TERAPIA GÊNICA
Profa. Dra. Ana Elizabete Silva
Departamento de Biologia
IBILCE - UNESP
TRATAMENTO DE DOENÇAS
GENÉTICAS
Na maioria das vezes o tratamento das
doenças genéticas é somente paliativo
amenizando os sintomas ao invés de
agir na causa primária: o gene
Terapia Gênica
Consiste na transferência de material genético para
células- alvo, com o objetivo de suprir os produtos de
um gene estruturalmente anormal no genoma do
paciente:
-adição do gene normal
-correção do gene
-silenciamento do gene defeituoso
ESTRATÉGIAS TERAPÊUTICAS
RELATO DE CASO
-criança de 8m após batida na
cabeça apresenta sangramento
nasal com recorrência  distúrbio
coagulação???
-testes mostrou 1% atividade fator
IX  Hemofilia B
-teste genético confirmou mutação
-19 anos: incluído ensaio
clínico p/ Terapia Gênica
-tratamento padrão: infusão
intravenosa de concentrado da
-vetor AAV- com gene fator
proteína recombinante ou derivado
IX direcionado p/fígado
plasma
(injeção na veia porta)
-risco de doenças infecciosas
-aumento nos níveis fator IX
(hepatite, AIDS) e anticorpos
contra proteína recombinante
FORMAS POTENCIAIS DE
TERAPIA GÊNICA
Terapia gênica
germinativa
Terapia gênica
somática
TERAPIA GÊNICA
GERMINATIVA
Terapia gênica para a mutação
little(lit): hormônio do crescimento
Regulador-Promotor da
Metalotioneína: remover metais
pesados
TERAPIA GÊNICA DE CÉLULAS
SOMÁTICAS
Terapia in vivo: as células são
tratadas dentro do corpo
Terapia ex vivo: as células do
paciente são retiradas e
manipuladas fora do corpo
TERAPIA GÊNICA IN VIVO
http://www.smartplanet.es/articulos.php?pageNum_ctapag=6&totalRows_ctapag=11&id=9-4-3
TERAPIA GÊNICA EX VIVO
1. Inserção de um gene em um vetor
2. Contato Vetor / Célula
3. Entrada e transporte do gene até o núcleo da
célula
4. Transcrição do RNAm a partir do gene
5. Tradução do RNAm em proteína
6. Secreção, fixação na membrana ou expressão
citoplasmática da proteína
PROCEDIMENTO BÁSICO PARA TERAPIA GÊNICA
Doença
apropriada
Estratégia de
transferência:
ex vivo ou in vivo
Células
alvo
Vetor
www.edu365.com/aulanet/comsoc/Lab_bio/simulacions/GeneTherapy/GeneTherapy.htm
(Animação)
CÉLULAS ALVO
Características: acessíveis, tempo de vida
longo no corpo, alta taxa de proliferação
Tipos de células alvo:
Células tronco (medula óssea- cordão
umbilical)
linfócitos
fibroblastos de pele
células musculares (mioblastos)
células vasculares endoteliais
hepatócitos
Técnicas de introdução de genes
em células de mamíferos:
A- Técnicas
que
utilizam
métodos físicos ou químicos:
baixa eficácia e transitório
 microinjeção de DNA
 eletroporação (choque elétrico)
 biobalística (gene gun)
 precipitado de fosfato de cálcio
 lipossomos
Sistemas Não-Virais: Microinjeções
de DNA
Microinjeção: núcleo da célula
(terapia ex vivo ou in vivo- embrião)
utilizada principalmente no
desenvolvimento de vacinas de
DNA.
http://www.bioloja.com/info/info.asp?id=96
Sistemas Não-Virais: Eletroporação
- Pulsos elétricos curtos de alta voltagem;
- Permeabilização da membrana celular;
- Entrada na célula de diferentes tipos de
moléculas, entre as quais os DNA.
Eletroporação: choque elétrico→poros (morte celular)
Fonte: http://aragoneria.com/boreas/articulos/terapiagenica1.htm
Sistemas Não-Virais: Microesferas –
Biobalística ou Gene-Gun
Bombardeio partículas de ouro/
tungstênio conjugada ao DNA:
bomba de hélio (morte celular)
Sistemas Não-Virais: Transfecção com
Fosfato de Cálcio
- Método utilizado com sucesso para introduzir
transgenes em células in vitro;
- Não apropriado para aplicação in vivo.
Precipitado c/DNA- endocitose
(cultura celular – ex vivo)
Sistemas Não-Virais: Lipossomos
dupla camada lipídica englobando uma fração aquosa -complexo de DNA
e lipídeos.
Lipossomos catiônicos: padrão ouro de vetores não virais
Desvantagens:
- Não possuem
capacidade
intrínseca de
atravessar a
membrana
nuclear:1 em
1000 plasmídeos
atinge o núcleo;
- Grande maioria
são levados ao
sistema
lisossômico.
Fonte:http://www.ufv.br/dbg/trab2002/TERAPIAG/TRG002.htm
Técnicas de introdução de genes
em células de mamíferos:
B-
Técnicas que utilizam vetores
biológicos:
retrovírus (RNA)
Adenovírus (DNA)
Adenovírus associado-AAV (parvovírus)
Lentivírus (retrovírus → cels. não
dividem)
Herpes vírus (invadir neurônios)
Cromossomo artificial
RETROVÍRUS
Retrovírus (vírus de RNA) são os vetores
ideais para a transferência de genes em
células humanas:
são capazes de infectar quase 100% das
células-alvo em divisão→ integra no genoma
hospedeiro
carregam fragmentos relativamente grandes
de DNA (8kb)
Desvatagem: infectam somente células em
divisão
Genes retrovírus:
Gag: proteína cápsula interna
RETROVÍRUS
Env: transcriptase reversa e integrase
Pol: envelope glicoproteína
Fonte:http://www.ufv.br/dbg/trab2002/TERAPIAG/TRG002.htm
INSERÇÃO RETROVIRAL
A inserção casual do DNA no genoma
das células hospedeiras pode :
inativar um gene importante: morte
celular
ativar um oncogene: alterar o padrão
normal de controle e divisão celular 
câncer
causar mutação
Adenovírus
Vantagens:
- DNA dupla fita;
- Infectam grande variedade
-
de tecidos;
Não possuem envelope, sua
partícula é muito estável;
Não se integram no DNA
das células hospedeiras;
Aceitam inserções de 30Kb;
Penetram em células que
não se multiplicam;
Não ativam protooncogene ;
Desvantagens
- Não é integrado ao genoma
celular;
- Resposta imune contra o
tecido transduzido com o
vetor.
- Baixa taxa de entrega in vivo
expressão transitória
Vetor mais utilizado
em terapia gênica
contra o câncer
http://bio.leo.sites.uol.com.br/terapiagenica.htm
Barreira para Terapia Gênica - Entrega do Gene
1- Estabilidade do vetor que carrega o gene durante transporte
2-Penetrar o tecido e ser captado pelas células alvo
3- Após endocitose, escapar de degradação lisossomal
4- Transporte para o núcleo
5- Manter atividade transcricional no núcleo
6- Evadir a resposta imune
Pré-Requisitos : Terapia Gênica
escolher a doença apropriada a ser tratada
identificar e clonar o gene e suas regiões reguladoras
assegurar que
prejudiciais
o
gene
inserido
não
tenha
efeitos
determinar as células-alvo certas que tenham duração de
vida adequada
verificar se a técnica é segura e eficiente para a introdução
do gene nas células
restringir a transferência do gene às células alvo somáticas
documentar e divulgar os resultados obtidos
Classes de Doenças Passíveis de
Terapia Gênica
Doenças Hereditárias
(monogênicas - AR)
Neoplasias
Doenças infecciosas (AIDS)
Outras Doenças: doença arterial
coronária; artrite; doença renal, etc
Mais de 1800 protocolos aprovados
2004: China aprovou 1º terapia gênica comercial para câncer
de cabeça e pescoço
2011: Pensilvania (CTL019) terapia de leucemia linfoblástica
aguda
Algumas tentativas de terapia gênica :
Deficiência da enzima desaminase de adenosina
(ADA)
Imunodeficiência combinada severa ligada ao X
(XSCID)
Fibrose Cística
Hemofília
DMD
Hipercolesterolemia Familial: LDLR (receptor de
lipoproteína de baixa densidade)
Doença de Parkinson e artrite
Câncer
AIDS
Deficiência da Desaminase
de Adenosina - (ADA)
Doença imunológica rara: debilitação do
sistema imune (imunodeficiência)
Enzima ADA: via purinas (tóxica)
linfócitos T (células-alvo) são muito
acessíveis
grande variação no nível de expressão
do gene ADA entre indivíduos normais
o primeiro protocolo aprovado para
terapia gênica foi para a correção da
deficiência da ADA.
1990: Drs. Anderson e Blease
(Ashanti De Silva)
ADA
o
linfócitos T foram coletados e expandidos em cultura ex
vivo
infectadas com
retrovírus
recombinante
os linfócitos foram injetados nos pacientes
expressão do gene ADA
detectada por 12 anos nos
linfócitos periféricos
transferência do gene não foi eficiente: receberam PEGADA (enzima exógena)
DEFICIÊNCIA DA DESAMINASE
DE ADENOSINA - ADA
NOVA TÉCNICA:
gene ADA transferido para
células tronco: sangue do cordão
umbilical
10% dos linfócitos T circulantes
carregavam o gene normal
tratamento com enzima ADA
exógena (PEG-ADA) foi removida
progressivamente
Células T expressando ADA 
significantemente
IMUNODEFICIÊNCIA COMBINADA
SEVERA LIGADA AO X - XSCID
Devido mutação do gene IL2RG: codifica a cadeia  do
receptor IL-2
Pacientes faltam células T e células B prejudicadas
França: 10 crianças selecionadas para terapia gênica:
células da medula óssea
retrovírus
9/10 crianças apresentaram células T com o gene
transduzido
Duas crianças desenvolveram leucêmia de células T
~ 3 anos após a terapia
inserção
do retrovírus próximo ao promotor do oncogene LMO2
(fator de crescimento)
http://www.blackbookdopina.net/2009/07/fibrose-cistica.html
FIBROSE CÍSTICA
gene mutante: CFTR - 7q31-32 (AR)
proteína reguladora de condutância
transmembrana:
transporte
de
Cldiminuído e do Na+ aumentado
afeta as glândulas exócrinas: problemas
respiratórios, digestivos e pancreáticos
Fibrose Cística
vetor adenoviral: infecta os pulmões, penetra em
células que não estão em divisão sem integrar no
seu DNA, permitindo que estas expressem o DNA
viral, introduzido pelo nariz com um spray (terapia
in vivo)
Desvantagem: inflamação com ataque imune
que neutraliza as células contendo gene
adenoviral; efeito da terapia de vida curta, cerca
de 6 semanas
Nova estratégia (2014): vetor pDNA (DNA
plamídeo) complexado com lipossomo  usando
nebulizador (aerosol viscoso)
Terapia Gênica - Cegueira
Abril/2008: Universidade da Pennsylvania e Hospital
da Philadelphia (USA) e Universidade de Londres:
trataram pacientes adultos jovens com neuropatia
óptica de Leber (LCA2)  defeito no pigmento do
epitélio da retina
Inserção do gene RPE65 (injeção com vetor viral
direto na retina): codifica a enzima que auxilia na
conversão da vitamina A para rodopsina A (pigmento
das células fotorreceptoras que absorvem luz)
Terapia Gênica - Cegueira
Terapia Gênica - Cegueira
Após a terapia mostraram melhora na visão: maior
sensibilidade a luz, detectaram movimentos manuais e
leitura de linhas de um cartaz de exame oftalmológico
Perspectiva: terapia em crianças c/LCA2 e retinoblastoma
2014- Universidade de Oxford: terapia gênica da
coroideremia (lesão da retina)  mutação no gene CHM
 vetor AAV injetado na retina em 6 homens  melhora
da visão (Nature, 2014)
VÍTIMAS DE TERAPIA GÊNICA
Mulher 36 anos - faleceu 22 dias
após terapia
TERAPIA GÊNICA DO CÂNCER
Introdução de genes supressores de tumor para
restaurar a função perdida.
Ex.: inserção do gene
TP53 normal em
tumores de pulmão 
bloquear a progressão
tumoral e apoptose
TERAPIA GÊNICA DO CÂNCER
Terapia pró-droga ou gene suicida: transferência
de um gene (HSV-tk) → tirosina quinase → que
ativam pró-drogas → tornam as células em
divisão sensíveis a drogas selecionadas
Usado no tratamento do Glioma: tipo de tumor
cerebral que afeta as células da glia que suportam
e interagem com os neurônios;
Um gene suicida na presença de um droga é
ativado e mata as células que o contêm.
Ex.: câncer cerebral, cabeça e pescoço,
ovário, mama, pulmão, cólon e pele
TERAPIA PRÓ-DROGA – GENE SUICIDA
http://www.scielo.br/pdf/ea/v24n70/a04v2470.pdf
Terapia Gênica no Brasil
- Em 2004 foi criada a Rede de
Terapia Gênica
- 27 institutos ou
Departamentos de 6 estados
(Rio de Janeiro, São Paulo e
Rio Grande do Sul), financiados
pelo Institutos do Milênio do
CNPq/MCT.
- Pesquisas: introdução de genes
com efeito terapêutico
Qual o alvo do Brasil?
- terapia gênica em câncer
- doenças graves do metabolismo
- doenças degenerativas e
cardiovasculares
- vacinas de DNA profiláticas para
doenças infecciosas e vacinas de
DNA terapêuticas para HPV
Terapia Gênica no Brasil
Rede é composta por:
Rio de Janeiro: o Instituto de Biofísica da UFRJ, o Instituto
Oswaldo Cruz e o Instituto Nacional do Câncer (INCA);
São Paulo: os Departamentos de Microbiologia e Biologia
Celular e Desenvolvimento da USP, o CINTERGEN da
UNIFESP, o InCor e o Instituto Butantã;
Rio Grande do Sul: os Departamentos de Genética e de
Biofísica e o Hospital de Clínicas da UFRGS, bem como o
Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul.
Terapia Gênica no Brasil
2009: 1o. Estudo Clínico em pacientes cardíacos
(isquemia) – fases 1 e 2 (segurança e eficácia)
Coordenado pelo Dr. Renato Karan Kalil – Inst. Cardiologia
do Rio Grande do Sul
Grupo de 10 pacientes
injeção de DNA (plasmídeo c/gene VEGF-165)
diretamente no coração estimula angiogênese
8 pacientes apresentaram bons resultados:
-aumento na capacidade de bombear sangue
-desempenho em testes de esforço físico
Terapia Gênica no Brasil
Glybera: primeiro medicamento
comercial de terapia gênica (Lab
UniQure - Holanda)
Deficiência da enzima
lipoproteína lipase: digestão da
gordura.
Vetor: adenovírus-associado
Aplicação de 12 injeções no
músculo da perna (dose única)
Custo: 1,5 milhão de euros (R$
3 milhões)
NANOTECNOLOGIA
NANOTECNOLOGIA
É o estudo de manipulação da matéria numa escala de
nanômetros (1 milímetro é igual a 1 milhão de nanos)
Tamanho: 5-500nm (um bilionésimo de metro) - minúsculas
partículas: variadas formas  tubos, conchas, espirais
-materiais: polímeros, dendrímeros, lipossomos,
nanotubos de carbono e metais (ouro e óxido de ferro)
NANOTECNOLOGIA
-Polímeros: vetor para entregar drogas quimioterápicas
e RNAi
-avaliar a toxicidade (ativação do complemento,
imunogenicidade, carcinogenicidade, teratogenicidade)
 devem ser não tóxicos e biodegradáveis  evitar
acúmulo no organismo (fígado, baço e medula óssea)
NANOTERAPIA
NANOTECNOLOGIA
Nanoconchas - esferas microscópicas  núcleo de sílica,
recoberto com uma finíssima camada de ouro e, em segundo
lugar, luz com comprimento de onda na faixa do infravermelho
 destroem células tumorais quando aquecidas com a luz de um
raio laser  interagem com a luz de forma específica 
"configuradas" para destruir sob a ação de comprimentos de onda
específicos
•injetaram nanoconchas na corrente sangüínea de
camundongos com câncer de cólon  as nanoconchas se
acumulam preferencialmente nos tumores (vasos mal
formados e permeáveis)  irradiação dos tumores com
fonte de laser  82% dos camundongos sobreviveram
NANOTECNOLOGIA
”Nanocomplexo”: liposomo + anticorpo, junto com
terapia genética  irá tanto detectar quanto alvejar células
metastatizadas de câncer, destruindo-as.
•liposomo encapsula o gene p53  ativa
apoptose nas células com danos genéticos.
•O complexo liposomo-anticorpo 
encontra a célula cancerosa  ligando-se ao
receptor transferrina (presente em grande
número na superfície das células
cancerosas).
• Terapia : melhorou o tratamento do câncer por
quimioterapia e radiação  morte das células danificadas
 nanocomplexo atinge somente as células cancerosas
NANOTECNOLOGIA
”Imunonanoconchas”: nanoconcha
direcionável possa encontrar um tipo
específico de câncer, onde quer que ele possa
estar escondido
•conectaram anticorpos anti-HER2 em
nanoconchas  aplicaram essas
imunonanoconchas sobre células de câncer de mama (em
laboratório)  utilizaram raios laser para aquecer o agente.
-Coraram as células  somente morreram as células de
expressão do HER2 que tinham sido ligadas a nanoconchas
•Células que não foram expostas ao câncer também
sobreviveram, sugerindo que o tratamento anticorponanoconcha efetivamente destrói as células cancerosas
HER2+.
NONOEMULSÃO MULTIFUNCIOANAL NONOTERANÓSTICO
Nanopartícula de óxido de ferro em emulsão água-óleo
carregando um fluoróforo (imagem guiada) e droga
terapêutica, após injeção intravenosa para alvejar câncer
de cólon em ratos.
Adv Mater . Author manuscript; available in PMC 2012 September 22.
Nanopartículas alvo-dirigidas em estudos préclínicos e clínicos
SGT-53: lipossomo contendo plasmídeo com o gene
TP53  tem como alvo receptor de transferrina  alta expressão em
células cancerosas.
Nanopartículas: doxorrubicina + 5-aza-dC  câncer mama
Nanopartículas e toxicidade
•Apesar do uso de nanopartículas até mesmo para consumo há poucas
informações sobre os possíveis efeitos tóxicos para a saúde humana e o meio
ambiente
- Efeitos já observados:
- Catalisar danos oxidativos ao DNA
- Nanopartículas de ouro: têm a capacidade de mover-se através da placenta da
mãe para o feto quando injetadas em ratas grávidas
- Nanopartículas de prata: Granulomas em ratos e camundongos após a
exposição aguda
Nanotubos de carbono: causam acelerado estresse oxidativo na pele
Pouca atenção tem sido dada aos efeitos ambientais