PPBio Amazônia Ocidental
Componente Temático:
Bioprospecção
Dra. Cecilia Veronica Nunez
Pesquisadora do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA
[email protected]
Objetivos
Objetivo Geral: Ampliar e aprofundar o
conhecimento da biodiversidade da Amazônia e
do seu potencial químico, biológico e econômico
para subsidiar as políticas de geração de
produtos e de melhoria da qualidade de vida da
população local.
Objetivo Específico 1. Realizar ensaios de atividade
antioxidante, citotóxico, anti-helmíntico, antibacteriano,
antifúngico, antimalárico, tuberculocida, antiinflamatório,
analgésico e inseticida em extratos, frações, substâncias
isoladas e óleos essenciais das espécies vegetais
selecionadas.
Objetivo Específico 2. Realizar o fracionamento
biomonitorado de extratos ativos visando a identificação
de princípios ativos.
Objetivo Específico 3. Realizar inventários
etnobotânicos em comunidades da Amazônia,
associados a obtenção de informações ecológicas e das
formas de manejo tradicional.
Objetivo Específico 4. Avaliar a toxicologia dos
extratos ativos nos ensaios realizados.
Estratégias de Pesquisa
Pelos entraves com o CGEN: 2 vertentes:
Escolha das plantas para bioprospecção:
Família vegetal com relatos de produção de
substâncias com atividade biológica.
Citações em livros e artigos de usos
etnobotânicos.
Levantamento etnobotânico nas
comunidades apenas para produção da
cartilha - 3 anos para conseguir a
autorização!
Para testar esses extratos: novo pedido em
Metodologia
Coleta do material vegetal;
Exsicata (depósito e identificação botânica);
Secagem;
Moagem;
Extração com solventes orgânicos e/ou água
destilada;
Ensaios biológicos com os extratos;
Fracionamento;
Ensaios biológicos com as frações e substâncias.
Entrevista livre para a abordagem etnobotânica.
Atividades Biológicas
CPPN / INPA:
Antioxidante;
Citotóxica (Artemia salina);
Antiinflamatória;
Analgésica;
Toxicologia.
Formação de Rede / Atividades
Brasil (Manaus):
Dentro do INPA - antifúngico, inseticida.
Fiocruz - antimalárico
UFAM - antibacteriano (bactérias de peixes)
UEA - biotransformação
EMBRAPA - doenças de animais de corte
Formação de Rede / Atividades
Brasil:
UFRGS (Porto Alegre, RS) - anti-helmíntico e
antifúngico
FURG (Rio Grande, RS)- anti-tuberculose
INCRA (Assentamento em Apuí, AM) - uso das plantas
Fundação Viver, Produzir, Preservar (Altamira, PA) uso das plantas
UFPA (Altamira, PA) – Herbário
França:
Université de Lille 2 (colaboração nos isolamentos e
análises das substâncias) – Interesse do PPBio e dos
cursos de Pós-Graduação
Rede de fitoquímicos e de ensaios para evitar
duplicação de estudos e desperdício de dinheiro
público (união de esforços em vez de “editais”).
Ensaios complementares nas instituições, por exemplo,
bactérias distintas sendo alvo dos extratos.
Atualmente estão em fracionamento 18 extratos
vegetais
INPA: Cecilia V. Nunez, Maria da Paz Lima, Adrian M.
Pohlit, Pierre A. Santos
UFAM: Valdir F. Veiga Jr.
Novas colaborações:
IEPA: Fabiano Cesarino
UFAC: Carromberth C. Fernandes.
Em construção um prédio (recursos da FINEP para
o grupo de bioprospecção - INPA), onde
duplicaremos o espaço para realizar os
fracionamentos e os ensaios biológicos (DCR,
doutorandos, etc.).
Resultados
Patentes:
Depósito de uma patente sobre o isolamento da
zerumbona, um sesquiterpeno com atividade
antitumoral descrita na literatura.
Empresa Croda ⇒ interessada em comercializá-la e
está em negociação com o Núcleo de Negócios e
Propriedade Intelectual do INPA para formalizar os
trâmites legais.
Depósito de uma patente sobre derivados de
nerolidil-catecol com atividade antimalárica.
Constituição de Extratoteca com 360 extratos
Principais Famílias: Rubiaceae, Fabaceae, Rutaceae.
Atividade antioxidante
(em equivalente em ácido ascórbico)
Extratos Atividade
Alta (1-2)
Atividade
Mediana
(2,1 a 4)
Atividade
Baixa
(4,1 a 9)
Sem
atividade
(> 9)
DCM
2
4
12
89
MeOH
34
19
15
50
H2O
16
19
22
68
Total
52
42
59
207
Aeromonas hydrophila
(bactéria patogênica de peixes)
Atividade
Média
Alta
0
0
0
0
1
0
Extratos
Total Ext.
Hex
DCM
AcOET
7
19
6
Baixa
3
8
2
EtOH
10
4
1
0
5
MeOH
52
16
9
0
27
H2O
30
4
6
0
20
Soma
124
37
17
0
70
Não ativo
4
11
3
Antifúngico (Cryptococcus sp.)
Meningite, entre outras
Atividade
Média
Alta
Extratos
Total Ext.
DCM
3
0
0
0
3
MeOH
10
0
0
1
9
H2O
2
0
0
0
2
Soma
15
0
0
1
14
Baixa
Não ativo
Ensaio sobre Artemia salina.
Figura 1 – Montagem do experimento inseticida
Figura 2 – Criação de Tenebrio molitor
Figura 3 – Manutenção da criação
Etnobotânica
• Demanda dos Índios Arara e Xipaia (PA),
onde nos solicitaram o levantamento das
plantas medicinais, principalmente as
usadas para malária
– Arara: 32 plantas usadas.
– Xipaia: 42 plantas usadas.
– Assentamento Tarumã-Mirim (AM): 134
plantas usadas.
– Assentamento do Juma (INCRA), Apuí (AM):
73 plantas usadas.
Aricafu Xipaia, coletando
Agosto de 2006, autorização do CGEN, outubro 2008.
ETNOCONHECIMENTO DAS PLANTAS
ODONTÁLGICAS
USADAS NO ASSENTAMENTO TARUMÃ-MIRIM,
AMAZONAS, BRASIL
Comunicações em Congressos
Ano
2005
Congresso
Nacional
1
Congresso
Internacional
2006
5
1
2007
8*
2
2008
8
9
2009
10
* Um trabalho foi premiado com o 2º lugar no congresso.
Artigos publicados
Ano
2006
Revistas
Nacionais
6
Revistas Internacionais
2007
6
7
2008
4
4
2009
4
3
3
Capacitações Concluídas
Alunos PIBIC-Jr
PIBIC
Trabalho de Mestrado Doutorado
Conclusão
de Curso
DCR
2005
4
2006
6
1 (UNIP
e
ULBRA)
4
1
1 (UERR)
4
(UFAM,
CEFET)
1
1
2 (UFAC e
Fund.
Paulo
Feitosa)
7
3
2
2007
4
6
2008
2
5
2009
1
Total
7
21
2
2
1 (UEA)
Capacitações em Andamento
Alunos
PIBIC-Jr
PIBIC
Mestrado
Doutorado
DCR
2009
1
26
6
5
1
Total
Geral
39
Integração com Outros Programas
Programa Biota FAPESP – Bioprospecta: com Profa.
Dra. Marilene Demasi, que coordena o projeto:
“Screening for specific proteasome inhibitors followed by
the determination of proapoptotic and antitumoral
properties in cell culture”, porém não tem interesse em
extratos, ela testará as moléculas puras.
Participamos do CYTED: “X.11.- PROYECTO
IBEROAMERICANO DE BÚSQUEDA Y EVALUACIÓN
DE AGENTES NATURALES ANTITUBERCULOSOS
(PIBATUB)”, coordenado pela Dra. Esther del Olmo
Fernández, da Universidade de Salamanca, Espanha,
concluído. Esta participação permitiu a colaboração
frutífera com o Prof. Dr. Pedro Almeida, FURG.
LBA: Co-orientação de um mestrado orientado pelo Dr.
Flávio Luizão.
Material Didático
Estamos preparando o material didático para
orientar os trabalhos laboratoriais de obtenção
de extratos, realização de fracionamento,
realização de ensaios biológicos e para a
operação do CLAE, CG e do RMN 60 MHz.
Estes materiais serão disponibilizados para os
demais participantes do Programa PPBio.
Título do projeto: Estudo químico dos extratos diclorometânico e metanólico das folhas e
dos galhos de Minquartia guianensis Aubl. (Olacaceae) visando substâncias
antioxidantes, citotóxicas e/ou antifúngicas.
Aluna: Lorena Mayara de Carvalho Cursino
Orientadora: Cecilia Veronica Nunez
Extrato DCM
(3,5 g)
CC de SiO 2
MG 1.0-2
Esqualeno
( 4 mg)
MG 1.23-29
(480 mg)
MG 1.10-13
Lupen-3-ona
(425 mg)
MG 1.105-109
(62 mg)
Coluna de SiO 2
MG 2,0-3
(114 mg)
MG 2.4-8
(133 mg)
MG 2.9-11
(25,6 mg)
Purificação CLAE
MG 2.17-18
(7 mg)
Coluna de
SiO2
MG 3.0
(1 mg)
MG 3.1
(14 mg)
Recristalizaēćo
com acetona
MG 3.1
Taraxerol
(4 mg)
MG 3.2-4
Taraxerol
(39,7 mg)
MG 3.8-9
(6 mg)
MG 3.1.1
Lupeol
(10 mg)
Figura 1: Fluxograma o extrato diclorometânico das folhas de Minquartia guianensis. Aubl.
Figura 2: Estruturas das substâncias isoladas das folhas de Minquartia guianensis.
Extrato MeOH (Folhas)
(5 g)
Coluna filtrante
de SiO2
MG 4.0-5
(Hex/DCM)
(148 mg)
Gradiente: acetona em
Hexano
MG 5.0-3
(15,6 mg)
MG 5.4-5
(13,7 mg)
MG 4.6-8
(AcOEt)
(73 mg)
MG 4.9-12
(MeOH)
(3,736 g)
CC Florisil
CC SiO2
MG 5.15
(25 mg)
Purificação
CLAE
Solventes: Hexano,
DCM, AcOEt e
MeOH
Gradiente:
AcOEt em DCM até
MeOH
MG 5.16 MG 5.28-30 MG 6.0-1 MG 6.70
(16,6 mg)
(18 mg)
(10,8 mg) (194 mg)
Purificação
CLAE
Gradiente: AcOEt em CC Florisil
MG 6.71-73
(1,168 g)
DCM até MeOH
MG 7.0-6
(7,9 mg)
MG 7.45-51
( 125 mg)
Figura 4: Fluxograma do fracionamento do extrato metanólico das folhas.
Figura 6: Cromatograma de MG5.16.
Condição de MG5.16: AcOEt isocrático, vol inj. 50µL, fluxo: 5mL/min, amostra dissolvida em
AcOEt, coluna SemiPrep NH2, 250x10mm, 5µm.
Resumos em Congressos:
•CURSINO, L. M. C., BRENNER, M. M., PEREIRA, E. C. L., SANTOS, P. A., OLIVEIRA, J. A. A.; PEREIRA JÚNIOR, O.
L.; NUNEZ, C. V. Estudo químico dos extratos diclorometânico e metanólico das folhas e dos galhos de Minquartia guianensis
Aubl. (Olacaceae), visando substâncias antioxidantes, citotóxicas e/ou antifúngicas. XVII Jornada de Iniciação científica. 2008.
Resumo expandido.
•CURSINO, L. M. C., BRENNER, M. M., MENEZES, J. F., COMANDOLLI, C. D., PEREIRA, E. C. L., SANTOS, P. A.,
NUNEZ, C. V. Atividade citotóxica dos extratos dos galhos de Minquartia guianensis Aubl. In: XX Simpósio de Plantas
Medicinais do Brasil e X International Congress of Ethnofarmacology, São Paulo, SP, 2008.
•ANDRADE, J. I. A. ; CURSINO, L. M. C.; SOUZA NETO, J. N. ; SANTOS, P. A. ; OSORIO, M. I. C. ; NUNEZ, Cecilia
Veronica . Actividad antibacteriana del extracto metanólico de las ramas de Minquartia guianensis contra Aeromonas
hydrophila.. In: Congreso Iberoamericano de Química e XXIV Congreso Peruano de Química, 2008, Cusco, Peru. Libro de
Resumenes. Lima: Sociedad Química del Peru, 2008. v. 1. p. 419-420.
•CURSINO, L. M. C. ; MESQUITA, A. S. S. ; MESQUITA, D. W. O. ; AMARAL, I. L. ; ROQUE, L. C. ; PEREIRA JÚNIOR,
O. L. ; NUNEZ, C. V. . Triterpenos das folhas de Minquartia guianensis Aubl.. In: 30ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira
de Química, 2007, Águas de Lindóia. Livro de resumos, 2007.
•RAMOS, D. F. ; GROLL, A. V. ; SCAINI, C. J. ; PEREIRA, E. C. L. ; CURSINO, L. M. C. ; MESQUITA, A. S. S. ;
PINHEIRO, C. C. S. ; NUNEZ, C. V. ; Silva, P. E. A. . Atividade Anti-microbacteriana de Extratos Vegetais da Amazônia. In:
24º Congresso Brasileiro de Microbiologia, 2007, Brasília. Livro de resumos, 2007.
•CURSINO, L. M. C. ; SOUZA, E. S. ; OLIVEIRA, J. A. A. ; NUNEZ, C. V. . Estudo químico dos extratos diclorometânico e
metanólico das folhas de Minquartia guianensis Aubl. (Olacaceae) visando substâncias antioxidantes e/ou citotóxicas.. In: XVI
Jornada de Iniciação Científica PIBIC CNPq/FAPEAM/INPA, 2007, Manaus. Livro de resumos, 2007.
•CURSINO, L. M. C. ; NUNEZ, C. V. . Chemosystematics Significance of Triterpenes in Olacaceae. In: XXVII
Reunião Anual sobre Evolução, Sistemática e Ecologia Micromoleculares (RESEM), 2007, São Predo. Livro de
resumos, 2007.
•CURSINO, L. M. C. ; Nunez, C. V. ; Gonçalves, J. B. . Estudo químico das folhas de Minquartia guianensis Aubl.
(Olacaceae) visando substâncias antioxidantes.. In: XV Jornada de Iniciação Científica do
PIBIC/CNPq/FAPEAM/INPA, 2006, Manaus. Livro de resumos, 2006.
•MESQUITA, D. W. O. ; NUNEZ, C. V. ; PEREIRA JÚNIOR, O. L. ; MESQUITA, A. S. S. ; CURSINO, L. M. C. ;
CARVALHO, S. R. . Determinação da Atividade Antioxidante dos Extratos Diclorometânico e Metanólico das Folhas
de Ferdinandusa goudotiana K. Schum. (Rubiaceae) por DPPH e ABTS. In: 58ª Reunião Anual da SBPC, 2006,
Florianópolis. Livro de resumos, 2006.
•CURSINO, L. M. C. ; SOUZA, E. S. ; PEREIRA, E. C. L. ; NOVAES, J. A. P. ; OLIVEIRA, J. A. A. ; NUNEZ, C. V.
. Atividade antioxidante, citotóxica e antifúngica dos extratos diclorometânico e metanólico das folhas de Minquartia
guianensis Aubl. (Olacaceae). In: XVI Congresso Italo latino americano de Etnomedicina, 2007, La Plata.
Artigo publicado (2009):
CURSINO, L. M. C.; MESQUITA, Adriana Spirotto Stein; MESQUITA, Denny William de Oliveira ; FERNANDES,
C. C. ; PEREIRA JUNIOR, Orlando Liborio ; AMARAL, I. L. ; NUNEZ, C. V. . Triterpenos das folhas de Minquartia
guianensis Aubl. (Olacaceae). Acta Amazonica, 2009.
Pontos Negativos
• CGEN: entrave sério para a
bioprospecção;
• Falta de apoio institucional (2 meses para
liberar a obra, recurso do CNPq);
– Pesquisador tem que fazer tudo: trabalho de
secretaria, cotações, compras, fiscalizar
obra... Além dos “normais”: projetos,
relatórios (nossos e dos alunos), orientar,
corrigir teses e dissertações...
– Sugestão: bolsas de gestão
Pontos Negativos
• Burocracia (INPA, MCT, CGEN, CNPq),
somos obrigados a preencher centenas de
formulários mas somos cobrados por
artigos publicados (e o tempo e a calma
para fazê-los???), cobranças internas e
externas (conseguir recursos do CNPq)
• Pela ocupação do tempo com a
burocracia, “sobra” pouco tempo para
preparar artigos e orientar.
Pontos Positivos
• Formação da rede, para ensaios, coletas,
fracionamentos, assim conseguimos
otimizar o recurso público;
• Aquisição de equipamentos de grande
porte, uso multi-institucional;
• Bolsas para estudantes, fundamentais
para o andamento do projeto e a
capacitação regional.
Equipamentos adquiridos pelo PPBio
Cromatógrafo Gasoso
(CG)
Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência
(CLAE ou HPLC)
Equipamentos adquiridos pelo PPBio
Concentrador de amostras (“Speed-Vac”)
Ultra-Violeta (UV)
Equipamentos aquiridos pelo projeto CNPq/CT-Agro, ligado ao PPBio
Liofilizador
Equipamentos aquiridos pelo projeto CNPq/CT-Agro, ligado ao PPBio
Ressonância Magnética Nuclear 60 MHz
Fundamental para a triagem de extratos ativos e frações.
Instalado há 1 mês.
Entrevista da Rede Amazônica, abril de 2008.
Foto tirada em 04 de setembro de 2005.
Fiocruz - Antibacteriana (bactérias que provocam diarréia)
Dra. Patrícia Orlandi, contato realizado há 15 dias.