Efeitos da estimulação osmótica sobre a morfologia e a expressão de
transportador de glutamato em cultura de astrócitos hipotalâmicos
Marina Malerba de Souza, Silvia Graciela Ruginsk Leitão
Unifal –MG (Instituto de Ciências Biomédicas / Departamento de Ciências Fisiológicas, Biomedicina)
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Introdução: A neuroglia é formada por células não neurais (células da glia) e inclui os astrócitos, que
participam de informações complexas dentro do sistema nervoso central (SNC). Os astrócitos não geram
potenciais de ação, mas geram correntes internas de cálcio e podem liberar gliotransmissores como o
glutamato (principal neurotransmissor excitatório do SNC). A recaptação do glutamato pelos astrócitos
tem função antiexcitotóxica, prevenindo a morte celular, e ocorre por meio de dois principais
transportadores de glutamato (GLAST e o GLT-1), que desempenham um papel fundamental no
clearance extracelular deste neurotransmissor. Além disso, os astrócitos expressam uma proteína
exclusiva em seu citoesqueleto, a GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein), que participa do rearranjo
estrutural destas células em diversas situações fisiológicas. [1] A partir de tais evidências, o presente
estudo pretende avaliar possíveis alterações morfológicas e de expressão de GFAP e GLAST induzidas
pela hiperosmolalidade do meio de incubação, usando para tal fim soluções hipertônicas à base de NaCl
ou manitol, um osmólito não permeante na membrana celular.
Material e métodos: Foram utilizados ratos Wistar machos neonatos que, após dois dias de nascimento,
foram eutanasiados por decapitação para remoção do hipotálamo médio basal. As amostras de tecido
foram dissociadas com tripsina e as células foram cultivadas em solução de DMEM contendo soro fetal
bovino e antibióticos. Cerca de sete dias após o plaqueamento, as células foram submetidas à separação
por agitação. As células em suspensão foram removidas e as células aderidas ao frasco (astrócitos) foram
novamente tripsinizadas e cultivadas em placa contendo ou não lamínulas com poli-D-lisina. No dia do
experimento, o meio de cultura foi removido e a cada poço da placa foi adicionado o volume de 1 mL de
solução estéril de Hank Isotônica (290 mosm/kg H2O, 128 mM de NaCl) ou Hipertônica (330 mosm/kg
H2O, a base de NaCl ou manitol), pH 7.4, por 2 horas. As lamínulas foram inicialmente fixadas com
metanol puro e, em seguida, processadas para imunofluorescência para GFAP e contracoradas com o
marcador nuclear DAPI. Em seguida, as lamínulas contendo as células foram lavadas e fixadas sobre uma
lâmina gelatinizada para visualização em microscópio e captura das imagens, que foram adquiridas com o
mesmo nível de exposição em todos os grupos. A quantificação do sinal fluorescente foi realizada por
meio do software Image J. Os gráficos foram construídos no programa Prism 3.0, sendo os resultados
expressos em médias ± erro padrão da média (EPM). A análise foi realizada por meio do teste de
variância (ANOVA) de uma via, com pós-teste de Newman-Keuls. O nível de significância adotado foi
de 5% (p<0,05).
Resultados e Discussões: A incubação com a solução Hank Hipertônica à base de NaCl diminuiu a área
da célula, evidenciada pela diminuição da marcação de GFAP neste grupo em relação à incubação com
Hank Isotônico (p <0,05). A incubação com solução Hank Hipertônica à base de manitol não alterou
significativamente a área celular.
Conclusão: O aumento da osmolalidade do meio de incubação somente foi capaz de induzir alteração no
tamanho celular e na marcação de GFAP quando produzido por um soluto permeante, no caso, NaCl. Isso
indica que os astrócitos reagem seletivamente a determinados tipos de estímulos extracelulares.
Financiamento: PIBIC/CNPq
Referências:
[1] Lent, R. 2002. Cem bilhões de neurônios? Conceitos fundamentais de neurociências. Brasil. 1:73-110.
Alfenas – MG – Brasil
12, 13 e 14 de novembro de 2015