EFEITO CITOTÓXICO DE EXTRATO EXTRACELULAR
OBTIDO DO GÊNERO Bacillus sp.
Silva, M.L.(1); Viana, W.C.M.(1); Feijó, F.M.C.(2); Batista, A.C.L.(1)
[email protected]
(1)
Laboratório de Biotecnologia de Fármacos, Universidade Federal Rural do SemiÁrido - UFERSA, Mossoró - RN, Brasil;
(2)
Laboratório de Microbiologia Veterinária, Universidade Federal rural do SemiÁrido - UFERSA, Mossoró - RN, Brasil.
RESUMO
Os micro-organismos halófilos são considerados com um forte potencial de
metabólitos secundários de interesse em diversos setores industriais. A
existência óbvia do grande potencial de aplicações de interesse biotecnológico
referente aos micro-organismos halófilos evidencia a grande importância de
projetos de investigação destinada à busca de biomoléculas. Nesse contexto,
esse trabalho teve como objetivo analisar in vitro a atividade citotóxica de
extrato extracelular de bactéria halófila Bacillus sp. em células de câncer de
rins. Para tal fim, utilizou-se do método de MTT. As células foram cultivadas
em placas de 96 poços, 100 µL/ poço (5x 103 e 1x 104 células/poço) com as
diferentes concentrações do extrato por um período de incubação de 24 h. As
concentrações de 75 e 100 µg/mL obtiveram os maiores efeitos de ação
antiproliferativa a frente da linhagem 786.0. Concluindo assim que o extrato
extracelular da espécie Bacillus sp. nas condições experimentais exercidas
obteve severa atividade citotóxica.
Palavras-chave:
Halotolerante.
Anticâncer,
Produto
Natural,
Micro-organismo
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INTRODUÇÃO
Os estudos dos micro-organismos halófilos tiveram inicio há cerca de
um século, tendo um maior impulso nos últimos 25 anos. O termo
halófilo vem do grego “halo” sal e “filo” amante de, assim sendo
amante de sal (SORIA, 2004). Existindo uma diversidade ampla tanto
no filo procarioto como no eucarioto, sendo capazes de balancear a sua
pressão osmótica em relação ao meio resistindo aos efeitos nocivos do
sal, como inibidor do crescimento microbiano (GONZÁLEZHERNÁNDEZ & PEÑA, 2002; SORIA, 2004). Esses podem ser
isolados de salinas terrestres, sendo essas úteis para a realização de
estudos sobre a diversidade microbiana por apresentar uma grande
distribuição de salinidade (DASSARMA & ARORA, 2002; SORIA,
2004).
Os micro-organismos halófilos são considerados com um forte
potencial de metabólitos secundários de interesse em diversos setores
industriais, como: alimentar, farmacêutico, cosmético, químico, dentre
outros (SORIA, 2004). Esses metabólitos de interesse farmacêutico são
extensamente isolados de micro-organismos terrestres tendo fornecido
importante contribuição para a formulação de novos agentes
antibacterianos, imunossupressores, agentes redutores de colesterol,
agentes anti-helmínticos, antidiabéticos e agentes anticâncer (BIONDI
et al., 2008; CHIN et al., 2006; DEMAIN & VAISHNAV, 2011).
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Algumas das aplicações que podem ser destacadas são a das
bacteriorrodopsinas, devido as suas propriedades fotocrómicas, sendo
utilizada na elaboração de materiais ópticos, holografia, moduladores
especiais de luz, dentre outros; a dos solutos orgânicos, os quais tem a
função de agir estabilizando biomoléculas e células, como antagonistas
de sais e protetor de estresse; a dos biopolímeros, como exemplos os
exopolissacarídeos, lipossomas, polihidroxialcanoatos; a das enzimas,
aqui citamos as hidrolases e as isomerases; a das halocinas, que
protegem contra o infarto do miocárdio; a dos pigmentos carotenóides
(β caroteno) e a dos ácidos graxos poli-insaturados de cadeia larga,
usados como complementos na dieta humana (SORIA, 2004).
A existência óbvia do grande potencial de aplicações de interesse
biotecnológico referente aos micro-organismos halófilos evidencia a
grande importância de projetos de investigação destinada à busca de
biomoléculas. Esperando-se um futuro muito promissor no campo da
aplicação biotecnológica desses micro-organismos (SORIA, 2004).
Nesse contexto, esse estudo pioneiro sobre o potencial biotecnológico
da microbiota do solo da salina São Camilo (Mossoró, Rio Grande do
Norte, Brasil), objetivou analisar in vitro a bioatividade citotóxica do
extrato extracelular da bactéria Bacilus sp. sob células tumorais.
Portanto, a área de pesquisa de produtos naturais produzidos por microorganismos deve ser expandida significativamente à medida que são
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ampliados os estudos de descoberta de novos micro-organismos e dos
seus bioprodutos (NEWMAN & CRAGG, 2012).
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta e Isolamento da Bactéria
Sedimentos de 100 g de solo foram coletados na salina São Camilo (S
05º 03.947’; N 37º 16.318’) Mossoró, Rio Grande do Norte, Brasil, com
o auxílio de sacos plásticos estéreis e técnicas assépticas. Para o
isolamento, as amostras foram suspensas em erlenmeyer com 90 mL de
solução de enriquecimento (Na4P2O7 2%) e agitadas em shaker por 30
minutos, seguido de igual período para permanecer estático para
decantação. Posteriormente, 10 mL da solução foram suspensas em 90
mL de solução de diluição (NaCl 2,25g; KCl 0,1 g; CaCl2 0,04g;
NaHCO2 0,05 g), sendo a solução diluída em forma de série a partir de
10-1 a 10-5. Alíquotas de 1 mL foram semeadas em placas de Petri
contendo
meio
BDA
(batata
dextrose
ágar)
com
diferentes
concentrações de NaCl (5%, 15% e 30%) e incubadas a 37º C por 24 h
até o aparecimento de pequenas colônias. Estrias de esgotamento foram
realizadas para garantir a pureza das colônias, que foi confirmada por
coloração de Gram e o uso de microscopia de luz. Linhagens puras
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foram inoculadas em meio líquido BHI (Brain Heart Infusion) contendo
5% de NaCl para a escala de crescimento.
Estudo Morfológico e Bioquímico
Morfologia celular e pigmentação foram observadas com o cultivo da
bactéria em placas de Petri contendo meio BHI, a coloração de Gram
também foi examinada. Catalase, DNAse, urease, oxidase, como
descrito por Bergey’s (1985) com algumas modificações, para a
verificação do gênero. Crescimento em diferentes pH (5, 7 e 9), em
concentrações de NaCl de 5 a 30 % e em diferentes temperaturas (5, 28,
37 e 45 º C) foram investigados. Também foi investigado o crescimento
das colônias em diferentes carboidratos como substrato (sacarose,
glucose, lactose, maltose, galactose). Para os testes acima, utilizou-se
tubos de ensaio contendo as soluções já citadas nas condições
estabelecidas pelos testes.
Escala de Crescimento e Extração
Esse procedimento seguiu Thomas e colaboradores (2011) com
modificações. Inicialmente, a cultura foi incubada em 10 mL de meio
líquido BHI em tubos de ensaio por 24 h. Para o crescimento em escala
foi utilizado 50 mL de caldo nutritivo (extrato de carne 3%; peptona
5%; NaCl 5%) em erlenmeyer com um inóculo bacteriano de 500 µL,
incubadas a 37º C por 24 h em 150 rpm. A cultura resultante foi
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centrifugada à 2000 rpm por 15 min e o sobrenadante suspenso em um
mesmo volume de acetato de etila (AcOEt) 1:1. A solução foi
evaporada à vácuo (evaporador rotativo BT 351, BIOTHEC®) e
liofilizada (Liofilizador LS 3000, TERRONI®). O extrato foi
ressuspenso em água destilada contendo DMSO 0,1% e filtrado em
poros de 0,22 µm (syringe filters K18-230 KASVI). Neste momento, o
extrato seguiu para o ensaio biológico.
Bioensaio de MTT
Todo o bioensaio foi realizado no Laboratório de Biotecnologia de
Polímeros Naturais, no Departamento de Biociências, da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, UFRN. Para o bioensaio de
citotoxicidade foi utilizada a linhagem de câncer de rins 786.0. As
células foram cultivadas em placas de 96 poços, 100 µL/ poço (1x 104
células/poço) contendo meio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle
Medium) com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/
estreptomicina e incubadas em incubadora (LABOVEN®) de CO2 5%
por 12 h a 37º C para adesão celular. Posteriormente, o meio
suplementado foi removido e somente o meio sem suplemento foi
plaqueado, e as placas incubadas por mais 24 h. Após esse período,
poços foram estabelecidos como controle negativo, contendo somente
meio de cultura, e tratamento nas concentrações de 10, 25, 50, 75 e 100
µg/mL, incubados por 24 h. O meio foi removido e 100 µg contendo
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0,5
mg/mL
de
MTT
(brometo
de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-iol)-
2,difeniltetrazólio, Anresco®) diluído em meio sem soro foi adicionado
em cada poço por 4 h. Após esse período a solução foi removida e 100
µL de álcool etílico foram adicionados nos poços para a solubilização
do formazan formado. As placas foram agitadas por 10 minutos e a
absorbância foi verificada em espectrofotômetro (EPOCH, BIOTEK®) a
570 nm. Todas as análises foram realizadas em triplicata.
Análise Estatística
A análise estatística foi realizada pelas diferenças entre os grupos
experimentais utilizando ANOVA de uma via, seguida pelo teste
Student Newman Keul’s usando o programa GRAPHPAD PRISM 5.0.
O nível de significância de p < 0,05.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Isolamento, Morfologia e Bioquímica
Foi isolada a espécie do gênero Bacillus sp. de habitat salino, sendo a
espécie caracterizada por apresentar pigmentação creme, forma de
bacilo curto, coloração de Gram +. A espécie apresentou crescimento
ótimo na temperatura de 37º C, em pH de 7, na concentração de NaCl
de 5%. Também produziu catalase e oxidou maltose e sacarose. O
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espécime apresenta características morfológicas e bioquímicas, as quais
auxiliaram para a confirmação do gênero Bacillus sp. (Tabela 1).
Tabela 1. Características gerais da espécie Bacillus sp.
Características fisiológicas, morfológicas e bioquímicas
Crescimento pH 5
+
Catalase
+
Crescimento pH 7
+
Oxidase
Crescimento pH 9
DNAse
Crescimento T 28º C
+
Lactose
Crescimento T 37ºC
+
Maltose
o
Crescimento T 45º C
+
Glucose
Crescimento T ≤ 5ºC
Galactose
Idol
Sacarose
f/o
Motilidade
+
[ ] NaCl 5 a 13%
+
[ ] NaCl 14 a
Pigmentação
Creme
30%
Gram
+
Habitat
Solo salino
Bacilo
Forma
curto
(+) positivo para o teste, (-) negativo pra o teste, (o) oxidou, (o/f)
oxidou e fermentou.
Bioensaio de MTT
O extrato extracelular da espécie Bacillus sp. obtida pela incorporação
com o solvente AcOEt apresentou efeito citotóxico pelo método de
MTT nas concentrações de 75 e 100 µg/mL sob a linhagem 786.0
(Figura 1).
Sendo esse efeito classificado como severamente citotóxico para as
concentrações de 75 e 100 µg/mL (Tabela 2).
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Figura 1. Efeito citotóxico sob a linhagem 786.0 determinado
pelo método MTT. Tempo de incubação de 24 h. ANOVA
seguido do teste Student Newman Keul’s * p<0,05.
Tabela 2. Classificação da citotoxicidade celular do extrato extracelular
sob a linhagem 786.0 de acordo com a ISO 10993-5: 1999.
citotoxicidade
faixa de viabilidade % [ ] µg/mL
não-citotóxico
> 90
Controle
levemente citotóxico
80 a 89
moderadamente citotóxico
50 a 79
25 e 50
severamente citotóxico
< 50
75 e 100
Fonte: Adaptado de OLIVEIRA, 2009.
O gênero Bacillus é conhecido por produzir diversos compostos
químicos com características peptídicas complexas. Porém, quando se
destaca a ação de bioprodutos isolados do mesmo gênero com atividade
anticâncer in vitro pouco se sabe. Mesmo assim, o pouco mostrou que,
metabólitos secundários extraídos do gênero Bacillus apresentou uma
extensa atividade citotóxica em linhagem de câncer de colón em
análises realizadas in vitro. Além desse efeito, muitos compostos
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apresentaram mecanismos de morte celular programada, característicos
de apoptose (JEONG et al., 2007).
De micro-organismos, em especial bactérias, muitos compostos
químicos bioativos já foram isolados. Mostrando assim o grande
potencial sustentável de se obter processos biotecnológicos para a
produção de bioprodutos com diversas aplicações, em especial com
novos mecanismos de ação para o combate ao câncer. Esses
bioprodutos podem ser largamente isolados de micro-organismos e
analisados in vitro em programas de screening potencializando os
achados de atividade antitumoral (BARREIRO & BOLZANI, 2009;
DAS et al., 2007; DEMAIN & VAISHNAV, 2011; HAYASHIDASOIZA et al., 2008; KWAKYE-AWUAH et al., 2007; NASCIMENTO
et al, 2012; NEWMAN & CRAGG, 2012).
Estudos
realizados
com
bactérias
halotolerantes
e
halófilas
apresentaram resultados animadores para a produção de bioprodutos
com características específicas superiores a produtos químicos
utilizados pelas grandes indústrias. Esse fato aumenta a relevância de se
extrair metabólitos secundários de bactérias extremas, como é o caso
das halófilas do gênero Bacillus, com o intuito de se aplicar em
processos biofarmacêuticos (ADRIO & DEMAIN, 2005; AUSTIN,
1989; DODIA et al., 2006; ESSGHAIER et al., 2008).
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CONCLUSÃO
Os resultados obtidos no experimento mostraram que o extrato
extracelular da espécie Bacillus sp. isolada de salina no Rio Grande do
Norte, apresentou atividade citotóxica in vitro severa nas concentrações
de 75 e 100 µg/mL sob a linhagem de câncer de rins (786.0). Como
também, efeito nefrotóxico sob a linhagem HEK nas mesmas condições
experimentais, evidenciando que o complexo químico, componente do
extrato extracelular possui atividade antiproliferativa em células
cancerígenas e tóxicas em células normais.
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