Pesquisa
BIORREATORES
Fotos cedidas pelo autor
Biorreatores para células, tecidos e órgãos vegetais - Produção de mudas em larga escala
Introdução
João Batista Teixeira,
Ph.D., Biologia Celular
[email protected]
Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia
Figura 1. Sistema de biorreator
de imersão temporária,
desenvolvido pela Embrapa
Recursos Genéticos e
Biotecnologia, utilizando
tanque de ar comprimido
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A micropropagação é uma forma
vegetativa de propagação de diferentes
espécies de plantas por meio da técnica
denominada cultura de tecidos. Essa
técnica requer laboratórios bem estruturados e pessoal treinado.
Em resumo, o procedimento envolve os seguintes passos: inicialmente, é
feita a escolha da planta matriz e do tipo
de material a ser utilizado, tais como
gemas, segmentos nodais, folhas, flores, etc. Em seguida, o material é desinfestado já em condições de laboratório
em ambiente estéril, e introduzido em
frascos igualmente estéreis, contendo
meio de cultura esterilizado. Esse meio
contém, todos os nutrientes necessários
ao crescimento e desenvolvimento do
material em cultivo, além de substâncias
reguladoras de crescimento. Os frascos
com o material são mantidos em salas
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002
de crescimento, sob condições de temperatura, luminosidade e fotoperíodo
adequados.
Milhões de plantas são produzidas
anualmente, em todo o mundo, por
meio da micropropagação. Entretanto,
esse método de multiplicação é altamente demandante de mão-de-obra e
só em condições especiais tal procedimento deve ser utilizado. Basicamente,
a escolha da micropropagação frente a
outras formas de propagação baseia-se
no valor venal da muda ou do produto
a ser obtido pela muda micropropagada.
A metodologia tradicional de micropropagação baseia-se em cultivos em
pequenos frascos, com número reduzido de plântulas por frasco, e uso de
meio nutritivo gelificado, o que acarreta
intensa manipulação das culturas, e envolve, com isso um grande contingente
de mão-de-obra especializada.
Biorreatores podem ser conceituados como equipamentos para cultivo
sob imersão temporária ou permanente
de células, gemas, embriões ou qualquer tipo de propágulo que possa ser
utilizado na micropropagação.
Os biorreatores utilizam meio de
cultura líquido, permitem a renovação
do ar durante o cultivo, bem como o
monitoramento de alguns parâmetros
essenciais ao crescimento do propágulo, tais como pH, oxigênio dissolvido,
temperatura, concentração de íons, etc.
Os primeiros biorreatores derivaram
dos equipamentos denominados fermentadores, os quais foram, há muitas
décadas, desenvolvidos para cultivo de
fungos e bactérias para fins industriais.
Assim, os primeiros biorreatores testados para plantas continuaram sendo
chamados de fermentadores, por serem
utilizados basicamente para o cultivo de
células vegetais isoladas, de forma mui-
mais comum a injeção de um fluxo de ar
a uma determinada pressão, combinada
com o movimento de uma hélice no
interior do frasco de cultivo (Takayama
& Akita, 1994). O ar que entra no
sistema é esterilizado ao ser forçado a
passar através de uma membrana com
poros de 0,22 a 0,44 micras de diâmetro.
O tamanho do frasco de cultivo
normalmente varia entre 1 e 20 litros,
embora volumes menores como 250 e
500 ml, ou maiores, 20 ou até mesmo 300
litros já tenham sido utilizados. Entretanto, a maioria dos frascos utilizados
está na faixa de 1 a 4 litros (Takayama
& Akita, 1994).
Figura 2. Sistema de biorreator, modelo compacto de 4 pares de
frascos, utilizando bomba compressora de ar
to parecida com o que era feito com os
fungos e bactérias.
Inicialmente, os fermentadores foram empregados com pouca ou nenhuma modificação para o cultivo de células vegetais. Para isso, pequenos ajustes
foram feitos na taxa de renovação do ar
e nas formas de agitação das células.
Biorreatores para cultivo de células vegetais foram bastante estudados, principalmente na década de 80, e uma série
de modelos específicos para plantas
foram desenvolvidos.
Recentemente, os biorreatores começaram a ser utilizados para cultivo de
células, tecidos, gemas e plântulas, tendo como objetivo final a produção de
mudas em larga escala.
O primeiro relato sobre o uso de
biorreatores para propagação vegetal
foi primeiramente feito por Takayama e
Misawa (1981) para micropropagação
de begônia. Nesse caso, os autores
utilizaram segmentos nodais de plântulas estabelecidas in vitro, seguindo protocolos de cultivos convencionais em
meio gelificado. Procedimentos similares foram adaptados para uma série de
outras espécies vegetais (Noriega &
Söndahl, 1993; Akita & Takayama, 1994).
Os biorreatores são aplicados igualmente à produção de embriões somáticos (Tautorus et al., 1992; Denchev et
al., 1992 e sementes sintéticas (Attree et
al., 1994; Onishi et al., 1994). Essa metodologia exige completo domínio sobre
o processo de indução e seleção de
calos embriogênicos, bem como da diferenciação e encapslulamento dos
embriões somáticos, além da germinação das sementes sintéticas.
Constituição básica
dos biorreatores
A constituição dos biorreatores usados para cultura de embrião, gemas e
hastes caulinares para fins de micropropagação é fundamentalmente a mesma
dos equipamentos utilizados para cultivo de fungos, bactérias e células vegetais (Takayama & Akita, 1994).
Basicamente, os biorreatores tradicionais apresentam os seguintes componentes: frasco de cultivo, motor elétrico
conectado a um eixo que se estende até
o interior do frasco, bomba compressora de ar, sensores de temperatura, pH e
oxigênio (Takayama & Akita, 1994).
O frasco de cultura é desenhado de
tal forma a permitir uma ótima aeração
do meio de cultura, bem como uma
homogeneização satisfatória com um
mínimo de dano mecânico do material
em cultivo. Os frascos podem ser feitos
de vidro, aço inoxidável, policarbonato,
polipropileno ou qualquer outro material que suporte a autoclavagem a uma
temperatura de 121 ° C durante 15 a 30
minutos. Freqüentemente, o frasco de
cultivo apresenta um envoltório metálico em forma de jaqueta, por onde
circula água com temperatura pre-determinada, para controle da temperatura de cultivo (Takayama & Akita, 1994).
A homogeneização do meio de cultura e a aeração do material em cultivo
são feitos de diversas formas, sendo a
Principais tipos de biorreatores
utilizados para cultivo de hastes
caulinares e embrião
Vários tipos de biorreatores têm sido
desenvolvidos e utilizados ou têm potencial de uso em cultivo de gemas,
embriões e plantas. Esses biorreatores
são classificados pelo tipo de agitação e
construção do frasco (Takayama & Akita, 1994).
Biorreatores tipo
aerador agitador
(“aeration agitation
bioreactor”)
Esse tipo de biorreator é o mais
parecido com os fermentadores convencionais. A agitação é basicamente
feita por meio de hélices conectadas a
um eixo giratório. É basicamente utilizado para células e embriões somáticos
(Kessel & Carr ,1972; Preil et al., 1988). A
grande desvantagem desse modelo de
biorreator é que, para haver uma boa
homogeneização do meio, é necessário
que a hélice gire em velocidades suficientemente elevadas, o que, regra geral,
causa dano mecânico acentuado ao
material em cultivo, principalmente em
hastes e gemas.
Biorreator tipo tambor rotatório (“roller drum bioreactor”)
Nesse tipo de biorreator, o frasco de
cultivo gira suavemente em movimentos rotacionais sobre dois eixos, que
servem não apenas de apoio, mas que
também são responsáveis por imprimir
ao frasco de cultivo o movimento rotatório. Nesse tipo de biorreator, o dano
mecânico é mínimo e é adequado ao
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biorreator apresenta excelentes resultados no cultivo de células, tecidos e
órgãos porque não há dano mecânico
nem agitação via borbulhamento. O
inconveniente desse modelo é a não
renovação do ar interno do frasco de
cultivo, o que pode ser contornado com
a inclusão de um sistema de aeração via
injeção de ar estéril.
Biorretor de aeração por
membrana porosa ao oxigênio
(“oxygen permeable
membrane aerator
bioreactor”)
Figura 3. Detalhe dos frascos do biorreator, com células embriogênicas
de café em cultivo
cultivo de embriões e plantas. Entretanto, o nível de oxigenação só é adequado
quando se utilizam meios de cultura
com alta viscosidade (Tanaka et al.,
1983).
Biorreator tipo filtro rotatório
(“spin filter biorreactor”)
Biorreator de filtro rotatório apresenta um filtro conectado a um eixo
central, por onde o meio de cultura é
descarregado (Styer, 1985). Esse elemento é responsável igualmente pela
homogeneização, bem como pela aeração do material em cultivo. Esse tipo de
biorreator funciona satisfatoriamente
bem para propagação via embriogênese
somática (Wheat et al., 1986).
Biorreator tipo borbulhamento
(“air driven bioreactor”)
O biorreator tipo borbulhamento
apresenta uma constituição muito simples. A homogeneização do meio, bem
como a aeração são feitos via borbulhamento de ar no fundo do frasco. Pode
ser de dois tipos: aeração simples ou
coluna de bolha.
Biorreator de aeração
simples e coluna de bolha
(“bubble column bioreactor”)
A relação altura/diâmetro de 1 a 2
define o biorreator de aeração simples e
se a relação é 3 ou acima, o biorreator é
do tipo coluna de bolha. Esses modelos
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de biorreatores apresentam bons resultados no cultivo de hastes caulinares,
bulbos, cormos e tubérculos (Takayama
& Misawa, 1981; Takayama et al, 1991).
Esse modelo de biorreator foi desenvolvido e utilizado primeiramente na micropropagacão, por Takayama & Misawa (1981).
Biorreator do tipo
levantamento de ar
(“air lift bioreactor”)
O meio de cultura nesse tipo de
biorreator é movido de baixo para cima
dentro de um tubo situado verticalmente no interior do frasco pelas bolhas de
ar produzidas no fundo do frasco de
cultivo. Esse modelo apresenta bons
resultados, uma vez que há uma boa
aeração e homogeneização do meio de
cultura e pouco dano mecânico ao
material em cultivo (Park et al, 1989). A
única diferença desse biorreator para o
modelo anterior é que o borbulhamento
de ar é feito dentro de um tubo centralizado no frasco de cultivo.
Biorreator do tipo fase gasosa
(“gaseous phase bioreactor”)
Esse modelo é equipado com um
suporte perfurado sobre o qual o material em cultivo é posicionado. O meio de
cultura, pulverizado sobre o material em
cultivo é, em seguida, drenado pela base
de suporte e novamente bombeado e
pulverizado a intervalos preestabelecidos (Ushiyama, 1984). Esse tipo de
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O frasco de cultura desse tipo de
biorreator contém uma canalização fina
em forma de espiral feita de material
poroso ao oxigênio, que pode ser de
teflon, silicone, policarbonato ou polipropileno, através do qual o oxigênio
passa para o meio de cultura. Esse
modelo de biorreator não apresenta
problemas relacionados com o dano
mecânico, uma vez que não há nenhum
tipo de agitação, entretanto, a homogeneização do meio de cultura fica prejudicada (Luttman et al, 1994).
Biorreator do tipo
sobre-aeração
(“overlay aeration bioreactor”)
Nesse modelo, a aeração é feita por
sopramento do ar estéril sobre o meio de
cultura. Eventualmente, esse tipo de
aeração pode ser combinado com agitação suave do meio (Ishibashi et al.,
1987). Esse modelo apresenta deficiência na aeração, o que pode comprometer o crescimento, sobretudo, de células
e tecidos.
Biorreator de
imersão temporária
Em todos os modelos descritos anteriormente, com exceção daquele que
utiliza um sistema de pulverização do
meio, o material em cultivo permanece
imerso continuamente no meio de cultura. Essa imersão contínua causa problemas de hiperhidratação dos tecidos,
órgãos e plântulas. Dependendo da espécie e do tipo de meio utilizado, a
hiperhidratação dos tecidos pode causar distúrbios fisiológicos sérios, que
irão afetar o crescimento e desenvolvimento do material em cultivo.
Visando a eliminar ou a minimizar
Figura 4. Hastes de abacaxi, em cultivo, em biorreator de imersão
temporária, em meio de multiplicação
esse problema, foi desenvolvido um
modelo de biorreator chamado de imersão temporária (Alvard et al., 1993).
Nesse tipo de biorreator, o meio de
cultura permanece em contato com o
explante por um período predeterminado. Em seguida, o meio é drenado e o
explante deixa de ficar em contato
direto com o meio de cultura.
O modelo desenvolvido por Alvard
et al. (1993) é constituído de um frasco
de dois compartimentos, um superior e
um inferior, conectados entre si por um
tubo. O meio de cultura é colocado no
compartimento inferior e o material a ser
cultivado, no superior. O meio de cultura passa do compartimento inferior para
o superior pela injeção de ar no compartimento inferior. Quando todo o meio
passa para o compartimento superior,
ocorre borbulhamento e aeração do
meio em contato com o material em
cultivo. O ar é expelido através de um
orifício na tampa do compartimento
superior. Após um período preestabelecido, a pressão do ar no compartimento
inferior é aliviada, o que, por gravidade,
faz com que o meio retorne ao compartimento inferior, permanecendo aí até
que o ciclo recomece.
O modelo desenvolvido por Alvard
et al. (1993) foi modificado no que se
refere à construção, mas mantendo as
mesmas características de funcionamento, dando origem ao sistema de biorreator denominado RITA® (Teisson et al.,
1995).
O sistema RITA® vem sendo utilizado para uma série de espécies vegetais,
com diferentes tipos de explantes, apresentando resultados muito bons (Alvard
et al., 1993; Teisson et al., 1995; Etienne
et al., 1997; Cabasson et al.,
1997; Etienne et al., 1999).
Na realidade, o princípio da imersão temporária
para cultivo de fragmentos
vegetais relativamente grandes foi primeiramente descrito por Steward et al.
(1952) e relatado por Harris
& Mason (1983). Segundo
Harris & Mason (1983),
Steward et al. (1952) demonstraram que raízes de
cenoura imersos em meio
líquido não apresentavam
crescimento satisfatório e
concluíram que o motivo se
Figura 5. Mudas alongadas de abacaxi, após a
tratava de deficiência de
multiplicação e alongamento em biorreator de
oxigenação do meio de
imersão temporária, prontas para serem
cultura. Visando a contoraclimatadas
nar esse problema, delinearam e construíram um equipamento que foi denominado “auxophyton”, o qual movimentava os frascos de cultura de forma
rotacional sobre uma roda, de tal forma
que, em determinado momento, os segmentos de raiz eram expostos ao ar e, no
momento seguinte, submersos no meio
líquido, conseguindo, com isso, um
aumento da matéria fresca de 38,1 mg
em meio gelificado para 98,6 mg em
meio líquido, no “auxophyton”.
Posteriormente, um equipamento
desenvolvido por Harris & Mason (1983),
para cultivo de explantes de uva em
meio líquido em frascos tipo Erlenmeyer, apresentava o mesmo princípio
relatado por Steward et al. (1952). Nesse
equipamento, o frasco tipo Erlenmeyer
era mudado automaticamente de posição a intervalos predeterminados, de tal
forma que, em certa posição, o explante
se encontrava submerso e, em outra
posição, não submerso. O estoque inicial de explantes era obtido através do
cultivo, por 28 dias, em meio gelificado
com agar. Após 90 dias de cultivo no
meio de imersão temporária, a produção
de brotos foi sete vezes superior ao
rendimento obtido pelo mesmo período
em meio com agar.
Em 1985, Tisserat & Vandercook
desenvolveram um sistema de cultivo
em imersão temporária, que consistia de
uma grande câmara de cultura, a qual
era periodicamente cheia de meio de
cultura. Embora o controle da troca
gasosa fosse insatisfatório, esse método
de cultivo por imersão temporária mostrou ser muito superior aos cultivos em
meios gelificados.
Atken-Christie & Jones (1987) utilizaram igualmente um sistema de cultivo
em imersão temporária na propagação
de Pinus. Nesse sistema, o meio nutritivo líquido era colocado sobre o meio
sólido sobre o qual estavam os explantes. O meio permanecia em contato com
o explante por 4 a 6 horas. Após esse
período, o meio era retirado através de
uma bomba de vácuo. Esse procedimento era repetido a cada semana.
Pouco tempo depois, Aitken-Chistie
& Davies (1988) desenvolveram um sistema semi-automático de cultivo sob
imersão temporária, no qual plântulas
eram cultivadas em um grande recipiente com meio gelificado, com adição e
remoção automática e periódica do meio
líquido.
Simonton et al. (1991) desenvolve-
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c) o sistema foi desenhado para comportar diferentes números de frascos de cultivo, o que é determinado pela extensão das tubulações,
bem como pela potência do compressor ou da fonte de ar comprimido;
d) o equipamento pode ser montado
em diferentes ambientes de intensidade de luz, fotoperíodo e temperatura;
e) o equipamento pode ser utilizado
para cultivo em regime de imersão
temporária ou contínua.
f)
Figura 6. Plantas aclimatadas de abacaxi, multiplicadas em
biorreator de imersão temporária
ram um equipamento automático de
micropropagação, no qual o meio líquido era injetado sobre as plântulas em
cultivo, de acordo com um esquema de
tempo preestabelecido. Embora esse sistema tenha apresentado uma excelente
performance quanto ao preciso controle da exposição do explante ao meio de
cultura, alguns problemas foram identificados, como o uso de um frasco relativamente grande, de difícil manuseio,
além de alguns problemas de contaminação especialmente do tipo bacteriana.
Uma modificação mais recente do
modelo de biorreator de imersão temporária foi feito por Lorenzo et al. (1998)
para micropropagação de gemas de
cana-de-açúcar e Escalona et al. (1999)
para gemas de abacaxi. Esse sistema
utiliza dois frascos, sendo um para cultivo do material vegetal e outro para
estocagem do meio de cultura. O meio
de cultura é transferido de um frasco
para o outro por meio de um vácuo de
250 mm de Hg. Entretanto, não foram
apresentados detalhes adicionais da
construção e funcionamento desse tipo
de biorreator.
Os modelos de biorreatores de imersão contínua encontrados na literatura
científica, em termos gerais, são equipamentos:
a) complexos, do ponto de vista de
montagem e funcionamento;
b) destinam-se apenas ao cultivo sob
condições de imersão contínua, não
permitindo versatilidade no seu uso, por
40
ex., transformação de um modelo de
imersão contínua para imersão temporária e vice-versa;
c) de difícil manipulação durante as
fases de esterilização, carga, descarga e
troca do meio de cultura.
Por sua vez, os modelos de imersão
temporária são mais simples na sua
concepção, montagem e funcionamento.
Sistema de Biorreator
desenvolvido pela Embrapa
A Embrapa-Recursos Genéticos e
Biotecnologia desenvolveu e submeteu ao INPI, para fins de patenteamento um sistema de biorreator tomando
como base o modelo desenvolvido por
Alvard et al., (1993) e Lorenzo et al.
(1998), que permite uma grande versatilidade de uso. O equipamento apresenta as seguintes características não
encontradas em outros modelos de
biorreatores:
a) o equipamento pode utilizar diferentes tipos de frascos, os quais
podem variar em tamanho, formato, constituição, tipo de tampa,
transparência, etc.;
b) a montagem é simples e os componentes (válvulas solenóides, temporizadores, fonte de ar comprimido, filtros de ar, fluxômetro, conexões metálicas, mangueiras de silicone, etc.) podem ser de fácil aquisição ou feitura;
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no regime de imersão contínua, o
equipamento pode funcionar sob
regime de borbulhamento contínuo com diferentes fluxos de ar ou
sob borbulhamento temporário,
cujo período pode ser definido
pelo temporizador. Para isso, são
necessários pequenos ajustes no
equipamento;
g) o equipamento permite fazer, ainda, uso de uma fonte de ar artificial
com dosagens específicas de oxigênio, nitrogênio e gás carbônico;
h) o equipamento pode ser utilizado
tanto para cultivo de células e
embriões, quanto para gemas e
segmentos nodais e raiz.
Nos primeiros ensaios, o sistema foi
testado para cultivo de microestacas de
batata para microtuberização e hastes
de abacaxi visando à multibrotação e
ao alongamento das mudas, sob regime de imersão temporária. Em ambos
os casos, os resultados preliminares
foram excelentes. No momento, estão
em andamento testes definitivos com
hastes de abacaxi, em experimentos de
multiplicação para fins de comparação
com o cultivo em meio líquido estacionário e em meio gelificado. Estão
igualmente em andamento os primeiros testes de cultivo de células embriogênicas de café.
Por ser um equipamento recémdesenvolvido, várias modificações estão sendo introduzidas no sistema,
como novos e mais adequados tipos de
frascos e tampas e novos sistemas de
iluminação com vistas a ajustá-lo para
cultivo de explantes específicos, como
células e gemas, além de propiciar uma
melhora no funcionamento, bem
como no uso e economia da fonte
luminosa.
Alguns exemplos de uso podem
ser enumerados para esse sistema de
cultivo em meio líquido, de forma
semi-automática: cultivo de células
embriogênicas e não embriogênicas,
embriões somáticos de diferentes espécies, gemas axilares e apicais para
fins de multibrotação, microestacas
de várias espécies para fins de crescimento e multiplicação das hastes
caulinares, cultivo de raiz para experimentos diversos, incluindo a produção de metabólitos secundários, além
de outras aplicações, como a germinação de embrião zigótico in vitro,
em alta quantidade e em condições
totalmente assépticas.
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Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002
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