Avaliação da Síntese de Fibras Elásticas por Transfecção em Culturas
de Células obtidas de Camundongos Deficientes em Fibrilina-1
Thanuci Silva¹ , Guilherme G. Braga¹, Ana Cláudia C. N. Diez¹, Cláudio C. Werneck¹, Gracc P. Keiler¹
Eduardo Galembeck¹
1Departamento
de Bioquímica, Bloco F, Instituto de Biologia – UNICAMP, CEP 13083-970, Campinas-SP, Brasil, fone (19) 3521-6149
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq
Palavras – chave : Fibrilna-1, síndrome de marfan
INTRODUÇÃO
Ao longo da evolução dos organismos pluricelulares a flexibilidade dos tecidos tem sido requisito essencial.
As fibras elásticas, envolvidas na capacidade que os tecidos tem de suportar estresses mecânicos conferindo
resiliência, são estruturas complexas essenciais presentes na matriz extracelular. Permitem que os tecidos sofram
deformações e que após esta, voltem a sua forma original sem que haja gasto de energia (Kielty, et. al, 2002). Estas
propriedades são imprescindíveis em órgãos como as artérias, pulmões, pele e outros tecidos nos quais haja muitos
ciclos de deformação/retração. As fibras elásticas são compostas de elastina a qual se apresenta envolvida por uma
rede de microfibrilas ricas principalmente em Fibrilinas. Mutações no gene da Fibrilina-1, foco deste estudo, estão
associadas com a Síndrome de Marfan, uma doença autossômica dominante. Em humanos, esta síndrome revela
manifestações clínicas principalmente nos pulmões, no sistema cardiovascular e no sistema esquelético. Neste
projeto, propusemos obter células de camundongos C57BL/6 com mutações no gene da fibrilina-1 (ausência dos
exons 19-24), modelo para Síndrome de Marfan, e avaliar a capacidade destas células em formar fibras elásticas
através da expressão de tropoelastina recombinante fusionada com uma etiqueta fluorescente (DsRed), utilizando
sistema dinâmico de captura de imagens (Axio Observer, Carl Zeiss, Alemanha).
RESULTADOS
Considerando a transfecção das culturas primárias e para verificar se o plasmídio a ser usado
estava funcionando, utilizamos células da linhagem RFL6, que são fibroblastos de pulmão de ratos,
que expressam em cultura os componentes das fibras elásticas. A transfecção foi realizada como
descrito anteriormente e a análise da deposição da tropoelastina+DsRed foi realizada e pode ser
visualizada. Diante destes resultados, as células obtidas dos camundongos serão agora
transfectadas e analisadas assim que tivermos a câmara de incubação das células que fica acoplada
ao microscópio consertada. Desta forma poderemos comparar a deposição da tropoelastina+DsRed
nas células que expressam diferentes quantidades de Fibrilina-1.
MATERIAIS E MÉTODOS
Neste trabalho, isolamos fibroblastos de derme a partir de camundongos recém-nascidos com 2-3 dias de idade.
Estes foram obtidos a partir de um cruzamento entre dois camundongos adultos heterozigotos para a mutação
no gene da fibrilina-1, Fbn1 (Fbn1mgΔ/+). A partir deste cruzamento obtivemos os três genótipos celulares que
foram utilizados durante este estudo: selvagens- Fbn1+/+ , heterozigotos- Fbn1mgΔ/+ e homozigotos: Fbn1mgΔ/
mgΔ.
As células foram então plaqueadas em meio DMEM + 10% Soro Fetal bovino + 1% penicilina 10.000 U.I/ ml e
estreptomicina 10 mg/ml e incubada em estufa 37oC com atmosfera de 5% de CO2.
As caudas dos animais recém-nascidos dos cruzamentos foram coletadas e identificadas. Logo após, para a lise,
as amostras foram incubadas com TNES (Tris 10mM, NaCl 125mM, EDTA 10nM, SDS 0,5% em pH 8) e
proteinase K (20mg/mL) por 16h (overnight) a 55oC. Após aguardar o tempo adequado, as amostras foram
tratadas com RNAse A (4mg/mL) por 30min. Em seguida, realizou-se o ensaio para precipitação de proteínas
com NaCl (5M) em centrifugação (15000xG) por 10min. Posteriormente, houve a precipitação do DNA com o
uso de isopropanol e centrifugação (15000xG) por 10min, e então, realizou-se a lavagem com etanol 70%
seguida por centrifugação (15000xG) por 5min. Apenas o precipitado seco (contendo somente DNA) resultante
foi utilizado, hidratado com TE (Tris 10mM e EDTA 1mM) e armazenado a -40ºC.
Para a reação de PCR, foram utilizados os seguintes oligonucletídios (primers):
•  1 R E A Ç Ã O : N e o F ( 5 ’ – G A G G C TAT T C G G C TAT G A C T – 3 ’ ) e N e o R ( 5 ’ –
CTCTTCGTCCAGATCATCCT – 3’)
•  2 REAÇÃO: 20F (5’- AAA CCA TCAAGGGCACTTGC–3’)eCC-R(5’CACATTCGCTGCCTTTAA TTC–
3’), nas concentrações finais de 10,0ρmol/uL em tampão TE com 2uL do DNA template e MasterMix (GE
Healthcare UK).
O produto das reações foram analisados por eletroforese em gel de agarose 0,75% acrescido de brometo de
etídio 5%, com marcador de peso molecular (100bp DNA ladder plus, para a primeira reação e 1kb DNA ladder
plus para a segunda reação) utilizando como tampão de corrida TBE 1x (160mA/40 min) e posteriormente
visualizado por fotodocumentador GE Healthcare UV 302nm.
Os animais que apresentaram banda com aproximadamente 440pb na primeira reação, foram identificados
como portadores da mutação no gene da fibrilina-1 (Fbn1mgΔ/+).
Já os animais que apresentaram banda com aproximadamente 600bp foram identificados como portadores do
alelo selvagem na segunda reação.
Portanto, os animais selvagens apresentaram banda apenas quando utilizado o par de primers 20F/CC-R, os
animais deficientes heterozigotos apresentaram bandas em ambos os pares NeoF/NeoR e 20F/CC-R e os
animais deficientes homozigotos apresentaram apenas a banda usando o par NeoF/NeoR.
Para otimizar a técnica de transfecção, foram descongelados vials contendo fibroblastos do genótipo selvagem
(Fbn1+/+ ) obtidos do estoque celular descrito anteriormente. Após verificar o crescimento normal das células,
estas foram tripsinizadas e então, plaqueadas (1-2x105 células) em uma placa de 6 poços para prepará-las para a
transfecção plasmidial de DNA.
Um dia antes da confluência dos poços, o meio de cultura foi trocado para DMEM + 10% de Soro Fetal Bovino
sem acréscimo de antibióticos. Então, no dia seguinte as células foram submetidas ao processo de transfecção
de DNA plasmidial utilizando o complexo Lipofectamine™ 2000 durante 24h, incubadas a 37°C com
atmosfera de 5% de CO2. As células foram então tratadas com Geneticina (500 µg/ml) para seleção. Os
fibroblastos selecionados foram submetidos ao sistema de aquisição de imagens por 24-48h (Axio Observer,
Carl Zeiss, Alemanha). Com este procedimento, podemos analisar a deposição de fibras elásticas na matriz
extracelular dos diferentes genótipos celulares obtidos e compararmos entre si analisando a deposição de
tropoelastina na matriz extracelular.
Em nosso estudo a deposição de tropoelastina na matriz extracelular dos fibroblastos, seria
prejudicada nas células com genótipo heterozigoto, seguida por aquelas de genótipo homozigoto.
Isto por que evidências (Handford et. al, 2000) sugerem que as fibrilinas são os componentes
principais das microfbrilas, sendo assim, mutações envolvendo genes que codificam a fibrilina-1
resultam em microfibrilas anormais in vivo e in vitro. O locus genômico da fibrilina-1 (FBN1) é
composto por aproximadamente 350kD de uma glicoproteína rica em cisteína responsável por
secretar e processar a produção da proteína funcional.
A FBN1 apresenta ainda domínios repetitivos, o mais comum, aquele que se repete 47 vezes na
proteína é o epidermal growth factor precurssor-like (EGF). O EGF apresenta 6 resíduos
conservados de cisteína associados a três ligações dissulfídicas. Além disso, 43 módulos de EGF
contém uma sequência de ligação de cálcio (cbEGF) (Frydman, 2008).
Considerando a transfecção das culturas primárias e para verificar se o plasmídio a ser usado
estava funcionando, utilizamos células da linhagem RFL6, que são fibroblastos de pulmão de ratos,
que expressam em cultura os componentes das fibras elásticas. A transfecção foi realizada como
descrito anteriormente e a análise da deposição da tropoelastina+DsRed foi realizada e pode ser
visualizada nas figuras 3 e 4. Onde podemos constatar a tropoelastina sendo depositada e marcada
em vermelho.
Diante destes resultados, as células obtidas dos camundongos serão agora transfectadas e
analisadas assim que tivermos a câmara de incubação das células, que fica acoplada ao
microscópio, consertada. Desta forma poderemos comparar a deposição da tropoelastina+DsRed
nas células que expressam diferentes quantidades de Fibrilina-1.
CONCLUSÕES
Apesar das funções regulatórias e sinalizadoras da Fibrilina-1 não estejam totalmente claras,
sua participação na estruturação das microfibrilas, responsáveis pela elasticidade dos tecidos é
de suma importância e tem sido foco de muitos estudos atualmente.
Este trabalho otimizou as técnicas de transfecção plasmidial em cultura primária de células
possibilitando que a deposição de tropoelastina pudesse ser observada em um sistema dinâmico
de aquisição de imagens, de forma que esta técnica também pudesse ser utilizada em diferentes
tipos de fibroblastos.
Os fibroblastos de derme, serão então submetidos ao mesmo sistema de aquisição de imagens
utilizado com as RFL6, para posterior análise desta deposição em genótipos onde a síntese de
Fibrilina-1 está comprometida devido à mutações no locus genômico que a codifica.