Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade
de Coimbra
Engenharia Biomédica
Controlo da
Replicação de
Plasmídeos
Trabalho elaborado por:
Andrêa Gouvêa
Ivânia Pereira
Lara Bolito
Magali Barbosa
Objectivos:
Pretende-se com este trabalho relevar a importância da bioinformática numa área
em expansão crescente, a genética e biotecnologia, executando modelos matemáticos/
informáticos e aplicando-os à área em estudo.
Introdução:
Talvez a propriedade fundamental de todos os organismos vivos seja a sua
capacidade de reprodução. Todos eles têm uma informação genética inerente,
transmitida pelos progenitores e garantida pela replicação, especificando a sua estrutura
e função.
Genética Mendeliana:
Os princípios clássicos da genética foram desenvolvidos por Gregor Mendel, em
1865, com base em resultados experimentais com ervilhas (verdes e amarelas). A
manifestação de características distintas e que variam entre seres (inclusive na mesma
espécie) revela a presença de genes. Ou seja, estes são sequências específicas de pares
de bases no DNA, e o seu conjunto constitui o código genético. Os genes, que em
mamíferos se estima serem entre 50.000 a 100.000, estão fisicamente ligados em
estruturas designadas por cromossomas, existentes no núcleo da célula. A localização
particular num cromossoma em que um determinado gene se encontra chama-se locus
genético. Os cromossomas são, assim, conjuntos de loci genéticos onde se encontram
codificados todos os genes que definem uma espécie.
O mapa genético de um organismo define o seu genótipo e a sua eventual
expressão é o fenótipo. Cada organismo pode ser alterado fisicamente conforme o meio
ambiente; contudo o seu mapeamento genético não é afectado.
Por exemplo, cruzando duas vagens de ervilhas, uma tendo ervilhas amarelas
(Y) e outra verdes (y), levam ao seguinte resultado:
2
Fig 1: Experiência de Mendel - cruzamento
de duas vagens de ervilha.
Cada cadeia progenitora tem duas cadeias idênticas do gene amarelo (Y) ou
verde (y). As plantas sucessoras são, contudo, híbridos, pois contêm um gene amarelo e
um gene verde. Por observações efectuadas, o gene dominante será, então o amarelo,
uma vez que a primeira geração de sucessores é amarela; o gene verde é recessivo. O
genótipo (composição genética) desta geração é Yy e o seu fenótipo (aparência física) é
amarelo.
Fig 2: Experiência de Mendel cruzamento de duas vagens de
ervilha.
3
Na geração seguinte poderá manifestar-se fisicamente o gene recessivo; porém,
só há 25% de probabilidades deste caso ocorrer.
Células Haplóides e Diplóides:
Um organismo haplóide contém células que apresentam metade do número de
cromossomas do cariótipo característico da sua espécie. Estas são produzidas a partir da
meiose, que tem por finalidade a produção de gâmetas, possuindo N cromossomas.
Por sua vez, os organismos diplóides contêm informação em duplicado. Para
cada característica existem pelo menos 2 genes, estando cada um em cromossomas
homólogos. Diz-se que a quantidade de DNA é 2N, em que N é o número de
cromossomas característicos da espécie em causa.
O estudo de células haplóides é, por isso, mais fácil, daí que seja privilegiado o
seu uso.
Fig. 3:constituição
celular
Estrutura do DNA
O DNA (ácido desoxirribonucleico) é uma macromolécula constituída por vários
polímeros, sendo a unidade básica o nucleótido, composto por um açúcar
(desoxirribose), um grupo fosfato e uma base azotada – purina (adenina ou guanina) ou
pirimidina – (timina e citosina), que se complementam, uma vez que as purinas se ligam
às pirimidinas.
4
A desoxirribose vai ligar-se ao grupo fosfato da base azotada, pelos carbonos 5’
e 1’, respectivamente.
A molécula de DNA é formada por duas cadeias polinucleotídicas, enroladas
uma na outra no sentido dos ponteiros do relógio, em forma de dupla hélice. As bases
são orientadas para o interior e ligam –se entre as cadeias por pontes de hidrogénio.
As cadeias são antiparalelas, correndo de 5’ para 3’, em sentidos opostos.
Fig.4 :Estrutura
química de uma cadeia
simples de DNA.
Fig. 5 :Esquema
representativo da
cadeia de DNA.
Plasmídeo:
Em termos genéticos e bioquímicos, a E.coli é, provavelmente, o organismo
mais bem estudado de todos os que se conhecem. Para além disso, tem características de
manipulação fácil: cresce rápida e economicamente, daí ser usada como o principal
organismo hospedeiro para produzir grandes quantidades de proteínas, a partir de genes
com origens diversas. O vector de expressão da bactéria é usualmente um plasmídeo.
Um plasmídeo é uma molécula circular dupla de DNA capaz de se replicar
independentemente dos cromossomas, cujo tamanho pode variar entre dezenas a
milhares de kilobases. Eles são introduzidos na bactéria por um processo conhecido
como transformação (em células eucarióticas é conhecido por transfecção).
5
Fig. 6: E.coli
Para estudar plasmídeos em laboratório, a cultura de células deriva de um
simples plasmídeo que facilmente se replica. Todas as células da cultura irão conter o
plasmídeo em questão. Estes contêm uma diversidade de genes para sua própria
manutenção, mas que não estão presentes na bactéria.
A presença de alguns plasmídeos nas células bacterianas torna-se evidente no
fenótipo destas; por exemplo, uma bactéria que contenha um plasmídeo tet-r torna-se
resistente à tetraciclina.
•
Replicação dos plasmídeos:
Os plasmídeos ligam-se a enzimas da célula hospedeira na replicação de DNA
para a sua reprodução. Mas a iniciação da replicação é controlada pelos genes dos
plasmídeos. Em consequência, o número de cópias do plasmídeo numa célula varia
conforme o seu tipo, dependendo da regulação na iniciação da replicação.
Os plasmídeos contêm uma série de genes para o estabelecimento de ligações
entre células e para transferir DNA do dador para o receptor. Uma cópia do plasmídeo
pode ser transferida na ligação da célula. A transferência é sempre acompanhada por
uma replicação do plasmídeo.
Todos os plasmídeos contém pelo menos uma sequência de DNA que serve
como uma origem de replicação ou ori (um ponto inicial para a replicação de DNA), e
que permite ao DNA do plasmídeo replicar-se independentemente do DNA
cromossómico, com locais específicos, onde as enzimas de restrição clivam a cadeia.
Algumas moléculas circulares de DNA replicam por um processo que não inclui
os intermediários característicos da replicação eucariótica.
6
Esta replicação chama-se “rolling-circle replication”. Neste processo a
replicação inicia-se com um corte numa ligação específica base-fosfato numa dupla
cadeia circular. Este corte produz duas extremidades quimicamente distintas 3’ e 5’. O
DNA é sintetizado pela adição de dexoxinucleótidos na extremidade 3’, com a mudança
simultânea da extremidade 5’.
À medida que a replicação prossegue, a extremidade 5’ roda para fora como uma
tubo que vai aumentando de comprimento.
Em muitos casos, à medida que este processo se efectua, uma cadeia
complementar é sintetizada, o que resulta num tubo idêntico, duplo de DNA.
Este fenómeno é comum em estádios tardios de replicação da dupla cadeia de
DNA.
O plasmídeo pode ser retirado e manipulado de uma célula e reinserido
permanentemente numa bactéria, sem que haja prejuízo ou dano. Depois da
transferência, ambas as células contêm um plasmídeo que pode servir novamente como
dador. Este processo efectua-se em poucos minutos.
É esta característica que torna os plasmídeos uma das ferramentas mais
importantes da engenharia genética genética.
Fig. 7: Rolling- circle
replication
•
Tipos de Plasmídeos:
Existem dois grupos básicos de plasmídeos: os conjuntivos e os nãoconjuntivos. Os plasmídeos conjuntivos contém um gene chamado tra-gene, que pode
iniciar a conjugação, isto é, a troca sexual de plasmídeos com outra bactéria (Fig. 4). Os
plasmídeos não-conjuntivos são incapazes de iniciar a conjugação e, por esse motivo, o
seu movimento para outra bactéria, mas podem ser transferidos com plasmídeos
conjuntivos durante a conjugação.
7
Fig. 8: Conjugação e transferência
Numa única célula podem coexistir vários tipos diferentes de plasmídeos. A E.
coli, por exemplo, tem até sete. Dois plasmídeos podem ser incompatíveis, e a sua
interacção resulta na destruição de um deles. Os plasmídeos podem, portanto, ser
colocados em grupos de incompatibilidade, que dependem da sua capacidade de
coexistir numa única célula.
Uma forma óbvia de classificar os plasmídeos é pela função que desempenham.
Existem cinco classes principais:
•
Plasmídeos de Fertilidade (F), que contém apenas transgenes. A sua única
função é a iniciação da conjugação bacteriana.
•
Plasmídeos de Resistência (R), que contém genes que os tornam resistentes a
antibióticos ou venenos.
•
Col-plasmídeos, que contém plasmídeos que determinam a produção de
colicinas, proteínas que podem matar outras bactérias.
•
Plasmídeos degradativos, que permitem a digestão de substâncias pouco
habituais, como o toluole ou o ácido salicílico.
•
Plasmídeos de virulência, que transformam a bactéria num agente patogénico.
Os plasmídeos que existem em cópia única em cada bactéria correm o risco de,
depois da divisão celular, desaparecer numa das bactérias filhas. Para se assegurarem de
que a célula tem "interesse" em manter uma cópia do plasmídeo em cada uma das
células filhas, alguns plasmídeos incluem um sistema viciante: produzem tanto um
8
veneno de longa vida como um seu antídoto de vida curta. A célula que mantiver uma
cópia do plasmídeo irá sobreviver, ao passo que a célula que não o possuir morrerá em
breve por falta do antídoto.
•
Aplicações dos Plasmídeos:
Os plasmídeos são ferramentas importantes nos laboratórios de genética e
bioquímica, onde são usados rotineiramente para multiplicar (fazer muitas cópias de) ou
expressar genes específicos. Há muitos plasmídeos com esse fim disponíveis no
mercado. Inicialmente, o gene a ser replicado é inserido num plasmídeo. Este deverá
conter, além do gene inserido, um ou mais genes capazes de conferir resistência
antibiótica à bactéria que servir de hospedeiro. Os plasmídeos são então inseridos em
bactérias pela transformação, e estes são depois incubadas em meio rico em
antibiótico(s) específico(s). Então, as bactérias que contiverem uma ou mais cópias do
plasmídeo expressam (fazem proteínas a partir de) o gene que confere resistência aos
antibióticos. Tipicamente, a célula produz uma proteína que irá ser destruída pelos
antibióticos que, de outra forma, matariam a célula. Os antibióticos matam as células
que não receberam plasmídeo, porque não possuem os genes de resistência aos
antibióticos. O resultado é que só as bactérias com a resistência aos antibióticos
sobrevivem, e estas são as mesmas que contém o gene a ser replicado. Desta forma, os
antibióticos actuam como filtros que seleccionam apenas as bactérias modificadas. E
agora estas bactérias podem ser cultivadas em grandes quantidades, recolhidas e
destruídas para isolar o plasmídeo interessante.
O DNA pode ser também de extrema importância para a purificação de DNA.
Por exemplo, o DNA é extraído de uma cadeia patogénica de Pneumococcus (DNA
circular), que está rodeada por uma cápsula de aparência lisa, formando colónias. A
adição de DNA purificado S a uma cultura normal, sem cápsula R resulta na formação
de colónias S. Então, o DNA purificado contém informação genética responsável pela
transformação de bactérias R em S.
9
Fig. 9:Purificação de DNA.
Outro uso importante dos plasmídeos é a produção de grandes quantidades de
proteínas. Neste caso, cultiva-se as bactérias que contém um plasmídeo que inclui o
gene que codifica a proteína que se pretende produzir. Da mesma forma que uma
bactéria produz proteínas que lhe conferem resistência aos antibióticos, também pode
ser induzida a produzir grandes quantidades de proteínas a partir do gene que nelas foi
introduzido. Esta é uma maneira barata e simples de produzir um gene ou a proteína que
ele codifica - por exemplo, a insulina - ou até mesmo antibióticos.
Pela sua maneabilidade, os plasmídeos são os vectores de excelência para a
clonagem de genes ou fragmentos de DNA específicos, apesar de também serem usados
na construção de bibliotecas de genes. Os plasmídeos usados em clonagem são
derivados de plasmídeos que ocorrem naturalmente e foram modificados, por
engenharia genética, de maneira a incorporarem um certo número de características
desejadas.
Fig. 10: vários processos
de plasmídeos
10
Clonagem:
Hoje em dia, a clonagem tem interesses múltiplos no âmbito da engenharia
genética, tais como:
9 Isolamento de um gene particular, parte de um gene, ou região de um genoma;
9 Produção de um RNA particular e proteínas moleculares em grandes
quantidades;
9 Grande eficiência na produção de bioquímicos como enzimas e drogas;
9 Criação de organismos com características particulares desejáveis, como por
exemplo, plantas e animais mais resistentes ao meio ambiente.
9 Diagnósticos de doenças genéticas
9 Correcção de defeitos genéticos
A clonagem de um gene pode ser descrita da seguinte forma: o gene é ligado a
um vector, formando uma molécula de DNA recombinante. Em seguida, esta molécula
é introduzida numa célula hospedeira, onde permanece desligado do genoma da célula
hospedeira. O vector tem capacidade de se replicar por si só, em paralelo com a própria
replicação do DNA do hospedeiro. O vector divide-se simultaneamente com a célula
hospedeira, e é transmitido às células hospedeiras. Diz-se assim que se obteve um clone
de células iguais, que permite amplificar o gene para melhor isolamento.
Nos processos de clonagem de genes ou de fragmentos de DNA, são utilizadas
diversas enzimas celulares, como as enzimas de restrição. Estas podem ser obtidas a
partir de microorganismos e fazem parte fulcral do sistema de defesa à invasão de DNA
estranho. Têm por função cortar esse DNA de uma forma específica, inactivando-o e
não digerindo o DNA endógeno que se encontra modificado em certas sequências.
Nesse corte, obtêm-se 3 tipos de extremidades de DNA, e as enzimas específicas fazem
a identificação de cada extremidade.
As extremidades obtidas por corte podem voltar a unir-se, por emparelhamento
de cadeias simples complementares. A sua ligação por uma enzima ligase reconstitui a
molécula original de DNA. É este processo que constitui a base de formação de
moléculas de DNA recombinantes apara clonagem, uma vez que permite juntar DNA
provenientes de células diferentes, que foram cortados com a mesma enzima ou com
extremidades compatíveis.
11
Fig. 11: colónia de bactérias in vitro
O isolamento de um plasmídeo recombinante é um exemplo típico de uma
experiência de clonagem em bactérias.
O plasmídeo contém uma origem de replicação oriB, uma marca de selecção que
codifica resistência a ampicilina – ampR – e um local de clonagem para a enzima EcoRI
(a enzima só corta uma vez no plasmídeo e o corte não influencia nenhum gene vital do
plasmídeo). Esta enzima vai linearizar o plasmídeo isolado.
Seguidamente, há um tratamento do plasmídeo, com fosfatase, por exemplo, que
vai remover os grupos fosfato 5’, para impedir uma reconstituição antecipada da cadeia
circular. Simultaneamente, o DNA a clonar também é clivado com EcoRI. O plasmídeo
e o DNA são, então, misturados na sua forma linear, e na presença da enzima ligase, que
promove as ligações fosfodiestéricas entre os grupos fosfato 5’ e hidroxilo 3’. Esta
recombinação permite uma transformação de bactérias, que reparam as quebras no DNA
recombinante.
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Deduções matemáticas:
Reacções químicas de expansão de volume:
Considerando uma reacção química envolvendo três espécies químicas
diferentes A, B e C:
k ''
µ
A + B →
C →
,
sendo:
k’’- constante de proporcionalidade da reacção de formação de C,
µ - constante de proporcionalidade da reacção de degradação de C;
Tendo em conta que a expansão do volume é dada por
V& = αV , sendo α a taxa de crescimento da população em estudo.
Designando x , y e z como as respectivas massas de A, B e C, tem-se
z& = k ' ' xy − µz ,
isto é, a variação da massa de C com o tempo depende de k’’ e µ, multiplicados pelas
massas de A e B.
Uma vez que as concentrações são dadas por A =
y
x
z
obtém-se
, B = ,C =
V
V
V
C& V + CV& = k ' ' AV .BV − µCV .
Definindo k ' ' =
k
, vem C& + αC = kAB − µC .
V
Aumentando o volume, diminui a constante k’’, modificando-se assim as
constantes das reacções, obtendo-se
k
µ +α
A+ B
C 
→
→ .
13
Aproximação de Michaelis – Menton
A degradação de um composto C implica a acção de uma enzima E c , formandose um complexo intermédio C, que se decompõe na enzima E c original e num novo
produto X.
C + Ec ⇔ C → Ec + X
Matematicamente:
& = k CE − k C − k C,
C
1
c
2
3
&
E = −k CE + k C + k C,
c
1
c
2
3
C& = −k 1 CE c + k 2 C.
Como a soma das duas primeiras equações referidas anteriormente é nula e a
massa da enzima é conservada durante a reacção, vem que
E c + C = E c (0) (tendo em conta que a concentração inicial de C é nula).
Das equações acima vem
VC = k 3 E C (0)
V
C
C
C& = −
, definindo
(k + k 3 )
kC = 2
Kc + C
k1
A este processo dá-se o nome de aproximação de Michaelis – Menton.
Controlo das reacções de replicação:
A replicação dos plasmídeos é controlada por reacções que envolvem produtos
intermédios e controlo por feedback (que pode aumentar ou diminuir as concentrações
iniciais de acordo com as concentrações finais/intermédias)
ƒ
Reacções de replicação:
14
1) os plasmídeos são copiados a uma velocidade γ 1 , para um segmento de RNA
γ1
P →
P + M ',
M’:
2) M’ passa a forma estável a uma velocidade γ 2 :
γ2
M ' →
M
3)M serve de padrão à síntese da proteína Q, à velocidade δ :
δ
M →
M +Q
4)Esta proteína regula a produção do plasmídeo P, por feedback, à velocidade a:
a
→
2P
Q+P
ƒ
Reacções de inibição:
1)Um segmento de P é copiado para uma molécula de controlo C, à
velocidade β :
β
P →
P+C
2)A molécula C pode interagir com M’ de modo a inactivá-lo à velocidade b:
b
C + M'
→
X
onde X é um composto genérico inactivo e que apresenta irrelevância para este
estudo.
ƒ
Reacções de degradação:
1) Seguindo a reacção de Michaelis-Menton aplicada à reacção de plasmídeos
obtém-se:
KC
σC
C + E c ←→

C →
EC + X
2) De modo semelhante para M, há uma enzima E M que degrada M:
KF
M
M + E M ←

→ M σ
→ EM + X
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Combinando todas as equações e reacções anteriormente expostas, obtém-se
assim as seguintes equações diferenciais para o estudo do problema em questão:
P& = (aQ − α ) P
C& = βP − (bM '+α +
VC
)C
KC + C
M& ' = γ 1 P − (bC + γ 2 + α ) M '
Q& = σM − (aP + α )Q

VM
M& = M ' γ 2 −  α +
KM + M


 M

Implementou-se estas deduções num circuito diferencial de simulink, obtendose o seguinte formato em anexo.
Deduziram-se de dados científicos obtidos em investigações paralelas os
seguintes valores:
Para as reacções de replicação, consideram-se as constantes γ1, γ2, δ e a a variar
num intervalo entre 0 e 1, uma vez que são representativas de taxas de variação, assim
como α. Para as reacções de inibição, as respectivas constantes β e b são negativas, com
intervalo de variação entre -1 e 0.
Na continuação da pesquisa efectuada nas áreas específicas de investigação, e
analisando as concentrações padrão usadas in vitro, conclui-se que o estudo da
replicação só faz sentido para as condições de equilíbrio, e os valores a atribuir são:
P = 3µg / mL
C = 4µg / mL
M ' = 0.001µg / mL
Q = 0.02µg / mL
M = 0.001µg / mL
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Gráficos obtidos:
Gráf.1: situação
de equilíbrio
De forma semelhante, podem obter-se os gráficos para cada variável de estado,
efectuando o comando plot (tout, simout1) ( por exemplo, para a variável Q) na janela
do workspace do Matlab:
Graf. 2: variação da
concentração de P
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Pela fácil análise do gráfico, observamos que a concentração de plasmídeos
mantém-se constante no decorrer da reacção, isto porque não interessa um aumento da
sua concentração, mas sim uma replicação, ou seja, um número final igual ao inicial.
Graf. 3: variação da
concentração de C
Há um decaimento exponencial da curva representativa de C ao longo da
reacção. Por exemplo, partindo de um valor de equilíbrio de 10, atinge um valor nulo no
final; isto é, não estará presente na cultura no fim da replicação.
Graf. 4: variação da
concentração de M’
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A sua concentração cresce de forma exponencial e atinge rapidamente o equilíbrio.
Porém, pelos dados experimentais obtidos, a sua concentração não chega a ser muito
elevada.
Graf. 5: variação da
concentração de Q
Este gráfico é de variação semelhante ao de C, há uma rápida adaptação ao meio e o seu
decréscimo é rápido, atingindo valores vestigiais (que se podem considerar quase
insignificantes) no fim da reacção.
Graf. 6: variação da
concentração de Q
19
O gráfico é semelhante ao de M’, o que é lógico, dada a sua complementaridade
a nível de reacção enzimática.
~
Graf. 7: situação
de caos
Ao analisarmos uma situação de caos, verifica-se que todas as concentrações
atingem um valor nulo. A nível biológico, isto significa que, pura e simplesmente,
deixamos de ter plasmídeos, ou seja, há uma extinção do nosso objecto de estudo.
É assim fácil de deduzir que a situação de desequilíbrio conduz a um caos nas
condições de cultura, com extinção desta.
Daí que esta hipótese não seja alvo de análise, uma vez que não concretiza os
nossos objectivos de trabalho.
Conclusão:
Tal como já foi referido, o caos não nos leva a conclusões válidas de estudo.
20
Então, ao analisar uma situação de equilíbrio, verificamos experimentalmente
que:
- um factor de crescimento α é muito pequeno, relativamente aos factores das
outras equações;
- Q tem valores muito pequenos;
- para que haja equilíbrio, as variáveis necessitam de ser constantes, daí que as
suas derivadas sejam nulas nestas condições;
- P é constante.
Os gráficos obtidos pela construção do circuito diferencial em simulink levam à
refutação destas premissas.
Analisando as equações diferenciais que foram implementadas em simulink:
P& = (aQ − α ) P
C& = βP − (bM '+α +
VC
)C
KC + C
M& ' = γ 1 P − (bC + γ 2 + α ) M '
Q& = σM − (aP + α )Q

VM
M& = M ' γ 2 −  α +
KM + M


 M

Aplicando as conclusões experimentais, anulando as derivadas, e tendo em conta
que Q e α:
aQP = δM ⇔ M =
aQP
δ
Substituindo na primeira equação:
M =
αP
δ
Podemos então deduzir que M é muito pequeno, uma vez que é dependente de α.
Retiramos também que:
M '=
MVM
, logo M’ também é muito pequeno, com expressão simplificada:
γ 2KM
M ' = αγ ' P, com γ ' =
VM
γ 2KMδ
21
Além disso:
αM' = γ 1 P − bCM '−γ 2 M ' ⇔ bC =
γ 1 − αγ ' γ 2
.
aγ '
Pela segunda equação, chegamos à determinação de P:
( β − γ 1 ) P = VC +
γ1
.
bγ '
Assim, a análise de todos os mecanismos envolvidos na replicação de
plasmídeos leva-nos a concluir que há mecanismos de controlo de replicação que
influenciam o crescimento, de modo a anular variação de P com o tempo (P& ) , fazendo
α P = α . Por exemplo, quanto mais lento for o crescimento, maior o inibidor C e menor
será M e M’( uma vez que estes estão estreitamente dependentes um do outro).
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Lidel, lda, ISBN: 972-757-163-8
HOPPENSTEAD, Frank C. and others– “Modeling and Simulation in Medicine
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COOPER, Geoffrey M. (2000) – “The Cell, a Mollecular approach”; 2nd
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GRIFFITHS, Anthony J. F. and others (2005) – “Introduction to Genetic
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INTERNET (http://pt.wikipedia.org/wiki/Biologia ;www.b-on.pt)
22