Produção de Enzimas
Maria Alice Zarur Coelho
Priscilla Filomena Fonseca Amaral
Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos
Químicos e Bioquímicos
Produção de Enzimas
Introdução
Comercialmente, uma enzima pode ser um preparado que, além da
proteína enzimática, contém quantidades variáveis de matéria
contaminante proteica e não-proteica e preservantes;
As células constituem-se, até hoje, o único meio para obtenção de
biocatalisadores, visto que ainda não é possível destacar-se sua
fabricação por síntese química.
As enzimas podem ser provenientes de:
• tecidos de organismos diferenciados (células animais e vegetais)
• microrganismos.
Produção de Enzimas
Introdução
- Produção: fermentação; produção agro-pecuária ou cultivo “in-vitro”;
- Recuperação: separação, extração e concentração;
- Purificação: varia de acordo com o tipo de catalisador enzimático;
- Formulação: normalização do produto enzimático.
(---) enzima extracelular,
(___) enzima intracelular.
Produção de Enzimas
Produção de Enzimas de Tecidos
Ainda se produz um número importante de enzimas de tecidos animais e
vegetais;
• Ex.: renina usada na elaboração de queijos,
proteases vegetais usadas em anti-inflamatórios,
amilases para a preparação de mostos de cerveja.
As enzimas de origem vegetal são produzidas em grande parte como subprodutos da atividade agrícola;
• Ex.: papaína, extraída do latéx do papaya,
bromelina, obtida do talo da pinha.
Situação análoga: enzimas de origem animal que se obtém como
subprodutos dos matadouros (renina).
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Produção de Enzimas de Tecidos
As enzimas de tecidos requerem um processo de ruptura celular para a
sua recuperação.
A extração é uma operação simples e de baixa incidência no custo de
produção.
• As células vegetais: providas de uma
• As células animais:
desprovidas de parede celular
podem ser facilmente rompidas
(corte ou choque osmótico)
rígida parede celular de natureza
celulósica, são muito sensíveis aos
esforços de corte, podendo ser
eficientemente extraídas em moinhos
convencionais.
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Produção de Enzimas de Tecidos
Produção em grande escala de enzimas em cultivos artificiais de tecidos:
pouco factível
complexidade do sistema
alto custo dos meios de cultivo
Produção de enzimas sofisticadas de alto custo:
ok
competição com a produção por fermentação
usando microrganismos geneticamente modificados.
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Produção de Enzimas de Tecidos
Enzimas de Origem Animal
• Tecidos animais são secos e triturados (moinhos ou homogeneizadores)
• Extraídas com solução aquosa ou tampão
• Resíduos removidos por filtração (uso de terra diatomácea) ou centrifugação
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Produção de Enzimas de Tecidos
Enzimas de Origem Animal
Pancreatina
• apresenta atividade amilolítica, proteolítica e lipolítica
• Pâncreas de porco
• Antigamente: realçar sabor de queijos
• Atualmente: Auxiliar digestivo
Pâncreas frescos ou congelados são triturados com tecido duodenal
Tripsina presente no duodeno inicia a ativação das enzimas
Massa é seca em secadores a vácuo, e desengordurada através de extração com
éter de petróleo
Flocos são secos em secadores a vácuo, para remoção do solvente, e moídos,
obtendo-se um pó fino e peneirado
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Produção de Enzimas de Tecidos
Enzimas de Origem Animal
Renina
• Usada na elaboração de queijos
Extração do quarto estômago de bezerro alimentado somente com leite
Lavagem e corte em tiras do estômago
Extração do coalho com uma solução de cloreto de sódio (12-20%)
Filtra-se e purifica-se a solução por precipitação salina
Acidificação
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Produção de Enzimas de Tecidos
Enzimas de Origem Animal
Pepsina
• Origem: Mucosa do estômago de porco
• Auxiliar digestivo
Mucosa é fatiada e misturada com ácido clorídrico ou fosfórico (pH 2,0) por
16 h a temperatura ambiente
Eleva-se a temperatura para 40-45°C por 1 h (pepsinogênio é convertido em
pepsina)
Tecido não digerido é filtrado, e seco no secador a vácuo a 40°C.
Pepsina de alta pureza é obtida através da concentração a vácuo do filtrado,
resfriamento a 5-8C e adição de etanol para atingir a concentração de 60%
Filtração e secagem a baixa temperatura
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Produção de Enzimas de Tecidos
Enzimas de Origem Animal
Catalase
• Obtida a partir de fígado e sangue de boi ou porco
• Pode atuar como peroxidase, degradando álcoois, nitritos e fenóis
Fígados são macerados e submetidos a agitação em solução aquosa de 25%
com acetona a 25oC
Concentração da acetona é aumentada a 35%, a massa obtida é filtrada e os
sólidos descartados
Mais acetona é adicionada (50%), precipitando a catalase, recuperada através
de filtração ou centrifugação
Precipitado pode ser seco ou ainda extraído em solução aquosa agitada por 1
h, removendo o material insolúvel
Catalase líquida é submetida à filtração estéril e comercializada, com ou sem
estabilizante (glicerol)
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Produção de Enzimas de Tecidos
Enzimas de Origem Vegetal
Papaína
• Enzima proteolítica
• Origem: latex do fruto verde do mamão
• Clarificação da cerveja, amaciamento de carne, auxiliar digestivo
• Extraída como suco prensado deste componente e posteriormente
purificada
• A adição de água e cloreto de sódio perfazem um preparado chamado
de papaína bruta
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Produção de Enzimas de Tecidos
Enzimas de Origem Vegetal
Bromelina
• Enzima proteolítica
• Origem: talo e fruto do abacaxi
• Clarificação da cerveja, amaciamento de carne, auxiliar digestivo
• Obtida do caule do abacaxi após moagem, prensagem, filtração e
precipitação (silfato de amônio, metanol isopropanol ou acetona) do
suco deste talo.
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Produção de Enzimas de Tecidos
Enzimas de Origem Vegetal
Malte
• Proteases, lipases e hemicelulases, oxiredutases e amilases (alfaamilases: no grão durante a germinação; beta-amilase presente no grão
antes da germinação)
• Origem: malte de cevada
• Após germinação é feita secagem: paralisação da atividade biológica
do grão e reduzir teor de umidade
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Produção de Enzimas Microbianas
Engenharia de Bioprocessos: propagação de células microbianas
Aplicação comercial: bactérias, fungos filamentosos e leveduras;
• Produção de enzimas extracelulares industriais: Bacillus e Aspergillus (8085% do mercado de enzimas extracelulares)
Produção de Enzimas
Produção de Enzimas Microbianas
Enzimas extracelulares: aquelas que passam pela
membrana celular
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Produção de Enzimas Microbianas
Enzimas extracelulares: aquelas que passam pela
membrana celular
Produção de Enzimas
Produção de Enzimas Microbianas
Síntese e excreção de proteína extracelulares em
bactérias
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Produção de Enzimas Microbianas
Síntese e excreção de proteína extracelulares
em eucariotos
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Produção de Enzimas Microbianas
Síntese e excreção de proteína extracelulares em eucariotos
Enzimas segregadas são
modificadas extensamente
durante sua passagem pelo
retículo endoplasmático e
pelo aparato de Golgi
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Síntese e excreção de proteína extracelulares
• Enzima
segregada:
possa
difundir
livremente através da parede celular e, no
caso de fungos e batérias Gram positivas,
chegar ao meio externo.
• Algumas enzimas permanecem associadas
a estruturas da membrana ou da parede
celular.
• Nas bactérias Gram negativas a secreção
de enzimas é mais complexa, devido a
presença de uma membrana externa
Única enzima relevante produzida por uma bactéria
Gram negativa é a pululanase de Klebsiella pulmoniae.
(a) Bactérias Gram positivas; (b)
Bactérias Gram negativas; (c) Fungos
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Produção de Enzimas Microbianas
Etapa Upstream
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Produção de Enzimas Microbianas
Cinética de Produção de Metabólitos
• As enzimas como agentes metabólicos terão o caráter de metabólitos
primários ou secundários dependendo da sua função metabólica
• Maioria das enzimas comerciais: enzimas degradativas (catabolismo) e têm
as características dos metabólitos primários. Isto não é absoluto!
• Modelo de Ludecking & Piret para a cinética de produção de metabólitos
por fermentação:
dP
dt
dX
dt
X
Não-associada ao crescimento
Associada ao crescimento
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Produção de Enzimas Microbianas
Cinética de Produção de Metabólitos
• Modelo de Ludecking & Piret para a cinética de produção de metabólitos
por fermentação:
dP
dt
dX
dt
X
• Metabólitos primários:
• Metabólitos secundários,
• Situações intermediárias são freqüentes na prática.
Ex.: -amilase de Bacillus subtilis, glucoamilase de Aspergillus niger e
lactase de Escherichia coli
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Produção de Enzimas Microbianas
Cinética de Produção de Metabólitos
• Uma enzima não é necessariamente sintetizada durante parte do ciclo de
crescimento
• Meio de composição adequada
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Produção de Enzimas Microbianas
Aspectos de controle genético da produção enzimática
• Indução
Enzimas constitutivas: - Proporção minoritária com relação ao total;
- Enzimas que estão implicadas com os
aspectos centrais do metabolismo.
- Produzidas continuamente independente da presença
de substrato.
Enzimas induzidas: - Proporção maioritária com relação ao total;
- Vão sendo sintetizadas em proporções baixas, mas
significativas, até que um substrato ou um produto
derivado de sua degradação induza um grande
aumento na síntese enzimática.
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Produção de Enzimas Microbianas
Aspectos de controle genético da produção enzimática
• Repressão
- Repressão pelo substrato
Na presença de uma fonte de carbono rapidamente assimilável como a Dglicose, a síntese de muitas enzimas se encontra reprimida.
- Repressão por um catabólito é um fenômeno que se dá comumente nos
microrganismos e que afeta a muitas enzima constitutivas e induzidas
- Repressão pela presença de compostos que contenham enxofre, nitrogênio e
outros.
Ex.: síntese da proteinase extracelular de Bacillus subtilis é reprimida pela
presença no meio de cultivo de certos compostos que contenham nitrogênio,
como o glutamato e o aspartato.
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Produção de Enzimas Microbianas
Meios de cultivo
• Meio sintético x Matérias-primas naturais
• Fonte de carbono: carboidrato que ingresse nas vias metabólicas centrais,
geralmente na forma de glicose
• Fonte de Nitrogênio: usualmente sal de amônio
• Enxofre, fósforo e magnésio: sais inorgânicos (sulfatos e fosfatos)
• Elementos-traços (K+, Ca2+, Na+, Fe2+, Mg2+, Zn2+ e Co2+): funções
metabólicas indispensáveis; sais inorgânicos.
Alguns podem adquirir especial relevância (cofatores da enzima)
Ex.: Ca2+ no caso da amilase; Co2+ no caso da glicose-isomerase.
• Hidrogênio e Oxigênio
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Produção de Enzimas Microbianas
Meios de cultivo
• Vitaminas, fatores de crescimento, aminoácidos
• Compostos que favoreçam a excreção (surfactantes), no caso de enzimas
extracelulares
• Os mecanismos de controle que operam sobre a síntese enzimática (indução
e repressão catabólica) devem ser considerados na formulação do meio.
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Produção de Enzimas Microbianas
Escolha do microrganismo
• Produtor da enzima de interesse em grande quantidade;
• Estável;
• Não-patogênico;
• Fácil manipulação.
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Produção de Enzimas Microbianas
Sistemas de Cultivo
• Superfície
• Submerso
- Batelada
- Batelada alimentada
- Contínuo
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Sistemas de Cultivo
• Superfície
- Dificuldades de controle operacional;
- Severos problemas de contaminação
- Vantagens importantes em relação a transferência de oxigênio e
recuperação do produto.
- A principal tecnologia de fermentação superficial é a fermentação em
estado sólido.
É empregada para produzir, em escala comercial, celulases, amilases
fúngicas, pectinases, proteases fúngicas e lipases.
Microrganismo: fungos filamentosos do gênero Aspergillus.
-amilase bacteriana mediante fermentação em estado sólido com farelo de
arroz como substrato suporte.
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Produção de Enzimas Microbianas
Sistemas de Cultivo
• Submerso: BATELADA
- O sistema mais empregado na produção de enzimas. (importância do
conhecimento da cinética)
- Algumas enzimas são marcadamente instáveis depois da sua etapa de
produção.
- Efeito das variáveis operacionais mais relevantes: pH e temperatura compromisso entre os valores ótimos para produção e crescimento;
Ex.: Produção de celulase de Trichoderma reesei em meio de cultivo
celulósico onde o pH ótimo de crescimento é 4.8, enquanto que o ótimo
de produção é 3.5.
Solução: valores intermediários ou efetuar alterações programadas de pH
e temperatura
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Produção de Enzimas Microbianas
Sistemas de Cultivo
• Submerso: BATELADA
Cinética de produção de celulases de Trichoderma reesei em batelada, mostrando a
instabilidade da fração endoglucanase.
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Produção de Enzimas Microbianas
Sistemas de Cultivo
• Submerso: BATELADA
- O sistema mais empregado na produção de enzimas. (importância do
conhecimento da cinética)
- Algumas enzimas são marcadamente instáveis depois da sua etapa de
produção.
- Efeito das variáveis operacionais mais relevantes: pH e temperatura compromisso entre os valores ótimos para produção e crescimento;
Ex.: Produção de celulase de Trichoderma reesei em meio de cultivo
celulósico onde o pH ótimo de crescimento é 4.8, enquanto que o ótimo
de produção é 3.5.
Solução: valores intermediários ou efetuar alterações programadas de pH
e temperatura
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Produção de Enzimas Microbianas
Sistemas de Cultivo
• Submerso: BATELADA ALIMENTADA
- Batelada seguida de alimentação de forma contínua ou intermitente até
alcançar o volume final de operação dentro do reator;
- Vantagens:
Controlar a velocidade específica de crescimento do microrganismo.
Produção de metabólitos secundários, metabólitos sujeitos à inibição por
alta concentração de substrato e metabólitos sujeitos a repressão catabólica
por substratos altamente metabolizáveis;
Esta situação é aplicável a maioria das enzimas de interesse comercial.
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Produção de Enzimas Microbianas
Sistemas de Cultivo
• Submerso: CONTÍNUO
-O cultivo, se operado em estado estacionário, deverá se manter em estado
fisiológico definido que, a princípio, pode ser aquele de máxima produtividade
em relação ao metabólito que se deseja produzir.
- Pode-se manipular a velocidade de crescimento através da taxa de
alimentação.
- Aplicação industrial na produção de enzimas e outros metabólitos é reduzida.
Maior complexidade do equipamento e sua operação,
Baixa concentração do produto obtido
Maiores perigos de contaminação e de desenvolvimento de mutantes devido
aos grandes períodos de operação.
Produção de Enzimas
Produção de Enzimas Microbianas
Produção de Enzimas com Microrganismos Geneticamente Modificados
• Atualmente: Todas as enzimas produzidas comercialmente provém de
microrganismos que são um produto de programas de melhoramento
genético
• Perspectivas: produzir enzimas com microrganismos manipulados por
técnicas modernas de recombinação genética.
• Técnica: Clonagem genética, clonagem molecular ou DNA
recombinante.
Obtenção por síntese química, por biossíntese ou por purificação de uma
fonte natural, um fragmento de DNA que codifique a síntese de uma
determinada enzima e introduzir este fragmento através de um vetor na
célula hospedeira onde o código genético vai se reproduzir e se expressar.
Produção de Enzimas
Produção de Enzimas Microbianas
Produção de Enzimas com Microrganismos Geneticamente Modificados
Clonagem do DNA utilizando vetores de fago
Clonagem do DNA em um plasmídeo vetor
Produção de Enzimas
Produção de Enzimas Microbianas
Produção de Enzimas com Microrganismos Geneticamente Modificados
• As enzimas são produtos genéticos primários, o que torna muito atrativa
sua produção por esta via.
• Através dela pode-se conseguir:
- Produzir enzimas de organismos superiores em sistemas microbianos;
- Transferir a capacidade produtiva de uma cepa mais adequada do ponto
de vista sanitário ou econômico;
- Melhorar o nível de produção e a pureza da enzima produzida.
• Problemática: estabilidade genética do microrganismo;
• Na prática: a reversão a estados sub-produtivos ou não-produtivos;
• Destaca-se o enorme potencial desta técnica: êxitos mais significativos na
produção de enzimas com microrganismos clonados.
Produção de Enzimas
Produção de Enzimas Microbianas
Produção de Enzimas com Microrganismos Geneticamente Modificados
• Ex.: renina: protease de origem animal com alta demanda
- Substituição por renina microbiana (de Mucor miehii): parcial.
-Produção por tecnologia de DNA recombinante:
Celltex, Genex, Genencor e Codon: produção de renina com cepas de
Escherichia coli (sem excreção);
Genecor: produção de renina animal extracelular com cepas Aspergillus
nidulans.
Outros centros: produção de renina excretável com cepas de Saccharomyces e
Kluyveromyces.
Gist-Brocades: renina animal produzida por cepas clonadas de Kluyveromyces
marxianus.
Produção de Enzimas
Produção de Enzimas Sintéticas
Introdução
• Uma enzima, apesar de conter muitos aminoácidos, utiliza somente uma
pequena porção destes no processo catalítico.
Ex.: tripsina contém 254 resíduos de aminoácidos: três aminoácidos são
implicados no mecanismo de proteólise.
Os demais aminoácidos: importantes para formar o sítio de união ao substrato.
Produção de Enzimas
Produção de Enzimas Sintéticas
Métodos
• Basear a estrutura em proteínas ou peptídeos
- Modificar uma enzima ou proteína existente
- Construir uma estrutura peptídica totalmente nova
Ex.: mioglobina: proteína transportadora de oxigênio
Modificada para produzir uma enzima do tipo oxidase:
- Une-se um catalisador de transferência de rutênio [Ru(NH3)5]3+ a cada um dos
três resíduos de histidina na mioglobina
- Enzima “bio-inorgânica, semi-sintética”: capaz de reduzir o oxigênio enquanto
que oxida vários compostos tais como o ascorbato.
- Construir uma nova enzima ainda é inviável: não é possível predizer a
estrutura tridimensional
Produção de Enzimas
Produção de Enzimas Sintéticas
Métodos
• Desenvolvimento dos sítios de união para moléculas orgânicas simples:
construir análogos não protéicos de enzimas
-Sistemas mais estudados:
dextrinas de Schardinger: oligosacarídeos cíclicos com resíduos de D-glicose
unidos por ligações - 1,4 e que formam sólidos cristalinos.
ciclomaltohexose ( -ciclodextrina): 6 resíduos de glicose
ciclomaltoheptose ( -ciclodextrina): 7 resíduos de glicose
ciclomaltooctose ( -ciclodextrina): 8 resíduos de glicose
Produção de Enzimas
Produção de Enzimas Sintéticas
Métodos
dextrinas de Schardinger:
Estrutura da ciclomaltohexose ( -ciclodextrina)
Orientação dos resíduos: formação de uma estrutura cilíndrica
- Interior relativamente hidrofóbico
- Grupos hidroxila estendendo-se a partir das bordas da molécula
- Proporcionam um sítio hidrofóbico
- Com o acoplamento covalente dos grupos reativos apropriados: possibilidade
de produzir um análogo enzimático.
Produção de Enzimas
Produção de Enzimas Sintéticas
Métodos
• Desenvolvimento dos sítios de união para moléculas orgânicas simples:
construir análogos não proteicos de enzimas
- Resultados
-ciclodextrina com 0-[-4(5)-mercaptometil – 2 – il] benzoato covalentemente
unido à borda da molécula: imitando centro ativo da quimotripsina.
Enzima sintética: máximo de atividade em pH 10
( -benzima) capaz de catalisar a hidrólise de certos ésteres tão rápido
quanto a quimotripsina.
cinética de Michaelis-Menten
é mais estável ao calor e ao alcali que seu equivalente natural.
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