ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO DA REGIÃO
-1082 DO GENE IL10 EM MULHERES COM
LESÕES INTRAEPITELIAIS CERVICAIS
RELACIONADAS À INFECÇÃO PELO HPV
Ana Flávia Carneiro de Albuquerque Crispino1, Renata Tavares Burlamaqui Proa1,Tamires dos Santos Silva1, Mayara
Costa Mansur Fernandes1,Sérgio Ferreira de Lima Júnior1, Athayde Leite de Sá Filho2, Sandra Heráclio3, Paulo Roberto
Eleutério de Souza4, Maria de Mascena Diniz Maia5

Introdução
A infecção pelo Papilomavírus Humano (HPV) é
uma das doenças Sexualmente Transmissíveis (DSTs)
de maior incidência e prevalência no mundo. [1].
Estudos epidemiológicos no Brasil têm mostrado que,
apesar da infecção pelo papilomavírus ser muito
comum (estima-se que cerca de 25% das mulheres
brasileiras estejam infectadas pelo vírus), somente uma
pequena fração das mulheres infectadas com um tipo de
papilomavírus oncogênico eventualmente desenvolverá
câncer do colo do útero. Mas, somente a infecção por
HPV não é o suficiente para a evolução do câncer,
sabe-se que outros fatores também podem estar
relacionados. Por exemplo, a imunodeficiência está
associada com uma rápida progressão do câncer
cervical.
Mesmo que ainda não se saiba a verdadeira relação
entre a infecção por HPV e o desencadeamento do
câncer de colo de útero, estudos sugerem que células
mediadoras de imunidade são importantes no controle
da infecção por HPV e no controle de neoplasmas
associados a esta infecção [2]. As células mediadoras
de imunidade são reguladas por citocinas que são
moléculas envolvidas na emissão de sinais entre as
células durante o desencadeamento das respostas
imunes. Estas citocinas são secretadas, em parte, pelas
células T auxiliares (Th). De acordo com o seu padrão
de produção, as citocinas são divididas em dois grupos:
Th1 e Th2. As células Th2 produzem a IL-10 e
algumas outras citocinas que favorecem a imunidade
humoral contra patógenos extracelulares e respostas
alérgicas [3]. Diversas alterações na resposta imune
celular tem sido relatadas em pacientes com lesões
(pré) neoplásicas cervicais. [4]
Este trabalho tem como objetivo relacionar a
presença de lesões intraepiteliais cervicais, sendo
causadas pela infecção por HPV, com o polimorfismo
do gene IL-10 (-1082).
Material e métodos
A. Amostras clínicas
Foram utilizadas 36 amostras de secreção vaginal de
mulheres que apresentam lesões intraepiteliais
cervicais. Estas amostras foram divididas em dois
grupos de acordo com a presença ou não da infecção
por HPV.
B. Extração de DNA das amostras
Procedeu-se a extração de DNA a partir de 500µl de
secreção vaginal utilizando o kit de extração “Wizard
Genomic DNA Purification kit” (PROMEGA). Após a
extração as amostras foram tratadas com RNAse e
posteriormente mantidas a uma temperatura de -20ºC.
C. PCR para identificação do polimorfismo da IL-10 (1082)
Para a reação de PCR foi utilizado um protocolo
com volume final de 10 μl contendo: ~ 200 ng de
DNA; de tampão 1X da enzima Taq Platinum
(invitrogen Life Technologies); deoxinucleotídeo
trifosfato (dNTP) 0,2mM, MgCl2 2,5 mM, 0,03U de
Taq Platinum DNA polimerase (Invitrogen, Life
Technologies); e 0,5 pmol/ul de cada um dos primers.
Foram realizadas 2 reações para cada amostra porque
utilizamos 2 primers alelos específicos (A ou G) e um
primer reverso comum para as duas reações (C) para,
assim, podermos genotipar cada amostra.
O protocolo de amplificação utilizado foi o seguinte:
desnaturação a 95 ° C por 5 min, seguido de 35 ciclos
de desnaturação a 95 ° C por 45 segundos, anelamento
a 62 ° C por 45 segundos e extensão final a 72 ° C por
________________
1. Aluno de graduação do curso de bacharelado em ciências biológicas, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua Dom Manoel de Medeiros,
s/n - CEP: 52171900 – Recife/PE
2. Aluno de mestrado da Universidade de Pernambuco
3.Médica do Instituto de Medicina Integral Prof. Fernando Figueira. Rua dos Coelhos, 300 Boa Vista - Recife - PE - Brasil
CEP 50070-550
4. Professor adjunto do departamento de biologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua Dom Manoel de Medeiros, s/n - CEP: 52171900
– Recife/PE
5. Professora associada, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua Dom Manoel de Medeiros, s/n - CEP: 52171900 – Recife/PE
Apoio financeiro: CNPq.
8min. A reação foi mantida em temperatura de 4 °C.
A separação do produto da amplificação foi
realizada pela eletroforese em gel de agarose 1,5%,
corado com Sybr Green e visualizado em luz
ultravioleta. O tamanho dos fragmentos obtidos da
PCR foram comparados com o marcador de peso
molecular ladder (Promega).
D. PCR para detecção do HPV
A amplificação para o sistema MY09/11 foi
realizada para um volume final de 15µl contendo 1x de
tampão da PCR, 100µM de cada dNTP (dATP, dGTP,
dCTP, dTTP), 1,5mM de MgCl2, 1pmol/µl de cada
primer específico (MY09 e MY11), 0,2 U de Taq DNA
polimerase e 200ng de DNA. Para essa reação foi
utilizado o kit “GoTaq® Hot Start Polymerase”
(PROMEGA). O seguinte protocolo de amplificação
foi utilizado: 94ºC por 4 minutos, seguidos de 40 ciclos
de desnaturação à 94ºC por 30 segundos, anelamento à
55ºC por 30 segundos e extensão à 72ºC por 30
segundos, seguidos de uma extensão adicional à 72ºC
por 8 minutos. O tamanho do fragmento esperado para
essa reação é de 450pb.
Como controle da qualidade da amostra utilizou-se
um sistema de primers específicos para β-globina
humana. As condições utilizadas para essa reação foi a
mesma do sistema de primers MY09/11. O tamanho do
fragmento esperado para essa reação é de 268pb.
E. Análise estatística dos resultados:
A comparação dos resultados entre os dois grupos
foi realizada usando o contingency 2x2 (c2/a two-tailed
Fisher Exact Probability Test) e foi calculada usando o
web site Vassarstats para o cálculo estatístico.
Resultados
Das 36 amostras de secreção vaginal analisadas, 12
foram positivas para HPV e 24 foram negativas. Estas
amostras foram então divididas em dois grupos para a
análise do polimorfismo na região promotora do gene
IL10 (Tabela 1). Desta forma, a frequência dos
genótipos foram determinadas no grupo HPV posisitivo
16%GG, 49%AG e 35%AA e no grupo HPV negativo
33%GG, 49%AG e 18% AA. Estes resultados mostram
que as freqüências genotípicas são significantemente
diferentes p= 0,03364 (95% IC 0.28-0.95, OR
0,5860962) entre os grupos analisados, mostrando que
existe correlação entre o polimorfismos do gene IL-10
e a susceptibilidade a infecção pelo HPV. Além disso,
as freqüências alélicas também são significantemente
diferentes em HPV positivo se comparado ao grupo
negativo (p=0,003794).
Discussão
O papel do polimorfismo do gene IL-10 (-1082) na
suscetibilidade de várias doenças infecciosas tem sido
bastante estudado, mas, por outro lado, o significado
funcional de vários polimorfismos ainda é incerto.
Nossa pesquisa confirmou a associação entre a
presença da mutação (-1082) no alelo A do gene IL-10
e a infecção pelo HPV em mulheres com lesões
intraepiteliais. Estes resultados são discordantes
daqueles obtidos por Govan et al. [5] que não
verificaram associação do polimorfismo do gene IL-10
e a infecção por HPV em duas populações: africana e
italiana. Por outro lado, outros estudos investigaram um
possível papel deste polimorfismo na prevalência do
câncer cervical induzido por HPV [6,7]. Desta forma, este
resultado vem reforçar o possível papel deste
polimorfismo na infecção pelo HPV na população
brasileira.
Referências
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perianal assintomático em pacientes portadores de HPV
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de Medicina de Botucatu. Rev bras Coloproct,
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[2] Wu TC. Immunology of the human papilloma virus
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[3]Scott P. IL-12 Initiation citokyne for cell mediated
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[4]Levy S, kopersztych S, Musatti CC, Souen JS,
Salvatore CA, Mendes NF. Cellular immunity in
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[5] Vandana A Govan1, Henri RO Carrara2, Johnny A
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[6] Stanczuk GA, Sibanda EN, Perrey C, Chirara M,
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[7] Ghaderi M, Nikitina L, Peacock CS, Hjelmstrom P,
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