7.28 Spring ‘01
Respostas do Conjunto de Problemas #3
Questão 1. Você está estudando a regulação da síntese de tirosina em um eucariota
unicelular. É pensado que a enzima Tyr1, que adiciona grupos hidroxila a anel aromático, pode
ser um componente "chave regulado" desta via biossintética. A atividade enzimática
significante de Tyr1 só é vista em células cultivadas em meio sem tirosina. Depois de identificar
o promotor do gene de Tyr1, você o funde a uma construção repórter, para começar a estudar
a regulação de Tyr1. Porém, você está surpreso pelos seguintes dados:
gene de fusão - promotor deTyr1 - β -Gal
β-Gal atividade
-Tyr
+Tyr
++++
++++
1a. O que isto lhe diz sobre a regulação de atividade de Tyr1? Descreva uma experiência
simples que você poderia usar para confirmar sua hipótese.
Desde que não há nenhuma mudança no produto do gene repórter, sob ambas as
condições, a regulação da atividade do gene de Tyr1 não acontece no nível de
transcripcional. Um modo para pesquisa adicional disto seria um Northern blot. Usando
uma sonda marcada para o gene de Tyr1, se você visse níveis semelhantes de mRNA de
Tyr1 em células cultivadas sob ambas as condições, você concluiria que a regulação foi
traducional ou pós-traducional. (Se você visse uma mudança, então as diferenças na
estabilidade do mRNA, sob condições diferentes, seriam uma implicação provável,
desde que a atividade de promotor pareça inalterada)
1b. Você suspeita que a estrutura do RNA pode ter um papel na regulação de Tyr1. Um pósdoutor amigável ajuda você com uma série de análises de proteção de nuclease, e você acha
uma região no mRNA maduro, purificado destas células, que parecem conter uma estrutura
secundária significante. Esta região fica acima situada, aproximadamente, 200 bp do códon de
iniciação.
Como esta região de estrutura secundária poderia afetar a expressão da proteína Tyr1? Como
você testaria se este elemento estrutural estava envolvido na regulação de Tyr1?
Dado a posição desta região com uma estrutura secundária, acima do códon de
iniciação, esta região poderia afetar a iniciação da tradução. O eIF4 não poderá facilitar
carregamento de ribossomo do mRNA adjacente ao cap 5' se a estrutura secundária do
RNA não for eliminada. Embora o eIF4a e eIF4b sejam capazes de “aplainar” estas
estruturas em muitos mRNAs, no caso do mRNA de Tyr1 um fator pode se ligar e
estabilizar esta estrutura, na presença de tirosina e bloquear este passo na iniciação da
tradução.
1
7.28 Spring ‘01
Respostas do Conjunto de Problemas #3
Você poderia testar o papel desta região de dois modos complementares:
i.Remova esta região do gene e veja se inibição da atividade tirosina-dependente
de Tyr1 está diminuída ou eliminada. (Teste se região é necessária para regulação.)
ii.Insira esta região em um gene repórter a uma posição semelhante acima de seu
códon de iniciação e veja se a atividade do produto do gene repórter é regulada, agora,
através da tirosina. (Teste se região é suficiente para regulação.)
1c. Você gera mutações agora que mudam os níveis de atividade de Tyr1. Você identifica uma
série de variantes mutantes com mutações pontuais que mapeiam para dentro do gene de
Tyr1. Os fenótipos de três classes das variantes são mostrados abaixo:
Atividade Tyr1
Tipo selvagem
Tipo A1
Tipo A2
Tipo B
-Tyr
++++
++++
++++
+
+ Tyr
+
++++
++++
+
Os locais das mutações específicas dentro do gene de Tyr1 são mostrados abaixo (nota: todas
as mutações de sequência de codificação são missense):
Um artigo recentemente publicado identificou vários domínios na proteína de Tyr1. Nenhuma
de suas mutações entrou no domínio catalítico da proteína. Também, as proteínas mutantes de
Tyr1 purificadas de todas as variantes mutantes mostraram atividade enzimática normal in vitro.
As mutações nas variantes tipo A2 são todas em uma região da proteína que é desnecessária
para função enzimática in vitro e não tem nenhuma função conhecida. As mutações nas
variantes tipo B são encontradas em uma região mostra estar envolvida na ligação de tirosina.
Usando todos esses dados, sugira uma explicação para os defeitos em cada uma destas
variantes mutantes e a função normal em células de tipo selvagem das regiões do gene de
Tyr1, onde estas de mutações se encontram.
Tipo A1:
Estes mutantes ou alteraram ou eliminaram a estrutura de RNA achada na
região 1. Normalmente, esta estrutura serve bloquear a tradução do mRNA de Tyr1, na
presença de tirosina (pelo mecanismo descrito na parte a). Nestes mutantes, a ausência
da estrutura tipo selvagem do RNA permite proceder à tradução, sob ambas as
condições.
Tipo A2:
Estes mutantes alteraram ou eliminaram uma região da proteína de Tyr1
envolvida na regulação da tradução de seu próprio mRNA. Esta parte da proteína poderia
interagir diretamente com o mRNA, ou poderia afetar o mRNA indiretamente por
interações com outras proteínas. Em qualquer caso, o efeito final deveria ser a
estabilização, na presença de tirosina, da estrutura de RNA achada na região 1 e a
prevenção da tradução de Tyr1. A ausência de tal estabilização na variante mutante
conduz a expressão desregulada de proteína Tyr1.
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7.28 Spring ‘01
Respostas do Conjunto de Problemas #3
Tipo B: A proteína de Tyr1 contém um sítio alostérico regulador de ligação com tirosina,
e este é alterado nestes mutantes em um de dois modos:
i. A tirosina é ligada com afinidade muita mais alta que na proteína Tyr1 tipo selvagem, e
assim até mesmo na ausência de tirosina externamente adicionada, o sítio permanece
ocupado.
ii. A conformação do domínio é alterada para ficar permanentemente na forma “tirosinaligada”, até mesmo na ausência de tirosina. Este sítio alostérico regularmente funciona
para perceber os níveis de tirosina na célula: quando a tirosina for abundante, este sítio
está ocupado e Tyr1 é capaz de suprimir a sua própria tradução (pelas ações da região
A2); quando a tirosina estiver escassa, este sítio está vazio e a proteína Tyr1 adota uma
conformação agora incapaz de suprimir a sua própria tradução. Nos mutantes, este sítio
e a proteína de Tyr1 estão sempre na conformação tirosina-ligada, supressora da
tradução.
1d. Você teve a intenção de identificar supressores para um de seus mutantes do tipo A1. Você
acha que as mutações pontuais localizadas em duas áreas podem restabelecer a atividade de
Tyr1 normalmente regulada nestas células: a área definida pelos mutantes do tipo A1, como
também a área definida pelos mutantes do tipo de A2. Como estes dois tipos diferentes de
supressores funcionam? O que isto implica sobre a regulação da atividade de Tyr1? Dê um
modelo tão completo quanto você puder.
Os supressores localizados dentro da região A1, provavelmente, restabelecem a
estrutura secundária do RNA tipo selvagem identificada na parte (b) restabelecendo as
interações de pareamento de bases com mutações complementares para as mutações
de A1 originais. (Veja o conjunto de problema #3, questão 7 para mais informações sobre
este tipo de supressão).
A existência de supressores na região A2 da proteína Tyr1 implica que este
domínio de proteína fisicamente contata que a estrutura de RNA na região 5' do mRNA
de Tyr1. Os supressores contêm mutações que alteram a proteína e permitem esta se
ligar à estrutura mutante de RNA. Neste caso, a proteína mutante de Tyr1 e o elemento
estrutural mutante de RNA interagem de maneira semelhante para a proteína tipo
selvagem de Tyr1 e o elemento estrutural tipo selvagem de RNA.
MODELO:
Quando os níveis de tirosina forem altos na célula, a proteína Tyr1 liga
uma molécula de tirosina em seu sítio alostérico (identificado pelos mutantes B).
Quando a tirosina for ligada por Tyr1, a proteína pode usar um domínio (definido pelos
mutantes A2)para ligar e estabilizar o elemento estrutural de RNA acima do códon de
iniciação. Isto impede agora o eIF4 de recrutar o Ribossomo ao mRNA, e nenhuma
tradução de Tyr1 nova acontecerá. De maneira que, os níveis da proteína Tyr1
permanecerão baixos na célula.
Quando níveis de tirosina forem baixos, a proteína Tyr1 não terá uma molécula de
tirosina ligada e não poderá se associar com o elemento estrutural do RNA. Agora eIF4
poderá recrutar o Ribossomo ao mRNA, e poderá iniciar a tradução Tyr1 e aumentar os
níveis da proteína Tyr1.
3
7.28 Spring ‘01
Respostas do Conjunto de Problemas #3
1e. Descreva um experimento que você poderia usar para testar seu modelo em d). Inclua
controles que usam suas formas de mutante do gene de Tyr1.
Uma experiência de gel shift que usa o mRNA de Tyr1 e a proteína de Tyr1 seria útil. A
proteína Tyr1 só deveria ligar ao mRNA de Tyr1 se a tirosina estiver presente. Na
ausência de tirosina, a proteína Tyr1 não deveria dar uma alteração no gel com o mRNA
de Tyr1. Também, não deveria haver (i) nenhuma ligação entre proteína tipo selvagem de
Tyr1 e o mRNAs mutante A1 e (ii) nenhuma ligação entre a proteína mutante de A2 de
Tyr1 e os mRNAs de tipo selvagem.
Questão 2 (12 pontos). Você identificou uma série de mutações no tRNA de Alanina que está
defectivo na tradução. Você está interessado em determinar em que funções cada mutação é
defectiva. Descreva brevemente como você poderia descobrir mutações que estavam
defectivas nas atividades seguintes. Você tem acesso a qualquer proteína purificada,
aminoácidos, ou RNAs que você precisa.
2A (3 Pontos). Acoplando a Alanina
Poderiam ser usados vários desenhos experimentais diferentes para descobrir se
o tRNA de Alanina está defectivo na tradução porque não pode ser “carregado” com
alanina. O mais simples seria combinar seu tRNA, a sintetase de tRNA de alanina, ATP, e
alanina radioativamente marcada. Corra os produtos desta reação em um gel e core com
brometo de etídeo para identificar o local do tRNA. Então seque o gel e exponha ao filme.
Se o tRNA mutante puder ser carregados, você esperaria que o sinal radioativo comigrasse com o tRNA. Porém, se o tRNA está defectivo em carregar, os aminoácidos
radioativos correrão para o fim do gel.
Outras possibilidades incluem uma reação “de carregar" semelhante in vitro,
seguida por uma ligação em filtro, onde o filtro foi tratado para ligar RNA, mas não
proteínas ou aminoácidos livres. Se você vir um sinal radioativo no filtro, então você
saberá se o tRNA foi carregado.
2B (3 Pontos). Interação com EF-Tu.
Qualquer experiência que poderia determinar se Ef-Tu pode ligar tRNA funcionaria aqui.
Uma possibilidade seria um ensaio de ligação em filtro, no qual o filtro foi tratado para
ligar apenas RNA. Você combinaria o tRNA, Ef-Tu radioativo e GTP, passaria a mistura
pelo filtro, lavaria e veria se radioatividade foi retida no filtro. Se você pode descobrir um
sinal radioativo, você sabe que o Ef-Tu pode ligar o tRNA. Outras possibilidades
incluem: ensaio de gel shift, IP (depois da ligação cruzada), coluna de afinidade, etc. Um
ensaio de interferência de modificação também funcionaria, se você assumir que aquela
interação de tRNA/EF-Tu é necessária para proteção do sítio A. Não foi atribuído crédito
aqui para centrifugação em gradiente de sacarose. A resolução de um gradiente de
sacarose não é boa bastante para separar o EF-Tu que é ligado ao tRNA do tRNA livre.
Os mutantes ou tipo selvagem dariam o mesmo resultado em uma separação de
gradiente de sacarose, e você poderia obter um resultado falso negativo.
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7.28 ‘01
Respostas do Conjunto de Problemas #3
2C (3 Pontos). Interação com o Ribossomo.
Considerando que o ribossomo é um complexo bastante incômodo de RNA e
proteínas, é provavelmente mais fácil usar gradientes de densidade de sacarose para
estudar se o tRNA mutante pode se ligar ao ribossomo. Você poderia querer combinar o
tRNA mutante radioativo carregado, Ef-Tu, GTP (ou, melhor, GMP-PCP), e o ribossomo
juntos e então adicionar esta mistura ao topo de um gradiente de densidade de
sacarose. Após remover as frações da centrifugação e fazer Northern blots (sondando
com um fragmento de DNA que é complementar a sequência de rRNA) para descobrir as
frações que contêm o ribossomo, use a contagem de cintilação para detectar o local do
tRNA carregado. Se o sinal radioativo co-eluir nas mesmas frações que o ribossomo,
sabe você que o tRNA pode interagir com o ribossomo.
Outra resposta comum foi usar um ensaio de interferência de modificação,
visando a proteção do sítio A (devido a interações EF-Tu e tRNA).
2D (3 Pontos). Considerando cada um dos três defeitos potenciais, qual você esperaria estar
nas regiões do Ala-tRNA que são conservadas em todos ou na maioria dos tRNAs? Qual você
esperaria estar em regiões do Ala-tRNA que são únicas?
A região do tRNA de alanina que é necessária para reconhecer a alanina é
provavelmente única neste tRNA. Cada tRNA terá uma região única que é envolvida na
ligação do seu aminoácido específico, que corresponde ao anticódon do tRNA. Os
domínios de tRNA que interagem com Ef-Tu e o ribossomo, provavelmente, são comuns
a todos os tRNAs (conservados) desde todos os tRNAs – independente do aminoácido
que eles estão levando-- precisa manter estas interações para serem funcionais. (1 ponto
cada)
Muitas pessoas escreveram todas as regiões únicas e conservadas do tRNA, que
não é o que a questão perguntou. Algum crédito parcial foi atribuído aqui, dependendo
de se você relacionou estas regiões aos defeitos descritos em 3A-3C.
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7.28 Spring ‘01
Respostas do Conjunto de Problemas #3
Questão 3 (30 pontos). Você está estudando a regulação do operon de fenilalanina(Phe) em
E. coli. Este operon codifica um mRNA para 3 proteínas necessárias para células produzir Phe.
Como um primeiro para caracterizar a regulação do operon, você funde a sequência codificante
para LacZ ao promotor do operon de fenilalanina para examinar regulação, na presença e
ausência de Phe. Você acha os seguintes resultados:
+Phe
-Phe
PromPhe-LacZ (Unidades de Atividade β-Gal)
500 Unid.
2500 Un.
3A (3 Pontos). O que pode concluir você sobre a regulação do operon a partir destes
resultados? Preste atenção particular à fase de biossíntese que é regulada como também
qualquer suposição que você fizer ao chegar à sua conclusão.
Para tirar conclusões a partir dos níveis de expressão de LacZ, nós temos que assumir
que a LacZ é estável nestas células e que a atividade ou estabilidade de LacZ não são
afetadas, pela presença ou ausência da fenilalanina (1 ponto). Dado estas suposições, os
dados sugerem que a expressão do operon Phe seja transcripcionalmente regulada (1
ponto) e que a regulação é dependente do nível de fenilalanina na célula. O operon é
induzido quando houver pouca fenilalanina e reprimido quando a fenilalanina for
abundante (1 ponto).
Você está surpreso por achar uma mudança de apenas cinco vezes na presença de
Phe, enquanto estudos de outros operons envolvidos em metabolismo de aminoácidos,
normalmente, apresentam uma repressão de 200-1000 vezes, na presença do aminoácido que
eles sintetizam. Para procurar uma regulação adicional, você funde a região codificante de
LacZ às regiões que codificam os C-terminais de PheA e de PheB. Em cada caso você acha
que a proteína de fusão é ativa para atividade de β -Galactosidase.
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7.28 Spring ‘01
Respostas do Conjunto de Problemas #3
Você testa para atividade de LacZ em variantes que contêm uma ou a outra construção na
presença ou ausência de Phe. Você obtém os seguintes resultados:
+Phe
-Phe
Fusão A
500 Unid.
2500 Unid.
Fusão B
2Unid.
2500 Unid.
3B (3 Pontos). O que você pode concluir sobre a regulação das proteínas PheA e PheB,
baseado nestes achados?
Fazendo fusões do gene de LacZ a ambos PheA e PheB, nós podemos observar a
regulação traducional (1 ponto) de ambos os genes. Você ainda precisa fazer as mesmas
suposições gerais sobre a atividade de LacZ que foi determinada em 5a. Estes
resultados indicam que PheA não é regulado no nível traducional, já que o LacZ fundido
ao PheA tem a mesma atividade de quando ele era controlado apenas pelo promotor de
Phe (1 ponto). O gene PheB não é apenas regulado transcripcionalmente, mas também
traducionalmente, uma vez que a atividade de LacZ, na ausência de fenilalanina, é mais
baixa na proteína de fusão. De forma que, a tradução de PheB é regulada negativamente
pela presença de Fenilalanina (1 ponto).
Intrigado pelos experimentos de substituição de LacZ, você quer identificar mutações
no operon de Phe que alteram a regulação observada. Para este fim, você induz mutações em
células de E. de coli que contém a construção de Fusão B. Você procura colônias que são
Azuis (= expressão de LacZ alta) na presença de Phe ou que são brancas (=baixa ou nenhuma
expressão de LacZ) na ausência de Phe.
Usando esta seleção, você identifica três classes de mutantes, que você chama
mutantes de Controle de Resposta de Fenilalanina (Cpr). Cpr1 e Cpr2 são constitutivamente
Brancos e Cpr3 é constitutivamente Azul.
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7.28 Spring ‘01
Respostas do Conjunto de Problemas #3
3C (5 pontos). Descreva como você determinaria se cada mutante de Cpr age em cis ou em
trans para o operon de Phe.
Para determinar se cada dos mutantes de Cpr é cis ou trans atuante, você quer
adicionar às células uma segunda construção de gene repórter. Você poderia usar um
plasmídeo que contém o promotor de Phe e uma fusão de PheB-luciferase (i.e. uma
Fusão extra B construída com luciferase, em vez de LacZ). Nota: considerando que estes
mutantes foram isolados no contexto da construção da Fusão B, elas são mutações que
afetam a regulação transcripcional E traducional de PheB. Um promotor de fusão (como
na parte 5A) não lhe permitirá analisar Cis - Trans, porque não permite a observação da
regulação traducional. (2 pontos para construção correta).
Esta construção lhe permitirá determinar se os mutantes de Cpr ou afetam a
regulação transcripcional ou traducional de PheB em cis ou trans. Se a mutação for
trans-atuante, você espera que a atividade de luciferase mostre o mesmo fenótipo que a
atividade de LacZ (i.e. o fenótipo mutante). Se a mutação é cis-atuante então a atividade
de luciferase deverá exibir a regulação do tipo selvagem (baixa em phe+, alta em phe -).
(3 pontos para análise de resultados).
Usando o teste cis-trans você acha o seguinte:
Cpr1 mutantes atuam em cis.
Cpr2 mutantes atuam em trans.
Cpr3 mutantes atuam em cis.
Para determinar onde as mutações cis-atuantes ficam situadas, você sequencia o
operon Phe a partir das variantes mutantes Cpr1 e Cpr3. Você acha mutações nos seguintes
locais perto do AUG de PheB:
3D (4 pontos). Baseado em seus achados, como você pensa que as mutações Cpr3 estão
influenciando a regulação do operon Phe?
As mutações de Cpr3 são cis-atuantes e conduzem à expressão constitutiva de
PheB. A natureza simétrica das mutações de Cpr3 sugere que as mutações possam estar
rompendo o loop do hairpin. A posição das mutações, logo depois da sequência S/D,
sugere que um loop de hairpin pode estar se formando para inibir a tradução de PheB.
Nós sabemos a partir dos dados de regulação de traducional, que a tradução de PheB é
fortemente reprimida na presença de fenilalanina, logo a formação deste loop deve ser
dependente de alto nível de fenilalanina (2 pontos para o hairpin, 2 pontos por
reconhecer sua dependência do nível de phe e que afeta a TRADUÇÃO).
Outra resposta que foi dada foi que a fenilalanina, ou um regulador dependente
de phe+, se liga a Cpr3 para bloquear a tradução de PheB. Isto é improvável, por causa
da natureza simétrica das mutações. Porém, um crédito parcial foi determinado para esta
resposta (2 pontos).
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7.28 Spring ‘01
Respostas do Conjunto de Problemas #3
3E (4 pontos). Brevemente descreva como você poderia testar sua hipótese?
Você poderia testar sua hipótese usando um ensaio genético ou bioquímico.
Nós mostramos que os supressores de mutações, que rompem loops de hairpins,
restabelecem o pareamento de base apropriado. Por exemplo, se você tivesse uma
mutação de A para G e o supressor estivesse perto e você veria uma mudança de um T
para um C. Este tipo de análise de supressão poderia lhe dar dados adicionais sobre se
a mutação de Cpr3 realmente rompe um loop de hairpin.
Para testar isto bioquimicamente, você poderia usar RNase S1 e Rnase SV, em
um ensaio de proteção do RNA tipo selvagem e mutante. Você esperaria ver a haste em
dupla fita característica do loop no RNA tipo selvagem, mas não nos mutantes Cpr3.
Se você usou um “modelo de repressão de ligação” na parte 5D, e você fez uma
boa análise para isto nesta seção, você recebeu crédito. Porém, a ligação de fenilalanina
(o aa) não dará um padrão de proteção a DNAse ou Rnase—isto é muito pouco. Você
precisaria hipotetisar uma proteína de ligação para usar este ensaio.
O Cpr1 e mutações de Cpr2 permanecem misteriosas para você. Você inicialmente
suspeita de um atenuador semelhante ao operon de Trp, mas você não acha códons de
iniciação entre o códon de parada do gene PheA e ATG do gene de PheB e o único
terminador no mRNA está depois do gene PheC. Não obstante, você dirige sua atenção para
a transcrição do operon Phe através de Northern blot e obtêm os seguintes resultados.
Depois de se assegurar uma vez mais que não há nenhum terminador na área de 2000
bp do sítio de iniciação de transcrição, você nota que esta região está perto do sítio das
mutações cis-atuantes Cpr1 e Cpr3.
Porque os mutantes de Cpr2 também não formam o transcrito de 2000 de bp em
condições de pouca Phe, você deseja saber se Cpr2 se liga ao RNA ou DNA no sítio de Cpr1.
3F (5 pontos). Descreva como você determinaria se este é o caso de usar a proteína de Cpr2
purificada, fornecida a você por um companheiro de laboratório generoso? Você pode fazer
qualquer RNA ou sonda de DNA que você quiser.
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7.28 Spring ‘01
Respostas do Conjunto de Problemas #3
Para testar se Cpr2 se liga a DNA ou RNA, você poderia executar um ensaio de
gel shift, usando um transcrito purificado de RNA do operon de Phe ou um fragmento de
DNA que contém o operon de Phe. Ambos estes fragmentos serão marcados nos seus
terminais 5' para facilitar visualização. Você carregaria no gel os fragmentos, com ou
sem Cpr2 purificado, e perguntaria se a banda foi elevada devido à ligação de Cpr2.
Outra resposta boa seria usar um ensaio de ligação com filtro com proteína de
Cpr2 não marcada e RNA ou dsDNA marcado que contêm o sítio de Cpr1. O filtro deve
reter proteína, mas deixar RNA e dsDNA fluírem. A radioatividade só permaneceria
associada com o filtro se a proteína se ligou o DNA ou RNA.
Você acha que a proteína de Cpr2 se liga ao sítio de dsDNA identificado pelas mutações de
Cpr1, mas que não se liga à forma do RNA do sítio de Cpr1. De forma interessante, você só
vê ligações na ausência de Phe. 3G (6 Pontos). Proponha um modelo que explica como Cpr2
pode influenciar a tradução do gene de PheB , através da ligação com dsDNA.
O Cpr2 poderia influenciar a tradução de PheB, através da ligação com dsDNA se
ele estiver envolvido na pausa da transcrição do gene de PheB. O passo crucial na
regulação traducional de PheB é se, ou não, o loop do hairpin, que bloqueia a sequência
S/D, pode se formar. Considerando que a transcrição e a tradução são acopladas em
procariotas, a formação do loop de hairpin poderia ser controlada pelo tempo de
transcrição, em particular se a transcrição for pausada, de forma que o RNA necessário
formar o loop não seja libertado da maquinaria de transcrição. O Cpr1 e mutações de
Cpr2 são críticas para estabelecer o tempo apropriado para impedir o loop do hairpin se
formar. O Cpr2 provavelmente se liga ao sítio de DNA codificado pelas mutações de Cpr1
e fisicamente bloqueia a transcrição, na ausência de Phe. O RNA necessário formar o
loop de hairpin não é libertado imediatamente e a tradução tem uma chance para se por
em dia. Quando a pausa é liberada, o RNA recentemente transcrito é imediatamente
traduzido, conduzindo à produção de PheB. Na presença de Phe, o Cpr2 não pode se
ligar e bloqueia a transcrição, o hairpin se forma, e o PheB não é feito. O produto de 2000
bp, visto pela análise de Northern, é o transcrito de RNA que é feito quando a RNA
polimerase é pausada por Cpr1. Você não vê isto em Cpr1 ou 2 mutantes, já que estas
mutações abolem a pausa.
O crédito completo requereu uma compreensão detalhada dos processos que
aconteceriam + e –Phe (por que a RNAP protelaria a formação do loop ou não,
acoplamento transcripcional e traducional, etc.). O crédito parcial foi atribuído para
respostas que mostraram alguma compreensão dos dados, mas que não forneceram um
modelo completo.
Problema 4. Você é um UROP que trabalha em um novo gene de telomerase em um ciliado
pouco estudado. Você clona o gene, mas não pode decifrar da sequência de DNA, onde o
quadro de leitura aberta (ORF) se inicia e acaba. Ao fim da sua capacidade, você consulta suas
notas em 7.28 e recorda que os ciliados têm, frequentemente, códigos genéticos estranhos.
Você decide que decifrar o código genético de ciliados seria um projeto muito mais excitante
que trabalhar em telômeros.
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7.28 Spring ‘01
Respostas do Conjunto de Problemas #3
4a) Você não está certo até mesmo que seu ciliado usa um código ternário (triplets, 3 nts=1aa),
mas dado que tem 20 aminoácidos, por que você pensa que o código de triplets é o mais
provável? (O que está errado com um código de doublet (2 nts=1aa) ou quadruplet (4 nt=1aa)?
Um código de doublet só codificaria 4*4 = 16 códons diferentes . Um
codificaria 4*4*4*4=256 códons, muitos mais que necessário.
quadruplet
4b) Qual é o número mínimo de tRNAs que uma célula para ser capaz de reconhecer
todos os 64 códons de triplet possíveis?
A primeira base do anticódon pode parear frouxamente com a última base do códon,
logo ter G ou U na primeira posição reconheceria, respectivamente, os códons com U ou
C, e códons com A ou G, na última posição. Portanto, em vez de 4*4*4=64 possíveis
códons, só há necessidade de 2*4*4 = 32 anti-códons. Também, desde que o códon de
parada não é reconhecido por um tRNA, mas por um fator de liberação, você pode
subtrair um anticódon para cada códon de parada.
4c) Seguindo nos passos de Ghobind Khorana, você faz um extrato celular do ciliado e o
programa com vários polímeros de RNA para ver que proteínas serão feitas. Quais são os
quatro códons mais simples para decifrar, e como?
Faça polímeros de cada ribonucleotídeo, e confira que aminoácido é sintetizado. Isto lhe
dirá o que UUU, AAA, GGG, e CCC codificam.
4d) Você decide então fazer copolímeros randômicos de G e U, misturando os ribonucleotídeos
junto, e recupera polipeptídeos que tem oito aminoácidos diferentes. Como você pode resolver
qual dos oito possíveis códons codifica para qual dos oito aminoácidos que você recuperou?
Quais códons seriam indistinguíveis por seu método?
Mude as proporções de Gs para Us. Isso deve mudar as proporções de códons
diferentes presentes nos seu RNAs. Você pode entender que a porcentagem de códons
então deve ter 3 Us, 2 Us e 1 U, e daí associar à porcentagem de cada aminoácido
recuperada. Porém, você não pode distinguir entre o três códons diferentes com 2 Us
(UUG, UGU, e GUU), e o três códons diferente com 1 U (UGG, GUG, e GGU). Para excluir
estes, você precisa fazer copolímeros repetidos de sequências específicas, como
(UUG)n.
4e) Você faz o mesmo com Gs e As, mas recupera menos que os 8 aminoácidos esperados.
Qual é o número de máximo de aminoácidos para que os 8 possíveis códons G e A poderiam
codificar? Por que?
4! Trema! Há apenas um possível anticódon de tRNA que reconhece GGA (UCC), e
aquele anticódon também reconhecerá o códon GGG. Semelhantemente, o anticódon
UUC reconhecerá o GAA e GAG, o anticódon UUU reconhecerá AAA e AAG, e o
anticódon UCU reconhecerá ambos AGA e AGG.
4f)Você observa ainda menos que o número de máximo de aminoácidos que você calculou
como possível na parte e. Qual é a explicação para isto e como você poderia testá-la?
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7.28 Spring ‘01
Respostas do Conjunto de Problemas #3
Um dos códons codifica uma parada. Corra os polipeptídeos sintetizados em um gel
poliacrilamida e SDS e veja se eles foram mais curtos que esses polímeros randômicos
sintetizados de Gs e Us. (Se houver um códon de parada, os polipeptídeos devem, em
média, ser de apenas 8 aminoácidos de comprimento.)
Problema 5. Você está interessado em estudar a iniciação da tradução com fMet-tRNA na
levedura fermentadora Saccharomyces cerevisiae. Em particular, você gostaria de investigar os
componentes específicos do sistema que direciona a iniciação ao primeiro AUG.
Especificamente, você está intrigado pela habilidade do sistema para distinguir entre AUGs
internos, que codificam metionina, do primeiro códon AUG que inicia com formil-Metionina.
Para investigar, inicialmente, como o sistema diferencia os diferentes códons de AUG,
você induz a mutação do tRNA que se liga a fMetionina. Você identifica três bases na
sequência do tRNA que são responsáveis pela sua habilidade para reconhecer o primeiro AUG,
exclusivamente, como o códon de iniciação. Você então induz a mutação nestas três bases de
forma que o tRNA já não mais retém sua habilidade para diferenciar o códon de iniciação dos
AUGs internos, mas por outro lado é normal em sua habilidade a ser carregado com a
fMetionina e parear com a sequência AUG. Finalmente, você substitui o alelo de tipo selvagem
do tRNA em sua variante com sua versão de mutante.
5a) Que fenótipo você esperaria da seu variante mutante? Providencie uma explicação para a
causa deste fenótipo.
Você não esperaria a iniciação de tradução. Um possível método que o fMettRNA usa
para distinguir o primeiro AUG de AUGs internos é a sua associação com eIF-2. O eIF-2
podem reconhecer um sequência no fMet-tRNA. Pode trazer o tRNA então ao sítio P
parcial da subunidade 40s do ribossomo para iniciação. Se as três bases que sofreram
mutações são responsáveis pela interação entre o eIF-2 e o fMet-tRNA, você não
carregaria fMet-tRNA no sítio P parcial e falha em iniciar.
Percebendo seu engano, você constrói uma variante que agora expressa ambos os alelos de
tipo selvagem do tRNA que se liga a fMetionina e seu alelo mutante.
5b) Que fenótipo espera você agora? Explique.
Considerando que você está expressando o alelo de tipo selvagem do tRNA que se liga a
fMet, você pode iniciar a tradução normalmente. Porém, desde que você também está
expressando o tRNA mutante, é possível que uma formil-Metionina será inserida em um
AUG interno, preferencialmente, no lugar de uma Metionina normal. Isto pode acontecer
se o fMet-tRNA associar com EF-Tu , preferencialmente, no lugar de eIF-2 e ser
carregado no sítio A. Se um fMet é inserido em uma cadeia de polipeptídeo em lugar de
uma Metionina normal, resultará numa terminação aberrante da tradução. Se você
visualizasse os polipeptídeos nesta variante (através de SDS-PAGE), você veria
polipeptídeos de comprimento variado, mas a maioria seria mais curto que um
polipeptídeo em uma variante de tipo selvagem.
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Respostas do Conjunto de Problemas #3
5c) Você suspeito que as três bases, nas quais você induziu mutação, do tRNA que se liga a
fMetionina são responsáveis por ligar um fator de iniciação como eIF2, eIF3, e eIF4. Descreva
um ensaio você pode usar para testar esta hipótese. Assuma que você tem acesso a tRNAs
purificados e fatores de iniciação.
Você pode executar um ensaio de ligação em filtro para testar se o tRNA de interesse se
liga a quaisquer dos fatores de iniciação. Para este ensaio, você usaria um filtro que
reterá proteínas, mas permite ácido de nucléico atravessar. Primeiro, marque
radioativamente seu tRNA. Então, incube com os fatores de iniciação purificados. Passe
sua mistura de proteína/tRNA pelo seu filtro. Finalmente, meça a radioatividade que
permanece no filtro. A radioatividade representa o tRNA retido no filtro, por causa de sua
ligação com fatores de iniciação. Para testar se as três bases “mudadas” são
responsáveis pela sua ligação com fatores de iniciação, você precisa testar seu mutante
e uma cópia de tipo selvagem do tRNA e comparar a radioatividade dos dois alelos.
5d) Você decide testar a especificidade do códon do fMet-tRNA. Fazendo desta forma, você
induz mutação no loop do anticódon de forma que o fMet-tRNA reconhece agora o códon GUG
para iniciação da tradução. Você então induz mutação no códon de iniciação do gene HIS de
AUG para GUG. Você monitora tradução do gene HIS e está muito surpreso em ver um
polipeptídeo de comprimento impróprio. Confundido por isto, você faz os mesmos mutantes de
anticódon e códon, mas desta vez no gene LEU. Uma vez mais, você obtém um polipeptídeo
de comprimento impróprio. Ofereça uma explicação para esta observação (sugestão:
normalmente, há seleção forte contra a presença de códon de iniciação de AUG na região
entre o 5'-CAP e o primeiro códon de iniciação).
A expectativa é que a iniciação normal pode acontecer ao induzir mutação no códon de
iniciação para GUG e no anticódon de fMet-tRNA para reconhecer GUG. Porém, este não
é o caso. É muito provável que o mutante de fMet-tRNA reconhecerá um GUG rio acima
do códon de iniciação correto e síntese de polipeptídeo será iniciada de lá. Isto resultará
em um polipeptídeo de comprimento impróprio, que também pode estar fora do quadro
de leitura correto. Sob circunstâncias normais, a seleção negativa contra AUGs entre o
5'-CAP e o códon de iniciação correto impedem esta situação. Porém, não há nenhuma
seleção deste tipo contra códons GUG, de maneira que eles têm a oportunidade para
ocorrer nesta região.
Questão 6) Durante um projeto de verão UROP você decide analisar a expressão de genes em
um fungo altamente proliferativo que isolou de seu chuveiro do dormitório. Desde que o
organismo parece crescer tão eficazmente, você razão que este fungo tem que ter uma
mitocôndria extremamente eficiente, e focaliza seus estudos iniciais em genes codificantes do
DNA mitocondrial . Você está excitado por achar um gene novo codificado pelo genoma de
mitocondrial; você nomeia este gene Fuz1. O transcrito de Fuz1 é muito longo, muito mais que
você esperou para codificar a proteína bastante pequena, que você pensa é o produto de Fuz1.
Então, você investiga se o transcrito é processado. Para fazer isto, você isola o RNA longo de
Fuz1, marca a extremidade 5' com P32, e incuba isto in vitro sob condições de reação
2+
2++
favoráveis para self-splicing de íntrons de ambos grupos I e II: Reações incluem Mn , Mg ,
32
NaCl, tampão de Tris-HCl, pH6,5, e P GTP. Abaixo se encontra um auto-radiograma do curso
de tempo desta reação de splicing in vitro.
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6a) Baseado neste padrão de splicing, você pensa que o RNA Fuz1 contém um íntron do grupo
I ou do II? Justifique sua resposta, brevemente.
O RNA deFuz1 contém um íntron do grupo I. A chave para entender isto é
observar cuidadosamente para o gel. O RNA de Fuz1 só estava marcado na extremidade
5'. Porém, os auto-radiogramas mostram que a reação inicial de splicing gera dois
produtos marcados. Se você olhar atrás para os ingredientes incluídos na reação, você
notará que GTP marcado foi incluído. O único modo de detectar ambos exon1 spliced
(contendo a marcação a 5') e o pedaço íntron+exon em 3 ' seria se a guanina marcada se
tornassem ligada covalentemente ao pedaço 3', como fazem os íntrons do Grupo I. O
íntron desaparece então porque o íntron de Grupo 1 é circularizado e o pedaço de 15 bp
que foi cortado contém a guanina marcada e este pedaço é muito pequeno para ser
detectado em um gel de agarose.
6b) Esquematize um diagrama de uma possível organização para o transcrito de Fuz1 antes de
processar, marcando o comprimento de todos os íntrons e exons. O Exon 1 tem,
aproximadamente, 200 bp, o íntron tem, aproximadamente, 3000 bp, e o Exon 2 tem,
aproximadamente, 100 bp. Providenciar a estrutura complexa de íntrons do grupo I
também é aceitável.
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6c) Para determinar se o gene de Fuz1 é responsável pelo crescimento rápido incomum do
fungo de chuveiro, você induz a mutação do gene com um mutagênico que dá origem
substituições de bases. Uma vez mais, sua suspeita estava correta; você isola muitos mutantes
de Fuz1 de crescimento lento. Você inicia a caracterização destas variantes mutantes, e agora
você está desapontado. Estas mutações não lhe darão muita compreensão da função
bioquímica da proteína de Fuz1, porque quase todos eles (pelo menos 90%) estão
completamente defeituosos na expressão da proteína. Ao ver estes resultados, você se critica
por usar um desenho experimental pobre. Por que tantas variantes mutantes estão
completamente defeituosas na expressão da proteína Fuz1?
O íntron no gene de Fuz1 é dez vezes mais longo que o exons. Se você fizesse uma
mutagênese randômica, a maioria das mutações que você geraria cairia dentro da região
não codificante do íntron e não seriam particularmente informativas sobre a função da
proteína de Fuz1. As mutações no íntron romperiam as estruturas secundárias
complexas que são necessárias para formar o centro catalítico do íntron e como
resultado o gene não poderia sofrer o self-splicing. Sem o splicing apropriado, um
produto funcional do gene Fuz1 não seria feito.
6d) Em uma tentativa para salvar alguns dados úteis da mecânica dos mutantes que você
isolou na parte C, você decide fazer uma análise de supressão com as variantes de fungo
mutantes de crescimento lento. Desta vez você induz mutação cada uma das variantes de
crescimento lento, e seleciona para mutantes que restabelecem o fenótipo de crescimento
rápido. Que tipo de informação você esperaria que esta experiência revelaria sobre expressão
de Fuz1?
Explique como você analisaria as variantes mutantes para obter a informação desejada.
Se sua hipótese estiver correta, as mutações de supressão que você isolou
deveriam restabelecer a estrutura secundária do íntron de grupo I. Como discutido em
classe, você esperaria ver mutações compensatórias. Por exemplo, se sua mutação
original fosse uma troca de T por C, então supressor desta mutação estaria por perto, e
seria uma troca A por G que restabeleceria o pareamento de bases apropriado entre
estes resíduos e restabeleceria a estrutura secundária apropriada. Este tipo de análise
mutacional lhe permitiriam definir a estrutura secundária do íntron, como também
identificar essas estruturas secundárias, que são cruciais para a formação do centro
catalítico do íntron.
Questão 7) Você está estudando o fungo patogênico C. albicans, e quando você sequencia um
de seus genes mitocondriais você acha que tem um novo íntron. A análise de sua sequência
sugere que possa ser relacionado a íntrons self-splicing do grupo II. Seu primeiro passo para
estudar a estrutura do íntron é a induzir a mutações nele.
7a) Você identifica uma série de mutantes que já não mais podem sofrer o splicing. Abaixo é
mostrada a sequência da região do íntron (NÃO o íntron inteiro) contendo estas mutações.
Qual é uma possível explicação para a falha no splicing nestas variantes mutantes?
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Respostas do Conjunto de Problemas #3
As mutações nas variantes mutantes podem romper os elementos da estrutura
secundária necessária para o dobramento apropriado do íntron em uma estrutura
catalítica ativa. A inspeção do sequência acima revela várias estruturas em loops de
haste potenciais, nas quais as mutações estão situadas.
7b) Você decide avançar a análise destes íntron mutantes tratando fragmentos que contêm
esta região com um conjunto de nucleases de RNA. Você usa um fragmento de RNA que
corresponde a sequência do íntron mostrada acima, marcado no seu terminal 5', como
substrato. Você visualiza os produtos digeridos através de auto-radiografia. O menor pedaço
que você pode distinguir no gel é 5 bases de comprimento, baseado no padrões de controle de
tamanho.
Você acha que os Mutantes B e C geram padrões semelhantes ao Mutante A, enquanto
Mutantes E e F geram padrões semelhantes ao Mutante D. Destes dados, esquematize o
seguinte:
i. A estrutura secundária do íntron de tipo selvagem.
ii. A estrutura secundária dos íntrons mutantes semelhantes ao Mutante A.
iii. A estrutura secundária dos íntrons mutantes semelhantes ao Mutante D.
Indique em cada regiões do desenho I-VIII. Também indique na estrutura de tipo selvagem,
onde as mutações individuais A-F, estão delineadas.
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7c) Você decide gerar novas mutações que suprimem os fenótipos mutantes e restabelecem
splicing normal. Você isola dois supressores diferentes, identificados como Sup1 e Sup2. O
Sup1, especificamente, apenas Mut A, e o Sup2, especificamente, suprime apenas Mut E.
Cada supressor se concentra em arrumar um local dentro do íntron, mas nenhum é revertedor.
Por que estas mutações de supressão são tão específicas? Você pode adivinhar o que as
mutações específicas poderiam ser, e onde eles poderiam ser localizados?
As mutações de supressão são específicas porque elas são mudanças de base
individuais complementares para as mutações originais e restabelecem pareamento
bases tipo “Watson-Crick” entre as duas bases na questão. Isto permite a reforma da
estrutura secundária original, embora com uma sequência diferente. Isto é conhecido
como “co-variação”.
A Mut. A tem um U em vez de um G na segunda posição na região VIII (na primeira
estrutura de haste). A Sup1 tem que ter então um A no lugar de um C na penúltima
posição na região VI.
Mut E muda um C para A na segunda posição da região II (na segunda haste). A Sup2 é
então, provavelmente, uma mudança de um G para um U na penúltima posição em região
IV.
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7d) Se você repetisse as experiências de proteção de nuclease com nuclease de S1 e veneno
de cobra mostrados acima usando fragmentos de íntron, marcados semelhantemente, das
duas variantes suprimidas (uma das quais carrega as mutações o Sup1 e Mut A, enquanto a
outra carrega as mutações Sup2 e Mut E), Quais seriam os padrões de digestão que você
esperaria? Explique seu raciocínio.
É provável que as duas variantes suprimidas contenham íntrons que geram padrões de
digestão, com S1 e nucleases de veneno de cobra, que são idênticos aos padrões de
digestão de tipo selvagem, desde que a atividade de splicing do íntron de tipo selvagem
também seja restabelecida.
Questão 8) Você está interessado em estudar o desenvolvimento de olho em camundongos e
seu laboratório descobriu , recentemente, um gene, BLG1, que causa o desenvolvimento de
camundongos olhos anormalmente grandes. Você tem uma suspeita que BLG1 poderia estar
envolvido na proliferação de tecido em outros processos de desenvolvimento, assim você
decide purificar BLG1 de uma variedade de diferentes tecidos de camundongos em
desenvolvimento. Você separa estas proteínas em um gel de poliacrilamida e SDS e então faz
um Western blot com um anticorpo primário para BLG1. Você usa um anticorpo secundário
radioativo (isto reconhecerá o anticorpo primário) e expõe seu gel ao filme. Você vê os
seguintes resultados no filme:
Olho
fígado cérebro
pulmão
músculo
8a) Em que tecidos BLG1 mais provavelmente está desempenhando um papel importante no
desenvolvimento? Por que?
BLG1 parece ser regulada para cima no olho, cérebro e tecidos de músculo
sugerindo que a proteína de BLG1 pode ser importante nestes tecidos.
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8b) Dê duas possíveis explicações que poderiam responder pela diferença na mobilidade da
proteína de BLG1 purificada de tecidos de cérebro. (Sugestão: não preocupe com produtos de
degradação.)
MODELO 1:
Você esperaria ver uma banda de BLG1 migrando mais rápida se a proteína fosse
proteoliticamente processada para gerar espécies de proteína menores.
MODELO 2:
O mRNA de BLG1 poderiam sofrer o splicing de modos alternativos em tecidos
diferentes. Em tecidos de cérebro BLG1 pode sofrer o splicing de tal um modo que nem
todos o exons são incluídos no mRNA processado. Isto conduziria a um produto de
proteína menor.
8c) Você decide testar suas hipóteses comparando o cDNA preparado de tecido de cérebro e
tecido de olho. Você recebeu lisados celulares de ambos os tecidos que contêm todo o DNA,
RNA, e proteína estes dois tecidos. Descreva em detalhes como você isolaria o cDNA de BLG1
destes dois lisados.
1) Isole o mRNA do lisados celulares. (Uma possibilidade seria usar uma coluna
afinidade oligo dT i.e. pequenas contas com (TTTT)n presas a elas. Você passaria seu
lisado celular para cima da coluna e os mRNAs adeririam às contas, devido ao
pareamento de bases da cauda de poli-A com o oligo de dT. Você lavaria a coluna e
eluiria então o mRNA.)
2) Anele um primer de oligo de dT ao mRNA para oferecer uma 3'-OH para começar uma
transcrição reversa. Adicione DNTPs e transcritase reversa.
3) Trate o híbrido RNA/DNA com uma base. A base desestabilizará o dúplex RNA/DNA e
degradará o RNA.
4) A transcrição reversa do mRNA original criará um pequeno hairpin estranho que pode
servir como um primer para sintetizar a segunda fita de cDNA. Use a DNA Polimerase I
para fazer um cDNA dupla fita.
5) Trate o cDNA dupla fita com nuclease de SI para digerir o hairpin e criar uma molécula
de cDNA dupla fita.
Questão 9) Você está estudando o mecanismo de splicing de pré-mRNA em um marsupial
raro, achado em uma ilha perto de Austrália. Para iniciar sua análise, você isola um clone de
cDNA de um mRNA abundante. Usando o clone de cDNA você isola a sequência de DNA
genômico que codifica este RNA; você nomeia o gene “kanga1”. Como resultado de comparar
as sequências do cDNA e genômica, você conclui que kanga1 tem 4 exons, cada um com,
aproximadamente, 200 nucleotídeos de comprimento.
9a) Desenhe um esquema da estrutura do gene de kanga1, o cDNA, o pré-mRNA e o mRNA.
Indique cada íntron e exon e Indique cada ácido nucléico nos seus terminais 3 ' e 5 '. Inclua
qualquer elemento importante para mais processamento posterior ou expressão.
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9b) Por comparação de sequências com genes de eucariotas, você acha bons alinhamentos
para os consensos 5 ' e 3 ' de sítios de splice. Porém, você não pode imediatamente achar um
consenso de branch site (sítio de ramificação). Pela inspeção das sequências mostrada s
abaixo, faça um círculo na sequência que mais provavelmente será usada como o branch site
para o splicing de um cada do íntrons. Baseado nestes dados, anote um consenso de branch
site para este marsupial. As sequências de íntron estão em tipo normal, os sítios de splice 3 '
estão em negrito e as sequências de exon são sublinhadas. Onde há "..." a sequência continua.
(Sugestão: sítio de consensos tem o mesmo comprimento e separação dos sítios de splice 3 '
como na sequência de levedura e o nucleotídeo que participa quimicamente na formação da
ramificação (branch) é o mesmo em marsupiais e mamíferos.)
Sequência consenso do branch site: GAGGUAGU
9c) Para entender o mecanismo de splicing neste marsupial, você montado uma reação
splicing in vitro. Primeiro você tenta usar purificou fatores de splicing de células mamífero. Você
acha que o pré-mRNA de kanga1 não é spliced por estes fatores. Então, você adiciona
componentes de um extrato nuclear feito de células marsupial e acha que a atividade de
splicing é restabelecida. Você fraciona este extrato para identificar qual componente(s) precisa
ser fornecido pelo extrato de marsupial. Baseado em seu conhecimento do mecanismo de
splice em mamífero, e a sequência de pré-mRNA de kanga1, julgue cada uma das seguintes
combinações de fatores como: improvável, possível ou muito provável sustentar o splicing
no pré-mRNA de kanga1. Os snRNPs são chamados simplesmente U1, U2 etc. na tabela
seguinte. Assuma que nenhum fator de adicional é requerido pelo splicing nesta experiência.
Justifique suas respostas, brevemente.
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Respostas do Conjunto de Problemas #3
U2 pareia com o ponto de ramificação e os consensos de branch site marsupiais são
diferentes do mamífero. U2 e U6 interagem para formar o centro catalítico, é melhor se
eles forem do mesmo organismo. Na parte (b) está determinado que o marsupial tem
sítios de splice 5 ' e 3 ' que se alinham com os consensos mamífero, de forma que é
provável que o U1 de mamífero e U2AF funcionem.
9d) Qual dos duas combinações de fatores na tabela da parte (c) você esperaria ser provável
promover o splicing de pré-mRNAs de mamífero? Anote o número das combinações da tabela
e, brevemente, justifique cada resposta.
1 – O U2 de mamífero deveria se ligar ao branch site do pré-mRNA de mamífero.
3 - Das opções restantes esta preserva a interação de U2-U6 das mesmas espécies. O U2
de mamífero não pode reconhecer o branch site de marsupial uma vez que esta
sequência difere substancialmente dos consensos mamífero.
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