Sipert, Carla Renata
Si74p
Produção de MIP-1alfa e SDF-1 por fibroblastos
de polpa dental humana em cultura frente ao desafio
com Enterococcus faecalis inativado por calor/ Carla
Renata Sipert -- Bauru, 2007.
xx, 65 p. : il. ; 30 cm.
Dissertação (Mestrado) -- Faculdade de
Odontologia de Bauru. Universidade de São Paulo.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Ferreira dos Santos
Autorizo, exclusivamente pra fins acadêmicos e científicos, a
reprodução total ou parcial desta tese, por processos
fotocopiadores e/ou meios eletrônicos.
Assinatura do autor:
Data:
Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos da FOBUSP: projeto de pesquisa aprovado em 30 de novembro de
2005.
Número do protocolo: 131/2005
Dados Curriculares
Dados Curriculares
Carla Renata Sipert
Nascimento
Santo André – São Paulo
14 de setembro de 1979
Graduação em Odontologia na
Faculdade de Odontologia de
Bauru / Universidade de São
Paulo
1998 - 2001
Especialização em Endodontia
pelo Hospital de Reabilitação de
Anomalias
Craniofaciais
/
Universidade de São Paulo
2002 - 2004
Mestrado em Endodontia na
Faculdade de Odontologia de
Bauru / Universidade de São
Paulo
2005 - Atual
iv
“O conhecimento começa (...) quando, olhando para um objeto, sentimos que ele está
a nos dizer: Decifra-me ou te devoro!
Mas essa ordem do objeto, somente os curiosos a ouvem.
É a curiosidade que nos faz fazer perguntas.
É na curiosidade que o pensamento se inicia.”
“ Quem está possuído pela curiosidade não descansa.”
Rubem Alves, 2005
v
Dedicatória e Agradecimentos
Dedicatória e Agradecimentos
ou
Sobre limas e fibroblastos...
A história que vou contar agora pode não ser muito original, mas de qualquer forma foi única para a minha vida: o meu Mestrado! Uma fase com a qual eu já sonhava desde a graduação e que em 19 de abril de 2004, o dia da prova de seleção, começava a ser real. Esta é a típica circunstância que deixa qualquer pessoa fora de seu estado emocional natural. Teria sido assim comigo se não fosse a providencial presença de meus queridos amigos de graduação dias antes da tão esperada prova. Graças a André Marchiori (Tony), Ednir Matheus Rossi, Daniel Silva (Mona), Gustavo Souza (Talento), Danilo Souza, Fernando Ueno (Tanakama), Luis Fernando Lopes (Slot) e Marina Vaz de Lima, não houve espaço para tensão em meio a tanto bom humor e critatividade. Os demais amigos que não estavam em Bauru, como Camila Rodini, Andréia Dias, Ana Carolina Jaña (Calanga), Marcelo Montanha (Montanha), Pedro Coesta e Deise Yamashiba devem ter feito uma bela corrente de pensamentos positivos de forma que algumas semanas depois da prova, meu nome constava dentre os alunos selecionados para o mestrado em endodontia – 2005/2007. Tive o privilégio de dividir esta comemoração com Celso Kenji Nishiyama, Renata Hussne e Edninha, pessoas que me incentivaram a fazer o mestrado mesmo ainda na especialização. Meus divertidos colegas: Victor Hugo Lopes, Fábio Aznar, Arnaldo Santana, Carolina Novaretti, Micheli Izeppe, Bianca Zambon, Carina Martini, Tatiana Bella, Marina Vaz de Lima, Daniele Fakhoury e Juliana Baldani, já deixavam saudades logo que o curso de especialização terminou. Pareceram muito curtos os 6 meses que precederam as aulas do mestrado. Um longo ciclo de disciplinas básicas teve início e, no decorrer do aprendizado que tivemos acerca de bases de dados, bioestatística, normas bibliográficas, revisões sistemáticas, softwares milagrosos, docência na Universidade e fotografia ao alcance de todos; tivemos a oportunidade de fazer amigos dentre todas as áreas, alguns dos quais levei por todo o curso: Luciana Rezende, Nicolas, Dafna, Érica Bariri, Simone Faustino, Ana Carolina Fracalossi, Janaína Ghizoni, Marcela Claudino, Ana Paula, Renata, Marta, Dani Fa, Flora, Gustavo Lauttenschläger, dentre muitos outros. Os meses que se seguiram foram de intensa convivência com os colegas da endodontia. Alguns dias depois das aulas já iniciadas, um deles ainda faltava: Ramiro Oropeza, o boliviano. Foi preciso pouco tempo para que todos percebessem a calma e tranqüilidade com que ele lidava com os trabalhos. Aliás, calma essa que contagiou a turma de tal forma que foi possível que formássemos um grupo tão unido que em todos estes meses de trabalho, compromissos e tensões, nunca houve uma única desavença entre nós. Pelo contrário, aos poucos conheceríamos a história e a personalidade de cada um. A Roberta, que por tantas vezes deixava seu filho Alexandre com os avós para executar os trabalhos em grupo, nunca faltou com sua simpatia e disposição durante estes momentos. A Márcia, sempre elegante e delicada mesmo após horas de trabalho seguidas. O Bruno, com tanta praticidade e agilidade, vi
Dedicatória e Agradecimentos
que me fazia muitas vezes pedir para o Fernando traduzir o que ele nos dizia! Este, por sua vez, sempre disposto a ajudar a todos e a rir de nossas piadas. A Clarice, com seu carisma, criatividade e muita animação, conquistou logo o carinho de toda turma. Essa convivência agradável era melhorada ainda mais pela presença da Patrícia com sua alegria constante e bom humor aliados sempre à prudência e maturidade em suas colocações. Mas sem dúvida, não houve maior parceiro nestes dois anos que pudesse superar o Ronan: não bastasse sermos colegas da mesma área, nos tornamos parceiros de dança, executamos nossos trabalhos no mesmo laboratório, compartilhamos nossas dificuldades e sucessos sempre da mesma maneira: rindo muito! Tanto convivemos que eu nem pensei em outra pessoa para me atender quando eu precisei de um endodontista. Evidentemente não fiquei livre do seu humor pontiagudo nem mesmo nesta situação. Em meados de abril de 2005, a minha orientação pelo professor dr. Carlos Ferreira dos Santos finalmente havia sido formalizada e poderíamos então pensar no projeto que seria executado durante o mestrado. Após um contato feito com a profa Dra Sandra Helena Penha de Oliveira, da Faculdade de Odontologia da UNESP de Araçatuba, o prof. Carlos e a dra Sandra me propuseram juntos um trabalho no qual eu faria cultura de fibroblastos de polpa para estudar a resposta destas células frente a um estímulo bacteriano. Imediatamente me apaixonei pela idéia e em julho deste mesmo ano passei 15 dias no laboratório da profª Sandra onde tive a oportunidade de entrar em contato pela primeira vez com parte daquilo que eu executaria nos próximos meses. A drª Sandra mostrou‐se completamente solícita tanto no ambiente de trabalho como em sua própria casa onde me recebeu. A sua ajuda acabou se estendendo por todo o período de execução do projeto: mesmo longe, ela se mostrava pronta a sanar minhas dúvidas a qualquer hora do dia. Ainda em Araçatuba, tive a oportunidade de trabalhar novamente com uma contemporânea minha de especialização, na época mestranda e orientada da drª Sandra, Alessandra Gomes, cuja ajuda foi fundamental para o máximo aproveitamento desta minha fase de estágio. Fiz mais alguns novos amigos, incluindo o prof. Dr. João Eduardo Gomes a quem devo muitas horas de conversas extremamente agradáveis, inteligentes e bem humoradas. Foi também nesta ocasião que conheci a amiga Melaine Lawal. Ao ser aprovada no doutorado em Bauru, ela se mudou para meu apartamento e então pudemos conviver por mais de um ano num clima de muita descontração e também de aprendizado mútuo. Ao voltar de Araçatuba, então, providenciei a redação do projeto que, por decisão do prof. Carlos, foi submetido à FAPESP para a solicitação de um auxílio. Em outubro do ano seguinte, este financiamento foi concedido ao meu orientador. Ainda no segundo semestre de 2005, cumprindo disciplinas e atividades, tive a imensa satisfação de acompanhar, pela primeira vez, a atividade dos alunos da graduação. Foram meses de trabalho vendo colegas aprendendo endodontia exatamente no mesmo local e da mesma forma como eu aprendi. Eram inevitáveis os momentos de saudosismo e menos ainda os momentos cômicos no decorrer desta convivência com alunos sempre tão alegres e tão divertidos. Momentos estes que eram reforçados pela nossa querida d. Neide, que sempre complementava nossa rotina com muita alegria e sabedoria. Alegria, por sinal, era algo que dificilmente faltava no ambiente de trabalho quando o Edimauro se fazia presente com uma velocidade de raciocínio incrível: tanto para suas ciladas como para seu trabalho. O convívio com os professores do departamento deixou para nós, alunos de mestrado, exemplos a serem vii
Dedicatória e Agradecimentos
levados para o resto de nossas vidas: a experiência do prof. Dr.Norberti Bernardinelli, a gentileza e minuciosidade do prof. Dr.Roberto Brandão Garcia, a competência e a seriedade do prof. Dr. Clóvis Bramante e o constante carinho e sabedoria do prof. Dr. Ivaldo Gomes de Moraes. Grandes mestres que me motivaram durante a graduação e que me ensinaram a motivar durante este mestrado. Em todos os momentos que precisamos de alguma assistência, tivemos a orientação da secretária Suely Bettio e ainda a imensa ajuda da Patrícia. A ajuda de todos os funcionários foi fundamental para nós, alunos, durante estes dois anos. Iniciado o ano de 2006, tornava‐se urgente o início da execução do meu projeto e para que o mesmo pudesse ser executado em Bauru, precisei contar com a ajuda da Prof ª Drª Ana Paula Campanelli, que cederia, por mais de um ano, um espaço no seu laboratório e muito tempo de sua agenda para supervisionar minhas atividades. O convívio com novos colegas se iniciou e aos poucos se tornou uma amizade bem mais intensa do que eu poderia imaginar. Trabalhar com muitas pessoas competentes já seria por si só estimulante, mas ainda melhor com pessoas que fazem o possível para que o ambiente de trabalho se mantenha agradável. Foi assim que fui inserida no grupo formado por Rodrigo, Victor, Aninha, Vanessa, Michele ,Tatiana Sales, Valéria Gelani, Thaís Gasparoto e Eduardo Figueira. A estes últimos quatro devo imensa gratidão por tamanha ajuda, atenção e orientação em tantos momentos em que me senti perdida perante coisas novas a aprender. O convívio diário no laboratório acabou deixando alguns momentos marcantes entre nós. A cada momento de dificuldade e desânimo, pude contar com o olhar de solidariedade da Tati! A experiência e sensatez da Val sempre me inspiraram uma imensa confiança de maneira a sempre recorrer a suas palavras em momentos difíceis. A ajuda e paciência do Eduardo salvaram as culturas por incontáveis vezes. Finalmente, o exemplo de alto astral e dedicação da Thaís serviram constantemente como injeção de ânimo e inspiração para que eu executasse meu trabalho. O convívio entre os colegas ia muito além do laboratório e dos corredores da faculdade. Intermináveis horas de conversas culturais e divertidas ocorreram em nossas casas, bares e festas. Ronan, Clarisse, Fernando, Thaís, Minke Gasparoto, Wagner Baseggio e Marcela Claudino, Ericson Janolio e Melina Bortolo são os responsáveis por tantos momentos animados e descontraídos durante esses dois anos. Em meio a estes encontros informais, uma amizade fantástica se estabeleceu entre mim e Minke Gasparoto. Sua presença rende, na mesma proporção, gargalhadas incontroláveis alternadas com riquíssimas conversas sobre filmes, músicas e, obviamente, direito internacional. Outros amigos apareceram em momentos cruciais: Rosário Zedebski me ajudou muito no início do trabalho com a realização da fotografia das culturas. Dentre nossos encontros em corredores, nunca houve ocasião em que seu alto astral não me contagiasse. Outros amigos reapareceram depois de muito tempo longe, como Milton Santa Maria Jr., que eu conheci ainda na minha graduação e que ao retornar a Bauru revelou‐se um grande amigo. Juntamente com sua noiva Aline, muitos momentos de descontração se passaram tanto em Bauru como em trânsito para Ribeirão Preto. Outro amigo de longa data a quem ajudei foi Heitor Honório: somente aceitei ser voluntária de sua pesquisa pela estima e consideração que tenho por ele desde a época da graduação. No entanto, o aparelho que nós, voluntários, usávamos dia e noite (pingando açúcar, colocando de molho na Coca‐Cola, etc.) para seu estudo de desmineralização de esmalte, serviria perfeitamente como um modelo de indução viii
Dedicatória e Agradecimentos
de estresse em seres humanos. Isso sem contar todas as explicações que eram fundamentais quando se almoçava fora de casa, quando toda a parafernália da pesquisa tinha que ser levada a tiracolo! Na rotina do laboratório, também pude contar com a imensa ajuda da secretária Dalva Ribeiro de Oliveira, que se mostrou uma grande amiga por diversas horas de conversa descontraída nos intervalos do trabalho. A companhia do técnico André Luis da Silva também contribuiu diversas vezes para trabalhos bem feitos num clima bastante agradável. Cláudia também se fez fundamental durante toda a organização de material para a execução dos protocolos. Para que o meu projeto tivesse início, algumas parcerias tiveram que ser feitas com colegas cirurgiões‐dentistas que me ajudariam a providenciar os terceiros molares para a padronização das culturas primárias. Foi fundamental nesta fase a ajuda que recebi de Érica Kuriki, Fernando Giglio, Karin Modena e Bella Luna Colombini. Durante a padronização do protocolo, pude contar com a ajuda da colega Vivien Sakai, o que foi de imensa valia naquele momento. Outros colegas do laboratório de farmacologia deram seu apoio e sua solidariedade durante diversas fases do trabalho como Adriana Calvo, Thaís Marchini, Ana Elisa Akashi e Thiago Cruvinel. Aos poucos eu também comecei a participar dos protocolos de cirurgia do LAFFIC e tive a oportunidade de conhecer melhor os alunos de iniciação científica Thiago, Leonardo, Paulo e Anderson. Foi muito gratificante poder contribuir e aprender com o trabalho destes queridos alunos! Durante a execução dos experimentos, eu precisei me deparar com muitas dificuldades, como já era previsto. Não raro, o trabalho era perdido em razão de culturas contaminadas, PCR´s borrados e citometrias frustradas. No entanto, nunca me faltou a ajuda de profissionais experientes e extremamente generosos como o dr. Fernando Cunha e o dr. João Santana (FMRP/USP) que nos cederam os anticorpos para a execução de ELISA. Juliana Bertozzi, funcionária da referida escola, gentilmente realizou a análise das amostras dos meus experimentos. Para a citometria de fluxo, contamos com a colaboração do Hemonúcleo do Hospital Amaral Carvalho através da profissional Fátima Barrach. A todos, o meu muito obrigado pela colaboração e paciência! Muitos profissionais do campus tiveram participação fundamental durante toda esta fase. A um grande funcionário desta escola dedico um imenso carinho e admiração: Thiago José Dionísio. Alguém que só há pouco concluiu sua graduação, mas já se mostra um perfeito mestre em paciência, bom humor, simpatia e principalmente, competência. Características estas também coroadas, de maneira unânime, pela profissional Vera Rufino Rosa. Muitos outros funcionários fizeram parte do convívio destes anos sempre de maneira solícita e agradável como Marilza, Eva, Ovídio, Gilmar, Thelma, Solange, seu Luís, Zilei, Mônica, Sueli. Cada qual essencial à escola em suas atividades. Sobre o significado para mim da Faculdade de Odontologia de Bauru haveria páginas do que falar, mas me contentarei em declarar a paixão que trago comigo desde o dia em que aqui pisei pela primeira vez na ocasião da matrícula para o curso de graduação. Neste local, muito mais sobre a vida aprendi do que ser cirurgiã‐dentista ou especialista ou mestre. Dedico a gratidão que carrego comigo ao atual diretor da escola prof. Dr. Luis Fernando Pegoraro e aos ex‐diretores durante todo o período em que estive aqui: Profª Drª Maria Fidela de Lima Navarro, atual secretária geral da USP, ix
Dedicatória e Agradecimentos
e ao prof. Dr. Aymar Pavarini, que me concedeu o grau de cirurgiã‐dentista no ano de 2001. À presidente da pós‐graduação, Profª Drª Maria Aparecida de Andrade Moreira Machado, meus agradecimentos pelo empenho e dedicação pela pós‐graduação desta escola. Agradeço também às secretárias da pós‐graduação Giane Tenório Quintela, Ana Letícia Momesso e Maria Margareth Mokarzel por tamanha paciência durante a solução dos trâmites burocráticos. Essencial agradecer ainda ao governo federal pela disponibilização da bolsa CNPq que proveu meu sustento ao longo destes dois anos. Ao governo do Estado de São Paulo deixo minha admiração por ainda manter uma universidade pública do nível da Universidade de São Paulo, respeitada dentre todas as grandes universidades do mundo. Agradeço mais uma vez ao governo estadual pelo auxílio concedido pela agência FAPESP, o que tornou este projeto e alguns futuros, passíveis de realização. Muito conhecimento é necessário para que se idealize um projeto com propensões a ser mundialmente aceito e respeitado. A realização deste grande sonho devo à profª Drª Sandra Oliveira, que me ofereceu algo para que eu pudesse trabalhar com paixão. Muito mais do que apenas atenção e paciência recebi da profª Drª Ana Paula Campanelli. Inimaginável foi o crescimento que desenvolvi durante estes meses de convivência em seu laboratório. Por aquele que me recebeu como sua orientada sem nem sequer ter sido sua aluna, e ainda assim me dedicar tamanho voto de confiança que eu jamais esperaria receber; o meu imenso respeito e admiração! Declaro a minha gratidão ao meu orientador Prof. Dr. Carlos Ferreira dos Santos, um homem que carrega consigo uma verdadeira lista de exemplos a ser seguida por qualquer pessoa que deseja ser mais humana, competente, respeitada e acima de tudo, humilde. Muitos familiares torciam e se preocupavam comigo durante estes 2 anos de curso. Muito carinho recebi à distância dos primos Mônica, Paulo, Rosmeri e Silvani Prediger, família Sipert (Luís, tio Arno, Marcos, Nico, Hugo, Manfred, tia Voni, Hari), família Reimann (Liki, Mário, Wagner, Vinícius), família Reffatti (Márcio e Tatiana, tio Chico, Elizete e Eliane), Vera e Gilberto Agibert. Em especial, agradeço a atenção que recebo sempre de minha tia Betti Sipert, uma pessoa que se fez presente em minha infância e assim continua sendo até hoje! A Eunice Kusuda, minha gratidão por abrir as portas de sua casa para mim de forma tão amável! Por sempre me acolher com carinho e, especialmente, alegria; o meu muito obrigada! Por mais que o programa de mestrado e a convivência com tantos profissionais competentes fossem responsáveis por tanto aprendizado e crescimento durante esta fase, levo comigo a certeza de que grande parte deste amadurecimento não teria sido tão evidente sem a parceria e o companheirismo daquele que comigo dividiu cada entusiasmo, emoção, decepção, dúvida e desabafo. A presença de Ricardo Kusuda nesta fase de minha vida fez com que todos os momentos tivessem um brilho especial! Poucas coisas na vida são tão acalentadoras como o abraço de uma avó. A Melida Alma Reffatti meu muito obrigado por tanto carinho e por tantas coisas lindas que eu aprendo a cada dia com essa pessoa tão especial. Também agradeço ao meu avô Anicleto Reffatti por toda força e determinação que passam a cada geração. Aos meus saudosos avós Erna Ziel Sipert e Evaldo Sipert, de quem herdo meu sobrenome, a promessa de honrá‐lo sempre com honestidade e humildade. x
Dedicatória e Agradecimentos
Ao amigo de todas as horas, ao que trouxe consigo ao nascer a alegria sem limites, meu irmão Tiago Alexandre Sipert, minha imensa gratidão por tanto carinho e amor, por tanta saudade compartilhada, por tantas frases só por você interpretadas. Tenho certeza de que a sua existência faz a minha muito mais feliz. Aos meus amados pais Vili Sipert e Marli Reffatti Sipert eu dedico minha dissertação com todas as honras que vocês merecem. Somente pais sonhadores como vocês compreenderiam os anseios de um filho também sonhador. Agradeço pelo alento e força em tantos momentos de dificuldade, saudade e desânimo. Serei eternamente grata pela compreensão quanto à minha ausência e falta de tempo para com a família. E que Deus permita que vocês vivam por muitas décadas para que eu ainda possa honrá‐los por muito mais tempo como ordena seu Santo Mandamento. E ao Criador dos Céus e da Terra, eu declaro minha gratidão e alegria pelo privilégio da vida. Agradeço a Deus, meu Pai maior, por possibilitar tantas oportunidades maravilhosas como todas estas que vivi durante o meu curso de Mestrado. Ao dividir minha rotina entre Clínica e Bancada, vocês todos fizeram com que eu pudesse me realizar ao aprender cada vez mais sobre limas e fibroblastos!... Muito obrigada!!!
Carla Sipert
xi
Sumário
RESUMO
1 Introdução e Síntese Bibliográfica
xx
3
2 Proposição
19
3 Material e métodos
23
3.1 Coleta do tecido pulpar..............................................................................................23
3.2 Cultura dos fibroblastos.............................................................................................23
3.3 Preparo do Enterococcus faecalis morto por calor....................................................24
3.4 Estimulação dos Fibroblastos Pulpares por Enterococcus faecalis morto por calor.24
3.5 ELISA........................................................................................................................24
3.6 Análise Estatística .....................................................................................................25
4 Resultados
29
4.1 Cultura dos fibroblastos.............................................................................................29
4.2 Produção de MIP-1α/CCL3 por ELISA....................................................................33
4.3 Produção de SDF-1/CXCL12 por ELISA .................................................................37
5 Discussão
43
6 Conclusão
51
Referências bibliográficas
55
ABSTRACT
65
Lista de Figuras
FIGURA 1
Cultura de fibroblastos de polpa dental humana
FIGURA 2
Produção de MIP-1α por fibroblastos de polpa dental humana 35
estimulados por Enterococcus faecalis inativado por calor
FIGURA 3
Valores individuais da produção de MIP-1α/CCL3 por 35
fibroblastos de polpa dental humena estimulados por
Enterococcus faecalis inativado por calor
FIGURA 4
Produção de SDF-1 por fibroblastos de polpa dental humana 43
estimulados por Enterococcus faecalis inativado por calor
FIGURA 5
Valores individuais da produção de SDF-1/CXCL12 por 53
fibroblastos de polpa dental humana estimulados por
Enterococcus faecalis inativado por calor
31
Lista de Tabelas
TABELA 1
Médias e erros-padrão da média (média ± EPM) referentes aos 33
valores de produção de MIP-1α/CCL3 por fibroblastos de
polpa dental humana.
TABELA 2
Médias e erros-padrão da média (média ± EPM) referentes aos 37
valores de produção de SDF-1/CXCL12 por fibroblastos de
polpa dental humana.
Lista de Abreviaturas e Símbolos
° = graus
% = por cento
et al = e colaboradores
LTA = Lipoteichoic acid - Ácido lipoteicóico
LPS = Lipopolysaccharide – Lipopolissacarídeo
VEGF = Vascular endothelial growth factor – Fator de crescimento vascular endotelial
TGF = Transforming Growth Factor – Fator de crescimento transformador
VBNC = Viable but non-culturable – Viável mas não cultivável
IL = Interleucin – Interleucina
GRO = Growth-related Oncogene – Oncogene relacionado ao crescimento
SDF = Stromal Cell-Derived Factor – Fator celular derivado de estroma
MCP = Monocyte Chemotactic Protein – Proteína quimiotática para monócito
MIP = Macrophage Inflammatory Protein – Proteína inflamatória para macrófago
TNF = Tumor Necrosis Factor – Fator de necrose tumoral
IP = Interferon-gama-inducible Protein – Proteína indutora de Interferon-gama
NK = Natural Killer – Células do sistema imune denominadas de “Exterminadoras
Naturais”
IFN = Interferon
CD = Cluster of differentiation – Agrupamento de diferenciação
TLR = Toll-like Receptor – Receptor do tipo Toll
MyD = Myeloid Differentiation – Diferenciação mielóide
NOD = Nucleotide-binding Oligomerization Domain – Domínio de oligomerização
ligado a nucleotídeo
A.a = Aggregatibacter Actinomycetemcomitans
HGF = Hepatocyte Growth Factor – Fator de crescimento para hepatócito
ATM = Articulação Têmporo-mandibular
IDO = Indoleamine-pyrrole 2,3-dioxygenase
RANTES = Regulated on Activation Normal T-cell Expressed and Secreted
CpG DNA = Notação utilizada para distinguir uma Citosina seguida de uma Guanina
RT-PCR = Reverse Transcriptase – Polymerase chain reaction – Transcriptase reversa
seguida de reação em cadeia da polimerase
DMEM = Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium – Meio de Eagle modificado por
Dulbecco
BHI = Brain Heart Infusion – Infusão de cérebro e coração
PBS = Phosphate Buffered Saline – Tampão fosfato salina
ELISA = Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay = Ensaio imuno-enzimático
FOB/USP = Faculdade de Odontologia de Bauru / Universidade de São Paulo
Resumo
Resumo
A polpa dental é formada de tecido conjuntivo frouxo sendo constituída por
diversas células, dentre as quais os fibroblastos são as mais numerosas. Ao serem
submetidas a agressões diversas, estas células respondem com a liberação de
substâncias, tais como citocinas e quimiocinas, que participam de maneira ativa no
processo inflamatório. Assim sendo, este trabalho teve como proposição: 1. avaliar a
capacidade de fibroblastos de polpa dental humana em cultura em produzirem as
quimiocinas MIP-1α /CCL3 e SDF-1/CXCL12; 2. avaliar a produção destas
quimiocinas pelos fibroblastos quando estimulados por Enterococcus faecalis morto por
calor com relação à quantidade de bactérias por célula e 3. avaliar a liberação destas
quimiocinas com relação ao tempo de estímulo. Para o estabelecimento das culturas, foi
coletada a polpa de terceiro molar hígido de um paciente saudável. O tecido foi
extraído, armazenado e picotado em meio de cultura para fibroblastos (DMEM), os
quais foram utilizados a partir da quarta passagem. Após adesão das células a placas de
24 poços, o meio de cultura contendo Enterococcus faecalis morto por calor numa
concentração correspondente a 1, 10 e 100 bactérias por fibroblasto foi adicionado aos
poços. Após 1, 6 e 24 horas, o sobrenadante das células foi coletado para a análise por
ELISA. A análise estatística foi realizada aplicando-se o teste Kruskal-Wallis com nível
de significância de 5%. A produção de MIP-1α /CCL3 e SDF-1/CXCL12 pelas células
pôde ser detectada por ELISA. Os fibroblastos pulpares se mostraram capazes de
produzir SDF-1 constitutivamente sendo que o estímulo bacteriano levou a uma
diminuição estatisticamente significativa desta produção. A produção de MIP-1α
também foi detectada tanto de maneira constitutiva como em resposta ao desafio
microbiano. Enquanto a concentração intermediária de bactéria por fibroblasto (10:1)
mostrou uma produção semelhante ao grupo controle, as concentrações de 1 e 100
bactérias por fibroblasto induziram aumento maior na primeira hora de estímulo. Essas
diferenças, entretanto, não foram estatisticamente significativas. A capacidade dos
fibroblastos secretarem quimiocinas, como MIP-1α e SDF-1, reforça a importância
dessas células dentro do contexto de imunidade e inflamação pulpar, principalmente por
serem as células mais numerosas deste microambiente.
Palavras-chave: Fibroblastos. Quimiocinas. Inflamação.
xx
Introdução e Síntese Bibliográfica
3
1 Introdução e Síntese Bibliográfica
A estrutura do tecido pulpar
A polpa dental é constituída de tecido conjuntivo frouxo derivado das células da
crista neural ou do ectomesênquima e encontra-se confinada no interior da câmara
pulpar e dos canais radiculares (CHIEGO JR1, 2002). Este tecido interage com outros
como o periodonto e o sistema nervoso central e pela sua integração com a dentina,
anatômica e funcionalmente, constitui juntamente com ela o complexo dentinopulpar
(GOODIS2, 2002). A polpa contém células que desempenham de funções divididas em
odontogênica, nutritiva, sensorial e defensiva, as quais permitem a preservação da sua
vitalidade durante a manutenção da homeostasia e o reparo após a agressão (CHIEGO
JR1, 2002). Apesar da polpa apresentar muitas propriedades em comum com outros
tecidos conjuntivos, sua localização peculiar lhe impõe uma série de características
ímpares a começar pela distribuição celular. Uma camada de odontoblastos, células
especializadas que produzem dentina, circunscreve a periferia do tecido pulpar com seu
corpo celular na polpa e seus prolongamentos no interior dos túbulos dentinários.
Subjacente aos odontoblastos, encontra-se uma área livre de células – zona de Weil –
constituída em sua maioria por fibras neurais não mielinizadas, capilares e processos de
fibroblastos. Mais profundamente situa-se a zona rica em células constituída de
fibroblastos em grande quantidade, células mesenquimais indiferenciadas, células de
defesa (macrófagos e linfócitos), capilares e fibras nervosas. Internamente a esta área,
localiza-se uma massa central de tecido conjuntivo conhecida por centro da polpa. Esta
região é composta por fibroblastos, vasos sangüíneos, nervos, células mesenquimais
indiferenciadas, macrófagos, linfócitos e fibras colágenas (OKIJI3, 2002). Dentre todos
os grupos celulares que povoam a polpa, os fibroblastos são os mais numerosos,
podendo ser encontrados em densidade ainda maior na zona rica em células (OKIJI3,
2002). Possuem um formato de estrela com longas extensões citoplasmáticas que
permanecem em contato com as demais células (odontoblastos e outros fibroblastos) por
meio de junções do tipo “gap” (TAKASHIBA; NARUISHI; MURAYAMA4, 2003).
4
Introdução e Síntese Bibliográfica
Os estímulos agressores que desafiam a polpa dental e os tecidos periapicais
O tecido pulpar é freqüentemente agredido por fatores ambientais como calor,
trauma mecânico, bactérias e suas toxinas, sendo estas consideradas o fator etiológico
principal da inflamação pulpar. Bactérias e seus derivados invadem a polpa dental em
decorrência da cárie (a maior fonte de bactérias em infecções da polpa e da área
periapical), de fraturas, de formações dentárias anômalas ou como conseqüência de
procedimentos restauradores (TROWBRIDGE5, 2002). Os microrganismos sob lesões
cariosas têm sido isolados e observa-se, de maneira geral, a presença de Streptococcus
sp., Actinomyces sp., Eubacterium sp. e Lactobacillus sp. em alta freqüência em lesões
de cárie superficial, enquanto que Eubacterium sp., Propionibacterium sp. e
Bifidobacterium sp. são isolados de lesões de cárie profunda (LOVE; JENKINSON6,
2002). A presença de Enterococcus sp. também é relatada em dentina cariada
(MARTIN et al.7, 2002).
A importância de microrganismos na etiopatogenia da doença periapical já tem
sido
amplamente
8
elucidada
pela
literatura
(KAKEHASHI;
STANLEY;
9
FITZGERALD , 1965, MOLLER et al , 2004). Especial atenção tem sido destinada ao
perfil microbiológico dos casos de insucesso do tratamento endodôntico. Neste
contexto, vários estudos têm relacionado a prevalência de Enterococcus faecalis em
lesões periapicais refratárias aos protocolos de tratamento atualmente empregados
(KAUFMAN et al.10, 2005, SEDGLEY et al.11, 2005, WILLIAMS et al.12, 2006,
ZOLETTI; SIQUEIRA; SANTOS 13, 2006). Enterococus habitam, de forma comensal,
o trato gastrintestinal de humanos, mas podem desencadear uma grande variedade de
doenças como infecções urinárias, endocardite bacteriana, dentre outras (JETT;
HUYCKE; GILMORE14, 1994). A presença de Enterococcus faecalis também se dá na
cavidade oral em locais como saliva, sulco gengival, dorso da língua e canais
radiculares infectados (SEDGLEY; LENNAN; CLEWELL15, 2004, SEDGLEY;
BUCK; APPELBE16, 2006). Entretanto, é notável a alta prevalência em casos de
insucesso do tratamento endodôntico, ou seja, quando da persistência da inflamação
periapical ou seu aparecimento após a intervenção profissional. Em estudos que utilizam
métodos de identificação por meio de biologia molecular, encontram-se prevalências
deste microrganismo de 12,1% (KAUFMAN et al.10, 2005), 43% (WILLIAMS et al.12,
2006), 80% (ZOLETTI; SIQUEIRA; SANTOS13, 2006) e 89,6% (SEDGLEY et al.11,
2006). WILLIAMS et al.12, 2006, relatam que E. faecalis foi de 2 a 3 vezes mais
5
Introdução e Síntese Bibliográfica
freqüente em infecções refratárias do que em primárias. As possíveis razões para esses
achados podem estar relacionadas à capacidade de E. faecalis em se adaptar a condições
adversas (FLAHAUT et al.17, 1996), como ocorre durante as diferentes fases do
tratamento endodôntico (WILLIAMS et al.12, 2006). Estes mecanismos de defesa estão
diretamente relacionados aos seus fatores de virulência, como por exemplo, adesinas
que se ligam ao colágeno tipo I (ROZDZINSKI et al.18, 2001), principal componente
orgânico da dentina (LINDE; GOLDBERG19, 1993), conferindo à bactéria a capacidade
de se alojar profundamente nos túbulos dentinários, permanecendo inatingíveis pela
ação do preparo biomecânico dos canais radiculares (WILLIAMS et al.12, 2006). Por ser
o trato gastrintestinal seu nicho natural, o ambiente alcalino proporcionado pelo uso da
medicação intracanal de hidróxido de cálcio não é capaz de inviabilizá-lo como a outros
microrganismos
(BYSTROM;
CLAESSON;
SUNDQVIST20,
1985,
DISTEL;
HATTON; GILLESPIE21, 2002). Nestas circunstâncias, E. faecalis é capaz de
sobreviver no interior dos canais radiculares mesmo na ausência de outros
microrganismos (MOLLER et al.9, 2004). Além disso, em ambientes desfavoráveis, E.
faecalis é capaz de assumir um estado denominado VBNC (“viable but nonculturable”
– viável mas não cultivável) (SIGNORETO et al.22, 2000), uma estratégia de
sobrevivência que o mantém metabolicamente ativo até que no meio no qual ele se
encontra, as condições favoráveis sejam restabelecidas (OLIVER23, 2005).
Outro fator de virulência importante é o ácido lipoteicóico (LTA), um
componente importante presente na membrana celular externa de microrganismos Gram
positivos, como é o caso de E. faecalis. O LTA é uma adesina anfifílica associada à
membrana com um fator de virulência potente que se assemelha ao LPS
(lipopolissacarídeo) de membrana. O LTA age como uma molécula de adesão que
facilita a colonização e a invasão de bactérias para o interior dos tecidos (GINSBURG24,
2002).
Os fibroblastos do tecido pulpar respondem de diferentes formas a estímulos
agressores
Em resposta aos estímulos agressores que acometem o tecido pulpar, como calor
e trauma mecânico e principalmente toxinas bacterianas, as células da polpa possuem a
capacidade de se reparar, se diferenciar em odontoblastos e produzir uma série de
proteínas da matriz durante o processo de reparo (CHAN et al.25, 2005). Nem toda
6
Introdução e Síntese Bibliográfica
reação inflamatória da polpa, portanto, resulta em dano permanente. Quando a lesão é
eliminada antes de comprometer em definitivo a polpa, a inflamação caminha para a
resolução e começa então o processo de reparo (TROWBRIDGE5, 2002) e nesta fase, a
síntese de colágeno é acelerada (OKIJI3, 2002). Mediante a ação de citocinas como o
fator de crescimento tumoral (TGF)-β1 e TGF-β2 e interleucina (IL)-1β, a deposição de
colágeno no tecido pulpar mostra-se aumentada (BARKHORDAR et al.26, 2002, CHAN
et al.25, 2005), provável razão pela qual fibroblastos inflamados depositam colágeno em
maior quantidade do que as mesmas células em condições normais (BARKHORDAR et
al.26, 2002). Esta síntese aumentada de colágeno pelos fibroblastos durante o processo
inflamatório é um evento fundamental para o reparo da polpa dental humana (CHAN et
al.25, 2005).
Recentemente, tem sido discutido que em resposta a estímulos variados, os
fibroblastos, além de produzirem colágeno, são capazes de secretar também vários tipos
de citocinas (SISMEY-DURRANT; HOPPS27, 1991, TAMURA et al.28, 1992,
YAMAJI et al.29, 1995, WANG et al.30, 1999, SUGIYAMA et al.31, 2000, WANG et
al.32, 2000, HOSOKAWA et al.33, 2005, UEHARA; TAKADA34, 2007) e da mesma
forma os fibroblastos pulpares (TOKUDA; NAGAOKA; TORII35, 2002, YANG et al.36,
2003, YANG et al.37, 2003, COIL; TAM; WATERFIELD38, 2004, YANG et al.39,
2004). Citocinas são proteínas secretadas por células de imunidade tanto inata como
adaptativa que atuam como mediadores destas mesmas células. São consideradas
reguladores fundamentais dos mecanismos de homeostasia como resposta imune,
inflamação e reparo (OLLIER40, 2004). As citocinas podem ser produzidas em resposta
a microrganismos e seus produtos, sendo que diferentes citocinas estimulam diversas
respostas em células constituintes da imunidade e inflamação. Dentre as citocinas,
destaca-se uma grande família de homólogos estruturais que estimulam o deslocamento
de leucócitos e regulam sua migração do sangue aos tecidos. A estas citocinas, deu-se o
nome de quimiocinas (citocina quimiotática). Elas são produzidas por várias células em
resposta a estímulos inflamatórios recrutando, assim, leucócitos ao local da inflamação
(ABBAS; LICHTMAN41, 2003). As quimiocinas são todas polipeptídeos entre 8 e 14
kDa sendo classificadas em subfamílias com base no número e posição dos resíduos de
cisteína N-terminal. As duas maiores subfamílias são a CC (resíduos de cisteína estão
adjacentes) e a CXC (os resíduos são separados por um aminoácido). Um número
menor de quimiocinas é classificado como C (apenas um resíduo de cisteína) ou CX3C
(três aminoácidos separando os resíduos) (ZLOTNIK; YOSHIE42, 2000). As
Introdução e Síntese Bibliográfica
7
quimiocinas dos grupos CC e CXC são produzidas por leucócitos, células endoteliais,
células epiteliais e também por fibroblastos. Como exemplos de quimiocinas da
subfamília CXC, podemos citar interleucina-8 (IL-8), oncongene relacionado com o
crescimento (GRO) e fator estroma derivado de célula (SDF). Já dentre os componentes
da subfamília CC, destacam-se a proteína quimiotática para monócito (MCP) e a
proteína inflamatória para macrófago (MIP) (SCHALL et al.43, 1993, OGURA et al.44,
2005). Em algumas destas células, a liberação de quimiocinas é induzida por
microrganismos e por outras citocinas como o fator de necrose tumoral (TNF) e IL-1.
Essa liberação constitui um importante mecanismo de defesa, pois recruta leucócitos
para a região onde ocorre a infecção (ABBAS; LICHTMAN41, 2003). A quimiotaxia
ocorre em resposta a um gradiente local de quimiocinas no espaço extracelular (DIEUNOSJEAN et al.45, 1999). Os fibroblastos pulpares têm-se mostrado capazes de
produzir a quimiocina IL-8/CXCL8 como constatado por alguns estudos (NAGAOKA
et al.46, 1996, YANG et al.36, 2003).
As quimiocinas MIP-1α/CCL3 e SDF-1/CXCL12
As primeiras quimiocinas foram descobertas no fim da década de 80 devido a
suas ações angiostática (por exemplo IP-10/CXCL10) e quimiotática para neutrófilo
(por exemplo IL-8/CXCL8) (DIEU-NOSJEAN et al.45, 1999). O interesse pelo estudo
de quimiocinas tem crescido cada vez mais, principalmente após evidências
demonstradas a respeito da ação protetora que essas citocinas exercem sobre o HIV
(CHOE et al.47, 1996). A partir de então, estudos têm mostrado a participação de
quimiocinas em diversos processos biológicos como embriogênese, desenvolvimento,
angiogênese, hematopoiese, resposta imune e inflamação (BAGGIOLINI; DEWALD;
MOSER48, 1997). Embora inicialmente as quimiocinas dos grupos CC e CXC tenham
sido caracterizadas como atrativos para monócitos/macrófagos e neutrófilos
respectivamente (ROLLINS49, 1997), muitos estudos têm mostrado que não há uma
correlação simples entre a estrutura primária de uma quimiocina e uma célula alvo
específica (DIEU-NOSJEAN et al.45, 1999).
O membro CCL3 (humano MIP-1α/LD78α) da família da proteína inflamatória
para macrófago-1 (MIP-1) é decodificado por genes localizados no cromossomo 11
(MENTEN; WUYTS; VAN DAMME50, 2002). Células diretamente envolvidas na
resposta imune como macrófagos, linfócitos T e B, neutrófilos, células dendríticas,
8
Introdução e Síntese Bibliográfica
mastócitos e células NK (“Natural killer”) são capazes de produzir grandes quantidades
de MIP-1. Plaquetas, osteoblastos, células epiteliais e fibroblastos, dentre outras,
também o fazem, mas em quantidades mais discretas. A produção de MIP-1 pode ser
induzida por diversos agentes pró-inflamatórios, LPS, substância P, infecções virais,
TNF-α, IFN-γ, IL-1α/β. Outras citocinas como IL-4 ou IL-10 podem levar a uma
diminuição da produção de MIP-1 (MAURER; STEBUT51, 2004). Esta quimiocina
participa tanto da fase aguda como crônica da inflamação por meio do recrutamento de
células pro-inflamatórias ao local de dano ou infecção. MIP-1α/CCL3 exerce
quimiotaxia para monócitos (migração transendotelial), linfócitos B, neutrófilos
ativados (BONECCHI et al.52, 1999) e eosinófilos (MAURER; VON STEBUT51, 2004).
É capaz de atrair ainda linfócitos T CD4+ e CD8+ tanto sob fenótipo de memória como
naive. (SCHALL et al.43, 1993). As evidências mostradas pela literatura constatam que
MIP-1α/CCL3 desempenha uma função muito importante na indução e modulação da
resposta imune e inflamatória (MAURER; VON STEBUT51, 2004).
O fator derivado de estroma ou SDF-1/CXCL12 é uma quimiocina produzida
constitutivamente por muitos tecidos distintos (BLEUL et al.53, 1996). O gene que a
codifica, sdf1, está localizado no cromossomo 10 (SHIROZU et al.54, 1995). Este gene é
traduzido como isoformas α e β que diferem em seu Cterminal. No entanto, não há
indícios de quaisquer diferenças no que tange a expressão ou função. SDF-1/CXCL12 é
quimiotática para leucócitos incluindo neutrófilos, monócitos, linfócitos B e T e células
progenitoras hematopoiéticas (BLEUL et al.53, 1996, AIUTI et al.55, 1997, CHAN;
HYDUK; CYBULSKY56, 2001). SDF-1/CXCL12 parece contribuir para o retorno de
neutrófilos senescentes para a medula uma vez que estas células se mostram ainda mais
responsivas a esta quimiocina quando idosas (MARTIN et al.57, 2003). Células
dendríticas respondem a um amplo espectro de quimiocinas incluindo MIP-1α/CCL3 e
SDF-1/CXCL12. No entanto, com a maturação, estas células perdem responsividade
para muitas quimiocinas, mas não para SDF-1/CXCL12 (DIEU et al.58, 1998). Existem
alguns indícios na literatura de que pode haver diminuição da produção de SDF1/CXCL12 durante o processo inflamatório (FEDYK et al.59, 2001, HOSOKAWA et
al.33, 2005).
A produção constitutiva de SDF-1/CXCL12 foi primeiramente constatada em
células do estroma de medula óssea (AIUTI et al.55, 1997). No entanto, a produção desta
quimiocina já pode ser demonstrada por fibroblastos sinoviais da articulação têmporo-
Introdução e Síntese Bibliográfica
9
mandibular humana (OGURA et al.44, 2005) e por fibroblastos de gengiva humana
(FEDYK et al.59, 2001, HOSOKAWA et al.33, 2005).
Fibroblastos, imunidade inata e inflamação
A participação dos fibroblastos na resposta imune inata tem sido demonstrada
com base em achados acerca de receptores vinculados ao reconhecimento de antígenos
bacterianos. A expressão de CD14 (agrupamento de diferenciação - proteína expressa na
superfície de algumas células do sistema imune, envolvida no reconhecimento de LPS
segundo WRIGHT et al.60, 1990) por fibroblastos de gengiva humana foi demonstrada
por WANG et al.
61
, 1998. Estas células são capazes de se ligarem ao LPS de
Escherichia coli e Porphyromonas gingivalis. A produção de IL-6 se mostrou
dependente de CD14. Em fibroblasto de gengiva de camundongos, o CD14 só se
mostrou expresso após estímulo por LPS (BOTERO et al.62, 2006). HATAKEYAMA et
al.63, 2003, mostraram presença expressiva de CD14 em fibroblastos de gengiva
humana contrastando com a presença discreta deste receptor em fibroblastos de
ligamento periodontal de um mesmo indivíduo.
Fibroblastos também parecem expressar uma classe de receptores denominados
tipo “Toll-like receptors”(TLR) – receptores do tipo Toll (MAHANONDA et al.64,
2007, UEHARA; TAKADA34, 2007). Estes receptores são mediadores do
reconhecimento inicial de patógenos microbianos, o que dá início à resposta imune
inata. Até o presente, são conhecidos 12 membros da família TLR (AKIRA;
UEMATSU; TAKEUSHI65, 2006). Estes receptores são expressos de maneira diferente
pelas células imunes e parecem responder a estímulos diferentes (AKIRA; TAKEDA;
KAISHO66, 2001). Entretanto, a expressão destes receptores vem sendo observada em
outros grupos de células incluindo fibroblastos gengivais (MAHANONDA et al.64,
2007), fibroblastos de ligamento periodontal (HATAKEYAMA et al.63, 2003) e
odontoblastos (DURAND et al.67, 2006). A expressão de TLR4, receptor para LPS, foi
relatada em fibroblastos de gengiva humana por WANG et al.32, 2000. Este receptor
pareceu influenciar a produção de IL-1 induzida por LPS. Novamente, porém em
fibroblastos de gengiva de camundongos, BOTERO et al. 62, 2006, mostram o aumento
da expressão de TLR4, assim como a de CD14, como já mencionado acima. Em estudos
mais amplos com fibroblastos de gengiva humana, MAHANONDA et al.64, 2007 e
10
Introdução e Síntese Bibliográfica
UEHARA; TAKADA34, 2007, observaram uma grande variedade de receptores
relacionados ao reconhecimento de microrganismos. MAHANONDA et al.64, 2007,
demonstraram a expressão de TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6 e TLR9 além
da relevância funcional de TLR2, 3, 4 e 5 que tiveram envolvimento na produção de IL8 pelos fibroblastos. UEHARA; TAKADA34, 2007, observaram a expressão de TLR1,
2, 3, 4, MD-2, TLR5, 6, 7, 8 e 9, MyD88, NOD1 e NOD2. O desafio com agonistas de
TLR2/6, TLR3, TLR4, TLR7/8, TLR9, NOD1 e NOD1 levou as células a produzirem
IL-6, IL-8 e MCP-1. Estes achados suportam o papel dos fibroblastos na resposta imune
inata contra bactérias.
As diversas respostas dos fibroblastos frente a estímulos de origem microbiana
vêm sendo elucidadas de maneira bastante variada pela literatura. Dentre os desafios
escolhidos para o estudo destas células no contexto de imunologia e inflamação,
encontram-se: sobrenadante de bactérias (LETZELTER et al.68, 1998, YANG et al.36,
2003, YANG et al.37, 2003, YANG et al.39, 2004), bactéria íntegra inativada
(SUGIYAMA et al.31, 2000, HOSOKAWA et al.33, 2005), extrato sonicado de bactérias
(YAMASAKI et al.69, 1998), estruturas bacterianas isoladas como vesícula extracelular
e proteína externa de membrana (SUTHIN et al.70, 2003), fímbria (SUGIYAMA et al.31,
2000) e peptidoglicana (HATAKEYAMA et al.63, 2003). Têm sido amplamente
estudados também os componentes de parece celular como o ácido lipoteicóico (LTA)
(SUGIYAMA et al.71, 1996, WANG et al.72, 2001, TELLES et al.73, 2003), proveniente
de bactérias gram-positivas; e o lipopolissacarídeo (LPS) (SISMEY-DURRANT;
HOPPS27, 1991, TAMURA et al.28, 1992, YAMAJI et al.29, 1995, WANG et al.61, 1998,
WANG et al.30, 1999, WANG et al.32, 2000, TOKUDA; NAGAOKA; TORII35, 2002,
BOTERO et al.74, 2003, SUTHIN et al.70, 2003, COIL; TAM; WATERFIELD38, 2004,
TARDIF; ROSS; ROUABHIA75, 2004, GUTIERREZ-VENEGAS et al.76, 2005,
HOSOKAWA et al.77, 2005, BOTERO et al.62, 2006, MAHANONDA et al.64, 2007,
UEHARA; TAKADA34, 2007) proveniente de bactérias gram-negativas. Além de
agentes microbianos, diversas citocinas têm sido utilizadas como estímulo a
fibroblastos: IL-10 (WANG et al.30, 1999, TOKUDA; NAGAOKA; TORII35, 2002), IL1β (TAKASHIBA et al.78, 1992, SUGIYAMA et al.71, 1996), IL-1α (SUGIYAMA et
al.31, 2000, FEDYK et al.59, 2001), TNF-α (TAKASHIBA et al.78, 1992, FEDYK et
al.59, 2000, TOKUDA, NAGAOKA, TORII35, 2002, HOSOKAWA et al.33, 2005,
OGURA et al.44, 2005, MAHANONDA et al.64, 2007,) e IFN-γ (TAMURA et al.28,
11
Introdução e Síntese Bibliográfica
1992, HOSOKAWA et al.33, 2005, MAHANONDA et al.64, 2007). Com todos os
estímulos acima citados, fibroblastos oriundos de diferentes tecidos demonstraram
alguma resposta relevante para o processo inflamatório dos mesmos.
A toxicidade bacteriana a fibroblastos no que concerne à proliferação destas
células em cultura, foi demonstrada por LETZELTER et al.68, 1998, com fibroblastos de
gengiva humana que tiveram seu crescimento diminuído com o sobrenadante de
Prevotella
nigrescens,
Capnocytophaga
ochracea
,
Aggregatibacter
actinomycetemcomitans e Peptostreptococus micros. A mesma inibição pôde ser
observada por YAMASAKI et al.69, 1998, em fibroblastos periapicais quando
estimulados pelo extrato sonicado de Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas
gingivalis e Fusobacterium nucleatum. De forma contrária, o extrato sonicado de
Prevotella intermedia levou ao estímulo do crescimento celular. Dentre os
microrganismos estudados, como mais tóxicos se mostraram P. gingivalis e F.
nucleatum. A capacidade de um componente de parede celular como o LTA de
Streptococcus mutans em induzir apoptose foi demonstrado em células da polpa de
dentes decíduos por WANG et al.72, 2001. No grupo tratado com LTA, os autores
observaram degradação do DNA das células, típica do processo de apoptose.
A literatura tem mostrado que os fibroblastos constituem um grupo de células
capazes de produzir mediadores inflamatórios frente a estímulos variados. A produção
do mRNA de VEGF foi mostrada com aumento por YANG et al.39, 2004 em
fibroblastos de polpa humana estimulados pelo sobrenadante de P. endodontalis, P.
gingivalis e P. intermedia. A produção desta mesma proteína por fibroblastos de tecido
gengival murino, como elucidado por TELLES et al.73, 2003, foi encontrada de maneira
constitutiva por estas células mas que não tiveram produção aumentada pelo LTA de
Streptococcus sanguinis e S. mutans. Por outro lado, em fibroblastos de gengiva
humana, SUTHIN et al.70, 2003, encontraram níveis significativamente mais altos de
VEGF quando as células foram estimuladas por vesícula extracelular e proteína externa
de membrana tanto de P. gingivalis como A.a. No entanto, o LPS de P.gingivalis não
foi capaz de induzir aumento dos níveis basais de VEGF.
A IL-6 é uma citocina amplamente estudada como resultado a estímulos
variados. Sua produção por fibroblastos de ligamento periodontal humano foi
demonstrada por YAMAJI et al.29, 1995, frente a desafio por LPS. Com este mesmo
antígeno, WANG et al.30, 1999, e WANG et al.61, 1998, mostraram a produção da
mesma citocina em fibroblastos de gengiva humana. No entanto, os autores enfatizam a
12
Introdução e Síntese Bibliográfica
inibição desta produção pelo tratamento conjunto com IL-10 (WANG et al.30, 1999) e
com anticorpo anti-CD14 (WANG et al.61, 1998). Os fibroblastos de polpa dental
humana também foram capazes de expressar mRNA para IL-6 frente ao desafio por
sobrenadante de bactérias gram-negativas conforme YANG et al.37, 2003, e a produção
desta mesma citocina foi confirmada por COIL; TAM; WATERFIELD38, 2004,
especialmente se estimuladas por LPS, quando a produção foi significativamente
aumentada.
A produção de IL-1β também tem sido demonstrada por diversos estudos. A
produção desta citocina por fibroblastos oriundos de periósteo de rato foi estudada por
SISMEY-DURRANT; HOPPS27, 1991. Os níveis basais de IL-1β eram baixos, mas o
estímulo com LPS de P. gingivalis levou a um aumento de até 6 vezes. TARDIF;
ROSS; ROUABHIA75, 2004, compararam a produção de IL-1β por fibroblastos de
derme e gengiva humanos. Frente ao desafio com LPS de Escherichia coli, ambos os
grupos produziram a citocina, porém as células da derme em níveis mais elevados.
Também em fibroblastos de gengiva humana, TAMURA et al.28, 1992, já haviam
mostrado a produção de IL-1β porém de maneira discreta. Fibroblastos de polpa dental
humana em cultura originados de tecido inflamado produziram níveis maiores de IL-1β
do que as células provenientes do tecido saudável segundo observado por
BARKHORDAR et al.26, 2002.
Outras citocinas, cuja produção já foi relatada como resposta de fibroblastos a
diferentes estímulos, podem ser citadas. O fator de crescimento para hepatócito (HGF)
teve sua produção basal aumentada em fibroblastos de gengiva humana estimulados por
LTA de S. sanguinis e E. faecalis. O estímulo concomitante com IL-1β levou ao
aumento na produção deste fator de maneira sinergística com LTA de S. sanguinis
(SUGIYAMA et al.71, 1996). Em estudo mais recente, SUGIYAMA et al.31, 2000,
demonstraram novamente nestas células o aumento de HGF induzido por P. gingivalis
(bactéria íntegra e inativada) e por fímbria deste mesmo microrganismo. O aumento de
HGF também foi observado quando do tratamento destes fibroblastos com IL-1α.
A produção de TGF-β por fibroblastos de ligamento periodontal humano foi
demonstrada por YAMAJI et al.29, 1995. A produção constitutiva desta citocina não foi
afetada por estímulo com LPS de P. gingivalis e de E. coli. TAMURA et al.28, 1992,
mostraram produção de IL-1α por fibroblastos de gengiva humana estimulados por LPS
de P. intermedia e P. gingivalis.
Introdução e Síntese Bibliográfica
13
A capacidade de fibroblastos em produzirem quimiocinas também vem sendo
estudada de forma variada. TAMURA et al.28, 1992, mostraram aumento da expressão
de mRNA para IL-8 (CXCL8) por fibroblastos de gengiva humana após desafio com
LPS de P. intermedia. Quando as células eram tratadas previamente com IFN-γ, a
expressão desta quimiocina foi ainda maior. Em fibroblastos de mesma origem,
TAKASHIBA et al.78, 1992 observaram o aumento da expressão de mRNA para IL8/CXCL8 após tratamento das células com IL-1β e TNF-α. O estudo também
demonstra a capacidade destes fibroblastos em induzir a migração de neutrófilos. Ao
estudar fibroblastos de ligamento periodontal humano perante estímulo por LPS de P.
gingivalis e E. coli, YAMAJI et al.29, 1995, também observaram aumento de IL8/CXCL8 como resposta ao desafio. O aumento da expressão do mRNA para IL8/CXCL8 por fibroblastos de polpa dental humana foi observado por YANG et al.36,
2003, ao estimularem as células com sobrenadante de P. endodontalis, P. gingivalis e P.
intermedia. A produção de IL-8/CXCL8 por fibroblastos pulpares humanos já havia
sido observada por TOKUDA et al.35, 2002. Quando tratadas previamente com IL-10,
as células estimuladas por LPS de P. intermedia, IL-1β e TNF-α tiveram inibidas a
expressão de mRNA para IL-8/CXCL8 induzida por estes estímulos. Em fibroblastos
sinoviais da articulação temporo-mandibular (ATM) humana, OGURA et al.44, 2005
observaram a produção de IL-8/CXCL8 e de outras quimiocinas como GRO-α/CXCL1,
MCP-1/CCL2 e RANTES/CCL5 significativamente aumentadas pelo tratamento com
TNF-α. MAHANONDA et al.64, 2007, e UEHARA; TAKADA34, 2007, observaram
também, em fibroblastos de gengiva humana, o aumento da produção de IL-8/CXCL8 e
IDO (molécula imunossupressora) e de IL-8/CXCL8, MCP-1/CCL2 e IL-6,
respectivamente, como resposta ao desafio com diferentes agonistas de TLRs.
A produção de CXCL12 (SDF-1α/β) foi demonstrada em fibroblastos de
gengiva e derme por FEDYK et al.59, 2001. A produção constitutiva se deu em níveis
altos, mas foi completamente inibida pelo tratamento das células com IL-1α e TNF-α.
Por outro lado, nas mesmas condições, os autores observaram aumento do mRNA para
IL-8/CXCL8 e MCP-1/CCL2. Também em fibroblastos de gengiva humana,
HOSOKAWA et al.33, 2005, observaram a produção constitutiva de CXCL12, que por
sua vez foi aumentada com estímulo por TNF-α, IFN-γ, TGF-β, RANTES/CCL5, MIP3α/CCL20 e fractalquina/CX3CL1, além de LPS de E. coli e CpGDNA. De maneira
contrastante, o LPS de P. gingivalis diminuiu esta produção. O fenômeno se confirma
14
Introdução e Síntese Bibliográfica
quando P. gingivalis na forma íntegra morta por calor foi utilizada como estímulo:
enquanto a produção de IL-8/CXCL8 aumentou, a de CXCL12 diminuiu.
Com relação à produção de MIP-1α/CCL3, OGURA et al.44, 2005, relatam
presença tão discreta desta quimiocina no sobrenadante das células em cultura, que
chega a estar próxima ao nível limite de detecção em fibroblastos de ATM humana.
Os trabalhos buscados na literatura mostram ser cada vez mais evidente o fato de
que fibroblastos constituem uma família heterogênea de células. Diversos relatos têm
documentado diferenças tanto em características fenotípicas como funcionais em
fibroblastos originados em diferentes sítios anatômicos (BROUTY-BOYE et al.79, 2000,
HATAKEYAMA et al.63, 2003). A produção de quimiocinas por fibroblastos de tecido
hematopoiético da medula óssea, baço mielometaplástico, pulmão fetal e adulto e tecido
brônquico distal a tumor, estroma metastático de melanoma de pulmão, tecido de mama
e carcinoma de mama foi estudada por BROUTY-BOYÉ et al.79, 2000, comparando as
células de acordo com o tecido de origem. Uma grande, porém variável quantidade de
IL-8/CXCL8, SDF-1/CXCL12, MCP-1/CCL2 e eotaxina/CCL11 foram analisadas por
RT-PCR. Ao analisar as respostas de fibroblastos provenientes da gengiva e do
ligamento periodontal, HATAKEYAMA et al.63, 2003, mostraram que num mesmo
indivíduo, os fibroblastos gengivais expressaram mais CD14 do que os fibroblastos de
ligamento periodontal. Os fibroblastos de gengiva também produziram quantidades
mais elevadas de IL-8/CXCL8 quando estimulados por LPS de Salmonella enterica do
que as células do ligamento periodontal, que de uma maneira geral mostraram-se mais
responsivas ao estímulo por peptidoglicana e muramilpeptídeo (componentes da parede
celular de bactérias gram-positivas). A expressão de TLR2 se mostrou mais intensa nos
fibroblastos de ligamento periodontal enquanto a de TLR4 foi muito semelhante para
ambas células. Estes achados conjuntos contribuem para o crescente interesse do estudo
de fibroblastos oriundos de diferentes regiões anatômicas incluindo os microambientes
existentes na cavidade bucal. Neste contexto, o comportamento dos fibroblastos
pulpares dentro da resposta imune inata e inflamatória se torna necessário e justificável.
A relevância dos fibroblastos no contexto de inflamação pulpar
A polpa dental vem sendo objeto de estudo não apenas pelas implicações
clínicas dos seus processos patológicos, mas também tem-se observado notável
interesse por este tecido devido a fatores específicos como sua localização interna a um
Introdução e Síntese Bibliográfica
15
tecido duro com paredes inflexíveis, seu suprimento vascular particular e dinâmica
celular, que juntos levam a um interesse crescente pela resposta que a polpa exerce a
agressões, especialmente infecções bacterianas (GOODIS2, 2002). A literatura tem
elucidado o comportamento dos odontoblastos na resposta imune inata da polpa como
primeira linha de defesa no processo de cárie tanto com relação à capacidade de
reconhecimento de antígeno como de recrutamento de células de defesa por meio da
produção de quimiocinas (BOTERO et al.74, 2003, BOTERO et al.62, 2006, DURAND
et al.67, 2006). No entanto, pelo fato dos fibroblastos serem as células mais numerosas a
povoarem o tecido pulpar, a sua participação na resposta imune e inflamação deste
tecido podem exercer um papel de fundamental importância (CHIEGO JR1, 2002).
Além disso, a literatura apresenta evidências inequívocas de que fibroblastos não
constituem um grupo único de células, mas sim um grupo com uma vasta variedade em
relação à forma, proliferação, expressão de receptores de membrana, função, além de
outras características (BROUTY-BOYE et al.79, 2000, HATAKEYAMA et al.63, 2003.
Tendo em vista que em processos inflamatórios, de maneira geral, as quimiocinas
exercem papel fundamental no recrutamento de células de defesa, torna-se também de
interesse significativo o estudo da liberação delas por fibroblastos da polpa mediante
agressão por microrganismos freqüentemente vinculados a infecções endodônticas
como no caso do Enterococcus faecalis. O estudo da possibilidade de recrutamento de
células de defesa (produção de quimiocinas) por fibroblastos dentro do contexto de
inflamação pulpar torna-se verdadeiramente necessário, uma vez que os fenômenos da
inflamação não ocorrem da mesma maneira em todos os sítios preenchidos por tecido
conjuntivo (RAVANTI et al.80, 1999, BARKHORDAR et al.26, 2002, MARTINEZ;
ARAUJO81, 2004).
16
Introdução e Síntese Bibliográfica
Proposição
19
2 Proposição
Justificativa: devido à importância dos fenômenos presentes na inflamação do
tecido pulpar, existe a necessidade de conhecê-los em detalhes uma vez que a
inflamação não ocorre por igual em todos os tecidos conjuntivos do organismo. Pela
predominância numérica dos fibroblastos no tecido pulpar e pelos recentes relatos
acerca da capacidade destas células em responderem a estímulos externos por meio da
liberação de diversas citocinas, dentre elas quimiocinas, que por sua vez desempenham
importante função na formação do infiltrado inflamatório, o presente trabalho teve como
objetivos:
ƒ
Avaliar a capacidade de fibroblastos de polpa dental humana em cultura quanto
à produção das quimiocinas MIP-1α/CCL3 e SDF-1/CXCL12.
ƒ
Avaliar a liberação das quimiocinas MIP-1α/CCL3 e SDF-1/CXCL12 por
fibroblastos de polpa dental humana em cultura quando estimulados por
Enterococcus faecalis inativado por calor, em diferentes quantidades de
bactérias por fibroblasto e em diferentes períodos de estimulação.
Material e Métodos
23
3 Material e Métodos
3.1 Coleta do Tecido Pulpar
O dente recentemente extraído (terceiro molar hígido) de um paciente livre de
doenças sistêmicas foi obtido no Laboratório de Fisiologia e Farmacologia Clínica da
FOB/USP. O dente foi doado pelo paciente em formulário específico devidamente
aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da FOB/USP (Processo no 131/2005). Após
remoção do ligamento periodontal e desinfecção do dente com solução de gluconato de
clorexidina 0,12% (Colgate – Palmolive Ind. e Com. LTDA, São Paulo, Brasil), o
armazenamento foi feito em soro fisiológico até sua utilização para a extração do tecido
pulpar. Um sulco transversal com ponta diamantada (#2200, KG Sorensen, São Paulo,
Brasil) foi realizado na região da junção amelocementária em toda a circunferência do
dente. Com a ajuda de dois alveolótomos, o dente foi fraturado e aberto em condições
assépticas, removendo-se assim sua polpa, a qual foi imediatamente imersa em meio de
cultura Dulbecco´s modified Eagle´s medium (DMEM) (Gibco, Invitrogen Corporation,
Califórnia, EUA) e acondicionada em placa de Petri de 100x10 mm (diâmetro x altura).
3.2 Cultura dos Fibroblastos
Os tecidos provenientes da polpa foram picotados com lâmina de bisturi no 15
(BD, São Paulo, Brasil) permanecendo imersos em meio de cultura DMEM
suplementado com soro bovino fetal 10% (Cultilab, Campinas, Brasil), penicilina 100
µg/mL, estreptomicina 100µg/mL e anfotericina B 0,5 mg/mL (Invitrogen, Califórnia,
EUA). Os fragmentos de polpa foram centrifugados e armazenados em novo meio de
cultura e mantidos em estufa a 37ºC e a 5% CO2. As culturas foram mantidas até os
fibroblastos alcançarem confluência com troca de meio a cada 2-3 dias. Após
confluência, os fibroblastos foram tripsinizados e a utilização das células ocorreu entre a
4a e a 8a passagens. O treinamento para a obtenção de cultura primária de fibroblastos a
partir de tecidos bucais foi realizado no Laboratório de Farmacologia da Faculdade de
Odontologia de Araçatuba (UNESP) sob orientação da Profa Dra Sandra Helena Penha
de Oliveira.
24
Material e Métodos
3.3 Preparo do Enterococcus faecalis morto por calor
A cepa de Enterococcus faecalis ATCC 29212 foi obtida do Laboratório de
Microbiologia e Imunologia, Departamento de Ciências Biológicas, da FOB/USP. Os
microrganismos foram reativados em meio BHI (brain heart infusion) (Difco, Detroit,
MI, USA) até atingirem crescimento exponencial. Os tubos de ensaio contendo as
bactérias foram aquecidos a 80ºC por 30 minutos conforme protocolo descrito por Noel
et al.82, 1995. Uma alíquota de 100µL foi semeada em BHI estéril para comprovar a
eficácia do processo. Estas culturas foram centrifugadas a 4.000 rpm por 20min em
temperatura ambiente e lavadas por 2 vezes em PBS (fosfato tamponado em salina),
ressuspensas em meio DMEM e diluídas para o uso. Ainda em PBS, foi realizada a
contagem das bactérias com o auxílio de um espectrofotômetro (Ultrospec 1000,
Pharmacia Biotech, Westerville, EUA) no comprimento de onda de 530nm tomando
como curva padrão a escala de Mc Farland (BIER83, 1985).
3.4 Estimulação dos Fibroblastos Pulpares por Enterococcus faecalis morto por calor
Os fibroblastos foram distribuídos em placas de 24 poços na concentração de 5 x
104 células por poço e deixados para aderirem até atingirem confluência. As células
foram mantidas em incubadora a 37ºC com 5% de CO2. O meio de cultura contendo E.
faecalis morto na proporção de 1:1, 10:1 e 100:1 bactérias:fibroblasto foi adicionado às
placas em duplicata. Após 1, 6 e 24 h, o sobrenadante das células foi coletado e
armazenado para a dosagem de quimiocinas por ensaio imunoenzimático (ELISA).
3.5 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbant Assay)
A
produção
de
MIP-1α/CCL3e
SDF-1/CXCL12
extracelular
foram
quantificadas usando-se o método de ensaio imunoenzimático (ELISA). Placas de 96
poços foram recobertas e incubadas durante 15-18h a 4ºC, com anticorpos anti-MIP-1α
(Anti-human CCL3/MIP-1α Antibody – AF-270-NA – R&D Systems, Minneapolis,
EUA) ou anti-SDF-1 (Monoclonal Anti-human/mouse CXCL12/SDF-1 Antibody –
MAB 350 – R&D Systems, Minneapolis, EUA) diluídos em tampão de fosfato de
cálcio. Após o tempo de incubação, as placas foram lavadas com PBS, contendo Tween
20 0,5% e bloqueadas durante 1 hora, em temperatura ambiente, com PBS contendo
soroalbumina bovina 1%. As placas, então, foram lavadas com PBS e incubadas com os
sobrenadantes das células ou com quantidades conhecidas de MIP-1α/CCL3 ou SDF-
Material e Métodos
25
1/CXCL12 quimiocinas recombinantes (R&D Systems: MIP-1α - 270-LD-010; SDF1α - 350-NS, Minneapolis, EUA) (curvas-padrão) durante 1 h a 40C. Após este período,
as placas foram lavadas com PBS e incubadas com anticorpo biotinilado (Biotinylated
Anti-human CCL3/MIP-1α Antibody – BAF 270 - R&D Systems; Biotinylated Antihuman CXCL12/SDF-1 Antibody – BAF 310 – R&D Systems, Minneapolis) por 30
minutos a 370C. As placas foram lavadas com PBS e o substrato (peróxido de
hidrogênio e tetrametilbenzidina na proporção de 1:1) adicionado conforme as
instruções do fabricante. Após 30 minutos, a solução de paralisação da reação (ácido
sulfúrico 2N) foi adicionada e a leitura foi realizada em espectrofotômetro ajustado para
o comprimento de onda de 490 nm. A obtenção da cultura primária de fibroblastos e sua
manutenção, bem como a manipulação do microrganismo e ainda a execução dos
experimentos de estímulo dos fibroblastos e ELISA foram realizados no Laboratório de
Microbiologia e Imunologia, Departamento de Ciências Biológicas, da FOB/USP sob
orientação da Profa Dra Ana Paula Campanelli.
3.6 Análise Estatística
A análise estatística foi realizada por meio do teste Kruskal-Wallis seguido de
pós-teste de Miller. Foi adotado nível de significância de 5% para que as diferenças
fossem consideradas estatisticamente significativas. Para esta análise, contamos com a
colaboração do Prof. Dr. José Roberto Pereira Lauris, docente da disciplina de
Bioestatística da FOB/USP.
Este trabalho contou com financiamento da Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado de São Paulo por meio de auxílio a pesquisa (Processo FAPESP 05/60167-0)
em nome do orientador Prof. Dr. Carlos Ferreira dos Santos.
26
Material e Métodos
Resultados
29
4 Resultados
4.1 Cultura dos fibroblastos
A técnica de cultura primária de fibroblastos a partir da extração do tecido
proveniente de polpa dental humana se mostrou passível de reprodução durante a
execução deste trabalho. Para tanto, os protocolos experimentais foram adaptados para
que fosse viável a estabilização da cultura de fibroblastos a partir de tecido humano, ao
invés do uso de tecido proveniente de rato ou camundongo, que representam espécies
tastante utilizadas para experimentos desta natureza. Adaptações também foram
necessárias para que a extração da polpa fosse realizada de maneira asséptica e a tempo
das células não sofrerem necrose após a extração dos dentes.
Seguem, a seguir, fotografias dos fibroblastos pulpares de acordo com o tempo
de cultura (visualização em microscópio óptico invertido).
30
Resultados
Resultados
31
Figura 1: Cultura de fibroblastos de polpa dental humana. A polpa dental de um terceiro molar
foi utilizada para a obtenção de cultura primária de fibroblastos. Em a, b e c, observam-se células
com 15 dias de cultura, antes de formarem confluência. Em d, e e f, fibroblastos com 30 dias de
cultura. Em f, pode ser observado aspecto de confluência. Em g, h e i, fibroblastos de polpa dental
humana com 60 dias de cultura após a 4a passagem. Em i, pode ser observada a ocorrência de
mitose (seta). Visualização em microscópio óptico invertido com aumento de 100x em a, b, d, e e
f, e de 320x em c, g, h e i.
32
Resultados
33
Resultados
4.2 Produção de MIP-1α/CCL3 por ELISA
A produção de MIP-1α/CCL3 pelas células em cultura foi detectada por ELISA
a partir da análise do sobrenadante das células em cultura. Os fibroblastos de polpa
dental humana foram estimulados por Enterococcus faecalis morto por calor nas
proporções de 1 bactéria por fibroblasto (EF1:1), 10 bactérias por fibroblasto (EF10:1) e
100 bactérias por fibroblasto (EF100:1) nos tempos experimentais de 1, 6 e 24 h. Foram
utilizadas como controle células não submetidas a estímulo (CLE). A produção de MIP1α/CCL3 pelos fibroblastos pulpares pôde ser constatada por ELISA e a resposta dos
fibroblastos frente a este estímulo variou de acordo com sua concentração (Figuras 2 e
3). Enquanto no grupo controle a produção de quimiocina parece se acumular no meio
de cultura ao longo das 24 h, nas concentrações de 1:1 e 100:1 bactérias:fibroblasto, a
produção maior ocorreu logo na primeira hora de estímulo, diminuindo nos períodos
seguintes, e chegando a zero no caso da concentração mais elevada de bactérias. Com o
estímulo de 10:1 bactérias:fibroblasto, a produção desta quimiocina aumentou
gradativamente ao longo do período experimental. A análise estatística por meio do
teste Kruskal-Wallis, entretanto, não mostrou diferença estatisticamente significativa
entre os grupos. As médias e erros-padrão seguem na tabela abaixo:
Tabela 1: Médias e erros-padrão das médias (média ± EPM) referentes aos valores de
produção de MIP-1α/CCL3 por fibroblastos de polpa dental humana estimulados por
Enterococcus faecalis inativado por calor nas proporções de 1:1, 10:1 e 100:1
bactérias:fibroblasto nos tempos experimentais de 1, 6 e 24 h. Valores de controle
(CLE) são relativos ao grupo sem estímulo (n=3).
1h
6h
24 h
CLE
2,55 ± 1,84
1,49 ± 1,23
7,19 ± 0,84
EF1:1
8,48 ± 0,93
1,43 ± 0,08
2,48 ± 2,31
EF10:1
0,94 ± 0,32
2,04 ± 2,04
6,28 ± 3,16
EF100:1
7,25 ± 3,62
4,23 ± 4,23
0±0
As diferenças não foram consideradas estatisticamente significativas pelo teste Kruskal-Wallis (p>0,05).
34
Resultados
35
Produção de MIP-1alfa (pg/mL)
Resultados
10.0
1h
6h
24 h
7.5
5.0
2.5
0.0
CLE
EF 1:1
EF 10:1
EF 100:1
Produção de MIP-1alfa (pg/mL)
Figura 2: Produção de MIP-1α/CCL3 por fibroblastos de polpa dental humana estimulados
por Enterococcus faecalis inativado por calor. Cultura primária de fibroblastos foi obtida
utilizando-se a polpa de um terceiro molar hígido. Após a 4a passagem, estas células foram
estimuladas por E. faecalis morto por calor em concentrações de 1:1, 10:1 e 100:1
bactérias:fibroblasto. Como controle, foi colocado sobre as células o meio de cultura sem estímulo
(CLE). A análise do sobrenadante por ELISA mostrou que fibroblastos de polpa dental humana
produzem MIP-1α. Os resultados apresentados mostram aumento da produção desta quimiocina ao
longo das 24h nos grupos controle (CLE) e 10:1 bactérias:fibroblasto. Com a adição de E. faecalis
nas proporções 1:1 e 100:1 bactérias:fibroblasto, observa-se tendência de aumento de produção de
MIP-1α logo na 1a hora de estímulo. O teste Kruskal-Wallis não revelou diferenças significativas
entre os grupos experimentais (n=3).
15
10
5
0
CLE
CLE
CLE
EF1:1
EF1:1
EF1:1
1h
6h
24h
1h
6h
24h
EF10:1 EF10:1 EF10:1 EF100:1 EF100:1 EF100:1
1h
6h
24h
1h
6h
24h
Concentração de bactéria e tempo
Figura 3: Valores individuais da produção de MIP-1α/CCL3 por fibroblastos de polpa dental
humana estimulados por Enterococcus faecalis inativado por calor. A detecção de MIP-1α
produzida pelos fibroblastos ocorreu de forma bastante heterogênea mesmo dentro do mesmo
grupo. Grupos controle (CLE) relativos ao grupo experimental sem estímulo. EF1:1, EF10:1 e
EF100:1: grupos experimentais com adição de estímulo nas proporções de 1:1, 10:1 e 100:1
bactérias:fibroblasto, respectivamente. Tempos experimentais de 1, 6 e 24h de contato dos
fibroblastos com o meio de cultura com ou sem estímulo (n=3).
36
Resultados
37
Resultados
4.3 Produção de SDF-1/CXCL12 por ELISA
A produção de SDF-1/CXCL12 também foi avaliada por ELISA. Os
resultados mostram que fibroblastos pulpares em cultura são capazes de produzir esta
quimiocina. Constitutivamente, a produção se mostrou elevada no período experimental
de 24 horas, mas não pôde ser detectada nos períodos anteriores. O estímulo com
Enterococcus faecalis inativado por calor causou aumento da produção de SDF1/CXCL12 na concentração de 1:1 bactéria:fibroblasto no período de 6 h. Ao analisar a
relação número de bactérias com a resposta no período experimental de 24 h, observouse diminuição estatisticamente significativa da produção desta quimiocina com o
aumento da concentração de estímulo bacteriano (p = 0,000655) (Figuras 4 e 5)
Tabela 1: Médias e erros-padrão das médias (média ± EPM) referentes aos valores de
produção de SDF-1/CXCL12 por fibroblastos de polpa dental humana estimulados por
Enterococcus faecalis inativado por calor nas proporções de 1:1, 10:1 e 100:1
bactérias:fibroblasto nos tempos experimentais de 1, 6 e 24 h. Valores de controle
(CLE) são relativos ao grupo sem estímulo (n=4).
1h
6h
24 h
CLE
0±0
0±0
173,00 ± 6,35*
EF1:1
0±0
40,50 ± 23,38
159,00 ± 17,03#
EF10:1
0±0
0±0
22,00 ± 12,70
EF100:1
0±0
0±0
14,00 ± 0&
Diferenças consideradas estatisticamente significativas pelo teste Kruskal-Wallis: * com relação aos
tempos correspondentes à ausência de estímulo (CLE) e ainda com relação às concentrações 10:1 e
100:1 no mesmo período experimental; # com relação ao período de 1h da mesma concentração de
microrganismo(EF1:1) e ainda com relação às concentrações EF10:1 e EF100:1 no mesmo período
experimental; e & com relação aos demais períodos avaliados na mesma concentração de E. faecalis.
38
Resultados
39
Produção de SDF-1 (pg/mL)
Resultados
200
*
1h
6h
24 h
#
100
&
0
CLE
EF 1:1
EF 10:1
EF 100:1
Produção de SDF-1 (pg/mL)
Figura 6: Produção de SDF-1/CXCL12 por fibroblastos de polpa dental humana estimulados
por Enterococcus faecalis inativado por calor. Cultura primária de fibroblastos foi obtida
utilizando-se a polpa de um terceiro molar hígido. Após a 4a passagem, estas células foram
estimuladas por E. faecalis morto por calor em concentrações de 1:1, 10:1 e 100:1
bactérias:fibroblasto. Como controle, foi colocado sobre as células o meio de cultura sem estímulo
(CLE). A análise do sobrenadante por ELISA mostrou que fibroblastos pulpares humanos
produzem SDF-1 constitutivamente. O estímulo com E. faecalis levou à diminuição da produção
desta quimiocina conforme o aumento da concentração de bactérias no período experimental de
24h. Diferenças significativas foram encontradas em * com relação aos tempos correspondentes à
ausência de estímulo e ainda com relação às concentrações 10:1 e 100:1 no mesmo período
experimental; # com relação ao período de 1h da mesma concentração de microrganismo e ainda
com relação às concentrações EF10:1 e EF100:1 no mesmo período experimental; e & com relação
aos demais períodos avaliados na mesma concentração de E. faecalis (n=4).
200
100
0
CLE
CLE
CLE
EF1:1
EF1:1
EF1:1
EF10:1
EF10:1
1h
6h
24h
1h
6h
24h
1h
6h
EF10:1 EF100:1 EF100:1 EF100:1
24h
1h
6h
24h
Concentração de bactéria e tempo
Figura 7: Valores individuais da produção de SDF-1/CXCL12 por fibroblastos de polpa
dental humana estimulados por Enterococcus faecalis inativado por calor. A detecção de SDF1 produzida pelos fibroblastos ocorreu de forma marcante no período de 24 horas. Com a
colocação e aumento da quantidade de bactérias como estímulo, esta produção diminuiu de forma
significativa segundo teste Kruskal-Wallis. Grupos controle (CLE) relativos ao grupo experimental
sem estímulo. EF1:1, EF10:1 e EF100:1: grupos experimentais com adição de estímulo nas
proporções de 1:1, 10:1 e 100:1 bactérias:fibroblasto, respectivamente. Tempos experimentais de
1, 6 e 24h de contato dos fibroblastos com o meio de cultura com ou sem estímulo (n=4).
40
Resultados
Discussão
43
5 Discussão
Os fibroblastos são células que povoam o centro do tecido pulpar e embora não
sejam a primeira linha de defesa deste tecido, como os odontoblastos (DURAND et
al.67, 2006), são as células mais numerosas deste microambiente (CHIEGO JR1, 2002).
Sendo inegável a importância do conhecimento acerca dos fenômenos imunológicos e
inflamatórios que afetam o tecido pulpar, estudar o papel dos fibroblastos neste contexto
torna-se fundamental para o crescimento da ciência na endodontia. Embora haja
evidências inequívocas da participação dos fibroblastos de outros tecidos como derme
(FEDYK et al.59, 2001, TARDIF; ROSS; ROUABHIA75, 2004), articulação têmporomandibular (OGURA et al.44, 2005), ligamento periodontal (YAMAJI et al.29, 1995,
HATAKEYAMA et al.63, 2003) e gengiva (SISMEY-DURRANT; HOPPS27, 1991,
TAKASHIBA et al.78, 1992, TAMURA et al.28, 1992, SUGIYAMA et al.71, 1996,
WANG et al.61, 1998, WANG et al.30, 1999, SUGIYAMA et al.31, 2000, WANG et al.32,
2000, FEDYK et al.59, 2001, SUTHIN et al.70, 2003, TARDIF; ROSS; ROUABHIA75,
2004, GUTIERREZ-VENEGAS et al.76, 2005, HOSOKAWA et al.33, 2005,
MAHANONDA et al.64, 2007, UEHARA; TAKADA34, 2007) nos fenômenos
inflamatórios e imunológicos através da capacidade destas células em produzirem
citocinas, dentre elas quimiocinas, além de outros agentes pró-inflamatórios, a
capacidade destas células oriundas da polpa dental ainda não foi completamente
elucidada (WANG et al.72, 2001, TOKUDA; NAGAOKA; TORII35, 2002, YANG et
al.36, 2003, YANG et al.37, 2003, COIL; TAM; WATERFIELD38, YANG et al.39, 2004).
Estudos com esse objetivo se justificam, uma vez que se considera consagrado o fato de
que fibroblastos não constituem um grupo celular único entre diferentes regiões
anatômicas (BROUTY-BOYE et al.79, 2000). Mais do que isso, fibroblastos oriundos de
regiões diferentes parecem apresentar características fenotípicas também diferentes
(PHIPPS et al.84, 1989) o que faz com que fibroblastos possam ser considerados em
subgrupos de células (PHIPPS et al.84, 1989, BROUTY-BOYE et al.79, 2000), mesmo
quando originados de diferentes tecidos da cavidade bucal (HATAKEYAMA et al.63,
2003).
A escolha da utilização de Enterococcus faecalis como estímulo neste trabalho
deveu-se principalmente à relevância que este microrganismo assume no contexto de
44
Discussão
infecção em endodontia. O destaque que este microrganismo recebe se deve
especialmente à freqüência com que ele é encontrado em lesões refratárias ao
tratamento endodôntico (KAUFMAN et al.10, 2005, SEDGLEY et al.11, 2006,
WILLIAMS et al.12, 2006, ZOLETTI; SIQUEIRA; SANTOS13, 2006). Isso se deve
principalmente à capacidade deste microrganismo em resistir a situações de ambiente
desfavorável ao seu crescimento (FLAHAUT et al.17, 1996). Dentre os fatores de
virulência conhecidos destacam-se a substância de agregação ROZDZINSKI et al.18,
2001, e o ácido lipoteicóico (SIGNORETTO et al.22, 2000.
A escolha por estruturas isoladas da parede celular de bactérias como estímulo
para células é amplamente utilizada na literatura por simplificar a análise e atividade
destes componentes como no caso de ácido lipoteicóico, peptidoglicanas, dentre outros.
No entanto, a atividade destas estruturas pode ser modificada de maneira importante
pela arquitetura e composição da parede celular em sua forma completa (NOEL et al.82,
1995). Em bactérias gram-positivas, como o Enterococcus faecalis, alguns
componentes, como o ácido lipoteicóico, estão localizados no interior da parede celular,
ao contrário do LPS em bactérias gram-negativas, o qual se localiza externamente à
parede celular (SHOCKMAN; BARRET85, 1983). O modelo de estímulo com o
microrganismo intacto inativado por calor tem sido utilizado por diversos autores e tem
como vantagem principal considerar a virulência do microrganismo em seu estado
íntegro (NOEL et al.82, 1995, SUGIYAMA et al.31, 2000, HOSOKAWA et al.33, 2005).
Dada a importância de se conhecer mais sobre o papel dos fibroblastos no
contexto de inflamação do microambiente pulpar, o presente estudo procurou investigar
a capacidade dos fibroblastos pulpares produzirem in vitro duas quimiocinas: MIP1α/CCL3 e SDF-1/CXCL12. Nossos dados mostram que constitutivamente estas células
foram capazes de produzir pequenas quantidades de MIP-1α, as quais aparentemente se
acumularam ao longo dos períodos experimentais. Com o desafio antigênico
proporcionado por Enterococcus faecalis morto por calor, a produção desta quimiocina
pelas células foi alterada. Embora estatisticamente as diferenças observadas não tenham
sido significativas, podemos sugerir uma tendência de aumento da produção de MIP1α/CCL3 na primeira hora de contato dos fibroblastos com o estímulo na proporção 1:1
e 100:1 bactérias:fibroblasto, sendo que nos períodos experimentais seguintes essa
produção tende a diminuir chegando a 0 na concentração mais elevada de bactérias. A
produção de MIP-1α/CCL3 induzida pelo estímulo na razão de 10 bactérias:fibroblasto
Discussão
45
apresentou perfil de aumento gradativo ao longo do período experimental de 24 h, de
certa forma semelhante ao ocorrido sem estímulo. Pelo nosso conhecimento, não
existem relatos na literatura acerca da produção de MIP-1α/CCL3 por fibroblastos de
polpa dental humana. O relato da produção de uma quimiocina pertencente ao grupo de
proteína inflamatória para macrófago em polpas inflamadas foi realizado por
NAKANISHI et al.86, 2005, por meio de imunohistoquímica. A marcação para MIP3α/CCL20 pôde ser localizada em monócitos/macrófagos CD68-positivos acumulados
de forma ajdacente à lesão cariosa; em contrapartida, esta quimiocina foi marcada de
maneira escassa no tecido pulpar normal. Fibroblastos sinoviais da ATM humana foram
capazes de produzir MIP-1α/CCL3 mas em níveis muito próximos ao limite inferior de
detecção por ELISA (OGURA et al.44, 2005). Sendo assim, nossos achados podem
contribuir para o conhecimento da participação dos fibroblastos na imunidade e
inflamação da polpa dental por meio da síntese de MIP-1α/CCL3, uma quimiocina com
participação tanto na resposta imune inata como adaptativa. Conforme observado, a
intensidade do estímulo agressor pode levar a diferentes perfis de produção de
quimiocina por estas células.
A produção aumentada de citocinas e quimiocinas por fibroblastos em
decorrência de desafio microbiano tem sido documentada na literatura. HOSOKAWA et
al.33, 2005, mostraram um aumento na produção de IL-8/CXCL8 por fibroblastos
gengivais estimulados por Porphyromonas gingivalis morta por calor. Utilizando como
estímulo o sobrenadante de bactérias, três trabalhos distintos de um mesmo grupo
demonstraram que em fibroblastos pulpares há indução da expressão de mRNA para IL8/CXCL8 (YANG et al.36, 2003), IL-6 (YANG et al.37, 2003) e VEGF (YANG et al.39,
2004), sendo que o mRNA para estes três mediadores não havia sido detectado
constitutivamente. Nossos resultados acerca da produção de MIP-1α corroboram o
fenômeno do aumento da produção de citocinas conforme observado por YAMAJI et
al.29, 1995, com o aumento de mRNA de IL-6 por LPS de E. coli e P. gingivalis em
fibroblastos de ligamento periodontal; MAHANONDA et al.64, 2007, com o aumento de
IL-8/CXCL8 por estímulos antigênicos variados em fibroblastos de gengiva; e
UEHARA; TAKADA34, 2007 com o aumento da produção de IL-6, IL-8 e MCP1/CCL2 também por fibroblastos de gengiva.
Com relação à produção de SDF-1/CXCL12, nossos resultados mostraram
produção constitutiva desta quimiocina numa quantidade que pode ser importante para
46
Discussão
manter a homeostasia do tecido pulpar, como já sugerido acerca do tecido periodontal
por HOSOKAWA et al.33, 2005. Com o estímulo bacteriano e seu aumento em
concentração, pudemos observar diminuição gradual, e estatisticamente significativa, da
produção desta quimiocina. Estes dados podem ser considerados relevantes uma vez que
corroboram o fenômeno relatado por HOSOKAWA et al.33, 2005, no qual
Porphyromonas gingivalis morta por calor levou à diminuição na produção de CXCL12
conforme o aumento da concentração de bactérias indicada pela densidade óptica. Por
outro lado, os autores relatam que a produção de IL-8/CXCL8 comportou-se de maneira
contrária, aumentando juntamente com a concentração bacteriana. Utilizando-se de
cultura primária de fibroblastos oriundos da derme e da gengiva, FEDYK et al.59, 2001,
demonstraram haver também produção constitutiva de SDF-1/CXCL12 por fibroblastos
de tecidos diferentes assim como observamos produção constitutiva desta quimiocina
pelos fibroblastos pulpares. No entanto, no estudo daqueles autores, quando as células
foram estimuladas por IL-1α e TNF-α, a produção de CXCL12 foi completamente
inibida, assim como a migração de linfócitos B Nalm-6. Mais uma vez, mediante o
estímulo pelas mesmas citocinas, os fibroblastos foram capazes de secretar quantidades
mais elevadas de IL-8/CXCL8 conforme o aumento da concentração das citocinas IL1α e TNF-1 (FEDYK et al.59, 2001). Os nossos achados, juntamente com os de
HOSOKAWA et al.33, 2005, e FEDYK et al.59, 2001, reforçam a possibilidade de
diminuição da produção de SDF-1/CXCL12 em resposta à infecção.
O fato da produção constitutiva das duas quimiocinas estudadas neste trabalho
ter sido alterada em função da colocação de um microrganismo em contato com os
fibroblastos sugere a possível ocorrência do reconhecimento de antígenos pelas células
em cultura (MAHANONDA et al.64, 2007, UEHARA; TAKADA34, 2007). A
capacidade de reconhecimento de antígenos por fibroblastos, em especial os pulpares,
ainda não foi completamente elucidada. WANG et al.61, 1998, mostraram a presença de
receptores CD14 em fibroblastos gengivais comprovando, ainda, a capacidade destes
receptores em se ligar a LPS de P. gingivalis. O bloqueio com anticorpo anti-CD14
diminuiu, mas não inibiu completamente, a produção de IL-6, o que sugere a presença
deste receptor no reconhecimento de antígenos por fibroblastos gengivais, mas também
de outros receptores não elucidados no estudo. Ao comparar fibroblastos originários da
gengiva e ligamento periodontal de um mesmo indivíduo, HATAKEYAMA et al.63,
2003, mostraram expressão de CD14 significativamente mais elevada por fibroblastos
Discussão
47
de gengiva, expressão de TLR2 discretamente mais elevada por fibroblastos de
ligamento periodontal e expressão semelhante de TLR4 por ambos grupos de célula.
MAHANONDA et al.64, 2007, demonstraram a expressão de receptores TLR em
fibroblastos de gengiva humana. Os receptores expressos foram: TLR1, TLR2, TLR3,
TLR4, TLR5, TLR6 e TLR9. Ligantes específicos para TLRs 2, 3, 4 e 5 levaram ao
aumento significativo da produção de IL-8 por estas células. Em estudo semelhante,
UEHARA; TAKADA34, 2007, demonstraram a expressão de TLR1-9, MD-2, MyD88,
NOD1 e NOD2, (todos moléculas reconhecedoras de antígenos). O estímulo com
ligantes específicos para TLRs 2/6, 3, 4, 7/8, 9 e para NOD1 e NOD2, causou aumento
significativo da produção de IL-6, IL-8 e MCP-1. Estes achados juntos sugerem não
somente a presença destes receptores em fibroblastos, mas também sua relevância
funcional (UEHARA; TAKADA34, 2007). Nas células da polpa dental, a existência de
um destes receptores, TLR4, já foi descrita na camada de odontoblastos de polpas
humanas por JIANG et al.87, 2006. Em células odontoblasto-like e células
indiferenciadas de linhagem murina, BOTERO et al.62, 2006, observaram a expressão
de CD14 e TLR4. Finalmente, vários receptores TLR (TLR1, TLR2, TL3, TLR4,
TLR5, TLR6 e TLR9) foram expressos em odontoblastos humanos em cultura
conforme relatado por DURAND et al.67, 2006. Até o presente, não há relatos da
expressão destes receptores sabidamente capazes de reconhecer antígenos em cultura
primária de fibroblastos de polpa dental humana, mas nossos achados contribuem para
sua futura investigação, o que abre perspectivas para trabalhos futuros.
A produção de SDF-1/CXCL12 presente no período experimental de 24h e
ausente nos períodos anteriores sugere resposta celular mais demorada do que aquela
que desencadeou a produção de MIP-1α/CCL3 ainda na primeira hora de estímulo. A
produção de SDF-1/CXCL12, ao contrário da síntese de MIP-1α/CCL3, pode ter
ocorrido não diretamente em resposta ao reconhecimento do antígeno, mas
indiretamente, se considerarmos a provável produção de outras citocinas inflamatórias
pelos fibroblastos em cultura. A produção de quimiocinas por diversas células e
inclusive por fibroblastos pode ser influenciada por citocinas, resultando tanto no
aumento como na diminuição de sua produção (GOUWY et al.88, 2005). Fibroblastos de
gengiva humana aumentaram a produção de IL-8 com estímulo por IL-1β e TNF-α
conforme estudo de TAKASHIBA et al.78, 1992. Em fibroblastos sinoviais da ATM,
TNF-α mostrou ser capaz de aumentar a produção de IL-8/CXCL8, GRO-α/CXCL1,
48
Discussão
MCP-1/CCL2 e RANTES/CCL5. Entretanto, a produção de MIP-1α/CCL3, MIP1β/CCL4 e SDF-1α/CXCL12 permaneceram muito baixas mesmo mediante incubação
com TNF-1α (OGURA et al.44, 2005). De forma contrária, FEDYK et al.59, 2001,
demonstraram que TNF-α e IL-1β diminuíram a produção de SDF-1/CXCL12 por
fibroblastos de gengiva e derme humanas. No mesmo estudo, estas citocinas
desencadearam aumento da produção de IL-8/CXCL8 e MCP-1/CCL2. Embora nosso
estudo não tenha investigado a possível interferência de citocinas na produção de SDF1/CXCL12 pelos fibroblastos pulpares, não podemos descartar a possibilidade de
ocorrência de produção e consumo de citocinas pelos fibroblastos, o que pode ter
levado, por meio delas, à estimulação das células culminando na síntese de SDF1/CXCL12. Pelo fato de haver relatos de diminuição na produção de SDF-1/CXL12
tanto por estímulo com bactéria morta por calor (HOSOKAWA et al.33, 2005) como
pela incubação com citocinas (FEDYK et al.59, 2001), estudos futuros devem ser
delineados para possibilitar melhor compreensão dos mecanismos de sinalização
autócrina, tais como aqueles envolvidos no reconhecimento de antígenos por
fibroblastos de polpa dental humana.
A inflamação do tecido pulpar é um fenômeno que, não raro, leva à perda de
suas estruturas devido ao caráter de irreversibilidade que a pulpite assume conforme se
instalam os fenômenos do processo inflamatório (KOKKAS et al89, 2007). Conhecer as
bases da inflamação pulpar poderá contribuir, a longo prazo, para o avanço e
crescimento da ciência em endodontia. O estudo dos diferentes grupos celulares que
compõem a polpa dental permite conhecer o papel que os mesmos desempenham,
isoladamente, dentro da resposta imune. O presente estudo relata, de maneira inédita, a
capacidade de fibroblastos de polpa dental humana produzirem em cultura as
quimiocinas MIP-1α e SDF-1. Além disso, mostramos que frente ao desafio microbiano
com Enterococcus faecalis, estas células alteraram a produção destas quimiocinas.
Nossos achados demonstram que os fibroblastos, mesmo não compondo a primeira
linha de defesa do tecido pulpar contra os agentes bacterianos da cárie dental,
provavelmente desempenham papel importante dentro da resposta inflamatória da
polpa. Podemos sugerir que os fibroblastos são capazes de recrutar células de defesa,
não se limitando, portanto, a funções estruturais, mas agindo também como verdadeiras
sentinelas do tecido pulpar.
Conclusão
51
6 Conclusão
Nas condições em que este trabalho foi realizado, pode-se concluir que:
Fibroblastos oriundos da polpa dental humana são capazes de produzir MIP-1α e
SDF-1 in vitro constitutivamente. Esta produção se alterou em resposta ao desafio por
Enterococcus faecalis inativado por calor.
A concentração de microrganismos parece induzir respostas diferentes quanto à
produção destas quimiocinas; pois os fibroblastos demonstraram uma tendência para o
aumento da produção de MIP-1α enquanto a produção de SDF-1 diminuiu com o
aumento da concentração bacteriana. O tempo de estímulo determinou diminuição da
produção de MIP-1α nas concentrações mais baixa e mais elevada, enquanto no grupo
controle e na concentração intermediária de bactérias, a quimiocina parece se acumular
no sobrenadante. A produção de SDF-1 só pôde ser detectada no período experimental
de 24h, o que sugere a participação de vias autócrinas envolvidas na síntese desta
quimiocina.
Referências Bibliográficas
55
Referências bibliográficas
1.
Chiego Jr. D. Histology of the pulp. In: Avery J, editor. Oral development and
histology. 3rd ed. ed. Stuttgart: Georg Thieme Verlag; 2002. p. 190-212.
2.
Goodis H. History of pulp biology. In: Hargreaves K, Goodis H, editors. Seltzer
and Bender´s Dental Pulp. 1 ed. Carol Stream: Quintessence publishing co.; 2002. p. 111.
3.
Okiji T. Pulp as a connective tissue. In: Hargreaves K, Goodis H, editors. Seltzer
and Bender´s Dental Pulp. Carol Stream: Quintessence Publishing Co.; 2002. p. 95-122.
4.
Takashiba S, Naruishi K, Murayama Y. Perspective of cytokine regulation for
periodontal treatment: fibroblast biology. J Periodontol 2003;74(1):103-10.
5.
Trowbridge H. Histology of pulpal inflamation. In: Hargreaves K, Goodis H,
editors. Seltzer and Bender´s Dental Pulp. Carol Stream: Quintessence publishing Co.;
2002. p. 227-245.
6.
Love RM, Jenkinson HF. Invasion of dentinal tubules by oral bacteria. Crit Rev
Oral Biol Med 2002;13(2):171-83.
7.
Martin FE, Nadkarni MA, Jacques NA, Hunter N. Quantitative microbiological
study of human carious dentine by culture and real-time PCR: association of anaerobes
with histopathological changes in chronic pulpitis. J Clin Microbiol 2002;40(5):1698704.
8.
Kakehashi S, Stanley HR, Fitzgerald RJ. The Effects of Surgical Exposures of
Dental Pulps in Germ-Free and Conventional Laboratory Rats. Oral Surg Oral Med Oral
Pathol 1965;20:340-9.
9.
Moller AJ, Fabricius L, Dahlen G, Sundqvist G, Happonen RP. Apical
periodontitis development and bacterial response to endodontic treatment. Experimental
root canal infections in monkeys with selected bacterial strains. Eur J Oral Sci
2004;112(3):207-15.
10.
Kaufman B, Spangberg L, Barry J, Fouad AF. Enterococcus spp. in
endodontically treated teeth with and without periradicular lesions. J Endod
2005;31(12):851-6.
11.
Sedgley C, Nagel A, Dahlen G, Reit C, Molander A. Real-time quantitative
polymerase chain reaction and culture analyses of enterococcus faecalis in root canals. J
Endod 2006;32(3):173-7.
12.
Williams JM, Trope M, Caplan DJ, Shugars DC. Detection and Quantitation of
E. faecalis by Real-time PCR (qPCR), Reverse Transcription-PCR (RT-PCR), and
Cultivation During Endodontic Treatment. J Endod 2006;32(8):715-21.
56
Referências Bibliográficas
13.
Zoletti GO, Siqueira JF, Jr., Santos KR. Identification of Enterococcus faecalis
in Root-filled Teeth With or Without Periradicular Lesions by Culture-dependent andIndependent Approaches. J Endod 2006;32(8):722-6.
14.
Jett BD, Huycke MM, Gilmore MS. Virulence of enterococci. Clin Microbiol
Rev 1994;7(4):462-78.
15.
Sedgley CM, Lennan SL, Clewell DB. Prevalence, phenotype and genotype of
oral enterococci. Oral Microbiol Immunol 2004;19(2):95-101.
16.
Sedgley C, Buck G, Appelbe O. Prevalence of Enterococcus faecalis at multiple
oral sites in endodontic patients using culture and PCR. J Endod 2006;32(2):104-9.
17.
Flahaut S, Hartke A, Giard JC, Benachour A, Boutibonnes P, Auffray Y.
Relationship between stress response toward bile salts, acid and heat treatment in
Enterococcus faecalis. FEMS Microbiol Lett 1996;138(1):49-54.
18.
Rozdzinski E, Marre R, Susa M, Wirth R, Muscholl-Silberhorn A. Aggregation
substance-mediated adherence of Enterococcus faecalis to immobilized extracellular
matrix proteins. Microb Pathog 2001;30(4):211-20.
19.
728.
Linde A, Goldberg M. Dentinogenesis. Crit Rev Oral Biol Med 1993;4(5):679-
20.
Bystrom A, Claesson R, Sundqvist G. The antibacterial effect of camphorated
paramonochlorophenol, camphorated phenol and calcium hydroxide in the treatment of
infected root canals. Endod Dent Traumatol 1985;1(5):170-5.
21.
Distel JW, Hatton JF, Gillespie MJ. Biofilm formation in medicated root canals.
J Endod 2002;28(10):689-93.
22.
Signoretto C, Lleo MM, Tafi MC, Canepari P. Cell wall chemical composition
of Enterococcus faecalis in the viable but nonculturable state. Appl Environ Microbiol
2000;66(5):1953-9.
23.
Oliver JD. The viable but nonculturable state in bacteria. J Microbiol 2005;43
Spec No:93-100.
24.
Ginsburg I. Role of lipoteichoic acid in infection and inflammation. Lancet
Infect Dis 2002;2(3):171-9.
25.
Chan CP, Lan WH, Chang MC, Chen YJ, Lan WC, Chang HH, et al. Effects of
TGF-beta s on the growth, collagen synthesis and collagen lattice contraction of human
dental pulp fibroblasts in vitro. Arch Oral Biol 2005;50(5):469-79.
26.
Barkhordar RA, Ghani QP, Russell TR, Hussain MZ. Interleukin-1beta activity
and collagen synthesis in human dental pulp fibroblasts. J Endod 2002;28(3):157-9.
Referências Bibliográficas
57
27.
Sismey-Durrant HJ, Hopps RM. Effect of lipopolysaccharide from
Porphyromonas gingivalis on prostaglandin E2 and interleukin-1-beta release from rat
periosteal and human gingival fibroblasts in vitro. Oral Microbiol Immunol
1991;6(6):378-80.
28.
Tamura M, Tokuda M, Nagaoka S, Takada H. Lipopolysaccharides of
Bacteroides intermedius (Prevotella intermedia) and Bacteroides (Porphyromonas)
gingivalis induce interleukin-8 gene expression in human gingival fibroblast cultures.
Infect Immun 1992;60(11):4932-7.
29.
Yamaji Y, Kubota T, Sasaguri K, Sato S, Suzuki Y, Kumada H, et al.
Inflammatory cytokine gene expression in human periodontal ligament fibroblasts
stimulated with bacterial lipopolysaccharides. Infect Immun 1995;63(9):3576-81.
30.
Wang PL, Shirasu S, Shinohar M, Azuma Y, Daito M, Yasuda H, et al. IL-10
inhibits Porphyromonas gingivalis LPS-stimulated human gingival fibroblasts
production of IL-6. Biochem Biophys Res Commun 1999;263(2):372-7.
31.
Sugiyama A, Ogawa T, Daikuhara Y, Takada H. Enhancement of hepatocyte
growth factor (scatter factor) production by human gingival fibroblasts in culture
stimulated with Porphyromonas gingivalis fimbriae. J Med Microbiol 2000;49(4):31925.
32.
Wang PL, Azuma Y, Shinohara M, Ohura K. Toll-like receptor 4-mediated
signal pathway induced by Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide in human
gingival fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun 2000;273(3):1161-7.
33.
Hosokawa Y, Hosokawa I, Ozaki K, Nakae H, Murakami K, Miyake Y, et al.
CXCL12 and CXCR4 expression by human gingival fibroblasts in periodontal disease.
Clin Exp Immunol 2005;141(3):467-74.
34.
Uehara A, Takada H. Functional TLRs and NODs in Human Gingival
Fibroblasts. J Dent Res 2007;86(3):249-54.
35.
Tokuda M, Nagaoka S, Torii M. Interleukin-10 inhibits expression of
interleukin-6 and -8 mRNA in human dental pulp cell cultures via nuclear factorkappaB deactivation. J Endod 2002;28(3):177-80.
36.
Yang LC, Huang FM, Lin CS, Liu CM, Lai CC, Chang YC. Induction of
interleukin-8 gene expression by black-pigmented Bacteroides in human pulp
fibroblasts and osteoblasts. Int Endod J 2003;36(11):774-9.
37.
Yang LC, Tsai CH, Huang FM, Liu CM, Lai CC, Chang YC. Induction of
interleukin-6 gene expression by pro-inflammatory cytokines and black-pigmented
Bacteroides in human pulp cell cultures. Int Endod J 2003;36(5):352-7.
38.
Coil J, Tam E, Waterfield JD. Proinflammatory cytokine profiles in pulp
fibroblasts stimulated with lipopolysaccharide and methyl mercaptan. J Endod
2004;30(2):88-91.
58
Referências Bibliográficas
39.
Yang LC, Tsai CH, Huang FM, Su YF, Lai CC, Liu CM, et al. Induction of
vascular endothelial growth factor expression in human pulp fibroblasts stimulated with
black-pigmented Bacteroides. Int Endod J 2004;37(9):588-92.
40.
Ollier WE. Cytokine genes and disease susceptibility. Cytokine 2004;28(45):174-8.
41.
Abbas A, Lichtman A. Cytokines. In: Abbas A, Lichtman A, editors. Cellular
and molecular immunology. 5th ed. ed. Philadelphia: Saunders; 2003. p. 243-274.
42.
Zlotnik A, Yoshie O. Chemokines: a new classification system and their role in
immunity. Immunity 2000;12(2):121-7.
43.
Schall TJ, Bacon K, Camp RD, Kaspari JW, Goeddel DV. Human macrophage
inflammatory protein alpha (MIP-1 alpha) and MIP-1 beta chemokines attract distinct
populations of lymphocytes. J Exp Med 1993;177(6):1821-6.
44.
Ogura N, Tobe M, Sakamaki H, Nagura H, Abiko Y, Kondoh T. Tumor necrosis
factor-alpha increases chemokine gene expression and production in synovial
fibroblasts from human temporomandibular joint. J Oral Pathol Med 2005;34(6):35763.
45.
Dieu-Nosjean MC, Vicari A, Lebecque S, Caux C. Regulation of dendritic cell
trafficking: a process that involves the participation of selective chemokines. J Leukoc
Biol 1999;66(2):252-62.
46.
Nagaoka S, Tokuda M, Sakuta T, Taketoshi Y, Tamura M, Takada H, et al.
Interleukin-8 gene expression by human dental pulp fibroblast in cultures stimulated
with Prevotella intermedia lipopolysaccharide. J Endod 1996;22(1):9-12.
47.
Choe H, Farzan M, Sun Y, Sullivan N, Rollins B, Ponath PD, et al. The betachemokine receptors CCR3 and CCR5 facilitate infection by primary HIV-1 isolates.
Cell 1996;85(7):1135-48.
48.
Baggiolini M, Dewald B, Moser B. Human chemokines: an update. Annu Rev
Immunol 1997;15:675-705.
49.
Rollins BJ. Chemokines. Blood 1997;90(3):909-28.
50.
Menten P, Wuyts A, Van Damme J. Macrophage inflammatory protein-1.
Cytokine Growth Factor Rev 2002;13(6):455-81.
51.
Maurer M, von Stebut E. Macrophage inflammatory protein-1. Int J Biochem
Cell Biol 2004;36(10):1882-6.
52.
Bonecchi R, Polentarutti N, Luini W, Borsatti A, Bernasconi S, Locati M, et al.
Up-regulation of CCR1 and CCR3 and induction of chemotaxis to CC chemokines by
IFN-gamma in human neutrophils. J Immunol 1999;162(1):474-9.
Referências Bibliográficas
59
53.
Bleul CC, Fuhlbrigge RC, Casasnovas JM, Aiuti A, Springer TA. A highly
efficacious lymphocyte chemoattractant, stromal cell-derived factor 1 (SDF-1). J Exp
Med 1996;184(3):1101-9.
54.
Shirozu M, Nakano T, Inazawa J, Tashiro K, Tada H, Shinohara T, et al.
Structure and chromosomal localization of the human stromal cell-derived factor 1
(SDF1) gene. Genomics 1995;28(3):495-500.
55.
Aiuti A, Webb IJ, Bleul C, Springer T, Gutierrez-Ramos JC. The chemokine
SDF-1 is a chemoattractant for human CD34+ hematopoietic progenitor cells and
provides a new mechanism to explain the mobilization of CD34+ progenitors to
peripheral blood. J Exp Med 1997;185(1):111-20.
56.
Chan JR, Hyduk SJ, Cybulsky MI. Chemoattractants induce a rapid and transient
upregulation of monocyte alpha4 integrin affinity for vascular cell adhesion molecule 1
which mediates arrest: an early step in the process of emigration. J Exp Med
2001;193(10):1149-58.
57.
Martin C, Burdon PC, Bridger G, Gutierrez-Ramos JC, Williams TJ, Rankin
SM. Chemokines acting via CXCR2 and CXCR4 control the release of neutrophils from
the bone marrow and their return following senescence. Immunity 2003;19(4):583-93.
58.
Dieu MC, Vanbervliet B, Vicari A, Bridon JM, Oldham E, Ait-Yahia S, et al.
Selective recruitment of immature and mature dendritic cells by distinct chemokines
expressed in different anatomic sites. J Exp Med 1998;188(2):373-86.
59.
Fedyk ER, Jones D, Critchley HO, Phipps RP, Blieden TM, Springer TA.
Expression of stromal-derived factor-1 is decreased by IL-1 and TNF and in dermal
wound healing. J Immunol 2001;166(9):5749-54.
60.
Wright SD, Ramos RA, Tobias PS, Ulevitch RJ, Mathison JC. CD14, a receptor
for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding protein. Science
1990;249(4975):1431-3.
61.
Wang PL, Sato K, Oido M, Fujii T, Kowashi Y, Shinohara M, et al. Involvement
of CD14 on human gingival fibroblasts in Porphyromonas gingivalis
lipopolysaccharide-mediated interleukin-6 secretion. Arch Oral Biol 1998;43(9):687-94.
62.
Botero TM, Shelburne CE, Holland GR, Hanks CT, Nor JE. TLR4 mediates
LPS-induced VEGF expression in odontoblasts. J Endod 2006;32(10):951-5.
63.
Hatakeyama J, Tamai R, Sugiyama A, Akashi S, Sugawara S, Takada H.
Contrasting responses of human gingival and periodontal ligament fibroblasts to
bacterial cell-surface components through the CD14/Toll-like receptor system. Oral
Microbiol Immunol 2003;18(1):14-23.
64.
Mahanonda R, Sa-Ard-Iam N, Montreekachon P, Pimkhaokham A,
Yongvanichit K, Fukuda MM, et al. IL-8 and IDO Expression by Human Gingival
Fibroblasts via TLRs. J Immunol 2007;178(2):1151-7.
60
Referências Bibliográficas
65.
Akira S, Uematsu S, Takeuchi O. Pathogen recognition and innate immunity.
Cell 2006;124(4):783-801.
66.
Akira S, Takeda K, Kaisho T. Toll-like receptors: critical proteins linking innate
and acquired immunity. Nat Immunol 2001;2(8):675-80.
67.
Durand SH, Flacher V, Romeas A, Carrouel F, Colomb E, Vincent C, et al.
Lipoteichoic acid increases TLR and functional chemokine expression while reducing
dentin formation in in vitro differentiated human odontoblasts. J Immunol
2006;176(5):2880-7.
68.
Letzelter C, Croute F, Pianezzi B, Roques C, Soleilhavoup JP. Supernatant
cytotoxicity and proteolytic activity of selected oral bacteria against human gingival
fibroblasts in vitro. Arch Oral Biol 1998;43(1):15-23.
69.
Yamasaki M, Nakata K, Imaizumi I, Iwama A, Nakane A, Nakamura H.
Cytotoxic effect of endodontic bacteria on periapical fibroblasts. J Endod
1998;24(8):534-9.
70.
Suthin K, Matsushita K, Machigashira M, Tatsuyama S, Imamura T, Torii M, et
al. Enhanced expression of vascular endothelial growth factor by periodontal pathogens
in gingival fibroblasts. J Periodontal Res 2003;38(1):90-6.
71.
Sugiyama A, Arakaki R, Ohnishi T, Arakaki N, Daikuhara Y, Takada H.
Lipoteichoic acid and interleukin 1 stimulate synergistically production of hepatocyte
growth factor (scatter factor) in human gingival fibroblasts in culture. Infect Immun
1996;64(4):1426-31.
72.
Wang PL, Shirasu S, Daito M, Ohura K. Streptococcus mutans lipoteichoic acidinduced apoptosis in cultured dental pulp cells from human deciduous teeth. Biochem
Biophys Res Commun 2001;281(4):957-61.
73.
Telles PD, Hanks CT, Machado MA, Nor JE. Lipoteichoic acid up-regulates
VEGF expression in macrophages and pulp cells. J Dent Res 2003;82(6):466-70.
74.
Botero TM, Mantellini MG, Song W, Hanks CT, Nor JE. Effect of
lipopolysaccharides on vascular endothelial growth factor expression in mouse pulp
cells and macrophages. Eur J Oral Sci 2003;111(3):228-34.
75.
Tardif F, Ross G, Rouabhia M. Gingival and dermal fibroblasts produce
interleukin-1 beta converting enzyme and interleukin-1 beta but not interleukin-18 even
after stimulation with lipopolysaccharide. J Cell Physiol 2004;198(1):125-32.
76.
Gutierrez-Venegas G, Maldonado-Frias S, Ontiveros-Granados A, KawasakiCardenas P. Role of p38 in nitric oxide synthase and cyclooxygenase expression, and
nitric oxide and PGE2 synthesis in human gingival fibroblasts stimulated with
lipopolysaccharides. Life Sci 2005;77(1):60-73.
77.
Hosokawa Y, Nakanishi T, Yamaguchi D, Nakae H, Matsuo T. Expression of
fractalkine (CX3CL1) and its receptor, CX3CR1, in periodontal diseased tissue. Clin
Exp Immunol 2005;139(3):506-12.
Referências Bibliográficas
61
78.
Takashiba S, Takigawa M, Takahashi K, Myokai F, Nishimura F, Chihara T, et
al. Interleukin-8 is a major neutrophil chemotactic factor derived from cultured human
gingival fibroblasts stimulated with interleukin-1 beta or tumor necrosis factor alpha.
Infect Immun 1992;60(12):5253-8.
79.
Brouty-Boye D, Pottin-Clemenceau C, Doucet C, Jasmin C, Azzarone B.
Chemokines and CD40 expression in human fibroblasts. Eur J Immunol
2000;30(3):914-9.
80.
Ravanti L, Hakkinen L, Larjava H, Saarialho-Kere U, Foschi M, Han J, et al.
Transforming growth factor-beta induces collagenase-3 expression by human gingival
fibroblasts via p38 mitogen-activated protein kinase. J Biol Chem 1999;274(52):37292300.
81.
Martinez EF, Araujo VC. In vitro immunoexpression of extracellular matrix
proteins in dental pulpal and gingival human fibroblasts. Int Endod J 2004;37(11):74955.
82.
Noel RF, Jr., Sato TT, Mendez C, Johnson MC, Pohlman TH. Activation of
human endothelial cells by viable or heat-killed gram-negative bacteria requires soluble
CD14. Infect Immun 1995;63(10):4046-53.
83.
Bier O. Técnicas bacteriológicas. In: Bier O, editor. Microbiologia e Imunologia.
24ª ed. São Paulo: Melhoramentos; 1985. p. 919-998.
84.
Phipps RP, Penney DP, Keng P, Quill H, Paxhia A, Derdak S, et al.
Characterization of two major populations of lung fibroblasts: distinguishing
morphology and discordant display of Thy 1 and class II MHC. Am J Respir Cell Mol
Biol 1989;1(1):65-74.
85.
Shockman GD, Barrett JF. Structure, function, and assembly of cell walls of
gram-positive bacteria. Annu Rev Microbiol 1983;37:501-27.
86.
Nakanishi T, Takahashi K, Hosokawa Y, Adachi T, Nakae H, Matsuo T.
Expression of macrophage inflammatory protein 3alpha in human inflamed dental pulp
tissue. J Endod 2005;31(2):84-7.
87.
Jiang HW, Zhang W, Ren BP, Zeng JF, Ling JQ. Expression of toll like receptor
4 in normal human odontoblasts and dental pulp tissue. J Endod 2006;32(8):747-51.
88.
Gouwy M, Struyf S, Proost P, Van Damme J. Synergy in cytokine and
chemokine networks amplifies the inflammatory response. Cytokine Growth Factor Rev
2005;16(6):561-80.
89.
Kokkas AB, Goulas A, Varsamidis K, Mirtsou V, Tziafas D. Irreversible but not
reversible pulpitis is associated with up-regulation of tumour necrosis factor-alpha gene
expression in human pulp. Int Endod J 2007;40(3):198-203.
62
Referências Bibliográficas
Abstract
65
Abstract
Production of MIP-1alfa and SDF-1 by cultured human dental pulp fibroblasts
challenged by heat killed Enterococcus faecalis
Dental pulp is a connective tissue structure constituted by many different cell
types. Among them, the fibroblasts are the most frequent ones. When challenged by
different aggressive agents, these cells are able to release some substances like
cytokines and chemokines, which are essential to trigger the inflammatory process. The
aims of this study were: 1. to evaluate the ability of fibroblasts to produce the
chemokines MIP-1α/CCL3) and SDF-1/CXCL12; 2. to evaluate the expression of these
chemokines by fibroblasts when challenged by heat killed Enterococcus faecalis in
gradual concentrations and 3. to evaluate the production of these chemokines in a time
course manner. The dental pulp from non-carious third molar was collected from a
healthy patient. Explants were made and stocked in culture medium (DMEM) for
fibroblasts growth. The cells were used since passage four. In a 24-well plate and after
reaching confluence, culture medium alone or containing heat killed E. faecalis at
proportion 1:1, 10:1 and 100:1 bacteria:fibroblast, were added to the fibroblasts. After
1, 6 and 24 hours, the supernatants were collected for analysis. The protein detection of
MIP-1α/CCL3 and SDF-1/CXCL12 was performed by ELISA. For statistical analysis,
data were assessed by Kruskal-Wallis followed by Miller post-test. Significance levels
of 5% were adopted. Production of both chemokines was detected by ELISA. Pulp
fibroblasts were able to produce SDF-1 constitutively. This production decreased with
the increase in the number of heat killed E. faecalis increased (p<0.05). Production of
MIP-1α was detected in unchallenged and challenged cells. The median bacterial
concentration (10:1) presented a profile production similar to that of unstimulated cells.
Bacterial concentrations of 1 and 100 microrganisms/cell showed a highly enhanced
production of MIP-1α at the first hour of stimulum; however, these data were not
statistically significant (p>0.05). Fibroblasts ability to produce chemokines, like MIP1α and SDF-1, confirms their importance at immune and inflammatory events in dental
pulp, specially being fibroblasts the most abundant cells at this microenvironment.
Keywords: Fibroblasts. Chemokines. Inflammation.