UFRJ
Avaliação da Resposta Imune Celular in vitro Induzida por Novos
Antígenos de Mycobacterium leprae.
Márcia Valéria Brandão dos Santos Martins
Dissertação de Doutorado apresentada ao Programa de
Pós-Graduação
em
Microbiologia,
Instituto
de
Microbiologia Paulo Góes, da Universidade Federal do
Rio de janeiro, como pré-requisito para obtenção do
Título de Doutor em Microbiologia.
Orientadores: Dra. Maria Cristina Vidal Pessolani
Pesquisador Titular do Laboratório de
Microbiologia Celular – Departamento de
Micobacterioses –FIOCRUZ
Dr. Geraldo Moura Batista Pereira
Pesquisador Titular do Laboratório de
Microbiologia Celular – Departamento de
Micobacterioses –FIOCRUZ
Dra. Leila Fonseca
Professor Titular do Instituto de Microbiologia
Paulo Góes- Universidade federal do Rio de
Janeiro
Rio de Janeiro
Agosto de 2006
1
Avaliação da Resposta Imune Celular in vitro Induzida por Novos
Antígenos de Mycobacterium leprae.
Márcia Valéria Brandão dos Santos Martins
Orientadores: Dra. Maria Cristina Vidal Pessolani
Dr. Geraldo Moura Batista Pereira
Dra. Leila Fonseca
Dissertação de Doutorado submetida ao Programa de Pós-Graduação
em Microbiologia, Instituto de Microbiologia Paulo Góes, da Universidade
Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à
obtenção do título de Doutor em Microbiologia.
Aprovada por:
______________________________________________
Presidente, Prof.
___________________________________________
Prof.
___________________________________________
Prof.
__________________________________________
Prof.
__________________________________________
Prof.
___________________________________________
Prof.
Rio de Janeiro
Agosto de 2006
2
FICHA CATALOGRÁFICA
Martins, Márcia Valéria Brandão dos Santos
Avaliação da Resposta Imune Celular in vitro Induzida por Novos
Antígenos de Mycobacterium leprae./ Márcia Valéria Brandão dos Santos
Martins. – Rio de Janeiro: UFRJ/ IMPG, 2006.
Páginas 85
Orientadores: Dra. Maria Cristina Vidal Pessolani, Dr. Geraldo Moura
Batista Pereira e Dra. Leila Fonseca
Microbiologia, 2006.
1. Mycobacterium leprae; 2. peptídeos; 3. IFN-γ; 4. resposta imune; 5. PPD
I – Pessolani, Maria Cristina Vidal; Pereira, Geraldo Moura Batista e Fonseca,
Leila. II – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Microbiologia
Paulo Góes. III - Título
3
Trabalho desenvolvido no Laboratório de Microbiologia Celular e Molecular,
do Departamento de Micobacterioses, IOC, FIOCRUZ, sob orientação da
Dra. Maria Cristina Vidal Pessolani, Dr. Geraldo Moura Batista Pereira e
Dra. Leila Fonseca.
4
Obrigado Senhor
Obrigado pelas alegrias que me levantaram e pelas dores que me
fortaleceram.
Obrigado pelos sucessos que me fizeram sentir-me grande e pelos
fracassos que me deram a oportunidade de perseverar.
Obrigado pelos cuidados que me confortaram e pelas mágoas que me
exercitaram para perdoar.
Obrigado pelas horas de bem estar que me mantiveram ativo e por
outras que me revelaram o valor da saúde.
Obrigado pelos auxílios que me foram prestados e pelos abandonos
que fizeram crescer meu apoio em mim mesmo.
Obrigado pelas compreensões que encontrei e pelas incompreensões
que algumas vezes refletiram a minha própria imagem.
Obrigado pelos ganhos que fizeram de mim um ser mais confiante e
pelas perdas que me demonstraram ser possível continuar.
Obrigado pelos momentos altos que me exibiram Tuas bênçãos e
pelos momentos baixos que me abriram para Tua proteção.
Obrigado, Senhor, por jamais teres me esquecido.
5
Agradecimentos:
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A Deus por todas as maravilhas com que Ele têm me presenteado e por ter
me dado à oportunidade de hoje esta defendendo esta tese;
A minha mãe Aranilda e meu pai Raimundo por todo carinho, dedicação, apoio
e incentivo. Sem Eles eu não teria chegado até aqui;
Ao meu filho Philip pela paciência, compreensão e amizade que teve comigo
durante este trabalho;
A minha irmã Mônica por todas as dificuldades que passamos juntas durante
este período e pelas palavras carinhosas que muitas vezes me confortaram;
Ao meu amor Marcos Paulo por ter entrado na minha vida e pela paciência
que muitas vezes precisa ter comigo;
Aos meus orientadores Maria Cristina Vidal Pessolani, Geraldo Moura
Batista Pereira e Leila Fonseca por terem acreditado e confiado em mim,
pela dedicação, paciência muitas vezes e ensinamentos. Pela atenção
dispensada na realização deste trabalho. Sem vocês nada teria sido
possível;
Em especial a Dra. Maria Cristina Vidal Pessolani por sua dedicação com a
pesquisa e com seus alunos;
A Dra. Euzenir Nunes Sarno pela oportunidade de desenvolver minha tese
no Departamento de Micobacterioses e pelo incentivo e apoio de sempre;
Ao Dr. Brennan, Spencer e Backer da Universidade do Colorado (USA) pelo
fornecimento dos materiais e antígenos utilizados nestes trabalhos;
Ao Haroldo da Faculdade de Medicina da UERJ pela realização das análises
estatística dos trabalhos;
Aos pacientes, sem eles seria impossível a realização deste trabalho;
A amiga Luciana e Mônica pela ajuda nas correções da tese;
Aos colegas de Departamento que estavam sempre prontos para esclarecer
minhas dúvidas e também por tornarem o dia-a-dia mais alegre: Cristiana,
Adriano, Márcio, Tempone, Leonardo, Tatiana, Lucinéia, Michelle Lopes,
Rose, Rosane Telles, Elza, Elisa Maeda, Júlio, Sabrina, Patrícia, Érika,
Danuza, Íris, Danuza, Marjore, Fidelton, Danielzinho, Augusto, Pedro;
Ao Sr. Paulo Salles pelas conversas nas horas mais difícies, cuidado e
incentivo de sempre;
A equipe do Ambulatório Souza Araújo pela atenção a mim dispensada: Dr.
José Augusto, Dra. Ana Maria, Nádia, Denise, Virna, Rita;
A Socorro Amador e Dr. Beth do Instituto Evandro Chagas de Belém pela
oportunidade de no final da minha tese participar de um trabalho de campo
(Breu Branco e Tucuruí), no qual pude presenciar a realidade da hanseníase;
A minha família e aos meus amigos que simplesmente por existirem tornam
minha vida mais feliz.
6
ÍNDICE
LISTA DE ABREVIATURAS
xi
RESUMO
xvi
ABSTRACT
xviii
1.0- INTRODUÇÃO
1
1.1.- Breve histórico da hanseníase
1
1.2 -- Prevalência atual, distribuição geográfica e transmissão
3
1.3- Aspectos clínicos e reposta imunológica do hospedeiro
6
1.4- Mycobacterium leprae
9
1.5-Estratégias de prevenção e controle da hanseníase
11
1.5.1-Métodos de diagnóstico
12
1.5.2-Tratamento
14
1.5.3-Prevenção da hanseníase através da vacinação com BCG
14
1.6 – Justificativa e estratégias para o desenvolvimento de um teste
para o diagnóstico precoce da hanseníase
15
2.0 – OBJETIVOS
20
3.0 – INDIVÍDUOS, MATERIAIS E MÉTODOS
21
3.1 - Biossegurança e Comitê de ética
21
7
3.2 – Antígenos utilizados
21
3.2.1-Seleção dos genes e peptídeos de M. leprae
21
3.3 – Indivíduos estudados
3.4 - Culturas
de
células
22
mononucleares de
sangue
periférico
(PBMCs) estimuladas com os antígenos
23
3.5 - Dosagem de IFNγ em sobrenadantes de culturas de PBMCs
24
3.6 – Avaliação por citometria de fluxo da expressão de CD69
e IFNγ por linfócitos T CD4+, CD4+/CLA+ e linfócitos totais frente ao
24
PPD em culturas de sangue total
3.6.1 - Análise das culturas de sangue total por Citometria de Fluxo 25
3.7 – Análise da freqüência de linfócitos T CD4+ e CD8+ produtoras
de IFN-γ em culturas de PBMCs estimuladas com peptídeos sintéticos
26
3.7.1 – Análise por citômetria de fluxo das culturas de PBMCs
26
3.8 - Cultivo in vitro de sangue total
estimuladas com peptídeos
Sintéticos
28
3.9 - Análises estatísticas utilizadas
28
3.9.1 - Regressão múltipla
para análise de correlação entre a
freqüência de linfócitos T PPD específico em sangue total e, níveis
de IFN-γ
em culturas
de
PBMCs
reatividade ao teste tuberculínico
3.9.2 - Análise de variância (ANOVA)
estimuladas com PPD e
28
29
8
4.0 – RESULTADOS
4.1 - Identificação de parâmetros de ativação de linfócitos T in vitro
que se correlacionam com a reatividade cutânea ao PPD
30
4.1.1– Análise da freqüência de Linfócitos T CD4+ periféricos
PPD específicos produtores de IFN-γ em indivíduos PPD positivos
30
e PPD negativos reatores ou não ao teste tuberculínico
4.1.2 – Quantificação de
IFN-γ em sobrenadantes de culturas de
PBMCs estimuladas com PPD de indivíduos PPD positivos e PPD
negativos
37
4.1.3 – Análise de correlação entre a freqüência de linfócitos T
PPD específicos em sangue total e níveis de IFN-γ em culturas de
PBMCs estimuladas com PPD e reatividade ao teste tuberculínico
38
4.2 - Avaliação da produção de IFN-γ em resposta a antígenos
específicos
do
recombinantes)
M. leprae
em
(peptídeos
células
sintéticos
e
proteínas
mononucleares de indivíduos com
diferentes graus de exposição ao M. leprae
4.2.1 – Peptídeos
sintéticos
produção de IFN-γ em
M. leprae específicos induziram a
culturas de PBMCs isoladas de pacientes
com hanseníase e contatos
4.2.2 – Análise
40
do fenótipo dos linfócitos T peptídeo específicos
por citometria de fluxo
4.2.3 - Análise
40
estatística
54
da resposta dos diferentes grupos
estudados aos peptídeos individuais
56
9
4.3 – Análise dos
sangue
total
níveis de IFN-γ produzidos nas
estimuladas
com
culturas
de
peptídeos sintéticos M. leprae
específicos
57
5.0 – DISCUSSÃO
60
6.0 – CONCLUSÃO
71
7.0 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
73
8.0 - ANEXOS
10
LISTA DE ABREVIATURAS
a.C.
Antes de Cristo
AIMV
Meio Imunoterápico Adaptativo V
ANOVA
Análise de variância
APC
Allophycocyanin/ Aloficocianina
APC
Célula apresentadora de antígeno
BB
Forma borderline borderline da hanseníase
BCGid
Bacilo de Calmette-Guérin
BL
Forma borderline lepromatosa da hanseníase
BSA
Albumina de Soro Bovino
BT
Forma borderline tuberculóide da hanseníase
CD 3, 4, 8, 69
Cluster de differentiation 3, 4, 8, 69
CLA
Cutaneous lymphocyte antigen
Cy
CyChrome/ CyCromo
DNA
Ácido Desoxirribonucléico
DTH
Hipersensibilidade tardia
EC
Indivíduos controle de área endêmica
E. coli
Escherichia coli
ELISA
Enzyme
linked
immunosorbent
assay/Ensaio
Imunoenzimático
ELISPOT
Enzyme-Linked Immunospot/ Imuno-sinal enzimático
FITC
Fluorescein isothiocyanate/ Isotiocianato de Fluoresceína
g
gravidade
HLA
Antígenos leucocitários humanos
11
I
Forma Indeterminada da hanseníase
IB
Índice bacilar
IFN-γ
Interferon gama
IFN-γR
Receptor de Interferon gama
IL
Interleucina
LL
Forma lepromatosa polar da hanseníase
MB
Pacientes da forma multibacilar
MHC
Complexo principal de histocompatibilidade
M. leprae
Mycobacterium leprae
ML
Mycobacterium leprae
MLCwA
Fração de proteínas extraídas da parede celular
MLSA
Fração de proteínas extraídas do citosol
mm
Milímetros
mM
Milimolar
M. tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis
NEC
Indivíduos controles de área não endêmica
OMS
Organização Mundial de Saúde
pg
Picograma
PCR
Reação em cadeia da polimerase
P37-94
Peptídeos 37 – 94
PE
Phycoerythrin/ Ficoeritrina
PGL-I
Glicolipídio fenólico
PHA
Pytohemaglutinina
PPD
Purified Protein Derivative/ Proteína purificada derivada de
Micobacterium tuberculosis
12
PQT
Poliquimioterapia
NK
Células natural killer
NKT
Linfócitos NKT
ºC
Graus Celsius
OMS
Organização Mundial de Saúde
PB
Paucibacilar
PBMC
Células mononucleares do sangue periférico
PBS
Salina tamponada com fosfato
PGL-I
Glicolipídio fenólico I
q.s.p.
Quantidade suficiente para
PQT
Poliquimioterapia
RNA
Ácido ribonucléico
RNAm
Ácido ribonucléico mensageiro
SEB
Enterotoxina B de Staphylococcus aureus
SFB
Soro Fetal bovino
TB
Pacientes com tuberculose
Th1
Linfócito T “helper” 1
TNF-α
Fator de necrose tumoral alfa
TT
Forma tuberculóide polar da hanseníase
U/mL
Unidades por mililitros
13
LEGENDA DE FIGURAS
FIGURA 1 – Disseminação da hanseníase pelo mundo.
FIGURA 2 – Mapa dos coeficientes de prevalência da hanseníase no mundo
em 2004.
FIGURA 3 – Vias de eliminação e penetração do bacilo.
FIGURA 4 – Escala da imunopatologia Clínica da hanseníase.
FIGURA 5 – Padrão de resposta imune na hanseníase.
FIGURA 6 – Esquema do teste rápido do fluxo lateral de dez minutos –ML flow.
FIGURA 7 – Protocolo experimental usado para avaliação do comportamento e
participação dos linfócitos T CD4+ em resposta aos peptídeos.
FIGURA 8 – Protocolo experimental usado para avaliação do comportamento e
participação dos linfócitos T CD8+ em resposta aos peptídeos.
FIGURA 9 – Freqüência de linfócitos T CD4+/CD69+ produtores de IFN-γ frente
ao SEB ou PPD em um indivíduo PPD+.
FIGURA 10 – Freqüência de linfócitos T CD4+ expressando CD69 e
CD4+/CD69+ produtores de IFN-γ frente ao SEB ou PPD em um indivíduo
PPD+ e PPD-.
FIGURA 11 – Freqüência de linfócitos T CD4+ ativados (CD69+) e ativados
produtores de IFN-γ (CD4+/CD69+/ IFN-γ) em culturas de sangue total de
indivíduos PPD+ e PPD-estimulada com PPD (10µg/mL).
FIGURA 12 – Freqüência de linfócitos T CD4+/CLA+ em culturas de sangue de
indivíduos PPD+ e PPD-.
FIGURA 13 – Freqüência de linfócitos T CD4+/CLA+ e CD4+/CLA- ativados
(CD69+) e produtores de IFN-γ em culturas de sangue total de indivíduos PPD+
e PPD- estimuladas com PPD.
FIGURA 14 – Freqüência de linfócitos totais, linfócitos T CD4-, monócitos e
neutrófilos expressando CD69 e produtores de IFN-γ em sangue total de
indivíduos reatores e não reatores ao teste tuberculínico.
FIGURA 15 – Quantificação dos níveis de IFN-γ (pg/mL) nas culturas de PBMC
de indivíduos PPD+ e PPD- estimuladas por 1 e 5 dias com PPD (10µg/mL) por
ELISA.
FIGURA 16 – Representa um modelo de regressão múltipla.
14
FIGURA 17 – Níveis de IFN-γ nas culturas de PBMCs de pacientes com
hanseníase da forma paucibacilar
(PB) e multibacilar (MB), contatos de
pacientes de forma multibacilar (HC), pacientes com tuberculose (TB),
controles de área endêmica (EC) e controles de áreas não-endêmica (NEC)
frente ao superantígeno SEB e M. leprae total.
FIGURA 18 – Níveis de IFN-γ em sobrenadantes de culturas de PBMCs em
resposta à proteína ML0008 e a peptídeos sintéticos derivados da sua
seqüência.
FIGURA 19 – Níveis de IFN-γ em sobrenadantes de culturas de PBMCs em
resposta à proteína ML0126 e a peptídeos sintéticos derivados da sua
seqüência.
FIGURA 20 – Níveis de IFN-γ em sobrenadantes de culturas de PBMCs em
resposta à proteína ML1057 e a peptídeos sintéticos derivados da sua
seqüência.
FIGURA 21 – Níveis de IFN-γ em resposta à proteína ML2567 e a peptídeos
sintéticos derivados da sua seqüência.
FIGURA 22 – Níveis de IFN-γ em resposta a peptídeos reconhecidos
seletivamente por indivíduos infectados por M. leprae.
FIGURA 23 – Níveis de IFN-γ em resposta a peptídeos sintéticos que
mostraram reatividade cruzada, induzindo IFN-γ em indivíduos sadios de área
endêmica e/ou com tuberculose.
FIGURA 24 – Resposta individual de IFN-γ nos grupos PB, TB e EC contra as
quatro proteínas recombinantes e seus respectivos peptídeos e aos peptídeos
da proteína ML0394.
FIGURA 25 – Freqüência de linfócitos T CD4+ ativados (CD69+) e produtores
de IFN-γ por peptídeos de 9 nanômero (P51, P59, P65) e a mistura deles.
FIGURA 26 – ANOVA dos níveis de IFN-γ induzido por peptídeos sintéticos de
M. leprae.
FIGURA 27 – Quantificação de IFN-γ no plasma das culturas de sangue total
estimuladas com mitógeno (controle positivo), PPD e as proteínas de M. leprae
(MLSA e MLCwA).
FIGURA 28 – Níveis de IFN-γ no plasma das culturas de sangue total
estimuladas com o peptídeo P69 e os pools 1, 2, 3 e 4.
15
RESUMO
A hanseníase carece até os dias atuais de um teste imunológico específico que
detecte a infecção pelo Mycobacterium leprae. Com a finalidade de contribuir
para o desenvolvimento de um teste simples baseado na detecção de resposta
imune celular especifica contra o bacilo, como por exemplo, um teste cutâneo,
dividimos o presente trabalho em duas etapas. Na primeira etapa analisamos a
resposta imune ao teste tuberculínico (PPD), considerado o teste padrão ouro
para a detecção de infecção pelo M. tuberculosis. Pretendíamos, com esta
etapa, definir parâmetros de ativação in vitro de linfócitos T que se
correlacionassem fortemente com a reatividade cutânea ao PPD para
posteriormente utiliza-los no processo de seleção de novos antígenos
candidatos a um teste cutâneo para a hanseníase, ou mesmo como um teste in
vitro alternativo ao teste cutâneo. Para atingir este objetivo, avaliamos em
indivíduos sadios PPD+ e PPD- a freqüência de linfócitos T específicos para
PPD expressando CD69 (marcador de ativação) e interferon gama (IFN-γ) por
citometria de fluxo. Também quantificamos os níveis de IFN-γ em
sobrenadantes de culturas de células mononucleares do sangue periférico
(PBMCs), estimuladas por um e cinco dias com PPD. O emprego de um
modelo de regressão múltipla mostrou uma boa correlação entre a freqüência
de linfócitos T CD4+ PPD específicos CD69+ produtores de IFN-γ e o grau de
reatividade cutânea ao teste tuberculínico. Esta análise também sugeriu uma
associação entre os níveis de IFN-γ detectados em sobrenadantes de cultura
de cinco dias, mas não de um dia, e o grau de induração ao PPD. Este último
parâmetro foi utilizado, então, numa segunda etapa deste trabalho, para avaliar
um painel de antígenos específicos do M. leprae, definidos a partir do
seqüenciamento recentemente concluído do seu genoma, quanto ao seu
potencial uso no diagnóstico especifico da infecção do M. leprae. Nesta etapa,
PBMCs isoladas de pacientes com as diferentes formas clínicas da
hanseníase, contatos de pacientes mutibacilares, pacientes com tuberculose
pulmonar, indivíduos sadios de área endêmica e indivíduos sadios de áreas
não endêmica foram estimuladas com sonicado de M. leprae, quatro proteínas
recombinantes específicas de M. leprae (ML0008, ML0126, ML1057, ML2567)
e 58 peptídeos de 15 e 9 aminoácidos (p37 a p94) sintetizados a partir de
seqüências gênicas do M. leprae. Após cinco dias, os sobrenadantes das
culturas foram recolhidos e os níveis de IFN-γ determinados por ELISA. A
análise de Variância (ANOVA) foi utilizada para detectar diferenças
significativas nos níveis de IFN-γ induzidos por cada antígeno nos diferentes
grupos estudados. As células dos indivíduos de área não endêmica
produziram IFN-γ abaixo dos níveis detectáveis pela ELISA frente a todos os
antígenos de M. leprae testados. As proteínas recombinantes específicas
induziram a produção de IFN-γ em indivíduos sadios de área endêmica,
demonstrando, assim, baixo potencial de utilização num futuro teste para o
diagnóstico especifico da hanseníase. Já a maioria dos peptídeos sintéticos
(35) gerou uma resposta específica, sendo capaz de discriminar indivíduos com
as formas paucibacilares e contatos (população infectada com M. leprae) do
resto da população testada. Numa etapa seguinte, o fenótipo das células
produtoras de IFN-γ foi investigado num paciente paucibacilar por citometria de
fluxo utilizando 3 peptídeos decapentâmero, 3 peptídeos nanômero e a mistura
deles. Os peptídeos decapentâmero selecionados continham na sua seqüência
16
os peptídeos nanômero utilizados. Uma alta freqüência de linfócitos T CD4+ e
CD8+ produtores de IFN-γ frente aos peptídeos decapentâmero, nanômero e a
mistura deles foi observada. Contudo, enquanto os peptídeos decapentâmero
foram eficientes na indução de produção de IFN-γ em ambas as populações
celulares CD4 e CD8, os peptídeos nanômetro induziram preferencialmente a
produção de IFN-γ em linfócitos T CD8+. Os resultados obtidos neste trabalho
sugerem que peptídeos sintéticos derivados da seqüência de genes
específicos do M. leprae reconhecidos tanto por células CD4 como CD8
poderão ser futuramente empregados na identificação de infecção latente e/ou
ativa com M. leprae, criando assim uma nova ferramenta para o diagnóstico e
controle da hanseníase.
17
ABSTRACT
Presently, leprosy still needs a specific immunological test that could identify
Mycobacterium leprae infection. To contribute with a simple test development
based on a specific cellular immune response against the bacille, for example a
skin test, we have divided this work in two steps. In the first step, we have
analysed the immune response to PPD, since it is considered a gold standard
for detection of M. tuberculosis infection. Then, we defined T cell activation
parameters strongly correlated with cutaneous reactivity to PPD, for use in the
selection of the new candidate antigens that could be used in a skin test for
micobacterial infections or an in vitro alternative one. To reach this aim, we
have assessed the frequencies of PPD-responsive activated (CD69+) and IFNγ-producing CD4+T cells in PPD-positive and negative individuals by flow
cytometry. In addittion, the production of IFN-γ was measured by ELISA in
supernatants of PPD-stimulated PBMC cultures after one and five days of
incubation. The multiple regression model has shown a good correlation
between the frequency of PPD-responsive activated (CD69+) and IFN-γproducing CD4+T and PPD skin test. This analysis has also suggested
association between IFN-γ level in supernatants of PPD-stimulated PBMC at 5
days, but not at 1 day, with PPD induration. This last parameter was then used
to evaluate a panel of specific M. leprae antigens recently defined from its
genome sequence as with potential for use in specific diagnosis of M. leprae
infection. In this step, PBMC isolated from patients with different clinical forms of
leprosy, household contacts of currently active multibacillary leprosy cases,
pulmonary tuberculosis patients, healthy individuals from endemic and nonendemic area were stimulated with sonicated M. leprae, four M. leprae specific
recombinant proteins (ML0008, ML0126, ML1057, ML2567) and 58 9- and 15mer peptides (p37 to p94) sinthesized from M. leprae genome sequence. After
5 days, the supernatants were collected and the IFN-γ production was
measured by ELISA. Analysis of variance (ANOVA) was performed to
determine significantly differences in IFN-γ levels induced by each antigen
among different group studied. The cells of the individuals from non-endemic
area have produced IFNγ level under that detectable by ELISA to all the M.
leprae antigens applied. The specific recombinant proteins have induced IFN-γ
production in healthy individuals from endemic area, showing low potential for
future use in a specific diagnostic test for leprosy. On the other hand, the
majority of the synthetic peptides (35) induced specific IFN-γ responses,
discriminating the paucibacillary leprosy and household contact groups (M.
leprae infected population) of the remaining investigated population. In the next
step, 3 15-mer peptides, 3 9-mer peptides, and a mix of them, were investigated
as to phenotype of the IFN-γ-producing CD4+T in a paucibacillary patient by
flow cytometry. The selected 15-mer peptides contained at least one selected 9mer sequences within each them. A high frequency of IFN-γ-producing CD4+
and CD8+ T was observed when these cells were stimulated with 15- and 9mer peptides, and with mix of them. However, while the 15-mer peptides were
efficient in inducing IFN-γ responses in both the CD4- and CD8- T cell subsets,
9-mer peptides preferentially activated CD8- T cells. The results obtained in this
work suggest that synthetic peptides from specific M. leprae antigens recently
defined from its genome sequence, recognized by both the CD4- and CD8- T
cell subsets, could be used to identify latent and/or active M. leprae infection,
creating a new tool for leprosy diagnosis and control.
18
I – INTRODUÇÃO
1.1 - Breve Histórico da Hanseníase.
As primeiras descrições da hanseníase e os primeiros relatos de
pessoas com sintomatologia característica da doença datam de 600 a.C., na
Índia. Historicamente, ela ficou conhecida como “lepra”, termo derivado da
palavra grega Lepros que significa escamoso. A primeira descrição da
hanseníase na Europa foi relatada por Aretaeus em 150 a.C. na Grécia. No
início do século XIII, a lepra já era muito freqüente na Europa com a existência
de aproximadamente 19.000 leprosários. A hanseníase diminuiu na Europa a
partir do século XVII, provavelmente em função do isolamento dos doentes,
melhorias sanitárias e elevação do padrão de vida da população (Maurano,
1944).
A hanseníase deve ter chegado às Américas com os colonizadores
europeus, especialmente no Brasil, entre os séculos XVI e XVII. Nos Estados
Unidos, foram os franceses, que deram origem ao estado de Louisiana, os
quais provavelmente trouxeram a hanseníase; na América do Sul, a doença
teria sido trazida pelos colonos espanhóis e portugueses. Atualmente todos os
países sul-americanos com exceção do Chile têm hanseníase (Opromolla,
2000). Um estudo recente de tipagem molecular de Mycobacterium leprae,
agente etiológico da hanseníase, realizado por Monot al et (2005) reforça a
hipótese de que a doença teve origem no leste da África Oriental, e dali se
estendeu através dos movimentos migratórios humanos para a Europa, Ásia e
América (inclusive no Brasil) (Figura 1).
19
Figura 1 - Disseminação da hanseníase pelo mundo. Os círculos indicam a origem das
amostras analisadas e os quatros diferentes genótipos identificados (genótipo 1: amarelo, 2:
laranja, 3: roxo e 4: verde). As setas coloridas indicam a direção das migrações humanas
determinadas pela análise dos genotipica de M. leprae. As setas em cinza correspondem às
rotas de migração humana determinadas por estudos genéticos, arqueológicos e antropológicos,
com estimativa de tempo de migração em anos. Adaptado de por Monot al et. Nature (2005)
Os primeiros documentos que atestam à existência da hanseníase no
Brasil datam de 1696, onde o Governador Artur de Sá e Menezes procurava
dar assistência no Rio de Janeiro aos “míseros leprosos”, já então em número
apreciável. O Estado de São Paulo, no início da década de 30 do século XIX,
adota o modelo de isolamento compulsório aos hansenianos.
Em 1954, a
Organização Mundial de Saúde (OMS) envia uma Comissão ao Brasil, a qual
recomendou o fim do isolamento compulsório a exemplo de outros países
(Ferreira et al., 1983).
O Professor Rotberg modificou radicalmente a política sanitária com
relação à hanseníase em São Paulo. Ele nomeou uma comissão de
hansenólogos, entre eles, os doutores Lauro de Souza Lima e Nélson de
Souza Campos, e promoveu campanhas educativas e transformou o DPL
(Departamento de Profilaxia da Lepra) no “Departamento de Dermatologia
Sanitária”, objetivando auxiliar no processo de redução do estigma em relação
à doença (Opromolla, 2000). Houve, porém, num período recente, a crença de
que o imenso resíduo de estigmatização da lepra residiria em torno do nome da
doença.
Estas concepções ocasionaram um movimento no Brasil de
substituição da nomenclatura da doença lepra para hanseníase, que em 1995
20
(Lei Federal no. 9.010. Publicada no Diário Oficial da União, auditoria do
Deputado Elias Murad do PSDB/MG), foi objetivo de lei específica,
formalizando através de documento legal essa alteração.
Em 1868, o físico Norueguês Gerhard Henrik Amauer Hansen foi
convidado para auxiliar Danielssen e Boeck. Ele permaneceu neste trabalho
até 1871 e durante este período, tentou convencer seus colegas, sobretudo a
Danielssen, de que a hanseníase era uma doença infecciosa, mas não
conseguiu mudar a visão do colega. Em 1871 foi convidado pela Sociedade
Médica Norueguesa para estudar a causa da hanseníase e, finalmente, em
1873 ele estabelece por meio do microscópio a presença de corpos em forma
de bastões em preparações não fixadas de nódulos de pacientes hansenianos.
Desta forma, a microbiologia médica foi iniciada por Hansen, nove anos antes
da descoberta do bacilo da tuberculose (Hastings & Opromolla 1994).
A utilização de quimioterápicos no tratamento da hanseníase remonta do
século VI, com a utilização na Birmânia do óleo de Hydnocarpus, difundindo-se
esta prática por toda a Europa no século IX. A partir da década de 40, a
monoterapia com sulfonas foi adotada, causando um grande impacto no
tratamento da doença. O surgimento de casos sulfono resistentes, a
persistência bacilar e o abandono ao tratamento devido a sua longa duração
levaram a OMS a recomendar, em 1982, um tratamento poliquimioterápico
baseado na associação das drogas dapsona, rifampicina e clofazimina.
1.2 – Prevalência atual, distribuição geográfica e transmissão.
Desde a implantação da poliquimioterapia (PQT), a prevalência
mundial da hanseníase foi reduzida em aproximadamente 90% pela cura de
mais de nove milhões de pacientes (WHO, 2005). Segundo dados da OMS
(2004), a hanseníase encontra-se mais concentrada em nove países, nos quais
ela ainda representa um problema de saúde pública. Juntos, estes países
respondem por 84% da prevalência e 88% da detecção mundial. São os
seguintes: Angola, Brasil, República Africana Central, República Democrática
do Congo, Índia, Madagascar, Moçambique, Nepal e Unidade Republicana da
Tanzânia (WHO 2004). Em 2004, o Brasil era o país que apresentava maior
21
taxa de prevalência de 4,6 por 10.000 indivíduos, e um número total de casos
de 79.908.
Nenhuma informação/
Hanseníase raramente
detectada
Figura 2 - Mapa dos coeficientes de prevalência da hanseníase no mundo em 2004. Fonte: WHO
2004.
No Brasil, os estados de Santa Catarina e Rio Grande do Sul exibem as
melhores estatísticas: menos de um caso em cada 10.000 habitantes. Na outra
ponta está o Mato Grosso, com taxa de detecção de 15,2 em cada 10.000
habitantes. Rondônia, Roraima, Acre, Tocantins, Maranhão e Espírito Santo
apresentam de cinco a nove casos/10.000 habitantes (WHO 2004).
Diferente da brusca queda da taxa global de prevalência ocasionada
pela PQT, o número de casos novos detectados anualmente vem
permanecendo constante ou tem aumentado. Esta persistência na taxa de
detecção de novos casos de hanseníase nos países endêmicos pode ser
atribuída a vários fatores, tais como: à intensidade na busca de novos casos, à
alta transmissão em certas áreas proveniente de indivíduos assintomáticos
transmissores, ou à recidiva de casos previamente tratados e à falta de um
teste diagnóstico que detecte a infecção num estágio precoce da doença. O
Brasil
apresenta
aproximadamente
45.000
novos
casos
por
ano
(www.saude.gov.br).
22
O contato com M. leprae se faz principalmente pelas vias aéreas
superiores (Fig.2) e a infecção subclínica ocorre em uma grande proporção de
pessoas expostas (revisto por Gallo et al, 2005). Almeida e colaboradores
demonstraram claramente que o DNA deste patógeno estava presente na
mucosa de pacientes e de seus contatos, corroborando a idéia de que a
infecção latente ocorre freqüentemente e de que o nariz é principal via de saída
e entrada de M. leprae (Almeida et al., 2004).
VIAS DE ELIMINAÇÃO
DO BACILO
•
•
Mucosa nasal
e orofaríngea
Lesões de pele
VIAS DE PENETRAÇÃO
DO BACILO
•
•
Mucosa nasal
Pele lesionada
Indivíduo
exposto
Figura 3 – Vias de eliminação e penetração do bacilo. Modelo adaptado do Manual de
procedimentos e atividades e controle da Hanseníase, 2001.
A infecção causada por este patógeno apresenta um longo período de
latência, sendo o tempo médio de incubação de aproximadamente quatro anos
em pacientes do pólo tuberculóide, e de até 30 anos para os do pólo
lepromatoso (Noordeen, SK, 1994; Pessolani et al., 2003). Este longo período
de incubação contribui para a transmissão da hanseníase, pois antes mesmo
da manifestação clínica dos sintomas, o indivíduo já é um transmissor
potencial. Por isso, entender o mecanismo de transmissão da hanseníase é um
passo importante para o desenvolvimento de métodos que possam interromper
a cadeia de transmissão, levando desta forma à erradicação da doença (Smith
et al., 2004).
23
1.3 – Aspectos clínicos e resposta imunológica do hospedeiro.
A hanseníase acomete principalmente a pele e os nervos periféricos e
manifesta-se através de um amplo espectro de formas clínicas, determinado
pela variedade da resposta imune do paciente à bactéria. A hanseníase
dificilmente leva à morte, mas constitui a principal causa de neuropatia
periférica, a lesão neural sendo observada em todas as formas clínicas da
doença. O tropismo de M. leprae pelas células de Schwann leva à
desmielinização, fibrose e degeneração dos nervos periféricos, processos
esses que se mostram pouco reversíveis e que continuam com o tempo a
despeito do tratamento dos pacientes. Em conseqüência, aproximadamente
30% dos indivíduos acometidos com hanseníase apresentam deformidades
físicas como seqüelas da doença. Estima-se que existiam, em 1992, entre 23.000.000 de indivíduos no mundo portadores de deficiência física decorrentes
da hanseníase (Noordeen et al., 1994).
Um outro aspecto importante da hanseníase é que, a despeito da
poliquimioterapia, aproximadamente 50% dos doentes desenvolvem quadros
clínicos de inflamação aguda denominados de episódios reacionais. Durante
as reações ocorre o desenvolvimento de neurites, responsáveis pela
exacerbação do dano nervoso e pela conseqüente incapacitação dos
pacientes. Os sintomas dos quadros reacionais são minimizados através da
administração de anti-inflamatórios e corticóides. Ou seja, mesmo tratados, a
lesão nervosa evolui nos pacientes com hanseníase, levando muitas vezes a
quadros de incapacidade e deformidade física.
Como representado na figura 4, apenas uma minoria dos indivíduos
expostos a M. leprae (somente cerca de 5 a 10% das pessoas) desenvolve a
doença, o que pode estar ligado a fatores genéticos condicionando
susceptibilidade à infecção por este patógeno (Sehgal, Joginder, Sharma.,
1989). Na população susceptível, os padrões de resposta imune do hospedeiro
ao bacilo estão associados ao espectro de formas clínicas observadas na
hanseníase, também caracterizadas por diferentes cargas bacilares e número
de lesões observadas na pele. As manifestações clínicas (Ridley e Jopling,
1966) variam da forma tuberculóide polar (TT- indivíduos com hiper24
responsividade ao M. leprae) à forma lepromatosa polar (LL- indivíduos hiporesponsivo ao bacilo) (Figura 4). Existem as formas intermediárias borderline
tuberculóide (BT), borderline borderline (BB) e borderline lepromatosa (BL).
Estas formas podem ser grosseiramente agrupadas em multibacilares - MB
(LL, BL e BB), e paucibacilares – PB (TT e BT). Os pacientes com as formas
mutibacilares são considerados a principal fonte de infecção.
Indivíduos
Sadios
90%
Hanseníase
Indeterminada
10%
Imunidade
Celular
Produção de
Anticorpos
IL-2, IFN-γγ
IL-4, IL-10
M. leprae nos tecidos
(Fonte: The Lancet, vol 363 (10): 1209-19; 2004)
Figura 4
– Escala da imunopatologia clínica da hanseníase.
Patógenos intracelulares como M. leprae estimulam o desenvolvimento
no hospedeiro de uma resposta mediada por células, efetiva no controle da
infecção. Esta resposta é mediada principalmente por linfócitos CD4+ que
produzem IFN-γ, citocina que desempenha um papel crítico na eliminação do
bacilo através da ativação de macrófagos (Kaufmann, 1991). A Figura 5
resume as principais células e citocinas envolvidas numa resposta protetora
(tipo 1) e não protetora (resposta tipo 2). Respostas do tipo 1 são direcionadas,
em parte, pela IL-12, que irá induzir a produção de IFN-γ por células Natural
Killer (NK), num estágio inicial da resposta imune, além de estimular a ativação,
25
a diferenciação e a expansão dos linfócitos Th1 antígeno-específicos. Além de
IL-12, outras três citocinas foram identificadas como estimuladoras de IFN-γ.
IL-23, que possui algumas características em comum com IL-12, mas com
menor capacidade indutora de IFN-γ; IL-18, que em sinergia com IL-12
promove uma ótima produção de IFN-γ, e IL-27, que induz a proliferação de
linfócitos T virgens e estimulam a produção de quantidades significantes de
IFN-γ, principalmente quando em sinergia com IL-12 e IL-18 (Ottenhoff, et
al.,2005).
Figura 5-Na forma TT, no padrão de resposta tipo 1, IL-12 é um fator de crescimento autócrino
para os linfócitos T helper, que faz ativação de macrófagos mediada por IFN-γ (imunidade mediada
por células). No padrão de resposta tipo 2, na forma LL, IL-4 é um fator de crescimento para os
linfócitos T supressores que estimulam a diferenciação de linfócitos B a produzir anticorpos
(imunidade humoral). Na presença de IL-4, uma subclasse de linfócitos TCD4+ (Th3) é ativada
para produção de TGF−β, um potente fator supressor de macrófago. Citocinas de macrófagos são
cruciais em cada padrão: no tipo 1, IL-12 é um poderoso estimulo para linfócitos T helper, no tipo 2,
IL-10 suprime o próprio macrófago. Citocinas produzidas em um tipo de resposta podem
mutuamente se inibir de um modo multifacetado, simplificado no esquema por duas grandes setas
(Goulart, 1995. Adaptado de Modlin & Bloom 1993).
De fato, indivíduos deficientes para o receptor de IFN-γ (IFN-γR) são
suscetíveis a várias doenças micobacterianas, inclusive à hanseníase
(Kerksiek & Pamer, 1999; Lima et al, 2000; Langrish et al, 2004). Na
hanseníase o IFN-γ é produzido tanto por linfócitos T CD4+ quanto CD8+ na
hanseníase (Spencer et al. 2005). Além desta citocina, outras também são
importantes para o controle da hanseníase, como TNFα que, em sinergismo
26
com IFN-γ, irá induzir a formação de granuloma contendo tanto linfócitos T
CD4+ quanto CD8+ , e que participará na contenção da infecção (Flynn, 2004).
Os pacientes do pólo tuberculóide (TT) possuem resposta imune celular
específica a M. leprae, a qual é confirmada pela proliferação de linfócitos T e
produção de citocinas em resposta a antígenos de M.leprae in vitro, estando
esta resposta associada à contenção do bacilo. As lesões desses pacientes,
com pouco ou nenhum bacilo, apresentam um infiltrado linfocitário organizado,
com presença de macrófagos diferenciados em células epiteliais e linfócitos T
CD4+, (também chamados de T “helper”), os quais secretam citocinas do tipo T
“helper-1” (Th-1), como IL-2 e IFN-γ. Nestes pacientes, há predominância de
linfócitos T CD4+ sobre os T CD8+, observando-se os linfócitos T CD4+ na
região central do granuloma e os CD8+ na periferia do granuloma (revisto por
Scollard et al, 2006).
Em pacientes do pólo lepromatoso (LL) não se observa resposta imune
celular a M. leprae, apesar desta continuar intacta como constatado em
ensaios com patógenos relacionados, como por exemplo, Mycobacterium
tuberculosis – (Hastings et al., 1989). A ausência de resposta imune celular
específica favorece uma proliferação incontrolada do bacilo, com muitas lesões
e altos títulos de anticorpos específicos para o glicolipídio fenólico – I (PGL-I) e
para proteínas antigênicas específicas de M. leprae (Triccas et al., 1996). Na
derme destes pacientes há macrófagos infectados com muitas bactérias, mas
poucos linfócitos T CD4+ e CD8+, e nenhum granuloma organizado. Já a forma
clínica Indeterminada (I) pode permanecer inalterada durante muito tempo
antes de evoluir para as formas mais diferenciadas do espectro da doença,
podendo também ocorrer a cura espontânea, mesmo sem tratamento
(www.saude.gov.br).
1.4- Mycobacterium leprae.
Como previamente mencionado, M. leprae foi o primeiro microrganismo
a ser identificado como agente etiológico de uma doença humana. O bacilo de
Hansen, como também é chamado, é um patógeno intracelular obrigatório não
cultivável in vitro até os dias atuais. No seu hospedeiro natural, o homem, se
27
multiplica muito lentamente com o tempo de geração estimado em média de 12
a 14 dias.
M.
leprae
pertencente
à
classe
Actinobacteria;
subclasse
Actinobacteridae; ordem Actinomicetalis; subordem Corynebacterineae; e
família Mycobacteriaceae.
Apresenta-se nos tecidos humanos como um
bastonete reto ou ligeiramente encurvado, medindo aproximadamente 1 a 8 µm
de comprimento por 0,2 a 0,5 µm de diâmetro (Rees et al., 1994). É um bacilo
Gram positivo e álcool-ácido resistente quando corado pelo método de ZiehlNeelsen. A localização das lesões hansenianas no corpo dos pacientes (pele,
mucosas e nervos periféricos) sugere que o bacilo tem preferência por
temperaturas menores que 37◦C (Lombardi, 1990).
O envelope deste patógeno, assim como o de outras micobactérias, está
dividido em duas partes: membrana plasmática e parede celular. A primeira é
constituída
por
característica
uma
principal
bicamada
a
fosfolipídica
presença
de
clássica
glicolipídios
e
possui
como
peculiares
como
fosfatidilinositolmanosídios, a lipoarabinomanana e a lipomanana; já a parede
celular é rica em lipídios, principalmente os ácidos micólicos, o que lhes
confere a propriedade álcool-ácido resistente (Método de Ziehl-Neelsen).
Na parede celular de M. leprae encontra-se o glicolipídio fenólico-I (PGLI), descrito por Hunter e Brennan em 1981, que é um componente majoritário e
exclusivo do envoltório externo de M. leprae.
Está envolvido na
imunogenicidade e patogenicidade na infecção por M. leprae, além de induzir
uma grande produção de anticorpos anti-IgM em pacientes, o que está
relacionado ao nível de bactérias do indivíduo, despertando então interesse no
que diz respeito a sua utilização no diagnóstico precoce da hanseníase (Hunter
& Brennan, 1981).
Em 1971, Kirchheimer & Storrs demonstraram a ocorrência de tatus
naturalmente infectados capturados no Estado da Louisiana nos Estados
Unidos da América.
Estes tatus, da espécie Dasypus novemcinctus,
apresentavam uma forma disseminada da doença com comprometimento de
pele, medula óssea, fígado, baço, linfonodos, pulmões, meninges e olhos. A
partir desta descoberta, estes animais vêm sendo mantidos em cativeiro para a
inoculação experimental de M. leprae, representando as principais fontes de
bactéria para estudos bioquímicos e imunológicos.
28
Recentemente, com a implantação do projeto de seqüenciamento do
genoma humano, genomas de muitos organismos, inclusive bactérias
patogênicas ao homem, vêm sendo definidos. Dentre estes, o genoma de M.
tuberculosis (Cole et al., 1998), M. leprae (Cole et al., 2001), M. marinum e M.
bovis foram recentemente concluídos (http://sanger.ac.uk).
O sequenciamento do genoma de M. leprae por Cole e colaboradores
(Cole et al, 2001) representou um grande avanço na área biomédica, pois está
ajudando a esclarecer alguns aspectos deste microrganismo único. O genoma
deste patógeno inclui 1065 genes que codificam proteínas, e 50 genes para
moléculas de RNA estáveis (Cole et al, 2001). O genoma de M. leprae (3268
kb), é aproximadamente 1,2 Mb menor do que o de M. tuberculosis (4411 kb) e
contém 1116 pseudogenes (genes que apresentam perda de regiões
necessárias a sua transcrição e/ou tradução), como por exemplo versões
inativadas de genes que ainda são funcionais em M. tuberculosis (Cole, et al.,
2001). O grande número de genes inativados talvez tenha alguma relação com
a condição de patógeno intracelular obrigatório e com a sua incapacidade de
crescer in vitro (Brosh, et al., 2000; Britton & Lockwood, 2004).
Um dado
importante no contexto de desenvolver novas ferramentas para o controle da
hanseníase foi a observação da presença, no genoma de M. leprae, de 165
genes não compartilhados com M. tuberculosis. Destes, 139 eram específicos
para M. leprae com ausência de seqüências homologas no Genebank
(http://sanger.ac.uk).
1.5 - Estratégias de prevenção e controle da hanseníase.
Três medidas principais contribuem para o controle de doenças
infecciosas:, (1) a disponibilidade de um teste para o diagnóstico específico da
infecção; (2) a quimioterapia, que possibilitaria a cura dos pacientes infectados,
apresentando, portanto resultados imediatos, e (3) a vacinação, que tem
caráter preventivo e cujos resultados apareceriam a médio e longo prazos.
29
1.5.1. Métodos de diagnóstico.
A hanseníase carece até os dias atuais de um teste imunológico
específico que detecte a infecção por M. leprae. O diagnóstico da hanseníase
se baseia principalmente nos sinais e sintomas clínicos do paciente. O exame
histopatológico das lesões e a determinação do índice bacteriológico, por outro
lado, auxiliam na definição da forma clínica dentro do espectro da hanseníase.
Recentemente, visando simplificar este diagnóstico no campo, um método
simples e rápido vem sendo implementado. Este teste, denominado de ML
Flow, se baseia na detecção de anticorpos específicos contra o PGL-I no
sangue (Hunter & Brennan, 1981). Estes anticorpos são predominantemente da
classe IgM e aumentam nas formas multibacilares (MB) do espectro da
hanseníase, com títulos altos em pacientes lepromatosos. Já a grande maioria
dos pacientes paucibacilares (PB) se mostra soronegativa. Este teste permite
assim distinguir entre pacientes MB e PB, permitindo a escolha do esquema
terapêutico mais adequado ao paciente. Também tem sido demonstrado que
contatos de pacientes com hanseníase soro positivos para PGL-I apresentam
risco maior de adoecer (Buhrer et al., 2000). Conseqüentemente, este teste
também vem sendo utilizado na população de contatos com a finalidade de
auxiliar na definição de indivíduos com alto risco de desenvolver principalmente
as formas MB da doença. O teste ML Flow consiste na aplicação do soro do
paciente sobre uma tira de nitrocelulose impregnada com o antígeno (Figura 6).
Não requer nenhum equipamento especial ou treinamento. É muito simples,
pois requer apenas uma punção na polpa digital com alfinete ou microlanceta
estéril para a realização; Detecta anticorpos IgM dirigidos para PGL-I de M.
leprae tanto em amostras de soro como de sangue total.
30
Control line
Test line
Negative
Positive
Figura 6- Esquema do teste rápido do fluxo lateral de dez minutos -ML flow Fonte: Buhrer 2002
A positividade é revelada pela mudança da cor observada na fita e pode ser
lida dentro de 10 minutos, o que facilita sobremaneira, juntamente com outras
informações clínicas e laboratoriais, o diagnóstico da hanseníase, a
classificação dos pacientes em multibacilares e paucibacilares para fins de
tratamento e a vigilância epidemiológica de contatos de pacientes hansenianos
que possuem elevados risco de adoecimento por formas grave de hanseníase.
Abordagens que incluem a amplificação de seqüências gênicas
específicas de M. leprae através da reação em cadeia da polimerase (PCR)
têm sido igualmente empregadas como suporte para o diagnóstico da forma
neural pura da hanseníase. A introdução recente da PCR forneceu
oportunidade sem precedentes para detecção específica, sensível e rápida do
DNA de M. leprae em espécimes clínicos. Estudos utilizando biópsia de pele
de pacientes com hanseníase têm demonstrado que a técnica de PCR é capaz
de aumentar a sensibilidade de detecção do M. leprae, sugerindo vantagem da
técnica quando comparada aos exames histopatológico e baciloscópico
convencionais (De Wit et al., 1991).
Nos países desenvolvidos, a técnica de
PCR para DNA de M. leprae tem sido utilizada para auxiliar no diagnóstico de
casos mais difíceis, como da forma neural pura (Dayal et al., 2005; Bezerra da
Cunha et al., 2006).
Entretanto, o alto custo e a sofisticada tecnologia
empregadas são entraves para sua incorporação no diagnóstico de rotina na
31
hanseníase, permanecendo ainda como importante instrumento de pesquisa
para auxiliar a compreender a epidemiologia da hanseníase na comunidade.
1.5.2 – Tratamento.
A quimioterapia constitui o principal veículo de controle da hanseníase. A
hanseníase é uma doença curável e o seu tratamento é indispensável para a
cura do paciente, e para a interrupção da transmissão da doença, sendo,
portanto estratégico para o controle da endemia e eliminação da hanseníase
como problema de saúde pública. O programa de tratamento da hanseníase,
desenvolvido pela OMS, recomenda que os pacientes PB sejam tratados por
seis meses com rifampicina e dapsona e os MB por 12 a 24 meses com
rifampicina, dapsona e clofazimina (http://who.int.lep).
1.5.3 - Prevenção da hanseníase através da vacinação com BCG.
A prevenção da hanseníase é feita através do uso da vacina do Bacilo
de Calmette-Guérin (BCG), a mesma utilizada para a prevenção da
tuberculose. Esta vacina foi desenvolvida originalmente na França por Albert
Calmette e Camille Guérin na primeira década do século XX segundo os
postulados de Louis Pasteur, e é proveniente de uma cepa virulenta de
Mycobacterium bovis (M. bovis), que foi atenuada após passagens in vitro das
culturas desta micobactéria em meio Souton-batata (Haile & Kallenius, 2005). A
OMS preconiza o uso da vacina BCG como estratégia contra a hanseníase, e
esta é amplamente utilizada em países endêmicos para a doença (Lockwood &
Suneetha, 2005).
A vacina BCG confere entre 20 e 90% de proteção contra as formas MB
e PB da hanseníase em todas as populações e uma das hipóteses para essa
variação é uma possível reação cruzada com micobactérias do ambiente (Fine
et al.,1985; Fine & Smith, 1996; Lombardi et al.,1996). A prevenção da forma
MB é particularmente importante. Existem evidências de impacto da BCG tanto
na incidência da hanseníase quanto na susceptibilidade às formas MB desta
doença (Fine & Smith, 1996). Na Venezuela, Convit e col. (1992)
32
demonstraram que a vacina combinada BCG/M. leprae não conferiu maior
proteção contra a hanseníase quando compararam com o BCG sozinho.
Em nosso país, a cepa utilizada na fabricação da vacina é a BCG
Moreau, que é fornecida em frasco âmbar de vinte doses, produzida pela
Fundação Ataulpho de Paiva e é apresentada na forma liofilizada (Pompeu &
Moraes, 2002).
Esta cepa conferiu cerca de 70% de proteção contra a
hanseníase, na vacinação neonatal, principalmente para a forma MB (Cunha et
al, 2004). Em grupos de risco (contatos), a vacinação com BCG conferiu cerca
de 50% de proteção, sendo esta proteção aumentada em 25% com a repetição
da vacina (Smith & Smith, 2000).
Estudos mais recentes avaliaram a correlação entre BCGid e níveis de
anticorpos IgM anti-PGL-I em pacientes hansenianos e seus comunicantes. Os
achados mostram níveis de anticorpos específicos reduzidos em indivíduos
previamente vacinados quando comparado aos não vacinados. A capacidade
do BCGid induzir ativação da resposta imunológica de doentes e comunicantes
pode estar associada à queda dos níveis dos anticorpos anti-PGL-I em ambos
os grupos (Foss et al. 2002).
A vacinação com BCG foi recomendada pelo Ministério da Saúde para a
hanseníase a partir de 1992 (Matos, et al., 1999). Atualmente, preconiza a
aplicação de duas doses de BCGid em todos os indivíduos sadios,
categorizados como contatos intradomiciliares de todos os casos novos de
hanseníase, independente da forma clínica do caso-índice (Lombardi et al
1996; Pompeu & Moraes, 2002).
Resumindo o exposto à cima, os programas atuais da hanseníase se
limitam ao tratamento de indivíduos com a doença clínica, ao acompanhamento
de seus contatos e a vacinação dos mesmos com o BCG.
1.6 – Justificativa e estratégias para o desenvolvimento de um
teste para o diagnóstico precoce da hanseníase.
Como já foi mencionado anteriormente, um dado preocupante é a
manutenção de uma alta taxa de detecção de casos novos de hanseníase,
apesar da queda nos índices de prevalência, o que sugere a permanência de
uma alta taxa de transmissão na população.
Entre os casos novos
33
diagnosticados no Brasil, mais da metade manifesta uma das formas
multibacilares da doença, um percentual alto de aproximadamente 8% são
crianças (menores de 14 anos) e um número significativo de casos detectados
já mostram algum grau de incapacidade física (http://who.int/lep). Estes dados
epidemiológicos indicam que o diagnóstico da hanseníase é feito tardiamente
no nosso país, favorecendo assim a cadeia de transmissão.
Dentro dos
conceitos de transmissão da hanseníase tem se verificado que os pacientes
multibacilares não tratados são a principal fonte de infecção. Contudo, devido
ao longo tempo de incubação da hanseníase, acredita-se que os indivíduos
infectados sejam capazes de transmitir a doença ainda numa fase
assintomática da doença. Em termos de saúde pública, o tratamento iniciado
mais precocemente preveniria o desenvolvimento de formas graves da
hanseníase. Também o diagnóstico precoce seguido de um tratamento
adequado poderia eliminar potenciais fontes de transmissão, contribuindo,
assim, para o rompimento da cadeia epidemiológica e a eliminação da doença.
A alta prevalência da tuberculose no nosso país aliada à obrigatoriedade
da vacinação com BCG nos neonatos exigem que este teste seja específico,
detectando somente indivíduos infectados com o bacilo de Hansen.
A ausência de modelos experimentais que mimetizam a doença em
humanos, e a impossibilidade do crescimento in vitro do M. leprae
representaram historicamente importantes limitações no desenvolvimento de
ferramentas para o controle da hanseníase. A disponibilidade de massa bacilar
proveniente de tecidos de tatus infectados permitiu durante as décadas de 80 e
90 avanços significativos no conhecimento da constituição molecular do bacilo
de Hansen. Através de metodologias bioquímicas convencionais foi possível
isolar e caracterizar uma série de moléculas de M. leprae. Também, com o
advento da biologia molecular, foi possível a construção de bibliotecas
genômicas do bacilo que foram, então, rastreadas com anticorpos monoclonais
e policlonais, levando à identificação de uma série de antígenos. Estudos em
pacientes com hanseníase demonstraram que vários destes antígenos, como
as proteínas de choque térmico 70, 65, 18, e 10 kDa, induzem resposta
imunológica celular medida através da produção in vitro de IFN-γ e proliferação
de
linfócitos.
Estes
antígenos,
contudo,
estão
presentes
em
outras
34
micobactérias, como M. tuberculosis e apresentam grande homologia entre si,
sendo pouco adequados para fins de diagnóstico.
A conclusão do seqüenciamento do genoma de M. leprae por Cole et al.,
(2001) abriu um imenso potencial na direção da descoberta de componentes
bacterianos relevantes no contexto da doença e na descoberta de antígenos
específicos de M. leprae.
Dando, assim, início a uma abordagem pós-
genômica para o desenvolvimento de um teste de diagnóstico especifico, um
estudo recente avaliou a indução de resposta imune celular por 81 peptídeos
deduzidos de 33 proteínas de M. leprae em pacientes e contatos do Brasil,
Etiópia, Nepal e Paquistão (Dockrell et al, 2000 [a]). Os 15 peptídeos que
apresentavam baixa ou nenhuma homologia com peptídeos de M. tuberculosis,
mostraram uma especificidade maior que 90% com sensibilidades variáveis,
sugerindo que um pool de peptídeos específicos de M. leprae poderia ser
utilizado para a monitoração de exposição à bactéria ou num diagnóstico
precoce da doença.
Recentemente, Araoz et al (2006) mostraram que as proteínas ML0308
e ML2498 (proteínas presentes em M. leprae e homólogas com proteínas
presentes em outras micobactérias) apresentaram uma alta imunogenicidade
humoral e celular, isto é, são candidatas para o diagnóstico de ambas as
formas de hanseníase (tuberculóide e lepromatosa).
Reece et al (2006)
utilizaram um pool de soros de pacientes MB não tratados e identificaram 14
proteínas reativas numa biblioteca de expressão de proteínas recombinantes
de M. leprae. Desta, duas proteínas (ML0405 e ML2331) identificam por ELISA
especificamente pacientes com a forma multibacilar (BL e LL), auxiliando o
diagnóstico sorológico por PGL-I.
Dentre os testes imunológicos apropriados para avaliar a infecção por
micobactérias está o teste cutâneo. Indivíduos previamente expostos a estes
patógenos respondem num período de 24-72 horas a frações antigênicas dos
mesmos, introduzidas subcutaneamente, através de uma reação denominada
de hipersensibilidade tardia (DTH), caracterizada pelo aparecimento de eritema
e induração local. Assim, no caso da tuberculose, o teste tuberculínico ou PPD
(Proteína purificada derivada de M. tuberculosis) é utilizado para identificar
exposição/infecção latente por M. tuberculosis. Já no caso da hanseníase, o
único teste cutâneo até hoje utilizado, da lepromina, se baseia numa
35
preparação antigênica purificada, e não constitui uma reação de DTH clássica,
sendo lido com 21- 28 dias (teste de Mitsuda). O mesmo avalia a capacidade
de desenvolver uma resposta imune celular contra M. leprae, mas não a
exposição previa ao mesmo.
Linfócitos T de memória antígeno-específicos do tipo CD4+, mas
possivelmente também do tipo CD8+, que, quando ativados, produzem IFN-γ
constituem os principais mediadores da reação de DTH e se acumulam no local
de inoculação do antígeno (Abbas, 2003). De fato, a produção de IFN-γ por
células mononucleares de sangue periférico em resposta ao PPD, por exemplo,
se correlaciona fortemente com a reatividade cutânea (in vivo) ao mesmo
antígeno observado em indivíduos expostos a M. tuberculosis (Mazurek &
Villarino, 2001). Esta correlação, mais bem explorada na tuberculose bovina,
vem permitindo a substituição do teste cutâneo tuberculinico pela quantificação
in vitro de IFNγ produzido por amostras de sangue total em resposta ao PPD
(Rothel et al., 1990). Um outro dado importante é a produção de diferentes
níveis de IFNγ entre indivíduos com hanseníase paucibacilar e multibacilar e
entre indivíduos doentes e aqueles expostos a M. leprae, mas que não
desenvolvem a doença (Lima et al., 2000). Os dados acima reforçam a idéia
de utilizar IFNγ como indicador de expansão de células de memória especificas
no contexto da infecção por M. leprae em substituição do teste cutâneo.
Também estes dados reforçam a idéia do desenvolvimento de um teste de
diagnóstico que detecte os indivíduos infectados, e dentre eles, diferencie
aqueles com hanseníase subclínica.
Outra molécula induzida que poderia ser utilizada como indicador de
células de memória antígeno especificas é o antígeno de ativação leucocitária
CD69. A expressão de CD69 é rapidamente induzida na superfície de linfócitos
T, B e Natural Killer após ativação, constituindo assim um marcador precoce de
ativação linfocitária (Chen, Prince, Buck., 1988). A análise in vitro da
capacidade de um determinado antígeno de induzir tanto a expressão de
CD69, assim como a produção de IFN-γ em diferentes subpopulações de
linfócitos T periféricos poderia refletir o seu potencial como reagente num teste
cutâneo para medir exposição previa a M. leprae. Esta correlação poderia se
tornar ainda mais significativa se a análise se concentrasse nos linfócitos T
36
cutâneos que expressam o antígeno de “homing” CLA (cutaneous lymphocyte
antigen). CLA é expresso na superfície de linfócitos circulantes efetores, ou de
memória,
que
migram
preferencialmente
para
epitélios.
Uma
grande
concentração de linfócitos CLA+ é observada em sítios de inflamação cutânea
e na mucosa oral (Kunkel and Butcher, 2002).
Recentemente, testes in vitro mais rápidos e fáceis de serem realizados,
que utilizam sangue total ao invés de células mononucleares do sangue
periférico foram propostos para estudar a resposta imunológica decorrente a
exposição a M. leprae em populações, como também para auxiliar no
diagnóstico precoce da hanseníase.
Com esta abordagem pode-se avaliar
parâmetros de ativação da resposta imune celular, como proliferação de
linfócitos T e produção de citocinas como IFN-γ. Outra aplicação potencial é a
triagem in vitro de antígenos de M. leprae ou frações com potencial para serem
usados no diagnóstico, antes de sua formulação como reagentes de teste
cutâneos para uso in vivo. Estudos em vários países estão em andamento
para avaliar a aplicabilidade, em ampla escala, dos testes laboratoriais com
sangue total e determinar se estes são suficientemente robustos para uso em
campo (Dockrell et al., 2000 [b]).
No presente estudo, avaliamos a indução por PPD da expressão de
CD69 e a produção de IFN-γ em distintas subpopulações de leucócitos em
indivíduos sadios PPD positivos e negativos. A correlação entre a indução in
vitro pelo PPD destes parâmetros e a reatividade cutânea ao teste tuberculínico
foi investigada com o objetivo de selecionar parâmetros de ativação in vitro de
linfócitos T que se correlacionam fortemente com a reatividade cutânea. Estes
parâmetros poderiam também servir de base para um teste in vitro que
substitua o teste cutâneo. Esta substituição seria bem vinda, uma vez que o
teste in vivo apresenta vários inconvenientes, como por exemplo, a inerente
subjetividade de interpretação e a necessidade de avaliação dos indivíduos em
duas ocasiões diferentes. Numa segunda parte deste estudo, investigamos a
capacidade de novos antígenos identificados a partir do seqüenciamento de M.
leprae na detecção de pacientes.
37
II-OBJETIVOS
OBJETIVO GERAL: Contribuir para o desenvolvimento de um teste específico
para o diagnóstico da hanseníase.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
1. Correlacionar a resposta cutânea ao PPD em indivíduos sadios com
os seguintes parâmetros de ativação in vitro de linfócitos T:
a) Freqüência, em amostras de sangue total incubadas com PPD,
de
linfócitos
totais
e
subpopulações
(linfócitos
T
CD4+,
CD4+/CLA+) ativados (CD69+), ou ativados e produtores de IFNγ (CD69+/IFN-γ+);
b) Níveis de IFN-γ em sobrenadantes de células mononucleares
estimuladas com PPD por um e cinco dias.
2. Avaliar a produção de IFN-γ em resposta a antígenos específicos de M.
leprae (peptídeos sintéticos e proteínas recombinantes) por células
mononucleares de sangue periférico de indivíduos com diferentes graus
de exposição a M. leprae e definir o fenótipo das células T produtoras de
IFN-γ em resposta aos peptídeos sintéticos.
3. Avaliar a indução de IFN-γ por peptídeos específicos para M. leprae em
cultura de sangue total de indivíduos com diferentes graus de exposição a
M. leprae.
38
III- INDIVÍDUOS, MATERIAL E MÉTODOS.
3.1 – Biossegurança e Comitê de ética.
O sangue dos pacientes e dos demais indivíduos incluídos neste estudo
foi manipulado em câmera de fluxo laminar respeitando as normas de
precauções para manipulação de material biológico.
Os testes e os
procedimentos deste trabalho foram aprovados pelos Comitês de Ética em
Pesquisa com seres humanos da Fundação Oswaldo Cruz sob o protocolo no
205/03 e da Colorado State University , Fort Collins, CO, USA.
3.2 – Antígenos utilizados.
PPD RT-23 (Statens Serum Institute, Copenhagen, Denmark), PPD
RT49 (Statens Serum Institute); sonicado total de M. leprae proveniente de
tecidos infectados de tatus, MLCwA (fração de proteínas extraídas da parede
celular), MLSA (fração de proteínas extraídas do citosol), proteínas
recombinantes específicas de M. leprae (ML0008, ML0126, ML1057 e ML2567)
e peptídeos sintéticos derivados da seqüência genômica (Anexo 7.6) de M.
leprae (p37-p94) sintetizados comercialmente foram doadas pelo Dr. Patrick J.
Brennan do Departamento de Microbiologia da Universidade do Colorado, Fort,
Collins, CO, USA; e Enteroxina B de Staphylococcus aureus (SEB; Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO, USA).
3.2.1-Seleção dos genes e peptídeos de M. leprae.
As seqüências dos peptídeos (decapentâmeros ou nanômeros) foram
selecionados
usando
o
programa
SYFPEITHI
(http://www.bmi-
heidelberg.com/syfpeithi). Este algoritmo seleciona seqüências peptídicas que
apresentam alta afinidade de ligação à molécula de MHC classe II HLA-DR
39
((DRB1*0101, DRB1*0301 [DR17], DRB1*0401 [DR4w4] e DRB1*1101) ou à
molécula de MHC classe I (HLA-A*0201). Os antígenos candidatos também
foram avaliados quanto à presença de regiões ricas em alfa-hélices (possíveis
regiões ligantes ao TCR) utilizando algoritmos apropriados. As proteínas
selecionadas foram produzidas em E. coli como proteínas recombinantes. Os
peptídeos foram avaliados quanto a sua homologia com outras proteínas
utilizando o programa BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Foram
excluídos todos os peptídeos com uma homologia significante com genes
expressos em outros microrganismos patogênicos. Alguns peptídeos (p79 e
p93) foram utilizados como controles (apresentam homologia com proteínas de
M. tuberculosis). Os peptídeos utilizados neste estudo foram sintetizados
comercialmente (Mimotopes, San Diego, CA) e estão discriminados no anexo
7.6.
3.3 – Indivíduos estudados.
•
Para identificar os parâmetros de ativação de linfócitos T in vitro que se
correlacionam com a reatividade cutânea ao PPD, um total de 10
indivíduos sadios (oito mulheres e dois homens) que trabalham no
laboratório de Microbiologia do Departamento de Micobacterioses
Celular e Molecular da Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil
foram analisados. Estes indivíduos realizaram o teste tuberculínico com
0,1 mL (5UT) de PPD RT-23 de acordo com o teste de Mantoux. A
induração transversa no local da injeção foi medida 48 horas depois da
aplicação e foi considerada positiva quando o diâmetro foi maior que 5
mm. Esses indivíduos foram submetidos à coleta de sangue após
consentimento, por punção venosa.
•
Para analisar a resposta de IFN-γ frente às proteínas recombinantes e
aos peptídeos sintéticos específicos de M. leprae, um total de 60
indivíduos foi estudado (Anexo 7.1).
Dez pacientes da forma
paucibacilar não tratados (PB) (dez pacientes BT), dez pacientes da
40
forma multibacilar não tratados (MB) (três LL e sete BL) e dez contatos
domiciliares de pacientes da forma multibacilar (HC) foram recrutados do
Ambulatório Souza Araújo, da Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro.
Dez pacientes virgens de tratamento com tuberculose e PPD+ foram
recrutados no Hospital Clementino Fraga Filho, da Universidade Federal
do Rio de Janeiro. Dez indivíduos sadios morando no Rio de Janeiro e
sem histórico de exposição a M. leprae e/ou M. tuberculosis foram
incluídos como grupo controle de área endêmica (EC) e dez indivíduos
morando no Colorado, USA serviram como grupo controle de área não
endêmica (NEC).
•
Para avaliar a indução de IFN-γ pelos peptídeos sintéticos do M. leprae e
a mistura deles em cultura de sangue total utilizando o teste Quantiferon
(Q-CMI), um total de 40 indivíduos foram avaliados (Anexo 7.3). Deste,
vinte eram pacientes hansenianos (10 pacientes paucibacilares e 10
pacientes multibacilares) com até três meses de tratamento e 10 eram
contatos de pacientes multibacilares todos recrutados do Hospital Dona
Libânia, Fortaleza-CE. Dez Indivíduos sadios moradores de Fortaleza
sem nenhum histórico de exposição ao M. leprae e/ou M. tuberculosis
foram incluídos nesta etapa como grupo controle de área endêmica.
3.4- Culturas de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs)
estimuladas com os antígenos.
O sangue foi retirado por pulsação venosa utilizando heparina na
concentração de 20 U/mL (Liquemine, Roche químicos e farmacêuticos S.A,
Rio de Janeiro) e as PBMCs foram isoladas usando o gradientes de
densidade Lymphoprep (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) seguindo-se
uma centrifugação de 1000 x g por 30 minutos. Após a separação, as PBMCs
foram lavadas com PBS (Gibco, Grand Island, NY,USA) e ressuspensas em
meio AIMV (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) suplementado com 100 U/mL
de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina e 2 mM de L-glutamina. PBMCs (2 x
105/poço) de cada indivíduo foram plaqueadas em placas de 96 poços de fundo
41
“U” (FALCON-BD Biosiences, Franklin Lakes, NJ, USA) e estimuladas com
PPD (10 µg/mL), M. leprae (20 µg/mL), proteínas recombinantes [ML008,
ML0126, ML1057 e ML2567 (10 µg/mL)] e peptídeos sintéticos [p37a p94 (10
µg/mL)] e Enterotoxina B de Staphylococcus aureus (SEB - 1 µg/mL - Sigma,
EUA) e incubadas a 37º C em 5% de CO2. As culturas estimuladas com PPD
foram mantidas por 1 e 5 dias. Após o período de incubação (cinco e cinco
dias) os sobrenadantes foram retirados e estocados a -70º C até o momento de
uso.
3.5 - Dosagem de IFN-γγ em sobrenadantes de culturas de PBMC.
Os níveis de IFN-γ nos sobrenadantes das culturas estimuladas com
PPD foram quantificados por ensaio imunoenzimático (ELISA) comercial,
conforme as recomendações do fabricante (BD Biosciences).
O kit é de
captura de IFN-γ constituído por pares de anticorpos monoclonais específicos
e, como padrão, IFN-γ recombinante. O limite de detecção de IFN-γ foi de 48
pg/mL.
Os níveis de IFN-γ nos sobrenadantes das culturas estimuladas com as
proteínas recombinantes e peptídeos sintéticos foram quantificados por ensaio
imunoenzimático utilizando o kit DuoSet conforme as recomendações dadas
pelo fabricante (R&D Systems, Minneapolis, MN). O limite de detecção de IFNγ neste ensaio foi de 125 pg/mL.
3.6 – Avaliação por citometria de fluxo da expressão de CD69 e IFN-γγ por
linfócitos T CD4+, CD4+/CLA+ e linfócitos totais frente ao PPD em
culturas de sangue total.
Um volume de 0,5 mL de sangue total dos indivíduos estudados foi
colocado em tubos Falcon de polipropileno (BD Biosciences, San Jose,
Califórnia, USA) e estimulado com PPD RT49 (10 µg/mL) e SEB (1 µg/mL) na
presença de anticorpos monoclonais co-estimuladores específicos para CD28 e
CD49d.
As culturas foram incubadas a 37º C com 5% de CO2 por duas
horas. Em seguida, foi adicionado 10 µg/mL de Brefeldina A (Sigma) e
42
incubado continuada por mais quatro horas.
A seguir, os eritrócitos foram
lisados com solução de lise do próprio kit e as células foram permeabilizadas
com saponina e marcadas com 20 µL da combinação de anti-IFNγ FITC, antiCD69 PE, CD4 PerCP-Cy5.5 (FastImmune CD4 Intracellular Cytokine
Detection Kit; BD Biosciences) e 10 µL de anti-CLA APC (BD Biosciences). O
controle negativo (células sem estímulo) e as células que foram estimuladas
com PPD ou SEB foram marcadas com anticorpos de especificidade irrelevante
pareados por isotipos específicos para IFN-γ, CD69, CD4 e CLA. As células
foram, então, homogeneizadas e incubadas à temperatura ambiente por 30
minutos ao abrigo da luz. Após o período de incubação, as amostras foram
lavadas por centrifugação a 500 x g por 10 minutos e fixadas com 200 µL de
paraformaldeido 1% em PBS e analisadas em citômetro de fluxo FACSCalibur
(BD Biosciences) nos canais FL1 (IFN-γ); FL2 (CD69); FL3 (CD4) e FL4 (CLA),
na Unidade de Citometria de Fluxo (UCF) da Faculdade de Ciências Médicas
da Universidade do Estado do Rio de Janeiro. As freqüências de linfócitos T
positivos para um dado estímulo (F) foram calculadas por subtração dos
valores obtidos nos pontos corados com anticorpos de especificidades
desejadas dos pontos corados com anticorpos de mesmo isotipo (Iso) (Esp), ou
seja, F% = Esp% - Iso%.
3.6.1 - Análise das culturas de sangue total por Citometria de Fluxo.
Os resultados da citometria de quatro cores utilizando o Citômetro de
fluxo FACSCalibur foram adquiridos e analisados peloo software BD CellQuest
Pró (BD Biosciences). Um total de 40.000 linfócitos T CD4+ foi contado.
Delimitou-se uma região de linfócitos (R1) no gráfico bi-dimensional de pontos
utilizando os parâmetros morfométricos FSC (“Foward Scatter”) em linha reta e
SSC (“Side Scatter”) revelando o tamanho e a granulosidade, respectivamente,
em amostra de sangue total. A partir desta região criou-se uma R2, constituída
apenas de células CD4+ (FL3); Todas as amostras da cultura foram analisadas
dentro de uma região lógica R1*R2 (linfócitos T CD4+) para expressão de
CD69 (PE-FL2) e IFN-γ (FITC–FL1). Para análise dos linfócitos CD4- utilizou-
43
se somente a intensidade média de fluorescência com a exclusão dos linfócitos
T CD4+ (linfócitos não-CD4+).
As populações celulares (monócitos e
polimorfonucleares) foram separadas por parâmetros (SSC x FSC) e foram
delimitadas em regiões nas mesmas amostras. A região negativa para cada
população foi definida com o isotipo controle.
Foram utilizadas os “beads”
CaliBRITE para calibração do citômetro (BD Biosciences).
3.7 – Análise da freqüência de linfócitos T CD4+ e CD8+ produtoras de
IFN-γγ em culturas de PBMCs estimuladas com peptídeos sintéticos.
Um total de 5 x 105 PBMCs por poço em meio AIMV foram distribuídas
em placas de 96 poços de fundo em “U” e estimuladas com os peptídeos (p51,
p52, p59, p61, p65 e p69) ou com o pool desses peptídeos, na presença de
anticorpos monoclonais específicos para CD28 e CD49d (co-estímulo).
As
culturas foram mantidas a 37º C em 5% de CO2 por 1 hora (para CD8) ou 2
horas (para CD4) e 10 µg/mL de Brefeldina A (Sigma) foram adicionados.
Após mais cinco horas de incubação (para CD8) ou 4 horas (para CD4) e, uma
incubação total de 6 horas, as células foram permeabilizadas e lavadas com
tampão (BSA 0,5% e NaN3 0,1% em PBS). Em seguida, foram marcadas com
2 µL da combinação de anti-IFNγ FITC, anti-CD69 PE e anti-CD4 PerCp-Cy5.5
(CD4 Intracellular Cytokine Detection Kit; BD Biosciences/Pharmigen, San
Jose, CA) ou 2 µL da combinação de anti-IFNγ FITC, anti-CD69 PE , anti-CD8
PerCp-Cy5.5 e anti-CD3 APC (CD8 Intracellular Cytokine Detection Kit;
Biosciences/Pharmigen), fixadas com paraformoldeído 1% e analisadas em
citômetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences). As frequências de linfócitos
T positivos para um dado estímulo (F) foram calculadas da seguinte forma: F%
= Esp% - Iso% (ver seção 3.6).
3.7.1 – Análise por Citômetria de fluxo das culturas de PBMCs.
A aquisição citométrica de quatro cores e análise foram realizadas
utilizando o Citômetro de fluxo FACSCalibur usando o software BD CellQuest
44
(BD Biosciences). Um total de 40.000 linfócitos T CD4+ e 10.000 linfócitos T
CD8+ foram selecionados como mostram as figuras 7 e 8.
Amostras da cultura com ou
sem os estímulos dentro de
R1*R2, em janela FL1 x FL2.
Figura 7. Protocolo experimental usado para avaliação do comportamento e da participação dos
linfócitos T CD4 + em resposta aos peptídeos.
Delimitou-se uma região de linfócitos (R1) no gráfico bi-dimensional de
pontos mostrando níveis de espalhamento luminoso em linha reta (FSC) e em
ângulo reto (SSC) em amostra de PBMCs; Desta região criou-se uma R2,
constituída apenas de células CD4+ (FL3); Todas as amostras da cultura foram
analisadas dentro de uma região lógica R1*R2 (linfócitos T CD4+) para
expressão de CD69 (PE-FL2) e IFN-γ (FITC–FL1) (Figura 7).
45
Amostras da cultura com ou
sem os estímulos dentro de
R1*R2, em janela FL1 x FL2.
Figura 8. Protocolo experimental usado para avaliação do comportamento e da participação dos
linfócitos T CD8+ em resposta aos peptídeos.
Criou-se a mesma região 1 (R1) (linfócitos totais) e a partir desta criouse a
região 2 (R2) avaliando as células CD3+ (FL3) e CD8+ (FL4). As
amostras foram analisadas dentro da região lógica R1*R2 para expressão de
CD69 (PE-FL2) e IFN-γ (FITC–FL1). A resposta aos peptídeos foi verificada
através da dupla-positividade (FL1+/FL2+) das células na região 3 (R3). O
percentual de células em R3 correspondeu a positividade ou negatividade da
resposta ao antígeno (Figura 8).
3.8-Cultivo in vitro de sangue total estimuladas com peptídeos sintéticos.
Após a retirada do sangue, 1 mL de sangue total foi distribuído em cada
poço de placas de 24 poços e estimulado com MLSA (10 µg/mL), MLCwA (10
µg/mL), peptídeos sintéticos (10 µg/mL), controle positivo (PHA 1%) e PPD (10
µg/mL). Algumas culturas foram estimuladas com diferentes combinações de
peptídeos, onde cada peptídeo foi adicionado na concentração de 10 µg/mL e
as culturas incubads a 37º C em 5% de CO2 por 24 horas. Após o período de
incubação, o plasma das culturas foi coletado e os níveis de IFN-γ foram
quantificados
pelo
teste
Quantiferon-CMI
(Cellestis)
conforme
as
especificações do fabricante.
46
3.9- Análises estatísticas utilizadas:
3.9.1- Regressão Múltipla para análise de correlação entre a freqüência de
linfócitos T PPD específicos em sangue total e, níveis de IFN-γ em culturas
de PBMCs estimuladas com PPD e reatividade ao teste tuberculinico.
Foi usado um modelo de regressão múltipla (programa estatístico versão
6 2003, Statsoft inc., Tulsa, OK, USA). Nesta análise os fatores independentes
foram a freqüência relativa de linfócitos T CD4+CD69+, CD4+CD69+IFN-γ+,
CD4+CD69+CLA+ e CD4+CD69+CLA+ IFN-γ+, e a variável dependente foi a
medida da induração. Os valores obtidos por ELISA para IFN-γ proveniente de
sobrenadantes de cultura de PBMC estimuladas com PPD por um e cinco dias
foram também usados como variáveis independentes. O método para
estimativa dos parâmetros foi o método dos quadrados mínimos. Análises de
resíduos e de colinearidades também foram realizadas.
3.9.2-Análise de variância (ANOVA).
Os níveis de IFN-γ induzidos pelos diferentes antígenos de M. leprae
(proteínas recombinantes e peptídeos sintéticos) de indivíduos estudados (PB,
MB, HC, EC e NEC) foram comparados através de análise de variância
(ANOVA) (Statistica Version 6.0, Statsoft, Inc. 2004). Nesta análise, o cut-off foi
definido como sendo duas vezes o limite de detecção do ELISA (=250 pg/mL).
A análise foi seguida pelo teste Tukey usado como um teste Post Hoc para
comparar dois grupos. A diferença entre os grupos foi considerada significativa
quando p foi menor ou igual a 0,05.
47
IV – RESULTADOS
4.1 – Identificação de parâmetros de ativação de linfócitos T in vitro que
se correlacionam com a reatividade cutânea ao PPD.
4.1.1 – Análise da freqüência de Linfócitos T CD4+ periféricos PPD
específicos produtores de IFN-γ em indivíduos PPD positivos e PPD
negativos no teste tuberculínico.
Como o teste cutâneo é um método que mede resposta imune mediada
por células, numa primeira etapa do trabalho analisamos parâmetros de
ativação in vitro de linfócitos T que se correlacionassem fortemente com a
reatividade cutânea ao PPD (teste tuberculínico).
Para tal, inicialmente
avaliamos por citometria de fluxo e ensaio imunoenzimático a indução de CD69
(marcador de ativação) e a síntese de IFN-γ  (importante na imunidade celular)
em células de sangue total estimuladas com PPD em indivíduos sadios PPD+ e
PPD-. Sangue periférico de dez indivíduos sadios foi coletado e submetido à
análise da freqüência de leucócitos específicos ao PPD e realizaram o teste
tuberculínico com PPD RT-23 de acordo com a técnica Mantoux. O diâmetro
da induração no local da injeção foi medido 48 horas após a aplicação e foi
considerado positivo quando o valor foi > 5 mm. Observamos na tabela 1 o
valor da induração de cada indivíduo testado. Interessantemente, um indivíduo
PPD negativo (LM) apresentou um grande eritema (18 mm) com completa
ausência de induração.
Indivíduos
AB
CD
EF
GH
IJ
LM
NO
PQ
RS
TU
Induração (mm)
13
32 (a)
16 (a)
19
19 (a)
0 (b)
0
0
0
0
Tabela 1 – Reatividade de 10 indivíduos sadios ao teste tuberculínico. (a) Reação com necrose, (b)
Ausência de induração com forte eritema.
48
Amostras de sangue total desses indivíduos foram cultivados com SEB,
um estímulo policlonal, ou com PPD RT-49 na presença dos anticorpos coestimuladores anti-CD28 e anti-CD49d por um período de 2 horas. Brefeldina A
foi adicionada às culturas para inibir a secreção de IFN-γ e as culturas foram
incubadas por mais 4 horas. Após este período foi realizado todo processo de
lise dos eritrócitos, permeabilização e os leucócitos foram marcados com
anticorpos monoclonais ligados a fluorocromos para a detecção de células
expressando CD4, CD69, CLA e IFNγ intracelular. A freqüência de linfócitos T
CD4+ totais e CD4+/CLA+ expressando CD69 e produzindo ou não IFN-γ foi
analisada por citometria de fluxo de quatro cores.
Os gráficos bi-dimensionais de pontos da figura 9 foram obtidos a
partir de um indivíduo PPD+, onde podemos observar claramente uma alta
freqüência de linfócitos T CD4+ ativados (expressando CD69) e produtores de
IFN-γ nas culturas estimuladas com SEB ou PPD, quando comparamos com a
cultura sem estímulo.
(A)
0,02%
0,01%
0,01%
0,76%
IFN -γ FITC
Controle de isotipo- IFNγ
Sem estímulo
0,02%
PPD
0,82%
SEB
Controle de isotipo-CD69
CD69 -PE
Figura 9 - Freqüência de linfócitos T CD4+/CD69+ produtores de IFN-γγ frente ao SEB ou
PPD em um indivíduo PPD+. Amostras de sangue total foram estimuladas com SEB (1µg/mL)
ou PPD (10µg/mL) e depois de 6 horas de cultura as células foram marcadas com anti-CD4
PerCP-Cy 5.5, -CD69 PE, -IFN-γ FITC. Delimitou-se uma região de linfócitos (R1) em amostra
de sangue total. A partir desta região criou-se uma R2, constituída apenas de células CD4+
(40.000); Todas as amostras da cultura foram analisadas dentro de uma região lógica R1*R2
(linfócitos T CD4+) para expressão de CD69 (PE-FL2) e IFN-γ (FITC–FL1). Os gráficos são
representativos de um indivíduo PPD+ (CD).
49
A seguir passamos, então, a comparar a freqüência de linfócitos T CD4+
ativados (CD4+/CD69+) e linfócitos T CD4+ ativados produzindo IFNγ (CD4+/CD69+/IFN-γ+) em culturas de indivíduos PPD+ e PPD- estimuladas
com SEB.
Como podemos observar na figura 10, nenhuma diferença na
freqüência de células CD4+ ativadas totais e naquelas produtoras de IFN-γ foi
detectada entre estes indivíduos quando o estímulo utilizado foi o SEB.
Linfócitos T CD4+
Linfócitos T CD4+/CD69+
1,2
8
PPD -
PPD+
PPD -
PPD+
6
IFN--γ + (%)
CD69+ (%)
1,0
4
0,8
0,6
0,4
2
0,2
0
AB
CD EF
GH
IJ LM
NO PQ
RS TU
0,0
AB
CD
EF
GH
IJ
LM NO PQ
RS
TU
Figura 10 - Freqüência de linfócitos T CD4+ expressando CD69 e CD4+/CD69+ produtores de IFN-γγ
frente ao SEB em um indivíduo PPD+ e PPD-. Amostras de sangue total foram estimuladas com SEB
(1µg/mL) e depois de 6 horas de cultura as células foram marcadas com anti-CD4 PerCP-Cy 5.5, -CD69
PE, -IFN-γ FITC e a análise realizada conforme descrita em materiais e métodos.
Culturas sem estímulo (
) e culturas estimuladas com SEB (
). As iniciais no eixo x representam
os indivíduos estudados.
Contudo, quando analisamos a resposta ao PPD, diferenças importantes
foram observadas entre indivíduos reatores ou não ao teste tuberculínico. A
diferença entre estes dois grupos de indivíduos foi maior quando analisamos a
freqüência de linfócitos T CD4+ ativados. Freqüências detectáveis de linfócitos
T CD4+ PPD específicos expressando CD69+ e produzindo ou não IFN-γ só
foram observadas em amostras de sangue total de indivíduos reatores ao PPD
(figura 11).
50
Linfócitos T CD4+
Linfócitos T CD4+/CD69+
1,0
6
PPD+
PPD-
PPD+
PPD-
0,8
4
IFN--γ (%)
CD69 (%)
5
3
2
0,6
0,4
0,2
1
0
0,0
AB
CD
EF GH
IJ LM NO
PQ
RS
TU
AB CD EF GH
IJ LM NO PQ
RS
TU
Figura 11 - Freqüência de linfócitos T CD4+ ativados (CD69+) e ativados produtores de INF-γγ
(CD4+/CD69+/IFN-γγ) em culturas de sangue total de indivíduos PPD+ e PPD – estimulada com PPD
(10µ
µg/mL). Após de 6 horas de cultura todo procedimento de lise e permeabilização foi realizado e a
seguir, as células foram marcadas com anticorpos monoclonais específicos para moléculas de superfície
(CD69, CD4) e intracelulares (IFN-γ). A análise foi realizada como descrita na seção de Material e
Métodos. (
) Culturas sem estímulo e (
) culturas estimuladas com PPD. As iniciais no eixo x
representam os indivíduos estudados.
Sabendo que CLA é uma molécula normalmente expressa em 5% a 15%
dos linfócitos T CD4 e CD8 circulantes e importantes no processo de migração
para a pele, passamos a investigar se a correlação existente entre o teste in
vivo (teste tuberculínico) e os parâmetros de ativação in vitro (CD69 e IFN-γ) na
população de linfócitos TCD4+ iria permanecer ou ser enriquecida quando
analisássemos a população de linfócitos T CD4+/CLA+. Como esperado, a
freqüência de linfócitos T CD4+ totais circulantes expressando CLA foi similar
entre os indivíduos PPD+ e PPD- variando entre 3.5% a 5.5%, e esta
freqüência não foi alterada quando as culturas foram estimuladas com PPD
(Figura 12).
51
Linfócitos T CD4+
6
PPD+
PPD-
CLA+ (%)
5
4
3
2
1
0
AB CD EF GH IJ
LM NO PQ RS TU
Figura 12 - Freqüência de linfócitos T CD4+/CLA+ em culturas de sangue total de
indivíduos PPD+ e PPD-. As amostras foram estimuladas com PPD (10µg/mL) e depois de 6
horas de cultura as células foram marcadas com anticorpos monoclonais de especificidades
desejadas para moléculas de superfície (CD4, CLA) A análise foi realizada como descrita na
seção de Material e Métodos. As iniciais no eixo x representam os indivíduos estudados (
)
Culturas sem estímulo e (
) culturas estimuladas com PPD.
A figura 13 mostra que, como esperado, alguns linfócitos T CD4+
específicos para o PPD expressam CLA. Contudo, nenhum enriquecimento na
expressão de CD69 e na produção de IFN-γ foi observado quando
comparamos à população de linfócitos T CD4+/CLA+ com a população de
linfócitos T CD4+/CLA- (Figura 13). A resposta dos linfócitos T CD4+ ao PPD
medida através da expressão de CD69 e produção de IFN-γ foi observada tanto
nas subpopulações de CLA+ quanto nas de CLA -.
52
Linfócitos T CD4+/CLA-
Linfócitos T CD4+/CLA+
6
6
CD69+ (%)
5
PPD +
5
PPD-
4
4
3
3
2
2
1
1
PPD+
0
0
AB CD EF GH IJ LM NO PQ RS TU
AB CD EF GH IJ LM NO PQ RS TU
Linfócitos T CD4+/CLA-/CD69+
Linfócitos T CD4+/CLA+/CD69+
1,0
IFN-γ+ (%)
0,8
PPD-
1,0
PPD +
PPD-
0,8
0,6
0,6
0,4
0,4
0,2
0,2
0,0
PPD +
PPD-
0,0
AB CD EF GH IJ LM NO PQ RS TU
AB CD EF GH IJ LM NO PQ RS TU
Figura 13 - Freqüência de linfócitos T CD4+/CLA+ e CD4+/CLA- ativados (CD69+) e
produtores de IFN-γγ em culturas de sangue total de indivíduos PPD+ e PPDestimuladas com PPD. Amostras de sangue total foram estimuladas com PPD (10µg/mL) e
após 6 horas de cultura foi realizado o processo de lise, permeabilização e as células foram
marcadas com anti-CD4 PerCP-Cy 5.5, anti-CD4 PerCP-Cy 5.5, - CD69 PE, - IFNγ FITC, CLA APC. As análises foram realizadas em regiões de linfócitos T CD4+/CLA+ e em linfócitos
T CD4+/CLA-. As iniciais no eixo x representam os indivíduos estudados. (
) Culturas sem
estímulo e (
) culturas estimuladas com PPD.
Também avaliamos se as células produtoras de IFN-γ em resposta ao
PPD se restringiam aos linfócitos T CD4.
A população total de linfócitos,
linfócitos CD4, monócitos e neutrófilos presentes nas culturas de sangue total
foram analisadas e produtoras de IFN-γ (CD69+/IFN-γ) (Figura 14).
Como
esperado, a expressão de CD69 foi observada em linfócitos T CD4-, assim
como em monócitos e neutrófilos, sendo sua expressão induzida na presença
de PPD. Isto foi observado tanto em indivíduos PPD+ como em PPD-. Já IFN-γ
foi somente detectado na população de linfócitos totais estimulados com PPD
oriunda dos indivíduos PPD+.
Por outro lado, a freqüência de células
53
produtoras de IFN-γ entre os linfócitos CD4- foi irrelevante, confirmando a
população de linfócitos T CD4+ PPD específicos como a principal produtora
desta citocina.
Linfócitos Totais
5
4
CD69+(%)
Linfócitos CD46
6
PPD +
PPD -
5
3
3
2
2
1
1
0
PPD+
0
AB CD EF GH IJ LM NO PQ RS TU
AB CD EF GH
Monócitos
6
Neutrófilos
PPD+
PPD -
4
5
4
3
3
2
2
1
1
0
PPD +
AB CD EF GH IJ LM NO PQ RS TU
Linfócitos CD4-
Linfócitos Totais
1,0
1,0
0,8
IFN -γγ + (%)
PPD -
0
AB CD EF GH IJ LM NO PQ RS TU
PPD +
PPD -
0,8
0,6
0,6
0,4
0,4
0,2
0,2
0,0
AB CD EF GH IJ LM NO PQ RS TU
0,8
IJ LM NO PQ RS TU
6
5
1,0
PPD -
4
0,0
PPD +
PPD -
AB CD EF GH IJ LM NO PQ RS TU
Neutrófilos
Monócitos
1,0
PPD +
PPD -
0,8
0,6
0,6
0,4
0,4
0,2
0,2
PPD +
PPD -
0,0
0,0
AB CD EF GH IJ LM NO PQ RS TU
AB CD EF GH IJ LM NO PQ RS TU
Figura 14 - Freqüência de linfócitos totais, linfócitos T CD4-, monócitos e neutrófilos
expressando CD69 e produtores de IFN-γγ em sangue total de indivíduos reatores e não
reatores ao teste tuberculínico. Amostras de sangue total foram estimuladas com PPD
(10µg/mL) e depois de 6 horas de cultura as células foram marcadas com anti-CD4 PerCP-Cy 5.5,
anti-CD4 PerCP-Cy 5.5, - CD69 PE, - IFN-γ FITC. A análise foi realizada conforme descrito na
seção de Material e Métodos. (
) Culturas sem estímulo e (
) culturas estimuladas com
PPD. As iniciais no eixo x representam os indivíduos estudados.
54
4.1.2 – Quantificação de IFN-γ em sobrenadantes de culturas de PBMCs
estimuladas com PPD de indivíduos PPD positivos e PPD negativos.
A produção de IFN-γ isolados foi quantificada por ELISA em
sobrenadantes de culturas estimuladas com PPD depois de um e cinco dias de
incubação.
As PBMCs isoladas tanto de indivíduos PPD positivos quanto
negativos produziram IFN-γ em reposta ao PPD, mas os níveis foram
significantemente maiores nos indivíduos com o teste tuberculínico positivo
(Figura 15).
A diferença nos níveis de IFN-γ entre ambos os grupos (PPD+/PPD-) foi
maior nos sobrenadantes das culturas de cinco dias, onde todos os indivíduos
PPD+ mostraram um aumento nos níveis de IFN-γ em relação aos níveis
observados com um dia de estímulo. Já nas culturas dos indivíduos PPD-, os
níveis de IFN-γ em cinco dias não aumentaram ou mesmo diminuíram.
Interessantemente, um indivíduo PPD- (LM), com um grande eritema no teste
cutâneo (Tabela 1), produziu níveis de IFN-γ comparáveis àqueles observados
nas culturas de indivíduos PPD+ com um dia de incubação.
Estes níveis,
contudo, não aumentaram com o passar do tempo (cinco dias).
5 dias
1 dia
5000
Níveis de IFN-γγ (pg/mL)
3500
3000
PPD +
PPD -
PPD +
PPD -
3000
2500
2500
2000
1500
3500
2000
*
1500
1000
1000
500
500
*
0
0
AB CD EF GH IJ LM NO PQ RS TU
AB CD EF GH
IJ LM
NO PQ RS TU
Figura 15 – Quantificação dos níveis de IFN-γγ (pg/mL) nas culturas de PBMC de indivíduos
PPD + e PPD- estimuladas por 1 e 5 dias com PPD (10µ
µg/mL) por ELISA. Os dados dos gráficos
são apresentados em ∆pg/mL ( nívies de IFN-γ das culturas estimuladas – os níveis de IFN-γ das
culturas não estimuladas). * Indica o indivíduo PPD- com um grande eritema no teste cutâneo. As
iniciais no eixo x representam os indivíduos estudados.
55
4.1.3 – Análise de correlação entre a freqüência de linfócitos T PPD
específicos em sangue total e níveis de IFN-γ em culturas de PBMCs
estimuladas com PPD e reatividade ao teste tuberculínico.
Para verificar a existência de correlação entre os parâmetros avaliados
in vitro em resposta ao PPD e a reatividade ao teste tuberculínico in vivo, foi
aplicado o modelo de regressão múltipla. Os valores de p para as variáveis
independentes CD4+/CD69+/IFN-γ+ e IFN-γ de cinco dias foram 0,042 e 0,07,
respectivamente. A tabela 2 e a figura 16 mostram os resultados obtidos que
indicam correlação entre a freqüência de linfócitos T CD4+/CD69+/IFN-γ+ e o
grau de reatividade ao teste tuberculínico. Sugerem também a existência de
associação entre os níveis de IFN-γ nos sobrenadantes das culturas de PBMCs
estimuladas com PPD por cinco dias e o teste cutâneo, embora não seja
estatisticamente significativo. O modelo tem um R2 = 0.8212, mostrando que
este é um modelo com prognóstico razoável.
Variáveis
B
St Err of B
p-nível
CD4+/CD69+/IFN-γ+
21.35958
8.638775
0.042675
IFN-γ (5 dias)
0.00308
0.001452
0.071604
R²= 0.82119713
F(2,7)=16.075 p<0.00242
Tabela 2: Coeficientes de regressão múltipla e significância estatística. O diâmetro da induração no
teste tuberculínico PPD foi considerado a variável dependente.
56
Figure 5
(A)
Predicted vs. Observed Values
Tuberculin Skin Test (TST)
35
30
Observed TST Values
25
20
15
10
5
0
-5
-5
0
5
10
15
20
25
Predicted TST Values
30
35
95% confidence
(B)
Partial Correlations
PPD
CD4+CD69+
CD4+CLA+CD69+
CD4+CLA+
CD69+IFN-γγ+
CD4+CD69+IFN-γγ +
Figura 16 - Representa um modelo de regressão múltipla (Statistica v.6 2003, Statsoft inc., Tulsa,
OK, USA).
57
4.2 - Avaliação da produção de IFN-γγ em resposta a antígenos específicos
de M. leprae (peptídeos sintéticos e proteínas recombinantes) em células
mononucleares de indivíduos com diferentes graus de exposição a M.
leprae.
Após a conclusão do seqüenciamento do genoma de M. leprae foi possível
obter proteínas recombinantes e peptídeos sintéticos derivados da seqüência
de genes específicos da bactéria. No presente trabalho, avaliamos o potencial
destes novos antígenos na detecção específica de indivíduos infectados por M.
leprae no Rio de Janeiro, uma área endêmica para a hanseníase e tuberculose.
As seqüências dos peptídeos sintéticos utilizados nesta etapa do trabalho
estão listadas no anexo 7.6.
4.2.1 – Peptídeos sintéticos M. leprae específicos induziram a produção de
IFN-γ em culturas de PBMCs isoladas de pacientes com hanseníase e seus
contatos.
PBMCs de pacientes (PB e MB), contatos de pacientes multibacilares
(HC), paciente com tuberculose (TB), controle de área endêmica (EC) e
controle de área não endêmica (ENC) foram cultivadas com as proteínas
recombinantes, peptídeos sintéticos e antígenos controles (sonicado total de M.
leprae e SEB) e a produção de IFN-γ foi medida após cinco dias de cultura por
ensaio imunoenzimático. Os resultados da resposta de IFN-γ para M. leprae e
os estímulos controles são mostrados na figura 17.
58
SEB
Níveis de IFN-γγ (pg/mL)
Sem estímulo
7000
5000
4500
6000
4000
3500
3000
5000
4000
2500
2000
3000
1500
1000
500
0
-500
2000
1000
0
PB
MB
HC
EC
TB
PB
NEC
MB
HC
EC
TB
NEC
Níveis de IFN-γγ (pg/mL)
M. leprae
5000
4500
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
-500
HC
PB
TB
MB
EC NEC
Figura 17 - Nivéis de IFN-γ nas culturas de PBMCs de pacientes com hanseníase da forma
paucibacilar (PB) e multibacilar (MB), contatos de pacientes da forma multibacilar (HC),
pacientes com tuberculose (TB), controles de área endêmica (EC) e controles de áreas nãoendêmica (NEC) frente ao superantígeno SEB e M. leprae total. As culturas não estimuladas
representam os níveis de IFN-γ na ausência de estímulo antigênico. A linha pontilhada representa o
cut-off de 125 pg/ml de IFN-γ.
Nas figuras 18, 19, 20, 21, 22 e 23 observamos a resposta de IFN-γ
induzida pelo conjunto de 58 peptídeos sintéticos e pelas quatro proteínas
recombinantes (ML 008, ML 0126, ML 1057 e ML2567).
59
ML0008
IFN-γγ (pg/mL)
6000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
PB
2500
2250
MB
HC
P37
TB
NEC
P38
2500
2250
2000
2000
1750
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
1500
1250
1000
750
500
250
0
PB
2500
EC
MB
HC
EC
TB
-250
NEC
PB
P39
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
PB
MB
HC
EC
2500
2250
TB
HC
EC
TB
NEC
P40
PB
NEC
MB
MB
HC
EC
TB
NEC
P41
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
PB
MB
HC
EC
TB
NEC
Figura 18 - Níveis de IFN-γ em sobrenadantes de culturas de PBMC em resposta à proteína ML0008 e
peptídeos sintéticos derivados da sua seqüência. PB, Pacientes Paucibacilares (n=10); MB, Pacientes
Multibacilares (10); HC, Contatos de pacientes da forma multibacilar (n=10); EC, Controles de área endêmica
(n=10); TB, Pacientes com tuberculose (n=10), NEC, Controles de área não-endêmica (n=10). A linha
pontilhada corresponde ao limite de detecção do ELISA (125 pg/ml).
60
ML0126
IFN-γγ (pg/mL)
6000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
IFN-γ (pg/mL)
PB
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
P42
PB
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
MB HC
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
EC
TB NEC
P45
PB
MB HC
MB
EC
TB
NEC
HC
TB
NEC
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
P43
PB
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
EC
PB
PB
MB HC EC TB NEC
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
P80
MB
HC
EC
TB NEC
P44
MB
HC
EC
TB
NEC
P81
PB
MB
HC
EC
TB
NEC
Figura 19 - Níveis de IFN-γ em sobrenadantes de culturas de PBMCs em resposta a proteína ML0126
e peptídeos sintéticos derivados da sua seqüência. PB, Pacientes Paucibacilares (n=10); MB, Pacientes
Multibacilares (10); HC, Contatos de pacientes da forma multibacilar (n=10); EC, Controles de área
endêmica (n=10); TB, Pacientes com tuberculose (n=10), NEC, Controles de área não-endêmica (n=10). A
linha pontilhada corresponde ao limite de detecção do ELISA (125 pg/ml).
61
ML1057
IFN-γγ (pg/mL)
6000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
PB
HC
MB
NEC
P50
2250
2250
2000
2000
1750
1750
1500
1500
1250
1250
1000
1000
IFN-γγ (pg/mL)
TB
2500
P49
2500
EC
750
750
500
500
250
250
0
0
-250
-250
PB
MB
HC
EC
TB
NEC
PB
P51
MB
HC
EC
TB
NEC
P52
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
PB
MB
HC
EC
TB
NEC
250
0
-250
PB
MB
HC
EC
TB
NEC
Figura 20 - Níveis de IFN-γ em sobrenadantes de culturas de PBMCs em resposta a proteína ML1057
e peptídeos sintéticos derivados da sua seqüência. PB, Pacientes Paucibacilares (n=10); MB, Pacientes
Multibacilares (10); HC, Contatos de pacientes da forma multibacilar (n=10); EC, Controles de área
endêmica (n=10); TB, Pacientes com tuberculose (n=10), NEC, Controles de área não-endêmica (n=10). A
linha pontilhada corresponde ao limite de detecção do ELISA (125 pg/ml).
62
ML2567
IFN-γγ (pg/mL)
6000
5500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
PB
IFN-γγ (pg/mL)
2500
MB
HC
EC
TB
P53
NEC
2500
2250
2250
2000
2000
1750
1750
1500
1500
1250
1250
1000
1000
750
750
500
500
250
250
0
0
-250
-250
PB
MB
HC
EC
2500
TB
P54
PB
NEC
MB
HC
EC
TB
NEC
P55
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
PB
MB
HC
EC
TB
NEC
Figura 21 - Níveis de IFN-γ em resposta a proteína ML2567 e peptídeos sintéticos derivados da sua
seqüência. PB, Pacientes Paucibacilares (n=10); MB, Pacientes Multibacilares (10); HC, Contatos de
pacientes da forma multibacilar (n=10); EC, Controles de área endêmica (n=10); TB, Pacientes com
tuberculose (n=10), NEC, Controles de área não-endêmica (n=10). A linha pontilhada corresponde ao limite
de detecção do ELISA (125 pg/ml).
63
Peptídeos sintéticos específicos
2500
2000
1750
1750
1500
1500
1250
1250
1000
1000
750
750
500
500
250
250
0
0
-250
-250
MB
HC
EC
TB
P56
2500
IFN-γ (pg/mL)
2250
2000
PB
PB
NEC
2250
2000
2000
1750
1750
1500
1500
1250
750
1250
1000
750
500
500
250
250
0
-250
1000
0
-250
MB
HC
EC
TB
NEC
P63
2500
PB
2250
2000
2000
1750
1750
1500
1500
1250
1250
1000
1000
750
750
500
500
250
0
-250
250
0
-250
MB
HC
EC
TB
NEC
HC
EC
TB
NEC
MB
HC
EC
TB
NEC
EC
TB
NEC
P64
2500
2250
PB
MB
P61
2500
2250
PB
P48
2500
P47
2250
PB
MB
HC
Fig. 22 (continua)
64
P65
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
PB
MB
HC
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
EC
TB
IFN-γ (pg/mL)
MB
HC
EC
TB
HC
EC
TB
NEC
MB
HC
EC
TB
NEC
P70
P69
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
PB
NEC
MB
P68
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
PB
PB
NEC
P67
P66
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
PB
MB
HC
EC
TB
HC
HC
EC
TB
NEC
EC
TB
NEC
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
MB
MB
P73
P71
PB
PB
NEC
EC
TB
NEC
PB
MB
HC
Fig. 22 (continua)
65
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
P74
500
250
0
-250
500
250
0
-250
PB
MB
HC
EC
TB
NEC
PB
MB
HC
EC
TB
NEC
P77
P76
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
2500
2250
2000
170
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
500
250
0
-250
PB
IFN-γ (pg/mL)
P75
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
MB
HC
EC
TB
PB
NEC
P78
2000
1750
1500
1500
HC
EC
TB
NEC
HC
EC
TB
NEC
EC
TB
NEC
P82
2500
2500
2250
2000
MB
2250
1750
1250
1250
1000
750
1000
750
500
500
250
0
-250
250
0
-250
PB
2500
MB
HC
EC
TB
PB
NEC
P85
P83
2250
MB
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
500
250
0
-250
250
0
-250
PB
MB
HC
EC
TB
NEC
PB
MB
HC
Fig. 22 (continua)
66
IFN-γ (pg/mL)
P86
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
PB
MB
HC
P88
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
EC
TB
PB
NEC
MB
P91
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
2500
2250
2000
1750
1500
500
250
0
-250
500
HC
EC
TB
NEC
P92
1250
1000
750
PB
MB
HC
EC
TB
NEC
250
0
-250
PB
MB
HC
EC
TB
NEC
Figura 22 - Níveis de IFN-γ em resposta a peptídeos reconhecidos seletivamente por indivíduos
infectados por M. leprae. PB, Pacientes Paucibacilares (n=10); MB, Pacientes Multibacilares (10); HC,
Contatos de pacientes da forma multibacilar (n=10); EC, Controles de área endêmica (n=10); TB, Pacientes
com tuberculose (n=10), NEC, Controles de área não-endêmica (n=10). A linha pontilhada corresponde ao
limite de detecção do ELISA (125 pg/ml).
67
Peptídeos sintéticos com reatividade cruzada
1250
1000
750
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
500
250
0
-250
2500
2250
P46
IFN-γ (pg/mL)
2000
1750
1500
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
PB
MB
HC
EC
TB
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
500
250
0
-250
PB
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
MB
HC
EC
TB
NEC
P60
MB
HC
EC
TB
NEC
MB
HC
EC
TB
NEC
HC
EC
TB
NEC
P59
PB
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
500
250
0
-250
PB
PB
NEC
P58
P57
MB
P62
PB
MB
HC
EC
TB
NEC
Fig. 23 (continua)
68
P72
P79
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
PB
MB
HC
EC
TB
500
250
0
-250
NEC
PB
MB
P84
2500
2250
2000
1750
1500
1250
IFN-γ (pg/mL)
1000
PB
MB
HC
EC
TB
PB
NEC
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
500
250
0
-250
MB
HC
MB
EC
TB
NEC
PB
MB
NEC
HC
EC
TB
NEC
HC
EC
TB
NEC
TB
NEC
P94
P93
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
TB
P90
P89
PB
EC
P87
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
750
500
250
0
-250
HC
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
-250
PB
MB
HC
EC
TB
NEC
PB
MB
HC
EC
Figura 23 - Níveis de IFN-γ em resposta a peptídeos sintéticos que mostraram reatividade cruzada,
induzindo IFN-γ em indivíduos sadios de área endêmica e/ou com tuberculose. . PB, Pacientes
Paucibacilares (n=10); MB, Pacientes Multibacilares (10); HC, Contatos de pacientes da forma multibacilar
(n=10); EC, Controles de área endêmica (n=10); TB, Pacientes com tuberculose (n=10), NEC, Controles de
área não-endêmica (n=10). A linha pontilhada corresponde ao limite de detecção do ELISA (125 pg/ml).
69
Como podemos observar, a resposta de IFN-γ foi uniformemente
negativa à todas as proteínas recombinantes e aos peptídeos sintéticos quando
avaliamos o grupo controle de área não-endêmica (NEC).
Na figura 17
observamos que os níveis de IFN-γ nas culturas não estimuladas (somente
meio) de todos os grupos estudados apresentaram valores abaixo ou mesmo
fora do limite de detecção. As células de todos os indivíduos produziram altos
níveis de IFN-γ estimuladas com SEB.
Observamos nas figuras 18, 19, 20 e 21 que a resposta das quatro
proteínas recombinantes foi geralmente maior quando comparada com a dos
peptídeos sintéticos, e que também menos específica, isto é, mais indivíduos
dos grupos EC e TB responderam (responderam a ML0008, 6 EC e 2 TB;
responderam a ML0126, 9 EC e 2 TB; responderam a ML1057, 10 EC e 1 TB e
responderam a ML2567, 7 EC e nenhum TB).
A resposta das PBMCs isoladas dos pacientes com hanseníase PB e
MB e dos contatos dos pacientes multibacilares frente aos peptídeos mostrou
uma notável especificidade, estimulando a produção de IFN-γ em 60% - 100%
dos 10 pacientes BT (grupo PB) e em 50% - 100% dos 10 contatos (grupo HC).
Entre um e quatro dos dez pacientes multibacilares (MB) responderam a certos
peptídeos. Trinta e cinco dos peptídeos não causaram nenhuma resposta nos
grupos TB ou EC, mas mostraram boa reatividade nos grupos PB e HC
(peptídeos indicados com um asterisco na tabela do anexo 7.6). Já vinte e três
dos peptídeos mostraram reatividade cruzada com os grupos TB e EC. Alguns
desses peptídeos apresentavam homologia com M. tuberculosis, como p70
(gene fbpD Rv3803c, 80% de identidade), p93 (gene mce1C RV0171, 73% de
identidade) e p72 (gene proS Rv2845c, 27% de identidade). Já outros
peptídeos dentre os 23 que induziram resposta nos grupos EC ou TB
apresentaram baixa ou nenhuma homologia com M. tuberculosis, como no
caso dos peptídeos p57 e p60. A reação cruzada observada pode ser devida a
epítopos presentes nestes peptídeos.
Uma análise dos dados mostrados na figura 24 indica que no grupo PB a
maioria dos indivíduos respondeu muito bem aos peptídeos produzidos a partir
das proteínas recombinantes específicas de M. leprae (ML0008, ML0126,
ML0394, ML1057 e ML2567) e que alguns dos indivíduos desse mesmo grupo
70
responderam fracamente ou não responderam a estes peptídeos. Quando
analisamos os indivíduos do grupo EC e TB, observamos que a maior parte
não respondeu a maioria dos peptídeos. Vale a pena mencionar que todos os
indivíduos respondedores dos grupos analisados também responderam ao
sonicado total de M. leprae.
Figura 24 - Resposta individual de IFN-γ nos grupos PB, TB e EC contra as quatro proteínas
Os
recombinantes e seus respectivos peptídeos e aos peptídeos da proteína ML 0394.
quadrados fechados indicam quantidades detectáveis de IFN-γ; quadrados abertos indicam níveis de
IFN-γ < 125 pg/mL; quadrados com linhas diagonais indicam quantidade de IFN-γ que variou de 125299 pg/mL; quadrados com linhas horizontais indicam quantidade de IFN-γ que variou de 300-499
pg/mL; quadrados cinza escuro indicam quantidade de IFN-γ que variou de 500-999 pg/mL e
quadrados totalmente pretos indicam quantidade de IFN-γ acima de 1000 pg/mL.
Quatro dos seis peptídeos nanômeros apresentaram um bom potencial
de especificidade. Três destes seis peptídeos estavam contidos dentro de
peptídeos decapentâmeros analisados: p52 em p51 (ML1057), p61 em p59
(ML0398c) e o p69 em p65 (ML1419c). Os pares de peptídeos nanômeros e
decapentâmeros produzidos a partir das proteínas ML1057 e ML1419c foram
específicos, induzindo uma boa resposta nos grupos PB e HC e nenhuma
71
resposta nos grupos TB, EC e NEC.
Quando analisamos os peptídeos
produzidos a partir da proteína ML0398c observamos que o peptídeo
nanômero mostrou ser mais específico que o peptídeo decapentâmero. Isto
sugere que peptídeos nanômeros podem induzir ativação de linfócitos T CD8+
específicos ao antígeno e tem potencial de diagnóstico.
4.2.2 – Análise do fenótipo dos linfócitos T peptídeo específicos por
citometria de fluxo.
As freqüências de linfócitos T CD4+ e CD8+ ativados (CD69+)
produtores
de
(decapentâmeros)
IFN-γ
e
específico
aos
aos
peptídeos
peptídeos
P51,
P59
e
P65
nanômetros
(P52,
P61
e
P69
respectivamente) que estão contidos nos peptídeos decapentêmeros foram
analisados no sangue de um paciente BT e determinadas por citometria de
fluxo. Quando os peptídeos nanômeros e os decapentâmeros contendo na sua
seqüência os peptídeos nanêmeros foram comparados, os peptídeos
nanômeros preferencialmente ativaram linfócitos CD8+ e os peptídeos
decapentâmeros induziram resposta em ambas as populações CD4+ e CD8+
(Figura 25). Estas observações confirmam prévios resultados, indicando que
os peptídeos decapentâmeros ativam ambos os linfócitos T CD4+ e CD8+
(Maecker et al., 2001) e que os peptídeos nanômeros ativam preferencialmente
linfócitos T CD8+.
72
Linfócitos T CD4+
Linfócitos T CD8+
P51 (15mer)
0.4
2.6
5.2
12.9
IFN-γ+
P52 (9mer)
0.2
0.8
0.2
4.6
2.0
2.0
Semestímulo
0.03
0.09
0.10
0.6
CD69+
CD69+/IFN-γγ + (%)
3 Linfócitos T CD4+
Linfócitos T CD8+
3
2
2
1
0
1
P52 P51 P61 P59 P69 P65 Mix
(9) (15) (9) (15) (9) (15)
0
P52 P51 P61 P59 P69 P65 Mix
(9) (15) (9) (15) (9) (15)
Figura 25 – Freqüência de linfócitos T CD4+ e CD8+ ativados (CD69+) e produtores de IFN-γ por
peptídeos nanômeros (P52, P61, P69), decapentâmeros (P51, P59, P65) e a mistura deles. PBMC de
um paciente PB foi mantida em cultura por 6 horas com os estímulos especificados, utilizando anticorpos
monoclonais anti-CD28 e anti-CD49d como co-estímulo, com brefeldina A adicionada 1 hora após o início
da cultura, e posteriormente marcadas com os anticorpos monoclonais de especificidades desejadas para
moléculas de superfície (CD4, CD8, CD69) e intracelular (IFN-γ), após a permeabilização. A freqüência
foi determinada utilizando a análise que está descrita na seção de Material e Métodos.
73
4.2.3 - Análise estatística da resposta dos diferentes grupos estudados
aos peptídeos individuais.
Os níveis de IFN-γ induzidos pelos peptídeos individuais nos diferentes
grupos de indivíduos foram comparados usando o teste ANOVA para avaliação
da significância estatística.
Em adição ao teste ANOVA, o teste Tukey foi
usado para avaliar diferenças significativas entre dois grupos. A figura 26
mostra a análise dos três padrões de resposta observados frente aos peptídeos
específicos utilizados – aqui representados pela resposta aos peptídeos p67,
p69 e p75.
Figura 26 - ANOVA dos níveis de IFN-γ induzido por peptídeos sintéticos de M. leprae. O teste
Tukey foi utilizado para avaliar a diferença significativa entre os grupos estudados. Os valores de p são
mostrados nos gráficos. . PB, Pacientes Paucibacilares (n=10); MB, Pacientes Multibacilares (10); HC,
Contatos de pacientes da forma multibacilar (n=10); EC, Controles de área endêmica (n=10); TB,
Pacientes com tuberculose (n=10), NEC, Controles de área não-endêmica (n=10).
74
Os gráficos mostram a média para cada grupo, e o intervalo de
confiança de 0,95 foi ajustado pelo método dos quadrados mínimos para o
modelo ANOVA. A resposta de IFN-γ ao peptídeo p69 foi significativamente
maior no grupo HC (p = 0,02) e no grupo PB (p = 0,01) quando comparados
aos grupos controles (TB e EC). Dos 35 peptídeos analisados, 29 mostraram
este
padrão
de
resposta.
Em
contraste,
o peptídeo
p75
induziu
significativamente um nível de IFN-γ mais alto no grupo HC quando
comparamos com o grupo PB (p = 0,04), MB (p = 0,001) e grupos controle (p =
0,001).
Três outros peptídeos (p68, p91 e p92) induziram o mesmo tipo de
resposta. Finalmente, a resposta de IFN-γ a p67 foi significativamente maior no
grupo PB (p = 0,001) quando comparado com o grupo HC (p = 0,04), com o
grupo MB (p = 0,01) e com os grupos controle (p = 0,01).
4.3 – Análise dos níveis de IFN-γγ produzidos nas culturas de sangue total
estimuladas com peptídeos sintéticos M. leprae- específicos.
Após análise dos resultados anteriores ficamos interessados em
padronizar um teste mais simples e rápido – como o teste QuantiFERON-TB
Gold que vem sendo utilizado para diagnóstico da tuberculose latente (Mazurek
et al., 2005). Este teste apresenta algumas vantagens em relação a outros
testes imunológicos, como por exemplo: utilização do sangue total não
necessitando da purificação das células brancas, mede a resposta imune
celular em 24 horas (produção de IFN-γ) e não necessita de equipamentos
sofisticados para sua realização.
Sendo assim, nesta etapa do trabalho
utilizamos sangue total de pacientes (PB e MB), contatos de pacientes
multibacilares e controles de área endêmica que foi cultivado com as proteínas
de M. leprae (MLSA e MLCwA), PPD, peptídeo sintético (p69), pool 1 (p38 e
p56), pool 2 (p85 e p51), pool 3 (p85, p51, p69 e p88), pool 4 (p69, p52 e p68)
e o controle positivo (fornecido pelo kit). A produção de IFN-γ foi medida após
24 horas utilizando o kit QuantiFERON-CMI. Os níveis de IFN-γ em resposta
ao controle positivo, PPD, MLSA e MLCwA são mostrados na figura 27.
75
PPD
400
150
IFN-γ (pg/mL)
IFNγ (pg/mL)
Controle Positivo
400
350
300
250
200
100
150
100
50
0
50
0
EC
HC
MB
EC
PB
HC
PB
MLCwA
200
140
100
120
IFN-γ (pg/mL)
IFNγ (pg/mL)
MLSA
MB
100
80
60
40
20
80
60
40
20
0
0
EC
HC
MB
PB
EC
HC
MB
PB
Figura 27 - Quantificação de IFN-γ nos plasma das culturas de sangue total estimuladas com
mitógeno (controle positivo), PPD e as proteínas de M. leprae (MLSA e MLCwA). Culturas de 24
horas e quantificação de IFN-γ por QuantiFERON-CMI. A linha dos gráficos representa o cut-off (=
20pg/mL). . PB, Pacientes Paucibacilares (n=20); MB, Pacientes Multibacilares (20); HC, Contatos de
pacientes da forma multibacilar (n=20); EC, Controles de área endêmica (n=20).
Já a resposta ao peptídeo p69 e aos pools de peptídeos pode ser
observada na figura 28.
Pool 1
Pool 2
Pool 3
76
100
80
80
IFNγ (pg/mL)
IFNγ (pg/mL)
POOL 1
P69
100
60
40
20
60
40
20
0
0
EC
MB
EC
PB
POOL 2
100
HC
80
60
40
20
MB
PB
POOL 3
100
IFN-γ (pg/mL)
IFNγ (pg/mL)
HC
80
60
40
20
0
0
EC
HC
MB
EC
PB
MB
PB
POOL 4
100
IFNγ (pg/mL)
HC
80
60
40
20
0
EC
HC
MB
PB
Figura 28 - Níveis de IFN-γ nos plasma das culturas de sangue total estimuladas com o peptídeo
P69 e os pools1, 2, 3 e 4. As culturas foram mantidas por 24 horas e o plasma retirado para posterior
quantificação de IFN-γ por QuantiFERON-CMI. A linha dos gráficos representa o cut-off (= 20pg/mL). PB,
Pacientes Paucibacilares (n=20); MB, Pacientes Multibacilares (20); HC, Contatos de pacientes da forma
multibacilar (n=20); EC, Controles de área endêmica (n=20).
As culturas de sangue total estimuladas com o estímulo policlonal
(controle positivo) e frações brutas micobacterianas produziram IFN-γ em níveis
detectáveis. Na figura 28 observamos a reposta de IFN-γ às proteínas MLSA e
MLCwA nos grupos PB, MB, HC e EC utilizando o QuantiFERON-CMI. Já o
peptídeo p69 e os pools de peptídeos induziram baixos níveis de IFN-γ,
sugerindo que as condições de estimulação de sangue total com os peptídeos
de M. leprae precisam ser otimizadas.
77
V- Discussão
Segundo recomendação dos Programas Nacionais de Controle da
hanseníase e da tuberculose, duas ferramentas necessitam ser urgentemente
desenvolvidas a fim de permitir o controle adequado destas endemias: 1) testes
que possibilitem o diagnóstico específico destas infecções ainda num estagio
precoce, permitindo desta maneira a interrupção da transmissão, e no caso da
hanseníase, do aparecimento de incapacidade física; e 2) uma vacina mais
eficaz que o BCG, a única atualmente disponível contra estas micobacterioses.
Como as infecções por micobacterias induzem no hospedeiro uma resposta
imune do tipo celular, um teste cutâneo, que classicamente mede este tipo de
resposta, poderia ser o tipo de teste imunológico de escolha para avaliação de
exposição previa e/ou infecção ativa por estes patógenos. De fato, o teste
tuberculínico ou do PPD vem sendo utilizado há mais de 50 anos dando
suporte ao diagnóstico da tuberculose. O PPD, contudo, constitui um extrato
bruto de proteínas bacterianas, e assim, é de baixa especificidade. Já a
hanseníase carece de um teste similar ao PPD que meça exposição
previa/infecção ativa. O teste cutâneo da lepromina até hoje utilizado se baseia
numa preparação antigênica purificada, e não constitui uma reação de DTH
clássica, sendo lido com 21- 28 dias (teste de Mitsuda). O mesmo avalia a
capacidade de desenvolver uma resposta imune celular contra M. leprae, mas
não a exposição previa à bactéria.
Idealmente um teste cutâneo para a hanseníase e tuberculose teria que ter
como
base
antígenos
espécie-especificos,
não
compartilhados
com
micobacterias ambientais ou com o BCG, tornando-os assim específicos para
uma ou outra infecção. Este aspecto é particularmente importante no caso do
Brasil, onde tanto a hanseniase como a tuberculose mostram altas
prevalências, e onde a vacinação com BCG em neonatos é obrigatória
(Benévolo-de-Andrade et al., 2005). O alto grau de reatividade cruzada
observada entre as micobacterias tem dificultado a identificação de antígenos
apropriados, tarefa esta que está sendo muito facilitada atualmente pela
genômica comparada que, através de ferramentas de bioinformática, possibilita
a
comparação
dos
vários
genomas
micobacterianos,
recentemente
78
seqüenciados, permitindo assim a identificação de genes e seqüências
espécie-específicos (Brosh et al., 2000)
A ausência de modelos experimentais que mimetizem a doença em
humanos (Truman, 2005), representa historicamente uma importante limitação
no desenvolvimento de ferramentas para o controle da hanseníase e
igualmente impõe desafios no processo de seleção de novos antígenos
específicos e apropriados para um teste cutâneo.
Assim, a escolha dos
melhores candidatos dependeria de ensaios de DTH em seres humanos, o que
representaria um processo bastante complicado. Uma alternativa para
solucionar este problema seria a avaliação dos novos antígenos através de
testes in vitro (Dockrell et al., 2000). Nestes testes in vitro teriam que ser
analisados parâmetros imunológicos que tivessem alta correlação com a
reação de DTH observada in vivo, possibilitando assim uma formulação final
adequada de um teste cutâneo novo e especifico para a hanseníase.
Recentemente, a medição de alguns parâmetros de resposta imune in
vitro vem sendo proposta como alternativa a um teste cutâneo na detecção de
tuberculose latente (Pai et al 2006; Ferrara et al 2006). Estes parâmetros
incluem a produção de IFN-γ por leucócitos de sangue periférico (determinada
por ELISA), ou o número de linfócitos T periféricos produtores de IFN-γ através
da técnica de ELISPOT, ambos avaliados em resposta a antígenos
micobacterianos especificos (Pala, Hussell, Openshaw, 2000; Doherty et al.,
2005; Hill et al., 2005).
Visando contribuir neste aspecto do problema, na primeira etapa do
nosso trabalho lançamos mão da técnica de citometria multiparamétrica
(FACS-M) para definir parâmetros de resposta imune in vitro correlacionados
com a induração cutânea (resposta in vivo) ao PPD, o único teste cutâneo
disponível no contexto das micobacterioses e considerado “padrão ouro” em
todos os estudos onde novos reagentes cutâneos são propostos. Esta
metodologia permite a identificação fenotípica de subpopulações leucocitárias
respondedoras a uma preparação antigênica e características funcionais
relevantes destas células, como o perfil de produção de citocinas ou expressão
de marcadores de “homing” (Gauduin, 2006). No nosso trabalho avaliamos
simultaneamente a expressão em leucócitos sanguineos estimulados com PPD
por curta duração (seis horas) de quatro marcadores considerados importantes
79
numa reação de DTH, a saber: o co-receptor de linfócitos CD4, o receptor de
“homing” CLA, a molécula de superfície CD69 e IFN-γ intracelular (Pitzalis et
al., 1996). Estes marcadores foram avaliados em amostras de sangue total.
Alem da análise de citometria de fluxo, os níveis de IFN-γ em resposta ao PPD
foram mensurados em sobrenadantes de culturas de PBMCs obtidas dos
mesmos indivíduos estimuladas por um e cinco dias com o antígeno.
Esta etapa do nosso trabalho foi realizada comparando cinco indivíduos
reatores ao teste tuberculílico com cinco indivíduos PPD negativos. Apesar do
numero pequeno de indivíduos analisados, os resultados obtidos mostraram-se
claros
e
significativos.
Os
nossos
dados
indicaram:
1)
freqüências
significativamente maiores de linfócitos T de memória específicos ao PPD nos
indivíduos PPD positivos (% de células expressando CD69 após seis horas de
estímulo com PPD); 2) idem para linfócitos T de memória específicos ao PPD
produtores de IFN-γ; e 3) que os linfócitos CD69+ produtores de IFN-γ
responsivos ao PPD detectados nas condições de ensaio utilizados eram
preferencialmente CD4+. Como esperado, a análise de CLA mostrou uma
porcentagem dos linfócitos CD4+ PPD específicos expressando este marcador.
As frequencias de células T CD4+/CLA+ PPD específicas ativadas (CD69+) ou
ativadas produtoras de IFN-γ (CD69+/IFN-γ+) obtidas em nosso estudo
sugerem um total de 1 a 10 milhões destas células no sangue, quantidade mais
do que suficiente para gerar uma resposta inflamatória cutânea ao PPD.
Quando os diferentes parâmetros avaliados foram comparados à
reatividade ao teste cutâneo, uma forte correlação positiva e significativa foi
observada entre o tamanho da induração e a freqüência de linfócitos T
CD4+/CD69+/IFN-γ+ PPD específicos. Quando comparamos esta freqüência
com os níveis de IFN-γ mensurados por ELISA nos sobrenadantes de cinco
dias de PBMCs estimulados com PPD o primeiro se mostrou mais sensivel na
discriminação entre indivíduos PPD positivos e negativos.
Uma aplicação inicial da FACS-M, usando o PPD como antígeno, seria
no auxilio ao diagnostico da tuberculose latente (TL), em substituição ao teste
cutâneo. Esta substituição seria especialmente útil em grupos de indivíduos
com risco reconhecidamente maior de apresentarem infecção latente ou
tuberculose ativa, mas que não são reativos ao teste cutâneo. Entre estes
80
indivíduos incluem-se crianças (Shingadia & Novelli, 2003), indivíduos HIV+
(Maiano & Maecker, 2004) e indivíduos com tuberculose pulmonar (Tsao et al.,
1999) que apresentam linfocitos T específicos ao M. tuberculose, mas com
baixa ou nenhuma expressão de CLA e IFN-γ (Magnani et al, 2000). A FACS-M
também poderia ser utilizada para monitorar pacientes com artrite reumatóide
submetidos à terapia de imunossupressão, especialmente quando drogas que
bloqueiam o TNF-α são usadas. Existe um forte risco de evolução da
tuberculose do estado latente para a forma ativa nestes pacientes, que também
passam a não responder ao teste tuberculínico devido ao estado de
imunosuppressão (Horsburgh, 2004).
Ativação dos leucócitos por PPD se correlacionou com a resposta ao
teste cutâneo e esta foi associada com a produção de IFN-γ somente quando
os linfócitos T CD4+ foram analisados em culturas de sangue total de pouca
duração. Quando analisamos nestas culturas os linfócitos CD4-, observamos
que estes não foram capazes de responder ao PPD em níveis apreciaveis, isto
é, não foram capazes de produzir IFN-γ. A predominancia de linfócitos PPD
especificos produtores de IFN-γ com o fenótipo CD4 era um resultado esperado
uma vez que a resposta específica a antígenos exógenos, como o PPD,
preferencialmente ativa linfócitos T CD4+ por peptídeos antigênicos associados
à molécula MHC classe II.
A detecção de linfócitos CD8+ antígeno-específico produtores de IFN-γ.
A expressão de CD69+ induzida por PPD foi observada em todas as
populações
de
leucócitos
analisados.
Esta
expressão
foi,
contudo,
marcadamente maior em indivíduos PPD positivos em relação aos negativos,
somente quando a população de linfócitos T CD4+ foi analisada. Quando as
outras populações de leucócitos foram analisadas, PPD foi capaz de estimular
a expressão de CD69 em níveis similares, tanto nos invidíduos reatores ou não
ao PPD. Este resultado é consistente com a indução da expressão de CD69
por mecanismos não antígeno-específico pela resposta imune inata mediada
por citocinas ou outros estímulos (Atzeni et al., 2002).
Estes resultados
indicam que a detecção de linfócitos T CD4+ específicos para antígenos
relevantes poderia ser realizada medindo-se a indução da expressão de CD69
81
como alternativa à mensuração de células produtoras de IFN-γ ou níveis de
IFN-γ.
A ausência no enriquecimento dos linfócitos T específicos ao PPD na
população CLA+ pode ser explicado pelo fato de que a expressão de
receptores de “homing” específicos para os tecidos é programada nas
populações de linfócitos T virgens no ambiente de primagem, mantidos pelas
células dendríticas (Lee et al., 2003). A rota mais conhecida da infecção por M.
tuberculosis é a via aérea. Consequentemente, a micobactéria interage com o
sistema imune em ambientes como o encontrado na boca, que é similar à pele
na indução da expressão de CLA e nos receptores de quimiocinas, estes
requeridos para o “homing” de pele. Outros ambientes dentro do hospedeiro
induzem diferentes padrões de homing (Kunkel & Butche, 2002), como
fenótipos efetores/memórias e perfis de produção de citocinas.
O uso de
FACS-M permite a avaliação simultânea de ativação, padrões de homing e
perfis de citocinas das células imunocompetentes respondedoras a antígenos.
Esta aproximação pode produzir vários parâmetros básicos que permitirá
determinar in vivo diferentes funções nas populações celulares avaliadas
induzidas por antígenos.
A freqüência de linfócitos T CD4+/CLA+ ativados
(CD69+ ou CD69+/IFN-γ+) específicos ao PPD observada em indivíduos PPD+
sugere que a taxa destas células encontradas no sangue é de 106 a 107. Este
número de linfócitos T CLA+ circulante é específico ao antígeno e é suficiente
para o desenvolvimento de uma reação cutânea, como uma resposta
inflamatória.
Numa segunda etapa deste trabalho, utilizamos um painel de antígenos
recombinantes e peptídeos sintéticos de M. leprae identificados a partir da
genomica comparada com ferramentas de bioinformatica na busca de
reagentes apropriados para compor um teste imunológico específico para a
detecção de infecção por M. leprae. O parâmetro imunológico de escolha foi a
produção de IFN-γ, citocina classicamente induzida no hospedeiro em resposta
a infecção por micobacterias (Kaufmann, 1991). Avaliamos a produção de IFNγ em culturas de PBMCs estimuladas por cinco dias com os novos antígenos
micobacterianos por se tratar de uma metodologia mais simples e econômica
que a FACS-M e guardar também boa correlação com a reação de DTH in vivo.
82
Para este estudo, incluímos indivíduos com diferentes graus de exposição ao
M. leprae para avaliar tanto o grau de antigenicidade quanto a especificidade
dos novos reagentes. Além dos pacientes de hanseníase com as diversas
formas MB e PB, assim como contatos familiares de pacientes MB, grupos que
exibem alta exposição ao bacilo, indivíduos com tuberculose pulmonar,
indivíduos sadios de área endêmica com exposição previa desconhecida ao M.
leprae e indivíduos sadios de área não endêmica foram estudados para
avaliação do grau de reatividade cruzada dos novos antigenos.
Quatro proteínas recombinantes e 58 peptideos sintéticos de
decapentâmeros e nanômeros foram testados, e um dado surpreendente foi a
alta antigenicidade dos mesmos, todos sendo reconhecidos por pelo menos
alguns indivíduos infectados por M. leprae, sugerindo que os critérios utilizados
para a escolha de moléculas antigenicas foram apropriados. De fato, estudos
têm demonstrado que a bioinformática pode aumentar a eficiência de
selecionar epítopos em antígenos micobacterianos (Vordermeier et al., 2001).
Vários programas, como TEPITOPE, Algoritmo e ProPred têm sido utilizados
para identificar peptídeos capazes de se ligar a moléculas de MHC.
Os
programas TEPITOPE e ProPred foram utilizados para identificar ligantes de
HLA-DR derivados de tumor e proteínas endógenas envolvidos em doenças
auto-imune (Manici et al., 1999).
Apesar de antigênicas, as proteínas recombinantes testadas no nosso
estudo também foram reconhecidas por pacientes com tuberculose e sadios de
área endêmica, provavelmente por conter epitopos comuns a moléculas
presentes em outros organismos. De fato, no inicio do estudo, em 2002, as
quatro proteínas recombinantes utilizadas figuravam como especificas para M.
leprae (http://sanger.ac.uk). Contudo, na época da conclusão deste trabalho,
em 2005, uma nova busca em banco de seqüências já mostrava que, embora
ML0008, ML1057, e ML2567 ainda preservassem seu caráter espécieespecífico, um gene com 69% de identidade com ML0126 havia sido
identificado no genoma de M. ulcerans (http://genopole.pasteur.fr/Mulc/Burulist.html). Contudo, a resposta à maioria dos peptídeos (35 dos 58, ou 60%) foi
surpreendentemente freqüente e específica, só sendo observada praticamente
entre os indivíduos previamente expostos ao M. leprae. Dentre os doentes,
essencialmente só os indivíduos com
as formas PB responderam aos
83
peptídeos, resultado este esperado em vista da ausência de resposta celular
especifica a M. leprae nos pacientes com as formas MB. A maioria dos
peptídeos induziu níveis comparáveis de IFN-γ tanto nos doentes (PB) como
nos contatos sadios (HC), diferenciando assim estes dois grupos do resto da
população. Uma observação interessante foi o comportamento de alguns
peptídeos (p67, p68, p75, p91 e p92) em termos da sua capacidade de
discriminar indivíduos doentes (pacientes PB) dos indivíduos sadios, mas
expostos (HC).
Uma explicação para a detecção de um nível maior de
resposta no grupo HC em comparação ao grupo PB pode estar no fato de que
os antígenos em teste são preferencialmente expressos durante o período de
latência da infecção. Antígenos potencialmente marcadores de infecção
latente, mas não da infecção ativa vêm sendo igualmente descritos no contexto
da tuberculose (Temmerman et al., 2005).
Estudos futuros com estes
peptídeos usando um número maior de indivíduos por grupo serão necessários
para determinar se os mesmos mantêm este padrão de resposta.
Nossas
observações
mostram
que
tanto
peptídeos
nanômeros
(selecionados com base na sua ligação com alta afinidade à moléculas MHC
classe I) como decapentâmeros (selecionados com base na sua ligação com
alta afinidade à moléculas MHC classe II) induziram a produção de IFN-γ
especificamente em indivíduos infectados com M. leprae. A análise fenotípica
das células respondedoras a estes peptídeos mostrou como esperado, uma
ativação preferencial de linfócitos T CD8+ por peptídeos nanômeros e uma
ativação preferencial de linfócitos T CD4+ por peptídeos decapentâmeros.
Apesar da grande dificuldade de selecionar peptídeos nanômeros para uso in
vitro, já que estes a apresentam uma grande homologia com as seqüências de
outros genes, a resposta especifica observada em nosso trabalho a estes
peptídeos indica que células T CD8+ específicas são geradas durante a
exposição a M. leprae e que estas células podem ter um potencial diagnóstico.
Ultimamente, o papel do linfócito T CD8+ nas infecções micobacterianas
tem recebido mais atenção. Estudos recentes têm sugerido que antígenos de
patógenos localizados no interior de vacúolos podem ter acesso ao citoplasma
da célula infectada e assim ser apresentados por moléculas MHC de classe I
(Flynn et al., 2004). Os Linfócitos T CD8+ podem agir como células citotóxicas
84
e como produtoras de citocinas (IFN-γ, por exemplo) em infecção por
micobactérias. Estes linfócitos também têm sido relacionados à proteção na
fase crônica da infecção por micobactérias (Orme, 2004). Esta população de
linfócitos T também reconhece vários antígenos que não são apresentados
pela via clássica de MHC de classe I, mas apresentados por um grupo de
moléculas próximas, as chamadas moléculas de classe Ib. Neste grupo estão
incluídas as CD1 bem como as H2-M3. Moléculas CD1 apresentam antígenos
lipídicos, e quando células infectadas por
micobactérias, como o M.
tuberculosis, por exemplo, morrem, elas podem liberar vesículas que podem
carregar antígenos lipídicos. Estes podem ser fagocitados por células
dendríticas que podem apresentar então estes antígenos a linfócitos T CD8+ e
a células NK/NKT via moléculas MHC de classe I ou CD1 (Flynn, 2004; Orme,
2004).
Esta via de apresentação antigênica, provavelmente, tem grande
relevância na defesa do hospedeiro contra micobactérias em geral,
principalmente pela produção de IFN-γ por estas células.
Comparando a população de linfócitos T CD8+ com a população de
linfócitos T CD4+ observamos que linfócitos T CD4+ requerem a presença do
antígeno para proliferação no curso da resposta inflamatória.
Este dado
sustenta a idéia de utilizar a freqüência de linfócitos T CD4+ específicos para
os antígenos de M.leprae como uma ferramenta para detecção das infecções
latente e ativa por este microrganismo.
Por outro lado, o contato com o
antígeno pelo linfócito T CD8+ induz atividade citotoxica antígeno-específica,
expressão de receptores de citocinas e produção de citocinas como o IFN-γ,
bem como proliferação. A interação dos linfócitos T CD8+ com a célula
apresentadora do antígeno (APC) leva, quando a célula T CD8+ tem sua
função citotóxica ativada, à destruição da APC. Assim, surge um primeiro
elemento que associa a resposta da célula T CD8+ à concentração do antígeno
reconhecido por esta célula, e no caso de um bacilo, à carga bacilar (Sud et al.,
2006). Quando linfócitos T CD4+ são ativados, uma mesma APC pode ativar
diversas células, reduzindo neste aspecto a correlação entre quantidade do
antígeno e magnitude de resposta, em comparação com os linfócitos T CD8+.
Além disto, já foi demonstrado previamente que linfócitos T CD8+ exigem
níveis
crescentes
de
ocupância
de
receptor
e
tempos
também
85
progressivamente crescentes de contato com a APC, quando se compara os
níveis que induzem função citotóxica, síntese de IFN-γ e proliferação (Valittuti
et al., 1996; Sad, Kagi & Mosmann, 1996; Nancey et al., 2006).
As características funcionais já apontadas para os linfócitos T CD8+
podem ser comparadas com os níveis de IFN-γ produzidos por estas células,
que são proporcionais à carga bacilar dos indivíduos infectados por M. leprae,
desde que, o antígeno de M. leprae reconhecido aumente seus níveis no
organismo.
Tomadas em conjunto, estas observações sugerem que epítopos M.
leprae-específicos, reconhecidos por linfócitos T CD8+, têm grande potencial
para utilização no diagnóstico precoce da infecção latente por M. leprae, e na
determinação do nível de exposição a este bacilo.
Nas décadas passadas, os peptídeos sintéticos foram amplamente
usados como imunógenos e na confecção de "kits" de diagnósticos, mas nos
últimos anos surgiu o interesse em tentar controlar alergias, doenças
infecciosas e o crescimento de determinados tumores através de vacinas
constituídas por estas biomoléculas. É o caso do sarampo, da malária, da
infecção causada pelo vírus sinctial respiratório humano e do melanoma. Os
peptídeos têm sido utilizados para o desenvolvimento de vacinas e testes de
diagnóstico para indivíduos infectados com HIV (Xu et al., 2003), como também
para o diagnóstico de doenças autos imunes (Hayer et al., 2005).
O uso de peptídeos sintéticos para o diagnóstico da tuberculose tem
sido bem empregado em humanos e bovinos, como também na utilização de
uma vacina protetora para camundongo (Mustafa, 2000).
Coquetéis de
peptídeos sintéticos derivados das proteínas ESAT-6 e CFP-10 foram utilizados
no sangue total de indivíduos sadios utilizando o teste Quantiferon CMI. Este
distinguiu indivíduos não vacinados de indivíduos infectados e indivíduos
vacinados com BCG (Streeton, Desem & Jones, 1998). A sensibilidade do
ensaio de detectar tuberculose foi de 77,9%, com uma especificidade de 100%.
Estes resultados demonstraram que coquetéis de peptídeos podem discriminar
a infecção por M. bovis e à vacinação com BCG com alto grau de sensibilidade
e especificidade (Vordermeier,et al, 2001). Também vem sendo utilizada a
técnica ELISPOT, que é eficiente em estimar a freqüência de células
86
produtoras de citocinas relevantes (Pala, Hussel & Openshaw, 2000; Doherty et
al., 2005; Hill et al., 2005).
Para designar um teste diagnóstico que seja altamente sensitivo e
específico para hanseníase, será necessário incorporar ao teste uma mistura
de peptídeos ou uma poliproteína, isto porque tem sido mostrado que o uso de
antígenos múltiplos aumenta a freqüência de resposta de indivíduos infectados.
Fatores que influenciam a resposta a componentes individuais de uma mistura
incluem os marcadores genéticos (polimorfismo de MHC) de um indivíduo e um
determindado peptídeo que pode ser apresentado diferentemente às moléculas
de MHC de uma pessoa para outra; o estado imune de um indivíduo, como a
não reposta em pacientes infectados pelo HIV; doenças induzidas por anergia;
e a variação de linfócitos T respondedores a um antígeno em particular durante
o curso da infecção, que é provavelmente muito importante para pacientes com
a forma paucibacilar versus multibacilar da hanseníase.
Atualmente, nós
temos examinado a resposta de um grande número de pacientes hansenianos
e grupo controles com a mistura dos peptídeos e, surpreendentemente, foi
observado um aumento na resposta dos pacientes PB e no grupo HC. Por
outro lado, aumentou a percentagem de respondedores no grupo MB, embora
conservando alto nível de especificidade. Isto é importante no contexto de
países endêmicos, principalmente examinando a resposta dos controles sadios
de área endêmica. A combinação dos peptídeos poderia formular um teste da
resposta celular com especificidade e sensibilidade que possa futuramente
servir para um teste precoce e rápido para hanseníase.
Um dado interessante do nosso estudo foi a observação de que
peptídeos decapentâmeros que continham na sua seqüência os peptídeos
nanômeros também mostraram um comportamento específico. Os nossos
resultados sugerem que peptídeos que contêm seqüências reconhecidas por
moléculas MHC das classes I e II poderiam gerar testes de diagnostico com
maior sensibilidade, uma vez que tanto linfócitos T CD4+ como T CD8+
específicos ao antígeno são ativados por tal seqüência. Uma outra estratégia
para aumentar a sensibilidade seria a utilização de peptídeos denominados
permissíveis ou promíscuos, ou seja, capazes de se ligar a diversos alelos de
MHC do tipo HLA-DR. Do ponto de vista epidemiológico, a utilização de testes
contendo pools de peptídeos promíscuos permitiria, potencialmente, identificar
87
a exposição/infecção a M. leprae em indivíduos de diferentes grupos étnicos,
com diferentes tipos de moléculas HLA.
Finalizando, nossos resultados sugerem que peptídeos específicos
derivados da seqüência do genoma de M. leprae poderão ser úteis no
desenvolvimento de testes in vivo ou in vitro, específicos para a detecção de
infecção por M. leprae. A disponibilidade da seqüência completa de genomas
de diversos organismos, as ferramentas de bioinformática disponíveis que
permitem
selecionar
proteínas
ou
regiões
protéicas
específicas
e
potencialmente antigênicas e a avaliação através de FACS-M da resposta
imunonológica a estes novos antígenos abrem uma boa perspectiva de
desenvolvimento, em curto prazo, de novas ferramentas para o controle de
doenças infecciosas.
88
VI – CONCLUSÃO
6.1 - Primeira Etapa:
1. A freqüência de linfócitos T CD4+/CD69+ e CD4+/CD69+/IFN-γ+ presentes
em amostras de sangue total estimuladas com PPD correlacionou-se com a
reatividade do paciente ao PPD in vivo.
2. Esta
correlação
também
foi
observada
quando
analisamos
as
subpopulações de linfócitos T CD4+/CLA+.
3. A freqüência de células produtoras de IFN-γ entre os linfócitos T CD4- foi
irrelevante, confirmando que a população de linfócitos T CD4+ PPDespecíficos são as células relevantes na produção de IFN-γ induzida por
PPD.
4. Os níveis de IFN-γ nos sobrenadantes de culturas de PBMC estimuladas
com PPD por cinco dias correlacionaram-se com a reatividade ao teste
tuberculínico in vivo.
5. Quando comparamos o ensaio ELISA e o FACS-Multiparamêtrico, este se
mostrou com maior sensibilidade para discriminar indivíduos PPD + dos
PPD-, e produzir informações relevantes além da freqüência de linfócitos T
específicos ao antígeno ou do nível de resposta.
6.2 – Segunda Etapa:
1. Os indivíduos de área não endêmica (EUA) produziram IFN-γ abaixo dos
níveis detectados pelo ELISA frente a todos os antígenos de M. leprae.
2. As proteínas recombinantes específicas mostraram um alto grau de
reatividade cruzada, demonstrando assim, baixa potencialidade de
utilização num futuro teste para o diagnóstico específico da hanseníase.
89
3. Já a maioria dos peptídeos sintéticos (35) gerou uma resposta específica,
sendo capaz de discriminar paciente ( forma paucibacilar) e contatos
(população infectada com M. leprae) do resto da população.
4. Foi observada uma freqüência alta de linfócitos T CD4+ e T CD8+
produtores de IFN-γ frente aos peptídeos decapentâmeros, nos peptídeos
nanômeros e à mistura deles.
5. Os peptídeos decapentâmeros foram eficientes na indução da produção
de IFN-γ em ambas as populações, linfócitos T CD4+ e CD8+.
6. Os peptídeos de 9 mer induziram preferencialmente a produção de IFNγ nos linfócitos T CD8+.
7. A produção de IFN- γ por linfócitos T CD8+ em resposta a epítopos M.
leprae-específicos, associados à molécula HLA de classe II, tem potencial
para uso na determinação de nível de exposição/carga bacilar durante a
infecção latente pelo M. leprae.
8. As culturas de sangue total estimuladas com o estímulo policlonal
(controle positivo) e frações brutas micobacterianas produziram IFN-γ em
níveis detectáveis pelo QuantiFERON-CMI.
9. Já o peptídeo p69 e os pools de peptídeos induziram baixos níveis de
IFN-γ, sugerindo que as condições de estimulação de sangue total com os
peptídeos de M. leprae precisam ser otimizadas.
90
VII - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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7- ANEXOS
7.1 - Termo de Consentimento
CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA PARTICIPAÇÃO DE PROJETO
Avaliação da resposta imune celular a antígenos micobacterianos
Investigador responsável: Maria Cristina Vidal Pessolani, Ph.D.
Geraldo Moura Batista Pereira, Ph.D
Proposta do estudo: O objetivo deste estudo é examinar a resposta de células do seu sangue
contra proteínas do Mycobacterium leprae, a bactéria causadora da hanseníase. Nós solicitamos
que você participe do estudo porque 1) você tem hanseníase, 2) você está ou esteve em contato
com pessoas com hanseníase por muitos anos ou 3) você não tem essa doença e também não
conhece quem tenha. Em qualquer caso, se a resposta das células do seu sangue for positiva,
isso não significa que você esteja com a doença ou que esteja piorando, mas sua participação
será importante para encontrarmos uma substância que possa ser usada como vacina ou como
teste de diagnóstico da hanseníase.
Para participar desse estudo, precisaremos que você responda a um questionário e que você
permita a uma coleta de 20 ml do seu sangue. É possível, para confirmar resultados, que
peçamos a você mais uma coleta de sangue em outro dia. Além disso, você (dá) (não dá)
permissão para guardar as suas células que sobrarem para fazer estudos futuros sem entrarmos
em contato com você. Se você optar por permitir guardar suas células, os pesquisadores que
decidirem realizar uma nova pesquisa com seu material se comprometem a só fazê-lo se houver
consentimento do Comitê de Ética, sempre mantendo o sigilo sobre sua identidade.
Para retirar seu sangue, uma pessoa bem treinada fará a punção da veia do seu antebraço, no
ambulatório Souza Araújo, Fundação Oswaldo Cruz. Esse procedimento dura, no máximo, dez
minutos, e pode causar, embora muito raramente, dor, rouxidão ou infecção no local da punção.
As pessoas que vão puncionar o seu sangue e os pesquisadores deste estudo se comprometem a
não revelar sua identidade, embora os resultados dos seus testes possam vir a ser divulgados no
meio científico. Você não terá nenhum benefício direto em participar desse estudo, mas sua
participação será importante já que o resultado do seu sangue pode contribuir para o
desenvolvimento de um teste de diagnóstico para a hanseníase, e assim prevenir melhor a
população.
Sua participação neste estudo é inteiramente voluntária, e você é livre para decidir se quer ou
não participar deste estudo, bem como a se retirar em qualquer etapa da pesquisa, sem que isso
cause qualquer problema no seu atendimento ou tratamento neste ambulatório.
NOME:
ASSINATURA:
DATA:
ASSINATURA DO RESPONSÁVEL:
Nome e telefone de contato para questões e problemas: Maria Cristina Vidal Pessolani, Ph.D.,
55-21-22709997
103
7.2 – Tabela com os dados dos indivíduos com diferentes graus de
exposição a M. leprae que participaram da avaliação da resposta dos
antígenos específicos de M. leprae (peptídeos sintéticos e proteínas
recombinantes) em células mononucleares.
Nome
A.J.S
D.R.S.A
M.C
N.R.P
N.L
Z.C.P
D.P
R.F.C
D.P.R
R.O.L
V.G.C.A
J.H.M.M
M.J.H
D.P
M.F.G.F
O.G.O
L.F.N
A.G.A
C.A.M
A.O
A.C.S
L.F.O
H.G.S
C.S.P.C
L.C.S
M.M.A
C.L.C
H.G
O.F.S
J.C
E.T
M.C
J.G
J.L.L.S
S.R.C
S.M
M.F.M
C.D
J.F
M.V.L
A.C.C
N.P
J.P.F
G.C.N
A.L.L.F
B.F.B.F
J.B.C.M
M.V
R.M
C.B.L
Sexo
F
F
F
M
F
F
M
M
F
F
F
M
F
F
F
F
M
F
F
F
F
F
F
F
F
M
F
M
M
M
F
F
M
M
F
F
M
M
M
M
F
F
F
M
F
M
M
M
F
F
Idade
55
25
23
51
48
35
19
23
32
42
41
32
42
23
38
50
47
25
37
32
52
46
31
37
44
50
34
47
43
39
45
37
30
28
19
32
41
44
41
36
19
19
17
18
18
19
18
20
18
17
Grupo
HC
HC
HC
HC
HC
HC
HC
HC
HC
HC
BT
BT
BT
BT
BT
BT
BT
BT
BT
BT
TB
TB
TB
TB
TB
TB
TB
TB
TB
TB
BL
BL
BL
BL
LL
BL
BL
LL
BL
LL
EC
EC
EC
EC
EC
EC
EC
EC
EC
EC
Cor
NEGRA
NEGRA
PARDA
PARDA
PARDA
PARDA
NEGRA
PARDA
NEGRA
PARDA
PARDA
BRANCA
PARDA
NEGRA
PARDA
PARDA
PARDA
PARDA
NEGRA
PARDA
PARDA
BRANCA
PARDA
PARDA
PARDA
PARDA
PARDA
PARDA
NEGRA
PARDA
PARDA
PARDA
PARDA
PARDA
PARDA
PARDA
NEGRA
PARDA
PARDA
PARDA
PARDA
BRANCA
PARDA
PARDA
PARDA
BRANCA
BRANCA
PARDA
PARDA
BRANCA
104
7.3 - Tabelas com valores de IFN-γ (pg/mL) obtidos por ELISA para a elaboração
dos gráficos que estão apresentados na seção de resultados (4.2.1).
Valores dos níveis de IFN-γγ detectados nos Contatos de pacientes
da forma multibacilar (HC).
Individuos
A.J.S
D.R.S.A
M.C
N.R.P
N.L
Z.C.P
D.P
R.F.C
D.P.R
R.O.L
37
379
409
284
0
0
429
291
252
284
278
38
368
435
198
0
0
419
757
283
862
0
39
520
495
178
715
0
549
462
234
1120
490
40
519
481
740
1496
0
576
317
279
776
0
41
452
440
153
974
0
312
316
266
0
143
42
811
395
339
0
0
419
389
339
0
0
43
306
452
166
135
0
397
268
186
0
0
44
287
442
131
0
0
432
187
139
0
0
45
393
444
0
495
0
518
229
382
365
0
46
451
372
523
209
0
623
334
232
0
135
47
502
356
349
0
0
884
433
253
0
0
48
547
384
263
0
0
691
351
578
0
204
49
251
455
242
0
0
261
384
168
0
272
50
311
461
260
235
0
246
210
229
757
135
51
435
401
192
491
0
753
1754
197
2612
231
52
699
426
306
413
0
1068
313
226
863
189
53
335
395
476
208
0
300
394
273
0
216
54
487
453
261
1991
0
255
442
343
0
0
55
273
528
200
45
0
467
353
150
0
136
56
369
540
0
0
0
947
228
403
266
0
57
291
414
0
799
0
857
1361
181
1975
419
58
766
403
424
604
0
675
740
275
0
258
59
491
583
604
448
0
415
535
206
0
142
60
499
369
136
169
0
428
545
280
0
383
61
285
394
151
425
0
728
228
220
0
201
62
383
361
0
147
0
441
320
310
0
0
63
464
351
0
254
0
1354
388
292
0
164
64
871
333
339
308
0
1137
617
163
137
205
65
377
507
288
219
0
645
491
329
0
0
66
514
67
296
68
368
69
296
70
843
71
316
72
497
73
652
74
355
75
395
105
321
222
0
0
454
211
387
342
192
342
230
133
0
679
277
191
0
0
402
0
206
0
600
418
166
0
166
329
0
340
0
2117
828
0
1340
219
381
483
417
0
1073
917
169
1366
427
251
0
274
0
946
234
196
632
0
1804
314
163
0
739
529
295
555
0
373
310
392
526
135
366
319
410
164
414
612
160
206
0
0
194
739
0
524
602
283
178
441
337
0
651
200
76
497
502
487
172
0
403
220
215
265
0
77
225
356
1296
0
156
0
0
0
359
0
78
262
398
275
172
181
143
219
340
258
163
79
204
291
502
143
523
0
194
145
926
275
80
254
370
359
299
356
0
0
0
646
0
81
220
312
618
341
217
289
526
0
1959
554
82
708
280
598
516
212
223
236
0
539
301
83
151
314
734
0
180
0
182
0
0
217
84
432
331
354
162
205
0
278
147
873
335
85
326
320
1033
294
453
0
152
1488
1007
157
86
271
285
426
206
284
76
230
0
748
249
87
215
419
860
416
182
308
618
0
2389
301
88
198
284
1172
156
209
220
622
0
906
0
89
221
314
410
0
172
136
0
0
0
152
90
514
310
576
132
196
346
353
293
0
190
91
426
320
907
192
315
0
223
183
802
171
92
295
304
487
197
232
215
0
235
778
383
93
249
341
709
1131
160
792
1310
0
1367
321
94
474
337
1741
277
232
611
309
0
1711
222
0008
1193
310
560
199
736
1222
0
508
1840
1853
0126
369
280
7581
526
192
138
139
139
461
387
1057
527
405
505
206
327
131
655
130
2557
315
2567
1011
311
5100
641
240
1145
378
0
4187
1253
ML
1107
282
1104
1121
2113
870
752
146
1280
534
Valores dos níveis de IFN-γγ detectados nos pacientes da forma
paucibacilar (PB).
106
Individuos
V.G.C.A
J.H.M.M
M.J.H
D.P
M.F.G.F
O.G.O
L.F.N
A.G.A
C.A.M
A.O
37
615
483
0
154
157
416
139
414
143
204
38
675
342
306
277
151
255
411
0
426
316
39
683
441
441
422
128
221
0
0
664
138
40
863
478
1015
128
0
149
486
357
0
273
50
736
590
387
236
139
243
357
151
423
481
41
679
331
338
245
146
213
534
0
0
302
51
1200
439
1065
2151
0
162
153
183
0
358
42
527
412
512
0
145
346
288
313
0
279
52
762
320
1152
1060
142
157
0
469
0
159
43
744
577
257
205
133
393
0
606
431
361
53
642
503
435
407
148
168
550
171
0
418
44
503
547
501
128
132
215
0
183
769
182
54
834
769
635
570
143
248
219
135
228
284
45
1512
629
573
650
146
172
284
0
0
252
46
906
432
1214
587
171
182
294
471
302
194
47
798
426
583
151
0
205
0
0
0
288
48
1034
731
520
652
139
296
272
211
0
389
49
693
518
513
353
143
349
159
954
185
261
56
860
415
223
0
133
170
147
0
460
316
57
1638
474
392
0
139
169
436
395
0
174
58
1303
390
1078
151
166
201
224
404
0
295
59
802
310
704
0
368
230
566
806
642
275
60
479
279
626
206
135
314
0
433
765
364
61
698
458
194
0
319
246
0
381
128
206
62
656
429
160
0
325
209
421
772
414
358
63
1466
703
0
484
518
221
136
623
130
271
64
539
565
815
273
1065
166
350
219
559
439
65
698
460
461
294
3976
243
528
339
0
259
66
842
321
1237
582
162
283
216
451
0
390
67
660
607
201
130
5176
195
504
745
3978
493
68
1059
523
249
133
3216
282
349
647
2175
295
69
1646
704
826
571
152
188
522
348
789
317
70
908
464
862
558
2871
202
195
987
1682
206
71
501
453
419
364
2366
205
0
558
0
351
72
733
346
522
594
2152
272
145
609
2685
492
73
655
341
1360
0
0
316
1771
564
575
502
74
390
212
424
0
135
148
147
319
558
320
75
467
158
201
522
129
0
0
348
0
169
76
405
77
490
78
663
79
724
80
761
81
1138
82
695
83
484
84
725
85
616
107
55
536
678
281
0
138
188
537
0
906
629
1043
228
235
0
0
336
251
289
285
281
442
0
0
0
334
868
154
405
272
580
0
1121
147
0
588
344
258
356
1107
0
0
0
0
431
753
158
333
212
0
0
0
310
421
973
301
198
892
294
0
0
415
180
434
381
576
0
141
0
0
632
336
692
149
560
0
0
0
0
298
444
136
265
263
0
331
0
202
637
599
400
410
348
1233
0
0
414
0
394
674
206
86
1659
242
399
0
0
170
0
302
1041
369
87
1944
160
1408
297
0
130
0
351
372
274
88
1952
717
0
0
0
0
0
247
439
204
89
3453
508
188
0
0
0
468
1817
240
197
90
3472
230
0
332
0
0
446
762
554
322
91
1063
410
1746
285
3453
262
842
506
613
375
92
2030
275
463
243
3368
0
0
510
1335
275
93
2191
123
1327
1198
3201
0
327
240
453
352
94
2174
773
3214
389
3334
0
144
246
269
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0
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0
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ML
2682
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4498
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1720
108
Valores dos níveis de IFN-γγ detectados nos pacientes com
tuberculose (TB).
Indivíduos
37
ACS
LFO
HAP
CS
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MM
C.L.C
HG
OFS
JC
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multibacilar (MB).
Indivíduos
37
ET
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JG
JL
SC
SM
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Indivíduos
37
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NP
JPF
GCN
ALLF
BFBF
JBCM
MV
RM
CBL
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0
0
0
0
0
0
0
0
0
75
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
113
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
76
77
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
86
0
0
0
0
0
0
0
220
0
0
0126
1270
996
147
552
287
0
211
1299
260
245
78
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
87
0
0
0
0
0
0
1417
0
681
0
1057
1200
908
1450
3197
510
2135
360
4217
5876
976
0
148
0
0
0
0
0
163
0
0
88
0
0
0
0
0
0
0
0
3219
0
2567
1424
0
0
3048
0
2722
269
4180
6299
2564
79
80
0
0
0
0
0
0
130
0
349
0
89
0
0
0
3169
0
0
1363
2022
1851
1249
81
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
90
0
0
0
2977
0
0
1332
4176
6028
2704
82
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
91
0
0
0
0
0
0
0
0
193
0
83
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
92
0
0
0
0
0
0
0
218
0
0
84
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
93
0
0
0
257
0
0
817
3708
2280
0
0
0
0
0
0
0
175
0
427
0
94
0
0
0
0
0
0
0
3813
0
0
ML
2813
3475
0
0
2579
0
3460
0
0
0
114
85
0
0
0
0
0
0
0
0
572
0
0008
1551
2515
0
193
0
0
2780
1390
350
0
7.4- Tabela com os dados dos indivíduos com diferentes graus de
exposição ao M. leprae de Fortaleza que participaram da avaliação da
resposta dos peptídeos sintéticos em cultura de sangue total utilizando o
QuantiFEROM-CMI.
NOME
M.P.L
E.P.L
W.S.A
C.C.S
P.C.S
O.M.R
A.A.P
F.G.S.P
D.M.D.C
H.F.N
J.U.A.A
M.C.C.R
A.S.B
F.C.S
M.P.C
F.M.P.P
R.S.C.P
M.G.NS
J.N.F
J.M.S
A.M.S
A.G.F
U.F.S
A.F.S
M.L.R.S
A.A.R.A
F.A.A.O
F.M.S
R.N.L.S
J.J.M.P
M.L.F.L
T.M.M.L
F.A.N
M.F.F.A
F.F.A.S
R.G.C
T.C.F
F.A.O.M
M.V.S
M.F.C.P
SEXO
F
M
M
F
M
M
M
M
F
M
M
F
M
M
F
M
F
F
F
F
F
F
M
M
F
F
F
M
M
M
F
F
M
F
F
F
F
M
F
F
IDADE
44
37
31
23
19
21
25
21
20
39
41
37
43
22
35
38
28
45
19
39
51
43
39
32
46
28
34
27
41
38
51
27
32
29
10
31
43
46
28
43
GRUPO
BL
HC
BT
EC
EC
EC
EC
EC
EC
BL
BT
TT
BT
TT
HC
HC
HC
BL
BT
BL
HC
BL
HC
LL
BL
HC
HC
BL
BL
TT
BT
HC
LL
HC
BT
TT
EC
EC
EC
EC
COR
PARDA
PARDA
PARDA
PARDA
PARDA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
PARDA
BRANCA
BRANCA
PARDA
PARDA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
PARDA
PARDA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
PARDA
PARDA
PARDA
PARDA
PARDA
PARDA
BRANCA
PARDA
PARDA
BRANCA
PARDA
PARDA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
PARDA
BRANCA
PGL-1
+FORTE
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIV O
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
+FORTE
NEGATIVO
+FRACO
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
+FORTE
+FRACO
+FRACO
+FRACO
+FORTE
+FORTE
+FRACO
+MODERADO
+FORTE
+MODERADO
NEGATIVO
NEGATIVO
+FORTE
NEGATIVO
+FRACO
+FRACO
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
BCG
NENHUMA
1º DOSE
NENHUMA
1º DOSE
NENHUMA
1º DOSE
NENHUMA
1º DOSE
NENHUMA
NENHUMA
NENHUMA
1º DOSE
1º DOSE
1º DOSE
NENHUMA
NENHUMA
1º DOSE
NENHUMA
NENHUMA
1º DOSE
1º DOSE
NENHUMA
NENHUMA
1º DOSE
NENHUMA
NENHUMA
1º DOSE
1º DOSE
NENHUMA
NENHUMA
NENHUMA
1º DOSE
1º DOSE
NENHUMA
NENHUMA
1º DOSE
2º DOSE
ID
B001
B002
B003
B004
B005
B006
B007
B008
B009
B010
B011
B012
B013
B014
B015
B016
B017
B018
B019
B020
B021
B022
B023
B024
B025
B026
B027
B028
B029
B030
B031
B032
B033
B034
B035
B036
B037
B038
B039
B040
115
7.5 - Tabelas com valores de IFN-γ (pg/mL) obtidos por QuantiFERON
para a elaboração dos gráficos apresentados na seção de resultados
(4.3).
CP
CN
PPD
MLSA
MLCwA
POOL 1
POOL 2
POOL 3
B001
1
1,597
0
0,036
1,187
0
0,099
0
0
B001
2
1,605
0
0
0,014
0
0
0
0
B001
Média
1,601
0
0
0,014
0
0
0
B001
IFN g
7,179
0
0
0,063
0
0
0
0
B002
1
0,908
0,495
0,35
0,296
0,368
0,613
0,389
0,303
B002
2
0,856
0,306
0,236
0,671
0,764
0,348
0,387
0,694
B002
Média
0,882
0,4005
0,293
0,296
0,368
0,348
0,388
0,303
B002
IFN g
3,955
1,796
1,313
1,327
1,650
1,560
1,739
1,358
POOL 4
P69
0
0
0
0,024
0
0
0
0
0,357
0,336
0,382
0,418
0,3695
0,377
1,657
1,690
0
0
CP
CN
PPD
MLSA
MLCwA
POOL 1
POOL 2
POOL 3
POOL 4
P69
B004
1
0,539
0
0,268
0,049
0,017
0
0,021
0,003
0
0,01
B004
2
0,524
0,003
0,243
0,123
0,019
0
0
0,002
0
0,002
B004
Média
0,5315
0,0015
0,2555
0,049
0,018
0
0
0,0025
0
0,002
B004
IFN g
3,784
0,010
1,819
0,348
0,128
0
0
0,017
0
0,014
B005
1
xx
0,616
0
0
0
0
0
0
0
0,026
B005
2
xx
0
0
0,008
0
0
0
0
0,236
0,034
B005
Média
xx
0
0
0,004
0
0
0
0
0
0,03
B005
IFN g
xx
0
0
0,017
0
0
0
0
0
0,134
B006
1
2,046
0
0,031
0,008
0,007
0,009
0
0
0
0,002
CP
CN
PPD
MLSA
MLCwA
POOL 1
POOL 2
POOL 3
POOL 4
P69
B007
1
2,415
0,007
0,366
0,04
0,048
0,005
0,006
0
0
0,008
B007
2
2,406
0,015
0,374
0,038
0,031
0,006
0
0
0,007
0,01
B007
B007 B008
Média IFN g
1
2,4105 17,165
xx
0,011 0,078 0,004
0,37
2,634
0,31
0,039 0,277 0,013
0,0395 0,281 0,019
0,0055 0,039 0,003
0
0
0,002
0
0
0
0
0
0,002
0,009 0,064 0,005
CP
B010
1
xx
B010
2
xx
B010
Média
xx
0
B010
IFN g
xx
B011
1
xx
B003
Média
0,756
0,05
0
0
0
0
0
0
B003
IFN g
3,390
0,224
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
B006
2
1,96
0
0,033
0,006
0,009
0
0,004
0
0,003
0,002
B006
Média
2,003
0
0,032
0,007
0,008
0
0
0
0
0,002
B006
IFN g
14,26
0
0,227
0,049
0,056
0
0
0
0
0,014
B008
2
xx
0,001
0,316
0,014
0,019
0,002
0,007
0,001
0,005
0,011
B008
B008 B009 B009 B009
Média
IFN g
1
2
Média
xx
xx
0,867 0,901 0,884
0,0025 0,017 0,042 0,075 0,0585
0,313
2,228 0,306 0,297 0,3015
0,0135 0,096 0,133 0,113 0,123
0,019 0,13529 0,11 0,098 0,104
0,0025 0,017 0,024 0,031 0,0275
0,002
0,014 0,035 0,049 0,042
0
0
0,039 0,04 0,0395
0,002
0,014
0,09 0,069 0,0795
0,008
0,056 0,119 0,065 0,092
B009
IFN g
4,90
0,324
1,672
0,682
0,576
0,152
0,233
0,219
0,441
0,510
B011
2
xx
B011
Média
xx
B012
IFN g
15,31
B011
IFN g
xx
B003 B003
1
2
0,807 0,705
0,542 0,05
0
0
0
0
0,11
0
0
0
0
0
0,076
0
B012 B012
1
2
2,751 2,771
B012
Média
2,761
116
CN
PPD
MLSA
MLCwA
POOL 1
POOL 2
POOL 3
POOL 4
P69
0,037
0,108
0,09
0,094
0,036
0,044
0,061
0,098
0,113
0,064
0,104
0,072
0,134
0,044
0,054
0,068
0,081
0,094
0,037 0,205
0,106 0,588
0,081 0,449
0,114 0,632
0,04
0,221
0,049 0,271
0,0645 0,357
0,0895 0,496
0,1035 0,5742
0,121
0,299
0,134
0,122
0,036
0,062
0,063
0,087
0,108
0,161
0,282
0,133
0,16
0,059
0,071
0,08
0,093
0,082
0,141
0,782
0,2905
1,61
0,1335 0,740
0,141
0,782
0,0475 0,263
0,0665 0,368
0,0715 0,396
0,09
0,499
0,095 0,52704
0,029
0,547
0,209
0,34
0,041
0,059
0,07
0,107
0,117
0,04
0,499
0,203
0,369
0,067
0,064
0,103
0,09
0,138
0,0345
0,523
0,206
0,3545
0,054
0,0615
0,0865
0,0985
0,1275
0,191
2,901
1,142
1,966
0,299
0,341
0,479
0,546
0,707
CP
CN
PPD
MLSA
MLCwA
POOL 1
POOL 2
POOL 3
POOL 4
P69
B013
1
0,852
xx
0,072
0,041
0,059
0,01
0,028
0,072
0,077
1,107
B013
2
0,935
0,03
0,031
0,107
0,088
0,069
0,233
0,409
0,08
0,135
B013
Média
0,8935
0,03
0,031
0,041
0,0735
0,01
0,028
0,072
0,0785
0,135
B013
IFN g
5,272
0,177
0,182
0,241
0,433
0,059
0,165
0,424
0,463
0,796
B014
1
xx
0,034
0,457
0,483
0,28
0,044
0,437
0,076
0,489
0,415
B014
2
xx
0,09
0,51
0,266
0,205
0,022
0,089
0,038
0,063
0,398
B014
Média
xx
0,034
0,4835
0,266
0,2425
0,022
0,089
0,038
0,063
0,4065
B014
IFN g
xx
0,200
2,852
1,569
1,430
0,129
0,525
0,224
0,371
2,398
B015
1
0,036
0,035
0,507
0,11
0,124
0,036
0,081
0,077
0,067
0,096
B015 B015
2
Média
0,024
0,03
0,116 0,035
0,907 0,507
0,131 0,1205
0,359 0,124
0,079 0,036
0,368 0,081
0,061 0,069
0,064 0,0655
0,393 0,096
B015
IFN g
0,177
0,206
2,991
0,710
0,731
0,212
0,477
0,407
0,386
0,566
CP
CN
PPD
MLSA
MLCwA
POOL 1
POOL 2
POOL 3
POOL 4
P69
B016
1
0,046
0,071
0,231
0,169
0,143
0,028
0,048
0,081
0,072
0,107
B016
2
0,084
0,054
0,652
0,204
0,428
0,149
0,166
0,093
0,11
branco
B016
Média
0,065
0,0625
0,231
0,1865
0,143
0,028
0,048
0,087
0,091
0,107
B016
IFN g
0,383
0,368
1,362
1,100
0,843
0,165
0,283
0,513
0,536
0,631
B017
1
xx
0,043
0,385
0,122
0,087
0,005
0,003
0,011
0,016
0,025
B017
2
xx
0,017
0,364
0,133
0,13
0
0,007
0,016
0,008
0,025
B017
Média
xx
0,017
0,3745
0,1275
0,1085
0
0,003
0,0135
0,012
0,025
B017
IFN g
xx
0,106
2,341
0,797
0,678
0
0,018
0,084
0,075
0,156
B018
1
xx
0
0,159
0,013
0,008
0,006
0
0
0
0
B018 B018
2
Média
xx
xx
0,005
0
0,128 0,1435
0
0
0,014 0,011
0
0
0
0
0
0
0,008
0
0
0
B018
IFN g
xx
0
0,897
0
0,068
0
0
0
0
0
CP
CN
PPD
MLSA
MLCwA
POOL 1
POOL 2
POOL 3
POOL 4
P69
B019
1
2,143
0
0,423
0,661
0,543
0
0
0
0
0
B019
2
2,084
0,154
0,405
0,708
0,564
0
0
0
0,01
0,006
B019
B019 B020
Média IFN g
1
2,1135 13,215 1,779
0
0
0
0,414 2,588 0,016
0,6845 4,279
0
0,5535 3,460 0,009
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0,003 0,0187 0,007
58
B020
2
1,655
0
0,018
0,003
0,019
0
0,002
0
0
0,005
B020
Média
1,717
0
0,017
0,0015
0,009
0
0,001
0
0
0,006
B020
IFN g
10,73
0
0,106
0,009
0,056
0
0,006
0
0
0,037
B021
1
1,368
0,218
0,125
0,054
0,077
0,021
0,039
0,077
0,202
0,135
B021 B021
2
Média
1,407 1,3875
0,029 0,029
0,105 0,115
0,078 0,066
0,052 0,0645
0,039
0,03
0,178 0,039
0,177 0,077
0,079 0,079
0,057 0,057
B021
IFN g
7,896
0,165
0,654
0,375
0,367
0,170
0,221
0,438
0,449
0,324
CP
B022
1
1,365
B022
2
1,343
B022
Média
1,354
B023
2
2,586
B023
Média
0,987
B023
IFN g
5,616
B024 B024
1
2
0,915 0,893
B022
IFN g
7,705
B023
1
0,987
B024
Média
0,904
117
B024
IFN g
5,144
CN
PPD
MLSA
MLCwA
POOL 1
POOL 2
POOL 3
POOL 4
P69
0,074
0,434
0,053
0,077
0,004
0,352
0,028
0,031
0,077
0,094
0,415
0,055
0,04
0
0
0,034
0,056
0,026
0,084
0,4245
0,054
0,0585
0,002
0
0,031
0,0435
0,026
0,478
2,415
0,307
0,332
0,011
0
0,176
0,247
0,147
0
0,057
0,054
0,081
0
0
0,045
0,009
0,041
0
0,033
0,046
0,075
0
1,644
0,001
0,023
0,043
0
0,045
0,05
0,078
0
0
0,001
0,009
0,042
0
0,256
0,284
0,443
0
0
0,005
0,0512
0,239
0,087
0,17
0,167
0,18
0,116
0,104
0,684
0,159
0,165
0,105
0,137
0,145
0,176
0,087
0,129
0,116
0,166
0,145
0,096
0,1535
0,156
0,178
0,1015
0,1165
0,116
0,1625
0,155
CP
CN
PPD
MLSA
MLCwA
POOL 1
POOL 2
POOL 3
POOL 4
P69
B025
1
1,83
0
0,009
0
0
0
0,032
0
0,258
0,013
B025
2
1,878
0
0,013
0,005
0
0,014
0
0,333
0,003
0
B025
B025 B026
Média IFN g
1
1,854 11,111 1,571
0
0
0,002
0,011 0,065 0,213
0,0025 0,014
0,95
0
0
0,113
0
0
0
0
0
0
0
0
0,015
0,003 0,017 0,318
0
0
0,006
B026
2
1,567
0,028
0,232
0,044
0,032
0
0
0,057
0,019
0
B026
Média
1,569
0,002
0,2225
0,044
0,032
0
0
0,015
0,019
0
B026
IFN g
9,403
0,012
1,333
0,263
0,191
0
0
0,089
0,113
0
B027
1
xx
0,021
0,042
0,177
0,131
0,051
0,071
0,102
0,016
0,021
B027 B027
B027
2
Média IFN g
xx
xx
xx
0
0
0
0,115 0,042 0,251
0,083 0,083 0,497
0,122 0,1265 0,758
0,02
0,02
0,119
0,016 0,016 0,0955
0,026 0,026 0,155
0,025 0,0205 0,122
1,088 0,021 0,125
CP
CN
PPD
MLSA
MLCwA
POOL 1
POOL 2
POOL 3
POOL 4
P69
B028
1
1,321
0
0,034
0,823
0,001
0,008
0,009
0,015
0,02
0,016
B028
2
1,265
0,017
0,349
0,017
0,974
0,361
0,023
0,01
0,004
0,075
B028
Média
1,293
0
0,034
0,017
0,001
0,008
0,009
0,0125
0,004
0,016
B028
IFN g
7,749
0
0,203
0,101
0,005
0,047
0,053
0,074
0,023
0,095
B029
1
1,544
0
0,013
0,002
0
0
0,547
0,018
0,068
0,009
B029
2
1,573
0
0,018
0
0,017
0
0
0
0
0,004
B029
Média
1,5585
0
0,0155
0,001
0
0
0
0
0
0,004
B029
IFN g
9,141
0
0,090
0,005
0
0
0
0
0
0,023
B030
1
2,806
0,134
0,407
0,099
0,032
0
0
0
0,028
0
B030 B030
2
Média
2,826 2,816
0
0
0,442 0,4245
0,135 0,117
0,047 0,0395
0
0
0
0
0
0
0,008 0,008
0
0
CP
CN
PPD
MLSA
MLCwA
POOL 1
POOL 2
POOL 3
POOL 4
P69
B031
1
2,452
0,027
0,201
0,067
0,062
0
0
0
0,008
0,008
B031
2
2,21
0,006
0,223
0,078
0,068
0
0,036
0,03
0
0,009
B031
Média
2,331
0,006
0,212
0,0725
0,065
0
0
0
0
0,0085
B031
IFN g
13,67
0,035
1,243
0,425
0,381
0
0
0
0
0,049
B032
1
0,835
0,065
0,106
0,062
0,034
0,089
0,036
0,023
0
0,102
B032
2
0,775
1,037
0,105
0,023
0,093
0,111
0
0,003
0
0,099
B032
Média
0,805
0,065
0,1055
0,023
0,034
0,1
0
0,003
0
0,1005
B032
IFN g
4,722
0,381
0,618
0,134
0,199
0,586
0
0,017
0
0,589
B0034 B0034 B0034 B0034
1
2
Média IFN g
0,282 0,306 0,294 1,810
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0,13
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
CP
B0035
1
1,124
B0035
2
1,147
B0035 B0035 B0036 B0036
Média IFN g
1
2
1,1355 6,994 2,276 2,424
B0036
Média
2,35
B0036 B0037 B0037 B0037 B0037
IFN g
1
2
Média IFN g
14,47 1,031 0,945 0,988 6,085
118
0,546
0,873
0,887
1,012
0,577
0,662
0,660
0,924
0,882
B030
IFN g
16,52
0
2,490
0,686
0,231
0
0
0
0,046
0
CN
PPD
MLSA
MLCwA
POOL 1
POOL 2
POOL 3
POOL 4
P69
0
0,363
0,056
0,018
0,001
0
0
0
0
0
0,38
0,056
0,054
0
0
0
0
0
0
0,3715
0,056
0,018
0
0
0
0
0
0
2,288
0,344
0,110
0
0
0
0
0
CP
CN
PPD
MLSA
MLCwA
POOL 1
POOL 2
POOL 3
POOL 4
P69
B0038
1
0,63
0
1,981
0,341
0,442
0
0
0,001
0,005
0,017
B0038
2
0,609
0,192
1,943
0,377
0,478
0
0
0,009
0,008
0,015
B0038 B0038
Média IFN g
0,6195 3,755
0
0
1,962 11,895
0,359 2,176
0,46
2,788
0
0
0
0
0,001 0,006
0,0065 0,039
0,016 0,097
0
0,324
0
xx
0
0
0
0
xx
0,213
0,043
0
0
0
0
0
0
0
0
0,043
0
0
0
0
0
0
0
0
0,264
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
B0039 B0039
1
2
1,43
1,39
0,005
0
0,167 0,165
0,031 0,019
0,022 0,047
0,001 0,697
0,026 0,022
0,012 0,052
0,004 0,007
0,014
0,16
B0039
Média
1,41
0
0,166
0,025
0,022
0,001
0,024
0,012
0,0055
0,014
B0039 B0040 B0040 B0040 B0040
IFN g
1
2
Média IFN g
8,548 1,412 1,355 1,3835 8,387
0
0,007 0,006 0,0065 0,039
1,006
0,17 0,171 0,1705 1,033
0,15
0,033 0,033 0,033 0,200
0,133 0,042 0,06
0,051 0,309
0,006 0,004 0,029 0,004 0,024
0,145
0,01 0,016 0,013 0,078
0,072
0
0
0
0
0,033
0
0,003 0,0015 0,009
0,08
0,011 0,016 0,0135 0,081
119
0
0
0
0
0
0
0
0
0
7.5 - Anexo 4: Tabela com os resultados da análise de citômetria de fluxo
que definiu o fenótipo da células T responsável pela produção de IFN-γγ
em resposta aos peptídeos sintéticos.
CD4
CD8
Ag
TN
CD69
CD69
IFNγ
IFNγ
ΤΝ
NS
6
S
0.1
0.03
31
S
0.64
0.09
7 Iso
0.04
0.04
32 Iso
0.04
0.14
SEB
8
S
27.56
2.98
33
S
29.52
3.54
9 Iso
0.45
0.09
34 Iso
0.03
0.13
Mix
10
S
9.72
0.94
35
S
15.64
1.82
11 Iso
0.22
0.03
36 Iso
0.39
0.25
p51
12
S
5.23
0.44
37
S
12.89
2.64
13 Iso
0.22
0.04
38 Iso
0.02
0.09
P52
14
S
1.99
0.21
39
S
4.55
0.77
15 Iso
0.01
0.15
40 Iso
0.39
0.25
P61
16
S
1.59
0.1
41
S
4.74
0.88
17 Iso
0.01
0.03
42 Iso
0.01
0.05
P59
18
S
4.19
0.31
43
S
5.17
0.79
19 Iso
0
0.03
44 Iso
0.03
0.12
P69
20
S
4.52
0.38
45
S
4.5
0.97
21 Iso
0.01
0.05
46 Iso
0.1
0.06
P65
22
S
5.7
0.42
47
S
3.9
0.71
23 Iso
0.02
0.02
48 Iso
0.11
0.11
PPD
24
S
2.33
0.09
25 Iso
0
0.04
NS= Não estimulado, S = Marcado com anticorpo específico, I = Controle de isotipo,
TN = Número dos tubos
-p65 (decapentâmero) contém p69 (nanômetro)
-p59 (decapentâmero) contém p61 (nanômetro)
-p51 (decapentâmero) contém p52 (nanômetro)
120
7.6 - Tabela com a listagem dos peptídeos sintéticos específicos de M.
leprae utilizados para avaliar a produção de IFN-γγ nas culturas de PBMC e
sangue total.
121
7.7 – ARTIGO 1
122
7.8 – ARTIGO 2
123