literatura de
populações em densidades acima de 3000 indivíduos/m2 (APPLETON, 1996; FRANÇA et al.
2007).
3.6.2.2. Pomacea dolioides (Reeve, 1856) (Gastropoda: Caenogastropoda: Ampullariidae)
38
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
Pomacea dolioides (Reeve, 1856) ocorre principalmente mais ao norte do Brasil, sendo encontrada
na bacia do Amazonas, inclusive na Venezuela (HAYES et al. 2009). Esta é uma espécie de
molusco de água doce nativa da América do Sul. A família Ampullariidae, a qual pertence, inclui
espécies que são amplamente distribuídas no continente Sul-Americano, onde constituem a maior
parte da malacofauna límnica. Estes gastrópodes são operculados, e apresentam hábito anfíbio, uma
vez que podem passar parte do tempo fora da água respirando ar atmosférico. A capacidade de
respirar tanto dentro, como fora da água, contribui para o sucesso adaptativo destes moluscos. A
presença do opérculo favorece a estivação deste molusco em condições ambientais desfavoráveis. O
gênero Pomacea distribui-se por toda a região Neotropical, geralmente em grandes densidades
populacionais, habitando coleções hídricas lênticas e estagnadas (THIENGO et al. 2011). Neste
gênero, encontram-se os maiores moluscos de água doce (podem alcançar até 170 mm), os quais
são dioicos, ovíparos e apresentam ovos calcários, que são depositados em cachos fora da água.
Além disso, apresentam ampla tolerância à poluição orgânica, a temperaturas baixas, a dessecação e
a salinidade. As pomáceas são utilizadas como animais ornamentais em aquários, o que favorece
sua dispersão através da aquariofilia. Em algumas partes do mundo, algumas espécies pertencentes
a este gênero se estabeleceram como invasoras devido a sua alta capacidade reprodutiva e
voracidade alimentar (COWIE 2002, THIENGO et al. 2011). Em algumas culturas, estes animais
são utilizados na alimentação e podem atuar na transmissão de nematódeos de importância médica
(YANG et al. 2013).
3.6.2.3. Omalonyx matheroni (Pontiez & Michaud, 1835) (Gastropoda: Pulmonata:
S uccineidae)
O gênero pode ser encontrado em diversos ambientes de água doce, eutrofizados ou não, associados
à margem ou vegetação emergente destes sistemas e ocorrendo, inclusive, em ambientes poluídos.
A distribuição geográfica de Omalonyx é a América do Sul, a leste dos Andes e ilhas das Baixas
Antilhas, no Caribe. No Brasil, encontra-se em todas as regiões do país (TILLIER 1981,
COSCARELLI et al. em preparação). Ap enas em uma, das nove bacias hidrográficas brasileiras,
este gênero não foi ainda registrado: a bacia do rio Uruguai, na região sul. No entanto, a presença de
Omalonyx nesta bacia foi registrada fora do Brasil, perto de Salto, Uruguai (OLAZARRI 1979). No
Brasil, O. matheroni apresenta uma área de ocorrência ampla incluindo toda a Amazônia (região
norte), sudeste e nordeste do país e, recentemente, a região Sul (ARRUDA et al. 2009). Esta espécie
de molusco foi descrita a partir de exemplares coletados na ilha de Guadalupe, nas Baixas Antilhas,
Caribe. São animais hermafroditas que apresentam desova gelatinosa e transp arente, permitindo que
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se visualize o embrião em desenvolvimento no interior do ovo. Uma desova de O. matheroni pode
conter em média 6 a 16 ovos, sendo que os ovos medem aproximadamente 2 mm de diâmetro e
levam de 13 a 20 dias para completar o desenvolvimento (M ONTRESOR et al. 2012).
3.6.3. Larvas de peixe
Os peixes são vertebrados aquáticos frequentemente utilizados como indicadores ambientais.
Ensaios com peixes auxiliam na compreensão sobre os efeitos dos tóxicos sobre vertebrados.
Devido a sua importância econômica e ecológica, existem muitos estudos sobre estes animais. Além
disso, se conhece bem o comportamento e as técnicas de manutenção em laboratório destes animais.
Os testes de toxicidade aguda com peixes são bem difundidos e algumas espécies como “fathead
minnow” Pimephales promelas, paulistinha ou peixe zebra Danio rerio e lebiste ou “guppy”
Poecilia reticulata são utilizadas com frequência. As larvas são normalmente mais sensíveis que os
adultos, desta forma, os testes com larvas têm sido escolhidos ao invés dos testes com adultos.
3.6.3.1. Oreochromis niloticus (Linnaeus, 1758) (Perciformes: Labroidei: Cichlidae)
Esta espécie é conhecida popularmente como tilápia, uma espécie invasora, originária da bacia do
rio Nilo, no Leste da África, que se encontra amplamente disseminada nas regiões tropicais e
subtropicais no Sudeste Asiático, e no Continente Americano (USA, M éxico, Panamá e toda a
América do Sul). No Brasil, foi introduzida em açudes da região Nordeste, difundindo-se para todo
o país. É uma espécie tropical cuja temperatura ideal para seu desenvolvimento varia entre 25 e
30°C. A tilápia é um dos peixes com maior potencial para a aquicultura por apresentar rápido
crescimento e possuir elevado valor comercial, principalmente nos países desenvolvidos. Além
disso, alimenta-se dos itens básicos da cadeia trófica, aceita grande variedade de alimentos,
responde com a mesma eficiência a ingestão de proteínas de origem vegetal e animal, possui
plasticidade fisiológica e é tolerante a doenças. Estas características fazem com que a tilápia seja
capaz de se adaptar a diferentes ambientes e sistemas de produção (AYROSA 2009).
40
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
3.6.3.2. Danio rerio (Hamilton, 1822) (Cypriniformes:Cyprinoidea:Cyprinidae)
O peixe zebra é um peixe pequeno, que habita rios tropicais, sendo nativo dos rios da Índia e sul da
Ásia. É um organismo muito popular como modelo de estudos de desenvolvimento genético,
biomedicina, neurofisiologia e ecotoxicologia. De fato, os embriões de peixe zebra são utilizados
em testes de diferentes químicos. Este peixe tem muitas características que facilitam seu uso como
modelo de estudo, mesmo quando comparados com outros modelos clássicos como os
camundongos e os ratos. Estes atributos são: pequeno tamanho, robustez, apresentam ovos e larvas
transparentes que facilitam a visualização e o acompanhamento do desenvolvimento, sem que haja a
necessidade do uso de equipamentos sofisticados. A fertilização é externa, os embriões são
facilmente manipulados e as alterações no desenvolvimento, facilmente observadas ao microscópio
óptico. A fecundidade é alta e o crescimento é rápido; a organogênese ocorre em 36 horas e as
larvas são bem móveis com 2-3 dias pós-eclosão (SPENCE et al. 2008; SCHOLZ et al. 2008).
Atualmente existem disponíveis muitas informações genômicas e fisiológicas sobre esse animal.
4. METODOLOGIA
4.1. Testes de toxicidade
Foram selecionados alguns compostos químicos para a realização dos testes de toxicidade aguda.
Foram realizados testes semi-estáticos com renovação total da solução a cada 24 horas. A duração
dos testes variou de 24 a 96 horas, dependendo das características do organismo e/ ou do estádio de
desenvolvimento deste. As concentrações testadas, em triplicata, no experimento definitivo (Tabela
3) foram selecionadas com base em experimentos-piloto. Inicialmente, os testes foram realizados
em diferentes estádio de vida de L. fortunei. Em uma segunda etapa, os compostos com potencial
aplicação no controle do mexilhão dourado foram testados em organismos não alvo de outros
táxons, visando uma melhor compreensão dos efeitos ecotoxicológicos associados ao controle
químico. Os critérios para a triagem dos compostos foram os seguintes: (1) compostos que estão
sendo ou que já foram usados para o controle do mexilhão dourado, como é o caso do M XD-100 e
do hidróxido de sódio (NaOH); (2) compostos sabidamente tóxicos a organismos aquáticos
límnicos, que podem apresentar potencial aplicação no controle químico do mexilhão dourado, mas
que ainda não foram utilizados e nem testados com esta finalidade. Seria o caso da amônia não
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ionizada (N-NH 3), do nitrito (N-NO 2-), do nitrato (N-NO 3-) e do cloreto de sódio (NaCl). Estes
compostos geralmente são monitorados durante a rotina de manutenção de animais aquáticos. No
entanto, no caso do mexilhão dourado, os níveis de segurança e a concentração letal mediana (CL50)
-
eram desconhecidos tanto para a amônia não ionizada (N-NH 3), quanto para o nitrito (N-NO 2 ), o
-
nitrato (N-NO 3 ) e o cloreto de sódio (NaCl).
Os reagentes utilizados no p reparo das soluções-teste foram os seguintes:
- Hidróxido de sódio (NaOH) (Cromoline, Brasil, 99.0% de pureza)
- Cloreto de sódio (NaCl) (Red Sea, França, 99.2% de pureza)
- Nitrito de sódio (NaNO 2) (Sigma-Aldrich, Japão, 99.0% de pureza)
- Nitrato de sódio (NaNO 3) (Sigma-Aldrich, Japão, 99.0% de pureza)
- Cloreto de amônio (NH 4Cl) (M erck, Alemanha, 99.8% de pureza)
- M XD-100 (Biocida comercial composto por taninos e amônia quaternária) (M axclean Ambiental e
Química S.A, Brasil).
Os critérios para a seleção dos organismos a se testar foram os seguintes: (1) organismos
representantes de diversos táxons (com ênfase nos moluscos que, neste caso, são o alvo do controle
químico); (2) de fácil manutenção em laboratório; (3) viabilidade de aquisição; (4) incluir
representantes da fauna nativa e exótica (5) organismos que possam ser individualizados, para
possibilitar que seja feito o mesmo delineamento utilizado nos experimentos com larvas e recrutas
de mexilhão dourado, permitindo assim a comparação dos resultados do mexilhão dourado com os
de outras esp écies. Foram realizados testes com os seguintes organismos:
- Protista ciliado: P. caudatum O.F.M üller, 1786 (Peniculia: Peniculida: Parameciidae)
42
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- M oluscos: desovas de O. matheroni (Gastropoda: Succineidae); juvenis de P. acuta; (Gastropoda:
Phy sidae); juvenis de P. dolioides (Caenogastropoda: Ampullariidae).
- Larvas de peixes: O. niloticus Linnaeus, 1758 (Perciformes: Cichlidae) e D. rerio Hamilton, 1822
(Cyprinoidea: Cyprinidae).
Foram feitas tentativas de realizar testes com espécies nativas de peixes Leporinus obtusidens
Valenciennes, 1837 (Characiformes: Anostomidae) (Piau), Prochilodus lineatus Valenciennes,
1837
(Characiformes: Curimatidae)
(Corimba) e Astyanax sp p.
Baird & Girard, 1854
(Characiformes: Characidae) (Lambari), mas devido a problemas de logística e as questões
inerentes à reprodução dos mesmos, as larvas não puderam ser obtidas na ocasião de realização dos
experimentos. Tentamos ainda obter microcrustáceos da espécie nativa Ceriodaphnia silvestrii
Daday, 1902 (Cladocera: Daphnidae), mas não foi possível adquiri-los na ocasião.
Foram realizados testes com desovas de Biomphalaria glabrata (Gastropoda: Planorbidae), mas
devido ao tamanho diminuto e a impossibilidade de individualização dos ovos, a desova desta
espécie não foi utilizada nos testes definitivos. Os juvenis de O. matheroni e de B. glabrata também
não foram selecionados para os testes definitivos uma vez que, por serem muito pequenos,
apresentaram o comportamento de sair da solução testes durante os experimentos piloto. Devido ao
tamanho reduzido e a movimentação rápida, não foi possível manipular com agilidade os rotíferos
Philodina sp . Ehrenberg, 1830 (Bdelloidea: Philodinida: Philodinidae), o que dificultou a realização
dos testes. Desta forma, estes organismos não foram utilizados nos testes definitivos.
Os parâmetros físico-químicos das soluções utilizadas nos testes foram monitorados diariamente,
como descrito abaixo. As soluções estoque foram preparadas com água destilada. Água de
abastecimento, desclorada com tiossulfato de sódio, foi utilizada para o preparo das soluções de
uso, cujas concentrações encontram-se listadas na Tabela 3.
M onitoramento dos parâmetros físico-químicos: Foram monitorados a temperatura, o pH, o
oxigênio dissolvido e a amônia não ionizada. Os equipamentos utilizados foram um oxímetro
(ProODO; YSI), e um medidor de bancada para pH/ ISE (HI 3221; Hanna) ao qual foi acoplado o
pHmetro (HI 1131B; Hanna) e o eletrodo seletivo para amônia (HI 4101; Hanna). A concentração
de amônia não ionizada foi calculada de acordo com a metodologia descrita por EMERSON et al.
43
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(1975), considerando a concentração mensurada de amônia total e os valores de pH e temperatura
da água.
4.1.1. Testes de toxicidade aguda: larvas de Limnoperna fortunei
3
As larvas de L. fortunei foram obtidas através da filtragem de um volume de 3 a 5 m em uma rede
de plâncton de 80 µm na Usina Hidrelétrica de Itaipu Binacional (Rio Paraná). No laboratório
localizado dentro da usina, o material foi triado e larvas no estádio de véliger (150 a 220µm)
(SANTOS et al. 2005) foram selecionadas em microscópio estereoscópico. Nesse estádio larval
valvado, os animais se movimentam ativamente e apresentam um véu bastante desenvolvido.
As larvas de mexilhão dourado foram submetidas a uma primeira triagem, sendo transferidas para
placas de cultura celular (6 poços por placa, 10mL de água desclorada por poço). Foram colocadas
no máximo 20 larvas por poço de modo a facilitar a transferência das mesmas para as placas teste.
Para os experimentos de toxicidade, as larvas foram novamente selecionadas e transferidas para
placas de cultura celular de 24 poços (cada poço com a capacidade de 3 mL), contendo as soluções
teste. Os químicos testados, número amostral e duração dos experimentos encontram-se listados na
Tabela 3.
4.1.2. Testes de toxicidade aguda: recrutas e adultos de Limnoperna fortunei
Os animais foram coletados manualmente no lago da Usina Hidrelétrica de Itaipu, nas proximidades
do laboratório do Portinho, localizado no Refúgio Biológico Bela Vista, em Foz do Iguaçu/PR (25º
26’ 48,9” S; 54° 32’ 58,1” W) de acordo com metodologia descrita por M ONTRESOR et al.
(2011). O processo de transporte até o LELf (Laboratório de Estudos de Limnoperna fortunei no
Centro de Pesquisas Hidráulicas – UFM G) durou cerca de 8 horas. Antes do início dos
experimentos, os mexilhões foram aclimatados, durante 15 dias, em quatro aquários de 200L, com
aeração constante e a temperatura de 18°C e fotoperíodo de 12 horas. Água de abastecimento,
desclorada com tiossulfato de sódio, foi utilizada para manutenção dos animais nos aquários. Os
parâmetros físico-químicos foram monitorados diariamente como descrito no item 4.1. A água dos
aquários foi mantida em pH 7,8 aproximadamente, oxigênio dissolvido sup erior a 8 mg/L, com
saturação acima de 90% e a amônia total em valores inferiores a 0,6 mg/L.
44
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Os mexilhões foram alimentados uma vez ao dia com microalgas cultivadas em laboratório,
Scenedesmus sp ., Selenastrum sp . ou Ankistrodesmus sp . O volume de cultura oferecido aos
mexilhões diariamente foi calculado de acordo com a concentração encontrada em cada cultivo no
dia de sua utilização e com o número de animais a se alimentar, de acordo com a equação 1
(M ANSUR et al. 2008).
V
B *C
(1)
A
V = volume (mL) da suspensão algácea a ser adicionada na cultura - B = número de mexilhões em
cada aquário - C = 3,2 x 106 (número de células por indivíduo) - A = número de células/mL da
suspensão algácea (obtido através da contagem das algas).
Dois dias antes de cada experimento, 200 mexilhões de tamanho inferior a 5 mm (recrutas) foram
selecionados e mantidos em incubadora a 25 ± 2°C, fotoperíodo de 12 horas e aeração constante. Os
espécimes que não se fixaram a parede do recipiente após 24 horas e que não apresentavam o sifão
estendido foram excluídos do experimento. Grup os de 18 indivíduos foram aleatoriamente disp ostos
individualmente em placas de 6 poços (cada poço com capacidade de 10 mL) contendo 10 mL de
água desclorada. Foram selecionadas para os testes, as placas nas quais todos os espécimes se
fixaram na parede do recipiente e apresentavam sifão exposto.
Para os testes com os animais adultos, 1.000 mexilhões (21-27 mm) foram selecionados e mantidos
em uma incubadora a 25 ± 2°C, fotoperíodo de 12 horas e aeração constante, dois dias antes dos
experimentos. Da mesma forma que descrito anteriormente, os espécimes que não se fixaram a
parede do recipiente após 24 horas e que não apresentavam o sifão estendido foram excluídos do
experimento. Foram aleatoriamente dispostos 11 indivíduos em frascos de vidro (500 mL) contendo
300 mL de água desclorada e aeração constante. Para os testes, foram selecionados os recipientes
em que todos os espécimes estavam fixados às p aredes.
Foram realizados testes semi-estaticos (com troca total das soluções a cada 24 horas) de toxicidade
aguda (24-96 h) independentes. As concentrações testadas, em triplicata, no experimento definitivo
(Tabela 3) foram selecionadas com base em experimentos-piloto. Nos testes com mexilhões adultos,
além da mortalidade, o comportamento dos animais (valvas abertas ou fechadas) também foi
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monitorado. Os químicos testados, número amostral e duração dos experimentos encontram-se
listados na Tabela 3. Antes da renovação diária das soluções, os parâmetros físico-químicos da água
foram monitorados como descrito anteriormente.
A mortalidade foi monitorada em intervalos de 24 h. Os animais mortos foram removidos dos
recipientes duas vezes ao dia para prevenir a deterioração da água. No último dia de experimento,
os animais que estavam fechados foram dissecados e aqueles que apresentavam batimento na
ciliatura das brânquias foram considerados vivos.
Um experimento adicional foi realizado para observar o comportamento de L. fortunei exposto a
CL50 96h de cada um dos compostos químicos. Os indivíduos foram selecionados e aclimatados
como descrito acima. M exilhões (30 por teste) foram individualmente colocados em poços
contendo 10 mL da solução a ser testada (0,25 mg/L N-NH 3, 11,10 mg/L M XD-100, 88,51 mg/L
NaOH e controle). Durante duas horas os indivíduos com as valvas abertas foram contabilizados em
intervalos de dez minutos.
4.1.3 Testes de toxicidade aguda: cálculo da CL50 e estimativa do nível de segurança
O cálculo da CL50 foi feito utilizando-se o programa “Trimmed Spearman-Karber” modificado
(HAM ILTON et al. 1977). A concentração segura de exposição aos químicos, ou nível de
segurança, foi calculada por inferência, considerando-se o valor de 10% da CL50-96h
(SLAUGHTER et al. 2007). Para comparar a toxicidade dos compostos químicos testados, foram
considerados o maior e o menor valor de CL50 para cada um deles. Estes valores e seus respectivos
intervalos de confiança foram comparados. Foram considerados diferentes aqueles valores em que
não houve sobreposição do intervalo de confiança.
4.1.4. Testes de toxicidade aguda: Análise do comportamento evasivo de mexilhão dourado
Os efeitos das diferentes concentrações dos químicos NaOH, NaCl, N-NO 2-, N-NO 3-, N-NH3, M XD100, na proporção de indivíduos adultos com as valvas abertas/ fechadas, nas primeiras 24 horas de
exposição, foram testados com análise de variância simples ANOVA (ZAR, 2009). Comparações "a
posteriori" foram feitas por inferência utilizando o intervalo de confiança de 95%.
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No outro experimento, em que foram testadas as concentrações referentes à CL50-96h (para o
M XD-100, N-NH 3, e NaOH), as proporções de adultos de L. fortunei apresentando as valvas abertas
foram comparadas com o teste do qui-quadrado.
4.1.5. Testes de toxicidade crônica: Exposição crônica do mexilhão dourado às concentrações
de segurança para a amônia e o MXD-100 e análise do conteúdo de carboidratos (ênfase
glicogênio)
Com o intuito de testar o nível de segurança previamente estimado para a amônia e para o M XD100, recrutas e adultos de mexilhão dourado foram expostos p or 21 dias a estes dois compostos, na
concentração de 1 mg/L M XD-100 e 0,025 mg/L N-NH 3. O grupo controle foi mantido na água
desclorada utilizada para o preparo das soluções, as quais foram trocadas diariamente. Foram
utilizados 25 indivíduos por tratamento (5 frascos com 5 indivíduos cada), os quais foram mantidos
em câmara incubadora com aeração constante, temperatura de 25 ± 2°C, pH~7,8 e fotoperíodo de
12 horas.
Os indivíduos adultos foram selecionados como descrito anteriormente e aleatoriamente
distribuídos em recipientes plásticos com capacidade de 4 L, contendo 2 L de solução teste. Os
recrutas foram acondicionados em frascos de 400 mL contendo 200 mL de solução. No momento da
troca diária de solução, os parâmetros físico-químicos da água foram mensurados como reportado
no item 4.1. Para alimentação, foi oferecida uma mistura de microalgas contendo aproximadamente
6
1,5x 10 cel./mL (Scenedesmus sp ., Ankistrodesmus sp . e Chlamydomonas sp .) 3 vezes p or semana,
3 horas antes da troca de solução, volume de 10 mL para os adultos e 1 mL para os recrutas. Os
aquários foram monitorados diariamente.
Ap ós os 21 dias de teste, os tecidos dos adultos foram separados das conchas com auxílio de pinças
oftalmológicas e tesouras de ponta fina. Ap roximadamente 1 g de tecido foi acondicionado
separadamente em tubos de criogênio 1,5 mL. Os tubos foram mantidos no gelo durante o processo
de coleta do tecido e, em seguida, foram armazenados em freezer (- 20ºC) até o processamento da
amostra. A análise do conteúdo de glicogênio foi realizada de acordo com protocolo descrito por
PINHEIRO & GOM ES (1994). Assim, as amostras foram descongeladas, pesadas e
homogeneizadas com um homogeneizador de tecido (Ten Broeck Py rex, Corning, NY, USA) em
TCA 10% (ácido tricloroacético) na proporção de 10 mL de TCA para 1 g de tecido.
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Posteriormente, as amostras foram centrifugadas por 5 minutos a 4000 rpm e o volume obtido foi
filtrado, aquecido por 5 min. a 45ºC. Foi adicionado metade do volume da amostra de etanol
absoluto. As amostras foram transferidas para um banho de gelo por 15 min. e centrifugadas a
18.000 G p or 10 min. Posteriormente, o precipitado foi ressusp endido em 5 mL de água destilada. A
2 ml desta amostra, foram adicionados 2 mL de HCL 1M , e, após 30 min a banho-maria a 100ºC
(água fervente), foi acrescentado 1 mL de NaOH 3M . Este material foi homogeneizado e transferido
para tubos Falcon de 15 mL, e ao mesmo foram adicionados 1 mL de 3,5 DNS (ácido dinitro
salicilato). As amostras foram analisadas em espectrofotômetro a 535 nm. Os valores de
absorbância foram anotados e comparados com o padrão. Para verificar os efeitos crônicos da
exposição a baixas doses de M XD-100 e amônia sobre a quantidade de glicogênio no tecido de L.
fortunei foi utilizada uma análise de variância simples ANOVA (ZAR, 2009).
4.1.6. Testes de toxicidade aguda com outros organismos
Testes de toxicidade utilizando organismos de outros táxons foram realizados com o intuito de
comparar os níveis de toxicidade do M XD-100 e da amônia para organismos não alvo. Foram
testados o protista P. caudatum, os moluscos P. acuta (jovem), O. matheroni (desova), P. dolioides
(jovem) e os peixes D. rerio (larva) e O. niloticus (larva). Para a comparação foram utilizados os
valores de CL50 calculados a partir dos testes de toxicidade aguda. Para favorecer as comparações,
os aspectos relativos à metodologia foram padronizados para minimizar a influência de diferenças
metodológicas nos resultados. No entanto, em alguns casos, foram necessários ajustes para adaptar
a metodologia a peculiaridades de cada espécie.
As soluções-estoque foram preparadas com água destilada e os respectivos compostos químicos. As
soluções de uso foram preparadas a partir da diluição da solução estoque com água de
abastecimento desclorada com tiossulfato de sódio. A concentração de amônia real foi mensurada
com o uso de um eletrodo seletivo para a amônia (APHA, 1995). A concentração de amônia não
ionizada foi calculada de acordo com a metodologia descrita por EMERSON et al. (1975),
considerando os valores de pH e temperatura da água e as concentrações conhecidas de amônia
total.
Foram realizados testes semi-estáticos independentes de toxicidade aguda aos químicos M XD-100 e
amônia. Para cada químico e cada organismos testado, foram utilizadas de 5 a 8 concentrações
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(Tabela 3) e um grupo controle, em triplicata, simultaneamente. As concentrações foram
previamente definidas com base em experimentos-piloto. Todos os testes foram realizados em
câmara incubadora a 27°C ± 1°C e fotoperíodo de 14 horas (exceto para tilápia temperatura 23ºC ±
2°C, fotoperíodo de 12 horas). A mortalidade foi monitorada após 24, 48, 72 e 96 horas de teste
para P. acuta, P. dolioides, O. matheroni e O. niloticus. Devido ao ciclo de vida curto de P.
caudatum, a mortalidade foi monitorada após 1 hora, 2 horas e 24 horas de exposição. Os testes
com D. rerio tiveram 48 horas de duração. A duração do experimento foi mais curta uma vez que
foram selecionados animais que não estivessem protegidos pelo córion (3 dias pós fertilizaçãoDPF), para evitar que a proteção do córion influenciasse nos resultados de toxicidade. No entanto,
após o 5º DPF, a reserva de alimento das larvas já seesgota e estas precisam ser alimentadas, o que
inviabilizaria a continuidade dos testes. No momento das trocas diárias de solução e ao fim dos
experimentos, os parâmetros físico-químicos da água foram mensurados (conforme descrito no item
4.1.2). Ao final do experimento as soluções foram substituídas por água desclorada e a mortalidade
foi monitorada por mais 24 horas.
Para as espécies P. caudatum P. acuta, P. dolioides, O. matheroni e D. rerio, os experimentos
foram realizados em placas de 24 poços, nas quais foram testados grupos de 6 indivíduos, em
triplicata (n=18). A cada poço, contendo 1 indivíduo, foram adicionados 2,5 mL de solução teste. A
mortalidade foi monitorada diariamente com o auxílio de microscópio estereoscópio.
As larvas de O. niloticus por serem maiores, mais ativas, e necessitarem de mais espaço que os
outros organismos testados, foram acondicionadas em frascos, e não em placas. O número de larvas
por frasco foi estabelecido respeitando o limite de densidade de 1 grama de larva/L. Para cada
concentração foram testados grupos de 9 indivíduos, em triplicata (n=27). Os frascos contendo 500
mL de solução foram mantidos em câmara incubadora com aeração artificial.
4.1.6.1 Testes com protista ciliado Paramecium caudatum
Exemplares de P. caudatum foram isolados a partir de amostras de água coletadas na Lagoa da
Pampulha, Belo Horizonte, M G, Brasil, (Coordenadas: 19o55’09” S, 43o56’47” O). Estas amostras
foram mantidas em placas de Petri às quais se adicionaram sementes de arroz com casca. A fim de
obter um grande número de indivíduos de P. caudatum para isolamento, a cultura foi monitorada
diariamente para se observar o crescimento do número de indivíduos desta espécie. Para o preparo
49
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do meio de cultura, água filtrada foi fervida e deixada esfriar em temperatura ambiente. Em uma
placa de Petri, sementes de arroz com casca foram submetidas à irradiação por luz ultravioleta
durante trinta minutos, tomando-se o cuidado de agitar a placa três vezes para expor toda a
sup erfície à incidência dos raios UV. A água filtrada foi colocada em oito tubos de ensaio 15x200
mm, aos quais foram adicionadas seis sementes de arroz com casca. Os tubos contendo a água
filtrada e as sementes de arroz com casca foram mantidas em descanso por, no mínimo, 24 horas.
Logo após, indivíduos de P. caudatum foram isolados das amostras de água da Lagoa da Pampulha
e mantidos em cultura nas p lacas de Petri, utilizando-se para isso micropipetas e microscópio óptico
de campo claro. Entre 10 e 15 indivíduos de P. caudatum foram inoculados em cada um dos oito
tubos de ensaio contendo água filtrada e sementes de arroz com casca. As culturas foram mantidas
em condições estéreis e em incubadora com temperatura de 23ºC e fotop eríodo de zero horas de luz,
até atingirem a fase logarítmica, que se deu após sete dias de cultura.
Para a realização dos testes, uma alíquota de 500 µL da cultura de P. caudatum foi colocada no
último poço de uma placa de cultura celular de 24 poços (cada poço com a capacidade de 3 mL).
Exemplares nadando ativamente foram individualmente selecionados com o auxílio de uma
micropipeta (1-5 µL) sob microscópio estereoscópio. Cada um destes exemplares foi transferido
para um poço e para cada concentração testada foi utilizada uma placa contendo 18 exemplares.
Cada fileira destas placas, contendo 6 indivíduos cada, constituiu uma amostra. Os testes foram
realizados em triplicata (n=18). A cada poço, contendo 1 indivíduo, foi adicionado 1 mL de solução
teste. Os animais foram mantidos em uma incubadora a 27 ± 1°C, fotoperíodo 0 horas de luz.
4.1.6.2. Testes com juvenis de moluscos gastrópodes (Physa acuta e Pomacea dolioides)
Os juvenis de P. acuta foram obtidos em laboratório, a partir de parentais coletados nas
proximidades do laboratório do Portinho, localizado no Refúgio Biológico Bela Vista, em Foz do
Iguaçu/PR. Estes animais foram encontrados sobre asrosetas do mexilhão dourado, as quais serviam
de substrato para P acuta. Os animais foram criados nas mesmas condições descritas no item 4.1.2.
para o mexilhão dourado e alimentados diariamente com alface. Exemplares jovens medindo entre
5-7 mm aproximadamente foram selecionados para o teste.
Desovas de P. dolioides foram obtidas nas margens da Lagoa da Pampulha, Belo Horizonte, M G.
Para que os ovos se desenvolvessem, as desovas foram colocadas individualmente no centro de uma
50
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placa de isopor de 5x5cm, em um aquário de vidro de (40x30x20cm) contendo água desclorada.
Este aquário foi observado diariamente e os jovens recém-eclodidos foram transferidos para outro
aquário, contendo aeração artificial e alimento. Diariamente, foi oferecida alface fresca como
alimento. Foram selecionados para os experimentos esp écimes com tamanho entre 5-7 mm.
Para ambas as espécies (P. acuta e P. dolioides) foram selecionados para os testes, exemplares com
movimentação ativa, os quais foram individualmente acondicionados em poços de uma placa de
cultura celular de 24 poços (cada poço com a capacidade de 3 mL).
4.1.6.3. Testes com desova de molusco gastrópode (Omalonyx matheroni)
Desovas de O. matheroni foram obtidas a partir de parentais coletados nas margens da Lagoa da
Pampulha, Belo Horizonte, M G, criados de acordo com metodologia descrita previamente
(M ONTRESOR et al. 2012). A criação foi observada diariamente para retirada das desovas recémpostas, as quais foram mantidas em câmara incubadora a 27 ± 1°C, fotoperíodo de 14 horas antes e
durante a realização dos experimentos. As desovas foram acondicionadas em placas de Petri com
tampa, contendo uma fina camada de água desclorada, a qual foi trocada diariamente.
A desova deste molusco é uma massa gelatinosa transparente em forma ovalada onde cada ovo é
envolvido por três membranas sendo que os ovos são relativamente grandes (~2 mm de diâmetro).
Isto permitiu que os embriões fossem selecionados para o teste sem danos. Os ovos foram
individualizados, permitindo que se colocasse um embrião por poço. Foram selecionados, sob
microscópio estereoscópio ovos contendo embriões na fase final do desenvolvimento (acima de 10
dias), os quais apresentavam as seguintes características: região cefálica bem desenvolvida com os
dois pares de tentáculos proeminentes e com a forma mais arredondada. Par de tentáculos posterior
com pigmentação do ocelo bem visível. A boca é vista como uma abertura única. Concha bem
formada é evidente no centro do manto que, por transparência, permite a observação dos batimentos
cardíacos. A região podal apresenta-se bem desenvolvida como o pé mais alongado, apresentando a
extremidade posterior mais afinada. Nota-se o embrião com suave movimentação.
4.1.6.4. Testes com larvas de peixe zebra (Danio rerio)
51
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
Os adultos de peixe zebra (Danio rerio) utilizados na obtenção das desovas p ara este estudo, foram
mantidos a 28°C, fotoperíodo de 14 h luz em um sistema automático de recirculação (Aquaneering)
no Laboratório de Neurociência da Faculdade de M edicina da Universidade Federal de M inas
Gerais (SOUZA et al. 2011). M achos e fêmeas de D. rerio (maduros sexualmente), mantidos em
laboratório de acordo com metodologia previamente descrita (SOUZA et al. 2011), foram
colocados, no final da tarde, em um mesmo aquário (3 casais por aquário) para obtenção de formas
larvares. No dia seguinte, pela manhã, as larvas foram retiradas do aquário e colocadas em uma
placa de Petri com meio de cultura contendo os sais necessários e o pH (7,2) adequado para seu
desenvolvimento (LAWRENCE 2007). As larvas foram mantidas em câmara incubadora a 27 ±
1°C, fotoperíodo de 14 horas até o final dos experimentos. Até o 3° dia após a fertilização (DPF),
foi realizada a troca diária do meio de cultura. No 3º DPF, larvas livres, com movimentação ativa e
sem alterações morfológicas aparentes foram selecionadas, sob microscópio estereoscópio e
individualmente acondicionados em placas de cultura celular de 24 poços (cada poço com a
capacidade de 3 mL).
4.1.6.5. Testes com larvas de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus)
Larvas de O. niloticus adquiridas de uma piscicultura localizada no município de Guapé/M G, foram
recebidas com 4 dias de vida e aclimatadas p ara as condições de laboratório por 15 dias. No período
de aclimatação foram mantidas em um aquário de 180 litros, a 23°C, e receberam alimento (ração
®
farelada, 55% PB, Laguna, Socil ) 4 vezes ao dia até a saciedade aparente. As larvas selecionadas
para os experimentos apresentavam morfologia e comportamento normais, comprimento total 14,5
± 1 mm e peso 50 ± 7 mg.
52
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Tabela 3. Características gerais dos testes toxicológicos realizados: organismos testados, número amostral, duração dos experimentos
(h), compostos químicos avaliados e as respectivas concentrações das soluções-teste*.
Organismo teste/
estádio de
desenvolvimento
Limnoperna fortunei/
Larva
n
(por grupo)
réplicas
n (por concentração)
Tempo
(horas)
6
3
18
24
n (por ensaio)
Limnoperna fortunei
Recruta
n (por ensaio)
6
3
18
96
NaOH
(mg/L)
NaCl
(‰)
N-NO2 (mg/L)
N-NO3(mg/L)
N-NH3
(mg/L)
MXD-100
(mg/L)
20
40
80
160
320
800
6
9
12
18
21
24
0,5
3
12
50
200
800
5
60
200
600
2000
0,02
0,09
0,15
0,17
0,32
0,35
0,70
1,40
0,05
0,5
1
4
7
10
100
500
126
126
126
108
162
162
50
100
200
400
800
2
6
12
24
36
200
400
800
2000
4000
6000
0,002
0,009
0,01
0,02
0,04
0,08
0,17
0,35
0,05
0,5
1
10
100
500
108
108
126
162
126
10
50
150
300
800
108
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Continuação
Organismo teste/
estádio de
desenvolvimento
Limnoperna fortunei
Adulto
n
(por grupo)
réplicas
n
(por concentração)
Tempo
(horas)
11
3
33
96
n (por ensaio)
Paramecium caudatum
n (por ensaio)
6
3
18
24
NaOH
(mg/L)
N-NO2 (mg/L)
NaCl
(‰)
40
80
160
240
320
400
800
2
6
12
24
36
264
198
35
50
65
80
95
175
400
800
26
4
N-NO3(mg/L)
N-NH3
(mg/L)
MXD-100
(mg/L)
200
400
800
1750
3500
7000
0.14
0.21
0.31
0.50
0.72
0,05
0,5
1
10
100
500
2000
5000
10000
231
198
330
0,19
1,94
5,84
9,74
19,49
29,24
38,99
58,48
5
7,5
10
15
30
40
216
168
54
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Continuação
Organismo teste/
estádio de
desenvolvimento
Physa acuta
Juvenis
n
(por grupo)
réplicas
n
(por concentração)
Tempo
(horas)
6
3
18
96
n (por ensaio)
Pomacea dolioides
Juvenis
n (por ensaio)
NaOH
(mg/L)
NaCl
(‰)
N-NO2 (mg/L)
N-NO3(mg/L)
N-NH3
(mg/L)
MXD-100
(mg/L)
0,09
0,19
0,97
1,94
3,89
5,84
7,79
9,74
0,5
1
5
10
50
162
6
3
18
96
0,09
0,19
0,97
1,94
3,89
5,84
7,792
9,74
162
0,5
1
5
10
20
30
40
50
162
162
55
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Organismo teste/
estádio de
desenvolvimento
Omalonyx matheroni
Desova
n
(por grupo)
réplicas
n
(por concentração)
Tempo
(horas)
6
3
18
96
n (por ensaio)
Oreochromis niloticus
(tilápia)
Larva
9
3
27
NaOH
(mg/L)
NaCl
(‰)
N-NO2 (mg/L)
N-NO3(mg/L)
N-NH3
(mg/L)
MXD-100
(mg/L)
0,19
1,94
9,74
19,49
29,24
38,99
58,48
10
50
100
200
300
500
1000
144
144
96
0,1
1
10
100
1000
n (por ensaio)
Danio rerio
(peixe-zebra)
Larva
162
6
3
18
48
n (por ensaio)
0,58
1,94
3,31
4,48
5,84
108
4
10
20
40
70
100
300
144
n= número amostral por concentração testada. Para obter o número amostral total o n deve ser multiplicado pelo número de concentrações
testadas por experimento.
Os dados utilizados para montar a tabela podem ser verificados nos Apêndices de 4 a 9.
* Cada ensaio incluiu as concentrações listadas nesta tabela e ainda um grupo controle.
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5. RES ULTADOS
Os resultados dos testes de toxicidade estão apresentados nas tabelas a seguir (Tabela 4 a 9). Cada
tabela exibe os resultados para um dos compostos químicos testados. Alguns destes compostos
foram testados somente nos diferentes estádios de vida do mexilhão dourado, sendo este o caso do
-
-
NaOH (Tabela 4), NaCl (Tabela 5), N-NO 2 (Tabela 6) e N-NO 3 (Tabela 7). Nos testes com amônia
(Tabela 8) e M XD-100 (Tabela 9) foram utilizados, além do mexilhão dourado, outros organismos.
A mortalidade dos animais testados aumentou de acordo com o aumento da concentração dos
compostos químicos e com o tempo de exposição. Não houve mortalidade igual ou sup erior a 10%
nos grupos controle para os diferentes testes realizados.
6. DISCUSS ÃO
Biocidas são utilizados para o tratamento de água, tratamento de esgoto, tratamento de água de
lastro e como agente anti-incrustante em tubulações industriais. M étodos químicos também são
utilizados na prevenção e controle de espécies invasoras. No entanto, os biocidas apresentam um
largo espectro de ação, o que resulta em danos a espécies não alvo. Em uma revisão da literatura,
foram identificados 32 biocidas, os quais foram classificados em dois grupos, oxidantes
(halogenados e não halogenados) e não oxidantes (ácidos, aldeídos, aminas, cetonas, metais)
(CHATTOPADHYAY et al. 2004). M uitos destes têm sido utilizados com frequência no tratamento
de água potável e de esgoto, e para prevenir incrustações em sistemas de resfriamento em indústrias
de diversos segmentos. Estratégias para minimizar estes danos incluem a busca por biocidas que
sejam ambientalmente menos agressivos e também a realização de estudos sobre a concentração
efetiva e tempo de aplicação, visando à otimização dos métodos utilizados. Dependendo do
composto químico utilizado, pode ser necessário um tratamento, ou neutralização do efluente antes
do seu descarte, evitando assim danos a organismos não alvo (CHATTOPADHYAY et al. 2004).
Com o aumento da dispersão do mexilhão dourado, diversos componentes químicos vêm sendo
testados e utilizados com o objetivo de controlar as populações e minimizar os impactos
econômicos causados por este bivalve (M ACKIE & CLAUDI 2010, DARRIGRAN &
DAM BORENEA 2011). No entanto, considerando os problemas ambientais que são desencadeados
pelo uso de produtos químicos na água (M ACKIE & CLAUDI 2010), esforços devem ser
concentrados na busca por biocidas menos agressivos ao ambiente e por estratégias de uso que
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minimizem os impactos ambientais. Neste contexto, é importante que se conheça a sensibilidade do
mexilhão dourado a diferentes compostos químicos, bem como os impactos em organismos nãoalvo. Ensaios em laboratório fornecem informações importantes à avaliação do risco ambiental
associado ao uso de compostos químicos no controle de espécies invasoras. Estas informações
também são importantes para o estabelecimento de medidas regulatórias.
6.2. Resposta comportamental de adultos do mexilhão dourado
Os bivalves apresentam um limitado repertório comportamental e a abertura e fechamento das
valvas é um dos comportamentos mais importantes, além de ser facilmente mensurado (FRANK et
al. 2007; HÉGARET et al. 2007; DI FIORI et al. 2012). O comportamento de abrir e fechar as
valvas foi avaliado em um trabalho com L. fortunei exposto ao glifosato (DI FIORI et al. 2012). No
presente trabalho, após 24 horas, foram observadas alterações no comportamento somente nas
maiores concentrações testadas: 160 mg/L de NaOH, 12 g/L NaCl; 400 mg/L NO 2-; 800 mg/L NO 3-;
0,31 mg/L de N-NH 3 e 100 mg/L de M XD-100 (Figuras 3-8). Estas concentrações, no entanto,
estão bem acima da faixa utilizada no controle de L. fortunei em plantas industriais. O presente
estudo mostrou que, assim como outros bivalves, L. fortunei é extremamente sensível a N-NH 3
(CL50 96-h = 0,25 mg/L). Entretanto, a exposição por 24 horas a este componente químico na
concentração da CL50 96-h não desencadeou alterações comportamentais (N-NH 3=96,7%,
controle=93,3% valvas abertas), reforçando o potencial da amônia no controle de L. fortunei. As
respostas comportamentais devem ser avaliadas ao se escolher uma estratégia de controle
(tratamento contínuo ou intermitente) (CALAZANS et al. 2012, M AROÑAS E DAM BORENEA
2006, ROLLA & M OTA 2010). Trabalhos sobre a tolerância de L. fortunei a métodos físicos e
químicos de controle devem considerar este comportamento. O presente estudo contribui para o
entendimento da relação entre a toxicidade e efeitos comportamentais em L. fortunei.
Os resultados do presente estudo contribuem para as discussões sobre o controle químico de
espécies invasoras. O desenvolvimento de estratégias ambientalmente seguras visa reduzir o
impacto ambiental decorrente das atividades humanas. A ampla e crescente utilização de biocidas
nos ecossistemas límnicos implica na necessidade de uma maior atenção à regulamentação do uso
destes.
58
Programa de Pós-graduação em Saneam ento, Meio Ambiente e Recursos Hídricos
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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