CURSO PRÉ – CONGRESSO: Citometria de fluxo
DOENÇAS LINFOPROLIFERATIVAS
CRÔNICAS
Dr. João Carlos de Campos Guerra
Departamento de Patologia Clínica - HIAE
Centro de Hematologia de São Paulo - CHSP
CLASSIFICAÇÃO “REAL”/ WHO (98)
Revised European Classification of Lymphomas
and World Health Organization
ENTIDADES (LEUCEMIA / LINFOMA)
BASEADAS EM DADOS:

 CLÍNICOS
 MORFOLÓGICOS

SP, MO, BMO, Biópsia de outros tecidos
 IMUNOLÓGICOS

Imunofenotipagem por citometria de fluxo

Imunocitoquímica / Imunohistoquímica
 CITOGENÉTICOS (FISH ) e MOLECULARES (PCR)
 Anormalidades genéticas com valor prognóstico
NEOPLASIAS DE CÉLULA B
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
PRECURSORAS:
Leuc. / Linf. Linfoblástico de Célula B Precursora
PERIFÉRICAS:
LLC cel-B / Linf. de Pequenos Linfócitos
Leucemia Pró - Linfocítica de Célula B
Linfoma linfoplasmocitóide / Imunocitoma
Linfoma de células do manto
Linfoma de centro folicular / folicular
Linf. B da Z. M. / esplênico / extranodal (tipo MALT) / nodal
Tricoleucemia ; Plasmocitoma ; Mieloma Múltiplo
Linfoma de Grandes Células B Difuso
Subtipos: Mediastinal (tímico) e Intravascular
Linfoma de Burkitt
NEOPLASIAS DE CÉLULA T e NK


T PRECURSORAS :
Leucemia / Linfoma Linfoblástico T precursora
T e NK PERIFÉRICAS:













LLC de célula T e Leucemia Pró -Linfocítica
Leucemia de Linfócitos Grandes Granulares
Leucemia Tipo célula T e Tipo célula NK
Micose Fungóide e Síndrome de Sézary
Linfoma de Célula T periférica Não Especificado
Doenças Linfoprolif. Cutâneas Prim. Cell T CD30+
Linfoma de Célula T γ/δ Hepatoesplênico
Linfoma de Célula T Tipo Paniculite Subcutânea
Linfoma de Célula T Angioimunoblástico
Linfoma de Célula T Intest.(assoc.ou não a enteropatia)
Leucemia/ Linfoma de Células T do Adulto, HTLV1+
Linf.Grandes Células Anaplásico, CD 30+, Tipos T e Nula
Linfoma de Grandes Células Anaplásico, Tipo Hodgkin (REAL: provisório)
Geração e maturação de células B
Pró-B
Pré-B
B
Imatura
Célula
do plasma
B Naïve
IgM
Centroblasto Centrócito
IgM
Memória
B
IgD
DH-JH
VH-DHJH
VL-JL
Medula óssea
Adpatado de Félix Reyes durante o EHA 2003 em Lyon, França, 12-15 de Junho
Mutações somáticas
Linfonodo
Mudança
Maturação das células B normais e
expressão do CD20
Célula
tronco
Célula
pré-pré B
TDT
Célula
pré-B
Célula
pré-B
Célula B
imatura
Célula
pré-B
Célula
B madura
Célula
B ativada
Plasmócito
CD 19
CD 20 CD 22
CD 38
CD 21
Expressão antigênica na
linhagem de células-B doentes
LLA
LLC, LLPC
Burkitt, LF, LDGC, TL
Célula
tronco
Pré-B
MW
MM
B precoce B Intermediária B- Madura B Plasmacitóide Plasmócito
±CD5
CD19
CD20
CD22
CD52
?
?
?
Doenças Linfoproliferativas crônicas
CITOMETRIA DE FLUXO
• Determinação da linhagem das células
malignas
• Detecção de clonalidade
• Análise da maturação celular e
heterogeneidade dentro das populações
celulares malignas
• Avaliação da expressão antigênica
LEUCEMIA LINFÓIDE CRÔNICA
LLC-B é a mais comum leucemia nos EUA.
Incidência : 27 casos por 100.000 hab./ano – 40% leucemia > 65 anos
Ásia e Japão a incidência é mais baixa, sendo inexplicável essa observação. É
de 20-30x mais comum na Europa, Austrália e Norte América
Os pacientes com LLC comumente tem mais de 50 anos,
com idade média de 65 anos. Rara <30 anos. 20-30% ~ 55 anos
Incidência homem/mulher de 2:1,
No estadiamento de Raí :
Bom prognóstico: score 0, Intermediário :I e II e
Pobre prognóstico :III e IV.
CARACTERÍSTICAS LABORATORIAIS NO
DIAGNÓSTICO DA LLC-B
 Linfocitose periférica > 5.000/mm3
 Linfocitose >30% na medula óssea
 Imunoglobulina de superfície monoclonal de intensidade baixa
comumente IgM e Kappa (62%), Lambda (2%), CD19 (70%),
CD20 (71%), HLA-DR (70%). CD19 ou CD20 / CD5 e CD23 (+).
Marcadores T: CD3 (24%), CD5 (93%), CD7(28%).
Marcador de monócitos: CD14(5%).
 Resultados negativos para CD10 (Linfoma Folicular)
FMC-7 (LPL), CD25/CD103 (Hairy cell) antígenos de célula T,
outros que não CD5 (neoplasia de célula T), CD79B e CD22
 Rearranjo gênico de imunoglobulina (+)
 Estudo citogenético: usualmente normal; trissomia do 12 é
relativamente específica.
Figura 1: LLC-B (Linfócitos maduros, Sombras celulares de Gun Precht e Prolinfócito)
LEUCEMIA LINFÓIDE CRÔNICA-SP
LEUCEMIA LINFÓIDE CRÔNICA
Figura 3: Histogramas característicos da LLC-B: Células linfóides B com
restrição de cadeia kappa (baixa expressão) e expressão antigênica de
CD5+ e CD20+ (baixa expressão).
76,9% de células CD19 (+)
CD19/Kappa +
Kappa de B.Ex
CD19/CD5 +
Sistema de Escore para
diagnóstico da LLC
Marcados
1 ponto
0 ponto
SmgI
fraca
forte
CD5
positivo
negativo
CD23
positivo
negativo
FMC7
negativo
positivo
CD22 ou CD79b
fraco
forte
Escores em LLC são geralmente >3, nas outras doenças células B são geralmente <3.
Fatores prognósticos em LLC
Fator
Baixo risco
Alto risco
Gênero
F
M
Estágio clínico
Binet A/Rai 0-1
Binet B/C Rai II/III/IV
morfologia
típico
atípico
BMO
Não-difusa
difusa
Tempo de duplicação
linfócito
> 12 meses
< 12 meses
Marcadores séricos
normais
aumentados
Expressão CD38
<20-30%
> 20-30%
citogenética
Ausente/del13q
Del 11q23
perda/mutação p53
trissomia do 12 e
alteração 14q
IgVH mutação
mutado
Não mutado
Figura : LLC com anormalidade citogenética: Trissomia do 12 por cariótipo
convencional e hibridização in situ por fluorescência (FISH).
Figura 2: A Síndrome de Richter (5-10%) é a transformação da LLC em um
Linfoma difuso de grandes células.
Histologia da medula óssea
Infiltrado intersticial e nodular de células linfóides maduras, intermediadas
por células hematopoéticas normais. No caso de infiltração difusa maciça
associa-se o quadro com um pior prognóstico.
A infiltração paratrabecular não é normalmente observada na LLC.
LEUCEMIA PRÓLINFOCÍTICA
LPL pode ser “de novo” ou secundária a LLC.
A definição de LPL:
> 55% de prólinfocitos no S.P.
LLC/LPL : 10% a 55%
LLC < 10%
A freqüência de LPL é de 10% em relação as LLCs.
Média de idade: 70 anos
Presença de esplenomegalia volumosa, raramente hepatomegalia e adenomegalia.
Na LPL-T a linfoadenomegalia é vista em 50% dos casos e
hepatomegalia em 40%, infiltração de pele em 27% dos pacientes. A meningite
leucêmica tem sido relatada, com tratamento intratecal eficaz.
É comum a doença em estágio avançado (Raí IV ou Binet C).
A média de sobrevida da LPL é de 2 a 3 anos, comparado com 8
anos de LLC. Curso clínico variável. Anemia e trombocitopenia
Relacionado com sobrevida curta.
Pacientes com LPL-T apresentam média de sobrevida de
7 a 7,5 meses, e raramente sobrevivem por 2 anos.
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA LEUCEMIA PRÓLINFOCÍTICA
1. Leucometria > 100.000/mm3
2. Prólinfócitos >55% no sangue periférico
3. Em Citometria de Fluxo linfócitos grandes com
fluorescência intensa
4. Ig de superfície monoclonal, mais comum IgM - kappa
5. LPL-B: Positivo: CD19,CD20,CD22,FMC-7,HLA-DR e
Negativo: TdT,CD10,CD5 (2/3)
6. LPL-T: TdT-,CD2+,CD3+,CD5+,CD7+,CD4+/CD8- (55-64%)
CD4+/CD8+ (21-30%), CD4-/CD8+ (10-13%)
7. Rearranjo gênico de imunoglobulina na LPL-B
8. Rearranjo gênico de receptor de célula T na LPL-T
9. Anormalidades citogenéticas: 14q+ para LPL-B,
inv(14)(q11q32), t(14;14)(q11;q32) e trissomia 8q para LPL-T.
25% do pct – t(11;14)(q13;q32) – Linfoma do manto- evolução leucêmica
nestes pacientes?
Figura 6: LPL: O nucléolo único e proeminente é
característico do prólinfocito.
COMPARAÇÃO ENTRE LLC, LLC/LPL, LPL
LLC
LLC/LPL
LPL
Leucócitos (x109)
10-120
intermediário
>100
Pro linfócitos (%)
<10
10-55
>55
Infiltração esplênica
infreq.
intermediário
presente
Adenomegalias
freq
intermediário
raro
Ig de superfície
fraca
bifásica
intensa
CD 5 (+)
pres.
bifásica
<30%
FMC-7 (+)
<20%
<20%
presente
Anorm.Citogenéticas
trissomia 12
trissomia 12
14q+
LEUCEMIA LINFOCÍTICA CRONICA DE LINHAGEM T
LLC-T é rara, sendo 1% a 2% das LLC.
A Leucemia de células T é um grupo heterogêneo de doenças:
- Leucemia/Linfoma da célula T do Adulto (LLTA)
- Doença de Linfócitos Grandes Granulares (LGLD)
ou também chamada de Doença Linfoproliferativa T- Gamma
- Leucemia Prólinfocítica de célula T (LPL-T)
O grupo britânico acredita que a LLC-T é uma variante da LPL-T pela
similaridade clínica, genética e pela microscopia eletrônica (nucléolo).
O grupo da Clínica Mayo classifica junto com a LLC-B pela morfologia.
Na classificação Americana/Européia de Linfoma está em estudo
e na Organização Mundial da Saúde (WHO) foi excluída, como entidade
separada.
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE LLC-T
Linfocitose > 5.000/mm3
Células leucêmicas: predomínio de linfócitos maduros
Linfocitose de medula óssea > 30%
Expressão de um ou mais antígenos T: CD2, CD3, CD5, CD7
Fenótipo mais freqüente : CD4(+)
Rearranjo gênico: TCR
Citogenética: t(14:14)(q11;q32), inv (14;14)(q11;32)
TdT e CD1 : negativos
Figura 5: LLC-T / LPL-T: Linfócitos pequenos com alta relação N/C, núcleo
redondo, nucléolo pequeno ou ausente. Ausência de grânulos no citoplasma.
LEUCEMIA DE CÉLULAS CABELUDAS - (HAIRY CELL LEUKEMIA)
A incidência de HCL é de 2% do total das leucemias
Seu diagnóstico é essencial pela possibilidadae de cura
Linfocitose de longo tempo, hepatoesplenomegalia e três punções
secas.
Anemia 85%, trombocitopenia 60 - 80% e leucopenia 60%
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE HAIRY CELL LEUKEMIA
1. Células leucêmicas com projeções citoplasmáticas finas
2. Pancitopenia com monocitopenia
3. TRAP positivo
4. Imunofenótipo Positivo para: CD11c, CD22, CD25,
FMC-7 e CD103
1. Imunohistoquimica: DBA-44 (+)
2. Imunoglobulina de superfície monoclonal
3. Características histológicas: Medula óssea com aspecto de
“ovo frito”, “favo de mel”
Formação de pseudosinus em baço
Lesão angiomatosa em fígado
8. Microscopia Eletrônica : Projeções citoplasmáticas finas e
complexo ribossomo-lamela
9. Rearranjo gênico de imunoglobulina
Leucemia das Células Cabeludas / Tricoleucemia: Células de hairy cell
com as delicadas projeções citoplasmáticas em toda superfície celular.
Análise da Hairy cell Leukemia por Citometria de Fluxo
Histograma Volume x Granularidade
Histograma CD19 x Granularidade
Hairy cell
Hairy cell
Linfocitos B
Linfocitos B
SISTEMA DE ESCORE PARA LLC
Doença
CD5
CD23
CD79b
Diferente do anterior em relação
Ao CD22(-) / CD79b = 1 ponto
FMC7
sIg
escores
LLC (escore)
+ (1)
+ (1)
-/w (1)
-/w (1)
W (1)
4-5
LPL-B
+/-
-
+
+
+
0-1
HCL
-
-/+
+
+/-
+
0-1
LCM
+
+/-
+
+
+
1-2
LF
-
-/+
+
+
+
0-1
LEZM
-
-/+
+
+
+
0-1
CD79b - parte do receptor de antígeno da célula B; CD22 pode ser usado
FMC7 - liga-se a um epitopo na conformação do CD20. CD20 de baixa intensidade na LLC, porém
FMC7 é melhor para o sistema de escore
Catovsky D. Hematol Oncol Clin N Am 2004; 18:783-794
LINFOMA E LEUCEMIA DA CÉLULA T DO ADULTO
O HTLV-1 pode ser transmitido sexualmente, transfusão sanguínea
e aleitamento materno. A transmissão requer a transferência das células
infectadas, não se transmitindo o vírus livre.
CARACTERÍSTICAS LABORATORIAIS DO ATCL:
 Presença de anticorpos contra o HTVL - I
 Fenótipo de células T monoclonais
 Positivo para CD2, CD3, CD4, CD5 e CD25
 Negativo para TdT, CD7, CD8 e CD1
 Identificação da presença do genoma pró-viral do HTLV-I por
Southern blotting ou PCR
 Isolamento do vírus HTLV-1
 Hipercalcemia
Linfoma/Leucemia da Célula T do Adulto: Células polilobuladas
(flower cell) com citoplasma fracamente basofílico.
A cromatina nuclear é pouco condensada, raramente nucléolos.
O citoplasma é moderadamente basofílico.
Na forma aguda é comum um grande número de linfócitos atípicos no S.P. e
as células variam de tamanho e forma.
Na forma crônica as células tumorais são uniformes em tamanho,
tendo menor porcentual do que a forma aguda.
LINFOMA NÃO - HODGKIN
 gg linfáticos → adenomegalia
 proliferação clonal T, B, cells retics
 LNH-B são os mais freqüentes
 sintomas B: 20% dos casos
 freqüentemente extranodal
AGENTES ETIOLÓGICOS
Predisposição individual
Imunodeficiência ou estimulação
Radiações ionizantes / subst tóxicas
Infecção viral
Alteração citogenética
Transplante de órgãos
AGENTES INFECCIOSOS
ENVOLVIDOS COM OS LNH
Burkitt ..................EBV e MALÁRIA
L. T/NK nasal......Vírus Epstein-Barr
L. MALT gástrico................H.pylori
L. / Leucemia cel -T....HTLV-I (adulto)
DIAGNÓSTICO CLÍNICO
Adenomegalia superficial ou
Cadeias ganglionares profundas
Hepato e esplenomegalia (freq)
Tumorações em outros órgãos e
tecidos (ossos, pele, glândulas, SNC
(extranodais)
DIAGNÓSTICO CLÍNICO
Fraqueza, febre
Emagrecimento e palidez
Hemorragias não são freqüentes
 tumoral em ossos e nervos 
sintomas neurológicos
Infiltração do tecido cutâneo
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
HEMOGRAMA
Citopenias: I.M.O.
Leucocitose
(LLBDD ~ LLC)
Grandes células
(leucossarcoma)
BIÓPSIA GG
Do maior gânglio
Cervical e axilar
Inguinal só se bem
patológico
MIELOGRAMA
Pode ser normal
Freqüente infiltração
BIÓPSIA M.O.
Células agrupadas (como
nódulos normais)
Infiltração pode ser de
forma difusa no
parênquima medular
IMUNOFENOTIPAGEM
 Citometria de Fluxo: SP,MO,gg
 Clone de células B:
 CD10, CD19, CD20,CD22, CD23
 Clone de células T:
 CD2, CD3, CD5,CD7, CD4, CD8
TRANSLOCAÇÕES CROMOSSÔMICAS
neoplasias de célula B
NEOPLASIA
Burkitt
MALT
Transloc. Gene Envolv.
Conseq.
t(8;14)
c-myc e IgH ativç c-myc
t(11;18)
AP12 e mlt
apoptose
t(1;14)
bcl-10
+ agressiva
FOLICULAR
t(14;18)
IgH e bcl-2
ativç bcl-2
MANTO
t(11;14)
bcl-1 e IgH ativç bcl-1/ciclD1
Gds Cells B Dif. t(3;14)→ bcl-6→ Dça extranod. Melhor prog.
TRANSLOCAÇÕES CROMOSSÔMICAS
neoplasias de célula T
NEOPLASIA
L.linfoblástico
transloc.
t(1;14)
LGC. Anaplásico t(2;5)
Gene Envolv.
tal-1/SCL
e a-TCR
ALK e NPM
Conseq.
transcrição
hematopoiética
formação de
tirosina-quinase
NPM-ALK híbrida
ESTADIAMENTO CLÍNICO
Tratamento, prognóstico, comparação
 Hemograma, DHL, ß2-microglobulina
Sorologias: HTLV I e II, EBV
B.M.O., biópsia ganglionar
Diagnósticos por imagem
Cintilografia com Gálio
ESTADIAMENTO CLÍNICO
DE ANN ARBOR - 1971
I: 1 região nodal (R.N.):(I); ou de 1 órgão ou local
extra-nodal (EN): (IE).
 II: 2 R.N., mesmo lado do diafragma (II) ou envolv.
localizado de 1 órgão ou local E.N. e 1 ou + R.N. do
mesmo lado do diafragma (IIE)
 III: envolv. R.N. em ambos os lados do diafragma (III)
que se podem acompanhar de lesão no baço (IIIS),
de local E.N. (IIIE) ou ambos (IIISE).
 IV: doença disseminada em um ou mais órgãos ou
tecidos E.N., com ou sem ↑ de gg linfáticos.

•
Índice Prognóstico Internacional
A . Pacientes de todas as idades
Risco Relativo
IDADE
< 60 anos x > 60 anos
1.96
DHL
< normal x > normal
1.85
Estado Clínico
0.1 x 2-4
1.80
Estadio (Ann Arbor) I/II x III/IV
1.47
Envolvimento extra-nodal <1sítio x >1 1.48
B. Pacientes com menos de 60 anos
Estadio (Ann Arbor) I/II x III/IV
DHL
< normal x > normal
Estado Clínico
0.1 x 2-4
2.17
1.95
1.81
CLASSIFICAÇÃO DOS LNH
 Baseada na biópsia tecidual
 Características imunológicas
 Características citogenéticas - moleculares
Freqüência dos LNH
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
LGCBD
FOLICULAR
Células B Z. Marginal, MALT
Células T Periféricas
Pequenos Linfócitos B
Célula do Manto
LGCB do mediastino
Linfoblástico de cél T Precurs.
lLinfoplasmocitóide
Burkitt, Micose Fungóide
Outros tipos
30,6%
22,1%
7,6%
7,0%
6,7%
6,0%
2,4%
1,7%
1,2%
< 1%
6,1%
LINFOMA DE GRANDES
CÉLULAS B DIFUSO
LGCB – CÉLULAS NÃO CLIVADAS
LGCBD
LINFOMA DE GRANDES
CÉLULAS B - SP
LINFOMA FOLICULAR, difuso
de pequenas células clivadas
• Adultos com idade superior a 50 anos
• IFT: CD20+,CD10 +/-, CD23+/-, CD43-, CD5-,
ciclina D1• EUA: 40% de todos os linfomas
• > representante dos indolentes: 70%
• Kiel: Centrocícito-Centroblástico
• Padrão de crescimento folicular
• OMS: I e II (peq. e grandes células)
LINFOMA FOLICULAR
A estrutura folicular neoplásica contém células dendríticas.
LINFOMA FOLICULAR
LINFOMA FOLICULAR
LINFOMA FOLICULAR
PEQUENAS CÉLULAS CLIVADAS
LINFOMA FOLICULAR
Prevalência do rearranjo do
gene bcl-2 em LNH
35%
t(14;18)+
85%
t(14;18)+
Linfoma Folicular
Linfoma difuso
de grandes células
Le Beau MM. Semin Oncol. 1990;17:20-29
Longo DL, DeVita VT Jr, et al. Cancer Principies & Practice of Oncology. 1993
Coloração Bcl-2
Negativo
Positivo
LNH FOLICULAR DE PEQUENAS
CÉLULAS CLIVADAS
LNH FOLICULAR DE PEQUENAS
CÉLULAS CLIVADAS
LNH DE PEQUENAS E GRANDES
CÉLULAS B
LINFOMAS MALT :
 Associados às mucosas
 Podem acometer todo o TGI
 Tireóide
 Aparelho respiratório e uro-genital
 De baixo ou alto grau
 Sempre de linfócitos B
 Bom prognóstico (demoram diversos anos
para infiltrar outros órgãos)
Linfoma MALT Ocular
CD 20 +
Linfoma MALT Gástrico
LINFOMA DE PEQUENAS
CÉLULAS DIFUSO
LINFOMA LINFOBLÁSTICO
Núcleo redondo ou oval e cromatina fina e dispersa. Os nucléolos
apresentam-se de 1 à 3 e há pouco citoplasma.
LINFOMA LINFOBLÁSTICO - T
PADRÃO CELULAR CONVOLUTO
LINFOMA DE BURKITT
 LNH-B de alto grau
 Relacionado ao EBV
 Raramente tem início em linfonodos
 Mitoses abundantes / Padrão celular de
“céu estrelado”
 Imuno-histoquímica com anticorpo anti EBV
mostrando moderada imunorreatividade
nuclear
LINFOMA DE BURKITT
Linfoblastos com membrana nuclear proeminente e macrófagos
dando aspecto de “céu estrelado”.
LINFOMA CENTROCÍTICO CENTROBLÁSTICO
 LNH mais freqüente
 LNH-B, de baixo grau
 Acomete preferencialmente idosos
 Padrão folicular e/ou difuso
 Mitoses raras
 Duas populações linfocitárias
LINFOMA CENTROCÍTICO CENTROBLÁSTICO
PEQUENAS E GRANDES CÉLULAS
MICOSE FUNGÓIDE
LNH cutâneo de células T CD4+
LNH de baixo grau (mitoses raras)
Relacionada com o HTLV I e II
Leucemização: 25% (S.de Sézary)
Padrão difuso de infiltração da derme e
epiderme por linfócitos com núcleo
convoluto,cerebriforme
Micose Fungóide / Síndrome de Sézary:
Núcleo cerebriforme com alta relação N/C.
Imunofenótipo
As células de Sézary são positivas para CD2, CD3, CD4 e CD5 e
caracteristicamente negativas para CD7, CD8 , CD1 e TdT.
LINFOMA HISTIOCÍTICO
Células neoplásicas grandes, com núcleos redondos ou ovais com
citoplasma abundante.
Linfoma Imunoblástico
LINFOMAS DE BAIXO GRAU
 Evolução lenta , apesar do tto
 Índice mitótico baixo
 Sem RC, mesmo com tto precoce e
adequado
 Tratamento: prolongamento e
melhoria da qualidade de vida
LINFOMAS DE ALTO GRAU

Evolução rápida sem tratamento (meses)
 Índice mitótico alto
 Bom prognóstico com tto precoce e
adequado
 TTO-alvo: células em proliferação
 RC (“cura”): pode ser alcançada