Diagnóstico viral
Detecção direta
1. Detecção antígenos.
imunofluorescência, ELISA etc.
2. Microscopía eletrônica
morfologia de partículas viruais.
Microscopía eletrónica
3. Microscopía de luz
Apariênica histológica. Corpos de
inclusâo.
4. Detecção do genoma viral. Hibridização com sondas
específicas. PCR (polymerase
chain reaction)
Detecção Indireta
1. Cultura de células Efeito citopático (CPE)
hema-absorção, imunofluorescência
2. Ovos
pocks on CAM
hemaaglutinação
corpos de inclusão
3. Animais
Doença o morte
Isolamento de vírus
Para o isolamento de vírus geralmente são usadas culturas de
células. Existem três tipos de cultura de células:
1. Cultura primária – Rim de macaco
2. Cultura semi-contínua. Fibroblastos embriõnicos humanos de pele
ou rim.
3. Cultura contínua - HeLa, Vero, Hep2, LLC-MK2, MDCK
As culturas primárias são conhecidas como os melhores sistemas ja que é
possível crescer o maior número de tipos de vírus. São caras e são de
difícil obtenção. As culturas contínuas são mais baratas, mais fáceis de
obter mas o tipo de vírus que podem crescer é limitado.
Cultura de células
O crescimento de vírus pode ocassionar:
1. Efeito citopático (CPE) – Deformação de células,
formação de sincício, pode ser específico e não
específico.
2. Haemadsorção – As células devem ter a habilidade
para grudar em eritrõcitos de mamíferos.
A confirmação da identidade do vírus pode ser feita com
neutralização, inibição de heamadsorção, ou testes de
imunofluorescência..
Efeito citopático (1)
Cytopathic effect of enterovirus 71 and HSV in cell culture: note the ballooning of cells .
(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital, Linda Stannard, University of Cape Town)
Efeito citopático (2)
Formação de sincicio em cultura
de célula causado por RSV (top), e
virus da caxumba (bottom).
(courtesy of Linda Stannard, University of Cape
Town, S.A.)
Monocamada não infectada
Vírus do sarampo
sincício
Vírus herpes simplex –1
sincício
Vírus da raiva – corpos de Negri
não-infectadas
infectadas
com vírus vaccinia
24 horas
HEMADSORÇÃO
Mecanismo utilizado em exames laboratoriais, onde ocorre
agregação de eritrócitos à superfície de células animais, em meio de
cultura, após infecção por vírus
.
Syncytial formation caused by mumps virus and haemadsorption
of erythrocytes onto the surface of the cell sheet.
(courtesy of Linda Stannard, University of Cape Town, S.A.)
Problemas com cultura de células





Periodo longo (até 4 semanas) requerido para resultado.
Muitas vezes a sensibilidade muito baixa, a sensibilidade depende em
grande medida, da condição do espécime
Suscetíveis
à
contaminação
bacteriana.
Sensíveis a substâncias tóxicas que podem estar presentes na
amostra.
Muitos vírus não crescem em cultura de células por exemplo, A
hepatite B, vírus diarreicas, parvovirose, papilomavírus. .
Virus Isolados por cultura de
células
Viruses readily isolated by cell culture
Less frequently isolated viruses
Herpes Simplex
Varicella-Zoster
Cytomegalovirus
Measles
Adenoviruses
Rubella
Polioviruses
Rhinoviruses
Coxsackie B viruses
Coxsackie A viruses
Echoviruses
Influenza
Parainfluenza
Mumps
Respiratory Syncytial Virus
citomegalovírus


O (CMV) é um importante patógeno em
neonatos e pacientes imunocomprometidos,
causando efeitos graves
morbidade e mortalidade. Pneumonite por
CMV é a causa infecciosa mais
comum de morte em pacientes com
transplante de medula óssea. Mulheres
mononucleose passa pro feto..
Técnicas de cultura rápidas são necessárias
para o diagnóstico
Técnicas de cultura rápidas.
técnica de cultura rápida está disponíveis através da
qual antígenos virais são detectados 2 a 4 dias após a
inoculação. O DEAFF (detection of early antigen fluorescent
foci ) para testar CMV é o melhor exemplo, segundo o
qual a monocamada de células é cultivada em lamina
de vidro que se coloca dentro de uma garrafa plástica.

Após a inoculação de vírus, em seguida, a garrafa é
centrifugada a uma velocidade baixa por uma hora
(para acelerar a adsorção dos vírus) e, em seguida,
incubadas por 2-4 dias.
A lamínula é então retirado e examinada para a
presença de antígenos virais por imunofluorescência
DEAFF test for CMV
(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital)
Cultura em ovos
Métodos

Ovos embrionados
Pocks do vírus da varíola
Pocks do vírus cowpox
Pocks do vírus vaccinia
Produção de vacinas
http://www.cbsnews.com/video/
watch/?id=5450993n
Microscopía eletrônica
São necessárias 106 partículas virais por ml para visualização. è usada uma
magnificação de 50,000 - 60,000. Podem ser detectados virus das sigs.
Amostras:
Fecais
Rotavirus, Adenovirus
Norwalk like viruses
Astrovirus, Calicivirus
Fluidos vesículares
HSV
VZV
Raspagem cutánea
papillomavirus, orf
molluscum contagiosum
Electronmicrographs
Adenovirus
Rotavirus
(courtesy of Linda Stannard, University of Cape Town, S.A.)
Poxvírus
Métodos

Microscopia eletrônica de transmissão:
- contrastação negativa ou corte de células infectadas.
Poxvírus
Adenovírus
Picornavírus
Filovírus
Rhabdovírus
Retrovírus
Microscopía eletrônica-imune
A sensibilidade e especificidade da microscopia eletrônica
pode ser melhorada através de microscopia eletrônica
imune. Existem duas variantes: -
microscopia eletrônica Imune (IEM) clássica - a amostra
é tratada com anti-soros específicos antes de serem
colocados à EM. As partículas virais presentes serão
aglutinadas e, portanto, ligam-se ao anticorpo.
microscopia eletrônica imune fase sólida (SPIEM) - a
grade é revestida com anti-soros específicos. Partículas
de vírus presentes na amostra será absorvida na rede
pelo anticorpo.
Immunofluorescense
Positive immunofluorescence test for
rabies virus antigen. (Source: CDC)
(Virology Laboratory, Yale-New
Haven Hospital)
CMV pp65 antigenaemia test
(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital)
Problemas com Microscopía
eletrônica

equipamentos caros
Manutenção cara
Exige observador experiente
Sensibilidade frequentemente baixa
Serologia
Detecção do aumento no título de anticorpos entre a fase
aguda e convalescente da infecção, ou detecção de IgM na
infecção primária.
Classical Techniques
Newer Techniques
1.
2.
3.
4.
5.
1.
2.
3.
4.
5.
Complement fixation tests (CFT)
Haemagglutination inhibition tests
Immunofluorescence techniques (IF)
Neutralization tests
Counter-immunoelectrophoresis
Radioimmunoassay (RIA)
Enzyme linked immunosorbent assay (EIA)
Particle agglutination
Western Blot (WB)
RIBA, Line immunoassay
Perfil Sorológico Típico após a
infecção aguda
Notar que na reinfecção IgM pode estar ausente ou presente em
níveis baixos transientemente.
Serology
Criterios para diagnóstico da infecção primária
Aumento de 4 vezes ou mais no título de IgG ou
anticorpos totais entre soros agudos e convalescentes
Presença de IgM
Soroconversão
Um título elevado de anticorpos IgG (anticorpos ou total)
- não muito confiável
Critérios para o diagnóstico de reinfecção
aumento vezes ou mais no título de IgG ou anticorpos
totais entre soros agudos e convalescentes
Ausência ou ligeiro aumento de IgM
Complement Fixation Test
Complement Fixation Test in Microtiter Plate. Rows 1 and 2 exhibit complement
fixation obtained with acute and convalescent phase serum specimens,
respectively. (2-fold serum dilutions were used) The observed 4-fold increase is
significant and indicates recent infection.
ELVIS (Enzyme Linked Viral Induced System)
Elvis cells infected with HSV-1
PRNT (plaque reduction
neutralization test),

neutralização do vírus mediada por
anticorpos é definida como a
interação do vírus com
anticorpos, resultando em
inativação do vírus de tal forma
que já não é capaz de infectar e
replicar em culturas de células ou
animais
Resultado do PRNT
há ou não presença de anticorpos neutralizantes no soro-teste
indivíduo já foi vacinado ou já teve contato com o vírus
Métodos
Testes sorológicos:
PRNT (plaque reduction neutralization test), Cada vírus que inicia uma infecção

produtiva produz uma área localizada de infecção ( chamada placa)
que pode ser detectada em uma variedade de maneiras. As placas são contadas
comparadas e se determina a percentagem de redução pelo soro na
infectividade do vírus total. (utilizado por ex. Efeito da vacina da dengue)
PRNT
ELISA
ELISA
Variação: uso de
anti-IgM
ELISA for HIV antibody
Microplate ELISA for HIV antibody: coloured wells indicate reactivity
WESTERN BLOT
Western Blot
HIV-1 Western Blot





Lane1: Positive Control
Lane 2: Negative Control
Sample A: Negative
Sample B: Indeterminate
Sample C: Positive
Utilidade dos resultados
serológicos




Quão útil é um resultado sorológico depende do vírus individual.
Por exemplo, a existência de vírus, tais como rubéola e hepatite A,
o aparecimento dos sintomas coincide com o desenvolvimento de
anticorpos. A detecção de anticorpos IgM ou títulos crescentes de
IgG
no
soro
do
paciente
indica
doença
ativa.
No entanto, muitos vírus muitas vezes produzem doença clínica
antes do aparecimento de anticorpos, como os vírus respiratórios e
diarreicas. Portanto, neste caso, qualquer diagnóstico sorológico
seria
retrospectiva
e, portanto, não será
tão
útil.
Existem também os vírus que produzem a doença clínica meses ou
anos após a soroconversão por exemplo, HIV e anti-rábica. No
caso desses vírus, a simples presença do anticorpo é suficiente
para fazer um diagnóstico definitivo.
Specimens for Routine Tests
Clinical Category
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Meningitis
Encephalitis
Paralytic disease
Respiratory illness
Hepatitis
Gastroenteritis
Congenital diseases
Skin lesions
9. Eye lesions
10.Myocarditis
11.Myositis
12.Glandular fever
13.Post Mortem
Blood
+
+
+
+
+
Throat
swab
+
+
+
+
Faeces
CSF
+
+
+
+
+
+
Other
Brain biopsy
Nasopharyngeal aspirate
+
+
+
+
+
+
+
+
Urine, saliva
Lesion sample e.g. vesicle
fluid, skin scrapping
Eye swab
Pericardial fluid
+
Autopsy
After use, swabs should be broken into a small bottle containing 2 ml of virus transport medium.
Swabs should be sent to the laboratory as soon as possible without freezing. Faeces, CSF, biopsy or
autopsy specimens should be put into a dry sterile container.
Métodos moleculares



Métodos baseados na detecção do genoma viral também são
comumente conhecidos como métodos moleculares.
Costuma-se dizer que os métodos moleculares é a direção do
futuro
do
diagnóstico
viral.
No entanto, na prática, embora o uso desses métodos tende a
aumentar, o papel desempenhado por métodos moleculares, em
um laboratório de rotina diagnóstica do vírus ainda é pequeno
se
comparado
aos
métodos
convencionais.
É certo porém que o papel dos métodos moleculares vai
aumentar rapidamente no futuro próximo.
Técnicas moleculares clássicas

Dot-blot, Southern blot, hydridization in-situ são
exemplos de técnicas clássicas. Eles dependem da
utilização de sondas específicas de DNA / RNA por
hibridação.
A especificidade da reação depende das condições
utilizadas para a hibridação. Entretanto, a sensibilidade
dessas técnicas não é melhor do que as convencionais
métodos
de
diagnóstico
viral.
No entanto, uma vez que são geralmente mais
tediosos e caros do que as técnicas convencionais, eles
nunca tiveram uma aceitação generalizada.
Polymerase Chain Reaction (1)

A técnica de PCR permite a amplificação in vitro de seqüências específicas de
DNA alvo por um fator de 106 e é, portanto, uma técnica extremamente sensível.

É baseado em uma reação enzimática que envolve o uso de oligonucleotídeos
sintéticos de acompanhamento da seqüência alvo nucleico de interesse.


Estes oligonucleotídeos atuam como iniciadores para a Taq polimerase
termoestável. Ciclos repetidos (geralmente 25 a 40) de desnaturação do DNA
molde (em 94oC), anelamento dos primers a suas seqüências complementares
(50oC) e extensão de primer (72oC) resultam na produção exponencial do
fragmento-alvo específicos.
Mais sensibilidade e especificidade podem ser obtidas pelo nested PCR.
Detecção e identificação do produto da PCR é geralmente realizada por
eletroforese em gel de agarose, a hibridação com uma sonda de
oligonucleotídeos, análise de enzimas de restrição, ou seqüenciamento de DNA.
Polymerase Chain Reaction (2)

Vantagens do PCR:

Sensibilidade extremamente elevadas, podem detectar até um genoma viral por volume de
amostra

Fácil de configurar

tempo de resposta rápido

Desvantagens da PCR

Extremamente susceptíveis à contaminação

Alto grau de habilidade do operador exigida

Não é fácil de configurar uma análise quantitativa.

Um resultado positivo pode ser difícil de interpretar, sobretudo com vírus latentes como o
CMV, onde qualquer pessoa soropositiva terá vírus presente no sangue,
independentemente de terem a doença ou não.

Esses problemas estão sendo tratados com a chegada de sistemas comerciais fechados, tais
como o Cobas Amplicor Roche, que exige o mínimo de manipulação. O uso de fibras
sintéticas alvos internos competitivos nestes ensaios comercial facilitou a quantificação
precisa dos resultados. No entanto, estes ensaios são muito caros.
Schematic of PCR
Each cycle doubles the copy number of the target