Novos compostos sintéticos com potencial
farmacológico: protecção contra stresse oxidativo
Novel synthetic compounds with pharmacological
potential: protection against oxidative stress
João Pedro Martins Soares de Castro e Silva
Orientador:
Profª. Doutora Olga Pereira Coutinho
Departamento de Biologia da Universidade do Minho
Doutoramento em Ciências
Biologia
Resumo
O stresse oxidativo tem sido descrito como um desequilíbrio entre espécies oxidantes e antioxidantes
em favor dos oxidantes, e tem sido comummente associado a diversas patologias, incluindo doenças
neurodegenerativas e cardiovasculares.
No âmbito de um projecto mais alargado com vista ao desenvolvimento de compostos úteis para o
melhoramento da saúde humana testou-se, neste trabalho o potencial farmacológico de quatro
compostos azotados sintetizados de novo (FMA4, FMA7, FMA762 e FMA796), em situações envolvendo
stresse oxidativo.
Experiências efectuadas em sistemas livres de células, usando os testes de descoloração do radical
DPPH e da degradação da 2-deoxi-D-ribose, indicaram a sua elevada actividade anti-radicalar, superior
para o FMA762 e FMA796. As propriedades de “scavenging” de radicais livres dos compostos azotados
foram confirmadas através da
observação dos seus efeitos protectores na formação de ROS/RNS intracelulares e na peroxidação
lipídica, ambas induzidas pelo par oxidante ascorbat/ferro em células PC12.
Os valores de lipossolubilidade encontrados parecem contribuir para o seu papel protector, uma vez que
são indicativos que os compostos atravessam a membrana lipídica, sendo capazes de actuar
intracelularmente. Além disso, os efeitos protectores dos compostos pareceram ser mediados pela sua
capacidade de complexação de radicais livres, uma vez que os mesmos foram incapazes de reverter a
diminuição na actividade dos sistemas naturais de defesa antioxidante, tais como os níveis de
GSH/GSSG, SOD e GPx, induzida por t-BHP.
Uma vez que os danos oxidativos no DNA são vistos como o tipo de dano mais provável de ocorrer em
células neuronais, estudaram-se os efeitos dos compostos na protecção e reparação deste tipo de dano.
Simultaneamente, realizou-se um estudo similar com os polifenóis luteolina, quercetina e ácido
rosmarínico. Usando o ensaio de Cometa, observou-se um efeito protector para todos os quatro
compostos (superior para o FMA762 e FMA796) na formação de quebras de DNA induzidas por t-BHP,
assim como um aumento na reparação deste tipo de dano. Embora os compostos azotados tenham
apresentado uma menor protecção relativamente à luteolina e à quercetina, eles não demonstraram
genotoxicidade para períodos de incubação mais longos (como descrito para a quercetina) e
apresentaram maior capacidade de reparação de quebras no DNA, de forma semelhante ao ácido
rosmarínico. Além disso, pelo menos o FMA796 e o ácido rosmarínico levaram ao aumento da
reparação de bases oxidadas induzidas com o composto fotosensibilizador Ro 19-80222. Por seu turno,
usando o ensaio in vitro de reparação de excisão de bases demonstrou-se também que ambos os
compostos azotados e o ácido rosmarínico levam a um aumento da actividade das enzimas de
reparação de DNA. Enquanto que para o ác. rosmarínico esse aumento parece ser mediado por uma
regulação a nível da expressão de genes, nomeadamente o OGG1, os efeitos benéficos dos compostos
azotados poderão ser atribuídos apenas à sua capacidade de “scavenging” de ROS.
O envolvimento do stresse oxidativo em doenças cardiovasculares, incluindo aterosclerose e
isquémia/reperfusão, tem sido igualmente descrito. Sendo assim, avaliouse o papel protector dos
compostos azotados nos danos oxidativos e em apoptose induzida por t-BHP em células H9c2. Os
compostos sintéticos, nomeadamente o FMA762
e FMA796, diminuíram a morte celular induzida por t-BHP, tal como determinado pelo ensaio de SRB e
pela quantificação de células com condensação de cromatina (marcação nuclear com Hoechst 33342).
Além disso, obtivemos evidência para o seu envolvimento na regulação de mecanismos de sinalização
intracelular conducentes a apoptose, particularmente os mediados pela mitocôndria. De facto, os
compostos mostraram capacidade para reverter alterações morfológicas a nível celular e mitocondrial
(marcação tripla com TMRM, calceína-AM e Hoechst), perda de potencial de membrana mitocondrial,
aumento de expressão das proteínas pró-apoptóticas p53, Bax e AIF, e activação das caspases 3 e 9,
eventos estes induzidos por t-BHP. Além disso, os resultados obtidos são indicativos de que a
capacidade de “scavenging” de ROS parece desempenhar um papel crucial no perfil de protecção dos
compostos, uma vez que na sua presença se observou uma diminuição na formação de ROS
intracelulares.
No seu conjunto, os resultados aqui apresentados revelam o potencial antioxidante dos novos
compostos sintéticos, demonstrando a sua forte capacidade para actuar em danos mediados por
stresse oxidativo em dois diferentes modelos celulares. Nalguns aspectos os compostos sintéticos
provaram ter vantagens relativamente a alguns polifenóis de origem natural. Deste modo, os novos
compostos nitrogenados poderão representar uma enorme inovação como princípios activos de
fármacos úteis no tratamento de várias patologias envolvendo stresse oxidativo, incluindo doenças
neurodegenerativas e cardiovasculares.
Abstract
Oxidative stress has been described as an imbalance in the equilibrium between oxidants and
antioxidants in favour of the former, and has been commonly associated with several pathologies,
including neurodegenerative and cardiovascular diseases.
As part of a broader research project aiming the development of drugs useful for the improvement of
human health, we studied the pharmacological potential of four novel synthetic nitrogen compounds
(FMA4, FMA7, FMA762 and FMA796), on different situations involving oxidative stress.
Experiments using cell-free systems, by the use of DPPH discolouration and 2-deoxy-D-ribose
degradation assays, indicated their high antiradical activity, which revealed to be superior for FMA762
and FMA796. The free radical scavenging properties of the nitrogen compounds were confirmed by
observing their protective effects on intracellular ROS/RNS formation and on lipid peroxidation, both
induced to PC12 cells, with the oxidant pair ascorbate/iron. Their relatively good liposolubility seemed to
contribute to their protective role, since it enables them to cross the lipid bilayer and act intracellularly.
Moreover, the protective effects of the nitrogen compounds seemed to be mediated by their ability to
scavenge free radicals, since they were unable to revert the t-BHP-induced decrease in the activity of the
natural antioxidant defence systems, such as GSH/GSSG levels, SOD and GPx.
Since oxidative DNA damage is regarded as the type of damage most likely to occur in neuronal cells, we
studied the effects of the compounds on the protection and repair of this kind of damage.
Simultaneously, a similar study with the polyphenols, luteolin, quercetin and rosmarinic acid, was
performed. Using the Comet assay, we observed a protective effect for all the four nitrogen compounds
(superior for FMA762 and FMA796) against t-BHP-induced strand-breaks formation, as well as an
increase in the repair of this kind of damage. In this regard, although the nitrogen compounds showed a
smaller protection relatively to luteolin and quercetin, they showed no genotoxicity for longer incubation
periods (as described for quercetin) and presented higher increases in strandbreaks repair capacity,
which were similar to rosmarinic acid. In addition, at least FMA796 and rosmarinic acid increased the
repair of oxidised bases induced with the photosensitiser compound Ro 19-8022. Furthermore, using
the in vitro base excision repair assay, we demonstrated that both nitrogen compounds and rosmarinic
acid led to an increase in the activity of DNA repair enzymes. Whereas in the case of rosmarinic acid this
increase seemed to be mediated by a regulation at the gene expression level, namely of OGG1, the
positive action of the nitrogen compounds might be attributed to their ROS scavenging activity.
Oxidative stress has also been reported to be involved in several cardiovascular diseases, including
atherosclerosis and ischemia/reperfusion injury. So, we evaluated the protective role of the nitrogen
compounds on t-BHP-induced oxidative injury and apoptosis in H9c2 cells. The synthetic compounds,
namely FMA762 and FMA796, decreased t-BHP-induced cell death, as measured both by the SRB assay
and by quantification of cells showing nuclear chromatin condensation (Hoechst 33342 staining).
In addition, evidence is shown for their involvement in the regulation of intracellular signalling
mechanisms leading to apoptotic cell death, namely those mediated by mitochondria. In fact they were
able to overcome t-BHP-induced cellular and mitochondrial morphological changes (triple labelling with
TMRM, calcein-AM and Hoechst probes), loss of mitochondrial membrane potential, increased
expression of the pro-apoptotic proteins p53, Bax and AIF, and activation of caspases 3 and 9.
Moreover, the results obtained indicate that the compounds’ ROS scavenging ability plays a crucial role
in this protection profile, as a decreased intracellular ROS formation was observed in their presence.
Altogether, the results herein presented reveal the antioxidant potential of novel synthetic compounds,
demonstrating their strong ability to act on oxidative stressmediated injury in two different cell models. In
some aspects they also prove to have advantages relatively to some polyphenols from natural origin. In
this way, the nitrogen compounds may represent a major breakthrough, as active principles of drugs
with pharmacological potential, useful in the treatment of disorders involving oxidative stress, including
neurodegenerative and cardiovascular diseases.