NÍVEIS DE EXPRESSÃO DE CD55, CD59 E CD46 EM LINFÓCITOS: UMA
OPORTUNIDADE PARA AUMENTAR A LISE DE LINFÓCITOS T CD20+
MEDIADA POR RITUXIMAB
Bianca Curzio (ME), Ana Carolina Leal, Martin Bonamino
Programa de Medicina Experimental – INCA
RESULTADOS
INTRODUÇÃO
A doença enxerto contra o hospedeiro (DECH) é a principal complicação do transplante
alogeneico de precursores hematopoiéticos e é responsável por altas taxas de
morbidade e mortalidade.
Níveis de expressão de CD55, CD59 e CD46 em linfócitos humanos
Os linfócitos T do doador geram tanto o efeito enxerto contra o hospedeiro quanto o
efeito enxerto contra a leucemia, portanto há a necessidade de se eliminar tardiamente
os linfócitos T, causadores da DECH, o que pode ser realizado através de estratégias
baseadas em genes suicidas.
Já foi mostrado que os níveis de expressão da proteína CD20 nos linfócitos B determinam
a resposta in vitro ao Rituximab (Golay, 2001). A partir desta informação, a expressão
transgênica de CD20 nas células T e a eliminação tardia das mesmas através do uso de
Rituximab foi validada in vitro (Serafini, 2004) e in vivo (Vogler, 2010). A maior limitação
deste sistema é que a CD20 é amplamente expressa em células B e a eliminação
indesejada das mesmas ocorre uma vez que o Rituximab é administrado para depletar as
células T CD20+. As proteínas de membrana CD55, CD59 e CD46 são reguladoras da
cascata do complemento e o bloqueio da atividade de CD55/CD59 resulta no aumento da
lise celular por complemento das células CD20+ na presença de Rituximab (Macor, 2007).
A redução da expressão de CD55, CD59 ou CD46 poderia aumentar a susceptibilidade das
células T CD20+ à lise mediada por Rituximab, permitindo o uso de doses subótimas de
Rituximab que não são capazes de lisar as células B de forma eficaz, poupando pelo
menos parte destas células do paciente ao mesmo tempo em que depletaria de forma
eficaz as células T CD20+ (Figura 1).
Figura 2. Gráfico representativo da avaliação da expressão de CD55, CD59 e CD46 em células B e T por FACS. As células
mononucleares do sangue periférico de 25 doadores foram marcadas com aCD55 ou aCD59 em células CD3+ ou CD20+.
Os níveis de expressão de CD46 foram avaliados através da marcação das células mononucleares do sangue periférico de
8 doadores com aCD46 em células CD3+ ou CD20+.
Lise de linfócitos B de 13 doadores com complemento e Rituximab
Dose subótima
de Rituximab
CONCLUSÃO
Nossos resultados mostram que a expressão de CD55 é significativamente maior em células B do que em
Célula B
não lisada
Célula T
lisada
células T e que a expressão de CD59 e CD46 é significativamente maior em células T do que em células B
(n=25 p<0,05 teste T e n=8 p<0,05 teste T , respectivamente). Observamos que existem dois tipos de
doadores: aqueles cujas células B são mais suscetíveis e aqueles cujas células B são menos suscetíveis à lise
OBJETIVOS
in vitro por Riuximab. Encontramos uma condição subótima (0,25 ìg/ml Rituximab e 10% de soro de coelho)
para a lise mediada por complemento, que permite poupar aproximadamente 40% das células B de
- Verificar os níveis de expressão de CD55, CD59 e CD46 nas células B e T dos doadores;
doadores saudáveis. Vamos avaliar se, sob estas condições, os linfócitos T CD20+ silenciados para CD55,
-Aumentar a eficácia do sistema de gene suicida CD20+/Rituximab através do
silenciamento de CD55, CD59 ou CD46 nas células T Cd20+;
CD59 ou CD46 se tornarão mais suscetíveis à lise mediada por Rituximab do que os linfócitos B
Estas informações podem ser úteis para decidir quais proteínas devem ser silenciadas para que os
- Usar doses subótimas de Rituximab para a eliminação de células T CD20+.
melhores resultados sejam atingidos e sugerem que talvez tratamentos personalizados possam ser
considerados de acordo com os níveis de expressão destas proteínas nos linfócitos de cada doador.
No momento, estamos realizando testes com células Jurkat modificadas para expressar CD20, através do
bloqueio da atividade de CD55 ou CD59 com anticorpos bloqueadores nas células Jurkat CD20+ para
MATERIAL E MÉTODOS
O sangue periférico de 25 doadores saudáveis foi coletado sob consentimento após a
aprovação do comitê de ética do INCA e as células mononucleares periféricas foram
isoladas através de centrifugação por gradiente de densidade usando histopaque. A
expressão de CD55, CD59 e CD46 em células T (CD3+) e células B (CD20+) foi verificada
por citometria de fluxo assim como a expressão de CD20 foi verificada em células B. As
células mononucleares periféricas de 10 doadores, contendo pelo menos 10% de células
B, foram incubadas com concentrações decrescentes de soro de coelho e Rituximab para
encontrar concentrações subótimas para a lise de células B. O percentual de células CD3+
foi avaliado por FACS após os ensaios de lise para que o percentual de células CD20+
pudesse ser estimado. Os shRNAs para CD55, CD59 ou CD46 humanas serão clonados
juntamente com a seqüência do cDNA de CD20 no plasmídeo PT3. O plasmídeo PT3 CD20
shRNA será eletroporado em células Jurkat e será avaliado o impacto do silenciamento na
eficácia da lise das células Jurkat CD20+ na presença de Rituximab através de FACS.
verificarmos se a suscetibilidade das mesmas à lise por Rituximab aumentará.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Golay J et al. Biologic response of B lymphoma cells to anti-CD20 monoclonal antibody rituximab in vitro: CD55 and CD59
regulate complement-mediated cell lysis. Blood 2000;95(12):3900-3908.
Macor P et al. In vivo Targeting of Human Neutralizing Antibodies against CD55 and CD59 to Lymphoma Cells Increases the
Antitumor Activity of Rituximab. Cancer Research 2007;67(21):10556-10563.
Serafini M et al. Elongation factor 1 (EF1a) promoter in a lentiviral backbone improves expression of the CD20 suicide gene
in primary T lymphocytes allowing efficient rituximab-mediated lysis. Haematologica 2004;89:86-95.
Vogler I et al. An improved bicistronic CD20/tCD34 vector for efficient purification and in vivo depletion of genemodified T cells for adoptive immunotherapy. Mol Ther. 2010;18(7):1330-8.
SUPORTE FINANCEIRO
CNPq – Instituto do Milênio Terapia Gênica, FAPERJ e
Fundação do Câncer - INCA.
Projeto Gráfico: Serviço de Edição e Informação Técnico-Científica / CEDC / INCA
Figura 3. Gráfico representativo da lise in vitro dos linfócitos totais de 13 doadores. Os linfócitos foram incubados com 10%
de soro de coelho como fonte de complemento e 0,25 ug/mL ou 1,25 ug/mL de Rituximab por 2 horas a 37ºC. Após a lise, as
células foram marcadas com aCD3 e o percentual de células CD20+ foi calculado e normalizado baseado no percentual de
células CD3+. Dois grupos diferentes de doadores foram observados: um grupo cujas células B são mais suscetíveis à lise e
outro cujas células B são menos suscetíveis à lise com concentrações subótimas de Rituximab.