MARCIA MARLY WINCK YAMAMOTO
ATIVIDADE DAS ENZIMAS CORTICOESTEROIDOGÊNICAS EM
PACIENTES NORMOANDROGÊNICAS E HIPERANDROGÊNICAS
COM SÍNDROME DE OVÁRIOS POLICÍSTICOS
FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE MEDICINA
COORDENAÇÃO DE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
DA SAÚDE
CUIABÁ, MT
2012
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE MEDICINA
COORDENAÇÃO DE PROGRAMAS DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
DA SAÚDE
ATIVIDADE DAS ENZIMAS CORTICOESTEROIDOGÊNICAS EM
PACIENTES NORMOANDROGÊNICAS E
HIPERANDROGÊNICAS COM SÍNDROME DOS OVÁRIOS
POLICÍSTICOS
Dissertação apresentada ao programa de pós-graduação
em ciências da saúde, para obtenção do título de mestre
em ciências da saúde, área de concentração reprodução
humana e climatério. Linha de pesquisa endocrinologia e
climatério
MÁRCIA MARLY WINCK YAMAMOTO
ORIENTADOR: PROF.DR. SEBASTIÃO FREITAS DE MEDEIROS
2012
Dados Internacionais de Catalogação na Fonte
Y19a
Yamamoto, Marcia Marly Winck.
Atividade das enzimas corticoesteroidogênicas em pacientes
normoandrogênicas e hiperandrogênicas com síndrome de
ovários policísticos / Marcia Marly Winck Yamamoto. -- 2012.
63 f. : il. color. ; 30 cm.
Orientador: Sebastião Freitas de Medeiros.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Mato
Grosso, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação
em Ciências da Saúde, Cuiabá, 2012.
Inclui bibliografia.
1. Síndrome de ovários policísticos. 2. Distúrbios menstruais.
3. Enzimas corticoesteroidogênicas. 4. Hiperandrogenismo. 5.
Nomoandrogenismo. I. Título.
CDU618.11-008
Ficha Catalográfica elaborada pelo Bibliotecário Jordan Antonio de Souza - CRB1/2099
Permitida a reprodução parcial ou total desde que citada a fonte
DEDICATÓRIA
Ao meu marido, professor, orientador, amigo e amor da minha vida: Sebastião Freitas
de Medeiros, pelo estímulo ao crescimento científico, pelo ensino de tantos anos, pela
ajuda nas horas difíceis no trabalho, pela orientação na direção da carreira
profissional, pela orientação deste estudo e por estar ao meu lado na realização de
mais um sonho!
As minhas duas filhas Ana Karine Lin e Cindy Lin, pela paciência quando por várias
vezes eu não estava presente ou não pude atendê-las por estar estudando ou
escrevendo esta dissertação.
Ao meu pai Takehiko, por acreditar em mim, quando, pela primeira vez, manifestei o
desejo de ser médica. Ele não teve medo das dificuldades que eu poderia atravessar.
Ele simplesmente acreditou!
À minha mãe Rosvida, por ser meu exemplo de luta, trabalho, dedicação e amor.
Ao meu irmão Wanderley por me mostrar o caminho da fé cristã verdadeira.
Ao meu irmão Marcos por me estimular diariamente a seguir em frente e crescer
sempre mais um pouco.
Ao meu irmãozinho Hiroshy, por me orgulhar a cada dia com suas vitórias pessoais e
profissionais.
A minha irmã Haidy e meu cunhado Norival, meus exemplos de perseverança, por
morar e trabalhar no Japão para dar estudo aos filhos.
Ao Pastor Carlinhos e sua esposa Elisa, que me acolheram, me escutaram e me
ensinaram a orar e a entender a Bíblia. Sem sua ajuda eu hoje não estaria com minha
família restaurada e realizando mais este sonho.
AGRADECIMENTOS
À Deus, pelo amor ao ser humano, Sua criação! Por amor, Ele nos mostra o
caminho correto, mesmo que seja através da dor.
Ao Prof. Dr. Sebastião Freitas de Medeiros pela imprescindível orientação.
Sua dedicação aos estudos buscando o aperfeiçoamento profissional, pessoal e
de
seus
alunos,
é
exemplo
diário
para
colegas,
alunos,
mestrandos,
doutorandos, funcionários, familiares, amigos e pacientes.
Ao Hospital Universitário Júlio Müler, juntamente com todos os funcionários,
principalmente à equipe do laboratório, ambulatório e arquivo por proporcionar
o atendimento, realização de exames e busca de prontuários das pacientes que
participaram do estudo.
Às pacientes do ambulatório de anovulação crônica do Hospital Universitário
Júlio Muller e dos consultórios do Instituto Tropical de Medicina Reprodutiva e
Menopausa, que fizeram parte deste estudo.
Aos amigos Angelo, Érico e Jacklyne pela desprendida ajuda no levantamento e
organização dos dados do estudo.
À toda equipe INTRO, em especial Sabrina, enfermeira, administradora e
amiga por ajudar a organizar minha vida pessoal e profissional; e Arlene,
minha querida secretária, companheira diária, que pelo seu jeito carinhoso e
alegre torna o trabalho ainda mais prazeroso.
A minha amiga Claudinéia, sempre presente, prestativa e carinhosa, pelas
dicas
na
digitação,
formatação
e
preparo
das
aulas.
I
SUMÁRIO
Lista de abreviaturas e siglas..........................................................................III
Lista de figuras.................................................................................................VI
Lista de tabelas................................................................................................VII
Resumo...........................................................................................................VIII
Abstract.............................................................................................................IX
1.INTRODUÇÃO......................................................................................01
2.JUSTIFICATIVA...................................................................................08
3.OBJETIVO............................................................................................09
3.1.OBJETIVO GERAL...........................................................................09
3.2.OBJETIVOS ESPECÍFICOS.............................................................09
4.MATERIAL E MÉTODOS.....................................................................10
4.1.TIPO DE ESTUDO............................................................................10
4.2.ASPECTOS ÉTICOS.........................................................................10
4.3. TAMANHO DA AMOSTRA..............................................................10
4.4. PACIENTES.....................................................................................10
4.5. CRITÉRIOS DE ELEGIBILIDADE....................................................11
4.5.1.CRITÉRIOS DE INCLUSÃO...........................................................11
4.5.2.CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO..........................................................11
4.6. AVALIAÇÃO CLÍNICA.....................................................................11
II
4.7. DEFINIÇÕES...................................................................................12
4.8. ULTRA-SONOGRAFIA, CRITÉRIOS ULTRA-SONOGRÁFICOS....14
4.9. AVALIAÇÃO BIOQUÍMICA..............................................................14
4.10. IMUNOENSAIOS............................................................................15
4.11. TESTE DA CORTROSINA.............................................................16
4.12. ANÁLISE DE DADOS....................................................................17
5. RESULTADOS....................................................................................18
6. DISCUSSÃO........................................................................................24
7. CONCLUSÕES....................................................................................37
8.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................38
9.ANEXOS...............................................................................................55
9.1. ANEXO 01........................................................................................55
9.2. ANEXO 02........................................................................................57
9.3. ANEXO 03........................................................................................58
9.4. ANEXO 04........................................................................................59
9.5. ANEXO 05.......................................................................................60
III
ABREVIATURAS E SIGLAS
A – Androstenediona
ACTH – Hormônio adrenocorticotrófico
ASC – Área sob a curva
ASRM – American Society for Reproductive Medicine
Arg - Arginina
CRH – Hormônio liberador de corticotrofina
CT – Colesterol total
CYP – Família de enzimas citocromo
CYP11A1 – P450scc ou P450c11a1
CYP11β1 – Têm atividade 11β-hidroxilase
CYP17A1 – Têm atividade 17α-hidroxilase e 17,20 liase
CYP19A – Têm atividade P450aromatase
CYP21A1 – Têm atividade 21-hidroxilase
Cys - Cistina
DHEA – Dehidroepiandrosterona
DHEAS – Sulfato de dehidroepiandrosterona
E1 – Estrona
E2 – Estradiol
ESHRE – European Society of Human Reproduction and Embryology
F – Cortisol (composto F)
FSH – Hormônio folículo estimulante
HbA1c – Hemoglobina glicada
IV
HDL –C – Colesterol ligado à lipoproteína de alta densidade
IAL – Índice de androgênio livre
IMC – Índice de massa corporal
Ins – Insulina
LDL-C – Colesterol ligado à lipoproteína de baixa densidade
LH – Hormônio luteinizante
NIH – National Institute of Health
PE - Pregnenolona
Pep C – Peptídeo C
PRL – Prolactina
P4 – Progesterona
P450arom – Citocromo P450 aromatase
P450c17α – Citocromo P450c 17α
RI – Resistência à insulina
SHBG – Globulina de ligação dos hormônios sexuais
SOP – Síndrome dos ovários policísticos
SULT2A1 - Sulfotransferase
TG – Triglicerídeos
TSH – Hormônio estimulante da tireóide
Tt – Testosterona total
TL – Testosterona livre
T4 L – Tiroxina livre
VLDL – Colesterol ligado à lipoproteína de densidade muito baixa
V
17β-HSD – 17 β Hidroxiesteróide desidrogenase
17-OHP4 – 17 Hidroxiprogesterona
17-OHPE – 17 Hidroxipregnenolona
11β-DOC – 11β Deoxicortisol (composto S)
11β-OHA - 11β Hidroxiandrostenediona
3β-HSD - 3β Hidroxiesteroide desidrogenase
VI
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 01........................................................................................................06
Esteroidogênese adrenal e ovariana
FIGURA 02........................................................................................................23
Atividade das enzimas 17α-hidroxilase (painel A) e 17,20 liase (painel B),
antes e 60 min após injeção de cortrosina em pacientes normo e
hiperandrogênicas com síndrome dos ovários policísticos.
VII
LISTA DE TABELAS
TABELA 01.......................................................................................................18
Aspectos antropométricos das pacientes com síndrome dos ovários
policísticos com ou sem hiperandrogenemia
TABELA 02.......................................................................................................18
Aspectos clínicos das pacientes com síndrome dos ovários policísticos
normo e hiperandrogênicas
TABELA 03.......................................................................................................19
Aspectos metabólicos das pacientes com síndrome dos ovários policísticos
normo e hiperandrogênicas.
TABELA 04.......................................................................................................20
Comparação dos aspectos endócrinos entre as pacientes com síndrome
dos ovários policísticos com ou sem hiperandrogenemia
TABELA 05.......................................................................................................21
Atividade das enzimas corticoesteroidogênicas em pacientes com
síndrome dos ovários policísticos normo e hiperandrogênicas.
TABELA 06.......................................................................................................22
Incremento dos hormônios adrenais após estímulo com cortrosina em
pacientes com síndrome dos ovários policísticos normo e
hiperandrogênicas.
TABELA 07.......................................................................................................22
Resposta adrenal a cortrosina em pacientes com síndrome dos ovários
policísticos normo e hiperandrogênica.
VIII
RESUMO
OBJETIVO: Avaliar a atividade das enzimas corticoesteroidogênicas em mulheres
com síndrome dos ovários policísticos. MATERIAL E MÉTODOS: Estudo de coorte.
Cento e vinte e duas pacientes com SOP foram incluídas; oitenta e uma apresentavam
hiperandrogenismo bioquímico e quarenta e uma tinham níveis de androgênios
normais.
Foi
realizada
a
comparação
da
atividade
das
enzimas
corticoesteroidogênicas em pacientes normo e hiperandrogênicas com SOP, utilizando
a razão produto/precursor, tanto em condições basais como após estimulação adrenal.
RESULTADOS: Duas pacientes foram excluídas devido níveis de 17OHP4 30 nmol/l
após injeção de tetracosactrin. Pacientes hiperandrogênicas tiveram altos níveis de
colesterol total, baixos níveis de colesterol de alta densidade e altos níveis de insulina
quando comparadas com aquelas normoandrogênicas. Atividades da 17α-hidroxilase
e 17,20 liase foram equivalentes na via ∆5 em ambos os grupos de pacientes com
SOP. Na via ∆4, em condições basais, pacientes hiperandrogênicas tiveram aumento
da atividade da 17α-hidroxilase e 17,20 liase (p=0,005 e p=0,047, respectivamente).
Pacientes hiperandrogênicas apresentaram diminuição da atividade da 21α-hidroxilase
e 11β-hidroxilase (p 0,0001) e aumento da 3β-HSD somente na conversão de DHEA
em androstenediona. Atividades da aromatase e 17β-HSD estão diminuídas no grupo
de SOP com hiperandrogenismo. Após estimulação, atividade da 17,20 liase foi
aumentada apenas na via ∆4 (p 0,0001). CONCLUSÕES: Na via ∆5, a atividade da
17α-hidroxilase e 17,20 liase foram equivalentes em ambos os grupos de pacientes
com SOP, mas na via ∆4, a atividade da 17,20 liase foi aumentada no grupo com
hiperandrogenismo. 3β-HSD foi mais ativa na conversão de DHEA para A, enquanto
21α-hidroxilase
e
11β-hidroxilase,
foram
menos
ativas
em
pacientes
hiperandrogênicas. Após estimulação com cortrosina, somente atividade da 17,20
liase persistiu elevada na via ∆4.
UNITERMOS: Síndrome dos ovários policísticos, esteroidogênese, hiperandrogenismo
IX
ABSTRACT
OBJECTIVE: To analyze the activities of the corticosteroidogenic enzymes in
polycystic ovary syndrome (PCOS) patients. MATERIAL AND METHODS: Cohort
study. One hundred and twenty-two patients with PCOS were enrolled; eight-one of
them presented biochemical hyperandrogenism and forty one had normal androgen
levels.
Comparison
of
corticosteroidogenic
enzymes
activity
in
normo
and
hyperandrogenic PCOS patients were performed using the product/precursor ratio,
both in the baseline condition and after adrenal stimulation. RESULTS: Two patients
were excluded because 17-OHP4 levels were
30nmol/l 60 min after tetracosactrin
injection. Hyperandrogenic patients showed higher levels of total cholesterol, low levels
of high density cholesterol, and higher levels of insulin than normoandrogenic ones.
17α-hydroxylase and 17,20 lyase activities were equivalent in the ∆5 pathway in both
groups of PCOS patients. In the ∆4 pathway, in basal condition, hyperandrogenic
patients showed greater 17α-hydroxylase and 17,20 lyase activities (p=0,005 and
p=0,047, respectively). Hyperandrogenic patients presented lower 21α-hydroxylase
and 11β-hydroxylase activities (p= 0,0001) and greater 3β-HSD only in the conversion
of DHEA into androstenedione. Aromatase and 17β-HSD activities were lower in the
hyperandrogenic PCOS group. After ACTH stimulation, 17,20 lyase activity was
increased only in the ∆4 pathway (p 0,0001). CONCLUSIONS: In the ∆5 pathway,
17α-hydroxylase and 17,20 lyase activities were equivalent in both groups of PCOS
patients, but in the ∆4 pathway, the 17,20 lyase activity
was greater in the
hyperandrogenic group. 3β-HSD was more active in the conversion of DHEA to A,
whyle 21α-hydroxylase and 11β-hydroxylase, were less active in hyperandrogenic
patients. After cortrosin stimulation, only 17,20 lyase activity persisted higher in the ∆4
pathway.
UNITERMS: Polycystic ovary syndrome, steroidogenesis, hyperandrogenism.
1.INTRODUÇÃO
1
INTRODUÇÃO
A síndrome dos ovários policísticos (SOP) tem início entre os 15 e os 17
anos de idade, ou mesmo antes, seguindo a menarca. Caracteriza-se por
irregularidade menstrual crônica, amadurecimento sexual precoce (57%), obesidade
(29-41%), acne (55%), hirsutismo (51-68% nas caucasianas e 10-20% das
orientais), amenorreia secundária (51%) e amenorreia primária com obesidade em
14% (Mechanick e Futterweit, 1984; Nobels e Dewailly, 1992). Esterilidade primária e
secundária estão presentes em 46% e 26%, respectivamente. Acanthosis nigricans
tem sido encontrada entre 5-50% dos casos (Dunaif, 1997). Achados clínicos e
laboratoriais da SOP são observados em 5 a 10% das mulheres em idade
reprodutiva, em cerca de 10% das adolescentes (Franks, 1995; Knochenhauer et al,
1998; Van Hooff et al, 1999) e em 1 a 7,5% da população geral (Futterweit e
Mechanick,
1988).
Na
população
com
sinais
de
anovulação
crônica
hiperandrogênica a ultra-sonografia revela ovários policísticos em 42-80% e ovários
normais em 28% das vezes. Na população normal, a ultra-sonografia mostra sinais
sistematizados de ovários policísticos entre 16% e 23% dos indivíduos (Lujan et al,
2009).
Estima-se
que
6-60%
das
pacientes
com
anovulação
crônica,
hiperandrogenismo e obesidade têm resistência à insulina, sendo que na população
normal esta incidência é de 2,3% (Dahlgren et al, 1992).
Como os critérios para se fazer o diagnóstico diferencial entre as
síndromes hiperandrogênica têm mudado com frequência, este fato tem influenciado
a classificação e prevalência das várias alterações endócrinas que cursam com
excesso de androgênios. Até a década 1980, testes diagnósticos com bloqueio ou
estimulação adrenal e ovariano e mensuração da secreção de androgênios eram
muito utilizados no esclarecimento da fonte do hiperandrogenismo (Maroulis, 1981).
2
Na atualidade, a busca e a definição da fonte do hiperandrogenismo continuam
importantes, já que algumas condições bem caracterizadas como a síndrome de
Cushing, tumor secretor de androgênios e deficiência enzimática clássica e não
clássica, necessitam ser excluídas para se fazer o diagnóstico correto da SOP
(Zawadzki e Dunaif, 1992) e programar conduta terapêutica adequada (de Medeiros
et al, 1995).
Uma vez que a população anteriormente diagnosticada com esta
síndrome era muito heterogênea, sua definição tem sido matéria de frequentes
debates nas últimas duas décadas. A primeira tentativa de padronizar critérios
diagnósticos, proposta em reunião de especialistas, em abril de 1990, o Instituto
Nacional de Saúde Norte Americano (NIH) em sua primeira conferência, definiu
como critérios para diagnosticar a SOP: 1) anovulação crônica, 2) clínica de
hiperandrogenismo
(hirsutismo,
acne,
alopecia
androgênica)
e/ou
hiperandrogenemia, e 3) exclusão de causas secundárias como hiperprolactinemia,
disfunções da tireóide, alterações da função adrenal e tumores de ovários ou
adrenal (Zawadzki e Dunaif, 1992).
Como esta definição não fazia menção aos aspectos ultra-sonográficos
ovarianos, não obteve grande aceitação na Europa. Assim, as Sociedades NorteAmericana de Medicina Reprodutiva (ASRM) e Européia de Reprodução Humana e
Embriologia (ESHRE) realizaram reunião para consenso em Roterdã (2003). Esta
reunião resultou na proposta consensual de que o diagnóstico da SOP deve incluir
pelo menos dois dos seguintes critérios: a) oligo-ovulação ou anovulação, b) sinais
clínicos ou bioquímicos de hiperandrogenismo, c) ovários policísticos à ultrasonografia. Como definido pelos critérios de Roterdã em 2003, ovários policísticos
têm, como significado, a presença, em pelo menos um ovário, de 12 ou mais
3
folículos com diâmetros entre 2-9 mm e/ou aumento no volume ovariano
ml
(Dewailly, 1997; Balen et al, 2003; Carmina et al, 2006). O consenso de Roterdã
manteve os mesmos critérios de exclusão: hiperprolactinemia, hipo/hipertireoidismo,
hiperplasia adrenal congênita clássica e não clássica, Cushing e tumores de ovário
ou adrenal secretores de androgênios (The Rotterdam, 2004).
Os critérios de Roterdã expandiram então os do NHI, incluindo pacientes
com mais dois fenótipos, pacientes com: (a) ovários policísticos, hiperandrogenismo
e ovulação normal, (b) pacientes com ovários policísticos e oligo/anovulação, sem
sinais de hiperandrogenismo. A possibilidade de que estes dois fenótipos deveriam
de fato ser ou não incluídos no diagnóstico da SOP foi examinada recentemente,
quando foi concluída pela inexistência de dados robustos na literatura corroborando
com a inclusão dos pacientes apenas com ovários policísticos ao ultra-som sem
sinais de hiperandrogenismo, ainda que possam ter oligo ou anovulação (Azziz,
2005; Chang et al,2005; Azziz et al, 2006; Lujan et al, 2008; Bart et al, 2012).
Por fim, têm-se atualmente como critérios para definir a SOP: a)
hiperadrogenismo clínico ou bioquímico, b) oligo/anovulação e/ou ovários policísticos
ao ultra-som e c) exclusão de hiperprolactinemia, disfunções da tireóide, hiperplasia
adrenal de manifestação tardia e tumores de ovário e adrenal produtores de
androgênios (Azziz, 2005; Azziz et al, 2006; Fauser et al, 2012). Como as
modificações endócrinas e anatômicas ovarianas instalam-se gradualmente, deve-se
também considerar no diagnóstico a existência de variação temporal entre o início
da síndrome e o aparecimento do conjunto de sinais e sintomas, incluindo o aspecto
policístico ovariano (Bloom et al, 2006). Na verdade, do ponto de vista clínico, são
extremamente relevantes tanto a documentação do hiperandrogenismo como o local
de sua produção (de Medeiros et al, 1995; Gil-Junior et al,2010). A SOP tem se
4
tornado quase sinônimo de hiperandrogenismo, já que em mulheres com sinais
clínicos de hiperandrogenismo, a prevalência desta síndrome pode ser de até 82%
(Azziz et al, 2004).
Após definição dos critérios diagnósticos da SOP em Roterdã (The Rotterdam 2004),
hiperandrogenismo bioquímico tem sido encontrado entre 75% - 82% destas
pacientes (Azziz et al, 2004; Broekmans et al, 2006; Huang et al, 2010; Gil-Junior et
al, 2010). Devido às repercussões clínico-metabólicas a curto e longo prazo do
hiperandrogenismo bioquímico e a racional abordagem terapêutica, é relevante que,
laboratorialmente, se documente a elevação dos androgênios na SOP (de Medeiros
et al, 1995). Mesmo após exclusão das pacientes com deficiências enzimáticas
clássicas do grupo de pacientes com SOP, parece haver ainda nesta síndrome
hiperatividade ou desregulação das enzimas corticoesteroidogênicas (Qin e
Rosenfield, 1998; Gil-Junior et al, 2010).
Os mecanismos fisiopatológicos da SOP são ainda incertos (Franks et al,
1997; Dunaif, 1997; Tsilchorozidou et al, 2004; Franks e Berga, 2012). Há alterações
no eixo hipotálamo-hipófise-ovariano com maior frequência dos pulsos do hormônio
luteinizante (LH), elevação dos níveis basais desta gonadotrofina, estímulo
monotônico do LH sobre as células tecais e maior secreção de testosterona e
androstenediona nestas células (de Medeiros e Yamamoto, 2001). Como a ação do
hormônio folículo estimulante (FSH) não se modifica ou mesmo diminui, há menor
aromatização dos androgênios na granulosa e acúmulo destes na circulação
(Jakimiuk et al, 1998). Substâncias que atuam localmente nos ovários, como insulina
e fatores do crescimento, podem amplificar a ação do LH e modular a ação das
enzimas esteroidogênicas na teca e granulosa (Gilling-Smith et al, 1997). Em
relação à função do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal na SOP, parece não haver
5
alteração na pulsatilidade do CRH, permanecendo normais os níveis basais de
hormônio adrenocorticotrófico (ACTH). No entanto, parece haver hiperatividade
adrenal generalizada, com amplificação local do estímulo do ACTH (Carmina e
Lobo, 1990) ou aceleração do catabolismo do cortisol (Gambineri et al, 2009), como
mecanismos responsáveis pela elevação dos androgênios adrenais na SOP,
principalmente dehidroepiandrosterona (DHEA) e seu sulfato (DHEAS) (Doi et al,
2005).
Nas adrenais a síntese de cortisol (F) e dehidroepiandrosterona (DHEA)
requer ação das enzimas de clivagem das cadeias laterais do colesterol-P450scc
(CYP11A1) e citocromo P450c17α (CYP17A1). Apesar da enzima P450c17α ter
maior expressão na camada fasciculada do que na reticulada, apenas a camada
reticulada sintetiza androgênios (Suzuki et al, 2000). A enzima P450c17α possui
atividades 17α-hidroxilase e 17, 20 liase (Rainey et al, 2002), sendo maior atividade
17α-hidroxilase na fasciculada e atividades 17α-hidroxilase e 17,20 liase
equivalentes na camada reticulada (Rainey et al, 2002). Por ação17α-hidroxilásica a
P450c17α liga e metaboliza rapidamente pregnenolona (PE) e progesterona (P4) em
17α-hidroxipregnenolona (17α-OHPE) e 17α-hidroxiprogesterona (17α-OHP4); mais
lentamente, via 17,20 liase, converte estes dois substratos em DHEA e
androstenediona (A) (Payne e Hales, 2004; Figura 1).
6
Figura 1: Representação esquemática da esteroidogênese adrenal e ovariana. Modificada de AH Payne & DB
Hales. P450scc: enzimas de clivagem das cadeias laterais do colesterol. 3β-HSD: 3β-hidroxiesteroide
desidrogenase. 17β-HSD3: 17β- hidroxiesteroide desidrogenase III. 17β-HSD1: 17β-hidroxiesteroide
desidrogenase I. Endocrine Review. 25:947-70, 2004.
Duas outras enzimas adrenais, 3β-hidróxiesteróide desidrogenase II (3βHSD) e sulfotransferase (SULT2A1) direcionam estes precursores (PE, 17α-OHPE,
P4, 17α-OHP4) para a síntese de DHEA, A e DHEAS, sendo que a SULT2A1, com
expressão principalmente na reticulada, tem a DHEA como precursor na síntese da
DHEAS. A 3β-HSD catalisa a oxidação e isomerização dos 3β-hidroxiesteróides (via
∆5) em 3-cetoesteróides (via ∆4),produzindo progesterona (P4) e 17α-OHP4 a partir
dos precursores PE e 17α-OHPE (Figura 1). Na esteroidogênese, 3β-HSD e
P450c17α competem por estes substratos. Assim, havendo maior atividade da 3βHSD II prevalece a síntese de aldosterona, em detrimento da produção de cortisol e
DHEA. Por outro lado, baixa atividade da 3β-HSD II com maior atividade P450c17α
7
favorece a produção de androgênios (Rainey e Nakamura, 2008). A elevação dos
androgênios ovarianos implica no aumento de testosterona (T) devido ao aumento
intrínseco da secreção dos androgênios pelas células da teca (Gilling-Smith et al,
1997) ou amplificação do sinal de LH nestas células pela insulina (Dunaif et al,
1992). Elevada atividade 17β-HSD ou diminuição da P450 aromatase (P450arom)
nas células ovarianas também elevam os níveis séricos da testosterona.
Após a exclusão das deficiências clássicas da 21α-hidroxilase, 3β-HSD e
11β-hidroxilase, defeitos leves ou ações não balanceadas destas enzimas, podem
responder pelo hiperandrogenismo na SOP (Chang et al, 1995; Zhang et al, 1995).
Poucos estudos examinaram as atividades destas enzimas na SOP, utilizando as
razões precursor/produto ou produto/precursor (Bayoumi e Althman, 2001; Dolfing et
al, 2003). Quando se utiliza a razão precursor/produto a deficiência enzimática é
identificada pela elevação desta fração e no exame da razão produto/precursor o
resultado é o inverso e a deficiência da enzima é presumida pela diminuição desta
razão. O presente estudo tem como proposta examinar as atividades das enzimas
corticoesteroidogênicas nas pacientes com SOP pela razão produto/precursor e
comparar estas atividades entre as pacientes com androgênios normais ou
elevados, provendo assim novas informações acerca da corticoesteroidogênese
ovariana e/ou adrenal após introdução dos critérios de Roterdã.
2. JUSTIFICATIVA
8
Justificativa
A síndrome dos ovários policísticos acomete entre 5% e 10% das
mulheres em idade reprodutiva, sendo a doença endócrino-metabólica mais comum
na mulher em idade fértil. Seu diagnóstico implica em aumento do risco de
esterilidade por anovulação, abortamento, diabetes gestacional, sangramento
uterino anormal, câncer de endométrio, obesidade, diabetes mellitus tipo II,
dislipidemia, hipertensão arterial, apneia do sono e várias doenças cardiovasculares.
Apesar do esforço para definir as causas da SOP, sua fisiopatologia permanece
pouco compreendida; assim, determinar os mecanismos causais da SOP com o
objetivo de prevenir o aparecimento de complicações tardias são os maiores
objetivos das pesquisas em ginecologia endócrina e medicina reprodutiva.
Tendo em vista a introdução dos critérios diagnósticos de Roterdã, dos
novos conhecimentos e conscientização das possíveis complicações tardias da
SOP, é recomendável que estudos epidemiológicos e clínicos anteriores sejam
reexaminados. Após definição dos parâmetros clínico-laboratoriais atuais e
esclarecimentos dos critérios de exclusão para o diagnóstico da SOP, o perfil
hormonal destas pacientes necessita ser revisto. A proposta deste estudo é avaliar a
participação das enzimas corticoesteroidogênicas nesta síndrome, provendo, assim,
conhecimentos para maior compreensão dos efeitos endócrino-metabólicos nocivos
desta síndrome.
3. OBJETIVOS
9
Objetivos
Objetivo geral
Avaliar a atividade das enzimas corticoesteroidogênicas em pacientes
normo e hiperandrogênicas com síndrome dos ovários policísticos.
Objetivos específicos
1. Comparar as variáveis antropométricas entre os pacientes com SOP normo e
hiperandrogênicas
2. Comparar as concentrações séricas de cortisol, estradiol, FSH, 17α-OHPE,
homônios tireoideanos, PRL, LH, T, 17α-OHP4, 11β-DOC, DHEAS, A, P4 e
SHBG entre pacientes normo e hiperandrogênicas com SOP.
3. Examinar a atividade da enzima P450c17α nas pacientes normo e
hiperandrogênicas com SOP, em condições basais.
4. Examinar a atividade da enzima P450c17α em pacientes com SOP após
estímulo adrenal com cortrosina.
5. Verificar a atividade da enzima 3β-hidroxiesteróide desidrogenase na SOP
6. Avaliar as atividades da aromatase e 17β-HSD em pacientes normo e
hiperandrogênicas com SOP.
7. Comparar a atividade combinada das enzimas 21α-hidroxilase e 11βhidroxilase entre pacientes normo e hiperandrogênicas com SOP.
8. Comparar a atividade combinada das enzimas 3β-HSD, 11β e 21α-hidroxilase
entre pacientes normo e hiperandrogênicas com SOP.
4. MATERIAL E MÉTODOS
10
Material e Métodos
4.1.Tipo de estudo
Estudo coorte
4.2. Aspectos éticos
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital
Universitário Julio Muller da UFMT. O termo de consentimento livre e esclarecido
(TCLE) foi aplicado na primeira entrevista, independentemente da paciente ter ou
não o diagnóstico de SOP confirmado.
4.3. Tamanho da amostra
O tamanho da amostra foi calculado assumindo concentração média de
testosterona total na SOP de 2,6 nmol/l, com desvio padrão de 1,2 nmol/l (Gil-Junior
et al, 2010),
diferença entre as médias da T entre pacientes normo e
hiperandrogênicas de 0,7 nmol/l, teste de significância de uma direção, erro alfa de
0,05 e erro beta de 0,84. O tamanho da amostra foi ainda ajustado para comparação
entre grupos de tamanhos diferentes (Daly e Bourke, 2000).
4.4. Pacientes
Todas as pacientes foram atendidas prospectivamente no ambulatório de
anovulação crônica do Hospital Universitário Júlio Muller e no Instituto Tropical de
Medicina Reprodutiva e Menopausa. Cento e vinte e duas pacientes com SOP,
identificadas de acordo com os critérios de Roterdã revistos por Azziz (Azziz et al,
2006) foram incluídas. Tendo-se em conta os níveis de androgênios circulantes, 81
tinham hiperandrogenismo, sendo que 70,7% tinham índices de androgênios livres
11
7; 75,6% tinham androstenediona
33,8% tinham DHEAS
8,7 nmol/l, 34,4% testosterona
2,4 nmol/l e
6,7 nmol/l. Quarenta e uma pacientes tinham níveis séricos
de androgênios normais e foram usadas para comparação (Bloom et al, 2006). Duas
destas pacientes, uma em cada grupo, foram excluídas após a primeira avaliação
por apresentarem níveis de 17α-OHP4
30 nmol/l 60 minutos após teste dinâmico
com cortrosina.
4.5. Critérios de elegibilidade
4.5.1. Critérios de inclusão
Foram incluídas as pacientes com diagnóstico clínico de SOP, utilizando
os critérios propostos em Roterdã: (a) oligo-ovulação ou anovulação, (b) sinais
clínicos de hiperandrogenismo (The Rotterdam, 2004). Apenas as pacientes que
concordaram em assinar o TCLE participaram do estudo.
4.5.2. Critérios de exclusão
. Foram excluídas do estudo, as pacientes que tivessem feito uso de
esteroides sexuais ou sensibilizadores de insulina nos últimos seis meses e aquelas
com hiperprolactinemia, hipotireoidismo, hipertireoidismo ou deficiência das enzimas
21α-hidroxilase, 11β-hidroxilase e 3β-hidroxiesteróide desidrogenase, ou tumores de
ovário e adrenal.
4.6. Avaliação clínica
Todas as pacientes foram submetidas à anamnese, detalhando os
aspectos reprodutivos e ginecológicos: idade da menarca, padrão menstrual, idade
do início e tipo de evolução dos sinais de hiperandrogenismo. Na sequência, todas
foram submetidas a
exame
físico
para
registro
dos parâmetros clínico-
12
antropométricos. A altura foi medida no estadiômetro de Harpender (Holtain Limited,
England) com a paciente em pé, sem sapatos, calcanhares afastados em 20-25 cm
e cabeça na posição horizontal. O peso foi verificado com a paciente usando apenas
vestes leves, aproximando-se para o 0,1Kg mais próximo. O índice de massa
corporal (IMC), usado para medir a adiposidade total, foi calculado pelo peso (Kg)
dividido pelo quadrado da altura (m²). Este parâmetro foi escolhido por apresentar a
melhor correlação com a massa gorda total (Key et al, 1972). A circunferência da
cintura, usada para medir a adiposidade visceral, foi medida em centímetros com a
paciente em pé, no plano horizontal, a meia distância da crista ilíaca e a margem do
arco costal inferior. A circunferência do quadril foi medida no plano da circunferência
máxima sobre as nádegas, arredondando-se para o 0,5 cm mais próximo (Clausen
et al, 1996). A superfície corporal foi estimada pela fórmula altura (cm) x peso
(Kg)/3600]
(Mosteller, 1987).
4.7. Definições
Reiterando, definiu-se SOP pelos critérios de Roterdã modificados (Azziz,
2006),
como
existência
de:
hiperandrogenismo
(hirsutismo,
acne
e/ou
hiperandrogenemia), disfunção ovariana (oligo/anovulação e/ou ovários policísticos
na ultrasonografia), exclusão de hiperprolactinemia, hiperplasia adrenal congênita,
neoplasias secretoras de androgênios, síndrome de Cushing, hipo/hipertireoidismo,
severa síndrome de resistência à insulina, uso de drogas androgênicas ou
anabolizantes. Ovários policísticos foram definidos pela presença de 12 ou mais
folículos, em pelo menos um ovário, medindo de 2 a 9 mm em diâmetro e/ou volume
ovariano
10 ml. Hiperandrogenismo clínico foi definido pela presença de acne e/ou
hirsutismo, não se utilizando de nenhum critério pré-estabelecido para classifica-los.
Hiperandrogenismo bioquímico foi definido por níveis de testosterona total
70 ng/dl
13
(2,4 nmol/l), sulfato de dehidroepiandrosterona
androstenediona
248 µg/dl (6,7 µmol/l),
245 ng/ml (8,7 nmol/l) e índice de androgênio livre (IAL)
7
(Silfen et al, 2003). O índice de androgênios livres foi estimado pela equação:
testosterona total (nmol/l) / SHBG (nmol/l) x 100 (Gurusinghe et al, 2010). A
atividade das células pancreáticas β foi examinada pelo modelo homeostático
HOMA-β (20 x Io µU/ml/Go mmol/L – 3,5). Resistência à insulina (RI) foi definida por
níveis basais de insulina
12,2 µU/ml, (Mc Auley et al, 2001), SHBG
20 nmol/l
(Dewally et al, 1993) ou pelo resultado do modelo homeostático HOMA-RI (Go
mmol/l x Io µU/ml/22,5)
2,8; onde Go= glicemia de jejum e Io= insulina de jejum
(Mathews et al, 1985). Hipotireoidismo foi definido por concentrações de TSH > 4,2
µUI/mL e T4L = 0,7ng/dL (9 pmol/L) (M Adachi et al, 2012). Hipertireoidismo foi
definido por TSH ≤ 0,1 um/L e T4L > 1,6 ng/dL (20,6 pmol/L) (Hallowell et al, 2002).
Hiperprolactinemia foi definida com PRL> 30 ng/mL.
Em relação aos defeitos enzimáticos adrenais, as pacientes com
hiperplasia adrenal de manifestação tardia por deficiência da enzima 21αhidroxilase, foram excluídas no início do estudo quando os níveis basais de 17αOHP4 fossem
500 ng/dl ( 15 nmol/l); quando eram
200 e
500 ng/dl as
pacientes foram incluídas no estudo e submetidas ao teste da cortrosina. Além
disso, considerando a possibilidade de falso negativo com o limite de 200 ng/dl,
todas as pacientes com resultados de 17α-OHP4
100 ng/dl e
200 ng/dl foram
também submetidas ao teste. A deficiência da enzima 21α-hidroxilase foi
definitivamente excluída por níveis de 17α-OHP4
1000 ng/dl (30nmol/l) 60 min
após o estímulo com cortrosina (New et al, 1983). A deficiência da 3β-HSD foi
descartada com níveis basais de 17α-OHPE
13,5 nmol/l; deficiência de enzima
14
11β-hidroxilase foi descartada pelos níveis de 11β-deoxicortisol
(11β-DOC)
8
ng/ml ( 0,24 nmol/l) (Sahin e Kelestimur, 1997).
4.8. Ultra-sonografia e critérios ultra-sonográficos
Volume ovariano e distribuição dos folículos
10 mm foram examinados
por ultra-sonografia , usando transdutor vaginal com frequência de 5-MHZ (Voluson®
E8, GE Helthcare, Inglaterra). O volume ovariano foi calculado pela fórmula para
comprimento, largura e altura: 0,5233 x D1 x D2 x D3, onde D1, D2 e D3 foram
tomados como os diâmetros máximos (Balen et al, 2003). Ovários policísticos foram
definidos pela presença de 12 ou mais folículos em pelo menos um dos ovários,
medindo 2 a 9 mm em diâmetro, e/ou volume ovariano
10 ml ao ultra-som (The
Rotterdam, 2004).
4.9. Avaliação bioquímica
Os ensaios bioquímicos foram realizados no Laboratório Central do
Hospital Universitário Julio Muller ou Laboratório Carlos Chagas. Vinte mililitros de
sangue foram colhidos após 10-12 h de jejum. A concentração de glicose plasmática
foi determinada pela reação da glicose oxidase (Beckman glucose analyser,
Fullerton, CA, USA). Hemoglobina glicada foi determinada pelo método HPLCCromatografia Liquída de Alta Performance (Bio-Rad Laboratories, Hércules, CA,
USA). Colesterol total (CT), triglicerídeos (TG) e colesterol ligado à lipoproteína de
alta densidade (HDL-C) foram estimados por métodos enzimáticos (Wiener Lab BT
3000 plus, Rosário, Argentina). A fração LDL colesterol (LDL-C) foi calculado pela
fórmula: LDL-C = CT – (HDL-C + TG/5) (Friedewald et al, 1972).
15
4.10. Imunoensaios
Como os vários esteroides examinados neste estudo sofrem alterações
com a fase do ciclo menstrual ou hora do dia, as amostras foram colhidas pela
manhã, até o quinto dia do início do fluxo menstrual ou, estando a paciente em
amenorreia, em qualquer dia, independente do tempo transcorrido desde a última
menstruação, tendo-se o cuidado de marcar as colheitas com a dosagem de
progesterona para certificação de que a amostra não tenha sido colhida após
eventual ovulação. Os resultados foram validados sempre que os níveis de
progesterona fossem
1,0 ng/ml (
8 nmol/l).
Os níveis hormonais no soro foram quantificados por métodos bem
estabelecidos e previamente validados. Utilizando kits disponíveis comercialmente,
as seguintes análises foram realizadas: FSH, LH, TSH, tiroxina livre, estradiol,
progesterona, testosterona, androstenediona, 17α-OHP4, 17α-OHPE, DHEAS, PRL,
cortisol, 11β-DOC, insulina e SHBG. Progesterona no soro foi mensurada por
quimioluminescência (Advia Centaur, Siemens Healthcare Diagnostics, UK) com
sensibilidade de 0,67 nmol/l (0,21 ng/ml), coeficientes de variação intra-ensaio e
inter-ensaio entre 3,7%-12,4% e 2,6%-3,9%, respectivamente. LH, FSH, TSH,
estradiol, PRL, SHBG, testosterona total e tiroxina livre no soro foram mensurados
por eletroquimioluminescência (Elecsys 1010, Roche diagnostics GMbH, Mannheim,
German). A sensibilidade e o coeficiente de variação intra-ensaio e inter-ensaio
foram respectivamente de 0,1 mUI/l, 1,8% e 3,4% para o LH; 0,1 mUI/ml, 1,8% e
3,5% para o FSH; 0,27µUI/ml, 2,1% e 8,6% para o TSH; 18,4 pmol/l, 3,3 % e 6,2%
para o estradiol; 0,002 nmol/l, 2,8% e 5,0% para PRL; 0,35 nmol/l, 2,6% e 5,6% para
SHBG; 0,069 nmol/l, 2,7% e 6,0% para testosterona total e 0,3 pmol/l, 3,6% e 6,2%
para tiroxina livre. Androstenediona, DHEAS, cortisol e insulina foram medidos por
16
quimioluminescência
(Siemens
Medical
Solution
Diagnostics,
CA,
USA);
sensibilidades, imprecisões intra e inter-ensaios foram, respectivamente, de 1,0
nmol/l, 6,4% e 8,2% para androstenediona; 0,08 µmol/l, 4,9% e 8,8% para DHEAS;
5,5 nmol/l, 5,8% e 8,6% para cortisol e 2 µUI/ml, 4,9% e 6,4% para insulina. 17αOHP4 foi medida por radioimunoensaio (Siemens Health Care Diagnostics Inc., CA,
USA), com sensibilidade de 0,21 nmol/l, coeficientes de variação inter e intra-ensaio
de 5,5% e 7,9% respectivamente. 11β-DOC foi medida por HPLC/RIE desenvolvido
in-house pelo laboratório Álvaro, Paraná, com sensibilidade de 0,3 nmol/l e
coeficientes de variação intra e inter-ensaio de 5,3% e 10,8% respectivamente. 17αOHPE foi medida por radioimunoensaio após cromatografia (HPLC), usando
hormônio marcado (NEN Life Science Products, Boston, MA, USA) e antissoro
fornecido pela ICN Biochemical Inc (Costa Mesa, CA, USA). A sensibilidade foi de
0,033 nmol/l e os coeficientes de variação intra e inter-ensaio foram de 8,9% e
11,0%, respectivamente.
4.11. Teste da cortrosina
O teste da cortrosina foi realizado entre 8:00-9:00 h após jejum de 12 h,
com a paciente sentada. Após a punção venosa e fixação de cateter heparinizado,
colheu-se 5 ml de sangue em tubo vacutainer® (Becton Dickinson UK Ltd, Plymouth,
Inglaterra). Fez-se então injeção em bolus de 0,25 mg de tetracosactrin
(Synacthen®, Novartis Pharmaceuticals, NJ, USA), colhendo-se novas amostras 30
e 60 min após, para dosagem de 17-OHP4, F, A e P4. A resposta de cada hormônio
foi avaliada pela área sob a curva (ASC) com inclusão do valor basal, usando a
regra do trapézio, e pelo incremento máximo (∆) determinado como a diferença entre
o valor basal e valor máximo alcançado dividido pelo valor basal. Considerou-se
resposta adrenal exagerada quando os níveis do cortisol 30 min após o estímulo
17
foram
18 µg/dl ou fossem aumentados em pelo menos 7 µg/dl (Gambineri et al,
2009). Esta resposta foi considerada ainda amplificada quando os níveis de 17αOHP4 foram
15nmol/l e
30 nmol/l 60 min após injeção da cortrosina.
4.12. Análise dos dados
Os resultados foram resumidos em figuras ou tabelas. A atividade das
enzimas foi avaliada através da relação produto/precursor. A distribuição de todos os
dados foi examinada pelo teste de Lilliefors. Dados com distribuição não paramétrica
foram transformados em escala logarítmica para análise e, ao final, retransformados
para as unidades originais. Assim estes resultados são apresentados como média
( ) e desvio padrão (DP). Variáveis que não mostraram distribuição gaussiana após
transformação logarítmica são apresentadas como mediana e primeiro e terceiro
quartis. Significâncias das comparações entre variáveis com distribuição normal
foram examinadas pelo teste de Welch não pareado. Variáveis com distribuição não
paramétrica foram comparadas pelo Wilcoxon sum rank test ou teste de proporção.
Valores de p menores que 0,05% foram considerados com significância estatística.
5. RESULTADOS
18
Resultados
As pacientes tinham idade média de 27,2
5,5 anos. Em relação à cor,
56,0% eram brancas, 20,2% negras, 1,8% indígenas, 1,8 % amarelas e 20,2%
miscigenadas; 73,9% eram casadas, 23,3% solteiras e 2,8% não declararam seu
estado civil. Considerando todas as pacientes, esterilidade conjugal foi motivo de
consulta em 40% das pacientes; 67,5% das pacientes tinham ciclos menstruais com
intervalos
34 dias ou amenorreia, 23,3% eram hirsutas, 21,6% apresentavam
acne. Acanthosis nigricans foi identificada em 23,3% das pacientes. A comparação
dos aspectos clínicos entre normo e hiperandrogênicas é mostrada na tabela 01.
Tabela 01. Aspectos clínicos das pacientes com SOP normo e hiperandrogênicas
Variável
Hirsutismo
Acne
Acanthosis nigricans
Esterilidade
Amenorréia
Oligomenorréia
Normoandrogênicas Hiperandrogênicas
N(%)
N(%)
7(17,5%)
21(26,3%)
10(25%)
16(20%)
8(20%)
20(25%)
8(20%)
40(50%)
15(37,5%)
48(60%)
4(10%)
14(17,5%)
0,610
0,768
0,770
0,064
0,117
0,678
– Teste de proporção
Não se observou diferença na idade, ou variáveis antropométricas, entre
pacientes com SOP normo ou hiperandrogênicas (tabela 2).
Tabela 02. Aspectos antropométricos das pacientes com síndrome dos ovários policísticos
com ou sem hiperandrogenemia.
Variável
Normoandrogenemia
Hiperandrogenemia
N
DP
N
DP
Idade (anos)
39
26,66 5,80
79
26,94 5,41 0,801
Peso (Kg)
38
74,65 25,59
75
75,40 16,25 0,869
Estatura (m)
37
1,58
0,06
64
1,57
0,07 0,450
37
29,60 9,97
64
30,60 6,52 0,587
IMC (Kg/
Cintura (cm)
39
87,93 18,60
59
90,93 13,10 0,422
Quadril (cm)
32
106,59 16,92
59
107,73 12,80 0,740
Razão (c/q)
32
0,82
0,06
59
0,84
0,07 0,157
37
1,79
0,31
64
1,81
1,19 0,899
Superfície corporal (
– Teste de Welch não pareado
19
Os dados do metabolismo dos lipídeos e glicídeos são mostrados na tabela 3. As
pacientes hiperandrogênicas têm níveis mais elevados do colesterol total (p 0,001)
e níveis mais baixos do HDL-C do que as normoandrogênicas (p=0,031). Em relação
ao metabolismo dos açúcares, a glicemia de jejum e a hemoglobina glicada
mostraram níveis semelhantes nas pacientes normo e hiperandrogênicas (p=0,353 e
0,196,respectivamente). No entanto, as pacientes hiperandrogênicas mostraram
níveis mais elevados de insulina de jejum (p=0,0033), maior produção de insulina
pelas células pancreáticas β (p
0,0001) e, considerando o HOMA-IR, maior
resistência à insulina (p=0,003).
Tabela 03. Aspectos metabólicos das pacientes com SOP normo e hiperandrogênicas
Variável
Colesterol total (mmol/l)
HDL-C (mmol/l)
LDL-C (mmol/l)
Glicemia jejum(mmol/l)
Hb A1c (%)
HOMA-IR
HOMA-B
Insulina (pmol/l)
Peptideo C (nmol/l)
Normoandrogênicas
N
DP
35
4,53
1,15
33
1,36
0,39
33
2,61
1,02
35
5,15
0,52
29
7,44
2,27
32
2,40
1,71
32
108,47
2,04
32
61,29
1,92
20
0,82
0,38
N
68
61
61
73
52
65
65
71
43
Hiperandrogênicas
DP
5,78
1,17
1,19
0,28
2,93
0,85
5,09
0,67
6,81
1,83
3,81
1,63
162,36
1,08
82,14
1,96
1,10
0,83
0,0001
0,031
0,130
0,353
0,196
0,003
0,0001
0,0033
0,071
a-Teste de Welch não pareado
Em condições basais as pacientes com SOP hiperandrogênicas
mostraram níveis mais elevados de LH, P4, testosterona total, A, DHEAS, 17αOHP4 e 11β-DOC e níveis mais baixos de SHBG do que aquelas com androgênios
normais (tabela 4). Cortisol, estradiol, FSH, PRL,17α-OHPE e hormônios tireoidianos
tiveram concentrações semelhantes nos dois grupos de pacientes.
20
Tabela 04. Comparação dos aspectos endócrinos entre as pacientes com síndrome dos
ovários policísticos com ou sem hiperandrogenemia
LH (mUI/ml
Normoandrogênicas
N
DP
36
2,50
1,31
35 14,56
1,16
37 513,18 348,88
38
6,66
1,91
Hiperandrogênicas
N
DP
72
2,19
1,16
62 14,23
1,46
75 489,80 246,97
74
9,32
1,69
FSH (mUI/ml
Razão FSH/LH
Testosterona total (nmol/l
SHBG (nmol/l
IAL (%)
Cortisol (nmol/l)
17α-hidroxipregnenolona (nmol/l
17α-hidroxiprogesterona (nmol/l
11β-deoxicortisol (nmol/l
DHEAS (µmol/l
Androstenediona (nmol/l
Estradiol (nmol/l
Progesterona (nmol/l
38
38
35
35
31
35
17
35
32
36
34
31
32
74
74
74
43
63
78
34
76
44
71
75
50
50
Hormônio
TSH (µUI/ml)
Tiroxina livre (pmol/l
Prolactina (pmol/l
6,10
2,57
1,50
39,35
4,16
347,80
4,98
3,36
6,13
3,74
5,15
162,51
61,29
1,49
1,54
0,50
1,67
1,77
139,40
2,80
1,60
1,73
1,54
1,51
64,80
1,92
5,64
2,85
2,20
25,38
10,17
358,90
6,07
4,74
7,29
5,31
11,49
191,97
175,36
1,39
1,41
1,04
1,70
5,86
172,10
3,55
1,66
1,71
2,70
4,96
97,0
1,52
0,233
0,224
0,824
0,118
0,352
0,717
0,239
0,005
0,0002
0,105
-Dados sofreram transformação logarítmica para atender os preceitos da distribuição gaussiana .
–Teste Wilcoxon
não pareado. *- Para converter unidades internacionais gravimétricas (UI) para unidades – massa divida 0,0347 para
testosterona total; 0,0271 para DHEAS; 0,0301 para 17-OHPE; 0,0303 para 17-OHP4; 0,0349 para androstenediona; 0,0289
para 11-DOC; 27,6 para cortisol; 3,67 para estradiol; 3,18 para progesterona e 0,04348 para PRL.
Na esteroidogênese adrenal e gonadal, as enzimas envolvidas na
transformação da pregnenolona em dehidroepiandrosterona e da progesterona em
androstenediona são as mesmas (17α-hidroxilase e 17,20 liase) e as vias de
transformação são conhecidas, respectivamente, como vias delta 5 (∆5) e delta 4
(∆4). Na avaliação da atividade das enzimas envolvidas na esteroidogênese em
condições basais (tabela 5), a enzima P450c17α mostrou maior atividade tanto da
17α-hidroxilase (17α-OHP4/P4 de 2,21 vs 3,49; p=0,0005) quanto da 17,20 liase, na
via ∆4 (A/17α-OHP4 de 2,58 vs 3,38; p=0,047), nas pacientes hiperandrogênicas. Na
via ∆5, as atividades 17α-hidroxilase e 17,20 liase não foram diferentes entre
mulheres normo e hiperandrogênicas. A enzima 3β-HSD mostrou maior atividade
nas pacientes hiperandrogênicas (A/DHEAS de 1,52 vs 3,02; p
0,0001), mas a
17α-OHPE é convertida em 17α-OHP4 na mesma razão entre mulheres normo e
21
hiperandrogênicas (p=0,837). As atividades das enzimas 21α-hidroxilase (11βDOC/17α-OHP4 de 2,2 vs 1,0; p 0,0001) e 11β-hidroxilase (C/11β-DOC de 74,4 vs
54,2;
p 0,0001)
estão
significativamente
diminuídas
nas
pacientes
hiperandrogênicas (tabela 5). As razões estradiol/androstenediona (
estradiol/testosterona (
/T), calculadas para
foram
pacientes
menores
nas
/A) e
avaliar a atividade da aromatase,
hiperandrogênicas
(p=0,0006
e
p=0,009,
respectivamente); todavia a conversão da androstenediona em testosterona, por
ação da enzima 17β-HSD, avaliada pela razão T/A, é menor nestas pacientes
hiperandrogênicas (p=0,006).
Tabela 05. Relação produto/precursor para calcular a atividade das enzimas
corticoesteroidogênicas em pacientes com síndrome dos ovários policísticos normo e
hiperandrogênicas
Enzima
Aromatase
17β-HSD3
11β-hidroxilase
21α-hidroxilase
3β-HSD (x
P450c17α
17α-hidroxilase
(∆4)
17,20 liase (∆4)
17,20 liase (∆5)
(x
11β-hidroxilase e
21α-hidroxilase
3β-HSD, 11βhidroxilase e 21αhidroxilase
Normoandrogenemia
N
DP
29
121,03
53,54
24
32,93
15,35
29
0,30
0,15
29
74,48
1,67
29
2,20
1,07
31
1,52
0,79
Hiperandrogenemia
N
DP
48
90,60
38,11
45
19,88
11,64
68
0,21
0,12
42
54,27
1,96
39
1,09
0,41
66
3,02
2,50
0,009
0,0006
0,006
0,0001
0,0001
0,0001
30
1,67
1,52
30
1,79
1,48
0,837
17α-OHP4/P4
30
2,21
1,45
58
3,49
1,76
0,0005
A/17α-OHP4
30
2,58
1,68
72
3,38
0,66
0,047
DHEAS/17α-OHPE
16
2,19
1,05
30
0,95
1,98
0,415
C/17α-OHP
34
148,40
2,44
73
85,30
1,98
0,0001
C/17α-OHP
14
60,30
1,83
31
58,90
1,19
0,017
/T
/A
C/11β11β-DOC/17α-OHP4
A/DHEAS
17α-OHP4/17αOHPE
- Todos os resultados são expressos em nmol/l
- Transformação logarítmica para atender os preceitos da distribuição gaussiana
- Teste não pareado de Wilcoxon
22
Após estímulo adrenal com cortrosina (tabela 6) os incrementos de F, A,
17α-OHP4 e P4 ocorreram na mesma proporção entre pacientes normo e
hiperandrogênicas (p 0,05).
Tabela 06. Incremento dos hormônios ovarianos e adrenais após estímulo adrenal com
ACTH, em pacientes com síndrome dos ovários policísticos normo e hiperandrogênicas.
Hormônio(%)
Incremento 0’-60’(%)
Normoandrogênicas
Hiperandrogênicas
150 (76-219)
165 (129-273)
155 (107-263)
156 (109-255)
28 (19-47)
33 (19-53)
42 (23-200)
80 (49-150)
Cortisol
17α-OHP4
Androstenediona
Progesterona
0,363
0,779
0,778
0,528
*- Os resultados são mostrados como mediana e primeiro e terceiro quartis.
- Teste de proporção
No entanto quando se calculou a área sob a curva aos 60 min, A e 17αOHP4
apresentaram
maior
resposta
a
cortrosina
(p 0,0001
e
p=0,049,
respectivamente) (tabela 07).
Tabela 07. Resposta adrenal com cortrosina, em pacientes com síndrome dos ovários
policísticos normo e hiperandrogênicas.
Hormônio(nmol/L)
Cortisol
17α-OHP4
Androstenediona
Progesterona
Área sob a curva (nmol/L. 60’)
Normoandrogênicas
Hiperandrogênicas
34453 (31183-37218)
338 (216-457)
397 (312-470)
157 (84-168)
34725 (30445-39175)
489 (387-727)
730 (555-992)
123 (96-163)
0,777
0,049
0,0001
0,999
*- Os resultados são mostrados como mediana e primeiro e terceiro quartis.
- Teste de Wilcoxon não pareado
Sessenta minutos após o estímulo com cortrosina a atividade da 17αhidroxilase na via ∆4 não mostrou ser diferente entre pacientes normo e
23
hiperandrogênicas (p=0,134). Por outro lado, a atividade da 17,20 liase foi maior nas
pacientes hiperandrogênicas nesta via (p 0,0001; figura 2).
Figura 02. Atividade das enzimas 17α-hidroxilase (painel A) e 17,20 liase (painel B), antes e
60 min após injeção de cortrosina em pacientes normo e hiperandrogênicas com síndrome
dos ovários policísticos.
6. DISCUSSÃO
24
Discussão
Este estudo, adotando os critérios de Roterdã, compara as atividades das
diversas enzimas corticoesteroidogênicas em pacientes normo e hiperandrogênicas
com SOP, ao invés de comparar pacientes com SOP e mulheres normais (Bloom et
al, 2006), tanto antes como após estímulo adrenal com cortrosina. Na SOP
hiperandrogenismo bioquímico, incluindo avaliação de vários androgênios, tem sido
encontrado entre 75% e 82% das pacientes, considerando diferentes populações
(Azziz et al, 2004; Huang et al, 2010). As concentrações hormonais basais nas
mulheres brasileiras com SOP são semelhantes aos resultados relatados em outros
países (Gil-Junior et al, 2010). Pelas repercussões clínico-metabólicas dos
androgênios, modulados ou não pelo hiperinsulinismo, é relevante que se identifique
a paciente com SOP que tenha ou não hiperandrogenismo bioquímico (Talbott et
al,1998). A definição da fonte destes androgênios, se ovariana, adrenal ou mista,
tem também importância prática na definição da conduta terapêutica e protocolo de
seguimento.
Hiperandrogenismo adrenal, definido pela elevação de DHEAS e
androstenediona, tem sido encontrada em até 62% das pacientes (Gonzalez et al,
1996; Kumar et al, 2005; Gil-Junior et al, 2010) e tem sido atribuído a maior
catabolismo do cortisol (Gambineri et al, 2009), menor formação de cortisol
(Tsilchrozidou et al, 2003) e/ou resposta amplificada dos androgênios adrenais a
níveis normais de ACTH (Moran et al, 2004; Stewart et al, 1993; Gonzalez, 1997;
Horrocks et al, 1983). Hiperandrogenismo ovariano, definido por níveis elevados de
testosterona, é mesmo mais frequente, sendo atribuído ao estímulo monotônico do
LH nas células da teca, modulado ou não por insulina ou fatores de crescimento
(Gilling-Smith et al, 1997; Nelson et al, 2001; Azziz et al, 2004).
25
Apesar do hiperandrogenismo, parece não haver alteração enzimática
específica na esteroidogênese em mulheres com SOP (Pasquali et al, 2011). Após a
introdução dos critérios de Roterdã são escassos os estudos que examinaram a
atividade
das
diferentes
enzimas
envolvidas
na
corticoesteroidogênese
ovariana/adrenal nestas pacientes. A verificação das atividades destas enzimas
constitui a principal proposta deste estudo. De um modo geral, tem se descrito
menor atividade da 11β-hidroxiesteróide desidrogenase (11β-HSD) (Ditkoff et al,
1995; Gambineri et al, 2009), maior atividade da sulfatase e maior atividade, ou
atividade desregulada, da enzima P450c17α (Barnes et al, 1989). De fato,
desregulação do complexo enzimático P450c17α tem sido relatada em alguns
estudos (Barnes et al, 1989; Gonzalez et al, 1996; Rosenfield, 1990). Na sequência
do texto discute-se, em separado, a atividade de cada enzima envolvida na síntese
dos corticóides e esteróides sexuais em pacientes com SOP
normo e
hiperandrogênicas, incluídas no presente estudo.
Atividade da aromatase
Ainda que os níveis basais de estradiol sérico não tenham sido muito
diferentes entre pacientes com SOP normo e hiperandrogênica, as razões
/T e
/A foram menores nas mulheres hiperandrogênica, sugerindo menor atividade da
P450arom neste grupo de pacientes. De fato, células da granulosa de folículos de
pacientes com SOP têm atividade p450arom quase totalmente abolida. A existência
de inibidores endógenos da atividade da aromatase, como 5α-androstenedione, no
líquido folicular e células da granulosa dos folículos de pacientes com SOP foi
postulada anteriormente para explicar a menor expressão do P450arom RNAm
nestas pacientes (Agarwal et al, 1996; Jakimiuk et al, 1998). Polimorfismo funcional
na expressão do gene CYP19 não foi identificado em pacientes com SOP, sugerindo
26
que variações na expressão da P450arom possam estar localizadas em outros
genes (Soderlund et al, 2005). No entanto, recentemente, foram identificadas
variantes entre os aminoácidos
Cys do gene CYP19, variantes estas
associadas com maior suscetibilidade para o desenvolvimento da SOP (Xita et al,
2010; Wang et al, 2011).
Atividade da 17β-hidroxiesteroide desidrogenase
A enzima 17β-HSD, com expressão nas células ovarianas da teca e
reticulada das adrenais, assegura a conversão da A em T, androgênio este com
maior atividade biológica. No presente estudo, a razão T/A foi menor no grupo de
pacientes com SOP que têm androgênios elevados na circulação, indicando
atividade até menor da 17β-HSD na SOP, pelo menos nas pacientes com
androgênios elevados. Polimorfismo resultando em maior atividade desta enzima
tem sido identificado, justificando o excesso de testosterona em pacientes com SOP,
pelo menos naquelas que exibem maiores níveis de testosterona e resistência à
insulina (Qin et al, 2006). No entanto, polimorfismo nos genes que expressam a 17βHSD podem (Lin et al, 2006; Marioli et al, 2009) ou não (Goodarzi et al, 2008) ser
encontrado nas pacientes com SOP. Maior atividade 17β-HSD, avaliada em estudo
anterior pela razão T/A, foi clinicamente demonstrada em pacientes com SOP como
um todo, sem estratificar naquelas com níveis androgênicos normais ou elevados
(Qin e Rosenfield, 1998). No entanto, em experimentos in vitro, células da teca e do
estroma ovariano de pacientes com SOP não mostraram maior atividade desta
enzima, atribuindo-se a elevação da testosterona em pacientes hiperandrogênica à
maior disponibilidade dos substratos DHEA e A em T e não conversão destes em T
por maior atividade 17β-HSD (Barbieri et al, 1992; Nelson et al, 2001). Em suporte a
esta assertiva, atividade maior da 17β-HSD não foi confirmada por outros
27
investigadores, tanto antes (Pittaway et al, 1983), como após adoção dos critérios de
Roterdã (Goodarzi et al, 2008). Estas diferenças ainda não estão claras, mas podem
ser atribuídas aos tamanhos das amostras examinadas, ao poder dos estudos ou à
multi etnia das pacientes avaliadas.
Atividade 11β-hidroxilase
Entre mulheres com hiperplasia adrenal de manifestação tardia, não
clássica e com manifestações clínicas de hiperandrogenismo, deficiências da 11βhidroxilase têm sido relatadas entre 0,6%-6,5% (Carmina et al, 1995, Kelestimur et
al, 1996). Considerando níveis de 11-DOC
36,3 nmol 60 min após injeção de
cortrosina a prevalência de deficiência parcial da 11β-hidroxilase em pacientes com
diagnóstico de SOP, adotando critérios de Roterdã, foi relatada em 8,4% (Sahin e
Kelestimur, 1997). No presente estudo, a atividade desta enzima não foi examinada
após estímulo adrenal, mas 10% (4/40) das pacientes hiperandrogênicas
apresentaram concentrações basais médias de 11-DOC de 18,2 nmol/l, nível três
vezes maior que o terceiro quartil das pacientes normoandrogênicas (dados não
mostrados).
Em suporte a esta observação, polimorfismo do gene CYP11B1 que
codifica a 11β-hidroxilase foi encontrado em pacientes não obesas com SOP
(Gambineri et al, 2006). Em estudos prévios a Roterdã, os achados sugeriam que o
acúmulo de 11-DOC não implicaria necessariamente em deficiência da 11βhidroxilase, e representaria apenas hipoatividade funcional desta enzima (Lucky et
al, 1986; Merkle et al, 1984). Mas a razão C/11-DOC menor nas pacientes
hiperandrogênicas no presente estudo, indica menor atividade 11β-hidroxilásica e
acúmulo de 11-DOC neste grupo, quando comparado com as pacientes
28
normoandrogênicas. Resultados semelhantes aos do presente estudo foram
observados em outro estudo pós-Roterdã, quando pacientes com SOP, incluindo
pacientes normo e hiperandrogênicas como um só grupo, foram comparadas com
controles normais (Sahin e Kelestimur, 1997). Certamente atividade atenuada da
11β-hidroxilase favorece o acúmulo de substratos, notadamente 17α-OHP4,
permitindo
maior
conversão
destes
precursores
em
androgênios
ou
mineralocorticoides. O resultado do presente estudo também confirma uma outra
observação pós-Roterdã de que pacientes oligomenorrêicas resistentes ao citrato de
clomifeno têm menor conversão de 11-DOC em cortisol (Dolfing et al, 2003). Existem
estudos mostrando que a menor produção de cortisol nestes casos seria
compensada por maior produção tissular periférica deste hormônio, assegurando
assim níveis séricos do cortisol semelhantes em pacientes com SOP, tanto normo
como hiperandrogênicas (Rask et al, 2002).
Atividade da enzima 21α-hidroxilase
Antes da introdução dos critérios de Roterdã, a forma clássica de
hiperplasia adrenal congênita por deficiência da 21α-hidroxilase foi relatada entre
1%-19% das pacientes com diagnóstico inicial de SOP (Cobin et al, 1985; Benjamin
et al, 1986), na dependência da composição étnica das populações estudadas
(Speiser et al, 1985). Utilizando como critérios diagnósticos níveis de 17α-OHP4
30 nmol/l 60 min após estímulo adrenal com cortrosina, a forma não clássica foi
identificada em 2/122 (1,6%) das pacientes inicialmente elegíveis no presente
estudo. Consequentemente as duas foram excluídas de futuras análises em
obediência aos critérios de Roterdã (Azziz et al, 2006). Após estímulo adrenal, entre
as pacientes com SOP normoandrogênicas 2/16 (12,5%) apresentaram níveis de
17α-OHP4 entre 15-30 nmol/l 60 min após cortrosina e entre aquelas com
29
hiperandrogenismo bioquímico 11/58 (18,9%) tiveram as concentrações de 17αOHP4 elevadas a estes níveis, indicando menor atividade da 21α-hidroxilase e
sugerindo maior prevalência de heterozigose CYP21A1 nas pacientes com SOP,
principalmente nas hiperandrogênicas. No entanto, no presente estudo esta
diferença não alcançou significância estatística (dados não mostrados).
Em outros estudos, também publicados após padronização de Roterdã,
entre 0%-22% das mulheres com SOP têm resposta elevada da 17α-OHP4 a
cortrosina, resposta esta indicativa de atenuação da atividade da enzima 21αhidroxilase nestas pacientes (Luboshitzky et al, 2003; Trakakis et al, 2008). Em
adição a estes achados, a razão 11β-DOC/17α-OHP4 foi significativamente menor
no presente estudo quando se comparou pacientes com SOP hiperandrogênicas e
normoandrogênicas (p 0,0001), tornando mais robusta a observação de menor
atividade da 21α-hidroxilase nas pacientes com SOP, principalmente quando os
níveis dos androgênios séricos são elevados.
Atividade da enzima 3β-hidroxiesteroide desidrogenase
A enzima 3β-HSD, inversamente associada aos níveis de androgênios
adrenais (Rainey e Nakamura, 2008), tem expressão nas camadas glomerulosa e
fasciculada das adrenais e células da granulosa nos ovários. Pacientes com SOP,
independentemente da fonte do hiperandrogenismo, têm mostrado variação na
atividade desta enzima. Uma forma clínica não clássica de deficiência da 3β-HSD foi
descrita em mulheres com hirsutismo, distúrbios menstruais ou SOP, antes (Lobo e
Goebelsman, 1981; Pang et al, 1985; Pang, 1998) e após a normatização do NIH,
fundamento dos critérios de Roterdã (Doldi et al, 2000). Ainda que considerada
pouco frequente, ação parcialmente deficiente desta enzima tem sido relatada entre
30
5%-30% das mulheres com sinais clínicos de hiperandrogenismo. Mulheres
hiperandrogênicas com atividade diminuída desta enzima têm a conversão dos 3βhidroxisteroides via ∆5 em 3β-hidroxisteroide via ∆4 atenuada, favorecendo o
acúmulo de pregnenolona, 17α-OHPE, DHEA e DHEAS, substratos para a síntese
de androgênios, tanto nas adrenais como nas gônadas (Rhéaume et al, 1991).
Vários estudos têm proposto diferentes critérios, observados 60 min após
injeção de cortrosina, para definir o que seria deficiência desta enzima: níveis de
DHEA
63,1 nmol/l (Schram et al, 1992), 17α-OHPE
DHEA/A, 17α-OHPE/17α-OHP4
50,8 nmol/l e razões
5,2 (Gonzalez et al, 1991) e razão A/DHEAS
1,5 (Doi et al, 2006). Ainda que a razão A/DHEAS para examinar a atividade 3β-HSD
não tenha sido assumida como um indicador bioquímico confiável (Lutfallah et
al,2002; Pang et al, 2003), razões entre hormônios são tidos ainda como o melhor
instrumento para avaliação de ações enzimáticas em estudos clínicos (Chang et al,
1995).
Considerando os critérios propostos até o momento, nenhuma paciente
incluída no presente estudo apresentou deficiência da 3β-HSD. Pacientes normo e
hiperandrogênica
não
apresentaram razões 17α-OHP4/17α-OHPE diferentes
(p=0,837), sugerindo atividades iguais desta enzima nos dois grupos e confirmando
informações anteriores de que a deficiência desta enzima não é comum nas
pacientes com SOP, particularmente quando os critérios de Roterdã são utilizados
no diagnóstico (Bayoumi e Althman, 2001). Por outro lado, no presente estudo, a
razão
A/DHEAS
foi
maior
entre
as
pacientes
hiperandrogênicas
(p
sugerindo maior atividade 3β-HSD apenas na conversão de DHEA em A.
Atividades 3βHSD iguais entre pacientes com SOP e mulheres normais foram
também anteriormente relatadas (Difkoff et al, 1995). No entanto, resultados
31
diferentes, mostrando resposta atenuada desta enzima foram encontrados em
pacientes com hiperandrogenismo adrenal e SOP antes da introdução dos critérios
de Roterdã (Pang et al, 1985). Estes resultados discrepantes observados antes e
após Roterdã podem dever-se às etnias das populações ou aos diferentes critérios
de inclusão assumidos nos diferentes estudos.
Atividade da enzima P450c17α
A
enzima
P450c17α,
expressa
em
ovários
e
adrenais,
tem,
intrinsecamente, as duas atividades 17α-hidroxilase e 17,20-liase. Em condições
normais, na camada fasciculada adrenal há predomínio da ação 17α-hidroxilásica e
na camada reticulada as duas atividades são iguais (Rainey e Nakamura, 2008). Na
comparação entre indivíduos hiperandrogênicos e normais, há relatos sugerindo
disfunção do complexo enzimático P450c17α. Na SOP, com frequência tem sido
relatado desregulação entre as atividades 17α-hidroxilase e 17,20-liase.
Maior
atividade da 17,20-liase tem sido atribuída à fosforilação de resíduos Ser/Thr, à
atividade do citocromo b5, ou aos níveis de insulina ou estradiol (Lee-Ribichaud et
al, 1995; Ditkoff et al, 1995; Zhang et al, 1995; Katagiri et al, 1995; Moghetti et al,
1996; Tee et al, 2008). Em adição, parece que a 17,20-liase é menos ativa nos
ovários do que nas adrenais (Gonzalez et al, 1996).
Mesmo após exclusão das disfunções enzimáticas específicas, como
recomendado em Roterdã, pacientes com SOP ainda podem exibir maior atividade
da enzima P450c17α do que mulheres normais (Unluhizarci et al, 1999). No entanto,
a prevalência de disfunção desta enzima, tanto em pacientes hiperandrogênicas que
não preenchem os critérios da SOP como naquelas com SOP, é imprecisa
(Gonzalez et al, 1996). Há mesmo relatos negando alteração da P450c17α na SOP
32
(Azziz et al, 1995), uma vez que nos experimentos in vitro parece não haver
atividade desigual entre 17α-hidroxilase e 17,20 liase nas células tecais de pacientes
com SOP (Nestler e Jakubowicz,1996; Nelson et al, 2001). No entanto, alguns
estudos verificaram expressões diferentes da P450c17α em adrenais e ovários na
SOP, com relatos de maior atividade 17α-hidroxilase sem ser acompanhada de
modificação na 17,20 liase nas células da teca (Carbunaru et al, 2004; Nelson et al,
2001).
Mesmo havendo inconsistências, são vários os estudos que mostram
desregulação da P450c17α em mulheres com SOP (Barnes et al, 1989; Rosenfield
et al, 1990). Esta observação persistiu mesmo nos estudos que adotaram os novos
critérios do NIH para definir a SOP (Ehrmann et al, 1992; Gonzalez et al, 1999;
Çolak et al, 2002). Há relatos de redução relativa da ação 17α-hidroxilásica com
aumento da 17,20 liase nas adrenais nestas pacientes (Ditkoff et al, 1995; Gonzalez
et al, 1996; Gonzalez et al, 1999) ou mesmo maior elevação da 17α-hidroxilase em
relação à 17,20 liase (Barnes et al, 1989; Ehrmann et al, 1992). Os fundamentos
para estas alterações na SOP não estão claros. Além de maior proporção de P450
oxiredutase/P450c17α ser condição necessária para que haja maior atividade 17,20
liásica (Lin et al, 1993), o citocromo b5 também parece aumentar mais efetivamente
a ação da 17,20 liase do que a da 17α-hidroxilase (Katagiri et al, 1995; Auchus et al,
1998). Além disso, o estrogênio circulante parece ativar a 17,20 liase na via ∆4 sem
alterar esta função na via ∆5 (Ditkoff et al, 1995) e a insulina pode inibi-la, pelo
menos nas adrenais (Moghetti et al, 1996). Assim, experimentalmente, o aumento da
insulina pode induzir progressiva redução do DHEAS (Guido et al, 2004). Por outro
lado, estudos mostram que in vivo a insulina estimula indistintamente o sistema 17α-
33
hidroxilase e 17,20 liase, tanto em ovários como em adrenais (Nestler e
Jakubowiccz, 1996; Ehrmann et al, 1995).
No presente estudo, em condições basais, as concentrações mais
elevadas de 17α-OHP4, DHEAS e A nas pacientes hiperandrogênicas do que nas
normoandrogênicas, sugerem maior atividade 17α-hidroxilase e 17,20 liase nestas
pacientes na via ∆4. As concentrações basais de 17α-OHPE não sendo diferentes
nos dois grupos, sugerem a mesma atividade basal da 17α-hidroxilase na via ∆5.
Quando avaliadas pela razão produto/precursor (17α-OHP4/P4) em condições
basais, comprovou-se maior atividade 17α-hidroxilase na via ∆4 nas pacientes
hiperandrogênicas, quando comparadas às normoandrogênicas, assim como maior
atividade da 17,20 liase na mesma via quando foi avaliada pela relação A/17αOHP4, (p=0,047). Na via ∆5,
as atividades da 17,20 liase foram iguais entre
pacientes normo e hiperandrogênicas (DHEAS/17α-OHPE, p= 0,415). Após estímulo
adrenal com cortrosina, maior atividade da 17,20 liase foi confirmada aos 60 min,
não se observando nenhuma diferença na ação da 17α-hidroxilase após o estímulo.
Enquanto maior atividade da 17,20 liase tem sido observada em
pacientes com SOP quando estas são comparadas com pacientes normais
(Bayoumy e Althman, 2001; Ditkoff et al, 1995), atividade semelhante da 17αhidroxilase foi observada entre pacientes com SOP e pacientes normais (Ditkoff et
al, 1995). Mesmo utilizando dose menor de cortrosina, maior atividade 17αhidroxilase e 17,20 liase já foi observada na via ∆4, quando pacientes com SOP
foram comparadas com mulheres normais. Com dose de 0,25 mg, pacientes com
SOP mostraram atividade maior apenas da 17,20 liase em um estudo (Gonzalez et
al, 1999). Alguns outros estudos examinando a atividade P450c17α em condições
basais mostraram que entre as pacientes hiperandrogênicas algumas têm atividade
34
17α-hidroxilase elevada na via ∆5, sendo que poucas delas têm também elevação
desta atividade na via ∆4. Em outro estudo, após estímulo adrenal com cortrosina,
poucas pacientes revelaram maior atividade da 17α-hidroxilase em relação à 17,20
liase (Azziz et al, 1995). Neste mesmo estudo, nenhuma paciente mostrou maior
atividade 17,20 liase na via ∆5, mas algumas o fizeram na via ∆4. Com esses
resultados os autores não admitiram haver desregulação da P450c17α nas
pacientes hiperandrogênicas.
Além dos achados do presente estudo, desregulação da P450c17α foi
encontrada após teste com cortrosina em outras publicações, sendo que níveis
séricos de insulina e estradiol foram considerados capazes de influenciar o
aparecimento da desregulação enzimática (Ehrmann et al, 1992; Ditkoff et al,1995).
Os resultados discrepantes constatados nas publicações disponíveis são devidos
provavelmente a diferentes populações estudadas ou a diferentes critérios de
elegibilidade na inclusão das pacientes. No presente estudo, todas as pacientes
incluídas preencheram os três critérios de Roterdã propostos para definir SOP e a
comparação foi feita entre pacientes normoandrogênicas vs hiperandrogênica e não
entre pacientes com SOP e mulheres normais. Os dados do presente estudo,
mostrando que em condições basais há maior atividade 17α-hidroxilase e 17,20 liase
na via ∆4 e após estímulo com cortrosina atividade é maior apenas na 17,20 liase
nesta via, suportam a existência de desregulação da enzima P450c17α em
pacientes com SOP.
Atividade combinada das enzimas 11β-hidroxilase e 21α-hidroxilase
A ação combinada das enzimas 11β-hidroxilase e 21α-hidroxilase,
avaliadas pela razão C/17α-OHP4, tem sido iguais entre pacientes com SOP e
35
mulheres normais (Ditkoff et al, 1995). No presente estudo, a razão C/17α-OHP4
revelou existência de diminuição significativa da ação dessas enzimas (p 0,0001)
nas pacientes hiperandrogênicas, possibilitando maior disponibilidade dos substratos
androgênicos nessas pacientes. A natureza e os mecanismos envolvidos nesse
defeito enzimático combinado são ainda incertos (Hurwitz et al, 1985) e mais
estudos em pacientes com SOP, ou com outras causas de hiperandrogenismo,
serão necessários.
Considerações finais
O presente estudo tem possíveis limitações. Primeiro, os critérios para
excluir as formas clássicas de deficiências da 21α-hidroxilase, 11β-hidroxilase e 3βHSD usados por diferentes autores ainda não estão definitivamente estabelecidos e
aqueles usados no presente estudo talvez não sejam universalmente aceitos.
Segundo, o uso da razão A/DHEAS como substituto da razão A/DHEA para avaliar a
ação da enzima 3β-HSD pode não ser adequada; no entanto, os níveis de DHEAS e
DHEA são fortemente correlacionados (Payne e Hales, 2004; Lucky et al, 1986;
Rosenfield et al, 1972) e o DHEAS tem a vantagem de ser relativamente estável ao
longo do dia e facilmente mensurado. Por fim, o número de pacientes no grupo
normoandrogênico é menor, mas a diferença no número de indivíduos em
comparação foi adequada e estatisticamente ajustada (Daly e Bourke, 2000).
Por outro lado, o estudo atual tem alguns aspectos robustos. O estudo
provê uma definição clara da SOP e usa vários parâmetros para definir
hiperandrogenismo, provendo então sensibilidade de pelo menos 75% na
identificação destes indivíduos (Huang et al, 2010). A análise em separado de
pacientes com níveis elevados de androgênios também favorece a identificação de
36
possíveis alterações na esteroidogênese dos indivíduos com SOP que não seriam
identificados caso as pacientes com SOP fossem analisadas como um só grupo. Por
fim, a análise em separado de pacientes com SOP, segundo o critério de
hiperandrogenismo bioquímico traz novas informações e abre outras possibilidades
para
esclarecimento
da
diagnosticadas com SOP.
heterogeneidade
observada
entre
as
pacientes
7. CONCLUSÕES
37
Conclusões
1. As atividades 17α-hidroxilase e 17,20 liase são iguais nos dois grupos na via
Δ5, mas estão aumentadas na via Δ4 nas pacientes hiperandrogênicas.
2. Após estímulo adrenal com cortrosina a atividade 17,20 liase persiste maior
na via Δ4.
3. A atividade da enzima 3β-HSD é maior nas pacientes hiperandrogênicas
apenas na conversão de DHEA em A.
4. As atividades das enzimas aromatase e 17β-HSD são menores nas pacientes
com SOP e hiperandrogenismo bioquímico.
5. A atividade combinada das enzimas 21α-hidroxilase e 11β-hidroxilase, está
diminuída nas pacientes com hiperandrogenismo bioquímico.
6. A atividade combinada das enzimas 3β-HSD, 11β-hidroxilase e 21αhidroxilase foi também menor nas pacientes hiperandrogênicas com SOP.
7. Pacientes
com
SOP
normo
e
hiperandrogênicas
têm
as
mesmas
concentrações séricas de cortisol, estradiol, FSH, 17α-OHPE, PRL e
homônios tireoidianos.
8. Pacientes
com
SOP
e
hiperandrogenismo
bioquímico
têm
maiores
concentrações de LH, Tt, 17α-OHP4, 11β-DOC, DHEAS, A e P4.
9. Pacientes com SOP e hiperandrogenismo
bioquímico têm menores
concentrações de SHBG do que as normoandrogênicas.
10. Não se observou diferenças na idade, ou variáveis antropométricas, entre
pacientes com SOP normo e hiperandrogênicas.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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9. ANEXOS
55
ANEXO 01
FICHA DE ACOMPANHAMENTO
PACIENTES COM ANOVULAÇÃO CRÔNICA HIPERANDROGÊNICA
I- Identificação:
Nome:
Idade:
Registro:
Cor/ Raça:
Branca
Negra
Amarela
Indígena
Outra
Estado Cívil:
Casada
Solteira
Outra
Maior ocupação:
Maior ocupação:
Escolaridade:
Analfabeto
1º grau completo
1º grau incompleto
2º grau completo
2º grau incompleto
3º grau completo
3º grau incompleto
II- Hábitos:
Tabagismo
Etilismo
Drogas ilícitas
Café
Chimarrão
Guaraná
Qual (is)?
Atividade física:
Horas/semana:
III – Parâmetros clínicos:

Anamnese:

Exames físicos:
Peso:
Estatura:
IMC:
Área:
PA:
Cíntura:
Quadril:
Rel C/Q:
Acne
Hirsutismo
Acantose
Estrias
Galactorréia
Obesidade
Esterilidade
Polimenorréia
Amenorréia primária
Amenorréia secundária
IV. Ultrassonografia transvaginal
Útero:
OD:
OE:
Endométrio:
Adams:
Espessura ________
Aspecto ________
Outros
Menarca
56
V- Parâmetros laboratoriais:
DATA
FSH
LH
Razão LH:FSH
PRL
T4 livre
TSH
Progesterona
Estradiol
Testosterona total
Testosterona livre
SHBG
Cortisol
Androstenediona
DHEA
DHEAS
17 OH progesterona
17 OH prognenolona
11- desoxicortisol
Glicemia de jejum
Insulina de jejum
Razão glicose: insulina
Peptídeo C
Hb glicosilada
Colesterol total
HDL
LDL
VLDL
Triglicérides
Albumina
VI- TESTES DINÂMICOS:
Curva glicêmica
0’
30’
60’
90’
120’
180’
Teste da cortrosina:
A
0’
30’
60’
Teste da GnRH:
LH
0’
30’
60’
VII- Antropometria:
Peso:
Estatura:
IMC:
R C:Q:
Curva insulínica
P4
17-OHP4
FSH
Data
Curva peptídeo C
17-OHPE
E2
Cortisol
P4
57
ANEXO 02
58
ANEXO 03
TERMO DO CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
1-Projeto de pesquisa: “Atividade das enzimas corticoesteroidogênicas em pacientes normoandrogênicas e
hiperandrogênicas com síndrome de ovários policísticos ”;
2-Pesquisadores: Dr Sebastião Freitas de Medeiros, médico, professor da disciplina Ginecologia e Obstetrícia do
Hospital Universitário Julio Muller e do Mestrado em Ciências da Saúde/Universidade Federal de Mato Grosso;
Dra.Márcia Marly Winck Yamamoto, médica do Instituto Tropical de Medicina Reprodutiva e Menopausa INTRO, aluna do mestrado em Ciências da Saúde/Universidade Federal de mato Grosso;
3-Finalidade da Pesquisa: Comparar a atividade das enzimas esteroidogênicas em pacientes normo e
hiperandrogênicas com síndrome dos ovários policísticos. Avaliar a resposta da glândula adrenal basal e após
administração endovenosa da cortrosina nestas pacientes com síndrome dos ovários policísticos através das
dosagens hormonais da progesterona, 17-hidroxiprogesterona,17-hidroxipregnenolona, 11-deoxicortisol,
androstenediona, cortisol, testosterona total, DHEAS, SHBG, insulina.
4-A pesquisa será realizada avaliando os níveis sangüíneos dos hormônios androgênios, glicose, insulina colesterol
total, triglicerídeos, HDL-c, LDL-c e teste da cortrosina através de coleta sangüínea por punção periférica da veia do
antebraço, de uma amostra basal e, avaliação dos níveis do cortisol, 17-hidroxiprogesterona, progesterona e
androstenediona após administração endovenosa de ACTH1-24, 30 e 60 minutos após (teste da cortrosina). Este
teste serve, entre outros, para detectar alterações na glândula adrenal e deficiência tardia da 21 hidroxilase;
5-O desconforto e risco do procedimento são mínimos , já que se tratam de punções venosas periféricas, com
materiais descartáveis, realizadas por pessoal treinado;
6-A paciente que concordar em participar da pesquisa se beneficiará, pois terá sua função adrenal avaliada, bem
como realização de exames de glicemia e perfil lipídico. Caso seja encontrada qualquer alteração, a mesma
receberá a devida orientação de tratamento e terá acompanhamento garantido no HUJM-MT;
7-Em qualquer fase da pesquisa, a participante terá acesso aos profissionais responsáveis pelo esclarecimento
de eventuais dúvidas através do telefone (65)-8468 9775 – Dra. Márcia;
8-É garantida a liberdade de retirada do concentimento informado em participar do estudo a qualquer momento, sem
qualquer prejuízo de continuidade do seu tratamento na instituição ;
9-Direito de confidencialidade- As informações obtidas serão analisadas em conjunto com outros pacientes, não
sendo divulgado a identificação de nenhum paciente;
10-Despesas e compensações: Não há despesas pessoais para a participante em qualquer fase do estudo, incluindo
exames e consultas. Não há compensação financeira relacionada á sua participação;
11-Compromisso do pesquisador em utilizar os dados e material coletado somente para esta pesquisa.
Acredito ter sido suficientemente informada a respeito das informações que li ou que foram lidas para mim,
descrevendo o estudo; “Atividade das enzimas corticoesteroidogênicas em pacientes normo e hiperandrogênicas
com síndrome de ovários policísticos”. Discuti com o médico que me atendeu sobre a minha decisão em participar
desse estudo. Ficaram claros para mim quais são os propósitos do estudo, os procedimentos a serem realizados, seus
desconfortos e riscos,as garantias de confidencialidade e de esclarecimentos permanentes. Ficou claro também que
minha participação é isenta de despesas e que tenho garantia de acesso a tratamento hospitalar, caso seja
comprovado através dos exames, que tenho alguma alteração que necessite tratamento. Concordo voluntariamente
em participar deste estudo e poderei retirar meu consentimento a qualquer momento, antes ou durante o mesmo,sem
penalidades, ou prejuízo, ou perda de qualquer benefício que eu possa ter adquirido no meu atendimento neste
serviço.
__________________ Data:
Assinatura do paciente
_________________ Data:
Assinatura da testemunha
#Somente para o responsável do projeto:
Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e Esclarecido deste paciente ou
representante legal para a participação do estudo.
__________________________ Data:
Assinatura
59
ANEXO 04
TABELA DE CONVERSÃO PARA SISTEMA DE UNIDADES INTERNACIONAL(SI)
Valores Referência
Fatores de conversão
Sistema Internacional (SI)
Androstenediona ng/dl
X 0,0349
Androstenediona nmol/l
Colesterol total mg/dl
X 0,0259
Colesterol total mmol/l
Triglicerídeos mg/dl
X 0,0113
Triglicerídeos mmol/l
HDL-c mg/dl
X 0,0259
HDL-c mmol/l
LDL-c mg/dl
X 0,0259
LDL-c mmol/l
Glicose mg/dl
X 0,0555
Glicose mmol/l
Insulina μU/ml
X 7,175
Insulina pmol/l
Estradiol (E2) pg/ml
X 3,67
Estradiol (E2) pmol/l
SHBG nmol/l
X 1,0
SHBG nmol/l
Prolactina ng/ml
X 0,04348
Prolactina nmol/l
TSH mUI/L
X 1,0
TSH mUI/L
T4 Livre ng/dl
X 12,87
T4 Livre pmol/l
FSH mIU/ml
X 1,0
FSH IU/L
LH mIU/ml
X 1,0
FSH IU/L
Testosterona Total ng/dl
X 0,0347
Testosterona Total nmol/l
Progesterona ng/ml
X 3,18
Progesterona nmol/l
17-Hidroxiprogesterona
X 0,0303
17-Hidroxiprogesterona
(17-OHP4) ng/dl
(17-OHP4) nmol/l
DHEAS μg/dl
X 0,0271
DHEAS μmol/l
17-Hidroxipregnenolona (17OHPE) ng/dl
X 0,0301
17-Hidroxipregnenolona
11-Deoxicortisol ng/dl
X 0,0289
(17-OHPE) nmol/l
11-Deoxicortisol nmol/l
60
ANEXO 5
Original Message ----From: EJOGRB [email protected]
To: [email protected]
Cc:
Sent: Sex 1/06/12 08:20
Subject: Fwd: Manuscript number assigned EJOGRB-12-8372
Ref.: Ms. No. EJOGRB-12-8372, Corticosteroidogenic enzyme activity in normo- and hyperandrogenic
Brazilian women with polycystic ovary syndrome
European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology
Dear Ph. D.,M.D. de Medeiros,
Your submission entitled "Corticosteroidogenic enzyme activity in normo- and hyperandrogenic Brazilian
women with polycystic ovary syndrome" has been assigned the following manuscript number: EJOGRB12-8372.
It will now be forwarded to one of the Specialty Editors for assessment: as a result of ever-increasing
submissions to this journal, it has become necessary to implement more stringent selection parameters,
and preliminary assessment is one of those recently implemented measures.
You will be able to check on the progress of your paper by logging into Elsevier's Editorial System (EES)
as an author. The URL is http://ees.elsevier.com/euro/
Your username is: de medeiros
If you need to retrieve password details, please go to: http://ees.elsevier.com/euro/automail_query.asp
With kind regards,
Lorraine McMorrow
Journal Manager
European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology
For further assistance, please visit our customer support site at http://support.elsevier.com
Here you can search for solutions on a range of topics, find answers to frequently asked questions and
learn more about EES via interactive tutorials. You will also find our 24/7 support contact details should
you need any further assistance from one of our customer support representatives.
61
Corticosteroidogenic enzyme activity in normo- and hyperandrogenic Brazilian women with
polycystic ovary syndrome
Sebastião Freitas de Medeiros, M.D., Ph.D. 1,2,3
Ângelo Barrionuevo Gil-Junior, M.D.2
Jacklyne Silva Barbosa, R.N.3
Érico Duarte Isaías, M.D.2
Márcia Marly Winck Yamamoto, M.D. 3
1
Department of Gynecology and Obstetrics at Medical Science School – UFMT, Cuiabá, MT,
Brazil
2
Julio Muller University Hospital, Cuiabá, MT, Brazil
3
Tropical Institute of Reproductive Medicine and Menopause, Cuiabá, MT, Brazil.
Corresponding author:
Sebastião Freitas de Medeiros
Rua Almirante Henrique Pinheiro Guedes, 195, Duque de Caxias, Cuiabá, MT,
ZIPMAIL: 78043-306, Brazil
Phone: (55)(65) 33227342
Fax: (55)(65) 36230079
E-mail: [email protected]
Condensation
Hyperandrogenic PCOS patients have higher 17,20 lyase activity in the Δ4 pathway, and lower
11β-hydroxylase and 21- hydroxylase activities than normoandrogenic ones.
62
Corticosteroidogenic enzyme activity in normo- and hyperandrogenic Brazilian women with
polycystic ovary syndrome
Sebastião Freitas de Medeiros, Ângelo Barrionuevo Gil-Junior, Jacklyne Silva Barbosa, Érico
Duarte Isaías, Márcia Marly Winck Yamamoto
ABSTRACT
OBJECTIVE: To compare the activities of the corticosteroidogenic enzymes in polycystic ovary
syndrome (PCOS) patients.
STUDY DESIGN: Cohort study including one hundred and twenty- two patients with PCOS at
the
Julio
Muller
University
Hospital;
eight-one
of
them
presented
biochemical
hyperandrogenism and 41 had normal androgen levels. The study compares the activities of
corticosteroidogenic enzyme in normo- and hyperandrogenic PCOS patients diagnosed by the
Rotterdam criteria using product/precursor ratio at baseline and after adrenal tetracosactrin
estimulation test. RESULTS and CONCLUSION: At baseline, the hyperandrogenic patients
showed greater 17-hydroxylase and 17, 20 lyase activities in the Δ4 pathway than the
normoandrogenic ones (p = 0.0005 and p= 0.047, respectively). In the Δ5 pathway this enzyme
complex showed the same activity in both groups. Hyperandrogenic patients presented lower 21hydroxylase, lower 11β-hydroxylase (p = <0.0001), and greater 3β-HSD activities (p< 0.0001).
After tetracosactrin stimulation only 17,20 lyase activity remained increased in the Δ4 pathway (
p< 0.0001). It was concluded that in PCOS the 17,20 lyase activity is higher in hyperandrogenic
patients, both at baseline and after adrenal stimulation. Greater conversion of DHEA into A
without higher conversion of 17-OHPE to 17-OHP4 in hyperandrogenic PCOS patients indicate
different 3β-HSDII activity in different adrenal cells. Hyperandrogenic PCOS patients have
lower 11β-hydroxylase and 21-hydroxylase activities.
Keywords: Polycystic ovary syndrome, steroidogenesis, hyperandrogenism, enzyme activity,
adrenal stimulation.
63
Introduction
In polycystic ovary syndrome (PCOS) the luteinizing hormone (LH) pulse frequency is
increased, resulting in greater secretion of ovarian testosterone (T) and androstenedione (A). As
the follicle-stimulating hormone (FSH) action is not increased, sometimes even decreased, there
is a relative lower aromatization of these androgens in the granulosa cells [1]. PCOS patients also
seem to have a generalized adrenal hyperactivity due to either enhancement of the hormone
adrenocorticotrophic (ACTH) action [2] or acceleration in cortisol catabolism [3]. After the
Rotterdam criteria [4] biochemical hyperandrogenism has been found in 75%-82% of PCOS
patients [5,6]. The short- and long-term metabolic consequences of the hyperandrogenism
require that the androgen levels and the source of such androgens, be determined to provide a
rational for therapy.
Androgen synthesis requires the action of the cholesterol side-chain cleavage (CYP11A)
and cytochrome P450c17α (CYP17) enzymes. The CYP17 enzyme mediates both 17hydroxylase and 17,20 lyase activities, with greater 17-hydroxylase activity in the adrenal
fasciculate layer and equivalent activities in the reticular layer. 17-hydroxylase promotes rapid
conversion of pregnenolone (PE) and progesterone (P4) into 17-hydroxypregnenolone (17OHPE) and 17-hydroxyprogesterone (17-OHP4); more slowly, the 17,20 lyase converts 17OHPE and 17-OHP4 into dehydroepiandrosterone (DHEA) and androstenedione (A) [7]. Two
other adrenal enzymes, 3β-hydroxysteroid dehydrogenase II (3β-HSDII), and sulfotransferase
(SULT2A1) drive these precursors towards the synthesis of A and dehydroepiandrosterone
sulfate (DHEAS) [7,8].
After excluding classical 21-hydroxylase, 3β-HSDII and 11β-hydroxylase deficiencies,
thyroid disfuntion hyperprolactinemia, defects in imbalanced enzyme activity may till account
for the biochemical hyperandrogenism seen in some PCOS patients [9,10]. Currently, a few
studies have investigated the activity of the corticosteroidogenic enzymes [11], without
comparing their results with those obtained before the Rotterdam standardization. It is possible
to exist differences in steroidogenic enzyme activities in PCOS patients diagnosed before and
after Rotterdam [12,13]. The present study aims to examine the activities of these enzymes in
normo- and hyperandrogenic PCOS patients, and compare its findings with those obtained before
the Nacional Institute of Health (NIH) meeting and the Rotterdam consensus.
64
Material and Methods
All the patients were prospectively enrolled at the Júlio Muller University Hospital and
Tropical Institute of Reproductive Medicine and Menopause, Cuiabá, MT, Brazil, from
January/2003 to May/2011. An informed consent approved by the local Committee for Ethics in
Research was signed by each patient. Those who have used sex steroids or insulin sensitizing
drugs over the last six months, or who did not fulfill the Rotterdan criteria were excluded.
Classics 21-hydroxylase, 3β-HSDII, and 11β-hydroxylase deficiencies were excluded as follows:
17-OHP4 levels ≤ 5ng/ml (≤ 15nmol/l), 17-OHPE < 0.42ng/ml (< 13,5nmol/l) and 11-DOC <
8ng/ml (< 24 nmol/l) [10,14]. Eighty-one patients had biochemical hyperandrogenism and 41
had normal androgen levels. Two of these patients (one of each group) were later excluded
because 17-OHP4 levels were > 30nmol/l 60 min after adrenal stimulation. In cases where the
17-OHP4 levels were > 1 and < 5 ng/ml, the tetracosactrin stimulation test was performed; 21hydroxylase enzyme deficiency was excluded if 17-OHP4 levels < 10ng/ml (30 nmol/l) 60 min
after tetracosactrin [14]. Patients were 27.2 ±5.5 years old. Anthropometric parameters were
measured as previously described [6]. Hyperandrogenism was defined with total testosterone ≥
2.4nmol/l, androstenedione ≥ 8.7nmol/l, DHEAS≥ 6.7nmol/l, and FAI ≥ 7 [6,15]. The FAI was
estimated as total testosterone (nmol/l)/sex hormone-binding globulin (SHBG; nmol/l) x 100.
The comparison between normo- and hyperandrogenic PCOS patients instead of comparing
PCOS subjects with healthy women attended recent recommendation [16].
The tetracosactrin stimulation test was performed between 8.00 and 9.00AM, after 12hours fast. At baseline, 30, and 60 min after the injection of 0.25 mg of tetracosactrin
(Synacthen®, Novartis Pharmaceuticals, NJ, USA), blood samples were collected and assayed
for 17-OHP4, cortisol (F), A and P4. The adrenal response was evaluated by the area under the
curve (AUC) and the difference between the basal value and the highest value, divided by the
basal value (maximum increment, ∆).
Hormones were measured by previously validated methods. Serum P4 was measured by a
chemiluminescence assay (Advia Centaur, Siemens Healthcare Diagnostics, UK) with sensitivity
of 0.67nmol/l (0.21 mg/ml), coefficients of intra-assay and inter-assay variation were between
3.7-12.4% and 2.6-3.9%, respectively. Serum LH, FSH, TSH, estradiol, PRL, SHBG, total
testosterone and FT4 were measured by electrochemiluminescence assay (Elecsys 1010, Roche
Diagnostics GMBH, Mannhein, German). The sensitivity and intra and inter-assay coefficients
of
variation were: 0.1 mUl/l, 1.8% - 3.4% for LH; 0.1 mUl/ml, 1.8% - 3.5% for FSH; 18.4 pmol/l,
3.3% - 6.2% for estradiol; 0.002nmol/l, 2.8% - 5.0% for PRL; 0.35 nmol/l, 2.6% - 5.6% for
65
SHBG; 0.27µUl/ml, 2.1% - 8.6% for TSH; 0.069 nmol/l and 2.7% - 6.0% for total testosterone;
0.3 pmol/l and 3.6% - 6.2% for FT4. Androstenedione, DHEAS, F, and insulin were measured
by chemiluminescence assay with sensitivity of 1.0 nmol/l, 0.08µmol/l, 5.5nmol/l and 2µUI/ml,
respectively (Siemens Medical Solution Diagnostics, CA, USA); intra and inter-assay precision
coefficients of variation were, respectively, 6.4% and 8.2% for A; 4.9% and 8.8% for DHEAS;
5.8% and 8.6% for F; 4.9% and 6.4% for insulin. 17-OHPE levels were verified by a coot-acount radioimmunoassay (Siemens Health Care Diagnostics Inc., CA, USA) with sensitivity of
0.21 nmol/l, inter and intra-assay imprecision of 5.5% and 7.9%, respectively. 11-DOC was
measured by a HPLC/RIA developed in-house by Alvaro Center of Analysis and Clinical
Research, Paraná, Brasil; sensitivity of 0.3 nmol/l and inter-assay coefficients of variation of
5.3% and 10.8%, respectively. 17-OHPE was measured by a HPLC/RIA, using tritiated steroid
(NEN Life Science Products, Boston, MA,USA) and antiserum from ICN Biochemical Inc
(Costa Mesa, CA,USA); sensitivity of 0.033nmol/l, intra and inter-assay coefficients of variation
of 8.9% and 11%.
Data with nonparametric distribution were transformed into a logarithmic scale before
analysis and subsequently retransformed into the original units. Anthropometric, endocrine and
enzymatic activity measure were presented as mean ( ) and standard deviation (SD). Data not
normally distributed (F, 17-OHP4 and A) were presented as median and first and third quartiles
and analyzed by unpaired Wilcoxon-Mann-Whitney test, Welch test, or proportion test; p value ≤
0.05% was considered as statistically significant.
Results
Infertility and secondary amenorrhea tended to be more frequent in hyperandrogenic
patients, without reaching statistical significance (p=0.064 and p=0.117 respectively); hirsutism,
acne, acanthosis nigricans, and oligomenorrhea were similar in normo- and hyperandrogenics
patients. No difference in age, BMI, waist/hip ratio, and body surface area was observed (Table
1). The hyperandrogenic patients had higher basal levels of LH, T, A, DHEAS, 17-HOP4, 11DOC, and insulin than normoandrogenic ones. Baseline concentrations of F, PRL, P4, E2 and
thyroid hormones were similar in both groups (Table 2).
At baseline, 17,20 lyase activity was not different between normoandrogenic and
hyperandrogenic women in the Δ5 pathway (Table 3). The hyperandrogenic patients
demonstrated higher 17-hydroxylase (17-OHP4/P4 of 3.49 vs 2.21; p = 0.0005) and 17,20 lyase
(A/17-OHP4 of 3.38 vs 2.58; p = 0.047) activities in the Δ4 pathway. The 3β-HSDII enzyme
converted more DHEA to A in the hyperandrogenic patients (A/DHEAS of 3.02 vs 1.52; p<
66
0.0001). In contrast, 17-HOPE was converted into 17-OHP4 at the same rate in both groups (17HOP4 ∕ 17-OHPE of 1.79 vs 1.67; p = 0.837). The activities of 21-hydroxylase (11-DOC/17OHP4 of 1.0 vs 2.2; p < 0.0001) and 11β-hydroxylase (C/11-DOC of 54.2 vs 74.4; p < 0.0001)
were lower in hyperandrogenic patients (Table 3).
After adrenal stimulation, the maximal levels of C, A, 17-OHP4, and P4 were not
different in normo- and hyperandrogenic patients (p > 0.05). However, the areas under the
response curves of 17-OHP4 and A were higher in the hiperandrogenics (p < 0.0001 and p =
0.049, respectively). Even though they have presented different activities under basal conditions,
after tetracosactrin stimulation normoandrogenic and hyperandrogenic patients did not differ in
their 17-hydroxylase activity in the Δ4 pathway (p = 0.134; Figure 1). On the other hand, like at
baseline, 17,20 lyase activity in this pathway was also greater in hyperandrogenic women (p <
0.0001; Figure 1). Two out of 16 (12.5%) normoandrogenic patients had 17-OHP4 levels
between 15 and 30 nmol/l; in the hyperandrogenic PCOS group 11/58 (18.9%) presented 17OHP4 levels in this range (p = 0.551).
Comments
The present study compares the activities of different corticosteroidogenic enzymes
between normoandrogenic and hyperandrogenic PCOS patients, rather than between PCOS and
healthy subjects, as recently suggested [16], both before and after adrenal stimulation. As far as
you know this is the first study comparing corticosteroidogenics enzyme activities between
normo- and hyperandrogenic PCOS patients. It was already shown that a single early morning
basal serum androgen measurement, as used in the current study, is an extremely accurate
screening method [17]. In previous studies, using several androgens as markers, biochemical
hyperandrogenism has been found in up to 80% of PCOS patients diagnosed by the Rotterdan
criteria, in different populations [5,6]. Adrenal hyperandrogenism was found in up to 62% of
PCOS patients [18]; ovarian hyperandrogenism seems to be even more frequent [5].
No
consistent enzymatic abnormality in PCOS patients steroidogenesis has been reported. After the
introduction of the Rotterdam criteria in the clinical setting, a few studies have examined the
activities of these enzymes [13]; this was the proposal of the current study.
The corticosteroidogenesis pathway understanding is facilitated by following Figure 2, a
modification of Payne and Hales [7]. Dysregulation of the P450c17α enzymatic complex in
PCOS was already reported before [12,19] and after [20] Rotterdam, at least in hyperandrogenic
PCOS patients. In the current study, 17,20 lyase activity was higher in the ∆4 pathway in the
hiperandrogenic patients, both at baseline and after tetracosactrin injection. Either decrease in
67
17-hydroxylase activity with increase in 17,20 lyase [17], or increase in 17-hydroxylase in
relation to 17,20 lyase [10] was found. An early study demonstrated that in PCOS patients
estrogen may activate 17,20 lyase in the ∆4 pathway without changing it in the ∆5 pathway [11].
The increase in 17,20 lyase activity in PCOS patients has also been attributed to Ser/Thr residues
phosphorylation, and cytochrome b5 [21-23].
In fact, P450C17α dysregulation has been
attributed to a modulatory effect of cytochrome b5, insulin, or estradiol [11,22]. In the current
study, estradiol levels were a little higher in the hyperandrogenic group, and this finding may
support previous observation that estrogen might increase 17,20 lyase activity in ∆4 pathway in
PCOS patients [11,13]. Also, hyperandrogenic patients presented higher insulin baseline levels.
Neverthless, the role of insulin in P450c17α enzyme activity has been reported to be inconsistent
[11,22,24].
The higher 17-OHP4 and A baseline levels found in the hyperandrogenic patients in the
present study indicated that at least the hyperandrogenic PCOS women have greater 17hydroxylase and 17,20 lyase activities in the Δ4 pathway. Higher basal levels of DHEAS and
17-OHPE also indicated higher P45017α complex activity in ∆5 pathway in hyperandrogenic
patients. These observations are relevant because in normal conditions the human P450c17α
possesses normal 17,20 lyase activity in the ∆5 pathway and minimal, if any, activity in the ∆4
pathway [25]. Greater activity of 17,20 lyase was previously demonstrated in PCOS patients
diagnosed according to the Rotterdam criteria as compared with healthy individuals; on the
other side 17-hydroxylase activity was shown to be the same in both PCOS and healthy women
[13]. There is no clear explanation for this inconsistency but 17-hydroxylase activity may
already be maximally driven precluding its further increase in the ∆4 pathway.
Hyperandrogenic patients may present decreased 3β-HSDII activity with lower
conversion of Δ5-3β-hydroxysteroids into Δ4-3β-hydroxysteroids [8,9]. The result is higher
levels of substrates for androgen synthesis [25,26]. Before Rotterdam, a non-classic clinical form
of 3β-HSD deficiency was reported in hyperandrogenic patients with hirsutism and abnormal
menstrual cycles [26,27] and different 3β-HSD activities were reported in PCOS patients both
before and after Rotterdam [25]. In the current study, normo- and hyperandrogenic PCOS
patients had equal ratios of progesterones (17-OHP4/17-OHPE p = 0.837), suggesting equal 3βHSDII activity in these groups in the conversion of 17-OHPE into 17-OHP4. Equal 3β-HSDII
activity was already reported by others when healthy women and PCOS patients were compared
[11]. Using DHEAS as surrogate for DHEA, the higher (A/DHEAS) ratio in hyperandrogenic
patients, found in the current study, suggests higher 3β-HSDII activity in the conversion of
68
DHEA into A. This discrepancy and inconsistence in the 3β-HSDII activity indicates that this
enzyme may not have the same gene expression in all adrenal cells [28].
Lower 21-hydroxylase activity has been found in 1%-19% of PCOS patients, depending
on the ethnicity [29]. In the present study, this lower activity was found only in hyperandrogenic
patients, in whom the 11-DOC/17-OHP4 ratio was significantly lower as compared to
normoandrogenic patients. So, the present study supports the tendency toward lower 21hydroxylase activity in some PCOS patients already found before [29] and after [30] Rotterdam
standardization.
Slight 11β-hydroxylase deficiency has been found in up to 8.4% of PCOS patients before
Rotterdam [11]. Ten percent (4/40) of the hyperandrogenic patients presented 11-DOC
concentrations of 18.2nmol/l, a level threefold higher than the third quartile of the
normoandrogenics, indicating some 11β - hydroxylase deficiency. Similar results were
previously observed when hyperandrogenic PCOS patients were compared with normal controls
[10]. In addition, in the current study, hyperandrogenic patients had lower C/11-DOC ratio, with
11-DOC accumulation. The findings support earlier observation of lower 11β-hydroxylase
activity in clomiphene resistant PCOS patients [12]. A significant decrease in the combined
activities of 11-hydroxylase and 21-hydroxylase was present in the hyperandrogenic patients in
the present study. After Rotterdan, the combined activities of these enzymes, as examined by
C/17-OHP4 ratio, were reported to be the same in PCOS patients as a whole group as compared
to healthy controls [31].
It may be concluded that anthropometric and clinical aspects were not different between normoand hyperandrogenic PCOS patients. Dysregulation of p450c17α enzymatic complex with
greater 17,20 lyase activity was found only in the hyperandrogenic PCOS patients at baseline
and after adrenal stimulation. Greater conversion of DHEA into A seen in hyperandrogenic
PCOS patients without higher conversion of 17-OHPE to 17-OHP4 indicates different 3β-HSDII
activity in different adrenal cells. Hyperandrogenic PCOS patients have lower 21-hydroxylase
and 11β - hydroxylase activities than normoandrogenic ones. The results of the current study are
confirmatory of the findings reported before NIH/Rotterdam systematization.
Thought the present study clearly define PCOS and hyperandrogenism, it may have
possible limitations. First: the criteria used to exclude classics 21-hydroxylase, 11β-hydroxylase,
and 3β-HSD deficiences are not standardized yet and those used in this study may be not
universally adopted. Second: the use of A/DHEAS ratio as a surrogate for A/DHEA ratio to
evaluate 3β-HSDII activity may be not appropriate. However, DHEAS and DHEA levels have
shown to be closely related [7,27] and DHEAS has the advantage of being stable throughout the
69
day. Third: The assays used to measure androgens may not be accurate but recent comparisons
between radioimmunoassays for T, 17-OHPE, 17OHP4, 11-DOC and liquid chromatography
mass spectrometry in tandem showed good agreemet between the methods [39,40]. Fourth: the
comparing of enzyme activities between normo- and hyperandrogenic PCOS patients instead
comparing PCOS patients with healthy women attended recent suggestion and added new
information on the phenotype heterogeneity seen in PCOS patients.
Acknowledgements
The authors thank to Biomed Proofreading for English copyediting of the manuscript.
70
Table 1. Anthropometric characteristics of normo-and hyperandrogenic PCOS patients.
Variable
Normoandrogenic patients
Hyperandrogenic patients
n
x
SD
n
x
SD
pa
Age (years)
39
26.6
5.8
79
27.0
5.4
0.719
Weight (kg)
38
74.6
25.6
75
16.3
0.861
Height (m)
37
1.58
0.06
64
1.57
0.07
0.450
BMI
37
29.0
10.0
64
30.6
6.5
0.386
Waist (cm)
32
87.9
18.6
59
90.9
13.1
0.422
Hip (cm)
32
106.6
16.9
59
107.7
12.8
0.749
W:H
32
0.82
0.06
59
0.84
0.08
0.182
Body area (m2)
37
1.76
0.3
64
1.81
0.2
0.369
a
Welch Test
75.4
71
Table 2. Comparison of demographic and endocrine characteristics in patients with polycystic ovary syndrome with and without
hyperandrogenemia.
Hormone
Normoandrogenic patients
n
x
SD
36
2.50
1.31
35
14.56
1.16
37
0.48
0.25
38
6.66
1.91
38
6.10
1.49
38
2.57
1.54
35
1.50
0.50
35
39.35
1.67
31
4.16
1.77
35
347.80
139.40
17
4.98
2.80
Hyperandrogenic patients
n
x
SD
72
2.19
1.16
62
14.23
1.46
75
0.43
0.21
74
9.32
1.69
74
5.64
1.39
74
2.85
1.41
74
2.20
1.04
43
25.38
1.70
63
10.17
5.86
78
358.90
172.10
34
6.07
3.55
pb
0.233
0.224
0.268
<0.0001
0.118
0.352
<0.0001
<0.0001
<0.0001
0.717
0.239
TSH (µUI/ml)
Free thyroxine (pmol/l) a
Prolactin (nmol)*
LH (mUI/ml)a
FSH (mUI/ml)a
LH:FSH ratioa
Total testosterone (nmol/l)*
SHBG (nmol/l) a
IAL(%)
Cortisol (nmol/l)*
17-hydroxypregnenolone
(nmol/l)*
17-hydroxyprogesterone
35
3.36
1.60
76
4.74
1.66
<0.0001
a*
(nmol/l)
11-deoxycortisol (nmol/l)a*
32
6.13
1.73
44
7.29
1.71
0.005
DHEAS (µmol/l)*
36
3.74
1.54
71
5.31
2.70
0.0002
Androstenedione (nmol/l)*
34
5.15
1.51
75
11.49
4.96
<0.001
Estradiol (nmol/l)*
31
162.51
64.80
50
191.97
97.0
0.105
Progesterone (nmol/l)*
31
2.23
1.46
61
1.86
1.15
0.224
Insulin (pmol/l)
32
61.29
1.92
71
82.14
1.96
0.0001
a
The data underwent logarithmic transformation to meet the Gaussian distribution precepts.
b
Wilcoxon unpaired test
⃰ To convert gravimetric international units (SI) values to mass units divide 0.0347 for total testosterone, 0.0271 for DHEAS, 0.0301 for 17OHPE, 0.0303 for 17-OHP4, 0.0349 for androstenedione, 0.0289 for 11-Doc, 27.6 for cortisol, 3.67 for estradiol, 3.18 for progesterone, 0.04348
for PRL, 12.87 for free thyroxine, and 6.945 for insulin.
72
Table 3. Corticosteroidogenic enzymes activity in normo-and hyperandrogenic patients with polycystic ovary syndrome.
Enzyme
Ratioa
Normoandrogenic patients
Hyperandrogenic patients
SD
pc
0.95
3.49
3.38
1.98
1.76
0.66
0.415
0.0005
0.047
30
66
1.79
3.02
1.48
2.50
0.837
< 0.0001
1.67
42
54.27
1.96
< 0.0001
2.20
1.07
39
1.09
0.41
< 0.0001
34
148.40
2.44
73
85.30
1.98
<0.0001
14
60.30
1.83
31
58.90
1.19
0.017
n
x
SD
n
DHEAS/17-OHPE
17-OHP4/P4
A/17-OHP4
16
30
30
2.19
2.21
2.58
1.05
1.45
1.68
30
58
72
 3β-HSDII (x10-3)
17-OHP4/17-HOPE
A/DHEAS
30
31
1.67
1.52
1.52
0.79
 11β-hydroxylase
C/11-DOCb
29
74.48
 21-hydroxylase
11-DOC/17-OHP4
29
 11 and 21-hydroxylase
C/17-OHP4b
 3β-HSDII, 11 and 21hydroxylase
C/17-OHPEb
 P450c17α
17, 20 lyase (∆5) (x103)
17-hydroxylase (∆4 pathway)
17, 20 lyase (∆4 pathway)
a
All the results are expressed in nmol/l.
b
The data underwent logarithmic transformation to meet the Gaussian distribution precepts.
c
Wilcoxon unpaired test
x
73
Figura 01
74
Figura 02