Universidade Federal de Ouro Preto
Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas
Área de concentração: Bioquímica Estrutural e Fisiológica
Ação do antioxidante tempol na hipertensão em
ratos com resistência à insulina induzida por frutose
e alimentados com dieta rica em sal
Waleska Claudia Dornas Amaral
Ouro Preto
2013
Waleska Claudia Dornas Amaral
Ação do antioxidante tempol na hipertensão em
ratos com resistência à insulina induzida por frutose
e alimentados com dieta rica em sal
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação
do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Ouro Preto, como parte
integrante dos requisitos para a obtenção do titulo
de Doutor em Ciências Biológicas, área de
concentração: Bioquímica Estrutural e Fisiológica.
Orientador Dr. Marcelo Eustáquio Silva
Laboratório de Nutrição Experimental
Ouro Preto
NUPEB-UFOP
2013
A485a
Amaral, Waleska Claudia Dornas.
Ação do antioxidante tempol na hipertensão em ratos com resistência à
insulina induzida por frutose e alimentados com dieta rica em sal [manuscrito] /
Waleska Claudia Dornas Amaral. - 2014.
118f.: il. color.; tabs.; quadro.
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Eustáquio Silva.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Ouro Preto.
Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências
Biológicas.
Área de concentração: Bioquímica Estrutural e Fisiológica.
1. Frutose - Teses. 2. Resistência à insulina - Teses. 3. Reação de oxidaçãoreação - Teses. 4. Hipertensão - Teses. I. Silva, Marcelo Eustáquio. II.
Universidade Federal de Ouro Preto. III. Título.
CDU: 612.349.8
Catalogação: [email protected]
iv
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Nutrição Experimental da Escola de Nutrição da
Universidade Federal de Ouro Preto, com o auxílio financeiro da Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
v
Dedicatória
A todas as pessoas que ajudaram e que se dedicaram para a realização deste trabalho.
vi
Agradecimentos
Ao meu orientador, Prof. Marcelo Eustáquio Silva, pela oportunidade e confiança.
Ao colaborador na pesquisa, Prof. Wanderson Geraldo de Lima.
Ao Prof. Rinaldo Cardoso dos Santos, pela ajuda constante.
Aos colegas do laboratório que foram imprescindíveis em vários momentos da pesquisa.
Ao Laboratório de Bioquímica Metabólica.
Ao Laboratório Piloto de Análises Clínicas da Escola de Farmácia.
À Profa. Andreia Carvalho Alzamora e Prof. Deoclécio Alves Chianca Júnior por gentilmente
disponibilizarem aparelho para medida de pressão arterial durante o estudo.
Ao técnico do Laboratório de Nutrição Experimental, Jair Pastor Mota.
vii
Resumo
Dornas WC. Ação do antioxidante tempol na hipertensão em ratos com resistência à
insulina induzida por frutose e alimentados com dieta rica em sal. [tese]. Ouro Preto:
Universidade Federal de Ouro Preto, 2013.
A frutose é um açúcar altamente lipogênico que tem efeitos metabólicos drásticos no fígado e
está associado a muitos componentes da síndrome metabólica. No entanto, não se sabe se a
hiperinsulinemia desencadeada por frutose dietética, que sensibiliza a pressão sanguínea
para a ingestão de sal, causa ou não hipertensão sustentada e se o estresse oxidativo
contribui para a regulação da pressão arterial em tais condições. Assim, nesse estudo foi
inicialmente avaliado o efeito da dieta com elevado teor de sal em ratos alimentados com
suplementação de frutose na água e, em sequência, foi testado se radical superóxido
contribui para a elevação da pressão sanguínea nesse modelo. Glicemia e trigliceridemia de
jejum foram maiores em ratos alimentados com frutose do que em ratos controle, enquanto
que o fígado também diferiu nesses animais, produzindo esteatose. Ratos alimentados com
frutose sob dieta rica em sal, reduziram sensibilidade à insulina desenvolvendo
hiperinsulinemia, o que levou a aumento dos níveis de sódio sérico. Somado a isso, observouse peroxidação lipídica com diminuição do nível de defesas antioxidantes verificado pela
menor atividade das enzimas superóxido dismutase, catalase e diminuição da razão
glutationa reduzida/oxidada no fígado. Especificamente, tratamento com frutose não causou
uma direta ação hipertensiva, enquanto sobrecarga de sal elevou significativamente pressão
arterial sistólica. A magnitude da hipertensão foi associada ao consumo de sal. Porém, ratos
tratados associadamente com alto teor de frutose e de sal, mesmo consumindo menos sal
que o grupo tratado apenas com sal, apresentaram níveis pressóricos semelhantes de
aumento de pressão, podendo-se atribuir um papel contributivo para a frutose na elevação
da pressão arterial. Por outro lado, administração do antioxidante tempol, um mimético da
superóxido dismutase que é a maior enzima envolvida na remoção do radical superóxido,
preveniu o progressivo aumento da resposta pressórica encontrada para ratos alimentados
com alto teor de frutose e sal relacionado à melhora de desordem metabólica. Dessa forma,
pode-se considerar que o estresse oxidativo contribuiu para as alterações na pressão arterial
sistêmica, indicando a participação do radical livre de oxigênio, superóxido, na manutenção
da pressão sanguínea no modelo desenvolvido.
Palavras-chave: Frutose, resistência à insulina, estresse oxidativo, hipertensão, tempol.
viii
Abstract
Dornas WC. Antioxidant action of tempol on hypertension in rats with insulin resistance
induced by fructose and fed high-salt diet. [thesis]. Ouro Preto: Universidade Federal de
Ouro Preto, 2013.
Fructose is a highly lipogenic sugar that has profound metabolic effects in the liver and is
associated with many of the components of metabolic syndrome. However, it is not known
whether hyperinsulinemia triggered by dietary fructose, which sensitizes the blood pressure
to salt intake, causes sustained hypertension and if oxidative stress contributes to the
regulation of arterial pressure in such conditions. So, the current study initially evaluated the
effect of a high-salt and fructose-enriched diet in rats, and in sequence whether superoxide
radicals contribute to increased blood pressure in this model. Fasting glycemia and
triglyceridemia were higher in fructose-fed rats than in control rats, whereas the liver also
differed in these animals, generating steatosis. Fructose-fed rats with high-salt diet had
reduced insulin sensitivity triggering hyperinsulinemia, which led to increased levels of serum
sodium. In addition, lipid peroxidation and decreased antioxidant defenses as verified by the
lower activity of superoxide dismutase, catalase, and a lower ratio of reduced/oxidized
glutathione in the liver. Specifically, the fructose treatment did not cause a direct
hypertensive action, while salt overload significantly elevated systolic blood pressure. The
magnitude of hypertension was associated with salt intake. Despite consuming less salt, rats
treated with fructose and salt showed a pattern of blood pressure rise similar to those
consuming a high-salt diet, which indicates that fructose contributes to the rise in blood
pressure. Moreover, administration of the antioxidant tempol, a mimetic of superoxide
dismutase, the most commonly involved enzyme in the removal of superoxide radicals,
prevented a progressive increase in the hypertensive response in high-fructose and salt-fed
rats, associated with the improvement of metabolic disorder. Thus, it is possible that
oxidative stress contributed to changes in systemic blood pressure, indicating the
involvement of the oxygen free radical, superoxide, in the maintenance of blood pressure in
the model developed.
Key words: Fructose, insulin resistance, oxidative stress, hypertension, tempol.
ix
Sumário
Introdução ......................................................................................................................................... 1
1-
REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................................... 3
1.1
1.1.1
Hipertensão ............................................................................................................... 5
1.1.2
Síndrome Metabólica ................................................................................................ 5
1.2
3-
FRUTOSE............................................................................................................................. 6
1.2.1
Frutose na alimentação ............................................................................................. 6
1.2.2
Metabolismo da frutose ............................................................................................ 8
1.2.3
Frutose, lipogênese e resistência à insulina ........................................................... 11
1.2.4
Frutose e hiperuricemia .......................................................................................... 15
1.2.5
Frutose e hipertensão.............................................................................................. 18
1.2.6
Frutose e estresse oxidativo.................................................................................... 21
1.3
2-
DOENÇAS CARDIOVASCULARES ........................................................................................ 3
SÓDIO ............................................................................................................................... 24
1.3.1
Sódio na alimentação .............................................................................................. 24
1.3.2
Fisiologia do sódio ................................................................................................... 26
1.3.3
Sódio e homeostase hídrica .................................................................................... 27
1.3.4
Sódio e hipertensão ................................................................................................. 29
1.3.5
Sódio e estresse oxidativo ....................................................................................... 31
OBJETIVOS................................................................................................................................ 34
2.1
OBJETIVO GERAL .............................................................................................................. 34
2.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................................. 34
MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................................................... 35
3.1
ANIMAIS E TRATAMENTOS ............................................................................................. 35
3.1.1
Protocolo A: Avaliação e padronização do modelo experimental......................... 35
3.1.2
Protocolo B: Efeito do antioxidante tempol em animais alimentados com dieta
rica em frutose e sal ................................................................................................................ 36
3.1.3
Dieta ......................................................................................................................... 37
3.1.4
Registro da pressão arterial e da frequência cardíaca por pletismografia ............ 37
3.1.5
Teste oral de tolerância à glicose ............................................................................ 38
3.2
ANÁLISES BIOQUÍMICAS.................................................................................................. 38
3.2.1
Determinação do hematócrito ................................................................................ 38
3.2.2
Contagem diferencial de leucócitos ........................................................................ 39
x
3.2.3
Atividade da paraoxonase-1 ................................................................................... 39
3.2.4
Concentração da insulina e leptina ......................................................................... 39
3.2.5
Determinação de sódio ........................................................................................... 40
3.2.6
Extração da gordura hepática ................................................................................. 40
3.2.7
Oxidação de lipídeos (peroxidação lipídica) pela dosagem das substâncias
reativas ao ácido tiobarbitúrico .............................................................................................. 40
4-
3.2.8
Atividade da superóxido dismutase........................................................................ 41
3.2.9
Atividade da catalase .............................................................................................. 42
3.2.10
Concentração de glutationa .................................................................................... 42
3.3
AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA ..................................................................................... 44
3.4
ANÁLISE ESTATÍSTICA ...................................................................................................... 44
RESULTADOS ............................................................................................................................ 45
4.1
CARACTERIZAÇÃO DO MODELO EXPERIMENTAL ........................................................... 45
4.1.1
Peso corporal, da gordura abdominal e dos órgãos, ingestão alimentar,
indicadores de função hepática e parâmetros metabólicos .................................................. 45
4.1.2
Sódio sérico .............................................................................................................. 47
4.1.3
Células sanguíneas ................................................................................................... 48
4.1.4
Peroxidação lipídica e componentes dos sistemas antioxidantes ......................... 49
4.1.5
Histopatologia hepática .......................................................................................... 52
4.1.6
Pressão arterial sistólica e correlação com consumo de sal .................................. 54
4.2
AÇÃO DO ANTIOXIDANTE TEMPOL ................................................................................. 55
4.2.1
Ganho de peso, de gordura abdominal e ingestão alimentar ............................... 55
4.2.2
Hematócrito, proteínas e glicose plasmática ......................................................... 55
4.2.3
Perfil lipídico, índice aterogênico e atividade da paraoxonase-1 .......................... 56
4.2.4
Peso relativo do fígado e parâmetros de função hepática .................................... 57
4.2.5
Peso relativo dos rins e produtos de degradação metabólica ............................... 57
4.2.6
Resposta pressórica e relação com peroxidação lipídica ....................................... 58
4.2.7
Correlação entre pressão arterial média e parâmetros sanguíneos...................... 60
5-
DISCUSSÃO ............................................................................................................................... 61
6-
CONCLUSÕES ............................................................................................................................ 77
Referências Bibliográficas ............................................................................................................... 78
Anexos............................................................................................................................................ 102
xi
Lista de Abreviaturas, Siglas e Símbolos
A
ADH hormônio antidiurético
AGL ácido graxo livre
ALT alanina aminotransferase
ALP fosfatase alcalina
AMP monofosfato de adenosina
ANG I angiotensina I
ANG II angiotensina II
ANP peptídeo natriurético atrial
ATP trifosfato de adenosina
APO-B apolipoproteína B
AST aspartato aminotransferase
AVE acidente vascular encefálico
B
BH2 diidrobiopterina
BH4 tetrahidrobiopterina
C
C controle
CT controle + tempol
CAT catalase
CIS cisteína
COX cicl ooxigenase
D
DAHL-SS rato Dahl sensível ao sal
DAHL-SR rato Dahl resistente ao sal
DAP doença arterial periférica
DCV doença cardiovascular
DCC doença cardíaca coronária
DIC doença isquêmica do coração
EF
ECA enzima conversora da angiotensina
ERO espécie reativa de oxigênio
F frutose
FS10 frutose e sal 10 semanas
FS20 frutose e sal 20 semanas
FS20T frutose e sal 20 semanas + tempol
G
GFR taxa de filtração glomerular
GLUT5 transportador de frutose
GPx glutationa peroxidase
GSH glutationa reduzida
GSSG glutationa oxidada
H
HAS hipertensão arterial sistêmica
HbA1c hemoglobina glicosilada
HDL lipoproteína de alta densidade
HFCS xarope de milho rico em frutose
H2O2 peróxido de hidrogênio
xii
HOMA modelo de avaliação da homeostase
IJK
L
LDL lipoproteína de baixa densidade
LDN lipogênese de novo
MN
MDA malonildialdeído
mRNA RNA mensageiro
NaCl cloreto de sódio
NADPH nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
NAFLD doença hepática gordurosa não alcoólica
Na+K+-ATPase bomba de sódio potássio
NCEP/ATP III National Cholesterol Education Progran – NCEP Adult Treatment
Panel III
NO óxido nítrico
NOS óxido nítrico sintase
eNOS óxido nítrico sintase endotelial
nNOS óxido nítrico sintase neuronal
O
(O2•−) ânion superóxido
(OH•) radical hidroxil
OMS Organização Mundial de Saúde
(ONOO−) peroxinitrito
oxLDL lipoproteína de baixa densidade oxidada
P
PA pressão arterial
PAD pressão arterial diastólica
PAM pressão arterial média
PAS pressão arterial sistólica
PAT-1 transportador de cloro
PON1 paraoxonase-1
QR
RI resistência à insulina
S
S sal
SHR ratos espontaneamente hipertensos
SM síndrome metabólica
SNC sistema nervoso central
SNS sistema nervoso simpático
SOD superóxido dismutase
SRA sistema renina-angiotensina
SRAA sistema renina-angiotensina aldosterona
T
TBA ácido tiobarbitúrico
TBARS substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
TEMPOL 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametil piperidina-1-oxil
TG triacilglicerol
TOTG teste oral de tolerância à glicose
UV
VLDL lipoproteína de muito baixa intensidade
XWYZ WKY Wistar-Kyoto
xiii
Lista de Ilustrações
Figura 1: Taxas de mortalidade por doenças cardiovasculares e suas diferentes causas no Brasil,
em 2007.............................................................................................................................................. 4
Figura 2: Formas isoméricas da frutose ............................................................................................. 8
Figura 3: Frutose e metabolismo da glicose nas células do fígado .................................................... 9
Figura 4: Efeitos do consumo crônico de frutose. ........................................................................... 11
Figura 5: Mecanismo proposto pelo qual frutose na dieta resulta em hipertensão ....................... 19
Figura 6: Formação de EROs a partir da redução de O2................................................................... 21
Figura 7: Função renal na homeostase de água e sal. ..................................................................... 28
Figura 8: Protocolo A........................................................................................................................ 36
Figura 9: Protocolo B ........................................................................................................................ 36
Figura 10: Teste oral de tolerância à glicose nos grupos experimentais ......................................... 47
Figura 11: Valores séricos de sódio para os grupos experimentais ................................................. 48
Figura 12: Concentrações das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) no coração, no
fígado e no rim dos diferentes grupos experimentais ..................................................................... 49
Figura 13: Atividade da enzima superóxido dismutase no coração, no fígado e no rim dos
diferentes grupos experimentais. .................................................................................................... 50
Figura 14: Atividade da enzima catalase no coração, no fígado e no rim dos diferentes grupos
experimentais................................................................................................................................... 51
Figura 15: Concentração de glutationa total, reduzida, oxidada e relação de glutationa reduzida
para oxidada no fígado dos diferentes grupos experimentais......................................................... 52
Figura 16: Fotomicrografia representativa da coloração hematoxilina e eosina (H&E) de seções
hepáticas de ratos nos diferentes grupos experimentais ................................................................ 53
Figura 17: Correlação de Pearson entre valores de PAS final (mmHg) e consumo de sal (g/dia). .. 54
Figura 18: Comparação das mudanças ao longo dos tratamentos para pressão arterial sistólica
(PAS), pressão arterial diastólica (PAD) e frequência cardíaca (FC) dos diferentes grupos
experimentais................................................................................................................................... 59
Figura 19: Correlação de Pearson entre valores de PAS (mmHg), PAD (mmHg) final e substâncias
reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) (nmoles/mL). ................................................................... 59
Figura 20: Esquema dos efeitos gerais induzidos pelo modelo dietético utilizado e pelo tratamento
com tempol em ratos Fischer........................................................................................................... 76
xiv
Quadros
Quadro 1: Grupos de causas de óbito na população brasileira em 2007 .......................................... 4
Quadro 2: Critérios da NCEP/ATPIII ................................................................................................... 6
Quadro 3: Efeitos de diferentes rotas de administração de frutose em diferentes espécies por
variados períodos ............................................................................................................................. 14
Quadro 4: Quantidades equivalentes entre sódio e sal .................................................................. 25
Tabelas
Tabela 1: Composição das dietas dos grupos experimentais .......................................................... 37
Tabela 2: Características dos grupos experimentais ....................................................................... 46
Tabela 3: Contagem de leucócitos nos grupos experimentais ........................................................ 48
Tabela 4: Registro pressórico dos grupos experimentais ao longo do experimento ...................... 54
Tabela 5: Peso corporal, da gordura abdominal e ingestão alimentar nos grupos experimentais . 55
Tabela 6: Hematócrito, proteínas e glicose plasmática em animais experimentais ....................... 56
Tabela 7: Perfil lipídico, índice aterogênico e atividade da PON1 nos grupos experimentais ........ 56
Tabela 8: Peso relativo do fígado, atividade sérica de transaminases e fosfatase alcalina nos
grupos experimentais....................................................................................................................... 57
Tabela 9: Peso relativo dos rins e produtos de degradação nos grupos experimentais ................. 58
Tabela 10: Correlação entre PAM final (mm/Hg) e parâmetros sanguíneos nos grupos
experimentais................................................................................................................................... 60
xv
Introdução
Introdução
A ocorrência generalizada de doenças crônicas como obesidade, diabetes,
hipertensão e dislipidemia, juntas conhecidas como síndrome metabólica (SM),
crescentemente causam morbidade e mortalidade em humanos (LAKKA et al., 2002;
GANG et al., 2004; GIRMAN et al., 2004). Entretanto, frente à complexa interação entre
susceptibilidade genética e fatores ambientais, o papel de cada um dos elementos
envolvidos nessa enfermidade é, muitas vezes, pouco compreendido devido a aspectos
éticos ou inerentes à própria doença e ao modo de investigação limitarem o estudo em
seres humanos. Esse fato levou os pesquisadores a utilizarem modelos animais tornandoos extremamente úteis e vantajosos por fornecerem subsídios para a melhor
compreensão das causas e da progressão da doença, além de testarem potenciais
intervenções terapêuticas. Nesse sentido, uma grande variedade de modelos
experimentais geram dados que são ferramentas importantes para a investigação das
doenças cardiovasculares (DCVs).
Uma mudança no padrão dietético de ratos foi utilizada no presente estudo,
tentando mimetizar a dieta ocidental, uma vez que está bem estabelecido que o alto
consumo de produtos alimentícios industrializados, ricos em açúcar e em sal e que
promovem distúrbios à homeostase, potencializam a incidência de DCV. O aumento no
consumo alimentar de frutose coincide com a crescente prevalência de obesidade e SM
nas duas últimas décadas (JOHNSON et al., 2007) e dados observacionais e experimentais
indicam uma associação entre maior consumo de sal nos dias atuais e elevação da
pressão arterial (PA) (ELLIOTT & BROWN, 2006). Todavia, os mecanismos pelos quais
decorrem todas essas alterações promovidas por diferentes fatores, permanecem
parcialmente desconhecidos, o que evidencia a importância de maiores investigações.
Pesquisa em roedores demonstra que o aumento da ingestão dietética de frutose
estimula a absorção de sal no intestino delgado e nos túbulos renais, resultando em
estado de sobrecarga de sal, ajustando-se, assim, em movimento a uma cascata de
eventos que levam à hipertensão (SOLEIMANI & ALBORZI, 2011). Além disso, o excesso de
ingestão de sódio e alterações na manipulação do mineral, conduzindo à sua retenção,
1
Introdução
são conceitos fisiopatológicos básicos da hipertensão arterial. A insulina apresenta um
efeito antinatriurético, estimulando a reabsorção renal de sódio. Esse efeito é claramente
mantido, e, talvez aumentado, em indivíduos com resistência à insulina (RI),
representando também um papel importante no desenvolvimento da hipertensão arterial
(HORITA et al., 2011).
Por outro lado, há evidências de que o tratamento com antioxidantes, como a
vitamina E, melhora a RI em ratos alimentados com frutose (FAURE et al., 1997) e previne
hipertensão (VASDEV et al., 2002). Acredita-se que dano oxidativo causado pela dieta é
devido a defeito no mecanismo de defesa antioxidante e ao aumento da produção de
radicais livres que desempenham um papel fundamental nas alterações cardiovasculares
associadas à RI (DELBOSC et al., 2005). Alto conteúdo de sal na dieta de ratos obesos, por
sua vez, foi associado a estresse oxidativo e à mudanças renais (DOBRIAN et al., 2003)
com possibilidade de que a elevada produção de radical superóxido (O2•−) vascular
origina-se, principalmente, a partir de uma maior atividade de nicotinamida adenina
dinucleotídeo fosfato (NADPH)-oxidase.
Desse modo, o interesse no papel do estresse oxidativo em uma variedade de
doenças chama a atenção para substâncias que impedem a geração de espécies reativas
de oxigênio (EROs). Tempol (4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxil), um membro da
família nitróxido, tem sido estudado extensivamente em modelos animais de estresse
oxidativo aumentado e os seus efeitos, sobre a função endotelial e hipertensão, costuma
mostrar resultados diversos em função dos diferentes modelos usados (BANDAY et al.,
2005; PRETI et al., 2005; DeRICHELIEU et al., 2005; PIRES et al., 2010). A química do
tempol e seus efeitos sobre a regulação da PA foi revisada recentemente (WILCOX &
PEARLMAN, 2008) e, assim, de acordo com todos esses dados, o estudo propõe que, com
a retirada dos O2•−, através do uso de tempol, se avalie a hipótese de que estresse
oxidativo é mediador da resposta hipertensiva em ratos com RI, alimentados com frutose
e sal.
2
Revisão de Literatura
1- REVISÃO DE LITERATURA
1.1 DOENÇAS CARDIOVASCULARES
O termo DCV é de natureza genérica e descreve um conjunto de enfermidades,
muitas vezes, relacionadas entre si. Essas podem incluir a doença cardíaca coronária
(DCC), afetando vasos sanguíneos que irrigam os músculos do coração, doença
cerebrovascular, que afeta os vasos sanguíneos que irrigam o cérebro e doença arterial
periférica (DAP), afetando vasos sanguíneos que irrigam os membros. Outras patologias
também incluem doença cardíaca congênita, malformação da estrutura do coração,
doença reumática do coração com danos ao músculo cardíaco e em válvulas por febre
reumática, além de hipertensão por elevação crônica da PA maior do que 140 mmHg para
pressão sistólica e 90 mmHg para pressão diastólica.
A mortalidade por DCV aumenta progressivamente com a elevação da PA de
forma linear, contínua e independente. De acordo com a Organização Mundial da Saúde
(OMS), dentre as mortes cujas causas foram registradas em 2008, as DCVs foram
responsáveis por aproximadamente 17,3 milhões de mortes (48%), sendo que desses 7,3
milhões foram por doença isquêmica do coração (DIC) e 6,2 milhões por acidente vascular
encefálico (AVE), seguida por doenças como câncer e outras doenças não transmissíveis
(21%), doenças respiratórias (12%) e diabetes mellitus (3%) (WILLIAMS, 2010), ocorrendo
na maioria em países de baixo e médio desenvolvimento econômico e mais da metade
em indivíduos entre 45 e 69 anos.
Para análise das tendências de mortalidade no Brasil, dados do Ministério da
Saúde revelam que no Brasil, em 2007, as DCVs também foram responsáveis pelo maior
número de casos de morte, o qual correspondeu a 29% do total de óbitos ocorridos e
registrados (Figura e Quadro 1). Foram utilizadas, para cálculo das taxas, as informações
de população do IBGE e as projeções disponibilizadas pelo Datasus. A elevação dessa
incidência, principalmente nos países em desenvolvimento, se deve a fatores como o
aumento da expectativa de vida, à diminuição ou controle de doenças infecto-parasitárias
e ao aumento do poder socioeconômico, propiciando mudança no estilo de vida para pior
3
Revisão de Literatura
em relação aos fatores patogênicos da doença (GUS et al., 2002). Aproximadamente 75%
dos casos novos de DCV ocorridos nos países desenvolvidos, nas últimas décadas, poderiam
ser explicados por dieta e atividade física inadequada, níveis lipídicos desfavoráveis,
obesidade, elevação da PA e fumo, ressaltando, assim, a importância do reconhecimento de
tais fatores para uma conduta individual mais adequada (KANNEL & WILSON, 1997).
31,10% 31,00%
25,10%
29
71
12,80%
Doenças
cardiovasculares
AVE
Outras causas
DIC
HAS
Outras
causas
Figura 1: Taxas de mortalidade por doenças cardiovasculares e suas diferentes causas no Brasil,
em 2007. Adaptado de MALTA et al. (2009). AVE (acidente vascular encefálico); DIC (doença isquêmica do coração);
HAS (hipertensão arterial sistêmica).
Quadro 1: Grupos de causas de óbito na população brasileira em 2007
Causas de mortalidade
Doenças do aparelho circulatório
Neoplasias (tumores)
Causas externas de morbidade e mortalidade
Doenças do aparelho respiratório
Sintomas, sinais e achados anormais clínicos e laboratoriais
Doenças endócrinas, nutricionais e metabólicas
Doenças do aparelho digestivo
Doenças infecciosas e parasitárias
Algumas afecções originadas no período perinatal
Doenças do sistema nervoso
Doenças do aparelho geniturinário
Malformação congênita e deformidades
Transtornos mentais e comportamentais
Doenças do sangue dos órgãos hematopoiéticos
Doenças do sistema osteomuscular e tecido conjuntivo
Doenças da pele e do tecido subcutâneo
Gravidez, parto e puerpério
Doenças do ouvido e da apófise mastóide
Doenças do olho e anexos
Total
Masc
158435
83719
107146
55490
48596
26315
33250
27428
16059
9653
9136
5387
7728
2758
1200
1066
0
79
13
593458
%
26,7
14,1
18,1
9,4
8,2
4,4
5,6
4,6
2,7
1,6
1,5
0,9
1,3
0,5
0,2
0,2
0,0
0,0
0,0
100
Fem
144220
71998
20996
47331
36802
32543
18654
19051
12167
9503
8282
4906
2518
2734
2394
1397
1637
65
15
437213
%
33,0
16,5
4,8
10,8
8,4
7,4
4,3
4,4
2,8
2,2
1,9
1,1
0,6
0,6
0,5
0,3
0,4
0,0
0,0
100
Total
302682
155734
128255
102834
85469
58867
51910
46487
28328
19157
17419
10398
10249
5492
3595
2464
1637
144
28
1031149
%
29,4
15,1
12,4
10,0
8,3
5,7
5,0
4,5
2,7
1,9
1,7
1,0
1,0
0,5
0,3
0,2
0,2
0,1
0,0
100
Fonte: SIM/DASIS/SVS/Ministério da Saúde
4
Revisão de Literatura
1.1.1
Hipertensão
Embora hipertensão seja reconhecida como o maior fator de risco para DCV (VASAN,
et al. 2001), os mecanismos pelos quais a HAS contribui para o desenvolvimento da doença
vascular são complexos e ainda pouco entendidos. Um aspecto fundamental da patogênese é
que, habitualmente, existem cofatores aterogênicos interagindo, com efeito multiplicativo ao
da eventual hipertensão arterial como a dislipidemia, a intolerância à glicose e a obesidade.
Contudo, parece claro que a HAS desempenha papel central nesse processo, uma vez que a
aterosclerose significativa, raramente, ocorre em segmentos do sistema circulatório com
baixo regime pressórico, tais como artérias pulmonares ou veias, a despeito da sua exposição
aos mesmos fatores circulantes aterogênicos. Portanto, o mecanismo pelo qual se desenvolve
o processo hipertensivo é de ordem multifatorial e diretamente ligado a alterações
metabólicas crônicas (GRUNDY et al., 2004). Entre hipertensos com SM, observa-se uma alta
prevalência de lesões em órgãos-alvo com impacto prognóstico adverso. Estudos recentes
indicam, dentre as lesões identificadas, elevada prevalência de hipertrofia de ventrículo
esquerdo, disfunção diastólica, aterosclerose de carótida, alterações na distensibilidade
aórtica, retinopatia hipertensiva e microalbuminúria, quando comparados portadores de
hipertensão arterial associada à SM com hipertensos sem outras manisfestações
características da síndrome (MULÈ et al., 2005).
1.1.2
Síndrome Metabólica
Inicialmente descrita por Reaven (1988), a SM foi caracterizada por uma constelação
de fatores de risco cardiovascular, incluindo dislipidemia aterogênica, intolerância à glicose,
hipertensão e obesidade visceral, condições que estão intimamente associadas a RI. Aliás, há
um consenso geral de que a RI/hiperinsulinemia são as características mais importantes da
SM e, na verdade, por vezes a SM é referida como um estado de RI. Isso pode ser devido à
associação da RI com outras manifestações da SM, especialmente com a hipertensão.
Entretanto, embora existam muitas definições para a SM como a National Cholesterol
Education Progran – NCEP Adult Treatment Panel III (NCEP/ATP III); International Diabetes
Federation (IDF), Organização Mundial de Saúde (OMS) e outras, a definição da NCEP/ATP III
é a mais amplamente usada, tanto na prática clínica como em estudos epidemiológicos.
Trata-se de um guia com foco no risco cardiovascular, que não usa como critério obrigatório a
evidência de anormalidades na insulina ou na glicemia. Apesar desse guia considerar a DCV
5
Revisão de Literatura
como desfecho primário da SM, muitos dos portadores dessa síndrome apresentam RI, o que
lhes confere um risco aumentado para o desenvolvimento da diabetes do tipo 2. Os critérios
da NCEP/ATP III encontram-se no quadro 2.
Quadro 2: Critérios da NCEP/ATPIII
Parâmetro
Glicose
Colesterol-HDL
Triacilglicerol
Obesidade
Hipertensão
Número de alterações > 3 de:
> 100 mg/dL ou em tratamento para hiperglicemia
Homens: < 40 mg/dL ou em tratamento para HDL baixo
Mulheres: < 50 mg/dL ou em tratamento para HDL baixo
TG > 150 mg/dL
Cintura > 102 cm para homens ou > 88 cm para mulheres
PA >130 x 85 mmHg ou em tratamento medicamentoso para hipertensão
Lipoproteína de alta densidade (HDL); Triacilglicerol (TG); Pressão Arterial (PA); National Cholesterol Education
Progran – NCEP Adult Treatment Panel III (NCEP/ATPIII/2001).
Vários estudos em animais e humanos sugerem que o consumo excessivo de frutose
pode contribuir para o aumento da prevalência da SM e seus componentes, incluindo a
hipertrigliceridemia, baixa concentração de lipoproteína de alta densidade (HDL), obesidade,
hipertensão arterial, hiperglicemia e hiperuricemia (HWANG et al., 1987; BEZERRA et al.,
2001; NAKAGAWA et al. 2006). Ao lado de modelos genéticos desenvolvidos para a pesquisa,
como rato Zucker obeso (CARLSON et al., 2000), a SM é induzida por vários protocolos
experimentais que incluem administração de sacarose e frutose na dieta. Ratos Wistar e
Sprague-Dawley alimentados com alto teor de frutose por várias semanas apresentam
aspectos característicos da SM, embora os resultados não sejam totalmente conclusivos.
Investigações envolvendo intervenções de longo prazo e nas quais sejam empregadas
quantidades de açúcares normalmente ingeridos são necessárias e podem preencher a lacuna
de informações sobre o tema.
1.2 FRUTOSE
1.2.1 Frutose na alimentação
Nos últimos anos, principalmente em países desenvolvidos, podemos considerar que
a ingestão de sacarose e frutose vem aumentando, acentuadamente, em decorrência do
maior consumo de produtos industrializados (BRAY et al., 2004). Enquanto por muito tempo o
consumo humano de frutose era entre 16 a 20 gramas/dia, em grande parte pelo consumo de
frutas frescas, a ocidentalização da alimentação resultou em aumento significativo na frutose
6
Revisão de Literatura
adicionada à dieta que pode atingir 60 a 100 gramas/dia e até 150 gramas/dia, se somada a
frutose proveniente da sacarose (PARK & YETLEY, 1993; BASCIANO et al., 2005).
Com avanços nas tecnologias de isomerização, de separação e de cristalização na
década de 1960, tornou-se possível a produção de frutose cristalina e de xarope de milho rico
em frutose (HFCS) (HANOVER & WHITE, 1993). Em particular, a introdução de HFCS, na
década de 1970, resultou em um consumo acelerado de adoçantes nos EUA, em parte devido
ao HFCS ser mais facilmente solubilizado em alimentos processados (BRAY et al., 2004).
Assim, a frutose foi incorporada em fórmulas envolvidas no preparo de frutas enlatadas,
geleias, doces em pasta, bolos, pudins, tabletes, pó para bebidas, refrigerantes etc., uma vez
que é 1,5 vezes mais doce do que a sacarose bem como seu custo vem sendo gradualmente
reduzido ao longo dos anos como resultado da melhoria nos processos envolvidos na
obtenção.
No Brasil, embora a ingestão de frutose não esteja bem estabelecida, estima-se um
consumo médio de aproximadamente 4 gramas/dia de frutose livre, originária de frutas,
doces, hortaliças e outros vegetais. Já a quantidade de frutose advinda da sacarose é de
aproximadamente 27,5 gramas/dia. Essa estimativa foi baseada em dados estatísticos de
consumo de produtos alimentares fornecidos pelo Instituto Brasileiro de Geografia e
Estatística, utilizando-se como fonte as pesquisas sobre orçamentos familiares. Estudos
mostraram que a dieta do brasileiro vem sendo modificada com uma tendência para redução
do consumo de leguminosas, hortaliças, frutas e aumento do consumo de açúcares simples e,
consequentemente, de frutose, principalmente proveniente da sacarose (MONTEIRO et al.,
2000).
Analisando os dados da Pesquisa de Orçamentos Familiares 2008-2009, podemos
notar aumento considerável no consumo de refrigerantes (400%), se comparado ao consumo
na década de 70 (IBGE, 2010). A disponibilidade relativa dos macronutrientes evidencia
excesso do teor de açúcar para as famílias das cinco regiões geográficas (variando de 13,9%
das calorias totais na Região Norte a 17,4% na Região Sudeste). O limite máximo de 10% para
a proporção de calorias provenientes de açúcares é amplamente ultrapassado em todas as
regiões e classes de rendimentos. Cabe ressaltar que esse é um aspecto que comprova as
tendências na alteração dos hábitos alimentares, observados atualmente no Brasil e no
mundo, traduzidos pela frequente troca de alimentos naturais, mais saudáveis, por alimentos
industrializados.
7
Revisão de Literatura
1.2.2 Metabolismo da frutose
A frutose é um monossacarídeo (C6H12O6) composto por seis átomos de carbono
unidos em ligações covalentes simples, apresentando grupamentos hidroxila, formados por
hidrogênio e oxigênio e um grupamento carbonila, formado por ligação dupla entre o
carbono e o oxigênio. A posição desse grupamento é que determinará, após a hidrólise do
monossacarídeo, se ele dará origem à cetona ou ao aldeído. A frutose, contendo o
grupamento carbonila no final da cadeia, quando hidrolisada, fornecerá cetona, e será
denominada cetohexose. Em equilíbrio, a frutose pode ser encontrada na forma
frutopiranose (70%) e frutofuranose (30%)(Figura 2).
Figura 2: Formas isoméricas da frutose. PONTIS & FISCHER, 1963.
Absorvida no jejuno e transportada para o interior do enterócito através do
transportador específico GLUT5 (transportador de frutose), a ação da frutose não depende da
estimulação pela insulina. Após a absorção, a frutose atinge a veia porta até o fígado,
transportada pela GLUT2 (MAYES, 1993). No hepatócito, a frutose é rapidamente fosforilada
no carbono 1, em uma reação mediada pela frutoquinase, ou no carbono 6, pela
hexoquinase. A maior parte da frutose é fosforilada no carbono 1, pois a hexoquinase tem
maior afinidade com a glicose (HALLFRISCH, 1990). A frutose-1 fosfato, a qual se acumula
rapidamente no fígado é quebrada em duas trioses, diidroxiacetona e gliceraldeído-fosfato,
8
Revisão de Literatura
em uma reação mediada pela aldolase B. Essas duas trioses poderão seguir três caminhos
distintos, com finalidades diferentes: 1) participar da via glicolítica fornecendo piruvato, o
qual é convertido para ácido láctico sob condições anaeróbicas ou entrar no ciclo do ácido
cítrico como acetil coenzima A sob condições aeróbicas liberando energia; 2) a diidroxicetona
fosfato pode ser reduzida para glicerol-3-fosfato, necessário para a síntese de triacilglicerol
(TG), fosfolipídio e outros lipídios e, finalmente, 3) a diidroxicetona fosfato pode ser
condensadas até formar a frutose-1,6-bifosfato pela aldolase e formar glicose ou glicogênio.
Dessa forma, dará origem ao piruvato, ao lipídio e ao glicogênio (HALLFRISCH, 1990). Na
figura 3, estão apresentadas as vias metabólicas da frutose e da glicose.
Frutose
Glicose
Glicose-6-fosfato
Frutoquinase
Glicoquinase
Glicose
G-6-fosfatase
Frutose-6-fosfato
Frutose e
metabolismo da
glicose nas
Fosfofrutoquinase
Frutose-1-fosfato
Frutose-1-6-bifosfato
células do fígado.
Adaptado de
HAVEL, 2005.fosfato
Gliceraldeido
Dihidroxicetona fosfato
Gliceraldeido-3-fosfato
sfato
Glicerol 3-P
Acil-glicerol
Lactato
Acil-CoA
VLDL
ATP
Citrato
Piruvato
Acetil-CoA
Citrato
CO2 + ATP
Figura 3: Frutose e metabolismo da glicose nas células do fígado. Adaptado de HAVEL, 2005.
O controle do metabolismo da glicose está relacionado a um derivado fosforilado da
frutose. Trata-se da frutose-2,6-bifosfato que está presente em todos os tecidos dos
mamíferos, exceto nos eritrócitos maduros, sendo o mais potente efetor da
fosfofrutoquinase (VAN SCHAFTINGEN, 1988). A frutose-2,6-bifosfato desempenha papel
9
Revisão de Literatura
importante na regulação da glicólise e, também, controla a gliconeogênese. O nível de
frutose-2,6-bifosfato parece afetar a atividade de duas importantes enzimas regulatórias
controlando o catabolismo e o anabolismo do carboidrato no fígado (fosfofrutoquinase e
frutose-1,6-bifosfatase). Altos níveis de trifosfato de adenosina (ATP) e de citrato exercem
inibição da fosfofrutoquinase, o que permite a regulação da reação de acordo com o estado
energético da célula (TORNHEIM & LOWENSTEIN, 1976); portanto, monofosfato de adenosina
(AMP) estimula a frutose-2,6-bifosfatase, a qual, então, forma frutose-6-fosfato, diminuindo o
nível de frutose-2,6-disfosfato. Esse nível diminuído de frutose-2,6-bisfosfato estimula a
frutose-1,6-bifosfatase, o qual favorece a conversão de frutose-1,6-bifosfato para frutose-6fosfato, um intermediário da gliconeogênese. Em contraste, aumento na frutose-2,6-bifosfato
estimula a 6-fosfofrutoquinase, a qual converte frutose-6-fosfato para frutose-1,6-bifosfato,
favorecendo a glicólise. Como o metabolismo da frutose não é afetado pelo passo regulador
da glicólise, fosforilações da frutose podem levar à depleção de ATP e ao aumento na síntese
de TG.
A ingestão de frutose resulta em menores excursões da glicemia pós-prandial em
comparação à glicose (GLINSMANN & BOWMAN, 1993). No entanto, quando quantidades
maiores de frutose são consumidas (por exemplo, em sacarose e HFCS), frutose continua a
entrar na via glicolítica e a produção de TG hepático é facilitada. A frutose pode fornecer
átomos de carbono, tanto para o glicerol quanto para as porções acil de moléculas de
acilglicerol (HALLFRISCH, 1990) e, assim, ao contrário do metabolismo da glicose, no qual a
absorção da glicose é negativamente regulada pela enzima fosfofrutoquinase, concentrações
elevadas de frutose podem servir como uma fonte relativamente desequilibrada de acetilCoA. De fato, os estudos em seres humanos mostraram que a ingestão de frutose resulta em
maiores taxas de lipogênese de novo (LDN) (LÊ et al., 2009). Dessa forma, frutose é mais
lipogênica do que a glicose, um efeito que pode ser exacerbado em doentes com
hiperlipidemia existente (JEPPESEN et al., 1995), ou com RI ou diabetes do tipo 2 (ABRAHA et
al., 1998). Além disso, a frutose não estimula a produção de insulina e leptina, que estão
envolvidas na regulação da homeostase energética. Portanto, a diminuição nas respostas de
insulina e a produção de leptina associadas ao consumo crônico de dietas ricas em frutose
podem ter efeitos nocivos a longo prazo sobre a regulação da ingestão de energia.
10
Revisão de Literatura
1.2.3 Frutose, lipogênese e resistência à insulina
Inicialmente, a frutose atraiu grande interesse como adoçante para pacientes com
diabetes mellitus, devido ao seu baixo índice glicêmico (UUSITUPA, 1994). Todavia, resultados
de vários estudos propõem que o consumo de frutose pode promover especificamente a
deposição de lipídios no tecido adiposo (BRAY et al., 2004; VASANKARI & VASANKARI, 2006;
STANHOPE & HAVEL, 2009), embora não aumente de forma aguda os níveis de glicose ou de
insulina no sangue, em contraste com a glicose. Curiosamente, o perfil de TG plasmáticos são
aumentados após o consumo de frutose com maior taxa de conversão da frutose em lipídios
no fígado e na taxa de secreção e de remoção de TG (BAR-ON & STEIN, 1968). Isso sugere que
a lipogênese pode ser o núcleo das alterações bioquímicas induzidas por frutose, apesar de
evidências emergentes demonstrarem que a estimulação simultânea de vias fisiológicas
alternativas também podem contribuir para os efeitos deletérios da frutose (Figura 4).
Figura 4: Efeitos do consumo crônico de frutose. Distúrbios ocorrem em vários tecidos, incluindo o fígado, o tecido
adiposo, o sistema gastrointestinal e o sistema nervoso central (SNC). GLP-1 (Peptídeo tipo I tipo glucagon); GLUT5 (Transportador de
Frutose, tipo 5).
11
Revisão de Literatura
O aumento na taxa de frutose induzindo LDN gera ácidos graxos, que podem, então,
ser incorporados em TG ou em outras espécies lipídicas, e são associados ao aumento na
síntese de lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL). Esse aumento das VLDL-TG
desempenha importante papel na doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD)
(OUYANG et al., 2008). A administração a longo prazo de frutose para ratos resulta em
macro-e microvesicular esteatose hepática, com aumento de aproximadamente 200% em
TGs hepáticos e 90% na concentração de colesterol hepático (ACKERMAN et al., 2005).
Entretanto, enquanto roedores tratados com frutose pode ser um modelo sustentável para
estudar vários aspectos da NAFLD humana (ANSTEE & GOLDIN, 2006; KAWASAKI et al., 2009;
CASTRO et al., 2011), a acumulação de gordura intra-hepática como consequência da
ingestão de frutose também tem sido menos documentada em humanos.
Assy et al. (2008) verificaram que pacientes que apresentam NAFLD sem fatores de
riscos clássicos consomem mais refrigerantes e sucos adoçados que controles. Os dados
demonstram correlação entre a gravidade da esteatose hepática e a quantidade de consumo
de refrigerantes e, como esperado, os níveis de RI foram maiores em pacientes com NAFLD
(ABDELMALEK et al., 2010). A retenção de lipídios nos hepatócitos é um pré-requisito para o
desenvolvimento da NAFLD. No tecido adiposo a RI acentua a lipólise de TG e inibe a
esterificação de ácidos graxos livres (AGLs), resultando em aumento dos níveis circulantes de
AGL que são captados pelo fígado. Adicionalmente nos hepatócitos, a hiperinsulinemia
aumenta a síntese de novo de ácidos graxos e inibe a sua β-oxidação. A consequência dessas
ações ocasionadas pela insulina é o acúmulo de AGL dentro dos hepatócitos. Além disso, a
síntese hepática de TG é guiada pelo aumento do conteúdo de AGL nos hepatócitos e
favorecida pela suprarregulação, mediada pela insulina. A RI hepática facilita a liberação de
EROs, bloqueia a secreção de TG dos hepatócitos pelo aumento da degradação intracelular de
VLDL e apolipoproteina B-100 (Apo-B100) e bloqueia a exocitose de vesículas contendo VLDL
(ANGULO, 2002; GRATTAGLIANO et al., 2008; PREISS & SATTAR, 2008). Dessa maneira é
possível observar que a entrada e síntese de novo de AGL no fígado ultrapassam sua oxidação
e secreção de TG, resultando em um efeito em cascata de acúmulo hepático de gordura,
podendo explicar o papel chave da RI no desenvolvimento da esteatose hepática.
Embora a frutose não aumente agudamente os níveis de insulina, a sua exposição
crônica parece causar indiretamente hiperinsulinemia. Em ratos alimentados com 66% de
frutose por 3 semanas, o mRNA do receptor de insulina e o números de receptores de
12
Revisão de Literatura
insulina no músculo esquelético foram significativamente diminuídos em comparação aos
ratos alimentados com uma dieta de ração padrão (CATENA et al., 2003). Em outro estudo,
descobriu-se que, após 28 dias de alimentação com frutose, não houve alterações na
concentração do receptor de insulina, mas a autofosforilação, um mecanismo necessário para
a sua ação, foi reduzida para 72% no fígado (UENO et al., 2000). Existem numerosos trabalhos
com roedores em que a frutose na dieta induz hiperlipidemia e é uma forma comum de
reproduzir características da SM (RUTLEDGE & ADELI, 2007). Dessa forma, animal alimentado
com frutose é um modelo experimental útil de RI e uma ferramenta para o estudo de vários
aspectos da SM (Quadro 1) devido mimetizarem diversas respostas fisiológicas humanas.
Ratos alimentados com dieta rica em frutose pode desenvolver hiperinsulinemia,
hipertrigliceridemia, RI e hipertensão. Thorburn et al. (1989) usaram ratos alimentados com
uma dieta contendo 35% de energia como frutose por 4 semanas e encontraram redução da
sensibilidade à insulina associada à prejudicada ação da insulina hepática e disponibilidade de
glicose. Blakely et al. (1981) mostraram aumentos nas concentrações de insulina e glicose de
jejum em ratos que consumiram 15% da energia como frutose por 15 meses, apesar de não
haver diferenças no peso corporal ou na ingestão de comida. Ao contrário de dietas ricas em
gordura, dietas ricas em sacarose causam RI na ausência de aumento da gordura visceral, mas
aumentam o conteúdo de TG no fígado e nos músculos, levando a um aumento de RI em
ratos machos (PAGLIASSOTTI et al., 1996). Em contrapartida, estudos demonstram que
fêmeas não desenvolvem hiperinsulinemia ou hipertensão com alimentação rica em sacarose
e frutose exceto após ovariectomia, sugerindo que os hormônios sexuais femininos podem
conferir uma proteção (HORTON et al., 1997; GALIPEAU et al., 2002). Porém, a ausência do
efeito de hormônios sexuais isoladamente (animais ovariectomizados) não causa mudança
significativa na PA, além de ovariectomia por si só também não afetar parâmetros
metabólicos (GALIPEAU et al., 2002). Apesar de nos animais não existir dúvida de que a
ingestão elevada de frutose causa RI, em humanos a evidência é menos clara. Um ensaio
clínico conduzido em 12 mulheres demonstrou que uma dieta isocalórica com elevados
teores de frutose resultou em redução na glicemia, insulinemia de jejum e leptina associado
ao aumento na concentração sérica de TG quando comparada a uma dieta com teor elevado
de glicose. O balanço controlado pelo sistema nervoso central (SNC) foi influenciado pela
insulina e leptina e, assim, dieta rica em frutose representa um fator de risco potencial para o
ganho de peso corporal (TEFF et al., 2004).
13
Revisão de Literatura
Quadro 3: Efeitos de diferentes rotas de administração de frutose em diferentes espécies por variados períodos
Método de
administração
Espécie
Qde
Tempo de estudo
Camundongo
10%
3 semanas
2 meses
Ratos
30%
4%
10%
20%
20%
10%
10%
8 semanas
14 semanas
8 semanas
5 semanas
10 semanas
2 e 5 semanas
20 semanas
30 dias
6-19 dias
18 semanas
60%
56,8%
60%
60%
60%
60%
65%
65%
66%
66%
60%
60%
15%
20%
8 semanas
6 semanas
10 semanas
30 dias
6 semanas
35 dias
2 semanas
4 semanas
4 semanas
8 semanas
2 semanas
20 a 28 dias
5 semanas
5 semanas
Efeito
Referência
Bebida
Cobaia
Hipertensão, Hiperinsulinemia
Hiperglicemia, Hiperinsulinemia, Hipertensão, Intolerância à glicose
Hipertrigliceridemia
Esteatose
Hipertensão
Hiperglicemia, Hipertrigliceridemia, Intolerância à glicose
Hipertensão, Resistência à insulina
Hipertrigliceridemia, Resistência à insulina, Hipertensão
Resistência à insulina, Hipertrigliceridemia, Hipertensão
Hipertrigliceridemia
Hipertrigliceridemia
Hipertrigliceridemia
Hiperglicemia
DAN et al., 2006
DeANGELIS et al., 2012
KANURI et al., 2011
VASDEV et al., 2002
JALAL et al., 2007
XU et al., 210
SUZUKI et al., 1997
ZHAO et al., 2009
DORNAS et al., 2012
MOTOYAMA et al., 2010
BAR-ON & STEIN, 1968
FÉLÉTOU et al., 2003
Comida
Camundongo
Rato
Hamster
Cachorro
Humanos
Intolerância à glicose, Dislipidemia, Hipertensão
Hipertrigliceridemia, Resistência à insulina
Hiperinsulinemia, Hipertrigliceridemia, Hiperuricemia
Hiperglicemia, Resistência à insulina, Hipertrigliceridemia
Hiperglicemia, Resistência à insulina, Hiperinsulinemia, Hipertrigliceridemia
Intolerância à glicose, Dislipidemia, Resistência à insulina
Hiperglicemia, Dislipidemia, Hipertensão
Hiperinsulinemia, Hipertrigliceridemia
Hiperinsulinemia, Hipertrigliceridemia, Hipertensão
Hiperglicemia, Resistência à insulina, Hiperinsulinemia
Hipertensão, Resistência à insulina, Hiperinsulinemia, Hipertrigliceridemia
Hipertensão, Resistência à insulina, Hiperinsulinemia, Hipertrigliceridemia
Hiperinsulinemia, Hiperglicemia
Hipertrigliceridemia, Hiperuricemia
14
FARAH et al., 2006
FAURE et al., 1997
NAKAGAWA et al., 2006
NANDHINI et al., 2005
LIU et al., 2011
EL MESALLAMY et al., 2010
KIN et al., 2010
BUSSEROLLES et al., 2003b
HWANG et al., 1987
D’ANGELO et al., 2005
TAGHIBIGLOU et al., 2000
MARTINEZ et al., 1994
HALLFRISCH et al., 1983
REISER et al., 1989
Revisão de Literatura
Paralelamente, Shapiro et al. (2008) relataram aumento de leptina em ratos
alimentados com frutose, o que implica que, apesar do aumento nos níveis de leptina há uma
diminuição na capacidade de resposta à leptina ocasionando diminuição da saciedade. Essa
observação mostra o potencial para aumento da ingestão de alimentos com a frutose. Além
disso, a administração central da frutose pode causar aumento de apetite, bem como
alterações significativas na função neuronal. Doses suprafisiológicas de frutose administradas
diretamente no cérebro induzem aumento do consumo alimentar, enquanto que a glicose
provoca diminuição na ingestão de alimentos (MILLER et al., 2002). Isso verificou-se estar
associado com a indução diferencial de malonil-CoA entre os dois açúcares (CHA et al., 2008).
Indivíduos obesos (SCHOLZ et al., 1996) e camundongos obesos induzidos por dieta
(FREDERICH et al., 1995) demonstram resistência à leptina o que contribui para a deposição
de lipídios no fígado (LEE et al., 2002) e no músculo esquelético (STEINBERG et al., 2002).
Como o metabolismo de glicose mediado pela insulina tem demonstrado regular a liberação
de leptina (MUELLER et al., 1998), esse fenômeno pode provavelmente ser atribuído a uma
falta de resposta da insulina com o consumo de frutose. Notavelmente, 4 semanas de frutose
na dieta induz hiperleptinemia em humanos associado a diminuição da sensibilidade à
insulina, esteatose hepática e aumento na circulação de TG (LÊ et al., 2006). Ratos
alimentados com frutose também exibem hiperleptinemia (MOORADIAN et al., 2000;
ROGLANS et al., 2007; SHAPIRO et. al., 2008).
1.2.4 Frutose e hiperuricemia
Estudos prévios intervencionais realizados (FOX & KELLEY, 1972; EMMERSON, 1974;
MACDONALD et al., 1978; REISER et al., 1989) demonstraram que frutose experimentalmente
tem a propriedade de induzir hiperuricemia. Essa relação foi repetidamente revisada e
discutida por vários estudos, entre eles Gao et al. (2007), Choi et al., (2008) e Nguyen et al.,
(2009), que encontraram associação entre maior consumo de bebidas ricas em açúcar e
aumento de ácido úrico sérico. Porém, Turner et al., (1979), Crapo & Kolterman, (1984), Osei
& Bossetti, (1989), Sun et al. (2010) e Wang et al. (2012) não observaram que frutose tem
influencia sobre concentrações séricas de ácido úrico.
Em seres humanos e outros primatas, o ácido úrico é o produto final do metabolismo
das purinas e é excretado como tal, mas outros mamíferos possuem a enzima uricase, que
permite, ainda, oxidação do ácido úrico para a alantoina (substância muito mais solúvel). A
consequência da ausência da enzima uricase em seres humanos é a ocorrência de gota, a qual
está associada à hiperuricemia.
15
Revisão de Literatura
Muitas investigações tanto in vivo quanto in vitro foram realizadas e, embora a
designação precoce do ácido úrico como um antioxidante (AMES et al., 1981) estime que esse
possa ser responsável por aproximadamente 60% da capacidade antioxidante do plasma
(NIETO et al., 2000), o ácido úrico também é reconhecido por apresentar propriedades
prooxidativas (SAUTIN et al., 2007) e pode ter numerosas funções biológicas deletérias. Por
exemplo, o ácido úrico estimula a proliferação das células do músculo liso vascular e a
liberação de substâncias quimiotáticas inflamatórias (RAO et al., 1991), induz quimiotaxia de
monócitos (ZARE et al., 2006), inibe a proliferação e a migração de células endoteliais (KANG
et al., 2005; KHOSLA et al., 2005) e causa estresse oxidativo nos adipócitos, indiretamente,
através da ativação da NADPH-oxidase, diminuindo a concentração de óxido nítrico (NO) total
(SAUTIN et al., 2007). Esse último estudo mostrou que EROs produzida pela NADPH-oxidase
aumenta a peroxidação lipídica evidenciando a associação entre ácido úrico, estresse
oxidativo e inflamação levando à SM. Isso apoia à ideia de que a hiperuricemia pode ser
considerada um fator causal na progressão da SM, como mostrado por Choi & Ford (2007) e
níveis elevados de ácido úrico são observados em uma variedade de estados de doença
metabólicas (MASUO et al., 2003; NAKANISHI et al., 2003; MELLEN et al., 2006).
Em ratos, frutose induz hiperuricemia ocasionando, também, vários aspectos da SM, o
que inclui hipertrigliceridemia, hiperglicemia e hipertensão (NAKAGAWA et al., 2006;
SÁNCHEZ-LOZADA et al., 2007). Além disso, ratos alimentados com frutose, tratados com o
agente alopurinol (inibidor da xantina oxidase) exibem melhora na SM, já que se observa que
o tratamento com drogas redutoras de ácido úrico reduz os níveis plasmáticos de insulina,
melhora sensibilidade à insulina e diminui pressão sanguínea (NAKAGAWA et al., 2006;
SÁNCHEZ-LOZADA et al., 2008).
Adicionalmente, observou-se participação do ácido úrico como um biomarcador de
fígado com gordura (MARCHESINI & BABINI, 2006; SARTORIO et al., 2007). Um estudo
recente da população da China (LI et al., 2009) relatou que a taxa de prevalência da NAFLD foi
significativamente maior em indivíduos com hiperuricemia do que naqueles sem
hiperuricemia (24,75 vs 9,54%, P <0,001) e a prevalência elevou-se progressivamente com
aumento nos níveis séricos de ácido úrico. Além disso, a análise de regressão múltipla
mostrou que a hiperuricemia foi associada a um risco aumentado de NAFLD (LI et al., 2009).
Existe também evidência experimental de que a hiperuricemia crônica pode ser capaz de
causar hipertrigliceridemia e esteatose em ratos. Nesses estudos, a hiperuricemia foi induzida
pela inibição da uricase (WEXLER, 1982) ou ácido oxônico (WEXLER & GREENBERG, 1977) e,
após 4 semanas, os animais desenvolveram concentrações elevadas de TG no soro e
16
Revisão de Literatura
esteatose. Entretanto, o mecanismo através do qual o ácido úrico pode ser capaz de induzir
esteatose ainda é desconhecido.
Considerando que doenças humanas, tais como obesidade, diabetes e DCVs são
complexas e apresentam origens multifatoriais, estudos sugerem que o ácido úrico é um fator
independente de risco para doença renal em humanos (HEINIG & JOHNSON, 2006). A fim de
verificar a hipótese de que a frutose dietética provoca diretamente disfunção renal, ratos
foram alimentados com 60% de frutose e desenvolveram hipertensão, hiperuricemia e
hipertrigliceridemia além de problemas renais, incluindo hipertrofia, hipertensão glomerular
e redução do fluxo glomerular (SÁNCHEZ-LOZADA et al., 2007). Um outro estudo (GERSCH et
al., 2007) mostrou que uma dieta com 60% de frutose acelerou a doença renal em ratos com
insuficiência renal crônica induzida cirurgicamente. Esse efeito pode ser mediado pela
hiperuricemia ou por outros componentes da SM, incluindo inflamação ou hiperinsulinemia.
Concentrações de ácido úrico são elevadas na grande maioria (89%) de adolescentes com
hipertensão (FEIG & JOHNSON, 2003) e um estudo prospectivo relatou que a redução de
concentrações de ácido úrico em pacientes com hiperuricemia e doença renal resulta em
progressão renal significativamente mais lenta e uma redução significativa da pressão arterial
sistólica (PAS) (SIU et al., 2006).
Assim, mais estudos clínicos são necessários e descobertas sugerem que o ácido úrico
pode contribuir para a epidemia da doença cardiorenal. Aproximadamente 25% a 50% dos
indivíduos hipertensos são relatados apresentarem níveis elevados de ácido úrico (CANNON
et al., 1966) e em animais, o efeito da concentração de ácido úrico é ainda mais pronunciado.
Ratos que desenvolvem hiperuricemia desenvolvem hipertensão devido à inibição da síntese
de óxido nítrico sintase (NOS) na mácula densa (MAZZALI et al., 2002). Ocorrem estímulo do
sistema renina intra-renal e inibição da função endotelial ao diminuir biodisponibilidade do
NO, o qual induz vasodilatação que é necessária para a insulina estimular a captação de
glicose nos tecidos. Quando a secreção de NO é prejudicada, a captação de glicose é reduzida
e mais insulina é segregada para compensar (HEINIG & JOHNSON, 2006). Perturbações na
dilatação dependente do NO costumam acompanhar a hiperuricemia e a extensão está
relacionada à magnitude da elevação do ácido úrico. Portanto, disfunção endotelial induzida
por ácido úrico com diminuição da produção de NO pode participar no desenvolvimento da RI
em ratos alimentados com frutose, e, a diminuição das concentrações de ácido úrico melhora
função do endotélio (BUTLER et al., 2000; DOEHNER et al., 2002; FARQUHARSON et al., 2002).
Assim, frutose e ácido úrico são susceptíveis de serem da maior importância no
desenvolvimento do fenótipo da SM.
17
Revisão de Literatura
1.2.5 Frutose e hipertensão
Semelhantemente a RI e à hiperlipidemia, muitos estudos demonstram que dieta com
teor alto de frutose pode induzir hipertensão. Entretanto, embora inúmeras investigações
com ratos alimentados com frutose são relacionadas a hipertensão (HWANG et al 1987;
VASDEV et al., 2002; 2007; ZHAO et al., 2009; KIM et al., 2010), há também outros relatos em
que não é observado aumento de PA nesse modelo (BRANDS et al., 1994; KOTCHEN et al.,
1997; BEZERRA et al., 2001; D’ANGELO et al., 2005). Esse conflito tem sido atribuido a
componentes dietéticos (ex: lipídios ou sódio) (SANTURÉ et al., 2002; NISHIMOTO et al., 2002;
SHAPIRO et al., 2008), diferentes linhagens e idade dos animais (KOTCHEN et al., 1997) ou a
diferentes técnicas usadas para medir PA (BRANDS et al., 1994; D’ANGELO et al., 2005).
Há, portanto, incertezas considerando o mecanismo pelo qual o consumo de frutose
pode produzir elevação da PA, mas numerosas possibilidades são propostas (Figura 5),
incluindo, principalmente, atenuação do baroreflexo e aumento da atividade do SNS
(DeANGELIS, 2012), elevação de catecolaminas circulantes (TRAN et al., 2009), elevação da
atividade do sistema renina-angiotensina (SRA) (KOBAYASHI et al., 1993), reabsorção de sódio
aumentada (BAUM, 1987), maior produção de ácido úrico (NAKAGAWA et al., 2006) e
disfunção endotelial (TAKAGAWA et al., 2002). Somado a isso, existe evidência de que
hiperinsulinemia, isoladamente, pode causar hipertensão, uma vez que administração de
insulina causa aumento da pressão sanguínea em ratos (BRANDS et al., 1991; 1992).
Tem-se observado que há associação entre RI e hipertensão em roedores bem como
em humanos (REAVEN & CHANG, 1991; BRANDS et al., 1991; DeFRONZO, 1992; ABE et al.,
1998) e intervenções que previnam RI também normalizam PA (REAVEN, 1991; VERMA et al.,
1994; LEE et al., 1994; SUZUKI et al., 1997). Comparados a indivíduos com PA normal, pessoas
com hipertensão são relativamente intolerantes à glicose (DeFRONZO, 1992), mas redução da
PA em indivíduos hipertensos não significa necessariamente reduzir o grau de intolerância à
glicose e hiperinsulinemia. Inibidor adrenérgico reduz PA mas não RI, como demonstrado por
Hwang et al. (1987), em ratos alimentados com frutose. Portanto, se frutose induz elevação
na atividade do SNS, então, essa mudança não é a causa da RI, da hiperinsulinemia e da
hipertrigliceridemia. Suzuki et al. (1997) demonstraram que tratamento com pioglitazona em
ratos com RI e hipertensos resultou em redução na glicemia, em normalização dos níveis de
insulina e da concentração de TG e também em redução da PAS, indicando que RI é
responsável pelo desenvolvimento de hipertensão em ratos com dieta rica em frutose.
Cronicamente, insulina ativa o SNS e provoca aumento no tônus vascular periférico
conduzindo a aumento na PA. A consequência é que essa ativação pode contribuir para a RI
18
Revisão de Literatura
fazendo com que vasoconstrição provoque diminuição do fluxo sanguíneo e, portanto, reduza
fornecimento de glicose aos tecidos (RATTIGAN et al., 1999). Sugere-se que, assim, há uma
relação causal entre a RI/hiperinsulinemia e hipertensão no modelo de dieta rica em frutose,
com o SNS potencialmente desempenhando um papel importante tanto no desenvolvimento
da hipertensão como também na RI.
Frutose
↓ Baroreflexo
Estresse oxidativo
Dislipidemia
↑ Ácido úrico
REsis
Resistência à insulina
Hiperinsulinemia
↑ SRA
↑ SNS
↑ Retenção de Na
+
↑ Vasoconstrição
Disfunção endotelial
Hipertensão
Figura 5: Mecanismo proposto pelo qual frutose na dieta resulta em hipertensão. Sistema Nervoso
Simpático (SNS); Sistema Renina Angiotensina (SRA). ABDULLA et al., 2011.
A hipertensão arterial nesse modelo tem sido também associada intimamente à
retenção de sódio. Os primeiros estudos que apresentaram diminuição da excreção urinária
de cloreto de sódio (NaCl), durante infusão aguda de insulina (DeFRONZO et al., 1975; BAUM,
1987), levaram à hipótese de que a hiperinsulinemia poderia contribuir para a hipertensão
arterial na SM. Durante a RI, o efeito vasodilatador da insulina pode estar inibido e, portanto,
torna-se incapaz de compensar a diminuição da reabsorção de sódio no túbulo proximal, com
predisposição à retenção de sódio (STENVINKEL et al., 1995). Administração aguda de insulina
resulta em diminuição da excreção de sódio em animais (BAUM, 1987) e em humanos (ter
MAATEN et al., 1999), com taxa de filtração glomerular (GFR) e fluxo sanguíneo renal
19
Revisão de Literatura
inalterados. De acordo com o conceito de feedback de fluido renal, uma redução primária da
capacidade de excreção renal ocasiona aumento compensatório na pressão sanguínea que
serve para manter o equilíbrio de fluidos. As reduções na capacidade de excreção renal
podem ocorrer devido a várias alterações funcionais ou patológicas intrínsecas ao rim ou a
fatores neuro-humorais que influenciam a excreção renal. Assim, excreção de sódio pode ser
mantida e alteração na GFR ou na reabsorção tubular podem ser mascaradas pela PA elevada.
Entretanto, na hipertensão prolongada, com duração de meses ou anos, são observadas
alterações patológicas nos capilares glomerulares resultando em reduções na taxa de GFR
que necessitam de mais elevações da PA e inibição da reabsorção tubular para manter o
equilíbrio de sódio (HALL et al., 1990).
Catena e colaboradores (2003), por outro lado, demonstraram que o efeito
antinatriurético da hiperinsulinemia pode ser determinado por um mecanismo que depende
do número de receptores de insulina nos tecidos, e essa densidade é inversamente
relacionada com a ingestão de sal na dieta. Assim, o efeito antinatriurético da insulina é
significativamente diminuído pela dieta com elevado teor de sal, mas não em ratos
alimentados com frutose, sugerindo que o mecanismo de feedback que normalmente limita
reabsorção de sódio induzida pela insulina está ausente nesse modelo experimental.
Portanto, a longo prazo, o elevado consumo de sal, juntamente com a alimentação
rica em frutose, resultará em mecanismo prejudicado de controle para o equilíbrio de sódio,
contribuindo para a hipertensão. Singh e colaboradores (2008) demonstraram que frutose
aumenta a absorção de sódio no trato gastrointestinal e no rim, através do aumento da
atividade de GLUT5 (Slc2a5), transportador de frutose, e PAT-1 (Slc26a6), um transportador
de cloro. Ambos são expressos nas membranas apicais do intestino delgado e no túbulo
proximal renal, estabelecendo uma ligação direta entre o aumento no consumo de frutose e
maior absorção de sal no intestino e, assim, diminuindo a sua excreção pelos rins (SINGH et
al., 2008; BARONE et al., 2009). Esse aumento pode contribuir para o desenvolvimento de
hipertensão em ratos alimentados com frutose.
Apesar de muito trabalho estar centrado em frutose induzir RI e doença cardiorrenal,
nem todas as fontes de frutose podem causar o mesmo efeito. Frutas naturais também são
ricas em antioxidantes que podem ter efeitos benéficos (VASDEV et al., 2002). Com efeito,
Forman et al. (2009) relataram que a ingestão de frutose não se correlaciona com pressão
sanguínea elevada na população em que muita ingestão da frutose foi a partir de fruta,
contendo compostos como vitamina C, quercetina, resveratrol, que podem alterar os seus
efeitos metabólicos. Por outro lado, quando o teor de frutose, a partir de frutas naturais, foi
20
Revisão de Literatura
excluída Jalal e colaboradores (2010) encontraram uma forte associação da ingestão de
frutose, advinda de sacarose ou de frutose adicionada a produtos industrializados, com
aumento da PA.
Por fim, estresse oxidativo pode ser considerado um fator patogênico importante no
desenvolvimento da hipertensão (PARAVICINI & TOUYZ, 2006) com dano oxidativo em ratos
alimentados com frutose (BUSSEROLLES et al., 2002a). Estudos apoiam que o aumento da
inativação oxidativa de NO, por um excesso de O2•−, pode ser responsável pela diminuição da
disponibilidade de NO e disfunção endotelial, o que contribui para a elevação da PA.
Consequentemente, aumento da produção de O2•− em tecido vascular, mediado através de
NADPH-oxidase está sendo estudado. Unger & Patil (2009) demonstraram, em ratos
alimentados com frutose, que administração crônica de apocinina, um suposto inibidor da
NADPH-oxidase, previne o desenvolvimento da disfunção endotelial e hipertensão pela
inibição da produção exagerada de O2•−, aumentando a biodisponibilidade de NO.
1.2.6
Frutose e estresse oxidativo
Os radicais livres são definidos como qualquer espécie química capaz de existência
independente de conter um ou mais elétrons desemparelhados, sendo assim altamente
reativos e capazes de atacar qualquer biomolécula (DEL MAESTRO, 1980). Condições que
envolvem o aumento dos níveis de radicais livres podem ser referidas como estresse
oxidativo, o qual ocorre durante os processos de oxidação biológica através da ação de
enzimas da respiração celular acoplada à fosforilação oxidativa para a formação de ATP na
mitocôndria.
Há ainda outras fontes de radicais no organismo que podem ser enzimáticas ou não.
Os principais sistemas enzimáticos que catalisam a redução univalente de O2 (Figura 6) são as
ciclooxigenase (COX), lipoxigenase, xantina oxidase, aldeído oxigenase, flavina desidrogenase
e peroxidase. Já as reações não enzimáticas incluem reações de autoxidação como as que
ocorrem com catecolaminas, flavinas e ferridoxinas, além de reações catalisadas por ferro,
cobre e radiação ionizante (YU, 1994).
O2
e-
O2•-
e-
H2O2
e-
OH•
e-
•H2O + O2
Figura 6: Formação de EROs a partir da redução de O2. Oxigênio (O2) é reduzido a água (H2O) recebendo quatro
elétrons de uma só vez pela citocromo oxidase gerando compostos intermediários altamente reativos.
21
Revisão de Literatura
Na SM, estresse oxidativo está relacionado à hiperglicemia, à hiperinsulinemia, à
hipertrigliceridemia e às defesas antioxidantes inadequadas. Como o estresse oxidativo,
através de EROs é considerado a causa subjacente no desenvolvimento de RI e intolerância à
glicose na diabetes tipo 2 (WRIGHT et al., 2006), não é surpreendente que alimentação rica
em frutose aumente o estresse oxidativo (BUSSEROLLES et al., 2002a) e está associada à SM
em roedores (MILLER & ADELI, 2008). Os efeitos prejudiciais da frutose são aumentados
quando as defesas antioxidantes são diminuídas ou quando há maior produção de radicais
livres (BUSSEROLLES et al., 2003a), enquanto que a suplementação de vitamina E melhora a
sensibilidade à insulina em ratos alimentados com dieta rica em frutose (FAURE et al., 1997).
O2•− é uma EROs relativamente abundante e é dismutada enzimaticamente pela
superóxido dismutase (SOD) para peróxido de hidrogênio (H2O2), o qual pode ser
metabolizado em água e oxigênio pela catalase (CAT) ou pela glutationa peroxidase (GPx)
(FRIDOVICH, 1995). Das suas 3 isoformas, a SOD extracelular é a de maior importância em
nível vascular. A sua produção e secreção ocorre na célula muscular lisa, ligando-se
posteriormente aos glicosaminoglicanos da matriz extracelular, na superfície da célula
endotelial, desempenhando, dessa forma, um papel essencial na regulação do estado redox
no interstício vascular (FRIDOVICH, 1995). Nas células vasculares, a glutationa reduzida
desempenha um papel na regulação do estado redox intracelular, provendo equivalentes
redutores a várias vias bioquímicas (TOUYZ, 2003). Entre essas reações, é de se destacar
aquela em que a GPx reduz o H2O2 e os peróxidos lipídicos a água e álcoois lipídicos,
oxidando, para isso, a glutationa reduzida a dissulfido de glutationa (glutationa oxidada). A
CAT
é,
igualmente,
uma
enzima
intracelular
antioxidante,
que
se
encontra
predominantemente nos peroxissomas, mas também, em alguma porcentagem, no
citoplasma das células. Caracteristicamente, é muito ativa quando existem níveis elevados de
estresse oxidativo dentro das células e, quando tal acontece, catalisa o H2O2 em água e
oxigênio molecular, protegendo assim, os elementos intracelulares dos efeitos nocivos do
H2O2 (CAI, 2005). Faure et al. (1999) demonstraram que ratos alimentados com alto conteúdo
de frutose conduz à RI e em estresse oxidativo. Além disso, evidenciaram que tratamento
com metformina, um sensibilizador da insulina, tem um efeito benéfico sobre alguns
componentes do sistema de defesa antioxidante. Assim, vários estudos demonstram que
dieta rica em frutose afeta negativamente equilíbrio entre a produção de radicais livres e de
defesa antioxidante em ratos, o que conduz a aumento da susceptibilidade à peroxidação
lipídica (BUSSEROLLES et al., 2002a, 2002b; 2003b). Com base nessas descobertas, foi
sugerido que a taurina, um aminoácido que contém enxofre, é capaz de diminuir o estresse
22
Revisão de Literatura
oxidativo e melhorar a sensibilidade à insulina em ratos alimentados com frutose (NANDHINI
et al., 2005; EL MESALLAMY et al., 2010). Esse aminoácido é um derivado da cisteína (Cis),
que é um precursor da glutationa reduzida (GSH) e está disponível em tecidos e células. Nos
seres humanos, a deficiência de Cis pode levar ao estresse oxidativo plasmático (JONES et al.,
2011), e, em roedores, insuficiência de aminoácidos de enxofre provoca estresse oxidativo no
plasma e tecido (NKABYO et al., 2006). Desse modo, suplementação de bebidas adoçadas
com frutose pode reduzir a ingestão dietética de aminoácidos de enxofre, sendo possível que
a diminuição desse consumo contribua para o estresse oxidativo observado em ratos
alimentados com frutose.
Degeneração neuronal na RI induzida por produção excessiva de EROs, peroxidação
lipídica, oxidação de proteína bem como diminuição da capacidade antioxidante no cérebro
de ratos alimentados com frutose na água, sugeriu acumulação de H2O2, induzindo
citotoxicidade no cérebro (YIN et al., 2013). O aumento na produção de EROs em ratos
alimentados com dieta rica em frutose pode reduzir biodisponibilidade de NO, o que explica
relaxamento vascular alterado. O excesso de O2•−, produzido na vasculatura de ratos com RI
pode degradar NO e aumentar a geração de outras EROs que são responsáveis pela
peroxidação de lipídios, ocasionando dano vascular dependente do endotélio (SHINOZAKI et
al., 1999; 2003). Então, a consequência mais importante do aumento do estresse oxidativo
sobre a função endotelial vascular é a diminuição da biodisponibilidade resultante da
inativação de NO por O2•− (PACHER et al., 2007). Fisiologicamente, a NOS converte a Larginina em NO ocasionando relaxamento da musculatura lisa do vaso. Essa reação ocorre na
presença de tetrahidrobiopterina (BH4) que se converte à diidrobiopterina (BH2) por meio da
redução de O2 a H2O. Em condições patológicas, como na deficiência de substrato (L-arginina)
ou de cofatores BH4, o O2 não é reduzido completamente a H2O. Tal redução incompleta gera
O2•− e, na RI, pode ser um fator patogênico para a disfunção endotelial através da ação
prejudicada da eNOS e aumento da degradação oxidativa de NO (SHINOZAKI et al., 2003). O
exagero da produção de O2•− estimula o desacoplamento da enzima eNOS o que leva a
contração do vaso. Tem sido também descrito que a geração exagerada de O 2•− pode
aumentar devido à atividade da NADPH-oxidase, o que resulta em oxidação do BH4,
comprometendo sua função como cofator. NADPH-oxidase está associada à maioria da
geração de O2•− favorecendo a produção de EROs (ZALBA et al., 2001). Entretanto, a
produção excessiva de EROs pode também estar ligada a processos patológicos associados à
disfunção endotelial e remodelamento vascular, que são características da hipertensão.
23
Revisão de Literatura
Dietas ricas em frutose, por sua vez, podem alterar o metabolismo celular com
ativação do SRA (SHINOZAKI et al., 2004; ISHIBASHI, 2007). Angiotensina II (Ang II), além do
seu papel fundamental no desenvolvimento da hipertensão, na medida em que provoca a
retenção de sódio (via aldosterona), tem ainda capacidade de promover a inflamação e
estresse oxidativo renal e vascular. Na verdade, evidência crescente sugere que a formação
de EROs e a ativação das cascatas de oxidação-redução, mediadas pela NADPH-oxidase, estão
envolvidas de forma crítica na hipertensão induzida pela Ang II (CERIELLO, 2008).
Ang II atua através do receptor AT1, estimula a NADPH-oxidase, levando,
consequentemente, à acumulação dos radicais livres O2•−, H2O2 e peroxinitrito
(ONOO−)(TOUYZ et al., 2004). O tratamento de ratos alimentados com frutose com
bloqueador de AT1 (losartan) normaliza a atividade da NADPH-oxidase, melhorando função
endotelial e efetivamente prevenindo que Ang II resulte em resposta pressórica contrátil em
ratos com RI (CANNIZZO et al., 2012). Descobriu-se então que a dieta rica em frutose
aumenta estresse oxidativo caracterizado pela superprodução de EROs dependente da
ativação de NADPH-oxidase, porém, esse aumento é diminuído por tempol e losartan,
corroborando o papel da geração de O2•− em RI induzida pela frutose, o que sugere o
envolvimento do SRA no estresse oxidativo.
1.3 SÓDIO
1.3.1
Sódio na alimentação
Os termos sal e sódio são frequentemente utilizados como sinônimos, embora, numa
base de concentração, o sal compreende 40% de sódio e 60% de cloro; 1 g de sódio é
equivalente a 2,55 g de sal; 1 mmol de sódio é equivalente a 23 mg de sódio e 1 g de sal é
equivalente a 17 mmol de sódio. O quadro 4 apresenta uma visão geral das diferentes
unidades. A maior fonte de sódio na dieta é o sal (NaCl) e o seu alto consumo, atualmente, é
utilizado como preditor de DCV. Embora a American Heart Association recomende um
consumo de sódio de <2300 mg por dia (AHA, 2010), pesquisas mostram que a população
mundial consome muito mais do que isso, ingerindo até 13 g de sal por dia, com um consumo
diário médio de 8,7 g (CDC, 2011). Em países ocidentais seu consumo é ainda mais elevado
não só pelo seu uso na preparação como na conservação de alimentos, sendo extremamente
excessivo para as necessidades fisiológicas humanas. O processamento de alimentos, muitas
vezes, envolve a adição de sódio por uma grande variedade de razões relacionadas ao sabor
ou ao processamento. Por exemplo, grão de bico, milho e ervilha que têm, naturalmente,
24
Revisão de Literatura
muito baixo teor de sódio, apresentam 10 a 100 vezes mais sódio pós-processamento (WHO,
2007).
Apesar de existirem poucas pesquisas sobre a mudança de padrões alimentares no
Brasil, o estudo de Barreto & Cyrillo em 2001 mostrou uma diminuição de 35% nos gastos
domésticos com hortaliças e frutas no orçamento familiar. Situação inversa foi encontrada
nos gastos com alimentos industrializados. Essa modificação não parece estar somente
relacionada aos preços do mercado, mas também ao marketing e à própria dinâmica de vida,
os quais exercem importante papel nas decisões de consumo. Uma alimentação mais pobre
em frutas e hortaliças é baseada em alimentos industrializados, mais rica em sal, o que parece
ser preditor de agravos à saúde. Assim, é nesse contexto que a relação sódio/potássio vem
sendo utilizada como marcador da qualidade na alimentação, visto que uma dieta mais
adequada em relação ao sódio e ao potássio pode estar relacionada ao maior consumo de
frutas e hortaliças e ao menor consumo de alimentos industrializados, como os embutidos e
enlatados. Kotchen & Kotchen em 1997 demonstram que essa relação é mais importante do
que a medida de sódio e potássio isoladamente. Outro estudo realizado por Kaufman et al.
(1996), na África, mostrou que essa relação estava associada à PAS e à pressão arterial
diastólica (PAD) e que o aumento da prevalência da hipertensão estava relacionado tanto às
mudanças econômicas quanto às dietéticas.
As iniciativas voltadas à redução no consumo de sódio se destacam entre as ações de
prevenção e de controle das doenças crônicas diretamente associadas à alimentação por uma
relação positiva entre custo e efetividade. Entre as principais estratégias encontram-se a
redução voluntária do conteúdo de sódio de alimentos processados e a realização de
campanhas de mídia para a promoção de hábitos alimentares saudáveis, que, segundo
estimativas da OMS, poderiam evitar 2,5 milhões de mortes e poupar bilhões de dólares aos
sistemas de saúde no mundo (WHO, 2010).
Quadro 4: Quantidades equivalentes entre sódio e sal
Sódio (mg)
1200
2000
2400
4000
Sódio (mmol)
51
87
104
174
Sal (g)
3,0
5,0
6,0
10,0
MOHAN & CAMPBELL, 2009
25
Revisão de Literatura
1.3.2
Fisiologia do sódio
No corpo de um homem pesando 70 kg há aproximadamente 3,5 mol de sódio.
Metade do sódio está dentro dos fluidos corporais (90% extracelular e 10% intracelular) e o
restante está presente no osso. O sódio é um elemento inorgânico e é um dos principais
eletrólitos, responsável pela osmolaridade e volume do fluido extracelular além de fazer
parte de diversas secreções do organismo, como a bile e os sucos pancreáticos. Seu equilíbrio
no corpo está intimamente ligado ao equilíbrio da água. Juntamente com potássio e cloro, o
sódio desempenha um papel na condução dos impulsos nervosos, excitação elétrica de
células musculares (incluindo o músculo cardíaco) e em combinação com o bicarbonato,
regula o pH corpóreo. Excesso ou deficiência pode ser a base de alterações no equilíbrio
ácido-base (ÉVORA et al., 1999).
Sódio e cloro são também vinculados ao transporte de muitas moléculas através das
membranas celulares. Bomba de sódio (também designada bomba de sódio-potássio), Na+K+ATPase, desempenha um papel fundamental no equilíbrio da água, na condução nervosa e no
transporte ativo. Para manter o potencial elétrico da célula, essa enzima precisa de uma baixa
concentração de íons de sódio e de uma elevada concentração de íons de potássio dentro da
célula. Fora das células existe uma alta concentração de sódio e uma baixa de potássio, pois
existe difusão desses componentes através de canais iônicos existentes na membrana celular
(KAPLAN, 2002). Para manter as concentrações ideais dos dois íons, a bomba de sódio libera
sódio para fora da célula e potássio para dentro. Nota-se que esse transporte é realizado
contra os gradientes de concentração desses dois íons, o que ocorre graças à energia liberada
com a clivagem de ATP. Os impulsos dos nervos ao longo de células, o transporte ativo de
nutrientes para os enterócitos e células musculares são todos dependentes da bomba Na +/K+ATPase (KAPLAN, 2002).
Em bom estado de saúde, a absorção de sódio no intestino é > 97%, transportado
para o rim, onde é filtrado e reabsorvido para a corrente sanguínea de forma a manter os
níveis normais no sangue. A quantidade de sódio absorvida é proporcional à quantidade de
sódio ingerida, e, por esse motivo, a excreção urinária (mais de 24 horas) é geralmente aceita
como a estimativa mais confiável de ingestão de sódio (ELLIOTT & BROWN, 2006), já que sua
excreção é realizada essencialmente através da urina (90 a 95%). O restante é eliminado pelas
fezes e pelo suor, sendo a sua excreção não mais que 2% pelas fezes e cerca de 2% pela pele,
durante a transpiração. Comunidades que vivem em climas tropicais mostram excreção mais
diluída para evitar a perda de excesso de sódio (GLEIBERMAN, 2009).
26
Revisão de Literatura
1.3.3
Sódio e homeostase hídrica
Dependendo da disponibilidade de água, o rim adulto saudável é capaz de excretar
muito ou pouco de sódio e de fluido (GUYTON, 1991). O plasma pode ser influenciado por
diversos mecanismos. Forças físicas, tais como pressão de perfusão e pressão coloidosmótica,
mecanismos neurais e comportamentais, como a sede e a fome de sal, a taxa de filtração
renal, bem como mecanismos endócrinos e hormonais, podem afetar a homeostase de Na+.
Assim, hormônios circulantes como a Ang II, a aldosterona, o fator natriurético atrial (ANF), a
atividade do nervo simpático renal têm uma influência importante sobre a relação pressãonatriurese (CAMPESE & KARUBIAN, 1991; McMANUS et al., 1995; CHIOLERO et al., 2001;
ANTUNES-RODRIGUES et al., 2004; DIETZ, 2005; KOPKAN & CERVENKA, 2009).
Embora haja indícios fortes de que o rim é a via final comum no padrão a longo prazo
de alteração da pressão, a anormalidade inicial deste não pode ser intrínseca ao
desenvolvimento da hipertensão. Aumento da pressão sanguínea na aurícula direita do
coração provoca a secreção do ANF, que aumenta a excreção do sódio e, consequentemente,
a perda de água na forma de urina. Isso resulta em redução da pressão sanguínea com o
volume de sangue diminuindo devido à eliminação da água. O mecanismo funciona em
sentido inverso, com uma diminuição no ANF diminuindo a perda de água e aumentando
pressão sanguínea quando diminuição da PA é detectada dentro do átrio direito do coração
(De BOLD, 1985).
Outro mecanismo é o sistema renina angiotensina aldosterona (SRAA) que é um dos
principais componentes de regulação homeostática. O sistema SRAA atua principalmente
através da regulação de reabsorção renal de sódio e responde à diminuição da PA dentro das
arteríolas aferentes do rim. A renina é uma enzima proteolítica liberada a partir de células
especializadas do aparelho justaglomerular, em resposta à diminuição da PA, à atividade do
SNS e as diminuições de NaCl no túbulo distal. Assim, a renina ativa o SRA por clivagem do
angiotensinogênio, produzido pelo fígado, para produzir a angiotensina I (Ang I), que é ainda
convertida em Ang II pela enzima conversora de angiotensina (ECA), principalmente dentro
dos capilares dos pulmões. Em seguida, Ang II contrai os vasos sanguíneos, aumenta a
secreção de hormônio antidiurético (ADH) e aldosterona, além de estimular o hipotálamo,
ativando o reflexo da sede (ANTUNES-RODRIGUES et al., 2004; COOPER et al., 2007; BADER &
GANTEN, 2008).
Reduções significativas na PA também provocam um aumento da secreção do ADH
com aumento da permeabilidade à água nas células dos ductos coletores renais, o que
permite que mais água seja reabsorvida a partir da urina para o sangue. Assim, a liberação de
27
Revisão de Literatura
ADH aumentando a reabsorção de água no interior do rim resultará em pequeno volume de
urina concentrada a ser produzido. Adicionalmente, elevação da PA será causada por
aumento no volume de sangue e diminuição da pressão osmótica do sangue (um efeito de
diluição), com resultante aumento do volume de sangue agindo de forma a restabelecer a PA.
ADH é considerado o regulador mais importante da osmolaridade do sangue
(McMANUS et al., 1995; ANTUNES-RODRIGUES et al., 2004). Um aumento da osmolaridade
do sangue, como maior concentração de sódio, provoca secreção de ADH a partir da pituitária
posterior mediada por osmorreceptores. Isso resulta em ativação da reabsorção de água nos
rins, diluindo, assim, o sangue e restaurando a osmolaridade normal (Figura 7).
Excesso de água
Déficit de água
Barorreceptores
Osmorreceptores
↑Osmolaridade
plasmática
↓Pressão
atrial
↑Pressão
atrial
Sede
↓Osmolaridade
plasmática
↑ ANF
VP
↓ Volume de urina
↑ Volume de urina
Antidiurese
Diurese
1
Excesso de sal
Déficit de sal
Angiotensina II
↑Volume plasmático
2
↓Volume plasmático
↑ ANF
Angiotensina I
Angiotensinogênio
3
↑ excreção de sal
↓ excreção de sal
4
Figura 7: Função renal na homeostase de água e sal. (1) Rim e resposta hipotalâmica para déficit de água; (2)
Rim e resposta hipotalâmica para excesso de água; (3) Rim e resposta adrenal para excesso de sal e (4) Rim e resposta
adrenal para déficit de sal. Adaptado de Despopoulos & Silbergafl, 1986. Fator natriurético atrial (ANF).
28
Revisão de Literatura
A osmolaridade no sangue é, dessa forma, mantida através do controle exato da
concentração de íons extracelulares e, concomitantemente, pelo equilíbrio de fluidos
(McMANUS et al., 1995; ANTUNES-RODRIGUES et al., 2004). Sugere-se também que a
excreção urinária de sódio e a pressão hidrostática intersticial renal estão sob a influência do
NO (KONE & BAYLIS, 1997; MAJID et al., 2001), e qualquer defeito desse sistema pode
resultar na geração de hipertensão (COWLEY et al., 1995; BARTON et al., 2000). Ocorre
diminuição significativa de nitratos no plasma em pacientes hipertensos, embora metabólicos
de NO, medidos no plasma ou urina, são apenas indicadores indiretos da produção de NO e
suas alterações não refletem necessariamente a disfunção endotelial (BRAGULAT et al.,
2001).
1.3.4
Sódio e hipertensão
Existe hoje uma infinidade de estudos sobre comunidades subdesenvolvidas que,
historicamente, têm um consumo muito baixo de sal (<1 g) e, predominantemente,
apresentam PA baixa sem hipertensão relacionada à idade, como visto nos países ocidentais.
Porém, a primeira implicação de que o sal pode ser um fator de aumento da PA foi relatada
com Ambar & Beaujard (1904) evidenciando uma relação positiva entre alto teor de sal na
alimentação e PA elevada. Já Kempner (1948) com o objetivo inicial de demonstrar a
eficiência no controle da hipertensão arterial e das complicações cardiovasculares utilizando
dieta com baixo teor proteico, em 500 pacientes acompanhados durante 4 anos, mudou os
rumos da pesquisa quando os resultados iniciais demonstraram que a simples restrição de sal
na dieta, por si só, era capaz de reduzir a PA.
Estudos clínicos e experimentais demonstram uma correlação positiva entre o sal
ingerido na dieta e valores de PA. Essa afirmativa tem como fundamento vários estudos que
avaliaram indivíduos normotensos, hipertensos, animais de laboratório, bem como pequenas
amostras e grandes populações (MASCIOLI et al., 1991; LAW et al., 1991; ELLIOTT et al., 1996;
VASDEV et al., 2003; KATORI & MAHIMA, 2006; STRAZZULLO et al., 2009). Ensaios clínicos e
em animais, por sua vez, mostram que reduzir a ingestão de sal diminui os níveis de PA em
grupos normotensos e hipertensos e podem prevenir a hipertensão. Uma pesquisa
envolvendo 3.000 indivíduos pré-hipertensos com idade entre 30-54, informou que a
diminuição da ingestão de sal reduz o risco de DCV em até 35% (COOK et al., 2007). Os
resultados confirmaram que os grupos restritos de sódio tinham menos probabilidade de
sofrer DCV e uma redução de risco de morte por qualquer outra causa. Outro estudo de
intervenção de longo prazo, avaliou PA e excreção urinária de sódio de 24 horas após redução
29
Revisão de Literatura
da ingestão de sal (> 50%) em uma população rural em Portugal. Uma diminuição progressiva
da pressão sanguínea foi observada quando comparada com o controle, além de correlações
significativas entre queda da PA e diminuição da relação sódio urinário e creatinina (FORTE et
al., 1989).
Uma das maiores pesquisas sobre consumo de sal (Intersalt) envolveu um estudo
controlado de 52 comunidades em 32 países ao redor do mundo, incluindo dados de mais de
10 mil adultos no total, todos com variáves nos níveis de ingestão de sal (0,5 g > 25 g/dia). A
investigação mostrou uma relação positiva entre a ingestão de sal e PA e uma inversa relação
para consumo de potássio e aumento da PA. Foi também estimado que um aumento de 6 g
por dia de sal, durante 30 anos levaria a uma elevação em 9 mmHg na PA (STAMLER et al.,
1996). Além desse estudo, uma meta-análise das bases Medline, Embase, Cochrane
Hypertension Group Specialised Register, Cochrane Central Register of Controlled Trials e
artigos relevantes envolvendo redução de consumo de sal e sua relação entre queda da PA
em indivíduos normotensos e hipertensos foi realizada por He & Mac Gregor (2000). A análise
constatou que sódio urinário estava significativamente associado à redução da PA. A
diminuição do consumo de sal ocasionou redução de -75 mmol/24h de sódio urinário e essa
queda resultou em mudança na PA (-4,18 mmHg para PAS e -2,06 mmHg para PAD) em 4
semanas. Essa intervenção para consumo menor de sal foi também relacionada a mudanças
na atividade de renina no plasma, concentração de aldosterona e noradrenalina e nenhuma
alteração nos níveis de lipídios. Levando em conta que a maioria dos estudos analisados
envolveu uma média de 2 g/dia de redução da ingestão de sal e as recomendações atuais são
para reduzi-lo por 5-7 g/dia, os autores argumentam que uma intervenção mais controlada e
maior do que 2 g/dia provavelmente ocasionaria maior redução na pressão sanguínea, à
semelhança das respostas dependentes da dose observada em estudos com animais.
Portanto, vários estudos têm sido realizados e, quase todos apoiam o conceito de que
o consumo de sal é um importante fator no aumento da PA da população. Entretanto, a
resposta da PA diante de modificações no consumo de sódio não costuma ser homogênea na
população. Existem indivíduos que apresentam “tendência” maior ou menor para queda ou
elevação da PA frente a reduções ou suplementações de sal, fenômeno explicado como
sensibilidade ao sal. Pacientes classificados como sensíveis ao sal mostram diminuição
significativa da excreção urinária de nitratos no final do período de elevado teor de sal em
contraste a hipertensos resistentes ao sal.
Modelos animais de hipertensão humana, incluindo ratos Dahl sensíveis ao sal (DahlSS), Wistar-Kyoto (WKY) e ratos espontaneamente hipertensos (SHR) respondem à dieta com
30
Revisão de Literatura
baixo e alto teor de sal com alterações da PA semelhante aos humanos sensíveis ao sal
(OGIHARA et al., 2002). Porém, os mecanismos pelos quais os indivíduos normotensos ou
hipertensos variam sua PA em diferentes graus, em resposta à restrição ou sobrecarga salina,
ainda não são completamente conhecidos.
Gordon & Mark (1984) encontraram função anormal dos barorreceptores em ratos
Dahl-SS, mesmo antes dos animais se tornarem hipertensos. Esses autores preconizaram um
mecanismo neurogênico alterado, que seria responsável pela hipertensão arterial nessa cepa
de ratos. Mecanismos renais associados ao desenvolvimento de hipertensão arterial nos
modelos Dahl-SS também foram identificados. Ratos Dahl-SS apresentam defeito na resposta
vasodilatadora renal que normalmente acompanha a sobrecarga salina com diferença na
vasculatura renal em relação à observada nos ratos Dahl resistente ao sal (Dahl-SR) (FINK et
al., 1980). Rins de ratos Dahl-SS não têm capacidade de vasodilatar integralmente
apresentando defeito na resposta vasodilatadora renal, que normalmente acompanha a
sobrecarga salina, e não aumentando com dieta rica em sal. Dahl & Heine (1975) observaram
que o transplante de um rim de rato Dahl-SR para um rato Dahl-SS previne o aparecimento de
hipertensão arterial nesse último, quando submetido à sobrecarga salina, o que de fato
sugere que o rim possa ser o órgão responsável pela sensibilidade ao sal. Em adição, cepas de
ratos Dahl-SS e Dahl-SR têm sido intensamente estudadas por meio de técnicas de biologia
molecular. Rapp et al. (1989) identificaram aumento na expressão do gene da renina nas
cepas de ratos Dahl-SS, sugerindo que essa maior expressividade do gene poderia estar
relacionada ao aumento da PA nesses animais quando expostos a sobrecarga salina.
1.3.5
Sódio e estresse oxidativo
A literatura sugere que estresse oxidativo participa da patogênese da hipertensão
com estudos relacionando modelos de hipertensão sensível ao sal e aumento do estresse
oxidativo (MANNING et al., 2003; TIAN et al., 2007; BANDAY et al., 2007). Dieta rica em sal
leva à geração de EROs e esse aumento do estresse oxidativo sistêmico pode contribuir para
prejudicar função endotelial, diminuindo dilatação endotélio-dependente em ratos
normotensos (LENDA et al., 2000). O2•− pode, então, inativar rapidamente NO, e essa reação
ocorre numa taxa mais rápida do que a interação de O 2•− com a SOD, sugerindo uma
interação preferencial entre O2•− e NO na parede vascular (HARRISON, 1997). Um mecanismo
sugerido, assim, é que dieta rica em sal aumenta produção de O2•− interagindo com NO,
formando ONOO−, o que reduz biodisponibilidade de NO (BRAGULAT et al., 2001) levando ao
31
Revisão de Literatura
comprometimento funcional do órgão. Outra possibilidade para a disfunção endotelial é a
diminuição na atividade da NOS (SATOH et al., 2005).
Assim sendo, em hipertensos com sobrecarga de sal foi observado diminuição nos
níveis plasmáticos e urinários de metabólitos de NO (FUJIWARA et al., 2000) com acumulação
significativa de O2•− no rim alterando regulação normal da função renal, e contribuindo para
o desenvolvimento da sensibilidade ao sal e hipertensão (CHEN et al., 1998). O estresse
oxidativo na hipertensão foi demonstrado pelo aumento da produção de marcadores, como
por exemplo, sobre a peroxidação lipídica com o produto isoprostano e malonildialdeído
(MDA) (SCHNACKENBERG & WILCOX, 1999; BELTOWSKI et al., 2005), e por efeitos de
diminuição da PA pelo uso de formas de células-permeáveis de SOD (LAURSEN et al., 1997) ou
de seus miméticos (SCHNACKENBERG & WILCOX, 1999). O2•− age como um vasoconstritor e
aumenta a reabsorção tubular de sódio (MAKINO et al., 2002) e NO exibe efeitos opostos ao
O2•−, de forma que também está envolvido na regulação da função renal. Além disso, os
efeitos do O2•− podem reduzir a expressão do sistema de defesa antioxidante (CHABRASHVILI
et al., 2003; WELCH et al., 2005) com o aumento da produção de EROs e sua degradação
reduzida podendo levar ao estresse oxidativo com ampla consequências fisiológicas e
fisiopatológicas.
O2•− é produzido em fagócitos ativados pela enzima NADPH-oxidase (BABIOR, 1999)
que também tem sido implicada na sinalização de O2•− na vasculatura (RAJAGOPALAN et al.,
1996), no córtex (CHABRASHVILI et al., 2002) e medula (ZOU et al., 2001) do rim. Ativação de
NADPH-oxidase leva à geração de O2•− induzida por Ang II (RAJAGOPALAN et al., 1996) e está
implicada na patogênese de vários modelos de hipertensão (GRIENDLING et al., 2000;
CHABRASHVILI et al., 2002). Normalmente, durante uma dieta rica em sal, o SRA está
suprimido. Como consequência dos baixos níveis circulantes de Ang II ocorre, nos vasos da
circulação renal, aumento na expressão dos receptores para Ang II (up regulation) e maior
reatividade local à Ang II (OIGMAN, 2000). Ou seja, quantidades pequenas de Ang II são
capazes de promover expressiva vasoconstricção. Na verdade, quando medido diretamente
em ratos com hipertensão sensível ao sal, o angiotensinogênio intrarenal se eleva,
acompanhado por um aumento da expressão do receptor AT1 da Ang II. Kitiyakara et al.
(2003) sugerem que o elevado teor de sal e Ang II regulam a expressão da NADPH-oxidase
uma vez que a essa enzima foi atribuído um papel importante na geração de EROs nos tecidos
vascular e cardíaco. Consequentemente, NADPH-oxidase pode desempenhar um papel crítico
na produção de EROs no rim com disfunção endotelial em animais hipertensos sensíveis ao
sal. Ocorre, dessa maneira, uma regulação positiva da NADPH-oxidase e aumento da
32
Revisão de Literatura
produção de EROs, o que leva a uma disparidade entre os mecanismos oxidativos e
antioxidantes nos tecidos, que estão envolvidos em muitos processos fisiopatológicos no
organismo.
Logo, nesse estudo considerou-se que ratos normotensos tratados com dieta rica em
sal podem ter a produção basal de O2•− aumentada e essa alteração poderia contribuir para o
desenvolvimento do estresse oxidativo, relacionado ao aumento da resistência vascular no
modelo estudado e possível regulação da perfusão tecidual. O consumo de sal, portanto,
induz mudanças na regulação da homeostase do sódio e do volume extracelular
principalmente pelos rins (GUYTON et al., 1972) com o SRA desempenhando um papel-chave
na regulação da função renal, no volume do fluido extracelular e na PA, além de induzir
estresse oxidativo (particularmente formação de O2•−). O desequilíbrio dessas interações está
ligado à fisiopatologia da hipertensão uma vez que a hemodinâmica renal na manutenção de
sódio e no volume de fluido extracelular são reguladas por esses sistemas . À medida que a
ativação de SRA, em particular o aumento de Ang II, pode induzir a geração de O2•−, sugerese, diante dessas questões, que as interações fisiológicas de SRA e O 2•− podem proporcionar
uma regulação coordenada da função renal (KOPKAN & CERVENKA, 2009).
33
Objetivos
2- OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
O presente estudo teve como objetivo avaliar se dieta rica em sal pode induzir
hipertensão em ratos com hiperinsulinemia, desencadeada por frutose dietética, com o
estresse oxidativo contribuindo para a regulação da PA.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Padronizar o modelo de estudo com a dieta empregada para:
 avaliar mudanças corpóreas e anatomopatológicas de órgãos-alvo;
 averiguar padrão de consumo alimentar;
 investigar a existência de aspectos característicos da SM;
 examinar a presença de estresse oxidativo identificando dano celular e/ou alteração
de defesas antioxidantes;
 verificar perfil de células sanguíneas e aspectos histológicos e funcionais hepáticos;
 verificar se a administração de frutose pode estimular aumento na reabsorção de
sódio com a sobrecarga de sal;
 avaliar uma provável interação entre sal e frutose, potencialmente, interferindo na
resposta pressórica.
Examinar a ação do antioxidante tempol no modelo estudado para:
 avaliar desenvolvimento corpóreo;
 averiguar padrão de consumo alimentar;
 identificar dados relativos ao estado nutricional e à função hepática;
 investigar perfil lipídico, índice aterogênico e resposta enzimática da PON;
 determinar se ocorreu variação de produtos finais de degradação metabólica;
 avaliar se O2•− pode estar envolvido na resposta pressórica encontrada;
 observar uma possível relação entre PA, peroxidação lipídica e parâmetros sanguíneos
avaliados.
34
Materiais e Métodos
3- MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 ANIMAIS E TRATAMENTOS
Para realizar esse estudo foram utilizados ratos machos Fischer, em idade adulta,
obtidos do Laboratório de Nutrição Experimental da Escola de Nutrição da Universidade
Federal de Ouro Preto. Todos os procedimentos foram cuidadosamente realizados e
aprovados pelo comitê de ética no uso de animais de laboratório da Universidade Federal de
Ouro Preto (068/2011). Mantidos numa sala com temperatura e umidade controladas, num
ciclo claro-escuro 12:12, os animais foram acondicionados individualmente em gaiolas do tipo
galvanizadas de fundo aramado, com livre acesso à comida e à água. Para o início do
experimento, grupos de 11 a 12 animais foram selecionados de modo que a média de peso
corporal fosse semelhante e, a cada duas semanas, ganho de peso foi regularmente avaliado.
Para calcular o consumo alimentar de cada animal foi medida a quantidade de dieta
oferecida, não consumida e desperdiçada. Já a ingestão hídrica foi verificada através do
volume de água presente no recipiente de fornecimento hídrico, subtraindo desse volume a
quantidade restante vinte e quatro horas depois. Esses dados foram avaliados próximo ao
término do experimento, sendo os valores apresentados referentes à média da mensuração
de 10 dias. Após 20 semanas de tratamento, com jejum por 10 a 12 horas, animais foram
anestesiados com isoflurano e eutanasiados por enxanguinação, através de um corte sobre o
plexo braquial. Para análise coletaram-se sangue, órgãos (fígado, coração e rins) e gordura
abdominal. Gordura e órgãos foram pesados logo após remoção e fígado, coração e rins
foram estocados a -80oC para subsequentes análises.
3.1.1
Protocolo A: Avaliação e padronização do modelo experimental
Os animais foram divididos inicialmente em três grupos: 1) grupo controle (C), que
recebeu dieta padrão e água; 2) grupo com dieta rica em sal (S), que recebeu dieta padrão
modificada com acréscimo de sal (8% NaCl) e água e 3) grupo com dieta rica em frutose (F),
que recebeu dieta padrão e solução de frutose (20%) em vez de água. Após 10 semanas de
tratamento, animais do grupo F foram subdivididos em 2 grupos: um que continuou a receber
suplementação de frutose e outro que associou alto teor de frutose e de sal por mais 10
semanas (FS10), com a mesma concentração de frutose e de sal na dieta já descrita para os
grupos F e S, respectivamente. Estenderam, assim, todos os grupos para 20 semanas de
tratamento (Figura 8).
35
Materiais e Métodos
Grupo controle (C )
Protocolo A
Grupo com dieta rica em sal (S)
Grupo com dieta rica em frutose (F)
Grupo com dieta rica em frutose e sal (FS10)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
11 12
13
14
15
16
17
18
19
20 (semanas)
Dieta
Figura 8: Protocolo A. Ratos foram divididos em grupo controle (C), recebendo dieta padrão e água por 20
semanas; grupo com dieta rica em sal (S), recebendo dieta padrão modificada com 8% de NaCl e água por 20 semanas;
grupo com dieta rica em frutose (F) , recebendo dieta padrão e solução de 20% de frutose como água por 20 semanas e
grupo com dieta rica em frutose e sal (FS10), recebendo dieta padrão modificada com 8% de NaCl e solução de 20% de
frutose como água por 10 semanas após tratamento prévio de dieta padrão e solução de 20% de frutose como água por
10 semanas.
3.1.2
Protocolo B: Efeito do antioxidante tempol em animais alimentados com dieta rica
em frutose e sal
Os animais foram divididos em dois grupos experimentais, um que recebeu dieta
padrão (C) e outro que recebeu dieta padrão modificada com acréscimo de sal (8% NaCl) e
solução de 20% de frutose em vez de água para beber (FS20). Da 13ª até a 20ª semana do
estudo, metade dos animais de cada um desses grupos foi tratado, uma vez ao dia com
veículo (água filtrada), ou com 10 mg/kg/dia de tempol (Sigma) em 2 mL/kg de peso por
gavagem, compondo os grupos (CT) e (FS20T) (Figura 9).
Grupo controle (C )
Protocolo B
Grupo controle + tempol (C T)
Administração de Tempol
Grupo com dieta rica em frutose e sal (FS20)
Administração de Tempol
Grupo com dieta rica em frutose e sal + tempol (FS20T)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
11 12
13
14
15
16
17
18
19
20 (semanas)
Dieta
Figura 9: Protocolo B. Ratos foram divididos em grupo controle (C), recebendo dieta padrão e água por 20 semanas
e da 13ª a 20ª semana foram tratados com gavagem, uma vez ao dia, com água; grupo controle e tempol (CT)
recebendo dieta padrão e água por 20 semanas e da 13ª a 20ª semana foram tratados com gavagem, uma vez ao dia,
com tempol (10 mg/kg de peso); grupo com dieta rica em frutose e sal (FS20), recebendo dieta padrão modificada com
8% de NaCl e solução de 20% de frutose como água por 20 semanas e da 13ª a 20ª semana foram tratados com
gavagem, uma vez ao dia, com água; grupo com dieta rica em frutose sal e tempol (FS20T), recebendo dieta padrão
modificada com 8% de NaCl e solução de 20% de frutose como água por 20 semanas e da 13ª a 20ª semana foram
tratados com gavagem, uma vez ao dia, com tempol (10 mg/kg de peso).
36
Materiais e Métodos
3.1.3
Dieta
No Laboratório de Nutrição Experimental (LABNEX) da Escola de Nutrição da Ufop,
foram elaboradas duas rações, sendo a padrão confeccionada segundo a recomendação de
Reeves e colaboradores (1993), modelo AIN-93M, e a modificada com acréscimo de 8% de
NaCl. A composição das dietas semipurificadas referidas nos protocolos A e B está
apresentada na tabela 1.
Animais de grupos alimentados com acréscimo de sal e de frutose foram tratados com
os respectivos constituintes, isoladamente e em combinação, de modo que distintos aportes
energéticos foram oferecidos para os diferentes grupos estabelecidos ao longo do estudo.
Tabela 1: Composição das dietas dos grupos experimentais
Composição (g/Kg dieta)
Ingredientes
3
3
C
S
F
FS
Amido de milho
622.5
542.5
622.5
542.5
Caseina
140.0
140.0
140.0
140.0
Sacarose
100.0
100.0
100.0
100.0
-
80.0
-
80.0
Celulose
50.0
50.0
50.0
50.0
Óleo de soja
40.0
40.0
40.0
40.0
1
35.0
35.0
35.0
35.0
2
10.0
10.0
10.0
10.0
2.5
2.5
2.5
2.5
3810
3490
3810
Sal
Minerais
Vitaminas
Colina
Energia (Kcal/Kg)
3490
1
(C) dieta controle; (S) dieta rica em sal; (F) dieta rica em frutose; (FS) dieta rica em frutose e sal. Mistura mineral para
AIN-93M; 2Mistura vitamínica para AIN-93M; 3D-Frutose (Synth®Labsynth, São Paulo, Brasil)

3.1.4
Registro da pressão arterial e da frequência cardíaca por pletismografia
Animais foram colocados em contenção em um tubo cilíndrico de acrílico, em que
somente a cauda foi mantida exteriorizada, próxima a uma lâmpada aquecida para promover
dilatação da artéria e facilitar a medida da PA. A aferição só foi registrada após um período de
adaptação dos animais ao sistema de medida, com valores pressóricos registrados no início,
na fase intermediária e no final do estudo. Um manguito de borracha foi adaptado à região
proximal da cauda e ligado a um esfingmomanômetro para insuflar e desinsuflar
automaticamente em intervalos fixos de tempo (segundos). Próximo ao manguito foi também
37
Materiais e Métodos
acoplado um transdutor de pulso (sensor) que captava sinais a serem enviados e registrados
em computador. No registro da pressão sanguínea por pletismografia de cauda, ocorrem a
perda e o retorno dos sinais de pulso e de FC durante o processo de insuflação e
desinsuflação do manguito, sendo considerado o valor da PA como o primeiro sinal de pulso
de retorno desse processo. Já para análise da FC foram selecionados intervalos de 10
segundos entre os ciclos de insuflar e de desinsuflar. O sinal era captado por um amplificador
de sinais e conectado a um conversor analógico digital.
3.1.5
Teste oral de tolerância à glicose
Antes do final do experimento, 8 animais de cada grupo foram utilizados para a
investigação da sensibilidade à insulina utilizando um teste oral de tolerância à glicose
(TOTG). Para realização do teste, os animais permaneceram 12 horas em jejum antes de
receberem uma solução de 2,5 g de glicose por kg de peso corporal, via gavagem, e a glicemia
foi determinada nos tempos zero (antes da sobrecarga), 30, 60 e 120 minutos após a
administração, utilizando-se glicosímetro automatizado e fitas para se medir glicemia.
3.2 ANÁLISES BIOQUÍMICAS
Amostras sanguíneas dos animais foram coletadas em tubos de polipropileno com ou
sem 15μL de anticoagulante para obtenção do plasma ou soro, respectivamente. Em seguida,
o sangue foi centrifugado a 10.000 g por 15 minutos e guardados sob refrigeração (-4oC).
Foram realizadas as seguintes dosagens bioquímicas utilizando-se kits comerciais: glicose, TG,
colesterol total, colesterol-HDL, alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase
(AST), fosfatase alcalina (ALP), albumina, proteínas totais, ureia, creatinina e ácido úrico. Os
princípios dos métodos e seus respectivos protocolos estão descritos no anexo 2 desse
trabalho.
3.2.1
Determinação do hematócrito
A determinação do hematócrito foi realizada por meio da técnica de
microhematócrito, segundo Goldenfarb et al. (1971). Tubos capilares foram preenchidos,
vedados em uma das extremidades e levados à centrífuga. Na centrifugação, os eritrócitos
foram compactados na parte inferior do tubo e, para a leitura, foi utilizado como auxílio o
cartão padrão. O resultado foi apresentado em porcentagem de células.
38
Materiais e Métodos
3.2.2
Contagem diferencial de leucócitos
Para contagem diferencial de leucócitos, uma gota de sangue foi usada para preparar
o esfregaço sanguíneo. A lâmina foi corada pelo corante Panotic Fast, o qual usa
componentes da coloração de Romanowsky. Contagem de 100 leucócitos foi realizada e os
resultados foram expressos como subtipos identificados para células polimorfonucleares
(PMN), linfócitos ou monócitos.
3.2.3
Atividade da paraoxonase-1
A atividade enzimática da paraoxonase-1 (PON1) no soro foi determinada de acordo
com Beltowski e colaboradores (2002). A avaliação da atividade paraoxonásica, usando
paraoxon como substrato, teve como base a velocidade de hidrólise desse, com a liberação
do para-nitrofenol por minuto. Inicialmente preparou-se uma solução contendo 9 mL de
tampão glicina/NaOH 50 mM pH10,5, contendo CaCl2 0,9mM e 2 μL de paraoxon. Em um
tubo de polipropileno adicionou-se 780 μL dessa solução e 20 μL de soro. A solução foi
homogeneizada e a absorbância das amostras foi lida no espectrofotômetro em 412 nm,
exatamente a cada minuto, por 3 minutos. O branco (tubo com 780 μL da solução preparada
inicialmente e 20 μL de água) foi utilizado para zerar o aparelho.
Para cálculo da enzima, 1 U da enzima PON1 é equivalente à hidrólise de 1 nmol de
paroxon por minuto (usualmente a atividade dessa enzima é representada por 1 mL de soro).
A atividade paraoxonásica da enzima foi calculada segundo a lei Lamber Beer. A absorbância
utilizada nessa expressão é o delta (absorbância por minuto) obtido das absorbâncias lidas no
1º e 3º minutos, subtraindo a absorbância do terceiro minuto pela absorbância do primeiro
minuto e dividindo por 2, uma vez que são 2 minutos entre as duas absorbâncias.
3.2.4
Concentração da insulina e leptina
A concentração sérica dos hormônios insulina e leptina foi determinada pelo método
de ELISA utilizando-se kits específicos descritos no anexo 2. A leitura foi realizada com auxílio
de leitor de micro-placa. O índice de resistência à ação da insulina foi estimado através do
cálculo do Homeostasis Model Assessment {HOMA-IR= [insulina em jejum (mol/L) x glicose
plasmática em jejum (mmol/L)] / 22,5} de acordo com Matthews et al. (1985).
39
Materiais e Métodos
3.2.5 Determinação de sódio
Sódio sérico foi determinado em fotômetro de chama, devidamente calibrado com
solução padrão contendo 140 mEq/L de sódio, diluído em água destilada na proporção de
1:100. Cada amostra foi diluída igualmente a solução padrão, homogeneizada e aspirada no
fotômetro de chama para a leitura da concentração do sódio e expressa em mmol/L.
3.2.6
Extração da gordura hepática
A gordura hepática foi extraída usando uma mistura de clorofórmio e metanol (2:1,
v/v), conforme descrito por Folch et al. (1957). Inicialmente, 400 mg de fígado foram
homogeneizados com 8 mL da mistura clorofórmio-metanol (2:1v/v) e o homogenato vertido
em tubos de vidro pré-lavados com éter de petróleo. Os tubos foram centrifugados a 1000 g
por 10 minutos. O sobrenadante foi retirado e colocado em outro tubo de vidro previamente
pesado e identificado. Foram acrescentados 2 mL da solução de NaCl 0,73% e nova
centrifugação foi realizada e, em seguida, a fase superior foi desprezada. Posteriormente, a
parede interna do tubo de vidro foi lavada com 3 mL da solução de Folch clorofórmio/metanol/água (3:48:47). A fase superior foi desprezada e os tubos com os
extratos lipídicos foram secos em estufa semiaberta, a 40oC, para evaporação total do
solvente. Após a evaporação, os tubos foram resfriados no dessecador e pesados novamente.
A quantidade de gordura no fígado (mg) foi obtida, subtraindo-se o peso do tubo final (g) do
peso do tubo inicial (g) multiplicado por 1000.
3.2.7
Oxidação de lipídeos (peroxidação lipídica) pela dosagem das substâncias reativas
ao ácido tiobarbitúrico
Determinação da concentração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
(TBARS) é fundamentada na capacidade do ácido tiobarbitúrico (TBA) se ligar a lipídios
oxidados, conforme descrito por Buege & Aust (1978).
Para a realização da dosagem, fragmentos de 100 mg do tecido foram
homogeneizados com 1 mL de tampão fosfato, pH 7,4 e, em seguida, centrifugados por 10
minutos a 10000 g a 4oC. O sobrenadante foi retirado e usado como amostra biológica.
Em um tubo foram adicionados 500 µL de homogeneizado, 250 µL de ácido
tricloroacético (TCA) 28% p/v dissolvido em HCl 0,25N, 250 µL de TBA 1% dissolvido em ácido
acético 1:1 e 125 µL de BHT 5 mM dissolvidos em etanol. Em seguida, o tubo foi levado ao
40
Materiais e Métodos
vórtex e colocado em banho-maria a 95oC por 15 minutos. Após serem resfriados em banho
de gelo, os tubos foram centrifugados por 10 minutos a 10000 g e o sobrenadante retirado foi
lido no espectrofotômetro a 535 nm, zerado com água destilada.
A concentração de TBARS foi determinada utilizando o coeficiente de extinção molar
(ε = 1,56 x 105L x mol-1 x cm-1), segundo a lei de Lambert Beer. Essa concentração foi
representada em nmoles/mL.
3.2.8
Atividade da superóxido dismutase
Atividade da SOD foi medida nos tecidos de acordo com o método de Marklund &
Marklund (1974) que se baseia na capacidade da SOD em inibir a autooxidação do pirogalol.
Os reagentes de trabalho utilizados foram: KH2PO4, Na2HPO4, Pirogalol, MTT {brometo de
(3-[4,5-dimetiltiazol-2H]-2,5-difeniltetrazolio) e DMSO (dimetilsulfóxido)}.
Para a realização da dosagem, fragmentos de 100 mg do tecido foram
homogeneizados com 1 mL de tampão fosfato (50 mM), pH 7,0, e em seguida, centrifugados
por 10 minutos a 12000 g a 4oC. O sobrenadante foi retirado e usado como amostra biológica.
A confecção das dosagens nas amostras usando placa de Elisa seguiu a sequência de adições
de reagentes, conforme o quadro a seguir.
Poço
Branco
Padrão
Amostra
Amostra
Tampão
30 µL
144 µL
129 µL
99 µL
MTT
(1,25 mM)
6 µL
6 µL
6 µL
Pirogalol
(100µM)
15 µL
15 µL
As amostras foram incubadas por 5 minutos em estufa à 37 oC. Logo após, 150 μL de
DMSO foram adicionados às mesmas para parar a reação. As absorbâncias foram lidas no
leitor de Elisa em um comprimento de onda de 570 nm. Considerando que uma unidade de
SOD (U) é responsável pela oxidação de 50% do piragolol, e que a absorbância da amostra
obtida em unidades de SOD, converteu-se a absorbância da amostra obtida em unidades de
SOD. Para cálculo da atividade de SOD, subtrai-se o resultado obtido da amostra pelo valor
encontrado do branco e, a seguir, divide-se esse valor pelo encontrado da subtração do
padrão pelo branco.
41
Materiais e Métodos
3.2.9
Atividade da catalase
A determinação da atividade da enzima CAT é baseada na sua capacidade de
converter H2O2 em água e oxigênio molecular, conforme descrito por Aebi (1984).
Para a preparação da amostra biológica 100 mg do tecido foram homogeneizados
com 1 mL de tampão fosfato 0,1 M, pH 7,2 e, em seguida, centrifugados por 10 minutos a
4oC. O sobrenadante foi retirado e usado como amostra biológica.
Em um tubo de polipropileno, adicionaram-se 50 µL de tampão fosfato pH 7,2; (0,1
mM) e 40 µL de água destilada. Em seguida, adicionaram-se 10 µL da amostra e 900 µL de
H2O2 (10 mM) e homogeneizou-se a solução. O espectrofotômetro foi zerado com H2O2 (5
mM) em 240 nm e determinaram-se as absorbâncias das amostras exatamente a cada
minuto, durante 2 minutos e 30 segundos.
1 U de CAT é equivalente à hidrólise de 1 µmol de H2O2 (ε = 39,4 L.mol-1.cm-1) por
minuto. Usualmente, a atividade dessa enzima é representada em Unidade por mL de
amostra. Calculou-se a atividade da CAT segundo a lei de Lambert Beer. A absorbância
utilizada nessa expressão é o delta obtido da primeira e da última absorbância lida
(absorbância final – absorbância inicial / 2).
3.2.10 Concentração de glutationa
Glutationa total foi determinada enzimaticamente de acordo com Akerboon & Sies
(1981). Esse ensaio utiliza um método cinético fundamentado na redução do 5,5’ ditio-bis-2ácido nitrobenzóico (DTNB). A glutation reduzida (GSH) presente na amostra reage com
DTNB, produzindo 5-tio-2-ácido nitrobenzóico (TNB) e glutationa oxidada (GSSG).
Para preparo dos reagentes de estoque foram usados: solução de ácido sulfosalicílico
(SSA) 5%; tampão fosfato 5x (500 mM), contendo 5 mM EDTA; solução padrão estoque de
glutationa (0,3 mg de glutationa reduzida em 0,1 mL de água destilada); solução de estoque
de DTNB (8 mg de DTNB foram diluídos em 5,33 mL de dimetil sulfosalicílico (DMSO)
resultando em uma solução com 1,5 mg/mL de concentração) e estoque de NADPH (solução
de 40 mg/mL).
A amostra biológica foi preparada com 100 mg do tecido homogeneizado em 1 mL de
ácido de sulfosalicílico 5% (SSA) e, em seguida, centrifugada a 10000 g, por 10 minutos a 4oC.
O sobrenadante foi retirado e usado como amostra biológica.
42
Materiais e Métodos
Os reagentes utilizados foram: solução de enzima diluída (diluir 15,2 μL de glutationa
redutase (100 unidades/mL) em 250 μL de tampão fosfato 1x); solução de NADPH de trabalho
(da solução de estoque de NADPH preparada são retirados 30 μL para 7,5 mL de tampão
fosfato 1x); mistura de trabalho (8 mL de tampão 1x, 228 μL da solução de enzimas diluída e
228 μL de DNPH solução de estoque); solução padrão de glutationa – preparar para a curva
padrão (diluir 10 μL de solução estoque de glutationa padrão com 2 mL de ácido SSA 5%).
Para a confecção da curva padrão e das dosagens nas amostras utilizou-se placa de Elisa
seguindo a sequência de adições de reagentes, conforme mostradas nos quadros a seguir.
CURVA PADRÃO:
Poço
[GSH] µM
Solução de
(µM)
SSA 5% (µL)
GSH
nmoles de GSH em
10 µL de amostra
1
2
3
4
5
50
25
12,5
6,25
3,125
50
25 (tubo 1)
25 (tubo 2)
25 (tubo 3)
25 (tubo 4)
-
25
25
25
25
0,5
0,25
0,125
0,062
0,0312
DOSAGEM:
Poço
Branco
Curva padrão
Amostra
Volume da
amostra
SSA 5%
Mistura de
trabalho
NADPH
(final)
-
10 µL
150 µL
50 µL
10 µL
-
150 µL
50 µL
10 µL
-
150 µL
50 µL
As amostras foram então incubadas, por 5 minutos à temperatura ambiente e, em
seguida, adicionou-se NADPH às mesmas com o cronômetro sendo disparado. As
absorbâncias foram lidas, durante 5 minutos a cada minuto, no leitor de Elisa a 412 nm. As
absorbâncias de diluições seriadas de uma solução padrão de glutationa reduzida foram
determinadas e GSSG, já presente na amostra, foi reduzida a GSH pela presença de GR e
NADPH (chamado de método enzimático), medido após derivação da glutationa total com
acréscimo de 2-vinilpiridina (2-VP). Após análise de regressão linear, foi determinada a
equação da reta [Concentração = a* (delta das absorbâncias) + b]. Essa equação foi utilizada
para determinar a concentração em nmoles de glutationa total em 10 μl de amostra, e esse
43
Materiais e Métodos
valor extrapolado para 1 mL de amostra. Índice de estresse oxidativo foi calculado pela razão
GSH/GSSG.
3.3 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA
Fígado foi removido e um lóbulo foi imediatamente fixado em 10% de formol
tamponado. Após fixação, o material foi desidratado em concentrações crescentes de álcool
(70, 80, 90 e 100%), diafanizados em xilol e embebidos e incluídos em parafina. Os blocos de
parafina foram submetidos à microtomia com obtenção de cortes histológicos de 4
micrômetros de espessura e montados em lâminas de microscopia. Os cortes foram
desparafinizados em duas trocas de xilol, hidratados em concentrações decrescentes de
álcool (100, 90, 80 e 70%) e, então, lavados em água corrente. Em seguida, foram corados
pela técnica histológica de rotina da Hematoxilina & Eosina e levados à estufa a 56% para
secagem e serem montados com lamínula e Entellan.
Análises foram realizadas usando método semi-quantitativo, como previamente
descrito por Brunt et al. (1999). Degenerações foram determinadas de acordo com a
porcentagem de gordura contida em hepatócitos. Grau de vesículas esteatóticas foi dividido
em 10 grades em que foram dados os valores de 0-4 graus de acordo com a presença de
esteatose envolvida no hepatócito da biópsia (0, nenhum; 1, 10%; 2, 10 a 33%; 3, 33 a 66% e
4, >66%). As imagens foram visualizadas pela objetiva de 40x e digitalizadas através de
microcâmera no Laboratório Multiusuários do Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Ouro Preto.
3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram expressos em média ± desvio padrão e com apoio instrumental
do programa de análise estatística GraphPad Prism 5. Para avaliar a normalidade dos dados
utilizou-se o teste de Kolmogorov-Smirnov. A significância de qualquer diferença em
proporções ou medianas foi testada pelo teste de Kruskal-Wallis e em médias pela ANOVA
one way, seguido por teste de Dunns ou Tukey, respectivamente. As correlações entre
diferentes variáveis foram realizadas pelo coeficiente de Pearson. Um p-valor ≤ 0,05 foi
considerado estatisticamente significativo.
44
Resultados
4- RESULTADOS
4.1
4.1.1
CARACTERIZAÇÃO DO MODELO EXPERIMENTAL
Peso corporal, da gordura abdominal e dos órgãos, ingestão alimentar, indicadores
de função hepática e parâmetros metabólicos
Para realização do estudo, inicialmente, os animais foram selecionados de forma que
os diferentes grupos apresentassem o mesmo peso corporal. Os animais foram pesados ao
longo do experimento e não se observou diferença no peso corporal com o uso da frutose na
dieta (451,2 ± 29,5g em C versus 448,2 ± 36,9g em F). Em contraste, tratamento com dieta
rica em sal mostrou menor ganho de peso, apresentando o grupo FS10 menor
desenvolvimento ponderal (-10%) em relação aos animais dos grupos C e F. Da mesma forma
observou-se menor gordura abdominal para animais alimentados com alto conteúdo de sal.
Para os órgãos coração e rim, sal resultou em maior peso relativo desses para S e FS em
relação aos grupos sem sobrecarga de sal ao passo que o peso relativo do fígado foi maior
para os animais em uso de frutose na dieta, comparando-se aos ratos C e S (Tabela 2).
Consumo alimentar foi significativamente diferente entre todos os tratamentos. Em
relação ao grupo C, animais do grupo S, que receberam dieta com menor densidade
energética, obtiveram maior consumo de ração, e, inversamente, suplementação de frutose
conduziu para menor consumo devido seu conteúdo energético prover calorias extras nesses
grupos (F e FS10). Adicionalmente, ingestão de líquido foi aumentada (4,5 vezes) quando
acréscimo de sal foi incorporado à dieta padrão, comparada aos grupos C e F, estimulando a
sede devido ao aumento na osmolaridade plasmática sistêmica. Dessa forma, ingerir mais
frutose, devido ao sal na ração, fez FS10 consumir menos calorias da ração do que outros
grupos, enquanto que o acréscimo de sal ao tratamento com suplementação de frutose,
quando combinados, resultou em maior consumo de frutose para animais FS10. Calculando,
grupo FS10 ingeriu 3,5 vezes mais frutose do que grupo F (Tabela 2).
As determinações bioquímicas da concentração de albumina e atividade das
transaminases AST e ALT, além de ALP, constituem marcadores importantes da função
hepática. Observou-se que os animais do grupo FS10 diminuíram significativamente (-25%) os
níveis séricos de albumina em relação aos grupos C e S. Além disso, dados apresentados
mostraram que atividade de ALP foi aumentada para FS10 em relação aos animais C bem
45
Resultados
como ALT para o grupo F, enquanto AST não apresentou mudança com os tratamentos
(Tabela 2).
Resultados demonstraram que tratamento com frutose produziu hiperglicemia
(animais do grupo F e FS), com grupo FS10 aumentando, significativamente, níveis de insulina
sérica em relação aos grupos C e S. RI, indicada pelo maior valor de HOMA, foi também maior
para o grupo FS10 em relação aos outros grupos. Concentrações de leptina no grupo F foram
maiores do que as dos outros grupos. Ratos FS10 desenvolveram hipertriacilgliceridemia
como mostrado por elevação nos níveis de TG (1,5 vezes maior do que o C) com maior
conteúdo de gordura hepática para os grupos F e FS10, comparadamente aos animais dos
grupos C e S. Concentração de ácido úrico sérico aumentou 25% em ratos do grupo F em
relação ao grupo C (Tabela 2).
Tabela 2: Características dos grupos experimentais
Parâmetros
Peso corporal inicial (g)
Peso corporal final (g)
Gordura abdominal (g)
Peso relativo coração (mg/g)
Peso relativo fígado (mg/g)
Peso relativo rim (mg/g)
Consumo de ração (g/dia)
Ingestão de líquido (ml/dia)
Albumina (g/dL)
AST (U/L)
ALT (U/L)
ALP (U/L)
Glicose plasmática (mmol/L)
Insulina (μmoles/L)
HOMA (índice)
Leptina (ng/mL)
Triacilglicerol (mmol/L)
Gordura hepática (mg/g de fígado)
Ácido úrico (mg/dL)
C
295 ± 21,5
a
451,2 ± 29,5
a
14,3 ± 2,3
b
2,4 ± 0,1
27,8 ± 3,0b
b
5,1 ± 0,2
b
17,9 ± 0,8
c
12,0 ± 2,1
a
2,8 ± 0,2
56,8 ± 17,3
b
16,0 ± 5,4
b
50,7 ± 11,2
b
8,0 ± 0,9
b
20,9 ± 13,1
b
7,6 ± 5,4
b
6,76 ± 2,5
b
1,42 ± 0,3
b
53,3 ± 6,0
b
1,37 ± 0,28
Tratamentos
S
F
295,1 ± 23,1
295,1 ± 22,2
ab
a
428,2 ± 28,2
448,2 ± 36,9
b
a
10,4 ± 1,5
14,2 ± 2,7
a
b
2,5 ± 0,2
2,3 ± 0,1
b
a
27,4 ± 2,6
30,6 ± 2,4
a
b
5,6 ± 0,3
5,2 ± 0,2
a
c
19,9 ± 1,8
15,9 ± 1,1
a
c
54,0 ± 7,4
9,2 ± 1,4
a
ab
2,8 ± 0,3
2,5 ± 0,5
56,8 ± 16,3
58,3 ± 17,3
ab
a
25,2 ± 11,2
28,7 ± 11,6
ab
ab
60,0 ± 11,2
59,6 ± 16,3
b
a
8,7 ± 1,1
11,9 ± 1,8
b
b
27,7 ± 14,2
34,0 ± 19,4
b
b
11,0 ± 7,0
17,4 ± 11,1
b
a
4,50 ± 1,2
10,1 ± 3,3
ab
ab
1,67 ± 0,5
2,07 ± 0,6
b
a
42,5 ± 4,4
73,4 ± 17,3
b
a
1,29 ± 0,25
1,72 ± 0,26
FS10
294,4 ± 28,5
b
412 ± 17,2
b
10,8 ± 2,0
a
2,6 ± 0,1
a
31,0 ± 2,1
a
5,8 ± 0,2
d
12,5 ± 1,6
b
32,7 ± 5,2
b
2,1 ± 0,4
57,1 ± 16,0
ab
24,8 ± 7,2
a
70,7 ± 13,1
a
12,7 ± 1,6
a
45,1 ± 25,8
a
23,2 ± 16,4
b
5,8 ± 2,4
a
2,22 ± 0,6
a
72,6 ± 12,6
ab
1,57 ± 0,37
Valores apresentados como média e desvio padrão foram obtidos dos grupos C (dieta controle e água por 20 semanas); S (dieta rica
em sal e água por 20 semanas); F (dieta controle + solução de frutose 20% em água por 20 semanas) e FS10 (dieta rica em sal e solução
de frutose 20% em água por 10 semanas após tratamento prévio por um período de 10 semanas com F). Diferentes letras dentro da
mesma linha indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey. Aspartato Aminotransferase
(AST); Alanina Aminotransferase (ALT); Fosfatase Alcalina (ALP) e Modelo de avaliação da homeostase (HOMA).
46
Resultados
Sensibilidade à insulina
Para o TOTG realizado para avaliar sensibilidade à insulina, observou-se que a
concentração de glicose basal não foi diferente entre os grupos experimentais (variando de
96,2 ± 14,1 mg/dL para 105,1 ± 10,8 mg/dL). Porém, ao longo do teste, em comparação aos
outros grupos, o grupo F apresentou maior valor de glicemia após 30 minutos do teste,
alcançando 180,1 ± 12,5 mg/dL. Em sequência, aos 120 minutos, grupos tratados com frutose
e sal, isoladamente e em combinação, não foram capazes de retornarem glicemia para
valores semelhantes aos apresentados no tempo zero. Esse dado indica que, tanto o sal
quanto a frutose podem ter respostas atenuadas para utilização da glicose, caracterizando
uma menor ação da insulina do que o grupo controle (Figura 10).
Figura 10: Teste oral de tolerância à glicose nos grupos experimentais. Valores são expressos como
média ± desvio padrão de 8 animais/grupo. C (dieta controle e água por 20 semanas); S (8% dieta enriquecida com sal e
água por 20 semanas); F (dieta controle + solução de frutose 20% em vez de água por 20 semanas) e FS10 (8% dieta
enriquecida com sal e solução de frutose 20% em vez de água por 10 semanas após prévio tratamento por um período
de 10 semanas com F). Diferentes letras indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo
teste de Tukey.
4.1.2
Sódio sérico
A concentração sérica de sódio nos diferentes grupos foi avaliada e notou-se que o
nível de sódio no soro foi significativamente menor no grupo S (127,6 ± 4,5 mmol/L) do que
nos tratamentos para os grupos C, F e FS10, respectivamente (142,9 ± 5,3 mmol/L; 140,8 ±
8,1 mmol/L e 135,8 ± 4,5 mmol/L). Entretanto, embora dieta rica em sal possa levar a uma
47
Resultados
alteração na excreção de sódio para equilíbrio da osmolaridade sanguínea, pôde-se constatar
que a associação de frutose e sal conduziu para mudança desse padrão resultando em
aumento da concentração sérica de sódio em relação ao tratamento com sal isoladamente
(Figura 11).
160
a
a
Sódio serico
(mmol/L)
150
a
140
b
130
120
110
C
S
F
FS10
Figura 11: Valores séricos de sódio para os grupos experimentais. C (dieta controle e água por 20
semanas); S (8% dieta enriquecida com sal e água por 20 semanas); F (dieta controle + solução de frutose 20% em vez
de água por 20 semanas) e FS10 (8% dieta enriquecida com sal e solução de frutose 20% em vez de água por 10
semanas após prévio tratamento por um período de 10 semanas com F). Valores são apresentados em média ± desvio
padrão. Diferentes letras indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey.
4.1.3
Células sanguíneas
Contagem diferencial de leucócitos no sangue dos ratos, sob o tratamento de frutose,
mostrou diminuição significativa no perfil de linfócitos em relação ao grupo controle, mas
manteve-se sem alteração a porcentagem de células PMNs. Em contrapartida, o perfil de
monócitos foi aumentado significativamente em ratos tratados com frutose na dieta, quando
comparados aos animais do grupo C (Tabela 3).
Tabela 3: Contagem de leucócitos nos grupos experimentais
Células PMN (%)
Linfócitos (%)
Monócitos (%)
C
11 (5-15)
42 (19-58)
47 (27-61)
S
13 (0-28)
47 (8-62)
39 (16-80)
F
8 (1-27)
*
14 (4-33)
**
74 (36-85)
FS10
17 (7-23)
***
11 (7-20)
*
72 (60-83)
Dados são apresentados em mediana e, entre parênteses, valores indicam menores e maiores porcentagens de células contadas para
os grupos C (dieta controle e água por 20 semanas); S (8% dieta enriquecida com sal e água por 20 semanas); F (dieta controle +
solução de frutose 20% em vez de água por 20 semanas) e FS10 (8% dieta enriquecida com sal e solução de frutose 20% em vez de
água por 10 semanas após prévio tratamento por um período de 10 semanas com F). *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001 versus C pelo teste
de Kruskall Wallis seguido pelo teste de Dunns. Células Polimorfonucleares (PMN).
48
Resultados
4.1.4
Peroxidação lipídica e componentes dos sistemas antioxidantes
A peroxidação lipídica tecidual, que reflete dano celular, foi avaliada por TBARS para
os órgãos coração, fígado e rim. Os níveis de TBARS no fígado demonstraram, para ratos
tratados com frutose e sal, maior média do que no grupo controle, o qual reflete que os
tratamentos promoveram estresse oxidativo hepático. Como consequência do processo de
lipoperoxidação, mudanças na permeabilidade seletiva das membranas alterando os fluxos
iônico e de outras substâncias resultam na perda da seletividade para entrada e/ou saída de
nutrientes e de substâncias tóxicas à célula com comprometimento dos componentes da
matriz extracelular. Os outros órgãos analisados, coração e rim, se mostraram menos
sensíveis ao estresse oxidativo, podendo esses serem mais protegidos ao ataque das EROs,
uma vez que não foi observada nenhuma mudança com os tratamentos (Figura 12).
Fígado
Coração
15
10
a
a
a
S
F
FS10
b
nmol/mL
nmol/mL
8
10
5
6
4
2
0
0
C
S
F
FS10
C
Rim
nmol/mL
15
10
5
0
C
S
F
FS10
Figura 12: Concentrações das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) no coração, no
fígado e no rim dos diferentes grupos experimentais. C (dieta controle e água por 20 semanas); S (8% dieta
enriquecida com sal e água por 20 semanas); F (dieta controle + solução de frutose 20% em vez de água por 20
semanas) e FS10 (8% dieta enriquecida com sal e solução de frutose 20% em vez de água por 10 semanas após prévio
tratamento por um período de 10 semanas com F). Valores são apresentados em média ± desvio padrão. Diferentes
letras indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey.
49
Resultados
Entre as principais enzimas responsáveis pela defesa antioxidante do organismo
destacam-se a SOD e a CAT, que constituem a primeira defesa endógena de neutralização das
EROs. A atividade da SOD apresentou-se significativamente diminuída no coração dos grupos
tratados com frutose e sal isoladamente em relação ao grupo C, porém, elevada para o grupo
FS10. Já no fígado, foi observada uma diminuição significativa da atividade de SOD apenas
para o grupo FS10, comparadamente aos animais do grupo controle. No rim, foi encontrado
aumento significativo da atividade de SOD para os diferentes tratamentos em relação aos
animais controles (Figura 13). A atividade da CAT no coração e no fígado foi acentuadamente
diminuída para o grupo FS10 em relação aos grupos F e C, respectivamente. No rim não se
observou diferença significativa entre os grupos para atividade de CAT. Os resultados estão
apresentados na figura 14.
Fígado
Coração
1.0
c
a
b
c
0.5
ab
b
C
S
F
FS10
a
a
a
S
F
FS10
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
C
S
F
a
ab
2.5
taxa de inibição (%)
taxa de inibição (%)
1.5
0.0
FS10
Rim
taxa de inibição (%)
2.5
2.0
b
1.5
1.0
0.5
0.0
C
Figura 13: Atividade da enzima superóxido dismutase no coração, no fígado e no rim dos
diferentes grupos experimentais. C (dieta controle e água por 20 semanas); S (8% dieta enriquecida com sal e
água por 20 semanas); F (dieta controle + solução de fruto se 20% em vez de água por 20 semanas) e FS10 (8% dieta
enriquecida com sal e solução de frutose 20% em vez de água por 10 semanas após prévio tratamento por um período
de 10 semanas com F). Valores são apresentados em média ± desvio padrão. Diferentes letras indicam diferença
significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey.
50
Resultados
Fígado
Coração
200
200
a
b
a
150
ab
ab
150
ab
b
U/mL
U/mL
b
100
100
50
50
0
0
C
S
F
C
FS10
S
F
FS10
Rim
50
(U/mL)
40
30
20
10
0
C
S
F
FS10
Figura 14: Atividade da enzima catalase no coração, no fígado e no rim dos diferentes grupos
experimentais. C (dieta controle e água por 20 semanas); S (8% dieta enriquecida com sal e água por 20 semanas); F
(dieta controle + solução de frutose 20% em ve z de água por 20 semanas) e FS10 (8% dieta enriquecida com sal e
solução de frutose 20% em vez de água por 10 semanas após prévio tratamento por um período de 10 semanas com F).
Valores são apresentados em média ± desvio padrão. Diferentes letras indicam diferença significativa em p<0,05 por
ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey.
Como a atividade da GPx é regulada pela peroxidação lipídica, a fim de buscar o
controle e a redução na taxa de lipoperoxidação, ocorre aumento na sua atividade com
velocidade de oxidação de GSH por H2O2, catalisada por GPx. Nesse estudo, avaliou-se o
status da glutationa e observou-se que, comparados ao grupo controle, níveis hepáticos de
glutationa total e GSH foram diminuídos significativamente no grupo FS10, embora nenhuma
mudança significativa tenha sido observada nos níveis de GSSG, como mostrado na figura 15.
O índice de estresse oxidativo foi calculado pela razão GSH/GSSG, a qual foi demonstrada ser
menor em ratos FS10 do que nos outros três grupos, razão essa que sugere que EROs foram
geradas em quantidades acima dos valores basais.
51
Resultados
Glutationa total
GSH
2.0
2.0
a
a
1.5
a
b
1.0
nmol/mL
nmol/mL
1.5
0.5
a
a
a
b
1.0
0.5
0.0
0.0
C
S
F
C
FS10
GSSG
S
F
FS10
GSH/GSSG
0.15
20
nmol/mL
a
15
0.10
a
a
10
b
0.05
5
0.00
0
C
S
F
FS10
C
S
F
FS10
Figura 15: Concentração de glutationa total, reduzida, oxidada e relação de glutationa reduzida
para oxidada no fígado dos diferentes grupos experimentais. C (dieta controle e água por 20 semanas); S
(8% dieta enriquecida com sal e água por 20 semanas); F (dieta controle + solução de frutose 20% em vez de água por
20 semanas) e FS10 (8% dieta enriquecida com sal e solução de frutose em vez de água por 10 semanas após prévio
tratamento por um período de 10 semanas com F). Valores são apresentados em média ± desvio padrão. Diferentes
letras indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey. GSH (Glutationa
reduzida); GSSG (Glutationa oxidada).
4.1.5
Histopatologia hepática
Fotomicrografias hepáticas coradas com H&E são mostradas na figura 16 (A, B, C e D)
e os resultados dos escores das variáveis histológicas são apresentados na figura 16 (E).
Ausência ou suave esteatose hepática ocorreram em ratos do grupo controle. Em ratos
tratados apenas com dieta rica em sal, predominantemente, não houve esteatose, mas vasos
hiperêmicos foram observados. Como esperado, frutose ocasionou acumulação de lipídios
em hepatócitos, evidenciados nos grupos F e FS10. Deposição de gordura no grupo F foi
classificada como macrovesicular, enquanto fígado de ratos do grupo FS10 mostrou,
principalmente, vesículas esteatóticas microvesiculares, com menor grau de acumulação do
que em ratos F. Um maior escore para esteatose foi encontrado no fígado de ratos F quando
comparado ao grupo C (p < 0,05).
52
Resultados
*
Figura 16: (A-D) Fotomicrografia representativa da coloração hematoxilina e eosina (H&E) de
seções hepáticas de ratos nos diferentes grupos experimentais. Anormalidades nos hepatócitos não
foram observadas no grupo C (A); Vasos hiperêmicos (cabeça de seta) e parênquima com aparência normal no grupo S
(B); Aspecto de esteatose macrovesicular no grupo F (C). Note hepatócitos com núcleos deslocados para a periferia da
célula (seta branca); Aspecto de esteatose microvesicular no grupo FS10 (D). Note células com vacúolos citoplasmáticos
sem delocamento de núcleo (seta preta) magnificação ×440. Grau de esteatose hepática de ratos nos diferentes grupos
experimentais (E). Valores (n = 8-11). Grupos C (dieta controle e água por 20 semanas); S (8% dieta enriquecida com sal
e água por 20 semanas); F (dieta controle + solução de frutose 20% em vez de água por 20 semanas) e FS10 (8% dieta
enriquecida com sal e solução de frutose 20% em vez de água por 10 semanas após prévio tratamento por um período
de 10 semanas com F). *p<0,05 pelo teste de Kruskall Wallis seguido pelo teste de Dunns.
53
Resultados
4.1.6
Pressão arterial sistólica e correlação com consumo de sal
Os valores médios da PAS ± desvio padrão, apresentados ao longo do tempo do
estudo, demonstraram que dieta rica em sal aumentou significativamente PAS (30mmHg) em
relação ao grupo controle no final do período experimental. Para o tratamento com frutose,
não foi observado modificação pressórica, apesar de leve tendência para aumento de PAS. A
mudança não foi suficientemente sustentada até o final do estudo, não alterando
significativamente os valores pressóricos. Acrescentando sal à dieta do grupo suplementado
com frutose, notou-se aumento da PAS com FS10 mostrando níveis pressóricos no final do
estudo superior ao do grupo C (Tabela 4). Adicionalmente, foi avaliada associação entre
consumo de sal e PAS (r=0,44; p<0,003). Quanto maior o consumo de sal maior PAS foi
observada. Ressalta-se que animais do grupo FS10 consumiram menos sal em relação ao
grupo S (além de menor tempo de tratamento, menor quantidade foi ingerida em g/dia, uma
vez que F na água ocasionou menor consumo de dieta sólida) (Figura 17).
Tabela 4: Registro pressórico dos grupos experimentais ao longo do experimento
Semana
0
9
18
C
b
127,0 ± 6,1
b
124,2 ± 12,6
b
125,8 ± 12,1
Pressão Arterial Sistólica (mmHg)
S
F
ab
ab
136,1 ± 30,7
142,3 ± 19,9
a
ab
155,7 ± 20,9
136,8 ± 17,0
FS10
a
150,3 ± 18,7
Valores apresentados como média e desvio padrão foram obtidos dos grupos C (dieta controle e água por 20 semanas); S (dieta rica
em sal e água por 20 semanas); F (dieta controle + solução de frutose 20% em água por 20 semanas) e FS10 (dieta rica em sal e solução
de frutose 20% em água por 10 semanas após tratamento prévio por um período de 10 semanas com F). Diferentes letras dentro da
mesma linha indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey.
PAS (mmHg)
200
150
100
r = 0.44
p < 0.003
50
0
0
2
4
6
Consumo de sal (g/dia)
Figura 17: Correlação de Pearson entre valores de PAS final (mmHg) e consumo de sal
(g/dia).
54
Resultados
4.2
4.2.1
AÇÃO DO ANTIOXIDANTE TEMPOL
Ganho de peso, de gordura abdominal e ingestão alimentar
Os dados demonstram que a combinação de sal e de frutose na dieta por 20 semanas
não ocasionou alteração no ganho de peso e de gordura abdominal nos animais no protocolo
B. Para os valores médios de ingestão de alimentos, observou-se que o fato da frutose, em
água, fornecer calorias extras para além das fornecidas pela dieta controle, resultou como
previsto em menor consumo de ração para os grupos FS20 e FS20T em relação aos grupos C e
CT. Como constatado no protocolo A, grupos tratados com dieta rica em sal aumentaram a
ingestão de líquido em comparação às dietas dos grupos que consumiram uma quantidade
normal de sal. Portanto, apesar dessa diferença no consumo de alimentos, não houve
diferença no ganho de peso corpóreo final e na gordura abdominal. Além do mais,
tratamento com tempol não ocasionou mudanças corporais e alteração no consumo
alimentar desses animais, independentemente do tipo de dieta (Tabela 5).
Tabela 5: Peso corporal, da gordura abdominal e ingestão alimentar nos grupos
experimentais
Parâmetros
Peso corporal inicial (g)
Peso corporal final (g)
Peso de gordura abdominal (g)
Consumo de ração (g/dia)
Ingestão de líquido (ml/dia)
Tratamentos
CT
FS20
296,4 ± 26,8
297,0 ± 25,1
394,1 ± 24,1
395,8 ± 28,2
12,8 ± 1,3
12,0 ± 2,2
a
b
14,9 ± 0,9
10,2 ± 1,8
b
a
15,2 ± 1,1
40,6 ± 4,7
C
296,7 ± 18,2
386,4 ± 23,3
11,4 ± 2,3
a
14,4 ± 0,9
b
16,2 ± 1,8
FS20T
299,1 ± 27,3
400,9 ± 28,5
11,9 ± 1,8
b
9,8 ± 1,1
a
40,7 ± 6,9
Valores apresentados como média e desvio padrão foram obtidos dos grupos C (dieta controle e água por 20 semanas); C + T (dieta
controle e água + tempol da 13ª a 20ª semana de tratamento); FS20 (dieta rica em sal + solução de frutose 20% em água por 20
semanas) e FS20 + T (dieta rica em sal e solução de frutose 20% em água por 10 semanas + tempol da 13ª a 20ª semana de
tratamento). Diferentes letras dentro da mesma linha indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo
teste de Tukey.
4.2.2
Hematócrito, proteínas e glicose plasmática
Dosagem de hematócrito sugeriu hemoconcentração nos grupos FS20 e FS20T em
relação ao grupo C. Em relação às proteínas totais e à albumina, não se observou variação
entre os diferentes grupos estudados, ao passo que concentração de glicose foi
significativamente aumentada para os animais do grupo FS20, quando comparados aos
grupos C e CT. Entretanto, nenhuma dessas variáveis foi alterada com tempol, embora média
do grupo FS20T reduziu em 12% glicemia, atenuando glicose plasmática do grupo FS20
(Tabela 6).
55
Resultados
Tabela 6: Hematócrito, proteínas e glicose plasmática em animais experimentais
Parâmetros
Hematócrito (%)
Proteína total (g/dL)
Albumina (g/dL)
Glicose (mmol/L)
C
b
26,7 ± 9,3
8,5 ± 1,3
3,3 ± 0,3
bc
7,5 ± 0,8
Tratamentos
CT
FS20
ab
a
31,0 ± 6,5
37,1 ± 8,3
8,3 ± 1,4
9,0 ± 0,8
3,3 ± ,0,2
3,6 ± 0,2
c
a
6,7 ± 0,6
9,9 ± 2,1
FS20T
a
38,5 ± 4,0
9,0 ± 1,1
3,4 ± 0,1
ab
8,8 ± 2,1
Valores apresentados como média e desvio padrão foram obtidos dos grupos C (dieta controle e água por 20 semanas); C + T (dieta
controle e água + tempol da 13ª a 20ª semana de tratamento); FS20 (dieta rica em sal + solução de frutose 20% em água por 20
semanas) e FS20 + T (dieta rica em sal e solução de frutose 20% em água por 10 semanas + tempol da 13ª a 20ª semana de
tratamento). Diferentes letras dentro da mesma linha indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo
teste de Tukey.
4.2.3
Perfil lipídico, índice aterogênico e atividade da paraoxonase-1
Trigliceridemia foi elevada em ratos FS20 comparando-se a animais do grupo C, mas,
tratamento com tempol reduziu esse aumento em 25%. Colesterol total e colesterol-HDL
apresentaram menores concentrações em ratos FS20 do que nos grupos C e CT. Tratamento
com tempol, novamente, restabeleceu os valores embora não igualando a mesma
concentração observada no grupo C. O índice aterogênico do grupo FS20 foi aumentado em
55% quando comparado aos animais do grupo C enquanto que tempol reduziu
acentuadamente esse aumento. Já a atividade sérica da PON1 sobre o substrato paraoxon
apresentou-se 8% menor no grupo FS20 do que o observado no grupo controle, e
interessantemente, tempol aumentou 1,4 vezes a atividade de PON1 dos ratos tratados com
frutose e sal, alcançando níveis maiores do que o mostrado pelos animais controle (Tabela 7).
Tabela 7: Perfil lipídico, índice aterogênico e atividade da PON1 nos grupos experimentais
Parâmetros
Triacilglicerol (mmol/L)
Colesterol total (mmol/L)
Colesterol-HDL (mmol/L)
Índice aterogênico
PON1 paraoxon (U/mL)
C
b
1,8 ± 0,7
b
2,8 ± 0,2
a
2,1 ± 0,2
b
0,3 ± 0,1
b
190,2 ± 19,8
Tratamentos
CT
FS20
b
a
1,8 ± 0,2
3,1 ± 0,8
a
d
3,2 ± 0,1
1,7 ± 0,2
a
c
2,2 ± 0,3
1,1 ± 0,1
ab
a
0,4 ± 0,1
0,5 ± 0,1
ab
b
203,5 ± 52,4
173,9 ± 41,4
FS20T
b
2,3 ± 0,5
c
2,1 ± 0,4
b
1,6 ± 0,3
b
0,3 ± 0,1
a
246,0 ± 49,0
Valores apresentados como média e desvio padrão foram obtidos dos grupos C (dieta controle e água por 20 semanas); C + T (dieta
controle e água + tempol da 13ª a 20ª semana de tratamento); FS20 (dieta rica em sal + solução de frutose 20% em água por 20
semanas) e FS20 + T (dieta rica em sal e solução de frutose 20% em água por 10 semanas + tempol da 13ª a 20ª semana de
tratamento). O índice aterogênico foi calculado: colesterol total – colesterol-HDL/colesterol-HDL. Diferentes letras dentro da mesma
linha indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey. Paraoxonase 1 (PON1).
56
Resultados
4.2.4
Peso relativo do fígado e parâmetros de função hepática
Em relação aos animais do grupo controle, verificou-se que peso relativo do fígado foi
significativamente maior dos animais tratados com a dieta FS e com o uso de tempol. Ratos
FS20 mostraram aumento na atividade de AST, ALT e ALP quando comparadas ao grupo C,
mas, tempol reverteu valor de ALT e ALP, melhorando função hepática, já que elevações
desses valores demonstram algum nível de comprometimento hepático. Curiosamente, o
tratamento com tempol aumentou atividade de ALP em animais recebendo dieta controle
(Tabela 8).
Tabela 8: Peso relativo do fígado, atividade sérica de transaminases e fosfatase alcalina
nos grupos experimentais
Parâmetros
Peso relativo fígado (mg/g)
AST (U/L)
ALT (U/L)
ALP (U/L)
Tratamentos
C
b
25,1 ± 1,5
b
43,6 ± 12,7
b
19,2 ± 5,0
b
67,4 ± 10,4
CT
a
28,8 ± 3,6
ab
49,1 ± 17,5
ab
21,6 ± 8,9
a
80,0 ± 8,7
FS20
a
30,8 ± 1,3
a
59,3 ± 11,9
a
28,9 ± 8,9
a
85,8 ± 11,6
FS20T
a
31,3 ± 2,6
ab
50,6 ± 13,6
b
18,0 ± 6,8
b
66,8 ± 11,4
Valores apresentados como média e desvio padrão foram obtidos dos grupos C (dieta controle e água por 20 semanas); C + T (dieta
controle e água + tempol da 13ª a 20ª semana de tratamento); FS20 (dieta rica em sal + solução de frutose 20% em água por 20
semanas) e FS20 + T (dieta rica em sal e solução de frutose 20% em água por 10 semanas + tempol da 13ª a 20ª semana de
tratamento). Diferentes letras dentro da mesma linha indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo
teste de Tukey. Aspartato Aminotransferase (ASP); Alanina Aminotransferase (ALT); Fosfatase Alcalina (ALP).
4.2.5
Peso relativo dos rins e produtos de degradação metabólica
Evidenciou-se aumento significativo do peso relativo dos rins para o grupo FS20 em
relação ao grupo CT. Níveis séricos de ureia, de creatinina e de ácido úrico foram
acentuadamente maiores em ratos FS20 do que em ratos C. Contudo, tempol mostrou efeitos
benéficos, prevenindo aumento de ácido úrico e de ureia em ratos FS20. No caso da ureia, é
válido salientar que esse é um dos principais catabólitos dos aminoácidos produzidos no
fígado. Já a creatinina, produzida pela utilização da fosfocreatina muscular, quando no
momento da atividade muscular ocorre defosforilação das moléculas de fosfocreatina para a
obtenção de energia, sofre ciclização não enzimática e transforma-se em creatinina. De
maneira semelhante à ureia, a creatinina, em situações de normalidade do funcionamento
muscular é constantemente produzida e lançada ao sangue, sofrendo filtração renal (Tabela
9).
57
Resultados
Tabela 9: Peso relativo dos rins e produtos de degradação nos grupos experimentais
Parâmetros
Peso relativo rim (mg/g)
Ureia (mg/dL)
Creatinina (mg/dL)
Ácido úrico (mg/dL)
Tratamentos
C
ab
5,4 ± 0,3
b
36,9 ± 3,7
b
0,9 ± 0,1
b
1,5 ± 0,4
CT
b
5,2 ± 0,8
b
35,2 ± 3,3
ab
1,0 ± 0,2
b
1,4 ± 0,6
FS20
a
5,9 ± 0,3
a
43,9 ± 2,6
a
1,3 ± 0,3
a
2,3 ± 0,8
FS20T
ab
5,8 ± 0,4
b
38,2 ± 7,3
ab
1,0 ± 0,2
b
1,6 ± 0,4
Valores apresentados como média e desvio padrão foram obtidos dos grupos C (dieta controle e água por 20 semanas); C + T (dieta
controle e água + tempol da 13ª a 20ª semana de tratamento); FS20 (dieta rica em sal + solução de frutose 20% em água por 20
semanas) e FS20 + T (dieta rica em sal e solução de frutose 20% em água por 10 semanas + tempol da 13ª a 20ª semana de
tratamento). Diferentes letras dentro da mesma linha indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo
teste de Tukey.
4.2.6
Resposta pressórica e relação com peroxidação lipídica
Para testar se O2•− contribui ou não para alteração pressórica encontrada no modelo
estudado, avaliaram-se PAS e PAD ao longo do estudo e sua relação com peroxidação lipídica.
A figura 18 mostra resultados semelhantes de valores pressóricos e de FC para os
diferentes grupos antes do início do estudo. Porém, na fase intermediária da pesquisa, foram
encontrados maiores valores de PAS e PAD para os animais do grupo FS20 comparados aos
dos ratos C. Esse aumento pressórico se manteve até o final do estudo para o grupo FS20;
todavia, adição de tempol ao tratamento reduziu significativamente PAS (175,2 ± 26,9 mmHg
em FS20 vs. 146,8 ± 19,3 mmHg em FS20T). Para valores de PAD, ao final do estudo, FS20T
não foi diferente dos animais do grupo FS20, mas apresentou valores semelhantes aos
apresentados pelos grupos C e CT. Para FC não se observou variação com FS bem como, após
adição de tempol, para os grupos C e FS20.
Adicionalmente, foi encontrada uma relação direta, utilizando o coeficiente de
correlação linear de Pearson, entre valores de PAS e PAD final com peroxidação lipídica no
fígado, medida através de TBARS (Figura 19). Quando plotados os dados de resposta
pressórica versus TBARS mostraram uma correlação positiva (r=0,578; p<0.0001 para PAS e
r=0,58; p<0,0001 para PAD), indicando que quanto maior a PAS e PAD, mais elevados são os
valores de TBARS no fígado.
58
Resultados
Figura 18: Comparação das mudanças ao longo dos tratamentos para pressão arterial sistólica
(PAS), pressão arterial diastólica (PAD) e frequência cardíaca (FC) dos diferentes grupos
experimentais. C (dieta controle e água por 20 semanas); CT (dieta controle e água + tempol da 13 a 20ª semana de
tratamento); FS20 (dieta rica em sal + solução de frutose 20% em água por 20 semanas) e FS20T (dieta rica em sal e
solução de frutose 20% em água por 10 semanas + tempol da 13ª a 20ª semana de tratamento).Valores são
#
apresentados em média ± desvio padrão. *p<0,05; **p<0,01 vs C e CT; p<0,05 vs grupo FS20.
200
PAD final (mmHg)
PAS final (mmHg)
250
200
150
100
r = 0,578
p < 0,0001
50
150
100
r = 0,58
p < 0,0001
50
0
0
0
2
4
0
6
5
10
15
20
25
TBARS (nmoles/mL)
TBARS (nmoles/mL)
Figura 19: Correlação de Pearson entre valores de PAS (mmHg), PAD (mmHg) final e substâncias
reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) (nmoles/mL).
59
Resultados
4.2.7
Correlação entre pressão arterial média e parâmetros sanguíneos
Nesse estudo foi realizado análise de correlação entre valores de pressão arterial
média (PAM) aferida ao final do estudo e parâmetros estudados para os grupos
experimentais. Os resultados apresentados mostram que mudanças na PAM foram
associadas positivamente e significativamente a alterações nos níveis de glicose (r=0,411;
p<0,01), de triacilglicerol (r=0,38; p<0,01), de proteína total (r=0,367; p<0,02), de albumina
(r=0,372; p<0,002), de ALT (r =0,431; p<0,006), de ácido úrico (r=0,514; p<0,001), de ureia
(r=0,504; p<0,0008) e de creatinina (r=0,476; p<0,002). As correlações entre PAM e colesterol
total (r=-0,439; p<0,003) e colesterol-HDL (r=-0,401; p<0,009) foram negativas. Essas relações
negativas são achados que apontam para o observado na literatura. Rato transporta TG
predominantemente pelo colesterol-HDL, e, a dislipidemia encontrada no estudo para o
tratamento com FS diminui acentuadamente colesterol total e HDL, enquanto PAM
aumentou correspondentemente. Correlações entre PAM e PON1, AST e ALP não foram
observadas (Tabela 10).
Tabela 10: Correlação entre PAM final (mm/Hg) e parâmetros sanguíneos nos grupos
experimentais
Variável
Glicose (mmol/L)
Triacilglicerol (mmol/L)
Colesterol total (mmol/L)
Colesterol-HDL (mmol/L)
PON1 (U/mL)
Proteína total (g/dL)
Albumina (g/dL)
AST (U/L)
ALT (U/L)
ALP (U/L)
Ácido úrico (mg/dL)
Ureia (mg/dL)
Creatinina (mg/dL)
r
0,411
0,380
–0,439
–0,401
–0,373
0,367
0,372
0,270
0,431
0,245
0,514
0,504
0,476
p
0,01
0,01
0,003
0,009
0,227
0,023
0,002
0,086
0,006
0,136
0,001
0,0008
0,002
Pressão arterial média (PAM); Lipoproteína de alta densidade (HDL); Paraoxonase-1 (PON1); Aspartato Aminotransferase (AST);
Alanina Aminotransferase (ALT); Fosfatase Alcalina (ALP).
60
Discussão
5- DISCUSSÃO
Muitos modelos experimentais indicam que o estresse oxidativo está envolvido na
patogênese da hipertensão arterial com aumento na produção de O2•− (DOBRIAN et al., 2001;
ZALBA et al., 2001; KAWADA et al., 2002; MENG et al., 2003; HATTORI et al., 2005;
PATTERSON et al., 2005; KOJSOVÁ et al., 2006; OHASHI et al., 2009). Os resultados
encontrados no presente estudo demonstram que ratos com RI, devido à suplementação
crônica de frutose, aumentam estresse oxidativo e PA quando mantidos sob uma dieta rica
em sal, e tratamento com tempol reverte hipertensão. Assim, embora o mecanismo do efeito
protetor do tempol não tenha sido determinado, os dados sugerem que SOD pode inibir o
desenvolvimento de hipertensão no modelo usado, com efeitos benéficos sobre desordem
metabólica encontrada.
Para melhor compreender o papel de cada elemento envolvido na fisiopatologia da
SM, pesquisadores utilizam modelos experimentais que podem determinar de maneira
controlada o papel da RI e da hipertensão. A insulina tem sido reconhecida por desempenhar
importante papel na ativação do SNS. Esse efeito pode ser mediado por um mecanismo
barorreflexo (ANDERSON et al. 1991) ou através de um efeito direto da insulina sobre a
liberação de noradrenalina a partir de terminações nervosas simpáticas (BHAGAT et al.,
1981). Por outro lado, há evidências de que o aumento da atividade simpática resulte em RI
devido ativação α1-adrenérgica causar redução no fluxo sanguíneo e, então, ocorrer
diminuição no fornecimento de glicose para o músculo esquelético (RATTIGAN et al., 1999). O
resultado é estimulação contínua do SNS devido à hiperinsulinemia compensatória em
resposta a RI. Nesse estudo, alto consumo de frutose dietética contribuiu para o
desenvolvimento e para a progressão da RI nos animais experimentais, ocasionando
hipertrigliceridemia, intolerância à glicose, hiperuricemia e estado pró-inflamatório, tal como
indicado em estudos prévios com ratos (THORBURN et al., 1989; LEE et al., 1994; KELLEY et
al., 2004 e KANNAPPAN et al., 2006). Os mecanismos de desenvolvimento de RI indicam que
o desenvolvimento de resistência à ação da insulina celular subtende o hiperinsulinismo
observado nos ratos do grupo FS, estando esse fator associado a um perfil lipídico
aterogênico.
Estudos realizados por Ouyang et al. (2008) associam a hiperuricemia à esteatose
hepática, com aumento do consumo de frutose, dados consistentes com o fato da elevação
61
Discussão
de ácido úrico ter um papel participativo na esteatose hepática no metabolismo da frutose.
Como a frutose pode acelerar o metabolismo das purinas, o aumento da concentração de
ácido úrico no soro para os animais do grupo F corrobora com o quadro de esteatose
macrovesicular observada nesse grupo, onde NAFLD é a característica mais representativa do
fígado na SM. O excesso de frutose é um componente lipogênico, o qual promove o
desenvolvimento de um perfil aterogênico lipídico. Assim, para refletir sobre as condições
alimentares modernas, o modelo experimental usado baseou-se na administração de uma
dieta indutora de RI com alto teor de frutose que se assemelha ao chamado 'fast food', que é
muito popular hoje em dia. Este tipo de dieta constitui tipicamente em estilo de vida
ocidentalizado, que inclui o consumo de alimentos processados que são ricos tanto em açúcar
quanto em sal. Nesse contexto, frutose tem sido largamente utilizada em estudos
metabólicos, embora não haja dados relativos a anormalidades do fígado associados a
regimes com sobrecarga de sal dietético associado.
A RI parece ser uma síndrome que está relacionada a agrupamento de desordens
metabólicas (DeFRONZO, 1992) sendo o termo lipotoxicidade utilizado para se referir à
condição que envolve a acumulação de TG em tecidos sensíveis à insulina, com
comprometimento de sua ação. Aumento da entrega do TG para os tecidos interfere na
utilização da glicose resultando em hiperglicemia, como mostrado nos resultados obtidos, em
que acumulação de TG nos animais pode ter contribuído para a insensibilidade à insulina
observada. O grau de RI mostrou-se mais elevado em ratos FS, como indicado por um maior
HOMA. Comparado ao índice HOMA, com base em medições de glicose e insulina basal, o
TOTG proporciona uma aproximação razoável da sensibilidade à insulina levando em
consideração tanto a sensibilidade à insulina no estado basal e após a ingestão de uma carga
de glicose. O grau de RI foi maior nos ratos alimentados com frutose e com sal, tal como
demonstrado pelos valores elevados de HOMA, bem como apresentaram menor tolerância à
glicose após o teste de glicose oral em relação ao grupo C. Outro fator encontrado em
animais alimentados com teor elevado de frutose é que estes exibem estresse hepático como
resultado da carga do metabolismo de frutose. Frutose induz dislipidemia, baixo grau de
inflamação hepática e ativação de vias sensíveis ao estresse, com evidência para
lipotoxicidade como demonstrado por Kannapan et al., (2006) e aumento do fígado em
função dos depósitos de gordura (ROSS et al., 2009). Dessa forma, geralmente o fígado pode
ser considerado o local mais comum de agressão tóxica por receber cerca de 80% do
62
Discussão
suprimento sanguíneo, através da veia porta, além de possuir enzimas com capacidade de
biotransformação de várias substâncias endógenas e exógenas para eliminação. Conforme
Fox & Campbell (2000), ALT e AST podem ser consideradas nos exames de bioquímica
sanguínea e sua elevação em conjunto pode indicar lesão hepática significativa. Evidenciou-se
em grupos tratados com frutose, aumento da atividade das ALT e ALP, indicando alteração da
função hepática que reflete dano hepatocelular. A AST ou transaminase glutâmicooxalacética (TGO) não é uma enzima específica para o fígado, pois pode originar-se tanto em
músculos como no tecido hepático. Já o citoplasma do hepatócito é rico em ALT, sendo que
um insulto à membrana hepatocelular resulta em aumento da ALT sérica e é, muitas vezes,
considerada um marcador de esteatose (ANGULO, 2002). Ainda em relação à doença
hepática, aumento da atividade da ALP é o resultado de maior síntese dessa enzima pelas
células que revestem os canalículos biliares, geralmente em resposta à colestase. Os maiores
aumentos de ácido graxo estão associados a desordens colestáticas difusas ou focais. Notouse, desse modo, com o tratamento empregado, dano hepático e, adicionalmente,
concentrações de albumina foram reduzidas em ratos FS10, provavelmente devido à menor
capacidade de síntese proteica hepática, como observado recentemente por Shinn & Moon,
(2010).
O consumo prolongado de dietas ricas em frutose pode levar ao aumento da ingestão
calórica e à contribuição para o ganho de peso e de gordura corporal com consequente
obesidade. Todavia, ingestão dietética de frutose não resultou em aumento de peso em
animais do estudo, o que possibilitou questionar a relação entre as alterações metabólicas e
o desenvolvimento da hipertensão sem as influências da confusão de obesidade ou
predisposições genéticas no modelo utilizado. Embora a ausência de ganho de peso corporal
foi relatada em vários estudos usando ratos (FAURE et al., 1997; BEZERRA et al., 2001;
D’ANGELO et al., 2005; VASDEV et al., 2007; JALAL et al., 2007; SHAPIRO et al., 2008), há
alguns poucos relatos de ganho de peso em roedores (EL MESALLAMY et al., 2010; KIM et al.,
2010). Consumo de bebidas adoçadas com frutose está ligado ao alto consumo de energia.
Estudos em ratos (SHAPIRO et al., 2008) e humanos (LÊ et al., 2006) mostram que a ingestão
crônica de frutose está correlacionada ao aumento nos níveis de leptina no plasma, e alguns
estudos mostraram que esse aumento precede a obesidade (MOORADIAN et al., 2000;
ROGLANS et al., 2007). O hormônio leptina tem um papel fundamental no equilíbrio
energético e na regulação do peso corporal, ativando núcleos do hipotálamo para reduzir a
63
Discussão
ingestão de alimentos, o que resulta em aumento do gasto de energia (FRIEDMAN & HALAAS,
1998). Tal resposta reduzida ou sua falta aos efeitos metabólicos da leptina é descrita como
resistência à leptina e é característico de seres humanos e roedores obesos (WIDDOWSON et
al., 1997; HEYMSFIELD et al., 1999). Curiosamente, essa resistência à leptina pode ser
sugerida no estudo, na ausência de qualquer variação no aumento de peso corporal, nos
animais sob alimentação rica em frutose (grupo F), comparadamente aos ratos controle. A
presença de resistência à leptina poderia, potencialmente, vir a ser um mecanismo
importante para a indução de obesidade apenas no grupo F, sem associação de sal à dieta.
Resultados demonstraram que ratos do grupo FS10 consumiram mais frutose do que ratos F,
mas apresentaram menor grau de desenvolvimento de peso devido dieta rica em sal, como
em outros estudos, mostrarem atenuação do ganho de peso em ratos (VASDEV et al., 2003;
HASEGAWA et al., 2006; CHO et al., 2007). Adicionalmente, Prada et al. (2000) encontraram
maior ganho de peso e de gordura na carcaça de ratos tratados com baixo teor de sal na dieta
do que conteúdo normal ou alto, do desmame até a fase adulta, com possibilidade de que o
gasto de energia diminui durante a restrição de sal a longo prazo. Isso leva a sugerir que o
contrário, alto consumo de sal, possa ocasionar maior consumo de energia. Apesar do
presente estudo não ter avaliado os mecanismos envolvidos nessa variação encontrada para
o peso, é possível, também, que a diminuição modesta (não significativa) de leptina no grupo
S tenha algum significado nesse menor ganho ponderal ao longo do estudo, uma vez que
leptina circula em níveis proporcionais à gordura corporal e é um sinal aferente chave ligando
nível de adiposidade corporal e estado nutricional.
Por outro lado, a ingestão de bebidas adoçadas com frutose está associada à
diminuição da ingestão de alimentos sólidos e proteína. Jurgens et al. (2005) mostraram que
a ingestão de alimento sólido por ratos alimentados com frutose na água foi diminuída, mas o
consumo de energia total era o mesmo do que dos animais controles. No presente estudo, os
dados são consistentes com essas informações prévias que mostraram que o consumo de
líquido adoçado com frutose está relacionado à diminuição do consumo de ração levando,
talvez, à menor ingestão de alguns nutrientes, dentre estes os aminoácidos sulfurados.
Deficiência de metionina, um aminoácido essencial, tem sido implicada na doença alcoólica
do fígado e cirrose hepática (KIRSCH et al., 2006), secundária ao seu importante papel como
um precursor da GSH. No entanto, o papel potencial da metionina na patogênese da
esteatose hepática não parece ter sido previamente estudada. Estudos usando bebida
64
Discussão
adoçada com frutose e estudos com esteatose usam produtos de peroxidação lipídica como
marcadores de estresse oxidativo e poucas pesquisas têm avaliado os sistemas antioxidantes
enzimáticos. Kunde et al. (2011) demonstraram que a diminuição da ingestão de aminoácidos
sulfurados, como ocorre nos modelos usados para estudar frutose-induzindo esteatose, não é
uma causa de estresse oxidativo hepático no modelo e não fornece uma explicação para a
acumulação de lipídios através do uso da frutose.
Estudos prévios (WU et al., 2000; EBENEZER et al., 2009) relatam que a insulina
plasmática é de 5 a 10 vezes superior em ratos Zucker obesos, um modelo animal que
desenvolve hipertensão moderada. Utilizando telemetria, método que facilita avaliação
precisa da PA por não se confundir ao estresse da medida ou limitar o tempo de amostragem
na aferição (CARLSON et al., 2000), há indicação de que, anormalidades metabólicas
encontradas no presente estudo e em outros são leves em comparação aos efeitos
observados no rato Zucker obeso, uma vez que esse animal apresenta aumento significativo
na PA basal. Logo, é possível que a RI mais grave pode causar hipertensão. Por outro lado,
cães alimentados com uma dieta rica em gordura desenvolvem hipertensão somente à
medida que ganham peso corporal, mas, no modelo de estudo, não houve tal ganho, nem o
peso corporal se correlacionou com PA. Isso sugere que os mecanismos envolvidos no
desenvolvimento da RI e hipertensão na pesquisa apresentada são provavelmente diferentes
dos modelos de obesidade. Na verdade, sabe-se que os indivíduos obesos apresentam
deficiência geral da sensibilidade à insulina provocada por diminuição da densidade de seus
receptores nas membranas celulares dos tecidos alvo, e, apenas uma minoria desses
indivíduos mostram um defeito em pós-receptores específicos para a captação estimulada
por insulina de glicose, semelhante ao defeito encontrado em pacientes com hipertensão
essencial (MARTINEZ et al., 1994).
Em sequência, a RI/hiperinsulinemia em ratos alimentados com frutose prejudica a
função endotelial e pode ou não contribuir para a elevação da PA. Em adição aos seus efeitos
sobre o metabolismo da glicose, a insulina tem mostrado induzir vasodilatação na vasculatura
do músculo esquelético em diabéticos sensíveis à insulina, mas não em indivíduos com RI
(BARON et al., 1993). O NO derivado do endotélio tem sido apontado como o mediador
possível do efeito vasodilatador da insulina no músculo esquelético (STEINBERG et al., 1994).
Sugere-se que esse efeito vascular desempenhe um papel fundamental na diminuição da
disponibilidade da glicose pela ação da insulina (BARON et al., 1993), já que o sistema
65
Discussão
vascular é importante para o fornecimento de nutrientes e de hormônios aos tecidos e,
então, qualquer deterioração na capacidade de resposta vascular poderia contribuir para a RI.
A disfunção vascular devido a uma dieta rica em frutose é observada em rato (TAKAGAWA et
al., 2002) e reconhece-se que a disfunção vascular na SM está associada à aumentada
sensibilidade de vasoconstrição (SHINOZAKI et al., 2004) e de produção de O2•− vascular
(DELBOSC et al., 2005). Além disso, ingestão de frutose crônica em ratos ocasiona deficiente
relaxamento endotélio-dependente (SHINOZAKI et al., 1999; 2000), com evidências de que a
insulina modula a expressão da enzima eNOS e estimula a vasodilatação causada pela
produção de NO (SCHERRER et al., 1994). Porém, em estados de RI, os efeitos sobre eNOS são
abolidos, resultando em deficiente relaxamento endotélio-dependente (KUBOKI et al., 2000).
Assim, é possível que essa ação vascular da insulina possa contribuir para exacerbar o
desenvolvimento de RI observada no estudo.
Embora resistência hormonal desperte grande atenção, tanto na pesquisa clínica,
quanto na básica, em função de sua associação com a doença cardiovascular (DeFRONZO,
1992), os mecanismos que ligam a sensibilidade à insulina à hipertensão arterial e ao
desenvolvimento e à progressão de desordens associadas, ainda não são completamente
conhecidos, apesar dos progressos alcançados. Nenhuma evidência definitiva mostra que a RI
e o hiperinsulinismo causem aumento de PA, embora também não existam dados suficientes
que mostrem que a RI não é uma consequência secundária da hipertensão. Entretanto, a
adição de clonidina (agonista adrenérgico utilizado como antihipertensivo) a água potável,
em ratos alimentados com frutose, impede o desenvolvimento de hipertensão, mas não da
RI, da hiperinsulinemia e da hipertrigliceridemia (HWANG et al., 1987). No presente estudo,
observou-se que uma dieta rica em frutose não produz isoladamente alteração na PAS,
apesar da PA aferida por pletismografia de cauda em vários estudos ser significativamente
maior em ratos tratados com frutose do que em animais controles (STORLIEN et al., 1993;
NAGAI et al., 2002; SÁNCHEZ-LOZADA et al., 2007; 2008).
Uma explicação para a dissociação aparente entre a RI e a PA pode ser aqui relatada
quanto ao grau de disfunção metabólica em ratos F que não foi suficiente para se obter um
efeito sobre a PA. Entretanto, um problema potencial que tem sido demonstrado com os
estudos em ratos relatando hipertensão é que a PA é medida, normalmente com a técnica,
não invasiva, de pletismografia de cauda. Dado que dietas com alto teor de açúcar estimulam
o SNS, uma possível consequência da dieta poderia ser uma leitura hipertensiva,
66
Discussão
especialmente uma vez que as medições são realizadas em condições diferentes daquelas em
que o rato permanece a maior parte do tempo e, assim, ter-se-ia o estresse inerente da
mudança da condição adaptada. Uma possível sugestão para esses resultados,
aparentemente contraditórios, é que a alta ingestão de açúcares simples produz somente um
modesto aumento na atividade do SNS. Esse aumento da atividade simpática não é suficiente
para elevar a PA cronicamente, mas pode aumentar labilidade da PA, eis que qualquer
estresse conduziria a um aumento agudo da FC e da PA (D’ANGELO et al., 2005). Resultados
desse estudo indicam que uma dieta com alto teor de frutose embora eleve modestamente
PA (não significativamente), não causa hipertensão. Assim, a alimentação com dieta rica em
frutose pode prejudicar a disponibilidade de glicose mediada pela insulina e aumentar a
labilidade, mas não parece causar diretamente hipertensão. No entanto, o potencial de
outros fatores tais como a linhagem do rato e o tipo de tratamento para explicar as diferentes
respostas a dietas devem ser exploradas. Dobrian et al. (2003) observaram que sobrecarga de
sal em ratos obesos induzidos por dieta rica em gordura acelera o desenvolvimento, mas, não
aumenta a gravidade da hipertensão.
Paralelamente, Rocchini et al. (1989) relataram que adolescentes obesos que
apresentavam PA elevada eram sensíveis ao sal e hiperinsulinêmicos em relação ao grupo
controle. Contudo, redução no peso desses indivíduos diminuíram concentrações plasmáticas
de insulina e eliminaram sensibilidade ao sal. Embora outros fatores, como aldosterona e
ativação simpática, possam ter influenciado o efeito do consumo do sal sobre pressão
sanguínea nesses indivíduos, esses resultados indicam que mudanças na concentração de
insulina correlacionam significativamente a sensibilidade ao sal. No presente estudo, os
dados sugerem que a resposta da PA à hiperinsulinemia em ratos FS10 pôde ser dependente
da retenção de sódio. A hipótese de que RI e hiperinsulinemia estão ligadas à elevação da PA
é sugerida pelos resultados desse estudo, uma vez que ratos FS10 apresentaram elevação
significativa da PAS similar ao grupo S, mesmo consumindo menos sal; animais do grupo FS10
receberam 10 semanas a menos de tratamento com sobrecarga de sal em relação ao grupo S,
além da frutose associada ao sal ter conduzido a uma menor ingestão de ração e,
consequentemente, menor consumo diário de sal na dieta. Comparadamente, observou-se
que a pressão para o grupo S não foi suficientemente diferente do grupo C na fase
intermediária do estudo (protocolo A), o que indica que apenas 10 semanas de tratamento
67
Discussão
com sal para o grupo FS10 é sugestivo de não aumentar significativamente PAS em relação ao
grupo controle se não houvesse o efeito adicional da frutose.
Pesquisas anteriores sugerem que indivíduos sensíveis ao sal, normotensos e
hipertensos, são hiperinsulinêmicos e apresentam RI em comparação a indivíduos resistentes
ao sal (SHARMA et al., 1993; ZAVARONI et al., 1995; FUENMAYOR et al., 1998) e sensibilidade
ao sal se relaciona a reabsorção tubular de sódio com a insulina estimulando retenção de
sódio como mostrado por Facchini et al. (1999). No presente estudo, a excreção urinária de
sódio pode ter diminuído no grupo FS, sugerido pela maior concentração de sódio sérico de
FS10 do que o encontrado no grupo S. Nesse sentido, pressão natriurese normalmente atua
para estabilizar PA, sendo que anormalidades na hemodinâmica renal ou na reabsorção
tubular podem alterar o ponto de ajuste em que a PA e a excreção de sódio são controladas.
O mecanismo da natriurese tem sido postulado como sendo um componente principal de um
sistema de realimentação para regulação a longo prazo da PA e do volume do fluido corporal.
Sob a maioria das condições, esse mecanismo atua para estabilizar a PA bem como os
volumes dos fluidos corporais (GUYTON et al., 1972). Por exemplo, a formação excessiva de
hormônios antinatriuréticos ou doenças que reduzem a capacidade de excreção renal podem
deslocar a curva de natriurese da pressão a maiores valores pressóricos e tendem a causar
retenção de sódio e aumento do volume de fluido extracelular, se a ingestão permanecer
constante. Acúmulo de líquido continuaria até que a PA aumentasse o suficiente para
restaurar excreção renal ao normal através de natriurese e no estado de equilíbrio, a
excreção renal seria mantida igual ao consumo, mas à custa de hipertensão.
Deve-se reconhecer, no entanto, que outros mecanismos como regulação anormal de
receptores de insulina renais por sal podem ter contribuído para a diminuição natriurética em
FS10, incluindo mudanças no SRA, nos peptídeos natriuréticos atriais (ANP), na produção de
NO e na hemodinâmica intra-renal. Ang II ou aldosterona regulam a reabsorção de sódio e
alto consumo de sal exacerba hipertensão (HALL et al., 1990). Contudo, embora indivíduos
com rins normais possam ser capazes de excretar aumentados conteúdos de sódio sem
alterar PA, é evidente que indivíduos que desenvolvem hipertensão essencial têm um relativo
defeito na sua habilidade para excretarem sódio (GUYTON et al., 1972). Ratos do grupo S
beberam mais liquido para diluir a ingestão de NaCl juntamente com alguma atenuação da
natriurese, resultando em expansão do volume plasmático e aumento da PA. Com isso,
elevação da pressão sanguínea em resposta ao aumento do consumo de sódio na dieta é
68
Discussão
considerada um fator de contribuição importante na patogênese da hipertensão, em
particular em seres humanos ou em animais com predisposição para sensibilidade ao sal,
mas, retenção de sódio pode ter indicado alteração da função renal com capacidade
excretória de sódio renal diminuída, produzindo aumentada reabsorção de sódio tubular para
ratos do grupo FS10. Além do mais, maior filtração glomerular determinada pela sobrecarga
salina poderia ser responsável pelo aumento da massa renal, acompanhando de aumento da
creatinina e ureia sérica como observado no estudo e por Kodama et al. (1997) em ratos
Dahl-SS submetidos à sobrecarga de sal por 19 semanas, indicando injúria renal atribuída ao
sal.
Adicionalmente, uma grande quantidade de estudos experimentais e clínicos tem
enfatizado a função crucial do sódio na regulação da pressão sanguínea e nas implicações de
um balanço anormal no desenvolvimento da hipertensão em modelos experimentais. Por
exemplo, as perturbações que elevam a PA, sem prejudicarem a capacidade de excreção
renal, também tendem a aumentar a excreção de sódio e à de água por meio da natriurese e
diurese reduzindo, assim, o volume de fluido extracelular e retornando para a pressão
sanguínea normal. Hipertensão causada pelo aumento do débito cardíaco ou da resistência
periférica total não pode ser sustentada se natriurese é inalterada porque excreção de sódio
permaneceria acima da ingestão de sódio até que a PA retornasse ao normal. Da mesma
forma, reduções na PA tendem a diminuir a excreção de sódio e a aumentar o volume de
líquido extracelular até que a PA retorne ao normal. Um aspecto importante do presente
sistema de equilíbrio é que existem muitos sistemas neuro-humorais que atuam para
amplificar a sua eficácia. Por exemplo, aumento na pressão sanguínea não só tende a elevar a
excreção renal diretamente através de efeitos hidroeletrolíticos sobre o rim, mas também
inibem a formação de Ang II e aldosterona, o que eleva ainda mais a excreção renal e diminui
o volume do fluido extracelular, promovendo mais rápida recuperação da PA (HALL et al.,
1986).
Diferenças na escolha do modelo animal, níveis de açúcar e de sal utilizados, assim
como desenho experimental tornam difícil a comparação entre os resultados desse estudo
com os outros relatados. Embora concentração elevada de sal dietético (8% de NaCl)
provoque hipertensão em ratos (VASDEV et al., 2003), avaliando associação entre frutose e
sal, Vasdev et al. (2007) sugeriram que tratamento de frutose propicia um ambiente que
permite que sal na dieta comprometa integridade da membrana celular produzindo mudança
69
Discussão
vascular e sustentada hipertensão. Demonstrou-se que altos níveis de sódio intracelular
aumentam o cálcio livre citosólico e contratilidade em células vasculares do músculo liso
(MATLIB, 1991). Consequentemente, altos níveis de cálcio intracelular também podem
aumentar o estresse oxidativo (GORDEEVA et al., 2003) modificando lipídios e proteínas,
componentes das membranas que comprometem a sua integridade (GRIENDLING et al.,
2000). Além do mais, aumento no catabolismo da frutose pode resultar em depleção de
energia nas células, tornando-as mais susceptíveis à peroxidação (GIARDINO et al., 1994).
Aumento da lipoperoxidação hepática em ratos FS pode estar associado à elevação da glicose
na circulação, o que aumenta a produção de radicais livres a partir de auto- oxidação de
glicose e de glicação das proteínas.
Em ratos, ao contrário de seres humanos e coelhos, o TG e o colesterol no plasma são
transportados predominantemente pelo colesterol-HDL (BELTOWSKI et al., 2002). HDL tem
sido atribuído a um independente preditor negativo para o desenvolvimento de eventos
cardiovasculares devido à sua capacidade para promover o efluxo de colesterol celular a
partir de células periféricas e entregá-lo para o fígado para excreção, um processo conhecido
como transporte reverso de colesterol (MERTENS & HOLVOET, 2001). Além disso, HDL
também atrai atenção especial devido ao seu potencial antioxidante. Nesse estudo,
observou-se diminuição acentuada de HDL para o grupo FS20. Somado a isso, PON-1, uma
enzima antioxidante sérica presente no colesterol-HDL que combate a peroxidação lipídica de
LDL, teve sua atividade diminuída. Segundo Rosenblat et al. (2006), PON-1 protege contra
aterosclerose por sua habilidade em reduzir formação de célula espumosa via redução de
estresse oxidativo e estimulação de macrófagos. Pode-se, assim, sugerir que as LDL oxidadas
venham a prejudicar a função endotelial, estimulando a resposta inflamatória de
monócitos/macrófagos, ativando a migração e a proliferação de células do músculo liso
vascular, induzindo uma resposta imune, tal como mostrado pelo aumento do perfil de
monócitos em animais tratados com frutose nesse estudo (Tabela 3). Por conseguinte,
inativação de PON1 em ratos FS pode reduzir a capacidade de HDL para inibir a modificação
de LDL, e também diminui a capacidade de HDL para inibir as interações endoteliais
monocíticas. Ambas as condições parecem ser importantes na resposta inflamatória nas
células das paredes arteriais, como demonstrado pela mudança no perfil de linfócitos em
relação ao grupo C, uma vez que esse é um achado comum durante a resposta inflamatória
sistêmica. Estudos clínicos e em animais sugerem que a baixa contagem de linfócitos tem um
70
Discussão
suposto papel na inflamação crônica (NÚÑEZ et al., 2011). Mostrou-se também que baixa
atividade de PON1 está relacionada no modelo estudado à diminuição dos níveis de HDL
contribuindo para o fato de que PON1 esteja envolvida na preservação da HDL (DORNAS et
al., 2012). Já que PON1 exerce um efeito protetor contra o estresse oxidativo, é possível
encontrar uma associação entre essa enzima e insuficiência hepática. Assim, atividade de
PON1 diminuiu enquanto a peroxidação lipídica aumentou em ratos FS, o que confirma que
essa enzima pode estar envolvida na defesa contra a produção de radicais livres no fígado.
Ratos tratados com frutose exibem estresse oxidativo, disfunção endotelial e
hipertensão (TAKAGAWA et al., 2002; NANDHINI et al., 2005; EL MESALLAMY et al., 2010) e o
tratamento com inibidor de NADPH-oxidase foi mostrado reduzir PA (UNGER & PATIL, 2009).
Peroxidação lipídica hepática significativamente aumentou para o grupo FS, que se
manifestou pelo aumento dos níveis de TBARS, o qual é bem relatado em ratos alimentados
com frutose (LEVI & WERMAN, 1998; BUSSEROLLES et al., 2003b; KELLEY et al., 2004). O
desenvolvimento de estresse oxidativo está relacionado a RI, e notou-se um possível
desequilíbrio entre o estado pró-e antioxidante em animais do estudo. Uma diminuição de
antioxidantes enzimáticos foi mostrada no fígado e no coração de ratos tratados com frutose
e sal, uma vez que a exposição prolongada à condição dietética imposta reduziu a atividade
de enzimas antioxidantes. Inativação de CuZn-SOD por glicação de resíduos de lisina
específicos foi avaliada por ODA et al. (1994) e EROS podem também reduzir a atividade das
enzimas antioxidantes CAT e GPx (DATTA et al., 2000). Essa diminuição é sugestiva de
reduzida capacidade potencial de eliminação de radicais livres em ratos com RI participando,
desse modo, na vulnerabilidade tecidual ao estresse oxidativo.
A diminuição da atividade de GSH-Px ou CAT pode resultar em aumento na produção
de radicais hidroxil (OH•) (GUTTERIDGE, 1994). Os OH• podem danificar as membranas das
células em que a função coordenada de enzimas e receptores que eles contêm é perdida.
Como GSH é o cofator de GSH-Px, é importante notar que concentração de GSH foi diminuída
no fígado dos ratos FS10 em comparação aos outros grupos. Em particular, o tratamento de
frutose e de sal associados diminuíram substancialmente GSH/GSSG. Apesar da importância
biológica da GSH/GSSG ser muito debatida, isso confirma que o tratamento empregado
aumenta estresse oxidativo devido à oxidação de GSH ocorrer durante o processo de redução
do H2O2 (JOHNSON et al., 2012). A queda no nível de glutationa é frequentemente observada
em pacientes com diabetes e agravada quando existem complicações associadas
71
Discussão
(THORNALLEY et al., 1996). Sua redução em ratos FS10 pode ter prejudicado a proteção das
membranas celulares contra os danos por radicais livres, o que também contribui para
diminuição da sensibilidade à insulina. O conteúdo de glutationa reduzida em eritrócitos de
indivíduos diabéticos mostra correlação negativa com o controle metabólico da diabetes,
avaliada pelos níveis de hemoglobina glicosilada (HbA1) (PAOLISSO & GIARGLIANO, 1996),
sugerindo um papel importante na atividade da insulina. Por outro lado, a glutationa poderia
favorecer a transcrição do receptor da insulina. De fato, o nível GSH das células aumenta a
atividade de alguns fatores de transcrição, tais como Sp1, que está envolvido na transcrição
do receptor de insulina (ARAKI et al., 1991).
Mecanismos regulatórios de feedback de enzimas antioxidantes previnem a sua
restauração para um nível normal, protegendo a célula contra efeitos de EROs. CAT previne
dano pela rápida conversão de H2O2 à água (TOUYZ, 2004). De fato, há possíveis vias pelo qual
metabolismo celular nesse modelo pode ter sido alterado, que por sua vez pode ter acelerado
o estresse oxidativo em ratos do grupo FS; uma vez que o aumento do estresse oxidativo
pode ser devido à geração de EROs e/ou à diminuição da proteção de antioxidantes não
enzimáticos ou enzimáticos (HALLIWELL, 1996). A produção de radicais livres e H2O2
resultantes da atividade de SOD pode ter gerado radicais OH• através de reação de Fenton, e
então EROs pode reduzir a atividade das enzimas antioxidantes (DATTA et al., 2000).
Observou-se redução de CAT em fígado e coração de ratos tratados com frutose e sal e,
portanto, uma diminuição dessa atividade é sugestiva de menor capacidade de eliminação de
EROs. No entanto, no rim observou-se aumento da atividade de SOD, o qual pode ter
ocorrido em resposta ao aumento da geração de O2•−, já que atividade aumentada de
enzimas antioxidantes é relatada como um mecanismo adaptativo para proteger as células
contra a toxicidade dos radicais livres (EREJUWA et al., 2011). Uma vez que SOD converte
O2•− a H2O2, maior atividade da SOD pode levar ao turnover de H2O2, e, em caso de aumento
da geração de H2O2, a CAT pode ser incapaz de eliminar, suficientemente, os níveis elevados
de H2O2. CAT é relatada ser altamente susceptível ao aumento de O2•− (KONO & FRIDOVICH,
1982) e pode, assim, tornar-se inibida. Dessa forma, a ocorrência da atividade dessas enzimas
antioxidantes descoordenadamente nos rins de ratos com RI pode implicar que esses animais
podem não estar protegidos contra o estresse oxidativo.
Vários ensaios têm sido realizados para determinar se o tratamento com
antioxidantes pode ou não reduzir PA, embora os resultados sejam conflitantes (KIM et al.,
72
Discussão
2002; VASDEV et al., 2002; WARD et al., 2007). Como O2•− atua tanto no meio extracelular e
intracelular, onde pode ter efeitos prejudiciais, incluindo peroxidação lipídica, agregação de
proteínas e destruição do DNA (MAXWELL, 1995), investigações prévias com mecanismos que
elevam o potencial de proteção contribuem para a destoxificação do organismo ao eliminar
O2•− e reduzir inflamação e aterosclerose (HENSON & JOHNSTON, 1987). SOD desempenha
um papel fundamental em mecanismos de defesa antioxidante, particularmente em estados
hiperglicêmicos ou de RI. Normalmente, a SOD abundante e outros antioxidantes no corpo
reagem com O2•− mantendo-os a níveis muito baixos. Sempre que a produção de O 2•− é
aumentada ou há uma deficiência nos sistemas antioxidantes, a repartição de NO pela O2•−
também aumenta; no rim, reabsorção de sódio elevada contribui para a progressão da
hipertensão em ratos alimentados com sobrecarga de sal. Atividade de SOD foi diminuída no
fígado de ratos FS10 e correlação negativa entre a sua atividade e a glicose no sangue em
ratos tratados com um mimético de SOD deve ser estabelecida. Dessa forma, a administração
de enzimas antioxidantes, como a SOD, pode prevenir ou tratar dano cardiovascular (BAKER
et al., 1985; JOLLY et al., 1999), embora os benefícios potenciais da administração sistêmica
de SOD sejam limitadas, porque essa não pode permear membranas biológicas e é, portanto,
incapaz de remover O2•− produzido intracelularmente. SOD nativa tem limitada
permeabilidade de membrana e provou ser decepcionante na prevenção de efeitos adversos
de O2•− ou na redução da PA. Assim, agentes alternativos com atividade semelhante à SOD
são investigados.
Miméticos da SOD melhoram função vascular em alguns estudos, mas não
significativamente em todos os casos (SCHNACKENBERG et al., 1998; ROBERTS et al., 2009;
ROSÓN et al., 2010). Alguns miméticos da SOD, tais como CuZn-SOD, são dependentes de
metais e podem se tornar ineficazes no meio intracelular devido à dissociação do metalligante. Consequentemente, são preferidos compostos com atividade de SOD que tenham
baixo peso molecular, estabilidade biológica, nenhuma toxicidade e permeabilidade da
membrana para utilização in vivo. Mitchell et al. (1990) demonstraram que tempol tem um
peso molecular baixo, é independente de metal e é permeável à membrana celular. Tempol
não age como um mimético da CAT, não altera concentração de H2O2 e não liga a NO
(SAMUNI et al., 1991), sendo então específico para O2•−. No presente estudo, foi observado
que a administração de tempol pode ter inibido o aumento da geração O 2•−, o que pode ter
aumentado a biodisponibilidade do NO, impedindo o desenvolvimento de disfunção
73
Discussão
endotelial. Essas observações podem apoiar a ideia de que a produção de O 2•− desempenha
um papel crítico no desenvolvimento da disfunção endotelial, resultando em hipertensão.
Tempol aumenta a biodisponibilidade de NO mantendo a regulação da pressão sanguínea
normal (WILCOX & WELCH, 1999).
Permeável à membrana, tempol demonstra atenuar a hipertensão (WILCOX &
PEARLMAN, 2008). Durante a hipertensão arterial, o efeito vasodilatador endógeno de NO é
prevenido devido à sua interação com EROs, especificamente O 2•−, que transforma NO em
peroxinitrito e diminui a sua biodisponibilidade, o que resulta em aumento da resistência
vascular (WILCOX & WELCH, 1999). Portanto, pode-se especular que tempol exerceu seus
efeitos benéficos restaurando os níveis de NO podendo atuar no controle direto do tônus
vascular. Schnackenberg & Wilcox (2001) relataram que tempol restaura prejudicada
dilatação mediada por NO de arteríolas aferentes renais em coelhos diabéticos. Limitação de
disponibilidade de NO pode atenuar o seu efeito sobre o tônus vascular renal e transporte de
Na+ (ORTIZ & GARVIN, 2002). Há evidências de que o NO e O 2•− têm ações antagônicas que
controlam o transporte de NaCl na alça de Henle e mácula densa, (ORTIZ & GARVIN, 2002) o
que sugere que O2•− poderia promover vasoconstrição renal através do aumento do feedback
tubuloglomerular, já que há uma interação específica entre O2•− e NO (KOMERS et al., 2000;
REN et al., 2002). Assim, o balanço de NO/O2•−, que é um regulador chave da função
endotelial e níveis de O2•−, sendo elevado em muitas formas de DCV, pode ter se acumulado
no rim (indiretamente observado pelo aumento da atividade de SOD na figura 13) e ter
alterado a regulação normal da função renal, contribuindo para o desenvolvimento da
hipertensão nos animais S e FS (KOPKAN & CERVENKA, 2009).
Resumidamente, níveis aumentados de O2•− pela associação de frutose e sal na dieta
podem aumentar significativamente a PA, tal qual observado nos animais FS20. Nesse estudo,
hipotetizou-se que diminuir níveis de O2•− teria potenciais implicações no modelo estudado,
uma vez que vários estudos mostram que baixos níveis de SOD estão presentes na RI e na
hipertensão em humanos e animais experimentais (BUCZYNSKI et al. 1993; YELINOVA et al.
1999; NANDHINI et al., 2005). De fato, tempol reduziu PA em ratos FS20 em acordo com
observações de outros pesquisadores. PAS e PAD foram aumentadas, significativamente, em
ratos FS20, em comparação com os ratos C, e a principal conclusão é que a hipertensão
causada pelo aparecimento de um provável ineficiente sistema antioxidante funcionando é
bloqueado pela administração crônica de tempol. Os valores pressóricos finais, atenuados
74
Discussão
pelo tratamento com tempol, foram associados à variação glicêmica, ao perfil lipídico
aterogênico e à hiperuricemia. Além disso, o desenvolvimento de RI foi marcado por uma
menor resposta antioxidante por PON1 e administração de tempol, marcadamente, restaurou
sua ação. A figura 20 resume os efeitos da administração dietética crônica da suplementação
de frutose associada à sobrecarga de sal e pelo tratamento com tempol.
Em contraste, apesar de às vezes ser mencionada, a relação entre o estresse oxidativo
e a ação da insulina tem sido negligenciada. À luz dos resultados encontrados, podemos
traçar um paralelo entre capacidade antioxidante e mecanismo de ação sobre a hipertensão
em ratos RI alimentados com frutose sob dieta rica em sal. Alterações observadas na defesa
anti-radicalar por tempol em ratos FS20 podem influenciar a atividade de insulina e melhorar
concentrações sérica de parâmetros lipídicos e de diferentes proteínas. Já em 1997, Faure &
colaboradores demonstravam melhoria na sensibilidade à insulina em ratos alimentados com
alto teor de frutose com o uso de vitamina E, ao passo que, níveis de TBARS
significativamente aumentados no fígado em ratos FS do estudo demonstraram associação
positiva com PAS e PAD. Isso indica uma relação entre estresse oxidativo e aumento de PA,
resultando em hipertensão e anomalidades metabólicas. Adicionalmente, o fígado pode ser o
alvo e o contribuinte para alterações sistêmicas com uma condição resultante de um
aumento descontrolado de radicais livres de oxigênio ou disfunção do sistema antioxidante.
Nesse sentido, os resultados confirmam que RI pode promover danos teciduais com
sobrecarga de sal conduzindo à retenção de sódio, hipertensão e ao maior estresse oxidativo.
A geração e a ação de substâncias oxidantes e antioxidantes dependem do sistema de óxidoredução, o que demonstra que o desequilíbrio entre a produção de espécies reativas e a
capacidade de o organismo lidar com esses compostos reativos pode prevenir ou não os
efeitos adversos advindos dessas alterações. Tempol e outros eliminadores de O2•− reduzem
significativamente PA em diferentes modelos de hipertensão, como no presente estudo,
impedindo a progressão da elevação da PA. Contudo, estudos adicionais são necessários para
explorarem a participação de EROs nas DCVs, uma vez que inúmeros mecanismos estão
envolvidos com imensa variação em relação aos modelos e protocolos de pesquisas
utilizados.
75
Discussão
Rato macho Fischer
Dieta rica em
frutose
Dieta rica em
sal
↑ consumo de frutose
na água
FÍGADO COM ESTEATOSE
Βeta-oxidação
↑Trigliceridemia
Peroxidação lipídica
↓GSH, GSH/GSSG,
SOD, CATALASE
↑atividade
NADPHoxidase
RI/Hiperinsulinemia
RIM
↑ Ang II
↑ingestão de água
↑reabsorção e
retenção de Na+
Expansão do volume
plasmático com
retenção hídrica
↑SOD
Gordura
CORAÇÃO
↑Estresse oxidativo
↑ O 2• −
↓ atividade SOD e
CATALASE
Tempol
Melhora do perfil lipídico e da glicemia, ↑
atividade da PON1, ↓do ácido úrico, da ureia
sérica e da atividade de ALP e ALT
↑PA
↓PA
Figura 20: Esquema dos efeitos gerais induzidos pelo modelo dietético utilizado e pelo tratamento
com tempol em ratos Fischer. Inicialmente, frutose na água é potencialmente disponibilizada pelo consumo
associado de sal e metabolizada aumentando a oxidação de lipídios que é, por si só, um potente produtor de EROs.
Frutose conduz à hipertrigliceridemia e à esteatose, resultando em RI, hiperinsulinemia, peroxidação lipídica com
aumento do estresse oxidativo estimulado, principalmente pela maior atividade de NADPH-oxidase produzindo O2•−.
Dieta rica em sal também aumenta atividade de NADPH-oxidase por Ang II. Hiperinsulinemia ocasiona retenção de
sódio potencializando estresse oxidativo quando frutose e sal estão associados na dieta. Consequentemente, há
diminuição das defesas antioxidantes, com menor concentração de GSH hepática, diminuição da atividade de SOD e
CAT no fígado e no coração e aumento da atividade de SOD no rim. Por outro lado, dieta rica em sal aumenta volume
extracelular e eleva PA. Por fim, administração de tempol, um eliminador de O2•−, diminui PA, melhora perfil lipídico e
dano hepático, aumenta atividade de PON1 e reduz ácido úrico, ureia associando-se à melhora da resposta pressórica.
Angiotensina II (Ang II); Fosfatase alcalina (ALP); Alanina aminotransferase (ALT); Catalase (CAT); Espécies reativas de
oxigênio (EROs); Glutationa reduzida/oxidada (GSH/GSSG); Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH); Ânion
superóxido (O2•−); Pressão arterial (PA); Paraoxonase 1 (PON1); Resistência à insulina (RI); Superóxido dismutase
(SOD); Triacilglicerol (TG).
76
Conclusões
6- CONCLUSÕES
Em conclusão, esse estudo fornece evidências de que modelo experimental de
hipertensão com ratos tratados com alto teor de frutose associado à sobrecarga de sal na
dieta exibe RI/hiperinsulinemia resultando em retenção de sal. Isso foi consistente com dados
da literatura que discutem o papel chave da insulina na regulação do metabolismo do sódio e
na pressão sanguínea. Coletivamente os dados também indicam aumento do estresse
oxidativo na desordem metabólica encontrada em combinação à elevação da PA, enquanto
tempol administrado cronicamente exerce efeito antihipertensivo, demonstrando, assim,
participação crucial de radicais O2•− na patogênese do estresse oxidativo com alteração dos
valores pressóricos nos animais do estudo. O modelo usado recapitula muitos dos efeitos
bioquímicos e fisiológicos que marcam tendências dietéticas atuais. A implicação é que a
exposição contínua a esses refinados, dietas de baixa qualidade, tem o potencial de resultar
em efeitos adversos para a saúde que podem, em parte, explicar o aumento exponencial dos
fatores de risco para as DCVs. Os resultados também denotam a importância de uma dieta
nutricionalmente equilibrada e confirmam a associação do estresse oxidativo nos vários
fatores envolvidos no desenvolvimento da RI com a presença de hipertensão. Assim, o estudo
oferece um paradigma nutricional em que aspectos estudados podem ser úteis e
cuidadosamente explorados para iniciativas de reduzirem tanto a quantidade de sal quanto
de frutose (provinda de sacarose ou de bebidas adoçadas com HFCS) como atualmente está
sendo vastamente consumida. Uma compreensão mais completa de como essa dieta
empregada afeta os mecanismos que causam insulto cardiovascular pode auxiliar na
prevenção de doenças com novas estratégias terapêuticas para combaterem a progressão
dessas condições.
77
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101
Anexos
Anexos
Anexo 1: Contribuição científica
Artigos publicados

 Dornas WC, Silva ME. Animal models for the study of arterial hypertension. Journal
of Biosciences. 36(4):731–737, 2011.
 Dornas WC, Lima, WG, dos Santos RC, de Souza MO, Silva M, Diniz MF, Silva ME,
Salt overload in fructose-fed insulin-resistant rats decreases paraoxonase-1
activity. Nutrition & Metabolism. 9:63, 2012.
 Dornas WC, Lima, WG, dos Santos RC, Guerra JF, de Souza MO, Silva M, Silva LS,
Diniz MF, Silva ME. High dietary salt decreases antioxidant defenses in the liver of
fructose-fed insulin-resistant rats. Journal of Nutritional Biochemistry. 24:2016–
2022, 2013.
Artigo aceito

Dornas WC, Lima, Silva M, Tavares R, Lima, WG, dos Santos RC, Pedrosa ML, Silva
ME. Efficacy of the superoxide dismutase mimetic tempol in animal hypertension
models: a meta-analysis. Journal of Hypertension.
102
Anexos
Anexo 2: Protocolos de dosagens bioquímicas
Kits Labtest
Ácido úrico – referência 73
Albumina – referência 19
Colesterol-HDL – referência 13
Colesterol total – referência 76
Creatinina – referência 96
Fosfatase alcalina – referência 79
Glicose – referência 85
Proteínas totais – referência 99
Transaminase oxalacética (AST) – referência 52
Transaminase pirúvica (ALT) – referência 53
Triglicérides (Triacilglicerol) – referência 87
Ureia – referência 27
Crystal Chem Downers Grove IL e Rat Leptin ELISA Kit, Linco Research
Insulina - Catálogo #90060
Leptina - Catálogo #90040
103
Review
Animal models for the study of arterial hypertension
WALESKA C DORNAS1and MARCELO E SILVA2,*
1
Research in Biological Sciences - NUPEB, 2Department of Foods, School of Nutrition, Ouro Preto University,
Minas Gerais, Brazil
*Corresponding author (Fax, +55-31-35591828; Email, [email protected])
Hypertension is one of the leading causes of disability or death due to stroke, heart attack and kidney failure. Because
the etiology of essential hypertension is not known and may be multifactorial, the use of experimental animal models
has provided valuable information regarding many aspects of the disease, which include etiology, pathophysiology,
complications and treatment. The models of hypertension are various, and in this review, we provide a brief overview
of the most widely used animal models, their features and their importance.
[Dornas WC and Silva ME 2011 Animal models for the study of arterial hypertension. J. Biosci. 36 731–737] DOI 10.1007/s12038-011-9097-y
1.
Introduction
Owing to the high occurrence of hypertension and problems
originating from this disease over the years, a series of
experimental models have been developed (Doggrell and
Brown 1998). The use of relevant models to mimic human
cardiovascular disease may offer useful information by
allowing an understanding of the cause and progression of
the disease status as well as potential therapeutic interventions (Badyal et al. 2003). However, an effective study of
particular cardiovascular alterations emerging in the course
of the developmental process requires the use of adequate
animal models. Accordingly, it should be mentioned that
each one of the studied models involves a different role in
the development of the disease (Fazan et al. 2001).
2.
2.1
Genetic hypertension
Spontaneously hypertensive rat
Spontaneously hypertensive rats (SHRs) were originally
inbred from Wistar rats and their Wistar–Kyoto (WKY)
Keywords.
inbred non-hypertensive controls (Okamoto and Aoki
1963). These rats develop hypertension at about 4–6 weeks
of age without physiological, pharmacological or surgical
intervention (Zicha and Kunes 1999); however, environmental factors affect the development of hypertension, and
the importance of this model has been attributed to the
similarity of its pathophysiology with essential hypertension
in humans (Trippodo and Frohlic 1981).
In vivo studies have shown that in the early stages of
hypertension, SHRs have an increased cardiac output with
normal total peripheral resistance. As the SHR progresses
into the established hypertension state, the cardiac output
returns to normal values and the hypertrophied blood
vessels produce an increase in the total peripheral
resistance (Smith and Hutchins 1979). With the advance
of hypertension, the SHR progressively develops (between
6 and 24 months of age) structural alterations in the heart,
which are associated with progressive cardiac hypertrophy
(Engelmann et al. 1987). As this is not a strictly inbred
strain, individual variations in the genetic background of
both SHR and particularly of their control strain may
significantly influence the resulting end-organ changes,
what can be seen in figure 1.
Blood pressure; cardiovascular disease; experimental models; hypertension
Abbreviations used: ANG II, angiotensin II; BHR, borderline hypertensive rat; CBF, cerebral blood flow; DOCA,
11-desoxycorticosterone acetate; DR, Dahl salt-resistant rat; DS, Dahl salt-sensitive rat; EDCF, endothelium-derived constricting factor;
EDRF, endothelium-derived relaxing factor; HR, heart rate; LV, left ventricle; MAP, mean arterial pressure; PRA, plasma rennin activity ;
RAAS, rennin–angiotensin–aldosterone system; ROS, reactive oxygen species; RSNA, renal sympathetic nerve activity; SAD, sinoaortic
baroreceptors ; SHR, spontaneously hypertensive rat; SHRSP, stroke-prone spontaneously hypertensive rat; SOD, superoxide dismutase ;
WKY, Wistar–Kyoto
http://www.ias.ac.in/jbiosci
J. Biosci. 36(4), September 2011, 731–737, * Indian Academy of Sciences
731
732
Waleska C Dornas and Marcelo E Silva
SHRSP
SHR
TGR(mREN2)27
BHR
DS
Salt-diet
Hypertension
Impaired
endothelium
Decreased CBF
Ischaemia
Cerebral and
myocardial lesions
Vascular
remodelling
Hypertrophy
Vascular resistance
EDRF
EDCF
Metabolic syndrome
Proteinuria
clearance
Renal damage
Glomerulosclerosis
Tubulointersticial fibrosis
Cardiac failure
Risk factor for sudden death
Figure 1. End-organ damage as affected by different experimental genetic models of hypertension: Cerebral blood flow (CBF);
endothelium-derived relaxing factor (EDRF) and endothelium-derived constricting factor (EDCF).
Stroke-prone spontaneously hypertensive rats (SHRSP),
bred from SHR developed with even higher levels of BP
and a strong tendency to die from stroke, are extreme
examples of cerebrovascular lesions developing spontaneously in animal models (Okamoto et al. 1974). It is the most
utilized animal model of spontaneous stroke and is regarded
as a unique animal model in which prevention of stroke can
be studied experimentally as the incidence of spontaneous
occurrence of stroke lesions in these models reach 80% in
males and 60% in females, with extensive cerebral arteriosclerosis (Yamori 1989).
Because of the high mortality rate of stroke in humans,
and of the similarity of stroke in SHRSP to that observed in
human essential hypertension, this model has been applied
to studies of stroke in human beings (Yamori et al. 1976).
Hypertrophy leads to increased vascular resistance (figure 1)
and wall sheer rates. As blood vessels become less
functionally responsive and more extensively filled with
atherosclerotic plaques, there is a risk for complications
such as cerebral hemorrhage, thrombosis, nephrosclerosis
and myocardial lesions in SHRs and especially cerebral
lesions in SHRSPs (Henning et al. 2010). Therefore, these
models can be used to study not only the pathogenesis and
therapy but also prophylaxis in essential hypertension and
its complications.
2.2
Dahl salt-sensitive rats
Another model is the Dahl salt-sensitive rat (DS), originally
derived by Dahl from the Sprague–Dawley stock on the
basis of developing hypertension with a high NaCl diet.
When fed normal salt diet, these rats become hypertensive,
indicating that this is a genetic model of hypertension with
the feature of salt sensitivity. On the basis of these
considerations, Dahl et al. (1962) selected from endocrossings of Sprague–Dawley rats and, on the basis of
pressure levels associated with a diet high in salt (8% NaCl),
J. Biosci. 36(4), September 2011
two strains of animals: the Dahl salt-sensitive rats (DS) and
the Dahl salt-resistant ones (DR).
The DS animals develop a systemic arterial hypertension
after ingesting a high-salt diet, while the DR animals can
maintain BP within normal limits even with the same diet.
The mechanisms of genetic salt-sensitive hypertension of
the Dahl strain rats are not yet fully known. In addition, DS
rats are possibly insulin resistant even before hypertension
is fully established, and salt-sensitive models of hypertension manifest a decrease in afferent arteriolar resistance and
a rise in glomerular pressure in response to an increase in
BP (Campese 1994). This could indicate that insulin
resistance and hypertension may be inherited as separate
traits that develop in a parallel but independent manner
(Channa et al. 2004).
Dahl salt-hypertensive rats are prone to hypertensive
nephropathy (figure 1). Hypertensive glomerular lesions
were conventionally characterized by mesangial proliferation, matrix accumulation and glomerulosclerosis, in addition to endothelial dysfunction (Nagase et al. 2006).
2.3
Transgenic hypertension models
Transgenic hypertension models can be generated by overexpression of a specific gene. This is an excellent model to
study the role of a specific gene in the pathogenesis of
hypertension. A representative of this type of hypertension is
the TGR(mREN2)27 transgenic rat developed by Mullins
et al. (1990), which suppresses endogenous renal renin
(Bader et al. 1992). TGR develops fulminant hypertension
(200 to 260 mmHg mean systolic BP) beginning at the 5th
week of age, exhibits more myocyte hypertrophy and, only to
a small extent, hyperplasia, and more endothelial dysfunction
than age- and BP-matched SHR (Mullins et al. 1990).
Structural lesions of the nephron in TGR are moderate in
both sexes at an age of 4 months, except for an overall
increase in wall thickness of the larger arterioles and arteries
Animal models in hypertension
(Bachmann et al. 1992). Although the model is not
representative of human hypertension, it does allow in vivo
analysis of the consequences of severe, monogenetic
activation of the Ras and allows identification of the types
of hypertensive damage that can be expected from an
activated Ras (figure 1).
2.4
Borderline hypertensive rat
Investigations using the borderline hypertensive rat (BHR)
have demonstrated the important role genetic factors can
play in mediating both the behavioural and cardiovascular
responses to environmental stressors.
BHR is a genetic model of environmentally induced
hypertension and it is the first filial offspring of the SHR
and the normotensive WKY rat, possessing genetic information from both parents (Sanders and Lawler 1992). The
mechanisms by which environmental stress produces hypertension in BHR have not been identified. However, the
sympathetic nervous system has been implicated. Increases
in plasma norepinephrine concentration during acute environmental stress have been observed in BHR, and changes
in vascular reactivity induced by stress may contribute to the
differential hemodynamic adaptations to stress observed in
WKY rats and BHR (Fuchs et al. 1998). BHR are
characterized by a high plasma concentration of vasopressin, exogenous vasopressin-induced hyperpressor action and
cardiac hypertrophy (figure 1).
3.
3.1
Renal hypertension
Renovascular hypertension
Since 1934, when Goldblatt and his coworkers induced an
elevation of BP by partial constriction of the renal artery of
dog, many renal-induced models of hypertension have been
successfully established. Goldblatt’s technique consists of
constricting one or both renal arteries by use of a small
adjustable silver clamp (Goldblatt et al. 1934). Generally,
renal-induced experimental hypertension includes twokidney one-clip hypertension (2K1C; constriction of one
renal artery while the contralateral kidney is left intact), onekidney one-clip hypertension (1K1C; one renal artery is
constricted and the contralateral kidney is removed), and
two-kidney two-clip hypertension (2K2C; constriction of
aorta or both renal arteries).
As the clip is not severe enough to cause ischaemia in
the 2K1C Goldblatt model, hypertension is induced by
unilateral stenosis of the renal artery. However, the
reduced renal perfusion pressure stimulates increased
renin synthesis and angiotensin II (ANG II), via its direct
vascular effects, acutely increases total peripheral resis-
733
tance and raises BP and also has actions on almost every
organ system (Guyton 1991).
Constricting the renal artery of the remaining kidney in
uninephrectomized rats produces 1K1C Goldblatt hypertension. This hypertensive model has been generally considered to be sodium-fluid volume-dependent, and is an ideal
model for studying the role of volume expansion in the
development of hypertension; owing to the absence of the
other normal kidney, no compensatory increase in sodium
and water excretion can occur, and hence, fluid volume is
retained (Liard et al. 1974).
When of the aorta or both renal arteries are constricted, there
is severe renal ischaemia caused by renal clipping, occasioning
the activation of renin-angiotensin and the sympathetic
nervous system and the elevation of serum vasopressin,
leading to increased BP (Suzuki et al. 1987). The 2K2C, with
a high incidence of spontaneous stroke, can be used as
SHRSP independent of a genetic deficiency. The lesioned
small artery or arteriole with thrombotic occlusion is the main
cause of cerebral infarction in 2K2C, and this may be similar
to lacunar infarction in the human brain (Zeng et al. 1998).
3.2
Renoprival hypertension
Significant reduction of nephron mass by subtotal nephrectomy in experimental animals or by various diseases in
humans triggers a chain of events that lead to glomerulosclerosis, tubulointerstitial injury, proteinuria and progression to end-stage renal disease (Quiroz et al. 2008).
Unilateral nephrectomy causes neither hypertension nor
cardiovascular lesions. However, hypertension caused by
renal arterial stenosis, exacerbated by high amounts of
protein and salt in the diet and/or by high volumes of water
consumed, as well as removal or not of the adrenal gland,
can affect the severity of renoprival hypertension. Removal
of one kidney and approximately two-thirds of the other is
followed by a slow increase in BP. In these animals,
intravascular volume increases and the resulting hypertension may have the same pathogenesis as renoprival
hypertension (Ledingham and Pelling 1970). Since a
bilateral nephrectomy leads to hypertension with vascular
lesions, especially if the animal’s life is prolonged after the
complete removal of the kidneys (Ferrario et al. 2009).
4.
4.1
Endocrine hypertension
Salt and mineralocorticoids
Mineralocorticoids cause retention of sodium and water in
the body until escape diuresis occurs due to increased
pressure on the kidneys and suppression of renin secretion.
The renal effects of this model are similar to hyperaldosterJ. Biosci. 36(4), September 2011
734
Waleska C Dornas and Marcelo E Silva
onism in humans. 11-desoxycorticosterone acetate (DOCA)
and a high-salt diet cause increase of BP within 3 weeks in
isolated perfused cortical collecting ducts, and can cause a
30-fold increase in sodium absorption (Garwitz and Jones
1982). Moreover, there is a reduced plasma rennin activity
(PRA), which is expected in a model of volume-dependent
hypertension, and oxidative stress also may be involved in
DOCA salt hypertension by the increase of superoxide
formation (Ortiz and Garvin 2001).
DOCA salt models progress quickly to severe hypertension
and hypertrophy and are therefore not suited for long-term
studies in chronic, stable disease; there should be minimal
mortality due to the procedures alone. Thereby, the major
limitations of the DOCA salt model are: (1) the pharmacological (large) doses of drug required, (2) the requirement for
surgical reduction of renal mass and (3) the ingestion of a
large amount of NaCl required. Moreover, it is not a very
realistic model for many human hypertensive patients
(Doggrell and Brown 1998).
Chronic social stress in a modern world represents an
important risk factor for the development of cardiovascular
disease. Its deleterious effects depend on the critical period
of exposure, duration and type, as all these factors may alter
functions of the basic autoregulatory stress response
components in the hypothalamic–pituitary–adrenal axis,
sympathoadrenal medullar system, rennin–angiotensin–
aldosterone system (RAAS) and sympathetic nervous system
(Zimmerman and Frohlich 1990; McCarty and Gold 1996;
Esch et al. 2002).
Different types of stress have been applied, such as
emotional stimuli, psychosocial stress, immobilization
stress, food deprivation and electric stimuli, air jet noise,
flashing lights, cold, and interaction of members of a social
group as they compete for food and water (Henry 1975;
Friedman and Dahl 1975; Papanek et al. 1991; Henry et al.
1993; Tucker and Hunt 1993; Bechtold et al. 2009).
4.2
Evidence suggests that the central nervous system participates in the genesis of hypertension. Neurogenic hypertension can be defined as a permanent increase in BP resulting
from a primarily neural change. Denervation of sinoaortic
baroreceptors (SAD) is the neurogenic model of hypertension most often used. The details of these control mechanisms have been studied by observing steady state changes
in mean arterial pressure (MAP), heart rate (HR) and renal
sympathetic nerve activity (RSNA) at various times after
complete disruption of these reflexes (DiBona and Jones
2001), and in association with other models to obtain a
global analysis of the baroreceptor-sympathetic reflex
(table 1).
Psychosocial and environment-induced hypertension
It has been reported that elevation of BP resulting from
repeated exposure to stressful situations may lead to a state
of persistent hypertension (Smith and Hutchins 1979).
Several mechanisms such as the resetting of the baroreceptor reflexes and structural autoregulation in the peripheral vasculature may operate to sustain BP at a high level
once it is raised, but these account less convincingly for the
initial elevation. However, if psychosocial factors are
involved in the development of hypertension, they are likely
to be linked with the early, triggering stages of the
pathophysiological sequence (Steptoe 1986).
5.
Neurogenic hypertension
Table 1. Association of baroreceptor denervation and other models of experimental hypertension
Baroreceptor denervation and angiotensin-II-induced hypertension
Sustained decrease in RSNA during angiotensin II infusion is baroreflex mediated (Barrett et al. 2005).
Sinoaortic denervation and administration L-NAME
Baroreflexes play an important role in the long-term control of BP, and one mediator of this control is nitric oxide (Ramchandra et al. 2003).
Sinoaortic denervation in chronic one-kidney, one-clip hypertensive
Central and peripheral components of the baroreflex are acting efficiently at higher BP when the aortic nerve is maximally stimulated or
the activity is abolished, suggesting that baroreceptor resetting may not be complete in chronic hypertension (Trindade et al. 2009).
Sinoaortic denervation and stress in BHR
Baroreflex resetting prevents a fall in BP when cardiac output is reduced during stress (Hatton et al. 1997).
Sinoaortic denervation with unilateral nephrectomy and administered NaCl
Vasopressin and neurogenic stimuli work together in some manner to elevate vascular resistance in salt-induced hypertension (Ryuzaki et al. 1991).
Sinoaortic denervation and administered NaCl
Baroreceptor reflex is required to prevent chronic salt-induced increases in arterial pressure (Osborn and Provo 1992).
J. Biosci. 36(4), September 2011
Animal models in hypertension
In rats, SAD leads to marked and sustained increase in
BP, and the increase of BP in rat is not accompanied by as
marked a tachycardia as that observed in dog (Krieger
1964). Thus, an increase in MAP stimulates baroreceptors
and causes a reciprocal reduction in sympathetic outflow to
resistance vessels and the heart so as to restore MAP to the
normal level and, therefore, cause neurogenic hypertension
(Thrasher 2002).
6.
Hypertension by chronic inhibition of nitric oxide
Nitric oxide (NO) plays an important role in regulating
systemic vascular resistance by exerting a tonic vasodilator
effect (Török 2008).
Chronic oral administration of an inhibitor of NO synthase,
L-NAME, promoted a persistent hypertension associated with
renal injury, characterized by glomerulosclerosis, glomerular
ischaemia and interstitial infiltration in the kidney (Baylis et al.
1992; Ribeiro et al. 1992). This hypertension is associated
with intense peripheral vasoconstriction and the consequent
increase in peripheral vascular resistance. As for the cardiac
output, some evidence seems to indicate a reduction even
during chronic inhibition of NO synthase. A likely
sympatho-excitatory action of central origin has also been
proposed by Biancardi et al. (2007), who showed that
vasoconstriction in response to L-NAME by the sympathetic
tone plays an important role in the initiation and maintenance
of hypertension.
In relation to cardiac abnormalities, the level of hypertrophy in this model is relatively minor as compared with
other models with similar BP levels. L-NAME-induced
pressure overload is associated with a distinct pattern of left
ventricle (LV) remodelling characterized by a decrease in
LV chamber size relative to wall thickness in the absence of
an increase in LV mass (Bartunek et al. 2000).
7.
Hypertension induced by ANG II
ANG II is known to play an important role in the physiological
regulation of vascular tone and BP and in pathological
conditions such as hypertension and heart failure, although
the mechanisms by which ANG II chronically exerts its effects
remain unclear. ANG II, the final mediator of the RAS, plays a
pivotal physiological role in cardiovascular homeostasis. It is a
potent vasoconstrictor of the peripheral vasculature and
induces growth of smooth muscle cells of blood vessels
and in the heart (Itoh et al. 1993).
This ANG II infusion rate does not cause immediate
increases in systemic BP but it rather leads to a slowly
developing hypertension over a period of 6–10 days. ANGII-induced hypertension produces a presumably baroreflexmediated sympathoinhibition corresponding to the increased
735
BP, but with the added challenge of increased dietary salt,
the sympathetic nervous system does not respond to the
increase in pressure with the appropriate inhibition
(McBryde et al. 2007).
8.
Dietetically induced hypertension
It is known that long-term exposure to a special diet (high
salt, fat or sugar) results in dietary hypertension in some
animals or humans (Navarro-Cid et al. 1995; Kang et al.
2004; Giani et al. 2009).
High-salt intake is able to decrease both plasma levels
and urinary excretion of nitrates (Fujiwara et al. 2000) and
increased superoxide production in both vasculature and
kidney blockade by superoxide dismutase (SOD)-enhanced
endothelium-dependent relaxation Roberts et al. (2000)
demonstrated the presence of oxidative stress and inactivation of NO in rats maintained on the high-fat or high-sugar
diet, which may contribute to the development of hypertension by enhanced generation of reactive oxygen species
(ROS). The reduction in NO availability in the high-fat and
high-sugar diet-fed animals was associated with marked salt
sensitivity, as evidenced by a significant rise in BP on the
high-salt diet (Roberts et al. 2003).
Dietary intake of fats and carbohydrate, particularly the
intake of simple sugars and the resultant effects of plasma
insulin, adipokine and lipid concentrations, may affect
cardiomyocyte size and function, especially with chronic
hypertension (Sharma et al. 2007). High fructose consumption by animals produces a model of the metabolic
syndrome with hypertension, hyperlipidaemia and insulin
resistance, and this greatly accelerates progression of
chronic kidney disease (Gersch et al. 2007).
9.
Concluding remarks
Animal models can lead to understanding of the interactions
of the principal regulatory factors in critical developmental
periods of hypertension. Many of these models were
developed by using etiologic factors responsible for human
hypertension, although the cardiovascular response can be
more easily obtained in animals than in human studies.
Thus, limitations are found for a direct and simplified
application of these results, which suggests that there is no
evidence to support that any experimental model of
hypertension exactly mimics all the symptoms of the human
disease. Furthermore, many researches have shown that
variables such as duration of exposure to causal factors and
dose, differences in animal species, gender as well as age of
the animal at the beginning of exposure, and the technique
for BP monitoring greatly differ amongst the studies and
may interfere with the results.
J. Biosci. 36(4), September 2011
736
Waleska C Dornas and Marcelo E Silva
In this sense we suggest that the various models should
be increasingly investigated, providing subsidies for new
findings in the pathogenesis of hypertension, with a rational
discussion about the advantages and disadvantages of each
experimental model in order to allow the best choice for the
study in question.
Acknowledgements
We are grateful to Dr Rinaldo Cardoso dos Santos for his
critical reading of the manuscript.
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MS received 21 January 2011; accepted 16 May 2011
ePublication: 16 August 2011
Corresponding editor: ASHIMA ANAND
J. Biosci. 36(4), September 2011
Dornas et al. Nutrition & Metabolism 2012, 9:63
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BRIEF COMMUNICATION
Open Access
Salt overload in fructose-fed insulin-resistant rats
decreases paraoxonase-1 activity
Waleska Cláudia Dornas1, Wanderson Geraldo de Lima1,2, Rinaldo Cardoso dos Santos3, Melina Oliveira de Souza1,
Maísa Silva1, Mirla Fiuza Diniz2 and Marcelo Eustáquio Silva1,3*
Abstract
Paraoxonase 1 (PON1) is a HDL-associated esterase/lactonase and its activity is inversely related to the risk of
cardiovascular diseases. The aim of the present study was to evaluate the effect of a high-salt diet on serum PON1
activity in fructose-fed insulin-resistant rats. Adult male Fischer rats were initially divided into two groups. Control
(CON), which received a normal salt diet and drinking water throughout the study; high fructose (HF), which
received a normal salt diet and 20% fructose supplemented drinking water. After 10 weeks, half of the animals from
HF group were randomly switched to a high-salt diet and 20% fructose supplemented drinking water (HFS) for
more 10 weeks. Serum PON1 activity was determined by synthetic substrate phenyl acetate. HFS rats showed
markedly decreased PON1 activity (HFS rats, 44.3 ± 14.4 g/dL versus CON rats, 64.4 ± 13.3 g/dL, P < 0.05) as
compared to controls. In parallel, the level of oxidative stress, as indicated by thiobarbituric acid reactive substances
(TBARS), was increased in HFS rats by 1.2-fold in the liver in relation to controls and was negatively correlated with
PON activity. Differential leukocyte counts in blood showed a significant change in lymphocytes and monocytes
profile. In conclusion, these results show that PON1 activity is decreased in fructose-fed insulin-resistant rats on a
high-salt diet, which may be associated with increased oxidative stress, leading to inflammation.
Keywords: Fructose-fed rats, High-salt diet, Paraoxonase, Atherosclerosis
Findings
Diabetes is a long-term disorder affecting the inner walls
of arteries and is characterized by endothelial dysfunction and oxidative modification of low density lipoprotein (LDL) which may induce atherosclerosis [1]. In
contrast, it is supposed that LDL particles can be protected from free radical-induced oxidation by an HDL
linked enzyme, paraoxonase 1 (PON1).
Although the precise mechanism of PON1 effect is
not yet completely known, it may possess antiatherogenic and anti-inflammatory properties, resulting
from its ability to destroy modified phospholipids and to
prevent accumulation of oxidized lipids in lipoproteins
[2-5]. In diabetes experimental models, it has been
reported that PON1 enzymatic activity is decreased [6,7]
* Correspondence: [email protected]
1
Research in Biological Sciences - NUPEB, Federal University of Ouro Preto,
Minas Gerais, Brazil
3
Department of Foods, School of Nutrition, University of Ouro Preto, Minas
Gerais, Brazil
Full list of author information is available at the end of the article
and reduced PON1 activity was suggested to play a role
in the severity of coronary atherosclerosis [2]. Nonetheless, oxidative stress pathways have also been proposed
to act in this process, with increased reactive oxygen
species (ROS) production and/or impaired antioxidant
defense, which may in turn lead to excessive peroxidation of polyunsaturated fatty acids contained in LDL
particles.
Our laboratory has recently reported that a hypercholesterolemic diet in rats cause a significant reduction of
PON1 activity, associated with increased oxidative stress
[8]. Once rats fed a high dose of fructose are considered
a nutritional model for insulin resistance [9-11], the
present study investigated the effects of a high-salt diet
in fructose-fed insulin-resistant rats on PON1 and its influence in serum and oxidative parameters. In addition
the influence of the diets on the inflammatory cells profile was also assessed.
Twenty-nine Fisher male rats, weighing about 300 g,
obtained from the School of Nutrition of the Federal
University of Ouro Preto, were housed in a temperature
© 2012 Dornas et al.; licensee BioMed Central Ltd. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative
Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), which permits unrestricted use, distribution, and
reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Dornas et al. Nutrition & Metabolism 2012, 9:63
http://www.nutritionandmetabolism.com/content/9/1/63
and humidity controlled room with a 12:12-h light/dark
cycle (lights on at 06.00 AM). Animals were initially
divided into two groups. The control group (CON)
received the standard AIN93 diet [12] and the high
fructose-fed group (HF) was given supplemented fructose as a 20% solution instead of pure water ad libitum
to induce insulin resistance. After 10 weeks, HF animals
were divided into 2 groups: those that continued to receive only 20% fructose in water and those switched to
the high fructose regimen + 8% NaCl in the standard
AIN93 diet (HFS). After 20 weeks fasting rats were
anesthetized and sacrificed. The experiments were
approved by the institutional Ethics Committee with
protocol number 068/2011 and were performed in accordance with the principles of the Brazilian College of
Animal Experimentation [13].
To determine the levels of serum components, blood
samples were collected in test tubes and centrifuged.
Serum total protein, albumin, total cholesterol, HDLcholesterol and triglyceride were assayed with colorimetric or enzymatic methods using commercially available
kits Labtest (Lagoa Santa, MG, Brazil) # 99, 19, 76, 13
and 87, respectively. The atherogenic index was calculated as follows: total cholesterol - HDL cholesterol/
HDL cholesterol.
PON activity was measured by a spectrophotometric
assay using phenyl acetate as substrate as described by
Beltowski et al. [14]. The enzymatic activity was calculated assuming the molar extinction coefficient of phenylacetate to be 1310 L . mol-1 . cm-1. The results were
expressed in units per milliliter, where 1 U of arylesterase hydrolyzes 1 mmol of phenylacetate per minute.
Basal lipid peroxidation status was measured in the liver
by TBARS assay [15].
A drop of blood was used to prepare blood smears,
which were stained with Panotic Fast which use essential
components dyes of Romanowsky [16]. Counts of 100
leukocytes were performed and the results were
expressed as subtypes identified in polymorphonuclear
(PMN), lymphocyte or monocyte cells.
The normality of the sample distribution for each continuous parameter was tested with the KolmogorovSmirnov test. The significance of any differences in proportions or medians was tested with Kruskal-Wallis test,
and in means analysis of variance (ANOVA) was used,
followed by Dunns and Tukey test, respectively. Pearson’s correlation coefficients were used to test the correlation among variables. A p-value of less than 0.05 was
considered statistically significant.
A high-salt diet in fructose-fed insulin-resistant rats
significantly decreased serum levels of total protein, albumin, total cholesterol and HDL-cholesterol after 20
wk of treatment in relation the control group as demonstrated in Table 1. Fructose-fed rats showed significantly
Page 2 of 5
Table 1 Serum total protein, albumin, triglyceride, total
cholesterol, HDL-cholesterol, atherogenic index and
PON1 activity of experimental rats after 20 weeks of
treatment
Number of rats/group
CON
HF
9
10
a
Total protein (g/dL)
7,0 ± 2,0
Albumin (g/dL)
2,8 ± 0,2a
Triglyceride (mg/dL)
Total cholesterol (mg/dL)
10
a
4,9 ± 1,5b
6,3 ± 1,8
2,6 ± 0,3a
b
98,0 ± 13,3a
a
Atherogenic index
0,39 ± 0,12b
197,1 ± 55,9a
183,5 ± 58,7
97,9 ± 20,9a
66,4 ± 10,6
2,1 ± 0,2b
a
126,1 ± 30,8
HDL-cholesterol (mg/dL)
PON1 (g/dL)
HFS
69,3 ± 9,0b
a
43,6 ± 12,17b
65,8 ± 9,4
0,47 ± 0,11b
a
64,45 ± 13,36
0,65 ± 0,26a
a
65,44 ± 17,29
44,3 ± 14,43b
Values (mean ± SD) were obtained from groups CON (AIN diet and water for
20 weeks); HF (AIN diet + 20% fructose solution in water for 20 weeks) and
HFS (8% NaCl in AIN93 diet + 20% fructose solution in water for 10 weeks after
previous treatment for a period of 10 weeks with HF). Different superscript
letters within the same row indicate significant difference at P < 0.05 by
one-way ANOVA followed by Tukey’s test. High-density lipoprotein (HDL);
paraoxonase1 activity (PON1).
higher triglyceride concentrations in both HF and HFS
groups (P < 0.05) as compared to control rats. The
atherogenic index of each experimental group was also
calculated and increased 66% in HFS rats as compared
to controls. PON1 activity markedly fell to 68% in those
animals, as compared to control and HF rats (P < 0.05
and P < 0.01, respectively) (Table 1).
Increased oxidative stress was noted in the liver
obtained from HFS rats, since TBARS levels were raised by
1.2 times (P < 0.05) as compared to controls (Figure 1A).
When data from all experimental groups were analyzed
together, the effects of all treatments on serum PON1
activity were positively correlated with total protein
(r = 0.7728, P < 0.001) (Figure 1B), albumin (r = 0.8142,
P < 0.001) (Figure 1C), total cholesterol (r = 0.6228, P
< 0.001) (Figure 1D) and HDL-cholesterol (r = 0.6145,
P < 0.001) (Figure 1E). In addition, a negative correlation was found between serum PON1 activity and
liver TBARS levels (r = − 0.6262, P < 0.01) (Figure 1F).
Differential leukocyte counts in the total blood smear
in insulin-resistant rats treated or not with the high-salt
diet showed a significant decrease in the lymphocyte
profile in relation to the control group, but the percentage of polymorphonuclear cells (PMNs) remained unchanged. Salt treatment caused a significant increase in
the monocyte profile in HF and HFS rats as compared
to the CON rats (Table 2).
In this study we observed a decrease in serum PON1
activity in insulin-resistant rats on a high-salt diet and
an association among PON1, oxidative stress and inflammation, which can occur during the development of
atherosclerosis.
HDL is the most powerful independent negative predictor of cardiovascular events. The protective effects of
Dornas et al. Nutrition & Metabolism 2012, 9:63
http://www.nutritionandmetabolism.com/content/9/1/63
(A)
(B)
2.0
(C)
100
100
b
b
1.0
0.5
80
60
40
r = 0.7728
P < 0.001
PON1 (g/dL)
1.5
PON1 (g/dL)
a
20
80
60
40
H
FS
H
F
C
O
0
5
10
0
1.5
15
Total protein (g/dL)
(E)
80
60
40
r = 0.6228
P < 0.001
20
PON1 (g/dL)
PON1 (g/dL)
100
0
50
100
150
100
100
80
80
60
40
r = 0.6145
P < 0.001
20
0
total-cholesterol (mg/dL)
2.5
3.0
3.5
(F)
0
0
2.0
Albumin (mg/dL)
20
40
60
80
HDL-cholesterol (mg/dL)
100
PON1 (g/dL)
(D)
r = 0.8142
P < 0.001
20
0
0.0
N
TBARS (nmol/mg ptn)
Page 3 of 5
60
40
r = - 0.6262
P < 0.01
20
0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
TBARS (nmol/mg protein)
Figure 1 (A) Liver TBARS levels; scatter plots illustrating the association between (B) PON1 and total protein and (C) albumin and (D)
Total cholesterol and (E) HDL-cholesterol and (F) TBARS in experimental groups. Control (dark filled circle); high-fructose (dark filled triangle)
and high-fructose + salt (dark filled square) rats. High-density lipoprotein (HDL); paraoxonase1 activity (PON1).
HDL have been first attributed to its capacity to promote cellular cholesterol efflux from peripheral cells and
deliver it to the liver for excretion, a process known as
reverse cholesterol transport [1]. Furthermore HDL has
also attracted particular attention because of its antioxidative potential. Interestingly this work sustains the relationship between low paraoxonase activity and diseases
with low antioxidant defense and excessive lipid peroxidation since paraoxonase may act protectively in atherogenesis by hydrolyzing some products of lipid
peroxidation and consequently by limiting LDL oxidation and foam cell formation [17].
In our model, serum albumin and protein levels are
reduced probably due to protein synthesis disruption in
Table 2 Polymorphonuclear cells, lymphocytes and
monocytes count of experimental rats after 20 weeks of
treatment
CON
PMN cells (%)
HF
HFS
5-15
3-27
7-23
Lymphocytes (%)
19-58
4-33**
7-20***
Monocytes (%)
27-76
36-85**
40-83*
Values were obtained from groups CON (AIN diet and water for 20 weeks); HF
(AIN diet + 20% fructose solution in water for 20 weeks), and HFS (8% high salt
in AIN93 diet + 20% fructose solution in water for 10 weeks after previous
treatment for a period of 10 weeks with HF). Kruskall Wallis test followed by
Dunns test. Values indicate lowest and highest percentage of cells counted
respectively. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001. Polymorphonuclear (PMN) cells.
the liver as observed by Shinn and Moon [18]. The
damaged hepatocytes are potent sources of reactive oxygen intermediates and oxidative stress is important in
many types of liver injury. Lipid peroxidation, which was
found increased in this study, could change the properties of biological membranes, resulting in severe cell
damage and play a significant role in the mechanisms
related to the alterations observed by us, as it has been
previously documented [19].
In rats, unlike in humans and rabbits, plasma triglycerides and cholesterol are transported predominantly by
HDL [14] and fructose per se, after having reached the
liver, may contribute to the increase in serum triglyceride as demonstrated in this study and by others authors
[9,20,21]. We showed that low PON1 activity is associated with decreased HDL levels and this contributes to
the hypothesis that PON1 is involved in the preservation
of HDL. Since PON1 exerts a protective effect against
oxidative stress, it is logical to find an association between this enzyme and liver impairment. PON1 activity
decreased while lipid peroxidation increased in HFS rats,
suggesting that PON1 activity may be involved in the
defense against free radical production in liver organelles. Moreover, the atherogenic index of these animals
indicated them to be more susceptible to the development of atherosclerosis. However the results of this
study showed that PON1 activity towards synthetic
Dornas et al. Nutrition & Metabolism 2012, 9:63
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substrates reflects its relationship to oxidative stress by
means of the marker used but this hypothesis needs support by means of further investigation.
A previous study has shown that PON1 protects
against atherosclerosis, by its ability to reduce macrophage foam cell formation, via reducing oxidative stress
and stimulation of cholesterol efflux from macrophages
[22]. The present study proposes that oxidatively modified LDL impair endothelial function, stimulate inflammatory response of monocytes/macrophages, activate
migration and proliferation of vascular smooth muscle
cells and induce immune response, as indicated by the
increase of monocytes in HF and HFS groups. Therefore,
inactivation of PON1 in HFS rats could reduce the
ability of HDL to inhibit LDL modification and also
decrease the ability of HDL to inhibit monocyticendothelial interactions. Both conditions appear to be
important in the inflammatory response in arterial wall
cells, as demonstrated by the change in lymphocyte
profile in relation to the control group, since this is a
common finding during the systemic inflammatory response. In addition, clinical and animal studies suggest
that low lymphocyte count plays a putative role in
chronic inflammation [23].
Our dietetic model was chosen due its relevance to
human nutrition because it mimics a common Western
diet, with high consumption of sugar drinks and salty
foods and this study is the first one to show an association between paraoxonase status and salt overload in
insulin-resistant rats. This supports the relationship between low PON1 activity and diseases with low antioxidant defense and excessive lipid peroxidation.
Paraoxonase may perform protectively in atherogenesis
by hydrolyzing some products of lipid peroxidation and
consequently by limiting LDL oxidation and foam cell
formation [24]. This allows us to hypothesize that paraoxonase activity may lead to failure in the protection of
LDL oxidation in insulin-resistant subjects on a high-salt
diet. Thus the lack of prevention of LDL oxidation by
HDL could be explained by the quantitative alteration of
HDL, since PON1 generally seems to contribute to the
antioxidant properties of HDL.
In conclusion, the present study indicates that a highsalt diet in fructose-fed rats leads to lowered serum
PON1 activity, with deleterious effects on the antioxidant defense system. Furthermore, we suggest that a
change in blood cells profile would reflect the oxidative
stress detected. These findings we believe to be relevant
in the field of human nutrition.
Abbreviations
HDL: High-density lipoprotein; LDL: Low-density lipoprotein;
PMNs: Polymorphonuclear; PON: Paraoxonase1; ROS: Reactive oxygen
species; TBARS: Thiobarbituric acid reactive substances.
Page 4 of 5
Competing interests
The authors declare that they have no competing interests.
Author details
Research in Biological Sciences - NUPEB, Federal University of Ouro Preto,
Minas Gerais, Brazil. 2Department of Biological Sciences, Institute of Exact and
Biological Sciences, Federal University of Ouro Preto, Minas Gerais, Brazil.
3
Department of Foods, School of Nutrition, University of Ouro Preto, Minas
Gerais, Brazil.
1
Author’s contributions
WCD and MES participated in the design of the study, interpretation of data
and edited the manuscript. WCD, MOS, MS, MFD collected the data. RCS
made substantial contributions in revising it critically for intellectual content.
WGL contributed to the discussion of data and statistical analysis. MES
coordinated the study. All authors read and approved the final version of the
manuscript.
Received: 29 March 2012 Accepted: 27 June 2012
Published: 27 June 2012
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doi:10.1186/1743-7075-9-63
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2012 9:63.
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Journal of Nutritional Biochemistry xx (2013) xxx – xxx
High dietary salt decreases antioxidant defenses in the liver of fructose-fed
insulin-resistant rats
Waleska Claudia Dornas a , Wanderson Geraldo de Lima a, b , Rinaldo Cardoso dos Santos c ,
Joyce Ferreira da Costa Guerra a , Melina Oliveira de Souza a , Maísa Silva a , Lorena Souza e Silva a ,
Mirla Fiuza Diniz b , Marcelo Eustáquio Silva a, c,⁎
b
a
Research in Biological Sciences - NUPEB, Federal University of Ouro Preto, Minas Gerais, Brazil
Department of Biological Sciences, Institute of Exact and Biological Sciences, Federal University of Ouro Preto, Minas Gerais, Brazil
c
Department of Foods, School of Nutrition, Federal University of Ouro Preto, Minas Gerais, Brazil
Received 23 November 2012; received in revised form 25 April 2013; accepted 14 June 2013
Abstract
In this study we investigated the hypothesis that a high-salt diet to hyperinsulinemic rats might impair antioxidant defense owing to its involvement in the
activation of sodium reabsorption to lead to higher oxidative stress. Rats were fed a standard (CON), a high-salt (HS), or a high-fructose (HF) diet for 10 weeks
after which, 50% of the animals belonging to the HF group were switched to a regimen of high-fructose and high-salt diet (HFS) for 10 more weeks, while the
other groups were fed with their respective diets. Animals were then euthanized and their blood and liver were examined. Fasting plasma glucose was found to
be significantly higher (approximately 50%) in fructose-fed rats than in the control and HS rats, whereas fat liver also differed in these animals, producing
steatosis. Feeding fructose-fed rats with the high-salt diet triggered hyperinsulinemia and lowered insulin sensitivity, which led to increased levels of serum
sodium compared to the HS group. This resulted in membrane perturbation, which in the presence of steatosis potentially enhanced hepatic lipid peroxidation,
thereby decreasing the level of antioxidant defenses, as shown by GSH/GSSG ratio (HFS rats, 7.098±2.1 versus CON rats, 13.2±6.1) and superoxide dismutase
(HFS rats, 2.1±0.05 versus CON rats, 2.3±0.1%), and catalase (HFS rats, 526.6±88.6 versus CON rats, 745.8±228.7 U/mg ptn) activities. Our results indicate that
consumption of a salt-rich diet by insulin-resistant rats may lead to regulation of sodium reabsorption, worsening hepatic lipid peroxidation associated with
impaired antioxidant defenses.
© 2013 Elsevier Inc. All rights reserved.
Keywords: high-salt diet; fructose-fed rats; oxidative stress; steatosis; antioxidant defenses
1. Introduction
Increasing evidence suggests the involvement of oxidative stress
in insulin resistance [1] and has generated high interest in the role of
free radicals in the maintenance of adequate levels of antioxidant
defenses [2,3]. In type 2 diabetes, a significant inverse correlation
exists between hepatic fat load and the antioxidant defense system
[4], which may prevent generation of an adequate compensatory
response for restoration of cellular redox balance [5]. In particular,
Abbreviations: AST, Aspartate aminotransferase; ALT, Alanine aminotransferase; CAT, Catalase; GFR, Glomerular filtration rate; GSH, Reduced
glutathione; GSSG, Oxidized glutathione; GPx, Glutathione peroxidase (GPx);
HOMA, Homeostasis model assessment; ROS, Reactive oxygen species; O−
2,
Superoxide anions; SOD, Superoxide dismutase; TBARS, Thiobarbituric acid
reactive substances.
⁎ Corresponding author. Research in Biological Sciences - NUPEB, Federal
University of Ouro Preto, Minas Gerais, Brazil.
E-mail addresses: [email protected] (W.C. Dornas);
[email protected] (M.E. Silva).
0955-2863/$ - see front matter © 2013 Elsevier Inc. All rights reserved.
http://dx.doi.org/10.1016/j.jnutbio.2013.06.006
changes have been demonstrated in some components of the free
radical defense system in different models [6–8].
We observed that the expression of genes encoding the antioxidant enzymes glutathione peroxidase (GPx), gamma-glutamylcysteine synthetase and superoxide dismutase (SOD) decreased in the
liver tissue of streptozotocin-induced diabetic rats because of
increased oxidative stress [9] associated with overproduction of
reactive oxygen species (ROS)[10]. Under normal conditions, almost
all of the produced superoxide anions (O2−) are converted to
hydrogen peroxide (H2O2) by the action of SOD, which is further
detoxified to water by catalase (CAT) or GPx [11]. However
hyperglycemia induce the overproduction of O2− [12] and dramatic
change in the oxidant/antioxidant balance has been postulated to play
a role in the pathogenesis of diabetes.
Increasing the sugar intake has been reported to result in
dyslipidemia, as indicated by elevated levels of serum triglycerides,
cholesterol, and low-density lipoproteins [13,14].These underlying
metabolic disturbances appear to induce insulin resistance commonly
observed in high-fructose fed human and animal models [15] when
fructose consumption causes progressive liver disease stimulated
2
W.C. Dornas et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2013) xxx–xxx
lipogenesis [16]. Furthermore, despite recent advances in elucidating
the pathogenesis of related conditions, studies have shown that
presence of insulin resistance and compensatory hyperinsulinemia
would lead to sodium retention [17].
Therefore in the present study we examined whether a high-salt
diet could impair antioxidant defenses in the liver of fructose-fed rats
due activation of enhanced renal sodium reabsorption potentiating
oxidative stress.
2. Materials and methods
2.1. Animal and diets
Forty-five male 12-week-old Fischer rats, weighing approximately 300 g, were
individually housed in a temperature-and humidity-controlled room under a 12 h
light/dark regimen. Initially, the rats were randomly assigned to three experimental
groups (n=10–12) as follows: the control group (CON), fed with the AIN93M diet [18]
and water; the high-salt group (HS), fed with the AIN93M diet plus 8% w/w NaCl and
water; and the high-fructose group (HF), fed with the AIN93M diet and a 20% w/v
fructose solution as drinking water. After 10 weeks of treatment, the animals belonging
to the HF group were further divided into 2 groups: rats that continued to be fed on the
fructose solution (HF) and rats that were switched to a high-fructose + high-salt
regimen (HFS) for 10 more weeks. Details of the experimental diets are given in
Table 1. Food and water were provided ad libitum and their intake was measured. At
the end of the experimental period, the rats were fasted for 12 hours, anesthetized with
isoflurane and euthanized by total blood collection from the brachial plexus. The blood
was centrifuged at 1500g for 15 min. One liver lobule from each animal was separated
for histological analysis and the rest was frozen at −80°C until further analysis. All the
procedures were approved by the Ethical Committee for Animal Care and Use of the
Federal University of Ouro Preto.
2.2. Biochemical determinations
Serum aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) activities
and plasma glucose concentration were determined using commercial kits from
Labtest Diagnostica SA (Lagoa Santa, MG, Brazil) # 108, 109 and 84, respectively, by
following the manufacturer’s instructions. ELISA was utilized to quantify plasma
insulin and leptin levels using commercial kits from Ultra Sensitive Rat Insulin ELISA,
Crystal Chem Downers Grove, IL, USA, and Rat Leptin ELISA Kit, Linco Research, USA,
(Catalog #90060 and #90040, respectively). The homeostasis model assessment
(HOMA), described by Matthews et al. [19] as a measure of insulin resistance, was
calculated using the formula [insulin (μmol/ml)×glucose (mM/L)/22.5]. Hepatic fat
was extracted using a chloroform-methanol mixture (2:1, v/v) according to the
method of Folch et al. [20] and the total lipids were quantified gravimetrically by
evaporating the solvents in the extract. Sodium concentrations were measured by
flame photometry (Olidef model C-71 apparatus; São Paulo, Brazil).
2.3. Antioxidant defenses and oxidative stress
Liver SOD activity was measured by the method of Marklund and Marklund [21].
One unit of SOD activity was defined as the amount of enzyme that inhibited the rate of
autoxidation of pyrogallol by 50%, which was determined at 570 nm. Catalase activity
was measured according to Aebi [22] and was expressed in units per milligram of
protein using the extinction coefficient of 0.0394 L/mmol/L/cm. The rate of H2O2
decomposition was followed by monitoring absorption at 240 nm in 50 mM phosphate
buffer, pH 7.0, containing 5 mM H2O2. Tissue protein content was determined
according to the method developed by Lowry et al. [23] using bovine serum albumin as
the standard. The total glutathione (GSH + GSSG) was measured after precipitation of
Table 1
Diets composition
Ingredient
Starch
Casein
Sucrose
Salt
Cellulose
Fat
1
Minerals
2
Vitamins
Choline
Energy content (kcal/kg)
1
Composition (g/kg diet)
CON
HS
HF3
HFS3
622.5
140.0
100.0
50.0
40.0
35.0
10.0
2.5
3810
542.5
140.0
100.0
80.0
50.0
40.0
35.0
10.0
2.5
3490
622.5
140.0
100.0
50.0
40.0
35.0
10.0
2.5
3810
542.5
140.0
100.0
80.0
50.0
40.0
35.0
10.0
2.5
3490
Mineral mixture for AIN93M; 2Vitamin mixture for AIN93M; 3D-Fructose (SynthLabsynth, São Paulo, Brazil).
proteins with an equal volume of 4% sulfosalicylic acid using the enzymatic method
previously described [24]. Oxidized glutathione (GSSG) was determined after
derivatization of total GSH with 2-vinylpiridine. Oxidative stress index was calculated
from the GSH/GSSG ratio and by lipid peroxidation status through of levels of
thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) as described by Buege and Aust [25].
2.4. Liver histology
After removal from each animal, the livers were immediately fixed in 10% buffered
formaldehyde, embedded in paraffin, cut (4-μm thickness) and mounted on glass
slides. The sections were deparaffinized in xylene, stained with hematoxylin and eosin
(H&E) using the standard technique and then examined. Histological examination of
the slides was performed by using concentrated light microscope equipped with
photographic digital camera (DM5000; Leica) with software Qwin Plus. Scoring of the
slides was performed using a semi-quantitative method reported by Brunt et al. [26].
Fat degeneration was graded according to the percentage of fat-containing hepatocytes. Grade of vesicular steatosis according to the original system involved 10 grades,
whereas in this system, steatosis was graded from 0–4 based on the percentage of
hepatocytes involved in the biopsy (0, none; 1, 10%; 2, 10–33%; 3, 33–66% and 4, N66%).
2.5. Statistical analysis
Normality of the sample distribution for each continuous parameter was tested
with the Kolmogorov–Smirnov test. The significance of any differences in proportions
of medians was tested with Kruskal–Wallis test and in means by one-way analysis of
variance (ANOVA), followed by Dunns and Tukey tests, respectively. Correlation
analysis was used to measure the degree to which 2 variables were related. Significance
for all measures was defined when Pb.05. GraphPad Prism version 5.00 for Windows
(San Diego, CA, USA) was used for statistical analyses.
3. Results
Notably, the mean food intake was significantly different amongst
different dietary groups. In relation to the control group, high dietary
NaCl resulted in a lower caloric value leading to higher food intake in
HS rats (Pb.01). On the other hand, fructose supplementation led to
lower food intake (Pb.001) due to its energy content (Fig. 1A). Mean
values for liquid intake were significantly higher in the high-salt
groups (Pb.001) than in the CON and HF groups (Fig. 1B). Higher
fructose intake lowered the energetic demand for solid food (Pb.001)
in HFS rats than in other groups (Fig. 1C). The high-salt diet led to
increased liquid intake, thus compelling HS and HFS rats to drink
approximately 4.0 and 3.0 times the liquid volumes consumed by the
CON animals, respectively, resulting in the corresponding differences
in the liquid calorie intake of HFS rats drinking the fructose solution
(Pb.001) in relation to HF rats (Fig. 1D). There were no significant
differences in the total energy intake (Fig. 1E). Moreover, plasma
leptin concentrations in HF rats was higher (Pb.01) compared to that
in other groups (Fig. 1F).
The average final body weight was lower in HFS rats than in HF
and CON rats (Pb.05). Relative liver weights were higher (Pb.05) in
fructose-fed rats (HF and HFS) and a corresponding increase was
observed in the liver lipid content and plasma glucose in fructose-fed
rats in relation to CON (Pb.05) and HS (Pb.001). The highest insulin
concentration was found in HFS rats (Pb.05) and HOMA analysis
revealed that this group had significantly higher values than the
controls animals (Pb.01), thereby indicating that the combination of
dietary fructose with NaCl in HFS rats impaired insulin response. For
determination of whether the dietary treatment induced liver injury,
serum AST and ALT activities were examined, and ALT but not AST in
the HF group were found to be significantly higher than that of the
control group (Pb.05). Augmented natriuretic response to a high-salt
diet significantly decreased serum sodium in HS rats compared to that
in other groups (Pb.05) and particularly HFS showed a substantial
increase in relation to the HS group (Table 2).
Photomicrographs of hepatic specimens stained with H&E are
shown in Fig. 2A–D, and the scores of histological variables are
presented as medians in Fig. 2E. Mild or no hepatic steatosis occurred
in CON rats (Fig. 2A). HS rats did not show predominant occurrence of
steatosis, but hyperemic vessels were observed in the parenchyma
W.C. Dornas et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2013) xxx–xxx
B
b
c
20
d
15
10
5
0
CON
HS
HF
a
60
b
40
20
c
c
CON
HS
HF
30
20
b
10
0
CON
HS
HF
a
a
a
b
60
40
20
CON
HS
HF
HFS
F
20
90
a
Leptin (ng/mL)
Total energy intake/day
(kcal)
a
80
HFS
E
40
100
0
0
HFS
D
Energy intake from
liquid/day (kcal)
C
80
Energy intake from
food/day (kcal)
a
25
Liquid intake/day (mL)
Food intake/day (g)
A
3
80
70
60
50
HFS
15
b
10
b
b
5
0
CON
HS
HF
HFS
CON
HS
HF
HFS
Fig. 1. Food, fluid, caloric intake and serum leptin of experimental rats. Symbols represent the animals in scatter plots to each group. Different letters indicate significant differences at
Pb.05 by one-way ANOVA followed by Tukey’s test. Control diet (CON); high-salt diet (HS); high-fructose diet (HF); high-fructose and salt (HFS) diet for 10 weeks after previous
treatment for a period of 10 weeks with HF.
cells (Fig. 2B). As expected, the high fructose treatment caused
hepatic lipid accumulation, which was evident in both HF and HFS
rats (Fig. 2C and 2D) with no signs of necroinflammation. Fat
deposition in the HF group was classified as macrovesicular, while
livers of HFS rats showed mainly a microvesicular pattern with lesser
grade of lipid accumulation in relation to HF rats. A statistically
significant higher steatosis score (Pb.05) was seen in livers from HF
compared to CON animals (Fig. 2E).
Compared with the control group, the hepatic levels of total
glutathione and GSH were significantly lower in the HFS group
(Pb.01), although no significant difference was observed in the GSSG
levels (Fig. 3). The GSH/GSSG ratio was calculated to determine
whether oxidative stress had been augmented and was found to be
lower in HFS rats than in control rats (Pb.01). Assessment of lipid
peroxidation showed damage in hepatocytes, as verified through
TBARS content of HFS in relation to CON animals (Pb.05). Furthermore, a progressive functional deficiency in antioxidant defenses was
also evidenced in the HFS group, with a significant decrease in SOD
and CAT activities, (Pb.05; Pb.001, respectively) in relation to the CON
group. Additionally, a negative correlation was found between TBARS
Table 2
Characteristics of experimental rats
Variable
Treatments
CON
HS
HF
HFS
Initial body weight, g
295.0±21.5 295.1±23.1
295.1±22.2 294.4±28.5
Final body weight, g
451.2±29.5a 428.2±28.2ab 448.2±36.9a 412.0±17.2b
Absolute weight liver, g
12.6±1.8ab
11.7±1.5b
13.7±1.9a
13.0±1.3ab
Relative liver weight, mg/g
27.8±3.0b
27.0± 2.3b
30.6±2.4a
31.6±1.3a
Total fat liver, mg/g
53.3±6.0b
42.5±4.4b
73.4±17.3a
72.6±12.6a
Plasma glucose, mmol/L
8.0±0.9b
8.7±1.1b
11,9±1.8a
12.7±1.6a
Plasma insulin, μmol/ml
20.9±13.1b 27.7±14.2b
34.0±19.4b 45.1±25.8a
HOMA-IR, score
7.6±5.4b
11.0±7.0b
17.4±11.1b 23.2±16.4a
Serum AST, U/L
56.8±17.3
56.8±16.3
58.3±17.3
57.1±16.0
Serum ALT, U/L
16.0±5.4b
25.2±11.2ab 28.7±11.6a
24.8±7.2ab
a
b
a
Serum sodium, mmol/L
142.9±5.3
127.6±4.5
140.8±8.1
135.8±4.5a
Values are expressed as means±S.D. Different letters within the same row indicate
significant differences at Pb.05 by one-way ANOVA followed by Tukey’s test.
and GSH/GSGG ratio (r=−0.40, Pb.01), SOD (r=−0.56, Pb.0005) and
CAT activities (r=−0.50, Pb.002) (Table 3).
4. Discussion
The present study suggested that the osmotic load caused by
augmenting dietary NaCl increased plasma osmolality, stimulated
thirst, and enhanced liquid intake, as observed by Manesh et al. [27].
Studies in both rats [28] and humans [29] have reported that chronic
fructose ingestion is associated with increase in plasma leptin levels
and leptin resistance, which alters the information that is relayed to
the central nervous system on energy intake and body fat stores for
regulation of food intake and energy homeostasis [30]. Roglans et al.
[31] reported that this increase precedes obesity, suggesting that the
liver is a key organ in the development of metabolic derangements
induced by fructose consumption. Nevertheless, in our study this
increase of leptin levels only in HF rats occurred in the absence of
augmented body weight: HF and control rats had the same body
weight, although leptin potently activates cellular fuel consumption
by stimulating fatty acid oxidation and reducing lipogenesis [32].
On the other hand, while fructose is more soluble, sweeter, and
less glucogenic than glucose or sucrose and has been recommended
as a replacement for these sugars in the diets of diabetic and obese
people, it is lipogenic and usually causes greater elevation in
triglyceride levels [3]. Significant differences due to fructose dietinduced development of fatty liver were observed in our experiments,
as well as in other studies [33,34]. Fructose treatment-induced
increased fatty liver and consequent hepatomegaly was found in HF
and HFS animals. Fructose-fed rats served as a model for diet-induced
insulin resistance, suggesting that pathophysiological mechanisms
and lipid retention in hepatocytes (hepatic steatosis) was an
important early sign in the development of a metabolic abnormalities
spectrum. Our model was thus proved appropriate because it
reproduced histologically detectable steatosis resulting primarily
from the deposition of fat in hepatocytes of fructose-fed rats.
However, our results demonstrated that HFS rats consumed more
fructose than HF rats did, but displayed lower degree of steatosis
4
W.C. Dornas et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2013) xxx–xxx
Fig. 2. (A-D) Representative photomicrographs H&E staining of liver sections of experimental rats. Hepatocytes abnormalities were not observed in the CON group (A); note hyperemic
vessels (arrowhead) and normal parenchyma appearance in the HS group (B); aspect of macrovesicular steatosis in the HF group (C). Note hepatocytes with a large negative image in
the cytoplasm with nucleus displaced into the periphery of the cell, large fat globule in most cases (white arrow); aspect of microvesicular steatosis in the HFS group (D). Note cells
with small cytoplasmic vacuoles without displaced nucleus (black arrow) magnification ×440. Grade of liver steatosis of rats in experimental groups (E). Values (medianne, n=8–11)
(*Pb.05 vs. control rats).
development. This may indicate that the high-salt diet model, as in
other studies, attenuated gain in body weight [35,36], which can lead
to lower accumulation of fat in hepatocytes, as supported by our data.
Determination of liver function parameters also revealed liver
dysfunction due to fructose-feeding and hepatic damage in fructose-fed rats. Fructose feeding was found to significantly enhance
serum ALT activity, indicating considerable hepatocellular injury in
HF rats. ALT has been routinely measured and is considered a
surrogate marker of liver fat accumulation [37]. Injury to the
hepatocyte leads to disruption of the plasma membrane and leakage
of the enzyme to the extracellular fluid. Thus it can be detected at
abnormal levels in the serum and this condition may be a cause of
hepatocyte death.
Rats are an excellent animal model to study the effects of
fructose intake because their fructose metabolism closely re-
sembles that of humans [38] and studies have shown that fructose
induces hyperglycemia and hyperinsulinemia [39,40]. The results
demonstrated that fructose administration produces insulin resistance in HFS rats consistently with previous studies carried out
using different techniques to assess insulin resistance [40,41].
Insulin resistance in fructose-fed rats has been attributed to a low
level of insulin-stimulated glucose oxidation due to modifications
in the post-receptor cascade of insulin action [42]. Thus elevated
plasma insulin concentrations enhance the synthesis of very-lowdensity lipoprotein, and this may induce increase in fatty liver as
observed by us in HF and HFS rats with decreased in response of
HFS rats to glucose utilization, featuring a lower insulin action as
indicated by higher HOMA values. In contrast, Nishimoto et al. [43]
used fructose-fed insulin-resistant rats with a low or high-sodium
diet and found no significant differences in plasma glucose or
W.C. Dornas et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2013) xxx–xxx
Total Gluthatione
a
a
1.5
GSSG
b
1.0
0.5
0.15
a
a
1.5
nmol/mL
nmol/mL
a
GSH
2.0
nmol/mL
2.0
a
b
1.0
0.10
0.05
0.5
0.0
0.00
0.0
CON
HS
HF
HFS
CON
HS
HF
HFS
CON
GSH/GSSG
HF
HFS
0.4
U/mg de ptn
a
15
a
a
10
b
5
0
CON
HS
HF
0.3
a
ab
a
ab
b
b
0.2
0.1
0.0
HFS
CON
SOD activity
2.5
HS
TBARS
20
HS
HF
HFS
Catalase activity
ab
1000
b
2.0
U/mg protein
% inhibition
5
1.5
1.0
0.5
a
a
800
a
b
600
400
200
0
0.0
CON
HS
HF
HFS
CON
HS
HF
HFS
Fig. 3. Antioxidant defenses and oxidative stress in the liver of experimental rats. Different letters indicate significant differences at Pb.05 by one-way ANOVA followed by Tukey’s test.
insulin among their groups, although they used a lower dosage for
both salt and fructose than in our study. This discrepancy among
studies may be better explained by the fact that diet-induced
modifications in metabolic and hormonal profile are probably
dependent on the duration of diet treatment, on the amount of
carbohydrate and salt in the diet besides interactions with other
nutrients [44–46].
Our model was based on the administration of a high-fructose diet
inducing insulin resistance that resembles the so-called ‘fast food’
that is highly popular nowadays. This type of diet constitutes an
important, typically westernized lifestyle, which includes consumption of processed foods that are high in salt and sugar. Fructose has
been broadly used in metabolic studies, although there is no data
concerning liver abnormalities associated with ‘high-salt’ regimens.
In this study, the high-salt diet led to greater urinary excretion of
sodium, but hyperinsulinemia showed in HFS rats has influence on
sodium retention as demonstrated by higher serum sodium concentrations in HFS when compared with the HS group. This antina-
Table 3
Regression analyses between TBARS (U/mg ptn) and antioxidant defenses of
experimental rats
Variable
r
P
Glutathione total, nmol/ml
GSH, nmol/ml
GSSG, nmol/ml
GSH/GSSG, ratio
SOD, % inhibition
Catalase, U/mg ptn
−0.21
−0.22
0.18
−0.40
−0.56
−0.50
.1815
.1540
.2558
.0194
.0005
.0024
triuretic effect may be opposed by a concomitant decrease in
proximal tubular sodium reabsorption [47] or an increase in
glomerular filtration rate (GFR) [48]. Chronic hyperinsulinaemia
increases GFR in normal dogs [48], but not in obese insulin-resistant
dogs [49] which suggest that insulin could increase GFR, and thus the
filtered sodium load, only in insulin-sensitive subjects. Insulin has
been known to enhance sodium reabsorption in the proximal tubule
and stimulates not only sodium but also volume absorption in the
rabbit proximal convoluted tubule. Thus, from these stimulatory
effects, it is clear that insulin acts on proximal tubules to reabsorb
sodium filtered from the glomeruli and yet, important regulatory
mechanisms exist subsequently in the Henle’s loop, distal tubule and
connecting tubule [17].
Besides, Vasdev et al. [50] showed that intracellular sodium levels
increase cytosolic free calcium, which can increase oxidative stress and
this condition changes the membrane components compromising its
integrity [51] because increased ROS generation has been shown to
induce cell membrane lipid peroxidation [52]. Therefore, it has been
suggested that lipid accumulation in the liver makes hepatocytes more
sensitive to oxidative stress [53], which in this study, potentially
activated lipid peroxidation, as demonstrated by increased TBARS in
HFS rats. The observed steatosis could have affected lipid composition
and fluidity of mitochondrial membranes, which increased oxidative
stress in the liver. In addition, changes in liver glutathione redox status
were monitored in this work by recording the GSH/GSSG ratio, because
severe oxidative stress may deplete cellular GSH, and glutathione play
an important function in detoxification of free radicals [54]. Glutathione
is the major intracellular non-protein antioxidant, and GPx converts
H2O2 to H2O by oxidizing glutathione to glutathione disulfide [2]. We
observed a decrease in liver GSH levels in HFS rats as well as in the GSH/
6
W.C. Dornas et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2013) xxx–xxx
GSSG ratio, which could be a consequence of adaptation of the fatty
liver, as suggested by the negative correlation of TBARS with GSH/GSSG
ratio. It may represent a consequence of the higher pro-oxidant status
developed in HFS rats, which is likely responsible for the high
consumption of cellular and circulating antioxidants. Moreover,
decreased SOD and CAT activities were observed in HFS rats that
could participate in hepatic vulnerability to oxidative stress. Decreased
feedback regulatory mechanisms involving these antioxidant enzymes,
prevents the restoration to normal enzyme level. Thus, the susceptibility of the tissue to oxidative stress was dependent on the alteration
in lipid composition and tissue damage. SOD play a key role in cell
protection against the deleterious effects of O2−, and catalase prevents
damage by rapidly converting H2O2 to water [55]. There are possible
pathways by which cellular metabolism in this model may be altered,
which in turn may accelerate oxidative stress. The increased oxidative
stress could be due to production of oxygen free radicals [3] and H2O2
resulting from SOD activity, which can generate hydroxyl radicals
through the Fenton reaction, and thus, ROS can themselves reduce the
activity of antioxidant enzymes such as CAT and GPx [56]. Consequently, a lowering of these activities is suggestive of reduced
scavenging potential in the insulin-resistant rats on high-salt diet.
Another possibility is that accumulation of advanced glycation products
resulted in the production of free radicals [57]. Therefore the high-salt
diet might be regarded as an instigator that reduces antioxidant
defenses, worsening insulin sensibility in the early stage of experimental diabetes in rats; however, further research is needed to define
the interdependencies/interactions among fructose, salt and oxidative
stress more clearly.
In conclusion, the high-salt diet reduced hepatic antioxidant
defenses in the fructose-fed rats, providing evidence to support the
idea that increased oxidative stress is involved in membrane
perturbation through important regulatory mechanisms. Thus, our
findings suggest that hyperinsulinemia play a role in sodium
retention and it is therefore possible that the deleterious effects of
salt overload on insulin- resistant subjects may be attributed, in part,
to the development of a substantial pro-oxidant condition that
impairs antioxidant defenses.
Acknowledgments
The authors would like to thank LAPAC (Pilot Laboratory of Clinical
Analysis, School of Pharmacy, Federal University of Ouro Preto) for
technical assistance.
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ÁCIDO ÚRICO Liquiform
Ref.: 73
Instruções de Uso
MS 10009010071
Finalidade . Sistema enzimático para determinação do ácido úrico
por reação de ponto final em amostras de sangue, urina e líquidos
(amniótico e sinovial).
O método proposto utiliza a técnica manual e é facilmente aplicável à
maioria dos analisadores automáticos e semi-automáticos capazes de
medir uma reação de ponto final entre 490 e 540 nm.
[Somente para uso diagnóstico in vitro.]
Metodologia . Enzimático-Trinder.
Princípio . O ácido úrico é determinado de acordo com as seguintes
Reagentes
reações:
1.
Uricase
Ácido Úrico + O2 + H2O
Alantoína + CO2 + H2O2
Peroxidase
2H2O2 + DHBS + 4-aminoantipirina
Antipirilquinonimina + 4H2O
O ácido úrico é oxidado pela uricase à alantoina e peróxido de hidrogênio.
O peróxido de hidrogênio, na presença da peroxidase, reage com o DHBS
e a 4-aminoantipirina, formando o cromogênio antipirilquinonimina.
A intensidade da cor vermelha formada é diretamente proporcional à
concentração do ácido úrico na amostra.
1 - Reagente 1 - Armazenar entre 2 - 8 ºC.
Contém tampão 80 mmol/L pH 7,0, 4-aminoantipirina 0,82 mmol/L,
peroxidase ≥16000 U/L, azida sódica 0,8 mmol/L e octil fenol
polioxietanol 1 g/L.
2.
2 - Reagente 2 - Armazenar entre 2 - 8 ºC.
Contém tampão 80 mmol/L pH 7,0, DHBS 10 mmol/L, uricase ≥500 U/L,
octil fenol polioxietanol 1 g/L e azida sódica 0,8 mmol/L.
3.
- Padrão - Armazenar entre 2 - 8 ºC.
Contém ácido úrico 6,0 mg/dL. Armazenar bem vedado para evitar
evaporação.
Características do sistema . A dosagem de ácido úrico
utilizando a reação de Trinder caracteriza-se por ser um método direto,
facilmente automatizável, que tem a especificidade da uricase. Muitos
produtos utilizam o fenol como reagente de acoplamento. Entretanto, a
baixa sensibilidade do fenol e a incompatibilidade de pH ótimo entre a
uricase de origem animal e a peroxidase criam sérios obstáculos à
confiabilidade do método.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nas condições
indicadas, são estáveis até a data de expiração impressa no rótulo.
Durante o manuseio, os reagentes estão sujeitos à contaminação de
natureza química e microbiana que podem provocar redução da
estabilidade.
A Labtest, com o sistema Liquiform, supera estas dificuldades
substituindo o fenol pelo ácido 3,5-dicloro-2-hidroxibenzeno sulfonato
(DHBS), que é 4 vezes mais sensível, permitindo uma relação adequada
entre amostra e reagentes, possibilitando obter uma sensibilidade ótima
em relação à baixa concentração do analito. Ao mesmo tempo a utilização
da uricase de origem vegetal possibilita trabalhar em pH onde se obtém
excelente atividade das enzimas envolvidas no processo.
Não utilizar o Reagente quando sua absorbância medida contra água em
520 nm for igual ou maior que 0,300 ou quando mostrar-se turvo ou com
sinais de contaminação.
A determinação do ácido úrico é direta utilizando apenas 0,02 mL de
amostra. As substâncias utilizadas na reação se encontram distribuídas
adequadamente em dois reagentes para conferir maior estabilidade na
forma líquida original e manutenção das condições ótimas da reação,
permitindo a utilização direta dos reagentes em sistemas automáticos,
facilitando a eliminação da ação de interferentes.
A metodologia monoreagente pode ser aplicada utilizando um Reagente
de Trabalho estável 90 dias entre 2 e 8 ºC, obtendo-se desempenho
adequado mesmo em situações de baixas demandas do teste. O sistema
permite ainda preparar o volume de Reagente de Trabalho necessário
para uma medição da concentração do ácido úrico.
A linearidade do método é de 20 mg/dL, o que diminui a necessidade de
efetuar diluições em um número significativo de amostras.
01 Português - Ref.: 73
Precauções e cuidados especiais
Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na
manipulação do reagente. Os reagentes contêm azida sódica que é tóxica.
Deve-se tomar cuidado para evitar a ingestão e no caso de contato com
os olhos, deve-se lavar imediatamente com grande quantidade de água e
procurar auxílio médico. A azida pode formar compostos altamente
explosivos com tubulações de chumbo e cobre. Portanto, utilizar grande
volume de água para descartar os reagentes.
Cuidados com o tempo de reação, temperatura de trabalho e pipetagens
são extremamente importantes para obtenção de resultados corretos.
Os reagentes devem ser manuseados seguindo as boas práticas de
laboratório que indicam evitar ingestão e contato com pele, mucosas e
olhos.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nas condições
indicadas, são estáveis até a data de expiração impressa no rótulo.
Durante o manuseio, os reagentes estão sujeitos à contaminações de
natureza química e microbiana que podem provocar redução da
estabilidade.
Material necessário e não fornecido
1. Banho-maria ou incubador mantido à temperatura constante (37 °C).
2. Fotômetro capaz de medir com exatidão a absorbância entre 490 e
540 nm.
3. Pipetas para medir amostras e reagentes.
4. Cronômetro.
Influências pré-analíticas . O ácido úrico está aumentado nas 24
horas que sucedem à ingestão aguda de álcool.
As concentrações séricas mostram grandes variações no dia a dia e
variações sazonais no mesmo indivíduo. O ácido úrico sérico se eleva
com o stress, estados de jejum prolongado e aumento do peso corporal.
Níveis elevados de ascorbato (vitamina C) produzem interferências
negativas por competição com o cromogênio na reação da peroxidase.
Se houver suspeita da presença de ácido ascórbico, deixar o soro em
repouso durante 90 minutos antes de iniciar a dosagem para não obter
resultados falsamente diminuídos.
Amostra
Usar soro, urina e líquidos (amniótico e sinovial). O analito é estável 3 dias
entre 2 - 8 ºC e 6 meses a 10 ºC negativos.
Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP) que
estabeleça procedimentos adequados para colheita, preparação e
armazenamento da amostra. Enfatizamos que os erros devidos à amostra
podem ser muito maiores que os erros ocorridos durante o procedimento
analítico.
Branco da amostra . Este procedimento é aplicável quando houver
ação positiva de interferentes. Misturar 1 mL de NaCl 150 mmol/L
(0,85%) com 0,02 mL da amostra. Medir a absorbância em 520 nm,
acertando o zero com água destilada ou deionizada. Subtrair a
absorbância assim obtida da absorbância do teste e calcular a
concentração. Este sistema de correção é aplicável apenas nos casos em
que a amostra produz interferência fotométrica.
Preparo do reagente de trabalho . O conjunto de um frasco do
Reagente 1 e um frasco de Reagente 2 permite preparar o Reagente de
Trabalho. Transferir o conteúdo de um frasco do Reagente 2 para um
frasco do Reagente 1 e homogeneizar suavemente. Anotar a data de
expiração. Estável 5 dias entre 15 - 25 °C e 90 dias entre 2 - 8 °C quando
não houver contaminação química ou microbiana. Identificar o frasco do
Reagente de Trabalho para evitar confusão com outros frascos do
Reagente 1. Para preservar seu desempenho o reagente deve
permanecer fora da geladeira somente o tempo necessário para se obter
o volume a ser utilizado. Evitar exposição à luz solar direta.
Opcionalmente pode-se preparar menor volume do Reagente de Trabalho
utilizando a proporção de 4 volumes do Reagente 1 para 1 (um) volume
do Reagente 2.
O Reagente de Trabalho contém tampão 80 mmol/L pH 7,0,
4-aminoantipirina 0,7 mmol/L, DHBS 2,0 mmol/L, peroxidase 13300 U/L,
uricase 100 U/L, azida sódica 0,8 mmol/L e octil fenol polioxietanol 1 g/L.
Procedimento
Ver OBSERVAÇÕES 1 e 2.
Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras de sangue
não transmitem infecções, todas elas devem ser consideradas como
potencialmente infectantes. Portanto, ao manuseá-las, deve-se seguir as
normas estabelecidas para biossegurança.
Urina . Homogeneizar a urina, separar 10 mL, acertar o pH entre 7,0 e 9,0
com NaOH 5% e aquecer 10 minutos a 56 °C para dissolver os cristais de
urato e ácido úrico. Diluir a urina 1:10 (0,1 mL de urina + 0,9 mL de água
destilada). Multiplicar o resultado obtido por 10.
Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimos aplicar as
normas locais, estaduais ou federais de proteção ambiental.
Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:
Interferências
A utilização de plasma fornece resultados falsamente diminuídos.
Valores de bilirrubina até 19 mg/dL, hemoglobina até 90 mg/dL e
triglicérides até 1800 mg/dL não produzem interferências significativas.
Valores de hemoglobina entre 90 e 180 mg/dL produzem resultados
falsamente elevados que podem ser minimizados utilizando o branco da
amostra.
Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina em uma
amostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo: diluir 0,05 mL
da amostra em 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L (0,85%) e medir a
absorbância em 405 ou 415 nm acertando o zero com água deionizada
ou destilada.
Hemoglobina (mg/dL) ≅ Absorbância405 x 601
Hemoglobina (mg/dL) ≅ Absorbância415 x 467
02 Português - Ref.: 73
Amostra
Padrão (N° 3)
Reagente de Trabalho
Branco
Teste
0,02 mL
1,0 mL
1,0 mL
Padrão
0,02 mL
1,0 mL
Misturar e incubar em banho-maria a 37 °C durante 10 minutos. O nível da
água no banho deve ser superior ao nível do reagente nos tubos de
ensaio. Determinar as absorbâncias do teste e padrão em 520 nm ou filtro
verde (490-540) acertando o zero com o branco. A cor é estável 15
minutos.
O procedimento sugerido para a medição é adequado para fotômetros
cujo volume mínimo de solução para leitura é igual ou menor que 1,0 mL.
Deve ser feita uma verificação da necessidade de ajuste do volume para o
fotômetro utilizado. Os volumes de amostra e reagente podem ser
modificados proporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do
teste e o procedimento de cálculo se mantém inalterado. Em caso de
redução dos volumes é fundamental que se observe o volume mínimo
necessário para a leitura fotométrica. Volumes da amostra menores que
0,01 mL são críticos em aplicações manuais e devem ser usados com
cautela porque aumentam a imprecisão da medição.
Cálculos
Linearidade
Absorbância do Teste
Ácido Úrico (mg/dL) =
x6
Absorbância do Padrão
Exemplo
O resultado da medição é linear até 20 mg/dL. Quando for obtido um valor
igual ou maior que 20 mg/dL, diluir a amostra com NaCl 150 mmol/L
(0,85%), realizar nova medição e multiplicar o resultado pelo fator de
diluição.
Urina . Diluir a amostra (com pH entre 7,0 e 9,0 e aquecida 10 minutos a
56 ºC) 1:20 ou 1:40 com água destilada ou deionizada e repetir a
medição. Multiplicar o resultado obtido por 20 (vinte) ou 40 (quarenta).
Absorbância do Teste = 0,175
Absorbância do Padrão = 0,138
0,175
Ácido Úrico (mg/dL) =
x 6 = 7,6
Diluir a amostra de tal modo que o valor encontrado se situe entre 5 e
10 mg/dL.
0,138
Devido a grande reprodutibilidade que pode ser obtida com a
metodologia, pode-se utilizar o método do fator.
6
Fator de Calibração =
Absorbância do Padrão
Ácido Úrico (mg/dL) = Absorbância do Teste x Fator
Exemplo
Controle interno da qualidade . O laboratório deve manter um
programa de controle interno da qualidade que defina claramente os
regulamentos aplicáveis, objetivos, procedimentos, critérios para
especificações da qualidade e limites de tolerância, ações corretivas e
registro das atividades. Materiais de controle devem ser utilizados para
avaliar a imprecisão e desvios da calibração.
Sugere-se que as especificações para o coeficiente de variação e o erro
total sejam baseadas nos componentes da variação biológica (VB)9,10.
6
Fator =
Sugerimos a verificação da linearidade metodológica e fotométrica, no
mínimo semestralmente, utilizando amostra com valores até 20 mg/dL.
= 43,5
Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas da linha Qualitrol - Labtest
para controle interno da qualidade em ensaios de química clínica.
0,138
Ácido Úrico (mg/dL) = 0,175 x 43,5 = 7,6
Intervalo de referência . Os intervalos devem ser usados apenas
mg/dL x volume urinário (mL)
Urina (mg / 24 horas) =
100
Calibração
Rastreabilidade do sistema
O padrão é rastreável ao Standard Reference Material (SRM) 913 do
National Institute of Standards and Technology (NIST).
Calibrações manuais
Obter o fator de calibração ao usar novo lote de reagentes ou quando o
controle interno da qualidade indicar.
Sistemas automáticos
Branco de reagentes: água ou solução de cloreto de sódio 150 mmol/L
(0,85%);
Padrões: usar calibradores protéicos. As concentrações de ácido úrico
nos calibradores da linha Calibra - Labtest são rastreáveis ao SRM 913 do
NIST.
Intervalo de calibrações
Calibração de 2 ou 3 pontos ao mudar de lote;
Calibração de 2 ou 3 pontos quando o controle interno da qualidade
indicar.
como orientação. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça, seus
próprios intervalos de referência na população atendida.
Soro (mg/dL)
Crianças11
Adultos
Homem
Mulher
Homem
Mulher
1,5 a 6,0
0,5 a 5,0
2,5 a 7,0
1,5 a 6,0
Urina: 250 a 750 mg/24 horas
Conversão: Unidades Convencionais (mg/dL) x 59,5 = Unidades SI
(µmol/L).
12
Características do desempenho
Exatidão .
Em duas amostras com concentrações de ácido úrico
iguais a 6,2 e 8,0 mg/dL foram adicionadas quantidades diferentes do
analito obtendo-se recuperações entre 96 e 98%. O erro sistemático
proporcional médio obtido em um valor de 6,0 mg/dL foi igual a
0,2 mg/dL ou 3,0%.
Especificidade . O método proposto foi comparado com um método
similar utilizando 40 amostras com valores situados entre 2,4 e
11,0 mg/dL. A comparação resultou na equação da regressão: y =
1,030x - 0,137 e um coeficiente de correlação (r) igual a 0,996.
03 Português - Ref.: 73
O erro sistemático total (constante e proporcional) verificado no nível de
decisão (6,0 mg/dL) foi igual a 0,043 mg/dL ou 0,7%. Como as amostras
foram selecionadas aleatoriamente em pacientes de ambulatório e
pacientes hospitalizados, pode-se inferir que o método tem uma
especificidade metodológica adequada.
Repetitividade - imprecisão intra-ensaio
Amostra 1
Amostra 2
N
20
20
Média
6,6
8,4
DP
0,09
0,07
CV (%)
1,3
0,8
Reprodutibilidade - imprecisão total
Amostra 1
Amostra 2
N
20
20
Média
6,6
8,5
DP
0,13
0,12
CV (%)
2,0
1,4
2. O laboratório clínico tem como objetivo fornecer resultados exatos e
precisos. A utilização de água de qualidade inadequada é uma causa
potencial de erros analíticos. A água utilizada no laboratório deve ter a
qualidade adequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes,
usar nas medições e para uso no enxágüe final da vidraria, deve ter
resistividade ≥1 megaohm.cm ou condutividade ≤1 microsiemens/cm e
concentração de silicatos <0,1 mg/L. Quando a coluna deionizadora está
com sua capacidade saturada ocorre produção de água alcalina com
liberação de vários íons, silicatos e substâncias com grande poder de
oxidação ou redução que deterioram os reagentes em poucos dias ou
mesmo horas, alterando os resultados de modo imprevisível. Assim, é
fundamental estabelecer um programa de controle da qualidade da água.
3. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas e medicamentosas de
interferência nos resultados e na metodologia sugere-se consultar:
<www.fxol.org/>.
Referências
Sensibilidade metodológica . Uma amostra não contendo ácido
úrico foi utilizada para calcular o limite de detecção do ensaio tendo sido
encontrado um valor igual a 0,071 mg/dL, equivalente à média de 20
ensaios mais dois desvios padrão.
Utilizando-se a absorbância do padrão como parâmetro verificou-se que
o limite de detecção fotométrica é 0,034 mg/dL, correspondendo a uma
absorbância igual a 0,001.
Efeitos da diluição da matriz .
Duas amostras com valores
iguais a 13,7 e 15,2 mg/dL foram utilizadas para avaliar a resposta do
sistema nas diluições da matriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usando
fatores de diluição que variaram de 2 a 8 foram encontradas
recuperações entre 91 e 103%.
Significado clínico . Numerosas doenças, condições fisiológicas,
alterações bioquímicas, fatores sociais e ambientais estão associados a
elevações na concentração do urato plasmático. Entre as etiologias da
hiperuricemia estão: insuficiência renal, cetoacidose, excesso de lactato,
uso de diuréticos e em todas as patologias em que a destruição de
nucleoproteínas está aumentada. O aumento de urato está positivamente
relacionado à hiperlipidemia, obesidade, aterosclerose, diabetes mellitus
e hipertensão, embora os mecanismos destas alterações ainda não
sejam bem compreendidos.
A gota, manifestação clínica da hiperuricemia, é classificada como
primária, secundária ou idiopática. É importante lembrar que a gota
secundária é uma complicação pouco comum quando relacionada à
frequência da hiperuricemia. É importante mencionar que a colchicina,
utilizada nos casos de gota aguda, não modifica os valores do ácido
úrico.
São pouco freqüentes as causas da hipouricemia ocorrendo na síndrome
de Fanconi, doença de Wilson, acromegalia, anemia perniciosa e
doenças malignas como linfoma de Hodgkin e carcinoma broncogênico.
Observações
1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são fatores
fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção de resultados
corretos.
04 Português - Ref.: 73
1. Duncan PH, Gochman N, Cooper T, Smith E, Sayze D. Clin Chem
1982;28:284-290.
2. Elin RJ, Johnson E, Chesler R. Clin Chem 1982;28:2089.
3. Inmetro - Boas Práticas de Laboratório Clínico e Listas de Verificação
para Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro, 1997.
4. Kabasakalian P, Kalliney S, Westcott A. Clin Chem 1973; 19:522.
5. Kageyama N. Clin Chim Acta 1971;31:421.
6. Tonks DB. Quality Control in Clinical Laboratories, Warner-Chilcott
Laboratories, Diagnostic Reagents Division, Scarborough, Canada,
1972.
7. Trivedi RC, Rebar L, Berta E, Stong L. Clin Chem 1978; 24:1908.
8. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem 1981;27:493501.
9. Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular,
B a s e d e D a t o s d e Va r i a c i ó n B i o l ó g i c a . D i s p o n í v e l
em:<http://www.seqc.es/ar ticle/ar ticleview/330/1/170>
(acesso em 04/2006).
10. Basques JC. Especificações da Qualidade Analítica. Labtest
Diagnóstica 2005.
11.Ferraz MHC, Delgado RB. Valores de Referência para Exames
Laboratoriais. In: Leão E, Corrêa EJ, Viana MB, Mota JAC (Ed).
Pediatria Ambulatorial. 3a. edição Belo Horizonte: Coopmed, 1988:
837-848.
12. Labtest: Dados de arquivo.
Apresentação
Produto
Referência
Conteúdo
1
73-4/30
Ácido Úrico
Liquiform
2
1
73-2/100
2
4 x 24 mL
4 x 6 mL
1 x 5 mL
2 x 80 mL
2 x 20 mL
1 x 5 mL
Estão disponíveis aplicações para sistemas automáticos e semiautomáticos.
O número de testes em aplicações automáticas depende dos
parâmetros de programação.
Informações ao consumidor
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especificações até a data de expiração indicada nos rótulos desde que os
cuidados de utilização e armazenamento indicados nos rótulos e nestas
instruções sejam seguidos corretamente.
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Ref.: 170309
05 Português - Ref.: 73
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Contenido suficiente para < n > tests
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Risco biológico
Riesgo biológico
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Material Calibrador
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Tóxico
Tóxico
Poison
Material Calibrador
Material Calibrador
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Reagente
Reactivo
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Temperature limitation (store at)
Fabricado por
Elaborado por
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Denominación de lote
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Consultar instrucciones de uso
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Control
Control
Número do catálogo
Número de catálogo
Catalog Number
Controle negativo
Control negativo
Negative control
Adições ou alterações significativas
Cambios o suplementos significativos
Significant additions or changes
Controle positivo
Control positivo
Positive control
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Dispositivo de diagnóstico in vitro
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Controle
Control
Control
Liofilizado
Liofilizado
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Corrosivo
Corrosivo
Corrosive
Ref.: 170309
06 Português - Ref.: 73
Instruções de Uso
ALBUMINA
Cat. 19
ANVISA 10009010025
FINALIDADE
Sistema para a determinação da albumina em amostras de
soro por reação de ponto final.
Somente para uso diagnóstico in vitro.
PRINCÍPIO
A albumina tem a propriedade de se ligar à uma grande
variedade de ânions orgânicos e moléculas complexas de
corantes.
O sistema de medição se baseia no desvio do pico de
absortividade máxima de um corante complexo (verde de
bromocresol) quando este se liga à albumina. A cor formada é
medida colorimetricamente entre 620 e 640 nm, sendo
proporcional à quantidade de albumina na amostra até a
concentração de 6,0 g/dL.
CARACTERÍSTICAS DO SISTEMA
Os métodos mais comumente utilizados para a dosagem da
albumina se baseiam na ligação com corantes. Esta ligação
que promove um desvio do pico de absortividade do corante,
permite que a cor resultante possa ser medida
colorimetricamente na presença de excesso do corante. A alta
afinidade de ligação da albumina permite que todas as suas
moléculas presentes na amostra participem da reação. O
sistema contém um detergente não iônico que reduz a
absorbância do branco, previne o aparecimento de turvação e
aumenta a linearidade.
Vários corantes como o metilorange, HABA, verde de
bromocresol (VBC) e púrpura de bromocresol (PBC) têm sido
utilizados na dosagem da albumina sérica, mas o VBC é o
reagente mais utilizado tendo inclusive sido recomendado pela
3
AACC . Este também tem sido o método de escolha dos
laboratórios, pois foi utilizado por 60% dos participantes do
programa de proficiência do Colégio Americano de
Patologistas no ano de 2002.
O verde de bromocresol possui especificidade para a albumina
e não sofre interferência de valores elevados da bilirrubina e
hemoglobina, permitindo também que a interferência de
valores elevados dos triglicérides possa ser corrigida
utilizando o branco da amostra.
O método tem excelente correlação com o fracionamento
eletroforético em acetato de celulose e é facilmente aplicável à
maioria dos analisadores semi-automáticos e automáticos
capazes de medir uma reação de ponto final entre 625 e
640 nm.
METODOLOGIA
Verde de Bromocresol.
REAGENTES
1. Reagente de Cor - Armazenar entre 2 - 8 ºC.
Contém tampão 60 mmol/L, pH 3,8; verde de bromocresol
300 mmol/L e Brij 35 ³ 6,0 mmol/L.
2. Padrão 3,8 g/dL - Armazenar entre 2 - 8 ºC.
Contém 3,8 g/dL de albumina bovina e azida sódica
0,1%.
Armazenar bem vedado para evitar evaporação.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nas
condições indicadas, são estáveis até a data de expiração
impressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estão
sujeitos a contaminações de natureza química e microbiana
que podem provocar redução da estabilidade.
PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS
Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na
manipulação do reagente.
O padrão contém azida sódica que é tóxica. Deve-se tomar
cuidado para evitar a ingestão e no caso de contato com os
olhos, deve-se lavar imediatamente com grande quantidade
de água e procurar auxílio médico. A azida pode formar
compostos altamente explosivos com tubulações de chumbo e
cobre. Portanto, utilizar grandes volumes de água para
descartar o reagente.
Um forte indício de deterioração é indicado por uma
absorbância maior que 0,300 quando o Reagente de Cor é
medido em 630 nm contra água.
MATERIAIS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOS
Fotômetro capaz de medir, com exatidão, a absorbância entre
600 e 640 nm.
Pipetas para medir amostras e reagentes.
Cronômetro.
AMOSTRA
Usar soro. A albumina é estável no soro 3 dias entre 2 - 8 ºC e
7 dias a 10 ºC negativos. Não usar plasma.
Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP)
que estabeleça procedimentos adequados para colheita,
preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos que
os erros devidos à amostra podem ser muito maiores que os
erros ocorridos durante o procedimento analítico.
Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras
de sangue não transmitem infecções, todas elas devem ser
consideradas como potencialmente infectantes. Portanto, ao
manuseá-las deve-se seguir as normas estabelecidas para
biossegurança.
Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimos
aplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteção
ambiental.
INTERFERÊNCIAS
Valores de bilirrubina até 38 mg/dL, hemoglobina até
180 mg/dL e triglicérides até 250 mg/dL não produzem
interferências significativas.
Valores de triglicérides maiores que 250 mg/dL produzem
interferências positivas que podem ser minimizadas utilizando
o branco de amostra.
Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina em
uma amostra hemolisada, pode-se proceder do seguinte
modo: Diluir 0,05 mL da amostra em 2,0 mL de NaCl
150 mmol/L (0,85%) e medir a absorbância em 405 ou 415 nm
acertando o zero com água deionizada ou destilada.
Hemoglobina (mg/dL) @ Absorbância405 X 601
Hemoglobina (mg/dL) @ Absorbância415 X 467
Minimização da Ação de Interferentes
Branco da amostra: Misturar 1,0 mL de NaCl 150 mmol/L
(0,85%) com 0,01 mL da amostra. Medir a absorbância em
630 nm, acertando o zero com água deionizada ou destilada.
Subtrair a absorbância assim obtida da absorbância do teste e
calcular a concentração. Este sistema de correção é aplicável
apenas aos casos em que a amostra produz interferência
fotométrica.
Exemplo:
Influências Pré- Analíticas
Em pacientes com depressão e pessoas obesas, o valor de
albumina tende a ser mais baixo.
O uso de torniquete por mais de 3 minutos provoca o aumento
do valor da albumina.
Plasmas obtidos com heparina de lítio e oxalato de potássio
combinado com fluoreto de sódio fornecem resultados
falsamente diminuídos.
Albumina (g/dL) = 0,242 x 12,6 = 3,0
Branco
Teste
Padrão
1,0 mL
1,0 mL
1,0 mL
Amostra
----
0,01 mL
----
Padrão (nº 2)
----
----
0,01 mL
Misturar e após 2 minutos, no máximo 10 minutos, determinar
as absorbâncias do teste e padrão em 630 nm ou filtro
vermelho (600 a 640) acertando o zero com o branco.
O procedimento sugerido para a medição é adequado para
fotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igual
ou menor que 1,0 mL. Deve ser feita uma verificação da
necessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado.
Os volumes de amostra e reagente podem ser modificados
proporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do teste
e o procedimento de cálculo se mantém inalterado. Em caso de
redução dos volumes é fundamental que se observe o volume
mínimo necessário para a leitura fotométrica. Volumes da
amostra menores que 0,01 mL são críticos em aplicações
manuais e devem ser usados com cautela porque aumentam a
imprecisão da medição.
CÁLCULOS
Absorbância do teste
Albumina (g/dL) =
x 3,8
Absorbância do padrão
Exemplo:
CALIBRAÇÃO
O padrão é rastreável ao Certified Reference Material CRM (BCR) 470 do Institute for Reference Materials and
Measurements/International Federation of Clinical Chemistry
(IRMM/IFCC).
Calibrações Manuais
Obter semanalmente o fator de calibração.
Sistemas Automáticos
Branco de reagentes: água ou solução de NaCl
150 mmol/L (0,85%);
Padrões: usar calibradores protéicos. As concentrações
de albumina nos calibradores da linha Calibra da Labtest
são rastreáveis ao CRM (BCR) 470 do IRMM/IFCC.
"
"
Intervalo de calibrações
Deve-se recalibrar o sistema nas seguintes situações:
Calibração de 2 ou 3 pontos ao mudar de lote;
Calibração de 2 ou 3 pontos quando o controle interno
da qualidade indicar.
"
"
LINEARIDADE
O resultado da medição é linear até 6,0 g/dL. Para valores
maiores, diluir a amostra com NaCl 150 mmol/L (0,85%),
realizar nova medição e multiplicar o resultado obtido pelo fator
de diluição. Diluir a amostra de tal modo que o valor encontrado
se situe entre 3,0 e 4,5 g/dL. Sugerimos a verificação da
linearidade metodológica e fotométrica, no mínimo
semestralmente, utilizando amostras com valores até 6,0 g/dL.
CONTROLE INTERNO DA QUALIDADE
O laboratório deve manter um programa de controle interno da
qualidade que defina claramente os regulamentos aplicáveis,
objetivos, procedimentos, critérios para especificações da
qualidade e limites de tolerância, ações corretivas e registro
das atividades. Materiais de controle devem ser utilizados para
avaliar a imprecisão e desvios da calibração. Sugere-se que as
especificações para o coeficiente de variação e o erro total
sejam baseadas nos componentes da variação biológica
5, 6,7
(VB)
.
Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas da linha
Qualitol da Labtest para controle interno da qualidade em
ensaios de química clínica.
Absorbância do teste = 0,242
Absorbância do padrão = 0,302
0,242
Albumina (g/dL) =
= 12,6
0,302
"
PROCEDIMENTO
Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:
Reagente de Cor (nº 1)
3,8
Fator =
x 3,8= 3,0
0,302
Devido a grande reprodutibilidade que pode ser obtida com a
metodologia, pode-se utilizar o método do fator.
3,8
Fator de Calibração =
Absorbância do padrão
Albumina (g/dL) = Absorbância do teste x Fator
INTERVALO DE REFERÊNCIA
Os intervalos devem ser usados apenas como orientação.
Recomenda-se que cada laboratório estabeleça, na
população atendida, seus próprios intervalos de referência.
8
Crianças e Adolescentes (g/dL)
1 a 30 dias
2,6 a 4,3
31 a 182 dias
2,8 a 4,6
183 a 365 dias
2,8 a 4,8
1 a 18 anos
2,9 a 4,7
Adultos: 3,5 a 5,5 g/dL
Conversão: Unidades Convencionais (g/dL) x 144,9 =
Unidades SI (µmol/L)
6
CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO
Exatidão
Em duas amostras com concentrações de albumina iguais a
2,7 e 4,2 g/dL foram adicionadas quantidades diferentes do
analito, obtendo-se recuperações entre 97 e 103%. O erro
sistemático proporcional médio obtido em um valor de 3,5 g/dL
foi igual a 0,04 g/dL ou 1,1%.
Especificidade
O método proposto foi comparado com um método similar
utilizando 80 amostras com valores situados entre
2,5 e 5,3 g/dL. A comparação resultou na equação da
regressão: y = 0,09 + 0,98x e um coeficiente de correlação (r)
igual a 0,994. O erro sistemático total (constante e
proporcional) verificado no nível de decisão (3,5 g/dL) foi igual
a 0,02 g/dL ou 0,6%. Como as amostras foram selecionadas
aleatoriamente em pacientes de ambulatório e pacientes
hospitalizados, pode-se inferir que o método tem uma
especificidade metodológica adequada.
Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio
N
MÉDIA
DP
CV%
Amostra 1
20
3,5
0,03
0,9
Amostra 2
20
5,2
0,06
1,2
Reprodutibilidade - Imprecisão total
N
MÉDIA
DP
CV%
Amostra 1
20
3,4
0,07
2,0
Amostra 2
20
5,1
0,06
1,2
Sensibilidade metodológica
Uma amostra protéica não contendo albumina foi utilizada
para calcular o limite de detecção do ensaio tendo sido
encontrado um valor igual a 0,015 g/dL, equivalente a média de
20 ensaios mais dois desvios padrão. Utilizando-se a
absorbância do padrão como parâmetro, verificou-se que
o limite de detecção fotométrica é de 0,013 g/dL,
correspondendo a uma absorbância igual a 0,001.
Efeitos da diluição da matriz
Duas amostras com valores iguais a 6,3 e 6,7 g/dL foram
utilizadas para avaliar a resposta do sistema nas diluições da
matriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usando fatores de
diluição que variaram de 2 a 8 foram encontradas
recuperações entre 95 e 103%.
SIGNIFICADO CLÍNICO
A albumina é a proteína mais importante do plasma humano,
representando 40 a 60% do total de proteína. Os níveis
plasmáticos de albumina, devido à sua relação com o aporte
de proteína e à produção no fígado, são freqüentemente
usados como parâmetro para avaliação do estado nutricional e
função hepática.
Diminuições da albumina ocorrem na cirrose e outras doenças
hepáticas incluindo o alcoolismo crônico, na gravidez
associado ao uso de contraceptivos orais, em muitas doenças
crônicas incluindo neoplasias, síndrome nefrótica,
enteropatias com perda protéica (doença de Chron, colite
ulcerativa), doenças inflamatórias como as doenças
autoimunes, imobilização prolongada, falência cardíaca e
outros estados catabólicos crônicos. A elevação da albumina
sérica é encontrada somente na desidratação.
OBSERVAÇÕES
1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são
fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e
obtenção de resultados corretos.
2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidade
adequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes e
usar nas medições, deve ter resistividade ³1 megaohm ou
condutividade £1 microsiemens e concentração de silicatos
<0,1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a água
pode ser do tipo III, com resistividade ³0,1 megaohms ou
condutividade £10 microsiemens. No enxágüe final utilizar
água tipo II. Quando a coluna deionizadora está com sua
capacidade saturada ocorre a produção de água alcalina com
liberação de vários íons, silicatos e substâncias com grande
poder de oxidação ou redução, que deterioram os reagentes
em poucos dias ou mesmo horas alterando os resultados de
modo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um
programa de controle da qualidade da água.
3. Para uma revisão das fontes medicamentosas de
interferência nos resultados e na metodologia sugere-se
consultar: <www.fxol.org/>.
REFERÊNCIAS
1. Bartholomew RJ, Delaney AM. Proc Austral Assoc Clin
Biochem 1966;1:214.
2. Basques JCA, Cabral GL, Cruz RS. Com II Congr Bras Anal
Clin. Janeiro, 1972.
3. Tonks DB. Quality Control in Clinical Laboratories, WamerChilcott Laboratories, Diagnostic Reagents Division,
Scarborough, Canada, 1972.
4. Peters T, Biamont GT, Doumas BT. Albumin in serum. Em
Faulkner WR. Meites S, eds. Selected methods of clinical
chemistry, volume 9, Washington: AACC Press, 1982:319.
5. Westgard JO, Groth T. Clin Chem 1981;27:493-501.
6. Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología
Molecular, Base de Datos de Variación Biológica.
Disponívelem:<http://www.seqc.es/article/articleview/330/1
/170> (acesso em 04/2006).
7. Basques JC. Especificações da Qualidade Analítica. Labtest
Diagnóstica 2005.
8. Soldin SJ, Brugnara C, Wong EC: Pediatric Reference
Ranges, 5a. edição, Washington: AACC Press, 2005:5-6.
9. Labtest: Dados de Arquivo.
APRESENTAÇÃO
Catálogo
Reagente de Cor
Padrão
19-100
19-250
1 x 100 mL
1 x 1 mL
1 x 250 mL
1 x 1 mL
Estão disponíveis aplicações para sistemas automáticos.
O número de testes em aplicações automáticas depende
dos parâmetros de programação.
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dentro das especificações até a data de expiração indicada
nos rótulos, desde que os cuidados de utilização e
armazenamento indicados nos rótulos e nestas instruções
sejam seguidos corretamente.
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Revisão: Dezembro, 2005.
Ref.: 181206
Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.
Reprodução sob prévia autorização
Instruções de Uso
COLESTEROL HDL
Cat.13
ANVISA 10009010026
FINALIDADE
Sistema para precipitação seletiva das lipoproteínas de baixa e
muito baixa densidade (LDL e VLDL) e determinação do
Colesterol HDL no sobrenadante, com reação de ponto final.
Somente para uso diagnóstico in vitro.
PRINCÍPIO
As lipoproteínas de muita baixa densidade (VLDL) e as
lipoproteínas de baixa densidade (LDL) são quantitativamente
precipitadas e após centrifugação, o colesterol ligado às
lipoproteínas de alta densidade (Colesterol HDL) é
determinado no sobrenadante.
CARACTERÍSTICAS DO SISTEMA
Na seleção de um sistema para dosar o Colesterol HDL, a
Labtest optou pelo ácido fosfotúngstico e cloreto de magnésio
que, precipitando seletiva e quantitativamente as VLDL e LDL
permitem a obtenção de resultados comparáveis ao do método
de referência.
Após centrifugação o Colesterol HDL é determinado no
sobrenadante utilizando o sistema enzimático Colesterol
Liquiform - Labtest (Cat. 76).
O sistema de medida colorimétrica é facilmente adaptável à
maioria dos analisadores automáticos capazes de medir uma
reação de ponto final em 500 nm.
METODOLOGIA
Labtest
REAGENTES
1. Precipitante - Armazenar entre 2 - 8 °C.
Contém ácido fosfotúngstico 1,5 mmol/L e cloreto de magnésio
54 mmol/L.
2. Padrão 20 mg/dL - Armazenar entre 2 - 8 °C.
Contém Colesterol 0,52 mmol/L. Armazenar bem vedado para
evitar evaporação.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nas
condições indicadas, são estáveis até a data de expiração
impressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estão
sujeitos à contaminações de natureza química e microbiana
que podem provocar redução da estabilidade.
PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS
Não utilizar o Reagente 1 - Colesterol Liquiform - Labtest
(Cat.76) quando sua absorbância medida contra a água em
500 nm for igual ou maior que 0,300, ou quando mostrar-se
turvo ou com sinais de contaminação.
Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na
manipulação do reagente.
MATERIAL NECESSÁRIO E NÃO FORNECIDO
Banho-maria mantido à temperatura constante (37 °C).
Fotômetro capaz de medir, com exatidão, a absorbância entre
490 e 540 nm.
Pipetas para medir amostras e reagente.
Cronômetro.
Centrífuga com capacidade superior a 3500 rpm.
Reagente para determinação de colesterol.
INFLUÊNCIAS PRÉ-ANALÍTICAS
As concentrações do colesterol HDL medidas em um mesmo
indivíduo e em diferentes ocasiões podem flutuar
consideravelmente devido as variações biológicas e também
às variações do método analítico. As concentrações no sangue
são fortemente influenciadas por fatores tais como dieta
recente, ingestão de álcool, variações do peso corporal,
atividades físicas e hábito de fumar. Os hormônios e outras
medicações também produzem variações na concentração do
colesterol HDL.
Considera-se que a variação biológica está em torno de 7,5%.
Assim, em uma série de repetições da dosagem em um
mesmo indivíduo, dois terços dos resultados estarão entre
±7,5% do valor médio. Portanto, a variação biológica se
constitui no fator mais importante da variabilidade total do
colesterol HDL. Os efeitos da variação biológica podem ser
controlados até certo ponto através da padronização das
condições de preparo do paciente e da colheita da amostra,
mas o colesterol HDL não pode ser estimado com confiança
através de um ensaio de uma única amostra. Várias amostras
devem ser obtidas e a média dos resultados pode ser
considerada como a concentração usual do colesterol HDL ou,
mais exatamente, pode ser considerada a faixa usual de
resultados para o indivíduo.
AMOSTRA
Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP)
que estabeleça procedimentos adequados para colheita,
preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos que
os erros devidos à amostra podem ser muito maiores que os
erros ocorridos durante o procedimento analítico.
Usar soro. O analito é estável 3 dias entre 2 - 8 °C. Obter a
amostra após jejum de pelo menos 12 horas. Não utilizar
amostras fortemente hemolisadas.
Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras
de sangue não transmitem infecções, todas elas devem ser
consideradas como potencialmente infectantes. Portanto, ao
manuseá-las, deve-se seguir as normas estabelecidas para
biossegurança.
Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimos
aplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteção
ambiental.
INTERFERÊNCIAS
Valores de bilirrubina até 5 mg/dL, hemoglobina até
180 mg/dL e triglicérides até 750 mg/dL não produzem
interferências significativas.
Valores de bilirrubina acima de 5 mg/dL produzem resultados
falsamente diminuídos.
Valores de triglicérides acima de 750 mg/dL produzem
resultados falsamente elevados.
Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina em
uma amostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo:
diluir 0,05 mL da amostra em 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L
(0,85%) e medir a absorbância em 405 ou 415 nm acertando o
zero com água deionizada ou destilada.
Hemoglobina(mg/dL) @ Absorbância405 x 601
Hemoglobina(mg/dL) @ Absorbância415 x 467
LIMITAÇÕES DO MÉTODO
Manter sempre a relação Amostra/Precipitante igual a 1:1.
Após a centrifugação, remover o sobrenadante límpido dentro
de 15 minutos para evitar resultados falsamente elevados.
Amostras lipêmicas e ocasionalmente amostras não lipêmicas
podem apresentar o sobrenadante turvo. Neste caso diluir a
amostra 1:2 com NaCI 150 mmol/L e repetir a precipitação.
Multiplicar o resultado final por 2. Caso o sobrenadante
permaneça ainda turvo a amostra não pode ser utilizada para
determinar o colesterol HDL.
Algumas amostras, principalmente lipêmicas, podem
apresentar o sobrenadante límpido com uma camada na sua
superfície que não deve ser pipetado, para evitar resultados
falsamente elevados.
CÁLCULOS
Devido a diluição 1:2 aplicada às amostras durante o
procedimento de precipitação das VLDL e LDL, o valor do
Padrão para cálculo dos resultados deve ser corrigido para
40 mg/dL.
Absorbância do Teste
Colesterol HDL (mg/dL) =
x 40
Absorbância do Padrão
Exemplo
Absorbância do Teste = 0,290
Absorbância do Padrão = 0,320
0,290
Colesterol HDL (mg/dL) =
x 40 = 36
0,320
PROCEDIMENTO
Ver limitações do método.
Devido a grande reprodutibilidade que pode ser obtida com a
metodologia, pode-se utilizar o método do fator.
Precipitação das VLDL e LDL
Em um tubo 12 x 75 colocar:
Fator de Calibração =
Soro
Precipitante
40
Absorbância do Padrão
0,25 mL
0,25 mL
Colesterol HDL(mg/dL) = Absorbância do Teste x Fator
Agitar vigorosamente durante 30 segundos. A agitação
sugerida é fundamental para obtenção de resultados
consistentes. Centrifugar a 3500 rpm por pelo menos 15
minutos para obter um sobrenadante límpido. Pipetar o
sobrenadante límpido imediatamente após a centrifugação,
tomando o cuidado para não ressuspender o precipitado, a fim
de evitar resultados falsamente elevados.
Colorimetria
Ver observações 1, 2 e 3.
Utilizar com o Reagente 1 - Colesterol Liquiform - Labtest
(Cat. 76).
Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:
Padrão
Branco
Teste
Sobrenadante
----
0,1 mL
----
Padrão (nº2)
----
----
0,1 mL
Reagente 1
1,0 mL
1,0 mL
1,0 mL
o
Misturar e colocar no banho-maria a 37 C durante
10 minutos. O nível da água no banho deve ser superior ao
nível do reagente nos tubos de ensaio. Determinar as
absorbâncias do teste e padrão em 500 nm ou filtro verde
(490 a 540) acertando o zero com o branco. A cor é estável por
60 minutos.
O procedimento sugerido para a medição é adequado para
fotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igual
ou menor que 1,0 mL. Deve ser feita uma verificação da
necessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado.
Os volumes de amostra e reagente podem ser modificados
proporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do teste
e o procedimento de cálculos se mantém inalterado. Em caso
de redução dos volumes é fundamental que se observe o
volume mínimo necessário para a leitura fotométrica. Volumes
da amostra menores que 0,01 mL são críticos em aplicações
manuais e devem ser usados com cautela porque aumentam a
imprecisão da medição.
Exemplo
40
Fator =
= 125
0,320
Colesterol HDL (mg/dL) = 0,290 x 125 = 36
RASTREABILIDADE DO SISTEMA
A calibração do sistema é rastreável ao Standard Reference
Material (SRM) 911 do National Instituite of Standards and
Technology (NIST).
LINEARIDADE
O resultado da medição é linear até 200 mg/dL. Quando for
obtido um valor igual ou maior que 200 mg/dL, diluir a amostra
1:2 com NaCl 150 mmol/L (0,85%), realizar nova medição e
multiplicar o resultado pelo fator de diluição.
CONTROLE INTERNO DA QUALIDADE
O laboratório deve manter um programa de controle interno da
qualidade que defina claramente os objetivos, procedimentos,
normas, critérios para limites de tolerância, ações corretivas e
registro das atividades. Ao mesmo tempo deve-se manter um
sistema definido para monitorizar a variabilidade analítica que
ocorre em todo o sistema de medição. Portanto, o uso de
controles para avaliar a imprecisão e desvios de calibração
deve ser prática rotineira no laboratório clínico. Sugere-se usar
um controle com um valor situado na faixa de referência ou no
nível de decisão e outro controle com um valor em outra faixa
de significância clínica. Deve-se criar uma meta de estado de
controle para que o erro de bias seja £ ± 5,0%, e o erro total seja
£ 13% e monitorar continuamente o estado de controle através
8
do sistema de regras de controle .
Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas da Linha
Qualitrol - Labtest, para controle interno da qualidade em
ensaios de química clínica.
VALORES DESEJÁVEIS OU RECOMENDADOS
Estes valores devem ser usados apenas como orientação.
Recomenda-se que cada laboratório estabeleça, na
população atendida, sua própria faixa de valores de referência.
Os valores desejáveis ou recomendados substituem os
valores de referência e são determinados a partir de dados
epidemiológicos, calculados estatisticamente, que relacionam
os níveis do colesterol com a prevalência de doença coronaria
isquêmica (DCI).
Classificação ATP III de Colesterol Total, LDL e HDL
(mg/dL):
10
Crianças e Adolescentes
Colesterol Total
Idade: 2 a 19 anos:
Desejável: < 170 mg/dL
Limítrofe: 170 a 199 mg/dL
Elevado: ³ 200 mg/dL
Colesterol LDL
Idade: 2 a 19 anos:
Desejável: <110 mg/dL
Limítrofe: 110 a 129 mg/dL
Elevado: ³ 130 mg/dL
Colesterol HDL
Idade: < 10 anos:
Desejável: ³ 40 mg/dL
10 a 19 anos: Desejável: ³ 35 mg/dL
11
Adultos
Colesterol Total
Desejável: < 200
Limiar elevado: 200-239
Elevado: ³ 240
Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio
N
MÉDIA
DP
CV(%)
Amostra 1
20
40
0,60
1,5
Amostra 2
20
59
0,49
0,8
Reprodutibilidade - Imprecisão total
N
MÉDIA
DP
CV(%)
Amostra 1
20
40
0,83
2,0
Amostra 2
20
58
0,99
1,7
Sensibilidade metodológica
Uma amostra protéica não contendo colesterol HDL foi
utilizada para calcular o limite de detecção do ensaio tendo
sido encontrado um valor igual a 0,40 mg/dL, equivalente à
média de 20 ensaios mais dois desvios padrão. Utilizando-se a
absorbância do padrão como parâmetro, o limite de detecção
fotométrica é 0,12 mg/dL, correspondendo a uma absorbância
igual a 0,001.
Efeitos da diluição da matriz
Uma amostra com valor igual a 92 mg/dL foi utilizada para
avaliar a resposta do sistema nas diluições da matriz com NaCl
150 mmol/L (0,85%). Usando fatores de diluição que variaram
de 1,2 a 2,0 encontraram-se recuperações entre 93 e 103%.
SIGNIFICADO CLÍNICO
Não há dúvida de que o colesterol é um fator de risco para DCI
e que ele marcha - junto com o fumo, hipertensão e intolerância
à glicose - como um dos quatro grandes fatores de DCI.
Estudos prospectivos e retrospectivos não deixam dúvidas da
existência de uma interrelação curvilinear entre os níveis de
colesterol sérico, mais especificamente LDL e VLDL, e a
incidência de DCI.
Colesterol LDL
Ótimo: < 100
Limiar ótimo: 100-129
Limiar elevado: 130-159
Elevado: 160-189
Muito elevado: ³ 190
Em 1977 ficou demonstrado que o Colesterol HDL tem um
efeito protetor contra a DCI. Os estudos de Framinghan
revelaram que os níveis do Colesterol HDL são inversamente
proporcionais à prevalência de DCI.
Colesterol HDL
Baixo: < 40
Elevado (desejável): ³ 60
9
CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO
Exatidão
Em duas amostras com concentrações de colesterol HDL
iguais a 28 e 54 mg/dL foram adicionadas quantidades
diferentes do analito, obtendo-se recuperações entre 95 e
100%. O erro sistemático proporcional médio obtido em um
valor de 60 mg/dL foi igual a 1,2 mg/dL ou 2,0%.
Especificidade
O método proposto foi comparado com um método similar
utilizando 80 amostras com valores situados entre 7 e
86 mg/dL. A comparação resultou na equação da regressão:
y = 1,337 + 0,932x e um coeficiente de correlação (r) igual a
0,993. O erro sistemático total (constante e proporcional)
verificado no nível de decisão (60 mg/dL) foi igual a
2,74 mg/dL ou 4,5%. Como as amostras foram selecionadas
aleatoriamente em pacientes de ambulatório e pacientes
hospitalizados, pode-se inferir que o método tem uma
especificidade metodológica adequada.
Está bem estabelecido que níveis elevados de Colesterol LDL
estão associados com risco aumentado de DCI. Também não
há dúvida de que tanto o Colesterol Total e as frações LDL e
VLDL podem ser diminuídas com dieta ou medicamento.
A redução de 1% no valor do Colesterol Total diminui a
prevalência de DCI em aproximadamente 2%.
As concentrações do Colesterol Total e do Colesterol HDL
dependem de metabolismos distintos e não se deve fazer
qualquer tentativa de buscar correlação entre seus níveis de
concentração.
COMO CALCULAR A CONCENTRAÇÃO DO COLESTEROL
VLDL E LDL
A concentração do Colesterol VLDL e LDL pode ser calculada
utilizando a equação de Friedewald, que é exata para
amostras cujas concentrações de triglicérides não
ultrapassem 400 mg/dL e não pertençam a pacientes
portadores de lipoproteinemia do Tipo III.
Equação de Friedewald
Colesterol VLDL = Triglicérides / 5
Colesterol LDL = Colesterol Total - (HDL + VLDL)
OBSERVAÇÕES
1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são
fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e
obtenção de resultados corretos.
APRESENTAÇÃO
Catálogo
Precipitante
Padrão
2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidade
adequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes e
usar nas medições deve ter resistividade ³ 1 megaohm ou
condutividade £ 1 microsiemens e concentração de silicatos
< 0,1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a água
pode ser do tipo III, com resistividade ³ 0,1 megaohms ou
condutividade £ 10 microsiemens. No enxágüe final utilizar
água tipo II. Quando a coluna deionizadora está com sua
capacidade saturada ocorre a produção de água alcalina com
liberação de vários íons, silicatos e substâncias com grande
poder de oxidação ou redução, que deterioram os reagentes
em poucos dias ou mesmo horas alterando os resultados de
modo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um
programa de controle da qualidade da água.
3. Para uma revisão das fontes medicamentosas de
interferência nos resultados e na metodologia sugere-se
consultar <www.fxol.org/>.
13-25
1 x 25 mL
1 x 5 mL
INFORMAÇÕES AO CONSUMIDOR
Termos e condições de garantia
A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produto
dentro das especificações até a data de expiração indicada
nos rótulos desde que os cuidados de utilização e
armazenamento indicados nos rótulos e nestas instruções
sejam seguidos corretamente.
Serviço de apoio ao cliente
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e-mail: [email protected]
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REFERÊNCIAS
1. III Diretrizes Brasileiras sobre Dislipidemias e Diretriz de
Prevenção da Aterosclerose. Sociedade Brasileira de
Cardiologia. Arq Bras Cardiol 2001;77(suppl III):1-48.
2. Tonks DB. Quality Control in Clinical Laboratories, WarnerChilcott Laboratories, Diagnostic Reagents Division,
Scarborough, Canada, 1972.
3. Virella MFL, Stone P, Ellis S, Colwell G. Clin Chem 1977;
23:882-884.
4. Warnick RG, Naguyent T, Albers AA. Clin Chem 1985; 2:217222.
5. Warnick RJ. Handbook of lipoprotein testing. Washington:
AACC Press, 1997.
6. Warnick RG, Wood PD. Clin Chem 1995; 41: 1427-33.
7. NCEP - Detection, evaluation and treatment of high blood
cholesterol in adults (Adult Treatment Panel III). NIH
Publication 02-5215, Bethesda, MD, 2002.
8. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Growth T.1981;27:493501.
9. Labtest. Dados de Arquivo.
10. Leite PF, Martinez TLR, Halpern A, Cendoroglo MS,
Novazzi JP, Fonseca FAH, Dias JCA. Risco
cardiovascular: fatores metabólicos e nutricionais:
diagnóstico e tratamento. São Paulo: Loyola, 1994. p.56.
11. Executive Summary of the Third report of the National
Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on
Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood
Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III). JAMA
2001;285:2486-97.
Revisão: Abril, 2004.
Ref.: 300606
Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.
Reprodução sob prévia autorização
Instruções de Uso
COLESTEROL
Liquiform
O sistema é facilmente aplicável em analisadores automáticos
e semi-automáticos capazes de medir uma reação de ponto
final em 500 nm e pode ser usado para medição do colesterol
HDL após precipitação seletiva das LDL e VLDL.
Cat. 76
ANVISA 10009010068
METODOLOGIA
Enzimático-Trinder.
FINALIDADE
Sistema enzimático para a determinação do colesterol total em
amostras de soro, por reação de ponto final.
Somente para uso diagnóstico in vitro.
REAGENTES
1. Reagente 1 - Armazenar entre 2 - 8°C.
Contém tampão 50 mmol/L, pH 7,0; fenol 24 mmol/L; colato de
sódio 500 mmol/L; azida sódica 15 mmol/L; 4-aminoantipirina
500 mmol/L; colesterol esterase ³250 U/L, colesterol oxidase
³250 U/L e peroxidase ³1000 U/L .
PRINCÍPIO
O colesterol total é determinado de acordo com as seguintes
reações:
Colesterol
Ésteres do colesterol
Colesterol + Ácidos graxos
Esterase
Colesterol
Colesterol + O2
Colest-4-en-ona + H2O2
Oxidase
Peroxidase
2 H2O2 + Fenol + 4-Aminoantipirina
Antipirilquinonimina + 4 H2O
Os ésteres de colesterol são hidrolisados pela colesterol
esterase a colesterol livre e ácidos graxos. O colesterol livre é
oxidado pela colesterol oxidase a colest-4-en-ona e peróxido
de hidrogênio. Na presença de peroxidase e peróxido de
hidrogênio, o fenol e a 4-aminoantipirina são oxidados
formando a antipirilquinonimina que tem absortividade máxima
em 500 nm.
A intensidade da cor vermelha formada na reação final é
diretamente proporcional à concentração do colesterol na
amostra.
CARACTERÍSTICAS DO SISTEMA
Os valores elevados do colesterol, principalmente o
colesterol ligado às lipoproteínas de baixa densidade, são um
dos mais importantes fatores de risco para o desenvolvimento
da doença arterial coronariana. O National Cholesterol
6
Education Program (NCEP) recomenda que os sistemas de
medição do colesterol apresentem características de
desempenho capazes de atingir os requisitos de exatidão e
precisão necessários para que os resultados tenham utilidade
médica.
Os dados de exatidão, repetitividade e reprodutibilidade
obtidos com o sistema Colesterol Liquiform demonstram que o
método é capaz de fornecer resultados que superam as
exigências do NCEP, fazendo com que possa ser considerado
como bastante seguro para a medição confiável do colesterol
total nos níveis de decisão mais importantes. Adicionalmente,
a comparação entre as imprecisões encontradas na
repetitividade e na reprodutibilidade demonstra que o sistema
de medição é bastante robusto nas regiões de concentrações
significativas para uso clínico, indicando um desempenho
estável no dia a dia.
O sistema é composto de um único reagente pronto para uso,
com estabilidade que garante desempenho consistente em
sua forma líquida original e manutenção das condições ótimas
da reação.
Colesterol Liquiform possui um sistema clarificador de alta
eficiência que elimina as interferências positivas produzidas
por valores de triglicérides até 2600 mg/dL.
Para preservar o desempenho, o reagente deve permanecer
fora da geladeira somente o tempo necessário para se obter o
volume a ser utilizado. Evitar exposição à luz solar direta.
2. Padrão - 200 mg/dL - Armazenar entre 2 - 30°C.
Contém azida sódica 15 mmol/L. Após o manuseio sugere-se
armazenar bem vedado para evitar evaporação.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nas
condições indicadas, são estáveis até a data de expiração
impressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estão
sujeitos à contaminações de natureza química e microbiana
que podem provocar redução da estabilidade.
PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS
Não utilizar o Reagente 1 quando sua absorbância, medida
contra a água em 500 nm, for igual ou maior que 0,300 ou
quando mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.
Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na
manipulação do reagente. O Reagente 1 e o Padrão contém
azida sódica que é toxica. Deve-se tomar cuidado para evitar a
ingestão e no caso de contato com os olhos deve-se lavar
imediatamente com grande quantidade de água e procurar
auxílio médico. A azida pode formar compostos altamente
explosivos com tubulações de chumbo e cobre. Portanto,
utilizar grandes volumes de água para descartar o reagente.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nas
condições indicadas, são estáveis até a data de expiração
impressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estão
sujeitos à contaminações de natureza química e microbiana
que podem provocar redução da estabilidade.
MATERIAL NECESSÁRIO E NÃO FORNECIDO
Banho-maria mantido à temperatura constante (37°C).
Fotômetro capaz de medir, com exatidão, a absorbância entre
490 e 510 nm.
Pipetas para medir amostras e reagente.
Cronômetro.
INFLUÊNCIAS PRÉ-ANALÍTICAS
A postura durante a colheita da amostra deve ser padronizada
porque pode ter efeitos significativos nos resultados. Se as
amostras são obtidas com o paciente na posição sentada,
deve-se padronizar para que o indivíduo esteja sentado
durante 15 minutos e não mais que 30 minutos. Um
garroteamento maior que 1 minuto produz hemoconcentração,
o que pode aumentar os valores do colesterol em 5,0% após
2 minutos e 10,0 a 15,0% após 5 minutos. Portanto, é muito
importante obter a amostra de sangue após liberar o torniquete
devendo-se padronizar todo o procedimento da colheita.
A variação biológica do colesterol, decorrente da variação
também biológica das lipoproteínas transportadoras do
colesterol, é observada quando a dosagem do colesterol é
repetida em um mesmo laboratório no espaço mínimo de uma
semana. Ela ocorre independentemente do erro analítico e
pode variar entre 1,7 e 11,6% com uma média de 6,1% devido,
principalmente, à variação biológica da LDL que é a principal
lipoproteína transportadora de colesterol.
PROCEDIMENTO
Ver observações 1, 2 e 3.
Níveis elevados de ascorbato (vitamina C) produzem
interferências negativas por competição com o cromogênio na
reação da peroxidase. Se houver suspeita da presença de
ácido ascórbico deixar o soro em repouso durante 90 minutos
antes de iniciar a dosagem para minimizar a ação do
interferente.
Reagente 1
AMOSTRA
Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP)
que estabeleça procedimentos adequados para colheita,
preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos que
os erros devidos à amostra podem ser muito maiores que os
erros ocorridos durante o procedimento analítico.
De modo geral, a amostra de sangue pode ser obtida com ou
sem jejum, mas é altamente recomendável que todos os
ensaios dos lípides sanguíneos, incluindo o colesterol, sejam
realizados em amostras colhidas em jejum. As vantagens da
utilização de amostras colhidas em jejum são decorrentes da
padronização da colheita, pois permitem a realização da
determinação de outros lípides que requerem o jejum e
minimizam a interferência da lipemia pós prandial que está
freqüentemente presente em amostras obtidas sem o jejum.
Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:
Padrão
Branco
Teste
Amostra
--
0,01 mL
--
Padrão (N° 2)
--
--
0,01 mL
1,0 mL
1,0 mL
1,0 mL
Misturar e incubar em banho-maria a 37°C durante 10
minutos. O nível de água no banho deve ser superior ao nível
de reagentes nos tubos de ensaio. Determinar as
absorbâncias do teste e padrão em 500 nm ou filtro verde
(490 a 510), acertando o zero com o branco. A cor é estável por
60 minutos.
O procedimento sugerido para a medição é adequado para
fotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igual
ou menor que 1,0 mL. Deve ser feita uma verificação da
necessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado.
Os volumes de amostra e reagente podem ser modificados
proporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do teste
e o procedimento de cálculo se mantém inalterado. Em caso de
redução dos volumes é fundamental que se observe o volume
mínimo necessário para a leitura fotométrica. Volumes da
amostra menores que 0,01 mL são críticos em aplicações
manuais e devem ser usados com cautela porque aumentam a
imprecisão da medição.
CÁLCULOS
Usar soro. Anticoagulantes como citrato, oxalato ou EDTA
produzem resultados falsamente diminuídos. O analito é
6
estável 7 dias entre 2 - 8°C e 6 meses a 20°C negativos .
Homogeneizar bem as amostras lipêmicas antes de iniciar a
dosagem. Não utilizar amostras fortemente hemolisadas.
Absorbância do Teste
Colesterol (mg/dL) =
x 200
Absorbância do Padrão
Exemplo:
Como o volume de amostra é pequeno, deve-se pipetar com
cuidado para minimizar a imprecisão do sistema de medição.
Absorbância do Teste = 0,290
Absorbância do Padrão = 0,345
Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras
de sangue não transmitem infecções, todas elas devem ser
consideradas como potencialmente infectantes. Portanto, ao
manuseá-las, deve-se seguir as normas estabelecidas para
biossegurança.
Colesterol (mg/dL) =
Para descartar os reagentes e o material biológico, sugerimos
aplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteção
ambiental.
0,290
x 200 = 168
0,345
Devido a grande reprodutibilidade que pode ser obtida com a
metodologia, pode-se utilizar o método do fator.
200
Fator de Calibração =
Absorbância do Padrão
INTERFERÊNCIAS
Valores de bilirrubina até 5 mg/dL, hemoglobina até 180 mg/dL
e triglicérides até 2600 mg/dL não produzem interferências
significativas. Valores de bilirrubina entre 5 e 38 mg/dL
produzem resultados falsamente diminuídos proporcionais à
concentração da bilirrubina.
Colesterol (mg/dL) = Absorbância do Teste x Fator
Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina em
uma amostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo:
Diluir 0,05 mL da amostra em 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L
(0,85%) e medir a absorbância em 405 ou 415 nm acertando o
zero com água deionizada ou destilada.
Colesterol (mg/dL) = 0,290 x 580 = 168
Hemoglobina(mg/dL) @ Absorbância4 0 x5 601
Hemoglobina(mg/dL) @ Absorbância4 1 x5 467
Exemplo:
200
Fator =
= 580
0,345
CALIBRAÇÃO
Rastreabilidade do Sistema
O padrão é rastreável ao Standard Reference Material (SRM)
911 do National Institute of Standards and Technology (NIST).
Calibrações manuais
Obter o fator de calibração ao usar novo lote de reagentes
ou quando o controle interno da qualidade indicar.
"
Sistemas automáticos
Branco de reagentes: água deionizada ou destilada, ou
solução de cloreto de sódio 150 mmol/L (0,85%);
Padrões: usar calibradores protéicos. As concentrações
de Colesterol nos calibradores da linha Calibra Labtest
são rastreáveis ao SRM 1951 do NIST.
"
"
Intervalo de calibrações
Deve-se recalibrar o sistema nas seguintes situações:
Calibração de 2 ou 3 pontos ao mudar de lote;
Calibração de 2 ou 3 pontos quando o controle interno
da qualidade indicar.
"
"
LINEARIDADE
O resultado da medição é linear até 500 mg/dL. Quando for
obtido um valor igual ou maior que 500 mg/dL, diluir a amostra
com NaCl 150 mmol/L (0,85%), realizar nova medição e
multiplicar o resultado pelo fator de diluição. Diluir a amostra de
tal modo que o valor encontrado se situe entre
150 e 300 mg/dL. Sugerimos a verificação da linearidade
metodológica e fotométrica, no mínimo semestralmente,
utilizando amostras com valores até 500 mg/dL.
CONTROLE INTERNO DA QUALIDADE
O laboratório deve manter um programa de controle
interno da qualidade que defina claramente os objetivos,
procedimentos, normas, critérios para limites de tolerância,
ações corretivas e registro das atividades. Ao mesmo tempo
deve-se manter um sistema definido para monitorar a
variabilidade analítica que ocorre em todo o sistema de
medição. Portanto, o uso de controles para avaliar a
imprecisão e desvios de calibração deve ser prática rotineira
no laboratório clínico. Sugere-se usar um controle com um
valor situado na faixa de referência ou no nível de decisão e
outro controle com um valor em outra faixa de significância
clínica. Deve-se criar uma meta de estado de controle6,9 para
que o erro de bias seja £ 3,0%, o coeficiente de variação seja
£ 3,0% e o erro total seja £ 8,9%. Sugere-se realizar a
monitoração contínua do estado de controle através do
sistema de sistema de regras de controle8.
10
Crianças e Adolescentes
Colesterol
Idade: 2 a 19 anos:
Desejável: <170 mg/dL
Limítrofe: 170 a 199 mg/dL
Elevado: 200 mg/dL
Colesterol HDL
Idade:
<10 anos:
10 a 19 anos:
Colesterol LDL
Idade: 2 a 19 anos:
Desejável: 40 mg/dL
Desejável: 35 mg/dL
Desejável: <110 mg/dL
Limítrofe: 110 a 129 mg/dL
Elevado: 130 mg/dL
Conversão: Unidades Convencionais (mg/dL) x 0,026 =
Unidades SI (mmol/L).
9
CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO
Exatidão
Em duas amostras com concentrações de colesterol iguais a
146 e 245 mg/dL foram adicionadas quantidades diferentes do
analito, obtendo-se recuperações entre 94 e 110%. O erro
sistemático proporcional médio obtido em um valor de
200 mg/dL foi igual a 4,0 mg/dL ou 2,0%.
Especificidade
O método proposto foi comparado com um método similar
utilizando 60 amostras com valores situados entre 96 e
495 mg/dL. A comparação resultou na equação da regressão:
y = 6,92 + 0,96x e um coeficiente de correlação (r) igual a
0,996. O erro sistemático total (constante e proporcional)
verificado no nível de decisão (200 mg/dL) foi igual a
1,08 mg/dL ou 0,54%. Como as amostras foram selecionadas
aleatoriamente em pacientes de ambulatório e pacientes
hospitalizados, pode-se inferir que o método tem uma
especificidade metodológica adequada.
Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio
N
MÉDIA
DP
CV(%)
Amostra 1
10
175
2,69
1,5
Sugere-se utilizar os produtos da linha Qualitrol da Labtest,
para controle interno da qualidade em ensaios de química
clínica.
Amostra 2
10
255
3,08
1,2
Amostra 3
10
357
4,23
1,2
VALORES RECOMENDÁVEIS OU DESEJADOS
Os valores abaixo substituem os valores de referência e foram
determinados a partir de dados epidemiológicos tratados
estatisticamente, que relacionam os níveis do colesterol com a
prevalência de doença coronariana isquêmica (DCI).
Reprodutibilidade - Imprecisão total
DP
CV(%)
Classificação ATP III de LDL, Colesterol Total e HDL
(mg/dL):
N
MÉDIA
Amostra 1
10
173
4,23
2,4
Amostra 2
10
253
5,77
2,2
Amostra 3
10
353
8,46
2,1
11
Adultos
Colesterol Total
Desejável: < 200
Limiar elevado: 200-239
Elevado: ³ 240
Colesterol HDL
Baixo: < 40
Elevado (desejável): ³ 60
Colesterol LDL
Òtimo: <100
Limiar ótimo: 100-129
Limiar elevado: 130-159
Elevado: 160-189
Muito elevado: ³ 190
Sensibilidade metodológica
Uma amostra protéica não contendo colesterol foi utilizada
para calcular o limite de detecção do ensaio tendo sido
encontrado um valor igual a 1,04 mg/dL, equivalente a média
de 20 ensaios mais dois desvios padrão. Utilizando-se a
absorbância do padrão como parâmetro verificou-se que o
limite de detecção fotométrica é de 0,06 mg/dL,
correspondendo a uma absorbância igual a 0,0001.
Efeitos da diluição da matriz
Duas amostras com valores iguais a 330 e 400 mg/dL foram
utilizadas para avaliar a resposta do sistema nas diluições da
matriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usando fatores de
diluição que variaram de 2 a 8 encontraram-se recuperações
entre 99 e 113%.
SIGNIFICADO CLÍNICO
O grande dilema da aterosclerose é que ela é um processo
silente. Está ativa em todos os indivíduos e permanece sem
qualquer manifestação por décadas e, subitamente se
manifesta através de dor torácica, infarto agudo do miocárdio
ou morte súbita. Estudos populacionais longitudinais como os
de Tecumset, Albany, Framinghan, Evans, Chicago, Oslo entre
outros, e também dados epidemiológicos e estudos
experimentais em animais, demonstraram uma correlação
positiva entre os níveis do colesterol, mais especificamente do
colesterol LDL e o risco de doença arterial coronariana (DAC).
Ao mesmo tempo foi evidenciado que os níveis de colesterol
HDL são inversamente proporcionais ao risco de DAC.
Valores aumentados de colesterol são encontrados na
nefrose, hipotireoidismo, doenças colestáticas do fígado e nas
hiperlipoproteínemias dos tipos IIa, IIb e III.
Níveis diminuídos são encontrados no hipertireoidismo,
doenças consumptivas e desnutrição crônica.
Além do nível do colesterol sérico, a hipertensão e o fumo
constituem fatores de risco de aterosclerose e DAC.
6. Rifai N, Warnick GR, Dominiczak MH. Handbook of
lipoprotein testing. AACC Press: Washington, 1997:75-97.
7. Tonks DB. Quality Control in Clinical Laboratories, WarnerChilcott Laboratories, Diagnostics Reagents Division,
Scarborough, Canada, 1972.
8. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem
1981;27:493-501.
9. Labtest: Dados de arquivo.
10. Leite PF, Martinez TLR, Halpern A, Cendoroglo MS,
Novazzi JP, Fonseca FAH, Dias JCA. Risco cardiovascular:
fatores metabólicos e nutricionais: diagnóstico e
tratamento. São Paulo: Loyola, 1994. P.56.
11. Executive Summary of the Third report of the National
Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on
Detection, Evaluation and Treatment of High Blood
Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III). JAMA
2001;285:2486-97.
APRESENTAÇÃO
OBSERVAÇÕES
1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são
fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e
obtenção de resultados corretos.
Catálogo
Reagente 1
Padrão
76-2/100
76-2/250
2 x 100 mL
1 x 5 mL
2 x 250 mL
1 x 5 mL
2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidade
adequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes e
usar nas medições, deve ter resistividade ³ 1 megaohm ou
condutividade £ 1 microsiemens e concentração de silicatos
< 0,1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a água
pode ser do tipo III, com resistividade ³ 0,1 megaohms ou
condutividade £ 10 microsiemens. No enxágüe final utilizar
água tipo II. Quando a coluna deionizadora está com sua
capacidade saturada ocorre a produção de água alcalina com
liberação de vários íons, silicatos e substâncias com grande
poder de oxidação ou redução que deterioram os reagentes
em poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados de
modo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um
programa de controle da qualidade da água.
O número de testes em aplicações automáticas depende dos
parâmetros de programação.
3. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas e
medicamentosas de interferência nos resultados e na
metodologia sugere-se consultar Young DS. Effects of Drugs
on Clinical Laboratory Tests, 3ª edição, Washington: AACC
Press, 1990.
Estão disponíveis aplicações para sistemas automáticos.
REFERÊNCIAS
1. Alain CA, Poon LS, Cahn CSG, Richmond W, Fu PC. Clin
Chem 1974;20:470.
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www.labtest.com.br
2. Bergmeyer HU. Methods of Enzymatic Analysis, 3ª edição,
Verlag Chemie:Weinhein, 1984;8:141-8.
3. Bull Org Mond Santé. 1970;43:891.
4. Fredrickson DS, Levy RJ, Lee RS. New Engl J Med 1967;
276:24, 94, 148, 215, 276.
5. Good NE, Winger GD, Winter W, Connoly TN, Izawa S,
Singh RMM. Biochemistry 1966;5:467.
Revisão: Abril, 2006
Ref.: 190606
Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.
Reprodução sob prévia autorização
Instruções de Uso
PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS
Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na
manipulação dos reagentes, os quais não devem ser
pipetados com a boca.
CREATININA K
Cat 96
ANVISA 10009010058
FINALIDADE
Sistema para a determinação da creatinina em soro, plasma,
urina e líquido amniótico por cinética de dois pontos.
Somente para uso diagnóstico in vitro.
PRINCÍPIO
A creatinina reage com o picrato alcalino formando um
complexo de cor vermelha. A quantidade da cor formada é
proporcional à concentração de creatinina na amostra.
Creatinina + Picrato alcalino
Picrato de Creatinina
CARACTERÍSTICAS DO SISTEMA
A metodologia é bastante simples e facilmente aplicável em
aparelhos automáticos e semi-automáticos capazes de medir
uma reação em modo cinético de 2 pontos em um tempo total
de 90 segundos. A interferência das proteínas plasmáticas,
que ocorre na reação de Jaffé, introduz um erro constante na
medição o qual é minimizado pela utilização de um índice de
1 2, 9,
correção (0,25 mg/dL) .
Os estudos realizados demonstraram que é possível eliminar
5
também as interferências causadas pela bilirrubina e lipemia .
Os procedimentos propostos utilizam a adição do ferricianeto
de potássio que oxida a bilirrubina e a desproteinização que
elimina a interferência da lipemia equivalente a uma
concentração de triglicérides de 1800 mg/dL.
O Picrato Alcalino mantém o desempenho analítico quando
armazenado tampado e refrigerado durante 15 dias,
permitindo o preparo de um volume maior de Reagente de
Trabalho de acordo com a rotina do laboratório.
O desenvolvimento do método foi direcionado para automação
não sendo recomendada a utilização em técnicas manuais, a
não ser que o laboratório disponha de facilidades para realizar
medições em cubetas termostatizadas utilizando pequenos
intervalos de tempo.
METODOLOGIA
Labtest.
REAGENTES
1. NaOH - Armazenar entre 15 - 30 °C.
Contém hidróxido de sódio 200 mmol/L. Reagente corrosivo.
2. Ácido Pícrico - Armazenar entre 15 - 30 °C.
Contém ácido pícrico 22,2 mmol/L.
3. Padrão 4,0 mg/dL - Armazenar entre 2 - 30 °C.
Contém creatinina 4,0 mg/dL. Após o manuseio sugere-se
armazenar bem vedado para evitar evaporação.
4. Ferricianeto - Armazenar entre 15 - 30 °C.
Contém ferricianeto de potássio 11 mmol/L. Não refrigerar.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nas
condições indicadas, são estáveis até a data de expiração
impressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estão
sujeitos a contaminações de natureza química e microbiana
que podem provocar redução da estabilidade.
O NaOH (N° 1) é corrosivo e pode produzir irritação,
queimaduras na pele e olhos e ulcerações quando ingerido. No
caso de ingestão oferecer grande quantidade de água com
suco de limão ou vinagre. Não provocar vômitos. Procurar
auxílio médico. Quando houver contato com os olhos, deve-se
lavar imediatamente com grande quantidade de água e
procurar auxílio médico.
Caso ocorra ingestão do Ácido Pícrico (N° 2), oferecer 4 copos
de água e, se o indivíduo estiver consciente, provocar vômitos
e procurar auxílio médico.
Um forte indício de deterioração dos reagentes é indicado
quando o Picrato Alcalino, medido em 510 nm contra a água,
apresentar uma absorbância maior que 0,200.
MATERIAIS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOS
Fotômetro com cubeta termostatizada capaz de medir
absorbância em modo cinético.
Analisador automático capaz de processar 1 ou 2 reagentes
(para aplicações automáticas).
Pipetas para medir amostras e reagentes.
Cronômetro (para medições manuais).
AMOSTRA
Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP)
que estabeleça procedimentos adequados para colheita,
preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos que
os erros devidos à amostra podem ser muito maiores que os
erros ocorridos durante o procedimento analítico.
Soro ou plasma (heparina, EDTA, fluoreto, oxalato e citrato). O
analito é estável 7 dias entre 2 - 8 °C. O anticoagulante Glistab Labtest (Cat. 29) permite a colheita de uma só amostra de
sangue para as dosagens de creatinina, glicose e uréia.
Urina de 24 horas e líquido amniótico devem ser centrifugados.
A amostra de urina não deve receber preservativos ou
conservantes e deve ser refrigerada durante o período da
colheita e depois de recebida no laboratório.
Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras
de material biológico humano não transmitem infecções, todas
elas devem ser consideradas como potencialmente
infectantes. Portanto, ao manuseá-las, devem-se seguir as
normas estabelecidas para biossegurança.
Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimos
aplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteção
ambiental.
INTERFERÊNCIAS
As proteínas presentes na amostra produzem uma
interferência positiva introduzindo um erro sistemático
constante. Este erro pode ser minimizado aplicando um índice
de correção. Como a urina não contém proteínas que podem
produzir interferências, o índice de correção não é aplicado no
cálculo da concentração em amostras de urina. Ver a aplicação
do índice de correção no item Cálculos.
A determinação da creatinina na urina pode ser afetada por
ação de grandes quantidades de substâncias redutoras
presentes nos casos de cetoacidose. A fervura da amostra de
urina por um minuto elimina parcialmente a interferência
dessas substâncias.
Concentrações de bilirrubina maiores que 5 mg/dL interferem
negativamente na reação. Concentrações de hemoglobina até
180 mg/dL e triglicérides até 900 mg/dL não interferem na
reação.
O controle da temperatura é absolutamente indispensável
para a reprodutibilidade dos resultados. Como o tempo de
reação é muito pequeno, é necessário utilizar um equipamento
com cubeta termostatizada a 37 °C.
Para avaliar a concentração aproximada de hemoglobina em
uma amostra, proceder do seguinte modo: diluir 0,05 mL da
amostra em 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L (0,85%) e medir a
absorbância em 405 ou 415 nm, acertando o zero com água
deionizada ou destilada.
É fundamental que as operações com amostras e padrões
sejam realizadas sempre de modo idêntico, mantendo-se
constante, ao máximo possível, o intervalo de tempo entre a
mistura da amostra ou Padrão com o reagente e o início da
medição fotométrica.
Hemoglobina (mg/dL) @ Absorbância4 0 x5 601
Caso os volumes propostos não atendam às necessidades do
instrumento para realizar a leitura fotométrica, aumentar
proporcionalmente os volumes de Picrato Alcalino e amostra
ou Padrão.
Hemoglobina (mg/dL) @ Absorbância4 1 x5 467
Eliminação da ação de interferentes
Nas amostras em que a concentração de bilirrubina está entre
5 e 19 mg/dL, a interferência pode ser eliminada através do
seguinte procedimento: adicionar 0,05 mL de Ferricianeto
(N° 4) a 0,5 mL da amostra. Misturar e aguardar 5 minutos.
Determinar a creatinina, multiplicar o resultado obtido por 1,1 e
aplicar o índice de correção.
Quando a concentração de bilirrubina for maior que 19 mg/dL e
menor que 38 mg/dL, diluir a amostra 1:2 com NaCl
150 mmol/L (0,85%). Adicionar 0,05 mL de Ferricianeto (N° 4) a
0,5 mL da amostra diluida. Misturar e aguardar 5 minutos.
Determinar a creatinina, multiplicar o resultado por 2,2 e aplicar
o índice de correção.
Para concentrações de triglicérides entre 900 mg/dL e
1800 mg/dL a interferência da lipemia pode ser eliminada
através do procedimento com desproteinização. Quando a
concentração de triglicérides for maior que 1800 mg/dL e
menor que 3500 mg/dL, diluir a amostra 1:2 com NaCl
150 mmol/L (0,85%), seguir o procedimento com
desproteinização para determinar a creatinina e multiplicar o
resultado por 2. Não aplicar o índice de correção quando
utilizar o procedimento com desproteinização.
Procedimento direto
Ajustar o fotômetro a zero em 510 nm (490 a 520 nm) com
água. Adicionar 0,10 mL de Padrão ou amostra a 1,0 mL do
Picrato Alcalino. Misturar e aspirar imediatamente para a
cubeta. Disparar o cronômetro e medir as absorbâncias aos
30 e 90 segundos.
Procedimento com desproteinização
Misturar 0,2 mL de soro a 0,4 mL de Ácido Pícrico (N° 2), agitar
e centrifugar durante 10 minutos. Acertar o zero do fotômetro
em 510 nm (490 a 520 nm) com água. Em outro tubo pipetar
0,8 mL de NaOH (N° 1) e adicionar 0,3 mL do sobrenadante
límpido. Misturar e aspirar imediatamente para a cubeta.
Disparar o cronômetro e medir as absorbâncias aos 30 e 90
segundos. O Padrão deve ser ensaiado utilizando o
procedimento direto. Não aplicar o índice de correção.
CÁLCULOS
DA do Teste ou Padrão = A9 0segundos - A3 0segundos
DA do Teste
Creatinina (não corrigida) =
x 4 mg/dL
DA do Padrão
Uma diluição da amostra, maior que 1:2, não é aconselhável
porque, em amostras com baixas concentrações da creatinina,
obtêm-se resultados com erros significativos devido ao
aumento da imprecisão analítica.
Exemplo
PREPARO DO PICRATO ALCALINO
Misturar 4 volumes de NaOH (N° 1) com 1 volume de Ácido
Pícrico (N° 2). Estável 15 dias entre 2 - 8 °C em frasco plástico
bem vedado. Um forte indício de deterioração é indicado por
uma absorbância maior que 0,200 quando o Picrato Alcalino é
medido em 510 nm contra a água.
Creatinina (não corrigida) =
A3 0Teste = 0,118
A9 0Teste = 0,130
A3 0Padrão = 0,092
A9 0Padrão = 0,139
0,130 - 0,118
x 4 mg/dL = 1,02 mg/dL
0,139 - 0,092
Aplicaçãodoíndicedecorreção
Creatinina(corrigida)=Creatinina(nãocorrigida)-Índicedecorreção(0,25mg/dL)
O CO2 atmosférico altera significativamente a estabilidade do
NaOH (N° 1) e do Picrato Alcalino, quando os reagentes são
mantidos em recipientes abertos. A modificação da
estabilidade é influenciada pelo tempo de exposição e
condições ambientais. Sugerimos manter na bandeja do
analisador somente o volume suficiente para a realização de
uma corrida analítica ou usar as informações do controle da
qualidade como indicador da necessidade de realizar nova
calibração.
PROCEDIMENTO
Para a dosagem na urina diluir a amostra 1:25 (0,2 mL de urina
+ 4,8 mL de água destilada ou deionizada). Multiplicar o
resultado obtido por 25.
Exemplo
Creatinina (corrigida) = 1,02 mg/dL - 0,25 mg/dL = 0,77 mg/dL
A interferência das proteínas plasmáticas, que ocorre na
2
reação de Jaffé , introduz um erro constante na medição o qual
é minimizado pela utilização do índice de correção
(0,25 mg/dL).
A utilização do índice de correção em medições automáticas é
apresentada nas aplicações dos produtos Labtest para
sistemas automáticos.
Creatinina Urinária
Exemplo
Creatininaurinária
CreatininaUrinária(mg/24h)=
xVolumedeurina(mL/24h)
100
Creatinina na urina (mg/dL) = 105
Creatinina (corrigida) no soro (mg/dL) = 0,95
Volume de 24 horas = 1520
Volume minuto = 1520/1440 = 1,055
mg/kg peso = mg/24 horas dividido pelo peso corporal
105
Como as amostras de urina não contêm proteínas em
concentrações capazes de introduzir erros constantes
nas medições, não é necessário aplicar o índice de
correção.
CALIBRAÇÃO
Rastreabilidade do Sistema
A concentração de creatinina no Padrão (N° 3) e nos
calibradores da linha Calibra é rastreável ao Standard
Reference Material (SRM) 914 do National Institute of
Standards and Technology (NIST).
Calibrações manuais
Obter novo fator de calibração ao usar novo lote de
reagentes ou quando o controle da qualidade indicar.
"
Sistemas automáticos
Branco de reagentes: água ou solução de cloreto de sódio
150 mmol/L (0,85%);
Padrão: usar calibradores da linha Calibra;
"
"
Intervalos de calibração
Calibração do branco ao usar novos frascos de
reagentes;
Calibração de 3 pontos ao mudar de lote;
Calibração de 3 pontos quando o controle da qualidade
indicar.
"
"
"
DEPURAÇÃO DA CREATININA ENDÓGENA
Instruir o paciente para que faça corretamente a colheita da
4
urina de 24 horas .
Dosar a creatinina no soro e na urina utilizando as
metodologias propostas. O soro pode ser obtido em qualquer
momento durante o período de colheita da urina.
Aplicar os resultados obtidos na equação abaixo:
U
Depuração =
x VM (mL/minuto)
S
U: creatinina na urina (mg/dL)
S: creatinina (corrigida) no soro (mg/dL)
VM: volume minuto (volume urinário de 24 horas, em mL,
dividido por 1440).
OBS.: A depuração deverá ser corrigida para a superfície
corporal do paciente, que é obtida através do nomograma
correlacionando peso e altura, ou usando a equação abaixo:
A= P
0 4, 2 5
xH
0 7, 2 5
x 0,007184
2
A = superfície corporal (m )
P = peso (kg)
H = altura (cm)
Multiplicar o valor da depuração por 1,73 e dividir pela
superfície corporal do paciente.
Depuração (mL/minuto) =
x 1,055 = 116
0,95
Peso = 60 Kg
2
Superfície corporal = 1,66 m
Altura = 165 cm
116 x 1,73
Depuração corrigida =
= 121 mL/minuto/1,73 m
2
1,66
LINEARIDADE
A reação é linear entre 0,2 mg/dL e 12 mg/dL. Para valores
maiores diluir a amostra com NaCl 150 mmol/L (0,85%) e
repetir a determinação. Multiplicar o resultado obtido pelo fator
de diluição e aplicar o índice de correção. Diluir a amostra de tal
modo que o valor encontrado se situe entre 2,0 e 6,0 mg/dL.
CONTROLE INTERNO DA QUALIDADE
O laboratório deve manter um programa de controle interno da
qualidade que defina claramente os regulamentos aplicáveis,
objetivos, procedimentos, critérios para especificações da
qualidade e limites de tolerância, ações corretivas e registro
das atividades. Materiais de controle devem ser utilizados para
avaliar a imprecisão e desvios da calibração. Sugere-se que as
especificações para o coeficiente de variação e o erro total
sejam baseadas nos componentes da variação biológica
8 1, 011,
(VB)
.
Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas da linha
Qualitrol - Labtest para controle interno da qualidade em
ensaios de química clínica.
VALORES DE REFERÊNCIA
Estes valores devem ser usados apenas como orientação.
Recomenda-se que cada laboratório estabeleça na população
atendida sua própria faixa de valores de referência.
Soro/Plasma (mg/dL)
Recém- nascidos
< 1 meses
1 - 12 meses
1 - 3 anos
4 - 7 anos
8 - 10 anos
11 - 12 anos
13 - 17 anos
Adulto
0,5 - 1,2
0,4 - 0,7
£ 0,7
£ 0,7
£ 0,8
£ 0,9
£ 1,0
£ 1,2
£ 1,3
Conversão mg/dL para Unidades SI: mmol/L = mg/dL x 88,4.
Urina (mg/kg/24 h)
2 - 3 anos
> 3 anos
Homem
Mulher
6 - 22
12 - 30
21 - 26
16 - 22
2
A determinação da creatinina plasmática é um teste de função
renal mais seguro do que a uréia. Nas doenças renais a
creatinina se eleva mais vagarosamente do que a uréia e se
reduz mais vagarosamente com a hemodiálise.
Depuração de Creatinina (mL/minuto/1,73 m )
70 - 140
Crianças
Homens
Mulheres
97 - 137
88 - 128
1 0
CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO
Exatidão
Em duas amostras com concentrações de creatinina iguais a
2,7 mg/dL e 8,7 mg/dL foram adicionadas quantidades
diferentes do analito, obtendo-se recuperações entre 97 e
100%. O erro sistemático proporcional médio estimado no
nível de decisão (1,6 mg/dL) é igual a 0,0232 mg/dL ou 1,45%.
Especificidade
O método proposto foi comparado com um método
enzimático (rastreável ao método definitivo) utilizando
20 amostras de soro com valores situados entre 0,52 e
11,0 mg/dL. A comparação resultou na equação da regressão
y = 1,007x + 0,028 e um coeficiente de correlação (r) igual a
0,998. O erro sistemático total (constante e proporcional)
estimado no nível de decisão (1,6 mg/dL) é igual a
0,0354 mg/dL ou 2,2%. Como as amostras foram selecionadas
aleatoriamente em pacientes de ambulatório e pacientes
hospitalizados, pode-se inferir que o método tem uma
especificidade metodológica adequada.
Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio
N
MÉDIA
DP
CV(%)
Amostra 1
20
0,66
0,013
1,97
Amostra 2
20
2,04
0,016
0,78
Amostra 3
20
7,49
0,144
1,92
CV(%)
Reprodutibilidade - Imprecisão total
N
MÉDIA
DP
Amostra 1
20
0,66
0,027
4,10
Amostra 2
20
2,04
0,038
1,86
Amostra 3
20
7,49
0,273
3,64
Sensibilidade metodológica
Uma amostra não contendo creatinina foi utilizada para
calcular o limite de detecção do ensaio tendo sido encontrado
um valor igual a 0,14 mg/dL, equivalente à média de 20 ensaios
mais dois desvios padrão. Utilizando-se a absorbância do
padrão como parâmetro verificou-se que o limite de detecção
fotométrica foi 0,12 mg/dL, correspondendo a uma diferença
de absorbância igual a 0,001.
Fatores extras renais como insuficiência cardíaca congestiva,
choque e obstrução mecânica do trato urinário provocam
elevação da creatinina plasmática.
OBSERVAÇÕES
1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são
fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e
obtenção de resultados corretos.
2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidade
adequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes e
usar nas medições deve ter resistividade ³1 megaohm ou
condutividade £1 microsiemens e concentração de silicatos
<0,1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a água
pode ser do tipo III com resistividade ³0,1 megaohms ou
condutividade £10 microsiemens. No enxágüe final utilizar
água tipo II. Quando a coluna deionizadora está com sua
capacidade saturada ocorre a produção de água alcalina com
liberação de vários íons, silicatos e substâncias com grande
poder de oxidação ou redução que deterioram os reagentes
em poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados de
modo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um
programa de controle da qualidade da água.
3. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas e
medicamentosas de interferência nos resultados e na
metodologia sugere-se consultar: www.fxol.org/
REFERÊNCIAS
1. Cook JGH. Clin Chimica Acta 1971;32:485-6.
2. Heinegard D, Tiderström G. Clin Chim Acta 1973;43:305-10.
3. Henry RJ, Cannon DC, Winkelman JW. Clinical Chemistry,
Principles and Technics, 2nd ed, New York, Harper &
Row,1974.
4. Infotec Labtest, Ano II N° 2.
5. Knapp ML, Mayne PD. Clin Chim Acta 1987;168:239-46.
6. O'Leary N, Pembroke A, Duggan PF. Clinical Chemistry
1992;38:1749-51.
7. Tonks DB. Quality Control in Clinical Laboratories. WarnerChilcott Laboratories, Diagnostic Reagents Division,
Scarborough, Canada, 1972.
8. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR,Groth T. Clin Chem 1981;
27:493-501.
Efeitos da diluição da matriz
Duas amostras com valores iguais a 8,6 e 10,0 mg/dL foram
utilizadas para avaliar a resposta do sistema nas diluições da
matriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Utilizando fatores de
diluição que variaram de 2 a 5 foram encontradas
recuperações entre 96,2 e 105%.
9. Yatzidis H. Clin Chem 1974,20:1131-34.
SIGNIFICADO CLÍNICO
A constância na formação e excreção da creatinina faz dela um
marcador muito útil de função renal, principalmente da filtração
glomerular, em virtude da sua relativa independência de
fatores como dieta, grau de hidratação e metabolismo protéico.
11. Basques JC. Especificações da Qualidade Analítica.
Labtest Diagnóstica 2005.
10. Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología
Molecular, Base de Datos de Variación Biológica.
Disponível em:<http://www.seqc.es/article/articleview/
330/1/170> (acesso em 04/2006).
12. Soldin SJ, Brugnara C, Wong EC: Pediatric Reference
Intervals, 5.ed. Washington: AACC Press, 2005. P.3-4.
13. Ferraz MHC, Delgado RB. Valores de Referência para
Exames Laboratoriais. In: Leão E, Corrêa EJ, Viana MB,
Mota JAC (Ed). Pediatria Ambulatorial. 3.ed. Belo
Horizonte: Coopmed, 1988. p.837-848
14. Labtest: Dados de Arquivo.
APRESENTAÇÃO
Catálogo
NaOH
Ácido Pícrico
Padrão
Ferriacianeto
96-300
1 x 240 mL
1 x 60 mL
1 x 5 mL
1 x 5 mL
Estão disponíveis aplicações para sistemas automáticos.
O número de testes em aplicações automáticas depende
dos parâmetros de programação.
Algumas apresentações podem ser disponibilizadas somente
mediante consulta.
INFORMAÇÕES AO CONSUMIDOR
Termos e Condições de Garantia
A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produto
dentro das especificações até a data de expiração indicada
nos rótulos, desde que os cuidados de utilização e
armazenamento indicados nos rótulos e nestas instruções
sejam seguidos corretamente.
Serviço de Apoio ao Cliente
Telefone 0800-31-3411 - Ligação Gratuita
E-mail: [email protected]
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Revisão: Junho, 2005.
Ref.: 200706
Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.
Reprodução sob prévia autorização
Instruções de Uso
FOSFATASE ALCALINA
Liquiform
Cat. 79
ANVISA 10009010050
FINALIDADE
Sistema para determinação em modo cinético da Fosfatase
Alcalina no soro.
Somente para uso diagnóstico in vitro.
PRINCÍPIO
A fosfatase alcalina (FALC) do soro, em pH alcalino,
hidrolisa o p-nitrofenilfosfato liberando p-nitrofenol e fosfato
inorgânico, segundo a reação seguinte:
FALC
p-Nitrofenilfosfato + H2O
p-Nitrofenol + fosfato
A quantidade produzida de p-nitrofenol que tem elevada
absorbância em 405 nm é diretamente proporcional à
atividade enzimática da fosfatase alcalina na amostra.
CARACTERÍSTICAS DO SISTEMA
O substrato p-nitrofenilfosfato foi selecionado porque é
prontamente hidrolisado pela fosfatase alcalina. O produto da
hidrólise possui elevada absortividade molar, permitindo
utilizar pequeno volume de amostra e curto tempo de
reação porque utiliza um tampão transfosforilante que
aumenta a velocidade do sistema.
O sistema se baseia no método de referência da AACC que
otimiza todas as condições da reação, incluindo
temperatura, pH, concentração dos reagentes e volume
fracional da amostra. Este método, com pequenas
modificações, está sendo considerado por várias
organizações nacionais e internacionais interessadas em
estabelecer um método de referência para a fosfatase alcalina.
As substâncias utilizadas na reação se encontram distribuídas
adequadamente em dois reagentes para conferir maior
estabilidade na forma líquida original e manutenção das
condições ótimas da reação, permitindo a utilização direta dos
reagentes em sistemas automáticos.
A metodologia monoreagente pode ser aplicada utilizando um
Reagente de Trabalho estável por 30 dias sob refrigeração
obtendo-se desempenho adequado mesmo em situações de
baixas demandas do teste. O sistema permite ainda preparar o
volume de Reagente de Trabalho necessário para apenas uma
medição da atividade enzimática da fosfatase alcalina.
2. Reagente 2 - Armazenar entre 2 - 8°C.
Contém p-Nitrofenilfosfato ³ 60 mmol/L, fenol ³ 50 mmol/L.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nas
condições indicadas, são estáveis até a data de expiração
impressa no rótulo. Durante o manuseio os reagentes estão
sujeitos a contaminações de natureza química e microbiana
que podem provocar redução da estabilidade.
RASTREABILIDADE DO SISTEMA
A absortividade molar do p-nitrofenol, produto da reação, é
utilizada como sistema de referência para a calibração do
ensaio.
PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS
Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na
manipulação do reagente.
O Reagente 1 contém azida sódica, que é tóxica. Deve-se
tomar cuidado para evitar a ingestão e no caso de contato com
os olhos deve-se lavar imediatamente com grande quantidade
de água e procurar auxílio médico. A azida pode formar
compostos altamente explosivos com tubulações de chumbo e
cobre. Portanto, utilizar grandes volumes de água para
descartar o reagente.
Não utilizar o Reagente de Trabalho quando sua absorbância,
medida contra a água em 405 nm, for igual ou maior que 1.2 ou
quando mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.
MATERIAIS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOS
Fotômetro com cubeta termostatizada capaz de medir com
exatidão a absorbância em 405 nm.
Pipetas para medir amostras e reagentes.
Cronômetro.
AMOSTRA
Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP)
que estabeleça procedimentos adequados para colheita,
preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos que
os erros devidos à amostra podem ser muito maiores que os
erros ocorridos durante o procedimento analítico.
A amostra de sangue deve ser obtida após jejum de no mínimo
8 horas.
Soro ou plasma (heparina). A amostra é estável por 7 dias entre
2 - 8°C. Quando a amostra é armazenada na temperatura
ambiente obtém-se resultados falsamente elevados.
Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras
de sangue não transmitem infecções, todas elas devem ser
consideradas como potencialmente infectantes. Portanto, ao
manuseá-las, deve-se seguir as normas estabelecidas para
biossegurança.
O sistema é simples e utiliza medidas em modo cinético
contínuo, podendo ser facilmente aplicado em analisadores
automáticos e semi-automáticos capazes de medir
absorbância em 405 nm.
Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimos
aplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteção
ambiental.
METODOLOGIA
Bowers e Mc Comb modificado.
INTERFERÊNCIAS
Citrato, fluoreto ,oxalato e EDTA são inibidores da atividade da
fosfatase alcalina porque formam complexos com o magnésio.
REAGENTES:
1. Reagente 1 - Armazenar entre 2 - 8°C.
Contém tampão pH 10.4, HEDTA 2.0 mmol/L, sulfato de zinco
1.2 mmol/L, acetato de magnésio 2.5 mmol/L, azida sódica
8 mmol/L.
Valores de Bilirrubina até 32 mg/dL não interferem na reação.
Amostras ligeiramente hemolisadas, com hemoglobina até
30 mg/dL, podem ser toleradas, mas hemólises mais
acentuadas não devem ser aceitas porque produzem
resultados falsamente diminuídos.
Valores de Triglicérides acima de 1800 mg/dL produzem
resultados falsamente elevados.
Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina em
uma amostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo:
Diluir 0.05 mL da amostra em 2.0 mL de NaCl 150 mmol/L
(0.85%) e medir a absorbância em 405 ou 415 nm acertando o
zero com água deionizada ou destilada.
Hemoglobina(mg/dL) @ Absorbância405 x 601
Hemoglobina(mg/dL) @ Absorbância415 x 467
PREPARO DO REAGENTE DE TRABALHO
O conjunto de um frasco do Reagente 1 e um frasco do
Reagente 2 permite preparar o Reagente de Trabalho.
Transferir o conteúdo de um frasco do Reagente 2 para um
frasco do Reagente 1 e homogeneizar por inversão. Anotar a
data de expiração.
Estável 5 dias entre 15 - 25°C e 30 dias entre 2 - 8°C quando
não houver contaminação química ou bacteriana. Identificar o
frasco do Reagente de Trabalho, para evitar confusão com
outros frascos do Reagente 1. Para preservar o desempenho,
o Reagente de Trabalho deve permanecer fora da geladeira
somente o tempo necessário para se obter o volume a ser
utilizado. Evitar exposição à luz solar direta.
Opcionalmente pode-se preparar menor volume do Reagente
de Trabalho utilizando a proporção de 4 (quatro) volumes do
Reagente 1 e 1 (um) volume do Reagente 2. Ex.: Para preparar
1 mL do Reagente de Trabalho misturar 0.8 mL do Reagente 1
com 0.2 mL do Reagente 2.
O Reagente de Trabalho contém tampão pH 10.4, sulfato de
zinco 1.0 mmol/L, fenol ³10 mmol/L, HEDTA 1.6 mmol/L,
acetato de magnésio 2.0 mmol/L, p-nitrofenil fosfato
³12 mmol/L, azida sódica 6.4 mmol/L.
PROCEDIMENTO
Condições da reação: comprimento de onda 405 nm;
cubeta termostatizada a 37 ± 0.2°C, com 10 mm de
espessura de solução, banda de passagem de 8 nm ou
menos e luz espúria menor que 0.1%.
1. Em um tubo rotulado Teste pipetar 1.0 mL do Reagente de
Trabalho.
2. Adicionar 0.02 mL da amostra, homogeneizar e transferir
imediatamente para a cubeta termostatizada a 37 ± 0.2°C.
Esperar 1 minuto.
3. Fazer a leitura da absorbância inicial (A1) disparando
simultaneamente o cronômetro. Repetir a leitura após 2
minutos (A2).
Para avaliar a linearidade da reação verificar se as
absorbâncias medidas em intervalos de 1 minuto são
comparáveis.
Calcular o (DA/minuto) subtraindo A1 de A2 e dividindo por 2.
CÁLCULOS
Ver linearidade.
A2 - A1
DATeste =
2
Atividade da Fosfatase Alcalina = DATeste x 2764
O fator 2764 foi calculado para as condições acima propostas.
Recalcular o fator quando for efetuada qualquer modificação
em um dos parâmetros utilizados para calculá-lo.
Ver método para cálculo do fator.
Exemplo:
A1 Teste = 0.610
A2 Teste = 0.660
0.660 - 0.610
DA/minuto =
= 0.025
2
Fosfatase Alcalina (U/L) a 37°C = 0.025 x 2764 = 69
Método para cálculo do fator
VT x 1000
Fator =
e x VA x d
VT = volume total do ensaio (1.02 mL)
VA = volume da amostra (0.02 mL)
1000 = conversão de U/mL para U/L
d = espessura da solução (1 cm)
e = absortividade milimolar do p-nitrofenol em 405 nm (18.45)
Exemplo:
1.02 x 1000
Fator =
= 2764
18.45 x 0.02 x 1
LINEARIDADE
A reação é linear até 1500 U/L. Para valores maiores diluir a
amostra 1:10 com NaCl 150 mmol/L (0.1 mL de soro + 0.9 mL
de NaCl 150 mmol/L), repetir a determinação e multiplicar o
resultado obtido por 10.
Sugerimos a verificação da linearidade metodológica e
fotométrica no mínimo semestralmente utilizando amostras
com atividades até 1500 U/L.
CONTROLE INTERNO DA QUALIDADE
O laboratório deve manter um programa de controle interno da
qualidade que defina claramente os objetivos, procedimentos,
normas, critérios para limites de tolerância, ações corretivas e
registro das atividades. Ao mesmo tempo deve-se manter um
sistema definido para monitorizar a variabilidade analítica que
ocorre em todo o sistema de medição. Portanto, o uso de
controles para avaliar a imprecisão e inexatidão das
determinações deve ser prática rotineira no laboratório clínico.
Sugere-se usar um controle com um valor situado na faixa de
referência ou no nível de decisão e outro controle com um valor
em outra faixa de significância clínica. Deve-se criar uma meta
de estado de controle para que a variação máxima encontrada
seja de 10% ou então utilizar o sistema de regras múltiplas de
Westgard5 para verificar a estabilidade do sistema de medição.
Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas Qualitrol 1 e
Qualitrol 2 da Labtest para controle interno da qualidade em
ensaios de química clínica.
VALORES DE REFERÊNCIA
Estes valores podem ser usados apenas como orientação.
Recomenda-se que cada laboratório estabeleça a sua própria
faixa de valores de referência da população atendida.
37 ºC
Adultos (U/L)
27 - 100
Crianças* (U/L)
75 - 390
*(incluindo adolescentes até 16 anos)
Conversão de U/L para Unidades SI: mkat/L = U/L x 0.0167
TEMPERATURA
A tabela abaixo permite converter a atividade medida em uma
determinada temperatura para o valor que seria obtido na
medição realizada em outras temperaturas.
Temperatura
de trabalho
25 ºC
30 ºC
37 ºC
Fatores de correção da temperatura
25 ºC
---0.69
0.48
30 ºC
1.45
---0.70
37 ºC
2.08
1.43
----
Exemplo: a atividade enzimática obtida em 37°C deve ser
multiplicada por 0.70 para se obter a atividade em 30°C ou por
0.48 para se obter a atividade em 25°C.
6
CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO
Exatidão
Em 2 amostras com concentrações de Fosfatase Alcalina
iguais a 59 e 200 U/L foram adicionadas quantidades
diferentes do analito, obtendo-se recuperação entre 94 e
102%.
Especificidade
O método proposto foi comparado com método similar
utilizando 40 amostras de soro com valores situados entre 47 e
707 U/L. A avaliação estatística dos resultados resultou na
equação da regressão y = 1.091x - 10.926 e um coeficiente de
correlação (r) igual a 0.999. O erro sistemático total (constante
e proporcional) verificado no nível de decisão (100 U/L) foi
igual a 2 U/L ou 2.0%. Como as amostras foram selecionadas
aleatoriamente em pacientes de ambulatório e pacientes
hospitalizados, pode-se inferir que o método tem uma
especificidade metodológica adequada.
Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio
N
MÉDIA
DP
CV (%)
Amostra 1
10
92
1.1
1.2
Amostra 2
10
174
1.6
0.9
Amostra 3
10
451
2.4
0.5
Reprodutibilidade - Imprecisão total
N
MÉDIA
DP
CV (%)
Amostra 1
10
89
2.0
2.2
Amostra 2
10
175
2.8
1.6
Amostra 3
10
447
6.3
1.4
Sensibilidade metodológica
Uma amostra protéica não contendo fosfatase alcalina foi
utilizada para calcular o limite de detecção do ensaio tendo
sido encontrado um valor igual a 2.4 U/L, equivalente à média
de 20 ensaios mais dois desvios padrão.
Efeitos da diluição da matriz:
Uma amostra com valor igual a 850 U/L foi utilizada para avaliar
a resposta do sistema nas diluições da matriz com NaCl
150 mmol/L. Usando fatores de diluição que variaram de 2 a 8
encontrou-se recuperações entre 101 e 104%.
SIGNIFICADO CLÍNICO
A fosfatase alcalina é produzida por muitos tecidos,
principalmente por ossos, fígado, intestino e placenta, e é
excretada pela bile. A dosagem sérica desta enzima é
particularmente útil na investigação das doenças
hepatobiliares e ósseas.
Níveis elevados de fosfatase alcalina ocorrem em pacientes
com doenças ósseas caracterizadas por um aumento da
atividade osteoblástica, como a osteite deformante,
raquitismo, osteomalácia, hiperparatireoidismo, metástase
óssea, sarcoma osteogênico e doença de Paget.
Níveis elevados de fosfatase alcalina ocorrem também em
pacientes com doenças obstrutivas das vias biliares,
metástases hepáticas, doenças granulomatosas e na cirrose
hepática. Nas doenças hepatocelulares como a hepatite
aguda viral, em geral ocorre um ligeiro aumento da enzima .
Níveis diminuídos da fosfatase alcalina são encontrados na
desnutrição crônica, na hipofosfatasemia e ocasionalmente no
hipotireoidismo e anemia perniciosa.
OBSERVAÇÕES
1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são
fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e
obtenção de resultados corretos.
2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidade
adequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes e
usar nas medições deve ter resistividade ³1 megaohm ou
condutividade £1 microsiemens e concentração de silicatos
<0.1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a água
pode ser do tipo III, com resistividade ³0.1 megaohms ou
condutividade £10 microsiemens. No enxágüe final utilizar
água tipo II. Quando a coluna deionizadora está com sua
capacidade saturada ocorre a produção de água alcalina com
liberação de vários íons, silicatos e substâncias com grande
poder de oxidação ou redução que deterioram os reagentes
em poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados de
modo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um
programa de controle da qualidade da água.
3. Como ocorre em toda medição da atividade enzimática, a
rigorosa observação do tempo e da temperatura de incubação
é de grande importância para a qualidade dos resultados
obtidos.
4. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas e
medicamentosas de interferência nos resultados e na
metodologia sugere-se consultar Young DS. Effects of Drugs
on Clinical Laboratory Tests, 3ª edição, Washington: AACC
Press, 1990.
REFERÊNCIAS
1. IFCC Methods for the measurement of catalytic
concentration of enzymes-Part 5, IFCC method for Alkaline
Phosphatase. J Clin Chem Clin Biochem 1983;21:731-47.
2. McComb RB, Bowers GN, Upretti A. Clin Chem
1981;27:135-41.
3. Tietz NW, Burtis CA, Ducan P et al. Clin Chem 1983;29: 751761.
4. Tonks DB Quality Control in Clinical Laboratories, WarnerChilcott Laboratories, Diagnostic Reagents Division,
Scarborough, Canada, 1972.
5. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem
1981;27:493-501.
6. Labtest: Dados de Arquivo.
APRESENTAÇÃO
Catálogo
Reagente 1
Reagente 2
79-4/30
4 x 24 mL
4 x 6 mL
Estão disponíveis as aplicações para sistemas
automáticos.
O número de testes em aplicações automáticas depende
dos parâmetros de programação.
INFORMAÇÕES AO CONSUMIDOR
Termos e Condições de Garantia
A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produto
dentro das especificações até a data de expiração indicada
nos rótulos desde que os cuidados de utilização e
armazenamento indicados nos rótulos e nestas instruções
sejam seguidos corretamente.
Serviço de Apoio ao Cliente
Telefone: 0800 31-3411 (Ligação gratuita)
e-mail: [email protected]
Labtest Diagnóstica S.A.
CNPJ: 16.516.296/0001-38
Av. Paulo Ferreira da Costa, 600 - Vista Alegre
Lagoa Santa - Minas Gerais - Brasil - 33400-000
Telefone (31) 3681-9288
Fax (31) 3681-9344
www.labtest.com.br
Revisão: Outubro, 2001
Ref.: 230306
Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.
Reprodução sob prévia autorização
Instruções de Uso
DIAGNÓSTICA
GLICOSE HK Liquiform
Cat. 85
ANVISA 10009010052
FINALIDADE
Sistema enzimático para determinação da Glicose por
fotometria ultravioleta de ponto final, em amostras de sangue,
urina, líquor e líquidos ascítico, pleural e sinovial.
Somente para uso diagnóstico in vitro
PRINCÍPIO
A adenosina trifosfato promove a fosforilação da glicose em
uma reação catalisada pela hexoquinase (HK), de acordo com
a seguinte reação:
HK
Glicose + ATP
Glicose-6-fosfato + ADP
A glicose-6-fosfato produzida na reação anterior é oxidada a
6-fosfogluconato na presença da nicotinamida adenina
dinucleótide (NAD), em reação catalisada especificamente
pela glicose-6-fosfato desidrogenase (G-6-PDH). Ocorre a
produção de um mol de NADH para cada mol de glicose-6fosfato que é oxidado. A absorbância resultante, medida em
340 nm, é diretamente proporcional à concentração da glicose
na amostra.
G-6-PDH
Glicose-6-fosfato + NAD
6-Fosfogluconato + NADH
CARACTERÍSTICAS DO SISTEMA
A hexoquinase é uma enzima que catalisa a transferência do
fosfato do ATP não somente para a glicose, mas também para
a D-frutose, D-manose, D-glucosamina e 2-deoxi-D-glicose.
Como a G-6-PDH tem elevada especificidade para a glicose-6fosfato, outras hexoses ou ésteres de pentose que são
fosforilados não participam da reação. Assim, o ensaio é
extremamente específico para a glicose.
A especificidade da reação proporcionada pela G-6-PDH
possibilita a determinação da glicose urinária com um grau
elevado de exatidão, o que não é conseguido quando se
empregam sistemas utilizando outras enzimas como
reagentes.
Os dados da repetitividade e da reprodutibilidade
demonstram de modo inequívoco que o sistema Glicose HK
Liquiform possui uma robustez extremamente desejável e
valiosa para um sistema analítico.
As substâncias utilizadas na reação se encontram distribuídas
adequadamente em dois reagentes, para conferir maior
estabilidade na forma líquida original e manutenção das
condições ótimas da reação, permitindo a utilização direta dos
reagentes em sistemas automáticos.
A metodologia monoreagente pode ser aplicada utilizando um
Reagente de Trabalho estável 60 dias sob refrigeração,
obtendo-se desempenho adequado mesmo em situações de
baixas demandas do teste. O sistema permite ainda preparar o
volume do Reagente de Trabalho necessário para uma
medição da atividade enzimática da glicose.
O sistema é facilmente aplicável a analisadores automáticos e
semi-automáticos, capazes de medir com exatidão a
absorbância em 340 nm.
METODOLOGIA
Bondar e Mead modificado.
REAGENTES
1. Reagente 1 - Armazenar entre 2 - 8 °C.
Contém tampão 90 mmol/L pH 7,4, ATP 4,1 mmol/L,
NAD 3,3 mmol/L, cloreto de magnésio 10 mmol/L e azida
sódica 7 mmol/L.
2. Reagente 2 - Armazenar entre 2 - 8 °C.
Contém Hexoquinase ³ 4100 U/L; G-6-PDH ³ 12500 U/L e
azida sódica 15 mmol/L.
3. Padrão 100 mg/dL - Armazenar entre 2 - 30 °C.
Após o manuseio armazenar bem vedado para evitar
evaporação.
O estabilizador do padrão pode precipitar-se em baixas
temperaturas, o que não interfere em seu desempenho.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nas
condições indicadas, são estáveis até a data de expiração
impressa no rótulo. Durante o manuseio os reagentes estão
sujeitos à contaminações de natureza química e microbiana
que podem provocar redução da estabilidade.
RASTREABILIDADE DO SISTEMA
A calibração do sistema é rastreável ao Standard Reference
Material 917a do National Institute of Standards and
Technology.
PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS
Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na
manipulação do reagente.
Os reagentes de Glicose HK Liquiform contêm azida sódica,
que é toxica. Deve-se tomar cuidado para evitar a ingestão e
no caso de contato com os olhos, deve-se lavar imediatamente
com grande quantidade de água e procurar auxílio médico. A
azida pode formar compostos altamente explosivos com
tubulações de chumbo e cobre. Portanto, utilizar grandes
volumes de água para descartar o reagente.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nas
condições indicadas, são estáveis até a data de expiração
impressa no rótulo. Durante o manuseio os reagentes estão
sujeitos à contaminações de natureza química e microbiana
que podem provocar redução da estabilidade.
Não utilizar o Reagente de Trabalho quando a sua absorbância
medida a 340 nm contra a água for maior que 0,350.
MATERIAIS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOS
Banho-maria mantido à temperatura constante (37 °C).
Fotômetro capaz de medir com exatidão a absorbância em
340 nm.
Pipetas para medir amostras e reagentes.
Cronômetro.
INFLUÊNCIAS PRÉ-ANALÍTICAS
Nas 24 horas que se sucedem à ingestão aguda de álcool,
ocorre significativa redução da glicemia. As reduções podem
também ser significativas nos indivíduos submetidos a jejum
prolongado ou em obesos tratados com dietas com baixo valor
calórico.
Pacientes diabéticos em uso continuado de clorpropamida
(Diabinese) podem desenvolver hipoglicemias importantes
que são muito difíceis de corrigir
AMOSTRA
Usar plasma, soro ou urina tomando as precauções a seguir. A
amostra de sangue deve ser obtida após jejum de no mínimo
8 horas ou de acordo com recomendação médica.
Pagina: 1
DIAGNÓSTICA
Realizar a colheita do sangue utilizando um anticoagulante
contendo um inibidor da glicólise. O uso do anticoagulante
Glistab (Labtest Cat.29) permite a colheita de uma só amostra
para as dosagens de creatinina, glicose e uréia.
As amostras de sangue não contendo antiglicolítico devem ser
centrifugadas imediatamente após a colheita e o plasma ou
soro, separados das células ou coágulo.
Nas amostras de sangue tratadas com antiglicolítico, a
concentração da glicose permanece estável até 8 horas. No
plasma, soro e outros líquidos separados das células, a glicose
permanece estável 3 dias entre 2 - 8 °C se não ocorrer
6
contaminação microbiana .
Se houver suspeita da presença de ácido ascórbico, deixar o
plasma ou soro em repouso durante 90 minutos antes de iniciar
a dosagem para não obter resultados falsamente diminuídos.
Em outros líquidos biológicos (líquor e líquidos ascítico, pleural
e sinovial), adicionar anticoagulante contendo antiglicolítico na
mesma proporção usada para a amostra de sangue e
centrifugar antes da dosagem.
As amostras de urina devem ser armazenadas entre 2 - 8 °C
para evitar interferências por contaminação microbiana.
Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras
de material biológico humano não transmitem infecções, todas
elas devem ser consideradas como potencialmente
infectantes. Portanto, ao manuseá-las deve-se seguir as
normas estabelecidas para biossegurança.
Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimos
aplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteção
ambiental.
INTERFERÊNCIAS
Valores de Bilirrubina até 16 mg/dL, Hemoglobina até
100 mg/dL e Triglicérides até 350 mg/dL não produzem
interferências significativas.
Valores de Bilirrubina até 32 mg/dL, Hemoglobina até
160 mg/dL e Triglicérides até 1800 mg/dL produzem
interferências positivas que podem ser minimizadas utilizando
o branco da amostra.
Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina em
uma amostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo:
Diluir 0,05 mL da amostra em 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L
(0,85%) e medir a absorbância em 405 ou 415 nm, acertando o
zero com água deionizada ou destilada.
Hemoglobina (mg/dL) @ Absorbância405 x 601
Hemoglobina (mg/dL) @ Absorbância415 x 467
Opcionalmente pode-se preparar menor volume do Reagente
de Trabalho utilizando-se da proporção de 4 (quatro) volumes
do Reagente 1 para 1 (um) volume do Reagente 2.
Ex.: Para preparar 1,0 mL do Reagente de Trabalho, misturar
0,8 mL do R1 com 0,2 mL do R2.
O Reagente de Trabalho contém tampão 72 mmol/L pH 7,4,
ATP 3,3 mmol/L, NAD 2,6 mmol/L, Hexoquinase ³ 820 U/L,
G-6-PDH ³ 2500 U/L, cloreto de magnésio 8,0 mmol/L, azida
sódica 9 mmol/L.
PROCEDIMENTO
Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:
Branco
Teste
Amostra
----
0,01 mL
----
Padrão
----
----
0,01 mL
1,0 mL
1,0 mL
1,0 mL
Reagente de Trabalho
Padrão
Misturar e incubar em banho maria a 37 ºC durante 5 minutos.
O nível da água no banho deve ser superior ao nível dos
reagentes nos tubos de ensaio. Determinar as absorbâncias
do teste e padrão em 340 nm, acertando o zero com o branco. A
absorbância é estável 60 minutos.
O procedimento sugerido para a medição é adequado para
fotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igual
ou menor que 1,0 mL. Deve ser feita uma verificação da
necessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado.
Os volumes de amostra e reagente podem ser modificados
proporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do teste,
e o procedimento de cálculos se mantém inalterado. Em caso
de redução dos volumes é fundamental que se observe o
volume mínimo necessário para a leitura fotométrica. Volumes
da amostra menores que 0,01 mL são críticos em aplicações
manuais e devem ser usados com cautela porque aumentam a
imprecisão da medição.
CÁLCULOS
Ver linearidade.
Absorbância doTeste
Glicose (mg/dL) =
x 100
Absorbância do Padrão
Exemplo:
ATeste = 0,322
A Padrão = 0,357
0,322
Branco da amostra: este procedimento é aplicável quando
houver ação positiva de interferentes. Misturar 1,0 mL de NaCl
150 mmol/L (0,85%) com 0,01 mL da amostra. Medir a
absorbância em 340 nm acertando o zero com água
deionizada ou destilada. Subtrair a absorbância assim obtida
da absorbância do teste e calcular a concentração.
Glicose (mg/dL) =
PREPARO DO REAGENTE DE TRABALHO
O conjunto de um frasco do Reagente 1 e um frasco do
Reagente 2 permite preparar o Reagente de Trabalho.
Transferir o conteúdo de um frasco de Reagente 2 para um
frasco de Reagente 1 e homogeneizar por inversão. Anotar a
data de expiração. Estável 5 dias entre 15 - 25 °C e 60 dias
entre 2 - 8°C quando não houver contaminação química ou
bacteriana. Identificar o frasco do Reagente de Trabalho para
evitar confusão com outros frascos do Reagente 1. Para
preservar seu desempenho o reagente deve permanecer fora
da geladeira somente o tempo necessário para se obter o
volume a ser utilizado. Evitar exposição à luz solar direta.
Fator de calibração =
x 100 = 90
0,357
Devido à grande reprodutibilidade que pode ser obtida com a
metodologia, o método do fator pode ser empregado
100
Absorbância do Padrão
Glicose (mg/dL) = Absorbância do Teste x Fator
Exemplo:
100
Fator =
= 280
0,357
Glicose (mg/dL) = 0,322 x 280 = 90
Pagina: 2
DIAGNÓSTICA
Plasma (jejum de 8 horas):
mg/dL x volume (mL)
70 a 99 mg/dL
Glicemia de jejum normal
100 a 125 mg/dL
Glicemia de jejum alterada
CALIBRAÇÃO
O padrão é rastreável ao Standard Reference Material (SRM)
917a do National Institute of Standards and Technology
(NIST).
³ a 126 mg/dL
Provável Diabetes Mellitus:
O diagnóstico de diabetes deve
ser confirmado em nova amostra
colhida em dia subseqüente.
Calibrações manuais
Obter o fator de calibração ao usar novo lote de
reagentes ou quando o controle interno da qualidade
indicar.
Líquor: 2/3 da glicemia quando a medição é realizada em
amostras colhidas simultaneamente.
Urina: menor que 20 mg/dL ou até 250 mg/24 horas
urina (mg/24 horas) =
100
"
Sistemas automáticos
Branco de reagentes: água ou solução de cloreto de
sódio 150 mmol/L (0,85%);
Padrões: usar calibradores protéicos. As
concentrações de Glicose no Calibra 1 e Calibra 2 são
rastreáveis ao SRM 965 do NIST.
"
"
"
Intervalo de calibrações
Deve-se recalibrar o sistema nas seguintes situações:
Calibração do branco ao usar novo frasco de
reagente;
Calibração de 2 ou 3 pontos ao mudar de lote;
Calibração de 2 ou 3 pontos quando o controle
interno da qualidade indicar.
"
"
"
LINEARIDADE
A reação é linear até 700 mg/dL. Para valores maiores, diluir a
amostra com NaCl 150 mmol/L (0,85%), realizar nova
determinação e multiplicar o resultado obtido pelo fator de
diluição. Diluir a amostra de tal modo que o valor encontrado se
situe entre 80 e 200 mg/dL. Sugerimos a verificação da
linearidade metodológica e fotométrica, no mínimo
semestralmente, utilizando amostras com valores até
700 mg/dL.
CONTROLE INTERNO DA QUALIDADE
O laboratório deve manter um programa de controle interno da
qualidade que defina claramente os objetivos, procedimentos,
normas, critérios para limites de tolerância, ações corretivas e
registro das atividades. Ao mesmo tempo deve manter um
sistema definido para monitorizar a variabilidade analítica que
ocorre em todo o sistema de medição. Portanto, o uso de
controles para avaliar a imprecisão e inexatidão das
determinações deve ser prática rotineira no laboratório clínico.
Sugere-se usar um controle com um valor situado na faixa de
referência ou no nível de decisão e outro controle com um valor
em outra faixa de significância clínica. Deve-se criar uma meta
de estado de controle para que a variação máxima encontrada
seja de 5% ou então utilizar o sistema de regras múltiplas de
7
Westgard para verificar a estabilidade do sistema de medição.
Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas Qualitrol 1 e
Qualitrol 2 da Labtest para controle interno da qualidade em
ensaios de química clínica.
VALORES DESEJÁVEIS OU RECOMENDADOS
Os valores abaixo substituem os valores de referência. Estes
valores foram determinados pela American Diabetes
Association (ADA) a partir de dados epidemiológicos
tratados estatisticamente e relacionam os níveis de
glicose com o risco de desenvolver diabetes mellitus
(Diabetes Care 2004; 27 (SUPPL 1): S5-S10 ou
http://care.diabetesjournals.org/cgi/content/full/27/suppl_1/s5).
Conversão: Unidades Convencionais (mg/dL) x 0,0556 =
Unidades SI (mmol/L).
8
CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO
Exatidão
Em duas amostras com concentrações de glicose iguais a
118 e 320 mg/dL foram adicionadas quantidades diferentes do
analito, obtendo-se uma recuperação entre 96 e 108%. O erro
sistemático proporcional médio obtido em um valor de
120 mg/dL foi igual a 2,4 mg/dL ou 2,0%.
Especificidade
O método proposto foi comparado com um método similar
utilizando 40 amostras com valores situados entre
25 e 590 mg/dL. A comparação resultou na equação da
regressão y = 0,995x + 1,01 e um coeficiente de correlação (r)
igual a 0,999. O erro sistemático total (constante e
proporcional) verificado no nível de decisão (120 mg/dL) foi
igual a 0,41 mg/dL ou 0,34%. Como as amostras foram
selecionadas aleatoriamente em pacientes de ambulatório e
pacientes hospitalizados, pode-se inferir que o método tem
uma especificidade metodológica adequada.
Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio
MÉDIA
DP
CV%
10
86
1,08
1,25
10
165
1,62
0,98
10
302
3,78
1,25
N
Amostra 1
Amostra 2
Amostra 3
Reprodutibilidade Imprecisão total
N
MÉDIA
DP
CV%
Amostra 1
10
88
2,52
2,90
Amostra 2
10
169
3,78
2,20
Amostra 3
10
300
5,04
1,70
Sensibilidade metodológica
Uma amostra protéica não contendo glicose foi utilizada para
calcular o limite de detecção do ensaio tendo sido encontrado
um valor igual a 2,9 mg/dL, equivalente à média de 20 ensaios
mais dois desvios padrão. Utilizando-se a absorbância do
padrão como parâmetro verificou-se que o limite de detecção
fotométrica é de 0,0277 mg/dL, correspondendo a uma
absorbância igual a 0,0001.
Efeitos da diluição da matriz
Três amostras com valores iguais a 500, 700 e 1000 mg/dL
foram utilizadas para avaliar a resposta do sistema nas
diluições da matriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usando
fatores de diluição que variaram de 2 a 8, encontrou-se uma
recuperação entre 95 e 103%.
Pagina: 3
DIAGNÓSTICA
SIGNIFICADO CLÍNICO
Valores elevados de glicose ocorrem nos vários tipos de
diabetes primários, nos estados de intolerância à glicose e no
diabetes secundário a várias doenças (hipertireoidismo,
hiperpituitarismo, hiperadrenocorticismo, etc.). Para uma
revisão dos critérios diagnósticos e classificação do
diabetes mellitus consultar Diabetes Care 2004; 27 (SUPPL 1):
S5-S10 ou:
http://care.diabetesjournals.org/cgi/content/full/27/suppl_1/s5).
Valores diminuídos de glicose ocorrem nas hipoglicemias que
podem ser devidas a várias causas. Quando a ocorrência de
sintomas de hipoglicemia é relacionada à alimentação, duas
formas de hipoglicemia podem ser definidas: hipoglicemia do
jejum e pós-prandial.
As causas mais comuns de hipoglicemia do jejum são:
hiperinsulinismo endógeno (insulinoma e sulfonilurea),
hiperinsulinismo exógeno (factício), tumores extrapancreáticos,
síndrome auto imune ( formação expontânea de anticorpos
para receptores da insulina), insuficiência supra-renal e ou
hipofisária, doença hepática grave e alcoolismo.
A hipoglicemia pós-prandial, dependendo da história clínica e
da resposta ao teste oral de tolerância à glicose, é classificada
em hipoglicemia alimentar, do diabético tipo II, do paciente com
intolerância à glicose, funcional ou reativa.
Para uma revisão dos critérios diagnósticos e classificação do
diabetes mellitus consultar Diabetes Care 2004; 27 (SUPPL 1):
S5-S10 ou:
http://care.diabetesjournals.org/cgi/content/full/27/suppl_1/s5).
A redução da concentração de glicose nos líquidos corporais
encontra-se usualmente relacionada a processos
inflamatórios ou infecciosos.
A determinação da concentração de glicose no líquor
representa um dos parâmetros para a distinção entre
meningite bacteriana e virótica tendo, porém, sensibilidade
inferior à avaliação da celularidade no mesmo material.
OBSERVAÇÕES
1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são
fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e
obtenção de resultados corretos.
2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidade
adequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes e
usar nas medições deve ter resistividade ³ 1 megaohm ou
condutividade £ 1 microsiemens e concentração de silicatos
< 0,1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a água
pode ser do tipo III com resistividade ³ 0,1 megaohms ou
condutividade £ 10 microsiemens. No enxágüe final utilizar
água tipo II. Quando a coluna deionizadora está com sua
capacidade saturada ocorre a produção de água alcalina com
liberação de vários íons, silicatos e substâncias com grande
poder de oxidação ou redução que deterioram os reagentes
em poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados de
modo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um
programa de controle da qualidade da água.
REFERÊNCIAS
1. Bergmeyer HU. Methods of Enzimatic Analisys, 3ed, vol 6,
Deerfield Beach: Verlag Chemie,1984;163-172.
2. Bjorkem I, Blomstrand R, Falk O, and Ohman G. Clin Chim
Acta 1976;72:353-62.
3. Bondar RJL, Mead D. Clin Chem 1974;20:586-90.
4. Inmetro - Boas Práticas de Laboratório Clínico e Listas de
Verificação para Avaliação, Qualitymark eds, Rio de Janeiro,
1997.
5. Kaplan LA, Pesce AJ.: Methods in Clinical Chemistry, St.
Louis: The C.V. Mosby Co., 1987;105-11.
6. Tietz NW. Fundamentals of Clinical Chemistry, Philadelphia:
W.B. Saunders Co, 1970;155.
7. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem
1981;27:493-501.
8. Labtest : Dados de Arquivo.
APRESENTAÇÃO
Catálogo
Nº de testes
Volume/teste
Reagente 1
Reagente 2
Padrão
85-4/50
200
1,0 mL
4 x 40 mL
4 x 10 mL
1 x 5 mL
O número de testes em aplicações automáticas depende dos
parâmetros de programação.
INFORMAÇÕES AO CONSUMIDOR
Termos e Condições de Garantia
A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produto
dentro das especificações até a data de expiração indicada
nos rótulos, desde que os cuidados de utilização e
armazenamento indicados nos rótulos e nestas instruções
sejam seguidos corretamente.
SERVIÇO DE APOIO AO CLIENTE
Telefone 0800-31-3411 - Ligação Gratuita
e-mail: [email protected]
Estão disponíveis as aplicações para sistemas automáticos.
Labtest Diagnóstica S.A.
CGC: 16.516.296 / 0001 - 38
Av. Paulo Ferreira da Costa, 600 - Vista Alegre
Lagoa Santa - Minas Gerais - Brasil - 33400-000
Telefone (31) 3681-9288
Fax (31) 3681-9344
www.labtest.com.br
3. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas e
medicamentosas de interferência nos resultados e na
metodologia sugere-se consultar Young DS Effects of Drugs on
Clinical Laboratory Tests, 3ª edição, Washington: AACC Press,
1990.
Revisão: Outubro, 2001
Ref.: 150604
Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.
Reprodução sob prévia autorização
Pagina: 4
Instruções de Uso
PROTEÍNAS TOTAIS
Cat. 99
ANVISA 10009010080
FINALIDADE
Sistema para a determinação colorimétrica das Proteínas
Totais em amostras de sangue e líquidos pleural, sinovial e
ascítico por reação de ponto final.
Somente para uso diagnóstico in vitro.
PRINCÍPIO
+2
Os íons cobre (Cu ) em meio alcalino (Reagente de Biureto)
reagem com as ligações peptídicas das proteínas séricas
formando cor púrpura, que tem absorbância máxima em
545 nm, proporcional à concentração das proteínas na
amostra.
CARACTERÍSTICAS DO SISTEMA
O sistema Proteínas Totais da Labtest é um método direto e
rápido que tem elevada sensibilidade, associada com a
especificidade da reação de biureto que é uma das reações
mais simples e exatas para determinação das proteínas em
líquidos biológicos. O reagente possui excelente estabilidade e
resposta semelhante para todas as proteínas do soro.
Concentrações moderadas de bilirrubina e hemoglobina
presentes na amostra não provocam erros significativos. As
concentrações de triglicérides maiores que 500 mg/dL
produzem interferências positivas que podem ser minimizadas
utilizando branco de amostra ou aplicando fotometria de leitura
bicromática com filtro primário em 545 nm e filtro secundário
em 700 nm.
O sistema é facilmente aplicável em analisadores semiautomáticos e automáticos capazes de medir com exatidão a
absorbância entre 530 e 550 nm.
METODOLOGIA
Biureto.
REAGENTES
1. Reagente Biureto - Armazenar entre 15 - 30 °C. Reagente
pronto para uso.
Contém hidróxido de sódio 600 mmol/L, sulfato de cobre
12 mmol/L, estabilizador e antioxidante. Manusear com
cuidado. Reagente corrosivo. Não pipetar com a boca.
2. Padrão 4,0 g/dL - Armazenar entre 15 - 30 °C. Armazenar
bem vedado para evitar evaporação
Contém albumina bovina 4 g/dL e azida sódica 14,6 mmol/L.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nas
condições indicadas, são estáveis até a data de expiração
impressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estão
sujeitos à contaminações de natureza química e microbiana
que podem provocar redução da estabilidade.
PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS
Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na
manipulação dos reagentes que não devem ser pipetados com
a boca. O Reagente Biureto contém hidróxido de sódio que é
corrosivo e pode produzir queimaduras. No caso de contato
com os olhos deve-se lavar imediatamente com grande
quantidade de água e procurar auxílio médico. Em caso de
ingestão oferecer grande quantidade de água com suco de
limão ou vinagre. Não provocar vômitos. Procurar auxílio
médico. Devem-se utilizar os equipamentos de proteção
adequados para manipular reagentes corrosivos.
O Padrão contém azida sódica, que é tóxica. Deve-se tomar
cuidado para evitar a ingestão e, no caso de contato com os
olhos, deve-se lavar imediatamente com grande quantidade
de água e procurar auxílio médico. A azida pode formar
compostos altamente explosivos com tubulações de chumbo e
cobre. Utilizar grandes volumes de água para descartar o
reagente.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nas
condições indicadas e manuseados de acordo com as boas
práticas de laboratório, são estáveis até a data de expiração
impressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estão
sujeitos à contaminações de natureza química e microbiana
que podem provocar redução da estabilidade.
MATERIAIS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOS
Fotômetro capaz de medir, com exatidão, a absorbância entre
530 e 550 nm e opcionalmente entre 700 e 800 nm.
Analisador automático capaz de processar 1 reagente (para
aplicações automáticas).
Pipetas para medir amostras e reagentes (aplicações
manuais).
Cronômetro (para aplicações manuais).
INFLUÊNCIAS PRÉ-ANALÍTICAS
Em amostras colhidas durante a manhã, as concentrações das
proteínas são 3% maiores que em amostras colhidas no
período da tarde. A mudança da posição em pé para a posição
deitada, provoca uma passagem de líquido do espaço
extravascular para os espaços intravasculares, que pode
reduzir as concentrações relativas das proteínas e dos analitos
ligados às proteínas em até 10%. No período de gestação,
devido ao aumento do líquido intravascular, a proteína total
diminui significativamente podendo apresentar reduções de
até 14%.
Quando o torniquete é mantido por mais de 3 minutos durante
a colheita da amostra, ocorre um aumento de até 5% no valor
da proteína total no sangue. Exercícios físicos aumentam as
concentrações das proteínas.
Soros fortemente hemolisados ou contendo expansores de
plasma (Dextran, PVP e Hemacel) nas amostras leva a
obtenção de resultados falsamente elevados.
AMOSTRA
Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP)
que estabeleça procedimentos adequados para colheita,
preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos que
os erros devidos à amostra podem ser muito maiores que os
erros ocorridos durante o procedimento analítico.
Usar soro e líquidos (pleural, sinovial e ascítico). As proteínas
são estáveis 3 dias entre 2 - 8 °C e 7 dias a 10 °C negativos.
A metodologia não é adequada para a dosagem das proteínas
na urina ou no líquor. Para estas amostras deve ser utilizada a
5
6
metodologia proposta por Meulemans e Pennock , ou utilizar
o produto Sensiprot Labtest, (Cat. 36).
Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras
de sangue não transmitem infecções, todas elas devem ser
consideradas como potencialmente infectantes. Portanto, ao
manuseá-las devem-se seguir as normas estabelecidas para
biossegurança.
Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimos
aplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteção
ambiental.
INTERFERÊNCIAS
As concentrações de bilirrubina até 32 mg/dL, hemoglobina até
130 mg/dL e triglicérides até 500 mg/dL não produzem
interferências significativas.
Exemplo:
Absorbância do teste = 0,405
Absorbância do padrão = 0,238
Concentrações de triglicérides entre 500 mg/dL e 1100 mg/dL
produzem interferências positivas que podem ser minimizadas
utilizando o Branco da Amostra ou fotometria de leitura
bicromática com filtro primário em 545 nm e filtro secundário
em 700 nm.
Proteínas Totais =
Concentrações de hemoglobina maiores que 130 mg/dL
produzem interferências positivas que não podem ser
minimizadas utilizando o Branco da Amostra.
Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina em
uma amostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo:
Diluir 0,05 mL da amostra em 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L
(0,85%) e medir a absorbância em 405 ou 415 nm acertando o
zero com água deionizada ou destilada.
0,405
x 4 g/dL = 6,80 g/dL
0,238
Devido a grande reprodutibilidade que pode ser obtida com a
metodologia, pode-se utilizar o método do fator para calcular
as concentrações das amostras com absorbância dentro do
intervalo de linearidade.
4 g/dL
Fator de calibração =
Absorbância do padrão
Proteínas Totais = Absorbância do teste x Fator (g/dL)
Exemplo:
4 g/dL
Fator =
= 16,80 g/dL
0,238
Hemoglobina (mg/dL) @ Absorbância405 x 601
Hemoglobina (mg/dL) @ Absorbância415 x 467
Proteínas Totais = 0,405 x 16,80 g/dL = 6,80 g/dL
Minimização da Ação de Interferentes
Branco da Amostra: Misturar 1,0 mL de NaCl 150 mmol/L
(0,85%) com 0,02 mL da amostra. Medir a absorbância em 545
nm, acertando o zero com água destilada ou deionizada.
Subtrair a absorbância assim obtida da absorbância do teste e
calcular a concentração. Este sistema de correção só pode ser
aplicado nos casos em que a amostra produz uma
interferência fotométrica como ocorre nas amostras lipêmicas
ou com concentração de bilirrubina maior que 32 mg/dL.
PROCEDIMENTO
Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:
Amostra
Padrão (n° 2)
Água destilada
Ou deionizada
Reagente Biureto
BRANCO
TESTE
PADRÃO
---
0,02 mL
---
---
---
0,02 mL
0,02 mL
---
---
1,0 mL
1,0 mL
1,0 mL
Misturar e incubar a 37 °C durante 10 minutos. Determinar as
absorbâncias do teste e padrão em 545 nm (530 a 550),
acertando o zero com o branco. A cor é estável durante 1 hora.
O procedimento sugerido para a medição é adequado para
fotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igual
ou menor que 1,0 mL. Deve ser feita uma verificação da
necessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado.
Os volumes de amostra e reagente podem ser modificados
proporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do teste.
O procedimento de cálculo se mantém inalterado. Em caso de
redução dos volumes é fundamental que se observe o volume
mínimo necessário para a leitura fotométrica. Volumes da
amostra menores que 0,01 mL são críticos em aplicações
manuais e devem ser usados com cautela porque aumentam a
imprecisão da medição.
CÁLCULOS
Ver linearidade.
Absorbância do teste
Proteínas Totais =
x (4 g/dL)
Absorbância do padrão
CALIBRAÇÃO
A concentração de proteínas no Padrão (No. 2) e nos
calibradores da serie Calibra é rastreável ao Standard
Reference Material (SRM) 927 do National Institute of
Standards and Technology (NIST).
Calibrações manuais
Obter o fator de calibração ao usar novo lote de reagentes
ou quando o controle interno da qualidade indicar.
"
Sistemas automáticos
Branco de reagentes: água ou solução de cloreto de sódio
150 mmol/L (0,85%);
Usar os calibradores da linha Calibra Labtest.
Intervalo de calibrações
Calibração de 2 ou 3 pontos ao mudar de lote;
Calibração de 2 ou 3 pontos quando o controle interno
da qualidade indicar.
"
"
"
"
"
LINEARIDADE
O resultado da medição é linear entre 1,0 e 14,0 g/dL. Para
valores maiores diluir a amostra com NaCI 150 mmol/L
(0,85%) e repetir a medição. Multiplicar o resultado obtido pelo
fator de diluição. Diluir a amostra de tal modo que o valor
encontrado se situe entre 4,0 e 8,0 g/dL. Sugerimos a
verificação da linearidade metodológica e fotométrica, no
mínimo semestralmente, utilizando amostras com valores até
14,0 g/dL.
CONTROLE INTERNO DA QUALIDADE
O laboratório deve manter um programa de controle interno da
qualidade que defina claramente os regulamentos aplicáveis,
objetivos, procedimentos, critérios para especificações da
qualidade e limites de tolerância, ações corretivas e registro
das atividades. Ao mesmo tempo deve manter um sistema
definido para monitorar a variabilidade analítica que ocorre em
todo o sistema de medição. Portanto, o uso de controles para
avaliar a imprecisão e inexatidão das determinações deve ser
prática rotineira no laboratório clínico. Sugere-se usar um
controle com um valor situado na faixa de referência ou no
nível de decisão e outro controle com um valor em outro nível
de significância clínica. Deve-se criar uma meta de estado de
controle para que o coeficiente de variação máximo seja
£ 2,0% com um erro total em relação ao valor real £ 5,2 % ou
7
então utilizar um sistema de regras de controle para verificar a
estabilidade do sistema de medição.
Especificações de erro máximo baseadas na Variação
Biológica: Imprecisão (CV%) £ 2,0%; Bias: £ ± 1,8%; Erro total:
£ 5,2%.
Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas da linha
Qualitrol Labtest para controle interno da qualidade em
ensaios de química clínica.
VALORES DE REFERÊNCIA
Estes valores devem ser usados apenas como orientação.
Recomenda-se que cada laboratório estabeleça, na
população atendida, sua própria faixa de valores de referência.
Soro: 6,0 a 8,0 g/dL.
Conversão: Unidades Convencionais (g/dL) x 10 = Unidades
SI (g/L).
8
CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO
Exatidão
Em duas amostras com concentração de Proteína igual a
6,3 g/dL foram adicionadas quantidades diferentes do analito,
obtendo-se recuperações entre 99,4 e 99,6%. O erro
sistemático proporcional médio obtido em um valor de 6,0 g/dL
é igual a 0,03 g/dL ou 0,5%.
Estudos de comparação de métodos
O método Proteínas Totais Labtest foi comparado com outro
método utilizando tecnologia similar, sendo obtidos os
seguintes resultados:
Método
Comparativo
20
20
2,53 a 12,45
2,68 a 12,35
7,72
7,77
Número de amostras
Intervalo de concentração (g/dL)
Média das estimativas (g/dL)
Equação da regressão
Proteínas Totais
Labtest
Método Labtest =
0,965xComparativo + 0,315 g/dL
Coeficiente de correlação
0,999
Erro sistemático médio (g/dL)
0,05
O erro sistemático médio é igual a 1,75% no nível de decisão
6,0 g/dL e 0,44% no nível de decisão 8,0 g/dL. Os erros são
menores que o erro sistemático analítico da especificação
baseada na variação biológica que é ± 1,8%. Confirma-se a
hipótese nula de que as diferenças entre o método Proteínas
Totais Labtest e o método comparativo não se desviam em
mais que o desvio provocado pelas imprecisões inerentes,
caracterizando a identidade ou relação funcional entre os
métodos. O erro total (erro aleatório + erro sistemático)
estimado em um nível de decisão igual a 6,0 g/dL, é igual a
0,11 g/dL ou 3,55%. O método Labtest é substancialmente
equivalente ao método comparativo. O coeficiente de
correlação (0,999) confirma a força da relação entre os
métodos.
Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio
N
MÉDIA
DP (g/dL)
CV%
Amostra 1
20
4,68
0,03
0,64
Amostra 2
20
6,40
0,04
0,63
Amostra 3
20
8,20
0,05
0,61
Reprodutibilidade - Imprecisão total
N
MÉDIA
DP (g/dL)
CV%
Amostra 1
20
4,68
0,05
1,07
Amostra 2
20
6,40
0,07
1,09
Amostra 3
20
8,20
0,06
0,73
Sensibilidade Metodológica
Utilizando-se a absorbância do padrão como parâmetro, o
limite de detecção fotométrica é 0,0168 g/dL, correspondendo
a uma absorbância igual a 0,001.
Efeitos da Diluição da Matriz
Duas amostras com valores iguais a 12,3 e 15,1 g/dL foram
utilizadas para avaliar a resposta do sistema nas diluições da
matriz com NaCl 150 mmol/L. Usando um fator de diluição
igual a 2, foram encontradas recuperações entre 100,5% e
101,3%. Os erros sistemáticos encontrados são
significativamente menores que o bias analítico da
especificação baseada nos componentes da variação
biológica.
SIGNIFICADO CLÍNICO
A dosagem isolada da proteína total tem pouco valor, porque a
alteração em uma das frações pode ser compensada por
alteração oposta de outra fração, como ocorre nas doenças
crônicas em que há diminuição de albumina com aumento de
gamaglobulina. Ocorrência similar pode ser observada em
respostas de fase aguda, tais como infecções ou traumas,
ocasião em que muitas proteínas plasmáticas produzidas no
fígado aumentam sua concentração, enquanto a albumina se
reduz, mantendo a concentração protéica total praticamente
inalterada.
As proteínas estão aumentadas em algumas neoplasias,
especialmente em mieloma múltiplo; na macroglobulinemia;
doenças autoimunes, como artrite reumatóide e lupus
eritematoso sistêmico; doenças granulomatosas como a
sarcoidose, leishmaniose visceral; endocardite bacteriana
sub-aguda e linfogranuloma; em alguns casos de doença
hepática crônica, como hepatite autoimune e na desidratação.
As proteínas estão diminuídas na gravidez; hiperhidratação,
desnutrição grave, cirrose e outras doenças hepáticas,
incluindo alcoolismo crônico; imobilização prolongada;
insuficiência cardíaca; nefrose e insuficiência renal;
hipertireoidismo; deficiência de cálcio e vitamina D e na
síndrome de má absorção.
A dosagem de proteína no líquido sinovial tem sensibilidade de
52% e especificidade de 56% nas doenças inflamatórias. A
determinação da concentração de proteínas no líquido pleural
é de pouco valor, exceto quando combinada com outros
parâmetros que permitam fazer a diferença entre exsudato e
transudato. Em 15 a 20% dos indivíduos com hepatopatias
acompanhadas de ascite, a concentração de proteína no
líquido ascítico é superior a 2,5 g/dL. Nos pacientes com ascite
de etiologia neoplásica, as concentrações de proteínas são
menores que 2,5 g/dL.
OBSERVAÇÕES
1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são
fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e
obtenção de resultados corretos.
2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidade
adequada a cada aplicação. Assim, para usar nas medições,
deve ter resistividade ³ 1 megaohm ou condutividade
£ 1 microsiemens e concentração de silicatos < 0,1 mg/L (água
tipo II). Para o enxágüe da vidraria a água pode ser do tipo III,
com resistividade ³ 0,1 megaohms ou condutividade
£ 10 microsiemens. No enxágüe final utilizar água tipo II.
Quando a coluna deionizadora está com sua capacidade
saturada ocorre a produção de água alcalina com liberação de
vários íons, silicatos e substâncias com grande poder de
oxidação ou redução que deterioram os reagentes em poucos
dias ou mesmo horas, alterando os resultados de modo
imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um programa
de controle da qualidade da água.
Labtest Diagnóstica S.A.
CNPJ: 16.516.296/0001-38
Av. Paulo Ferreira da Costa, 600
Lagoa Santa - Minas Gerais - Brasil - 33400-000
Telefone (31) 3681-9288
Fax (31) 3681-9344
www.labtest.com.br
3. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas e
medicamentosas de interferência nos resultados e na
metodologia sugere-se consultar: www.fxol.org/
REFERÊNCIAS
1. Burtis CA, Ashwood ER. Tietz Textbook of Clinical
C h e m i s t r y, 2 a . E d i ç ã o , W B S a u n d e r s
Company:Philadelphia, 1986, 695-700.
2. Faulkner WR, Meites S. Selected Methods for the
S m a l l C l i n i c a l C h e m i s t r y L a b o r a t o r y,
AACC:Washington,1982;9:317-320.
3. Henry RJ, Cannon DC, Winkelman JW. Clinical Chemistry,
Principles and Technics, 2a. Edição. Harper & Row:New
York, 1974,405-435.
4. Inmetro - Boas Praticas de Laboratório Clínico e Listas de
Verificação para Avaliação, Qualitymark eds:Rio de Janeiro,
1997.
5. Meulemans O. Clin Chim Acta 1960;5:757.
6. Pennock CA., Passant LP, Bolton FG. J Clin Path
1968;21:518.
7. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem
1981;27:493-501.
8. Labtest: Dados de Arquivo.
APRESENTAÇÃO
Catálogo
Reagente Biureto
Padrão
99-100
99-250
1 x 100 mL
1 x 3 mL
1 x 250 mL
1 x 3 mL
O número de testes em aplicações automáticas depende dos
parâmetros de programação.
INFORMAÇÕES AO CONSUMIDOR
Termos e Condições de Garantia
A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produto
dentro das especificações até a data de expiração indicada
nos rótulos desde que os cuidados de utilização e
armazenamento indicados nos rótulos e nestas instruções
sejam seguidos corretamente.
Serviço de Apoio ao Cliente
Telefone: 0800 31-3411 (Ligação gratuita)
e-mail: [email protected] Estão disponíveis aplicações para
sistemas automáticos.
Revisão: Agosto, 2005.
Ref.: 180805
Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.
Reprodução sob prévia autorização
Instruções de Uso
TRANSAMINASE
OXALACÉTICA
Cat. 52
ANVISA 10009010031
FINALIDADE
Sistema para medida da atividade da Transaminase
Oxalacética (TGO) em amostra de sangue por método cinético
de tempo fixo e medição de ponto final.
Somente para uso diagnóstico in vitro.
PRINCÍPIO
A transaminase oxalacética promove a transferência de
grupamentos amina de a-aminoácidos para a-cetoácidos.
TGO
L-Aspartato + a-cetoglutarato
Glutamato + Oxalacetato
O oxalacetato formado é medido através da formação de
hidrazona, a qual tem intensa cor em meio alcalino.
CARACTERÍSTICAS DO SISTEMA
O sistema Transaminase Oxalacética Labtest contém todos os
reagentes necessários a uma segura determinação, utilizando
um processo em 4 etapas e permitindo que a fotometria seja
realizada em qualquer fotômetro que tenha filtros com emissão
entre 490 a 540 nm.
Os reagentes são rigorosamente padronizados e estabilizados
visando à manutenção de rígidas e ótimas condições para a
ação enzimática.
O hidróxido de sódio é preparado e titulado em condições de
rigoroso controle, o que elimina a presença de carbonato e
assegura uma ação correta do reagente.
METODOLOGIA
Reitman e Frankel.
REAGENTES
1. TGO Substrato - Armazenar entre 2 - 8 ºC.
Contém tampão 67 mmol/L, pH 7,4; ácido a-cetoglutárico
2,0 mmol/L, ácido L-aspártico 99 mmol/L e azida sódica
15,4 mmol/L.
2. Reagente de Cor - Armazenar entre 2 - 8 ºC. Não congelar.
Contém 2,4-dinitrofenilhidrazina 1,0 mmol/L e ácido clorídrico
1,0 mol/L.
3. NaOH - Estoque - Armazenar entre 15 - 25 ºC.
Contém hidróxido de sódio 1,25 mol/L. Reagente corrosivo.
4. Padrão - Armazenar entre 2 - 8 ºC.
Contém piruvato de sódio 2 mmol/L. Após o manuseio
sugere-se armazenar bem vedado para evitar evaporação.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nas
condições indicadas, são estáveis até a data de expiração
impressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estão
sujeitos à contaminações de natureza química e microbiana
que podem provocar redução da estabilidade.
PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS
Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na
manipulação de reagentes.
O NaOH - Estoque contém hidróxido de sódio que é corrosivo e
pode produzir queimaduras.
O TGO Substrato contém azida sódica que é tóxica. Deve-se
tomar cuidado para evitar a ingestão e, no caso de contato com
os olhos, deve-se lavar imediatamente com grande quantidade
de água e procurar auxílio médico. A azida pode formar
compostos altamente explosivos com tubulações de chumbo e
cobre. Utilizar grandes volumes de água para descartar o
reagente.
Como ocorre com toda reação enzimática, a rigorosa
observação do tempo e da temperatura de incubação é de
grande importância para a qualidade dos resultados obtidos. A
diferença de 1 minuto no tempo de incubação desta dosagem
introduz um erro de 3,3% nos resultados.
MATERIAL NECESSÁRIO E NÃO FORNECIDO
Banho-maria mantido à temperatura constante (37 ºC)
Fotômetro capaz de medir, com exatidão, a absorbância entre
490 e 540 nm.
Pipetas para medir amostras e reagentes.
Cronômetro.
INFLUÊNCIAS PRÉ-ANALÍTICAS
Amostras hemolisadas produzem interferência positiva devido
à elevada concentração de TGO nas hemácias.
O alcoolismo crônico aumenta a atividade da TGO de 18 a
100%.
AMOSTRA
Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP)
que estabeleça procedimentos adequados para colheita,
preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos que
os erros devidos à amostra podem ser muito maiores que os
erros ocorridos durante o procedimento analítico.
Usar soro ou plasma (EDTA, heparina) e líquor. A atividade
enzimática é estável 4 dias entre 2 - 8 ºC e 2 semanas a 10 ºC
negativos.
Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras
de sangue não transmitem infecções, todas elas devem ser
consideradas como potencialmente infectantes. Portanto, ao
manuseá-las devem-se seguir as normas estabelecidas para
biossegurança.
Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimos
aplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteção
ambiental.
INTERFERÊNCIAS
Valores de Bilirrubina até 5 mg/dL e Triglicérides até 170 mg/dL
não produzem interferências significativas.
Amostras hemolisadas produzem interferência positiva devido
à elevada concentração de TGO nas hemácias.
Valores de Triglicérides entre 170 e 900 mg/dL produzem
interferência positiva que pode ser minimizada utilizando o
Branco de Amostra.
Minimização da Ação de Interferentes
Branco de Amostra: Misturar 3,0 mL de NaCl 150 mmol/L
(0,85%) com 0,05 mL da amostra. Medir a absorbância em
505 nm ou filtro verde (490 a 540), acertando o zero com água
destilada ou deionizada. Subtrair a absorbância assim obtida
da absorbância do teste e obter a atividade da transaminase
oxalacética utilizando a curva de calibração. Este sistema de
correção é aplicável apenas nos casos em que a amostra
produz interferência fotométrica.
PREPARO DO REAGENTE
Ver observações 1 e 2.
NaOH de Uso
NaOH de Uso:
Transferir quantitativamente o conteúdo do frasco nº 3
(160 mL) para um balão volumétrico ou proveta, completar
para 500 mL com água destilada ou deionizada livre de CO2 e
homogeneizar. Estável 12 meses em recipiente de plástico
entre 15 - 25 ºC.
A água utilizada deve ter resistividade ³1 megaohm ou
condutividade £1 microsiemens e concentração de silicatos
< 0,1 mg/L.
CURVA DE CALIBRAÇÃO
Como o sistema de medida Reitman-Frankel (Unidades/mL)
não segue a lei de Beer, é impossível utilizar o método do fator
para cálculo, sendo necessária a preparação de curva de
calibração.
Tomar 5 tubos de ensaio e proceder como a seguir:
Tubo nº
1
2
3
4
5
mL
mL
mL
mL
mL
Padrão (nº 4)
---
0,1
0,2
0,3
0,4
TGO Substrato (nº 1)
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
Água destilada ou deionizada 0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
Reagente de Cor (nº 2)
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
Misturar e deixar a temperatura ambiente durante 20 minutos.
NaOH de Uso
10,0 10,0 10,0 10,0 10,0
Misturar e deixar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
Determinar as absorbâncias ou T% em 505 nm ou filtro verde
(490 a 540), acertando o zero com água destilada ou
deionizada. A cor é estável por 60 minutos.
TRAÇADO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO
Traçar a curva de calibração correlacionando as leituras
obtidas com os valores em Unidades/mL expressos na tabela
abaixo, utilizando papel linear (para absorbâncias) ou monolog
(para T%).
Tubo nº
TGO (Unidade/mL)
1
2
3
Zero 24
61
4
5
114 190
PROCEDIMENTO
Ver observação 3.
Tomar 1 tubo de ensaio e proceder como a seguir:
Teste
TGO Substrato (nº 1)
0,25 mL
Incubar em banho-maria a 37 ºC durante 2 minutos. O nível da
água no banho deve ser superior ao nível dos reagentes nos
tubos de ensaio.
Amostra
0,05 mL
Misturar e incubar em banho-maria a 37 ºC exatamente 60
minutos.
Reagente de Cor (nº 2)
0,25 mL
Misturar e deixar a temperatura ambiente 20 minutos.
2,5 mL
Misturar e esperar 5 minutos. Determinar as absorbâncias ou
T% em 505 nm ou filtro verde (490 a 540), acertando o zero
com água destilada ou deionizada. A cor é estável 60 minutos.
Obter o valor de TGO usando a curva de calibração (ver
Desempenho do Sistema).
O procedimento sugerido para a medição é adequado para
fotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igual
ou menor que 3,0 mL. Deve ser feita uma verificação da
necessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado.
Os volumes de amostra e reagente podem ser modificados
proporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do teste
e o procedimento de cálculo se mantém inalterado. Em caso de
redução dos volumes é fundamental que se observe o volume
mínimo necessário para a leitura fotométrica. Volumes da
amostra menores que 0,01 mL são críticos em aplicações
manuais e devem ser usados com cautela porque aumentam a
imprecisão da medição.
DESEMPENHO DO SISTEMA
Quando for obtido um valor igual ou maior que 190
Unidades/mL, diluir a amostra com NaCl 150 mmol/L (0,85%),
realizar nova medição e multiplicar o resultado obtido pelo fator
de diluição. Diluir a amostra de tal modo que o valor encontrado
se situe entre 50 e 150 Unidades/mL. Sugerimos a verificação
do desempenho do sistema no mínimo semestralmente,
utilizando amostras com valores até 190 Unidades/mL.
CONTROLE INTERNO DA QUALIDADE
O laboratório deve manter um programa de controle interno da
qualidade que defina claramente os objetivos, procedimentos,
normas, critérios para limites de tolerância, ações corretivas e
registro das atividades. Ao mesmo tempo deve manter um
sistema definido para monitorar a variabilidade analítica que
ocorre em todo o sistema de medição. Portanto, o uso de
controles para avaliar a imprecisão e inexatidão das
determinações deve ser prática rotineira do laboratório clínico.
Sugere-se usar um controle com um valor situado na faixa de
referência ou no nível de decisão e outro controle com um valor
em outra faixa de significância clínica. Deve-se criar uma meta
de estado de controle para que a variação máxima encontrada
seja de 10% ou então utilizar o sistema de regras múltiplas de
7
Westgard para avaliação do estado de controle.
Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas da linha
Qualitrol da Labtest para controle interno da qualidade em
ensaios de química clínica.
VALORES DE REFERÊNCIA
Estes valores devem ser usados apenas como orientação.
Recomenda-se que cada laboratório estabeleça, na
população atendida, sua própria faixa de valores de referência.
Soro: 4 a 36 Unidades/mL
UI = Unidades/mL x 0,482
8
CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO
Exatidão
Em duas amostras com concentrações de transaminase
oxalacética iguais a 22 e 129 Unidades/mL foram adicionadas
quantidades diferentes da enzima obtendo-se recuperações
entre 104 e 108%. O erro sistemático proporcional médio
obtido em um valor de 60 Unidades/mL foi igual a 3,6
Unidades/mL ou 6,0%.
Especificidade
O método proposto foi comparado com um método similar
utilizando 80 amostras com valores situados entre 11 e 174
Unidades/mL. A comparação resultou na equação da
regressão: y = 0,895x - 6,818 e um coeficiente de correlação (r)
igual a 0,99. O erro sistemático total (constante e proporcional)
verificado no nível de decisão (60 Unidades/mL) foi igual a 13
Unidades/mL ou 22%. Como as amostras foram selecionadas
aleatoriamente em pacientes de ambulatório e pacientes
hospitalizados, pode-se inferir que o método tem uma
especificidade metodológica adequada.
Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio
N
MÉDIA
DP
CV%
Amostra 1
20
19
1,53
7,9
Amostra 2
20
61
2,66
4,4
Reprodutibilidade Imprecisão total
N
MÉDIA
DP
CV%
Amostra 1
20
20
2,86
14,7
Amostra 2
20
59
3,85
6,53
Sensibilidade metodológica
Uma amostra protéica não contendo transaminase oxalacética
foi utilizada para calcular o limite de detecção do ensaio tendo
sido encontrado um valor igual a 5,0 Unidades/mL, equivalente
à média de 20 ensaios mais dois desvios padrão.
Efeitos da diluição da matriz
Duas amostras com valores iguais a 149 e 165 Unidades/mL
foram utilizadas para avaliar a resposta do sistema nas
diluições da matriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usando
fatores de diluição que variaram de 2 a 8 foram encontradas
recuperações entre 88 e 100%.
SIGNIFICADO CLÍNICO
Elevações das transaminases ocorrem na hepatite (viral e
tóxica), na mononucleose, cirrose, colestase, carcinoma
hepático primário ou metatástico, pancreatite, traumatismo
extenso e no choque prolongado. Nas hepatopatias agudas,
geralmente, o valor da transaminase pirúvica (ALT) excede o
da oxalacética (AST).
A transaminase oxalacética quase sempre está elevada após o
infarto agudo do miocárdio, fato incomum para a pirúvica. A
transaminase oxalacética começa a elevar-se 6 a 12 horas
após o infarto para alcançar o pico máximo entre 24 a 48 horas,
normalizando-se pelo 5º ou 6º dia. Deve-se ressaltar que a
sensibilidade e especificidade da dosagem de AST no
diagnóstico do infarto agudo do miocárdio são baixas,
tornando a determinação desta enzima a menos indicada para
este diagnóstico.
A uremia encontra-se associada à queda da AST.
Elevações significativas da atividade da AST no líquor têm sido
observadas em pacientes com acidentes cerebrovasculares.
Se o nível sérico da enzima encontra-se também elevado,
trata-se provavelmente de dano maciço ao parênquima
cerebral. Neoplasias envolvendo o cérebro e a medula
espinhal são acompanhadas de vários graus de elevação na
atividade da AST no líquor.
Nos indivíduos com meningite bacteriana observam-se,
usualmente, valores dentro da faixa de referência.
Várias drogas comumente usadas encontram-se relacionadas
ao aumento da AST: isoniazida, fenotiazinas, eritromicina,
progesterona, esteróides, opiáceos, indometacina, halotano e
metildopa.
OBSERVAÇÕES
1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são
fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e
obtenção de resultados corretos.
2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidade
adequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes e
usar nas medições, deve ter resistividade ³1 megaohm ou
condutividade £1 microsiemens e concentração de silicatos
<0,1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a água
pode ser do tipo III, com resistividade ³0,1 megaohms ou
condutividade £10 microsiemens. No enxágüe final utilizar
água tipo II. Quando a coluna deionizadora está com sua
capacidade saturada ocorre a produção de água alcalina com
liberação de vários íons, silicatos e substâncias com grande
poder de oxidação ou redução que deterioram os reagentes
em poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados de
modo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um
programa de controle da qualidade da água.
3. Para uma revisão das fontes medicamentosas de
interferência nos resultados e na metodologia, sugere-se
consultar Young, DS. Effects of Drugs on Clinical Laboratory
a
Tests, 3 edição, Washington: AACC Press, 1990.
REFERÊNCIAS
1. Karmen A. J Clin Invest 1955;34:131.
2. Reitman S, Frankel S. Am J Clin Path 1957;28:56.
3. Tietz NW. Fundamentals of Clinical Chemistry, W.B.
Saunders Co, 1970.
4. Tonks DB. Quality Control in Clinical Laboratories, WarnerChilcott Laboratories, Diagnostic Reagents Division,
Scarborough, Canada, 1972.
5. Varley H. Practical Clinical Biochemistry, Willian Heinemann
Medical Book Ltd. 1967.
6. Wroblewski F, Cabaud P. Am J Clin Path 1957;27:235.
7. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Growth T.1981;27:493501.
8. Labtest: Dados de arquivo.
APRESENTAÇÃO
Catálogo
Nº de testes
Volume/Teste
TGO Substrato
Reagente de Cor
NaOH - Estoque
Padrão
52-200
200
3,0 mL
1 x 50 mL
1 x 50 mL
1 x 160 mL
1 x 4 mL
INFORMAÇÕES AO CONSUMIDOR
Termos e Condições de Garantia A Labtest Diagnóstica
garante o desempenho deste produto dentro das
especificações até a data de expiração indicada nos rótulos,
desde que os cuidados de utilização e armazenamento
indicados nos rótulos e nestas instruções sejam seguidos
corretamente.
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Revisão: Outubro, 2004
Ref.: 181104
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Reprodução sob prévia autorização
Instruções de Uso
TRANSAMINASE
PIRÚVICA
Cat. 53
ANVISA 10009010027
FINALIDADE
Sistema para medida da atividade da Transaminase Pirúvica
(TGP) em amostra de sangue por método cinético de tempo
fixo e medição de ponto final.
Somente para uso diagnóstico in vitro.
PRINCÍPIO
A transaminase pirúvica promove a transferência de
grupamentos amina de a-aminoácidos para a-cetoácidos.
TGP
L- Alanina + a-cetoglutarato
Glutamato + Piruvato
O piruvato formado é medido através da formação de
hidrazona, a qual tem intensa cor em meio alcalino.
CARACTERÍSTICAS DO SISTEMA
O sistema Transaminase Pirúvica Labtest contém todos os
reagentes necessários a uma segura determinação, utilizando
um processo em 4 etapas e permitindo que a fotometria seja
realizada em qualquer fotômetro que tenha filtros com emissão
entre 490 a 540 nm.
Os reagentes são rigorosamente padronizados e estabilizados
visando à manutenção de rígidas e ótimas condições para a
ação enzimática.
O hidróxido de sódio é preparado e titulado em condições de
rigoroso controle, o que elimina a presença de carbonato e
assegura uma ação correta do reagente.
METODOLOGIA
Reitman e Frankel.
REAGENTES
1. TGP Substrato - Armazenar entre 2 - 8 °C.
Contém tampão 67 mmol/L, pH 7,4; ácido a-cetoglutárico
2,0 mmol/L; L-alanina 100 mmol/L e azida sódica 15,4 mmol/L.
2. Reagente de Cor - Armazenar entre 2 - 8 °C. Não congelar.
Contém 2,4-dinitrofenilhidrazina 1,0 mmol/L e ácido clorídrico
1,0 mol/L.
3. NaOH - Estoque - Armazenar entre 15 - 25 °C.
Contém hidróxido de sódio 1,25 mol/L. Reagente corrosivo.
4. Padrão - Armazenar entre 2 - 8 °C.
Contém piruvato de sódio 2 mmol/L. Após o manuseio
sugere-se armazenar bem vedado para evitar evaporação.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nas
condições indicadas, são estáveis até a data de expiração
impressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estão
sujeitos à contaminações de natureza química e microbiana
que podem provocar redução da estabilidade.
PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS
Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na
manipulação de reagentes.
O NaOH - Estoque contém hidróxido de sódio que é corrosivo e
pode produzir queimaduras.
O TGP Substrato contém azida sódica que é tóxica. Deve-se
tomar cuidado para evitar a ingestão e, no caso de contato com
os olhos, deve-se lavar imediatamente com grande quantidade
de água e procurar auxílio médico. A azida pode formar
compostos altamente explosivos com tubulações de chumbo e
cobre. Utilizar grandes volumes de água para descartar o
reagente.
Como ocorre com toda reação enzimática, a rigorosa
observação do tempo e da temperatura de incubação é de
grande importância para a qualidade dos resultados obtidos. A
diferença de 1 minuto no tempo de incubação desta dosagem
introduz um erro de 3,3% nos resultados.
MATERIAL NECESSÁRIO E NÃO FORNECIDO
Banho-maria mantido à temperatura constante (37 °C)
Fotômetro capaz de medir, com exatidão, absorbância entre
490 e 540 nm.
Pipetas para medir amostras e reagentes.
Cronômetro.
INFLUÊNCIAS PRÉ-ANALÍTICAS
Exercícios em excesso (alta atividade) diminuem a atividade
da ALT.
Em pessoas do sexo feminino de todas as idades, a atividade
da ALT é mais baixa que em indivíduos do sexo masculino.
Esteróides anabólicos, andrógenos, cloranfenicol,
clorotiazida, uso prolongado de aspirina, gentamicina, entre
outros, podem provocar um aumento da atividade da TGP.
AMOSTRA
Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP)
que estabeleça procedimentos adequados para colheita,
preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos que
os erros devidos à amostra podem ser muito maiores que os
erros ocorridos durante o procedimento analítico.
Usar soro ou plasma (EDTA, heparina) e líquor. A atividade
enzimática é estável 4 dias entre 2 - 8 °C e 2 semanas a 10 °C
negativos.
Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras
de sangue não transmitem infecções, todas elas devem ser
consideradas como potencialmente infectantes. Portanto, ao
manuseá-las devem-se seguir as normas estabelecidas para
biossegurança.
Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimos
aplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteção
ambiental.
INTERFERÊNCIAS
Valores de Bilirrubina até 5 mg/dL, Hemoglobina até 90 mg/dL
e Triglicérides até 250 mg/dL não produzem interferências
significativas.
Valores de Hemoglobina até 180 mg/dL e Triglicérides entre
250 e 750 mg/dL produzem resultados falsamente elevados
que podem ser corrigidos utilizando o branco de amostra.
Valores de Bilirrubina acima de 5 mg/dL e Triglicérides acima
de 750 mg/dL produzem resultados falsamente elevados.
Neste caso o branco de amostra não é aplicável.
Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina em
uma amostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo:
Diluir 0,05 mL da amostra em 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L
(0,85%) e medir a absorbância em 405 ou 415 nm acertando o
zero com água deionizada ou destilada.
Hemoglobina (mg/dL) @ Absorbância405 x 601
Hemoglobina (mg/dL) @ Absorbância415 x 467
PROCEDIMENTO
Ver observação 3.
Tomar 1 tubo de ensaio e proceder como a seguir:
Teste
TGP Substrato (nº 1)
Minimização da Ação de Interferentes
Branco de Amostra: Misturar 3,0 mL de NaCl 150 mmol/L
(0,85%) com 0,05 mL da amostra. Medir a absorbância em
505 nm, acertando o zero com água deionizada ou destilada.
Subtrair a absorbância assim obtida da absorbância do teste e
obter a atividade da transaminase pirúvica utilizando a curva
de calibração. Este sistema de correção é aplicável apenas
nos casos em que a amostra produz interferência fotométrica.
Incubar em banho-maria a 37 °C durante 2 minutos. O nível da
água no banho deve ser superior ao nível dos reagentes nos
tubos de ensaio.
Amostra
A água utilizada deve ter resistividade ³1 megaohm ou
condutividade £1 microsiemens e concentração de silicatos
0,1 mg/L.
CURVA DE CALIBRAÇÃO
Como o sistema de medida Reitman-Frankel (Unidades/mL)
não segue a lei de Beer, é impossível utilizar o método do fator
para cálculo, sendo necessária a preparação de curva de
calibração.
Tomar 5 tubos de ensaio e proceder como a seguir:
1
2
3
4
5
mL
mL
mL
mL
mL
Padrão (nº 4)
---
0,1
0,2
0,3
0,4
TGP Substrato (nº 1)
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
Água destilada ou deionizada 0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
Reagente de Cor (nº 2)
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
Misturar e deixar a temperatura ambiente durante 20 minutos.
NaOH de Uso
TRAÇADO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO
Traçar a curva de calibração correlacionando as leituras
obtidas com os valores em Unidades/mL expressos na tabela
abaixo, utilizando papel linear (para absorbâncias) ou monolog
(para T%).
TGP (Unidades/mL)
NaOH de Uso
2,5 mL
Misturar e esperar 5 minutos. Determinar as absorbâncias ou
T% em 505 nm ou filtro verde (490 a 540), acertando o zero
com água destilada ou deionizada. A cor é estável 60 minutos.
Obter o valor de TGP usando a curva de calibração (ver
Desempenho do Sistema).
O procedimento sugerido para a medição é adequado para
fotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igual
ou menor que 3,0 mL. Deve ser feita uma verificação da
necessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado.
Os volumes de amostra e reagente podem ser modificados
proporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do teste
e o procedimento de cálculo se mantém inalterado. Em caso de
redução dos volumes é fundamental que se observe o volume
mínimo necessário para a leitura fotométrica. Volumes da
amostra menores que 0,01 mL são críticos em aplicações
manuais e devem ser usados com cautela porque aumentam a
imprecisão da medição.
DESEMPENHO DO SISTEMA
Quando for obtido um valor igual ou maior que 150
Unidades/mL, diluir a amostra com NaCl 150 mmol/L (0,85%),
realizar nova medição e multiplicar o resultado pelo fator de
diluição. Diluir a amostra de tal modo que o valor encontrado se
situe entre 50 e 120 Unidades/mL. Sugerimos a verificação do
desempenho do sistema, no mínimo semestralmente,
utilizando amostras com valores até 150 Unidades/mL.
10,0 10,0 10,0 10,0 10,0
Misturar e deixar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
Determinar as absorbâncias ou T% em 505 nm ou filtro verde
(490 a 540), acertando o zero com água destilada ou
deionizada. A cor é estável 60 minutos.
Tubo nº
0,25 mL
Misturar e deixar a temperatura ambiente durante 20 minutos.
NaOH de Uso:
Transferir quantitativamente o conteúdo do frasco nº 3
(160 mL) para um balão volumétrico ou proveta, completar
para 500 mL com água destilada ou deionizada livre de CO2 e
homogeneizar. Estável 12 meses em recipiente de plástico
entre 15 - 25 °C.
Tubo nº
0,05 mL
Misturar e incubar em banho-maria a 37 °C por exatamente 30
minutos.
Reagente de Cor (nº 2)
PREPARO DO REAGENTE
Ver observações 1 e 2.
0,25 mL
2
3
4
5
Zero 28
1
57
97
150
CONTROLE INTERNO DA QUALIDADE
O laboratório deve manter um programa de controle interno da
qualidade que defina claramente os objetivos, procedimentos,
normas, critérios para limites de tolerância, ações corretivas e
registro das atividades. Ao mesmo tempo deve manter um
sistema definido para monitorar a variabilidade analítica que
ocorre em todo o sistema de medição. Portanto, o uso de
controles para avaliar a imprecisão e inexatidão das
determinações deve ser prática rotineira do laboratório clínico.
Sugere-se usar um controle com um valor situado na faixa de
referência ou no nível de decisão e outro controle com um valor
em outra faixa de significância clínica. Deve-se criar uma meta
de estado de controle para que a variação máxima encontrada
seja de 10% ou então utilizar o sistema de regras múltiplas de
7
Westgard para avaliação do estado de controle.
Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas da linha
Qualitrol da Labtest para controle interno da qualidade em
ensaios de química clínica.
VALORES DE REFERÊNCIA
Estes valores devem ser usados apenas como orientação.
Recomenda-se que cada laboratório estabeleça, na
população atendida, sua própria faixa de valores de referência.
Soro: 4 a 32 Unidades/mL.
UI = Unidades/mL x 0,482
8
CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO
Exatidão
Em duas amostras com concentrações de transaminase
pirúvica iguais a 9 e 75 Unidades/mL foram adicionadas
quantidades diferentes da enzima obtendo-se recuperações
entre 94 e 104%. O erro sistemático proporcional médio obtido
em um valor de 60 Unidades/mL foi igual a 1,8 unidades/mL ou
3,0%.
Especificidade
O método proposto foi comparado com um método similar
utilizando 80 amostras com valores situados entre 2 e 140
Unidades/mL. A comparação resultou na equação da
regressão: y = 0,817x - 0,241 e um coeficiente de correlação (r)
igual a 0,99. O erro sistemático total (constante e proporcional)
verificado no nível de decisão (60 Unidades/mL) foi igual a 11
Unidades/mL ou 18%. Como as amostras foram selecionadas
aleatoriamente em pacientes de ambulatório e pacientes
hospitalizados, pode-se inferir que o método tem uma
especificidade metodológica adequada.
Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio
No infarto agudo do miocárdio, os valores de ALT encontramse dentro da faixa de referência ou ligeiramente aumentados.
Elevações da ALT também são relatadas na polimiosite,
dermatomiosite e rabdomiólise.
OBSERVAÇÕES
1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são
fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e
obtenção de resultados corretos.
2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidade
adequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes e
usar nas medições, deve ter resistividade ³1 megaohm ou
condutividade £1 microsiemens e concentração de silicatos
<0,1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a água
pode ser do tipo III, com resistividade ³0,1 megaohms ou
condutividade £10 microsiemens. No enxágüe final utilizar
água tipo II. Quando a coluna deionizadora está com sua
capacidade saturada ocorre a produção de água alcalina com
liberação de vários íons, silicatos e substâncias com grande
poder de oxidação ou redução que deterioram os reagentes
em poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados de
modo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um
programa de controle da qualidade da água.
3. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas e
medicamentosas de interferência nos resultados e na
metodologia sugere-se consultar Young, DS. Effects of Drugs
on Clinical Laboratory Tests, 3ª edição, Washington: AACC
Press, 1990.
REFERÊNCIAS
1. Karmen A. J Clin Invest 1955;34:131.
2. Reitman S, Frankel S. Am J Clin Path 1957;28:56.
N
MÉDIA
DP
CV%
Amostra 1
20
21
0,91
4,3
Amostra 2
20
43
1,24
2,9
4. Tonks DB. Quality Control in Clinical Laboratories, WarnerChilcott Laboratories, Diagnostic Reagents Division,
Scarborough, Canada, 1972.
5. Varley H. Practical Clinical Biochemistry, Willian Heinemann
Medical Book Ltd. 1967.
Reprodutibilidade - Imprecisão total
N
MÉDIA
DP
CV%
Amostra 1
20
22
1,42
6,5
Amostra 2
20
42
2,20
5,3
Sensibilidade metodológica
Uma amostra protéica não contendo transaminase pirúvica foi
utilizada para calcular o limite de detecção do ensaio tendo
sido encontrado um valor igual a 3,0 Unidades/mL, equivalente
à média de 20 ensaios mais dois desvios padrão.
Efeitos da diluição da matriz
Duas amostras com valores iguais a 112 e 154 Unidades/mL
foram utilizadas para avaliar a resposta do sistema nas
diluições da matriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usando
fatores de diluição que variaram de 2 a 4 foram encontradas
recuperações entre 91 e 100%.
SIGNIFICADO CLÍNICO
Elevações das transaminases ocorrem na hepatite (viral e
tóxica), na mononucleose, cirrose, colestase, carcinoma
hepático primário ou metastático, pancreatite, traumatismo
extenso e no choque prolongado. Valores de ALT são iguais ou
superiores aos de AST na maioria dos pacientes com hepatite
viral, icterícia pós-hepática ou colestase intra-hepática. Nos
casos de cirrose hepática, hepatite alcóolica ou carcinoma
metastático, os valores de ALT são inferiores aos de AST.
3. Tietz NW. Fundamentals of Clinical Chemistry, W.B.
Saunders Co, 1970.
6. Wroblewski F, Cabaud P. Am J Clin Path 1957;27:235.
7. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Growth T.1981;27:493501.
8. Labtest: Dados de arquivo.
APRESENTAÇÃO
Catálogo
53-200
Nº de testes
Volume/Teste
200
3,0 mL
TGP Substrato
Reagente de Cor
NaOH - Estoque
Padrão
1 x 50 mL
1 x 50 mL
1 x 160 mL
1 x 4 mL
INFORMAÇÕES AO CONSUMIDOR
Termos e Condições de Garantia
A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produto
dentro das especificações até a data de expiração indicada
nos rótulos, desde que os cuidados de utilização e
armazenamento indicados nos rótulos e nestas instruções
sejam seguidos corretamente.
Serviço de Apoio ao Cliente
Telefone: 0800 31-3411 (Ligação gratuita)
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Labtest Diagnóstica S.A.
CNPJ: 16.516.296/0001-38
Av. Paulo Ferreira da Costa, 600
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Revisão: Outubro, 2004
Ref.: 181104
Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.
Reprodução sob prévia autorização
Instruções de Uso
TRIGLICÉRIDES Liquiform
METODOLOGIA
6
Enzimático-Trinder .
Cat. 87
ANVISA 10009010070
REAGENTES
1. Reagente 1 - Armazenar entre 2 - 8 °C.
Contém tampão 50 mmol/L, pH 6,9; acetato de magnésio
4 mmol/L; 4-clorofenol 5 mmol/L; 4-aminoantipirina
300 mmol/L; ATP 1,0 mmol/L; lipase da lipoproteína ³1400 U/L;
glicerolquinase ³1000 U/L; glicerolfosfato oxidase ³1500 U/L;
peroxidase ³900 U/L e azida sódica 7 mmol/L.
FINALIDADE
Sistema enzimático para determinação dos triglicérides por
reação de ponto final em amostras de soro ou plasma (EDTA).
Somente para uso diagnóstico in vitro.
1-5
PRINCÍPIO
Os triglicérides são determinados de acordo com as seguintes
reações:
Para preservar o desempenho, o reagente deve permanecer
fora da geladeira somente o tempo necessário para se obter o
volume a ser utilizado. Evitar exposição à luz solar direta. O
reagente tem uma tonalidade rósea.
Lipase da
Triglicérides
Glicerol + Ácidos Graxos
Lipoproteína
Glicerolquinase
Glicerol + ATP
Glicerol-3-Fosfato + ADP
Mg
+2
Glicerol-3-Fosfato
Glicerol-3-Fosfato + O2
Dihidroxiacetona + H2O2
Oxidase
Peroxidase
2 H2O2 + 4-Aminoantipirina + 4-Clorofenol
Quinoneimina+ 4 H2O
A lipase da lipoproteína promove a hidrólise dos triglicérides
liberando glicerol, que é convertido, pela ação da
glicerolquinase, em glicerol-3-fosfato. Este é oxidado a
dihidroxiacetona e peróxido de hidrogênio na presença da
glicerolfosfato oxidase. Em seguida, ocorre uma reação de
acoplamento entre peróxido de hidrogênio, 4-aminoantipirina e
4-clorofenol, catalisada pela peroxidase, produzindo uma
quinoneimina que tem máximo de absorbância em 505 nm.
A intensidade da cor vermelha formada é diretamente
proporcional à concentração dos triglicérides na amostra.
CARACTERÍSTICAS DO SISTEMA
Triglicérides Liquiform utiliza metodologia colorimétrica
enzimática que confere boa reprodutibilidade e grande
especificidade ao sistema.
O reagente é disponibilizado sob a forma líquida, facilitando
assim sua aplicação e eliminando a possibilidade de se
introduzir erros durante as preparações de reagentes.
A necessidade de se repetir o teste em amostras de valores
elevados é minimizada pela grande linearidade do sistema que
se estende até 1100 mg/dL.
Os dados de repetitividade e reprodutibilidade obtidos com o
sistema Triglicérides Liquiform demonstram que o método é
capaz de fornecer resultados que superam as metas de
desempenho para as medidas dos triglicérides estabelecidas
pelo National Cholesterol Education Program (NCEP). A
comparação entre as imprecisões encontradas na
repetitividade e na reprodutibilidade demonstra que o sistema
de medição é bastante robusto nas regiões de concentrações
significativas para uso clínico, indicando que tem um
desempenho muito estável no dia a dia.
O sistema é facilmente aplicável a analisadores automáticos e
semi-automáticos capazes de medir com exatidão a
absorbância em 505 nm.
2. Padrão - Armazenar entre 2-30 °C.
Contém triglicérides 200 mg/dL e azida sódica 7 mmol/L.
Após o manuseio armazenar bem vedado para evitar
evaporação.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nas
condições indicadas, são estáveis até a data de expiração
impressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estão
sujeitos a contaminações de natureza química e microbiana
que podem provocar redução do tempo de estabilidade.
PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS
Para preservar o desempenho, os reagentes devem
permanecer fora da geladeira somente o tempo necessário
para se obter o volume a ser utilizado. Evitar exposição à luz
solar direta.
Não utilizar o Reagente 1 quando sua absorbância medida
contra água em 505 nm for igual ou maior que 0,300 ou quando
mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação. O reagente
tem uma tonalidade rósea.
Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na
manipulação dos reagentes.
Os reagentes contêm azida sódica que é tóxica. Deve-se
tomar cuidado para evitar a ingestão e no caso de contato com
os olhos deve-se lavar imediatamente com grande quantidade
de água e procurar auxílio médico. A azida pode formar
compostos altamente explosivos com tubulações de chumbo e
cobre. Utilizar grandes volumes de água para descartar os
reagentes.
MATERIAL NECESSÁRIO E NÃO FORNECIDO
Banho-maria mantido à temperatura constante (37 °C).
Fotômetro capaz de medir com exatidão a absorbância entre
490 e 520 nm.
Pipetas para medir amostras e reagentes.
Cronômetro.
5, 7, 8
INFLUÊNCIAS PRÉ-ANALÍTICAS
Como a concentração de triglicérides é influenciada por
hábitos dietéticos recentes, como consumo de álcool e por
variações do peso corporal e exercício físico, os valores dos
triglicérides em um mesmo indivíduo são bastante variáveis.
Os dados obtidos dentro de um mês, usando um método com
CV analítico de 3,0%, mostraram que a variação biológica
pode ser maior que 90% da variação intra-individual total.
Mesmo nos estados de jejum, ocorre considerável variação
biológica, podendo mostrar diferenças de 21% em medições
repetidas no mesmo indivíduo. Portanto, ao comparar
resultados repetidos de triglicérides com intervalos de
semanas ou meses deve-se considerar o efeito da variação
biológica.
Na ausência de jejum a concentração plasmática dos
triglicérides modifica-se consideravelmente no mesmo
indivíduo apresentando diferenças de até 1000%.
Amostras colhidas com heparina podem fornecer resultados
falsamente diminuídos.
Obter a amostra com o paciente assentado. O torniquete não
deve ser mantido por tempo maior que um minuto. Liberar o
torniquete antes de aspirar o sangue.
A contaminação do material utilizado ou da amostra com
glicerol fornece valores falsamente elevados. Assim, os
resultados obtidos em pacientes recebendo alimentação
parenteral devem ser interpretados com cautela porque esta
alimentação contém elevados teores de glicerol.
Níveis elevados de ácido ascórbico (vitamina C) produzem
interferências negativas por competição com o cromogênio na
reação da peroxidase. Se houver suspeita da presença de
ácido ascórbico, deixar o soro em repouso durante 90 minutos
antes de iniciar a dosagem para evitar resultados de
triglicérides falsamente diminuídos. Este procedimento
minimiza os valores de ácido ascórbico, podendo não ser
eficiente caso a concentração deste esteja elevada na
amostra.
AMOSTRA
Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP)
que estabeleça procedimentos adequados para colheita,
preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos que
os erros devidos à amostra podem ser muito maiores que os
erros ocorridos durante o procedimento analítico.
A amostra de sangue deve ser obtida após jejum de 12-14
horas. Deve-se enfatizar ao paciente a necessidade do jejum
no tempo recomendado. A falta de padronização nas colheitas
das amostras para a dosagem dos triglicérides tem gerado
enormes conflitos entre pacientes, médicos clínicos e os
laboratórios, porque, em muitos casos, não se toma o cuidado
de enfatizar aos pacientes a necessidade do jejum de 12-14
horas antes da colheita da amostra.
Usar soro ou plasma com EDTA. O analito é estável por dois
dias entre 2-8 °C. O armazenamento prolongado da amostra
não é recomendado. Os triglicérides podem ser hidrolisados,
liberando glicerol, o que leva à obtenção de resultados
falsamente diminuídos quando o ensaio utiliza branco para
eliminar a interferência do glicerol livre.
A heparina promove a ativação in vivo ou in vitro da lipase da
lipoproteína, fazendo com que a concentração dos triglicérides
se reduza gradativamente em amostras contendo heparina.
Este fenômeno ocorre também em amostras de soro obtidas
em pacientes recebendo doses terapêuticas de heparina.
Estas orientações para obtenção e conservação da amostra
9
estão padronizadas segundo as recomendações do NCEP .
Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina em
uma amostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo:
Diluir 0,05 mL da amostra em 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L
(0,85%) e medir a absorbância em 405 ou 415 nm, acertando o
zero com água deionizada ou destilada.
Hemoglobina (mg/dL) @ Absorbância405 x 601
Hemoglobina (mg/dL) @ Absorbância415 x 467
PROCEDIMENTO
Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:
Branco
Teste
Amostra
----
0,01 mL
----
Padrão
----
----
0,01 mL
1,0 mL
1,0 mL
1,0 mL
Reagente 1
Misturar e incubar em banho-maria a 37 °C durante 10
minutos. O nível da água no banho deve ser superior ao nível
dos reagentes nos tubos de ensaio. Determinar as
absorbâncias do teste e padrão em 505 nm ou filtro verde
(490 a 520), acertando o zero com o branco. A cor é estável 60
minutos.
O procedimento sugerido para a medição é adequado para
fotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igual
ou menor que 1,0 mL. Deve ser feita uma verificação da
necessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado.
Os volumes de amostra e reagente podem ser modificados
proporcionalmente, sem prejuízo para o desempenho do teste,
mantendo-se inalterado o procedimento de cálculo. Em caso
de redução dos volumes, é fundamental que se observe o
volume mínimo necessário para a leitura fotométrica. Volumes
de amostra menores que 0,01 mL são críticos em aplicações
manuais e devem ser usados com cautela porque aumentam a
imprecisão da medição.
CÁLCULOS
Ver linearidade.
Absorbância do Teste
Triglicérides (mg/dL) =
x 200
Absorbância do Padrão
Exemplo:
Absorbância do Teste = 0,174
Absorbância do Padrão = 0,202
0,174
Triglicérides (mg/dL) =
x 200 = 172
0,202
Devido a grande reprodutibilidade que pode ser obtida com a
metodologia, pode-se utilizar o método do fator.
200
Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras
de sangue não transmitem infecções, todas elas devem ser
consideradas como potencialmente infectantes. Portanto, ao
manuseá-las, devem-se seguir as normas estabelecidas para
biossegurança.
Fator de Calibração =
Para descartar os reagentes e o material biológico, sugerimos
aplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteção
ambiental.
Fator =
INTERFERÊNCIAS
Valores de bilirrubina até 10 mg/dL e hemoglobina até
200 mg/dL não produzem interferências significativas. Valores
de bilirrubina maiores que 10 mg/dL produzem resultados
falsamente diminuídos.
Padrão
Absorbância do Padrão
Triglicérides (mg/dL) = Absorbância do Teste x Fator
Exemplo:
200
= 990
0,202
Triglicérides (mg/dL) = 0,174 x 990 = 172
CALIBRAÇÃO
O padrão é rastreável ao Standard Reference Material (SRM)
1951 do National Institute of Standards and Technology
(NIST).
Calibrações manuais
Obter o fator de calibração ao usar novo lote de
reagentes ou quando o controle interno da qualidade
indicar.
Sistemas automáticos
Branco de reagentes: água ou solução de cloreto de
sódio 150 mmol/L (0,85%);
Padrão: usar calibradores protéicos. As concentrações
de triglicérides na linha Calibra são rastreáveis ao SRM
1951do NIST.
"
"
"
Intervalo de calibrações
Deve-se recalibrar o sistema nas seguintes situações:
Calibração do branco ao usar novo frasco de
reagente;
Calibração de 2 ou 3 pontos ao mudar de lote;
Calibração de 2 ou 3 pontos quando o controle
interno da qualidade indicar.
"
"
"
LINEARIDADE
O resultado da medição é linear até 1100 mg/dL. Para valores
maiores, diluir a amostra com NaCl 150 mmol/L (0,85%),
realizar nova medição e multiplicar o resultado obtido pelo fator
de diluição. Diluir a amostra de tal modo que o valor encontrado
se situe entre 100 e 250 mg/dL. Sugerimos a verificação da
linearidade metodológica e fotométrica, no mínimo
semestralmente, utilizando amostras com valores até
1100 mg/dL.
CONTROLE INTERNO DA QUALIDADE
O laboratório deve manter um programa de controle interno da
qualidade que defina claramente os objetivos, procedimentos,
normas, critérios para limites de tolerância, ações corretivas e
registro das atividades. Ao mesmo tempo deve-se manter um
sistema definido para monitorar a variabilidade analítica que
ocorre em todo o sistema de medição. Portanto, o uso de
controles para avaliar a imprecisão e desvios de calibração
deve ser prática rotineira no laboratório clínico. Sugere-se usar
um controle com um valor situado na faixa de referência ou no
nível de decisão e outro controle com um valor em outra faixa
de significância clínica. Deve-se criar uma meta de estado de
controle para que o erro de bias seja £ ± 5,0%, o coeficiente de
variação seja £ ± 5,0% e o erro total £ ± 15,0%, conforme
9
estabelecido pelo NCEP . Sugere-se realizar a monitorização
contínua do estado de controle através do sistema de regras
de controle.
Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas da linha
Qualitrol da Labtest para controle interno da qualidade em
ensaios de química clínica.
VALORES DESEJÁVEIS OU RECOMENDADOS
São valores que substituem os valores de referência. Foram
determinados a partir de dados epidemiológicos tratados
estatisticamente e estabelecem a concentração de
triglicérides como fator de risco independente para doença
11
coronariana isquêmica .
Triglicérides (mg/dL)
Desejável
Limiar Alto
Elevado
Muito Elevado
<150
150 - 199
200 - 499
>500
Valores desejáveis ou recomendados pediátricos
12
Triglicérides (mg/dL)
Desejável
Elevado
< 10 anos
10 a 19 anos
£100
>100
£130
>130
Conversão: Unidades Convencionais (mg/dL) x 0,0113 =
Unidades SI (mmol/L).
13
CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO
Exatidão
A recuperação foi obtida utilizando diluições de amostras com
valores elevados de triglicérides. As recuperações variaram
entre 100 e 102%.O erro sistemático proporcional médio
obtido em um valor de 200 mg/dL é igual a 4 mg/dL ou 2%.
Especificidade
O método proposto foi comparado com um método similar
utilizando 40 amostras com valores situados entre
38 e 652 mg/dL medidas em duplicata. A comparação resultou
na equação da regressão: y = 1,035x -1,4 e um coeficiente de
correlação (r) igual a 0,998. O erro sistemático total (constante
e proporcional) verificado no nível de decisão (200 mg/dL) é
igual a 7,0 mg/dL ou 3,5%. O erro total no mesmo nível de
decisão é 5,0%. Como as amostras foram selecionadas
aleatoriamente em pacientes de ambulatório e pacientes
hospitalizados, pode-se inferir que o método tem uma
especificidade metodológica adequada e atende aos
9
requisitos especificados pelo NCEP .
Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio
N
MÉDIA
DP
Amostra 1
80
151
1,59
CV(%)
1,06
Amostra 2
80
197
2,59
1,31
Amostra 3
80
412
4,30
1,04
DP
CV(%)
Reprodutibilidade - Imprecisão total
N
MÉDIA
Amostra 1
80
151
2,89
1,92
Amostra 2
80
197
3,80
1,93
Amostra 3
80
412
6,58
1,60
Sensibilidade metodológica
Uma amostra protéica não contendo triglicérides foi utilizada
para calcular o limite de detecção do ensaio tendo sido
encontrado um valor igual a 1,72 mg/dL, equivalente à média
de 20 ensaios mais dois desvios padrão. Utilizando-se a
absorbância do padrão como parâmetro, verificou-se que o
limite de detecção fotométrica é de 0,99 mg/dL,
correspondendo a uma absorbância igual a 0,001.
Efeitos da diluição da matriz
Duas amostras com valores iguais a 977 e 1051 mg/dL foram
utilizadas para avaliar a resposta do sistema nas diluições da
matriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usando fatores de
diluição que variaram de 2 a 8 foram encontradas
recuperações entre 100 e 102%.
SIGNIFICADO CLÍNICO
Recentes meta-análises de estudos prospectivos indicam que
os triglicérides elevados são também um fator de risco
independente para doença coronariana isquêmica (DCI).
Fatores que contribuem para valores elevados de triglicérides
na população em geral incluem obesidade e sobrepeso,
inatividade física, tabagismo, consumo excessivo de álcool e
dietas com elevado conteúdo de carboidratos.
Os achados de que valores triglicérides elevados representam
um fator de risco independente para DCI sugerem que
algumas lipoproteínas ricas em triglicérides sejam
aterogênicas, principalmente as VLDL parcialmente
degradadas, comumente chamadas lipoproteínas
remanescentes.
Na prática clínica, o colesterol VLDL (Triglicérides ¸ 5) é a mais
simples medida das lipoproteínas aterogênicas
remanescentes. Assim, o colesterol VLDL pode ser também
um alvo da terapêutica para redução do colesterol. O Adult
Treatment Panel (ATP) III proposto pelo NCEP identifica a
soma dos valores de colesterol LDL+VLDL [Colesterol não
HDL (colesterol total - colesterol HDL)] como alvo secundário
da terapêutica em pessoas com triglicérides elevados
(³200 mg/dL). A meta para o colesterol não HDL, em pessoas
com valores elevados de triglicérides, pode ser estabelecida
como sendo o valor do colesterol LDL mais 30 mg/dL (VLDL),
com base na premissa de que valores de colesterol VLDL
11
menores que 30 mg/dL são considerados desejáveis .
São causas de elevação dos triglicérides as várias doenças de
lípides chamadas hiperlipidemias ou hiperlipoproteinemias.
Nestas, sejam de causa primária ou secundária, ocorre
elevação dos triglicérides nos tipos I, IIb, III, IV e V.
3. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas e
medicamentosas de interferência nos resultados e na
metodologia sugere-se consultar: Young, DS. Effects of Drugs
on Clinical Laboratory Tests, 3ª edição, Washington: AACC
Press, 1990.
REFERÊNCIAS
1. Bucolo G, David H. Clin Chem 1973;19:475.
2. Fossati P, Prencipe L. Clin Chem 1982;28:2077.
3. Mc Gowan MW, Artiss JD, Strandbergh DR, Zak B. Clin
Chem 1983;29:538.
4. Nagele V, Hagele EO, Sauer G, Wiedeman E, Lehmann P,
Wahlefeld AW, Gruber W J Clin Chem Clin Biochem
1984;22:165.
5. Stein EA, Myers Gl. Clin Chem 1995;41:1421-26.
6. Trinder P. Ann Clin Biochem 1969;6:24.
7. Narayanan S. Indian J Clin Biochem 1996;11:12-16.
8. Rifai N, Warnick GR, Dominiczak MH. Handbook of
lipoprotein testing., Washington:AACC Press, 1997:75-97.
9. NCEP - Recommendations on Lipoprotein Measurement.
NIH Publication 95-3044, Bethesda, MD, 1995.
10. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem
1981;27:493-501.
11. Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of
High Blood Cholesterol in Adults. JAMA 2001;285:2486-97.
As hiperlipidemias ocorrem secundariamente no diabetes,
pancreatite, doença do armazenamento de glicogênio,
síndrome nefrótica, insuficiência renal crônica,
hipotireoidismo, gravidez e mieloma múltiplo.
12. Leite PF, Martinez TLR, Halpeen A, Cendoroglo MS,
Novazzi JP, Fonseca FAH, Dias JCA. Risco cardiovascular:
fatores metabólicos e nutricionais: diagnóstico e
tratamento. São Paulo: Loyola, 1994.p.56.
Várias mulheres em uso de estrógenos ou contraceptivos orais
apresentam aumento nas concentrações de triglicérides. A
hipertrigliceridemia também encontra-se associada ao uso de
bloqueadores beta-adrenérgicos, corticosteróides, diuréticos
tiazídicos e retinóides.
13. Labtest: Dados de arquivo.
APRESENTAÇÃO
Catálogo
Reagente 1
OBSERVAÇÕES
1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são
fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e
obtenção de resultados corretos.
2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidade
adequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes e
usar nas medições, deve ter resistividade ³1 megaohm ou
condutividade £1 microsiemens e concentração de silicatos
<0,1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a água
pode ser do tipo III, com resistividade ³0,1 megaohms ou
condutividade £10 microsiemens. No enxágüe final utilizar
água tipo II. Quando a coluna deionizadora está com sua
capacidade saturada ocorre a produção de água alcalina com
liberação de vários íons, silicatos e substâncias com grande
poder de oxidação ou redução que deterioram os reagentes
em poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados de
modo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um
programa de controle da qualidade da água.
Revisão: Novembro, 2004.
Ref.: 200606
Padrão
87-1/100
87-2/100
87-2/250
87-2/500
1 x 100 mL
2 x 100 mL
2 x 250 mL
2 x 500 mL
1 x 5 mL
1 x 5 mL
1 x 5 mL
1 x 5 mL
INFORMAÇÕES AO CONSUMIDOR
Termos e Condições de Garantia
A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produto
dentro das especificações até a data de expiração indicada
nos rótulos, desde que os cuidados de utilização e
armazenamento indicados nos rótulos e nestas instruções
sejam seguidos corretamente.
Serviço de Apoio ao Cliente
Telefone: 0800 31-3411 (Ligação gratuita)
e-mail: [email protected]
Labtest Diagnóstica S.A.
CNPJ: 16.516.296/0001-38
Av. Paulo Ferreira da Costa, 600 - Vista Alegre
Lagoa Santa - Minas Gerais - Brasil - 33400-000
www.labtest.com.br
Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.
Reprodução sob prévia autorização
DIAGNÓSTICA
URÉIA CE
Cat. 27
ANVISA 10009010011
FINALIDADE
Sistema enzimático-colorimétrico para a determinação da
uréia em amostras de sangue e urina, por reação de ponto
final.
Somente para uso diagnóstico in vitro.
PRINCÍPIO
A uréia é hidrolisada pela urease à íons amônio e CO2. Os íons
amônio reagem em pH alcalino com salicilato e hipoclorito de
sódio, sob a ação catalisadora do nitroprussiato de sódio para
formar azul de indofenol.
A intensidade da cor formada é proporcional à quantidade de
uréia na amostra.
CARACTERÍSTICAS DO SISTEMA
O sistema Uréia CE Labtest enzimático-colorimétrico utiliza
concentrações otimizadas de reagentes, principalmente a
urease, permitindo operar com cinética de ordem zero até uma
concentração de 300 mg/dL.
Consegue-se obter uma faixa dinâmica bastante extensa,
reduzindo-se acentuadamente a repetição de testes em
valores elevados.
O método utiliza a técnica manual e é facilmente aplicável em
analisadores semi-automáticos e automáticos capazes de
pipetar dois reagentes e medir com exatidão a absorbância
entre 580 e 620 nm.
Por todas estas razões, a Uréia CE Labtest é o método de
escolha quando se deseja utilizar uma metodologia
enzimática-colorimétrica para a determinação da uréia.
METODOLOGIA
Urease-Labtest.
REAGENTES
1. Urease - Armazenar entre 2 - 8 oC. Contém tampão fosfato
10 mmol/L e urease ³ 268 KU/L.
2. Tampão - Estoque - Armazenar entre 2 - 8 ºC. Contém
tampão fosfato 100 mmol/L, pH 6,9; salicilato de sódio
312 mmol/L e nitroprussiato de sódio 16,8 mmol/L.
3. Oxidante - Estoque - Armazenar entre 2 - 8 ºC. Contém
hidróxido de sódio 2,8 mol/L e hipoclorito de sódio 121 mmol/L.
4. Padrão 70 mg/dL - Armazenar entre 2 - 8 ºC. Contém azida
sódica 7,7 mmol/L.
Armazenar bem vedado para evitar evaporação.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nas
condições indicadas, são estáveis até a data de expiração
impressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estão
sujeitos à contaminações de natureza química e microbiana
que podem provocar redução da estabilidade.
PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS
Não armazenar os reagentes nas proximidades de soluções
de amônia.
Instruções de Uso
Como o volume da amostra é pequeno, deve-se pipetar
diretamente no fundo do tubo de ensaio realizando uma
medição cuidadosa para minimizar problemas de imprecisão.
Contaminação da água, vidraria e ambiente com amônia pode
produzir resultados falsamente elevados. Deve-se evitar fumar
próximo ao local das dosagens.
Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na
manipulação de reagentes.
O padrão de uréia contém azida sódica que é toxica. Deve-se
tomar cuidado para evitar a ingestão e no caso de contato com
os olhos, deve-se lavar imediatamente com grande quantidade
de água e procurar auxílio médico. A azida pode formar
compostos altamente explosivos com tubulações de chumbo e
cobre. Portanto, utilizar grandes volumes de água para
descartar o reagente.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nas
condições indicadas, são estáveis até a data de expiração
impressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estão
sujeitos à contaminações de natureza química e microbiana
que podem provocar redução da estabilidade.
MATERIAL NECESSÁRIO E NÃO FORNECIDO
Banho-maria mantido à temperatura constante (37 °C).
Fotômetro capaz de medir com exatidão a absorbância entre
580 e 620 nm.
Pipetas para medir amostras e reagentes.
Cronômetro.
INFLUÊNCIAS PRÉ-ANALÍTICAS
Os níveis de uréia no soro ou plasma aumentam
consideravelmente após exercícios físicos e com a idade.
Em mulheres grávidas, os níveis de uréia no soro e na urina
diminuem consideravelmente.
A alimentação aumenta os níveis de uréia no soro ou plasma,
principalmente em mulheres.
Para controle terapêutico, é aconselhável colher a amostra
sempre no mesmo horário devido a variações circadianas da
uréia.
AMOSTRA
Deve ser criado um procedimento Operacional Padrão (POP)
que estabeleça procedimentos adequados para colheita,
preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos que
os erros devidos à amostra podem ser muito maiores que os
erros ocorridos durante o procedimento analítico.
Usar soro ou plasma (fluoreto, oxalato, heparina, EDTA) e
urina. Não usar anticoagulantes contendo amônia. A
concentração de fluoreto na amostra não deve ser maior que
3 mg/mL pois o fluoreto em altas concentrações é inibidor da
urease.
O uso de anticoagulante Glistab da Labtest (Cat.29) permite a
colheita de uma só amostra para as dosagens de uréia, glicose
e creatinina.
A uréia é estável no soro ou plasma por 12 horas entre
15 - 25 ºC e vários dias entre 2 - 8 ºC. Não utilizar amostras com
sinais de contaminação microbiana.
A urina de 24 horas deve ser colhida em frasco contendo
2,0 mL de HCI 50% e centrifugada antes de usar. Não utilizar
formol como preservativo para a urina.
Pagina: 1
DIAGNÓSTICA
Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras
de sangue não transmitem infecções, todas elas devem ser
consideradas como potencialmente infectantes. Portanto, ao
manuseá-las deve-se seguir as normas estabelecidas para
biossegurança.
Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimos
aplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteção
ambiental.
INTERFERÊNCIAS
Valores de Bilirrubina até 32 mg/dL, Hemoglobina até 80 mg/dL
e Triglicérides até 900 mg/dL não produzem interferências
significativas.
Misturar e incubar a 37 ºC durante 5 minutos. Determinar as
absorbâncias do teste e padrão em 600 nm (580 a 620),
acertando o zero com o branco. A cor é estável 2 horas.
O procedimento sugerido para a medição é adequado para
fotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igual
ou menor que 2,0 mL. Deve ser feita uma verificação da
necessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado.
Os volumes de amostra e reagente podem ser modificados
proporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do teste
e o procedimento de cálculo se mantém inalterado. Em caso de
redução dos volumes é fundamental que se observe o volume
mínimo necessário para a leitura fotométrica.
Valores de Hemoglobina maiores que 80 mg/dL e Triglicérides
maiores que 900 mg/dL produzem interferências positivas que
não podem ser minimizadas com o uso do branco da amostra.
CÁLCULOS
Ver Linearidade.
Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina em
uma amostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo:
Diluir 0,05 mL da amostra em 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L
(0,85%) e medir a absorbância em 405 ou 415 nm acertando o
zero com água deionizada ou destilada.
mg/dL =
Absorbância do teste
Hemoglobina(mg/dL) @ Absorbância405 x 601
Hemoglobina(mg/dL) @ Absorbância415 x 467
x 70
Absorbância do padrão
Exemplo:
Absorbância do teste = 0,269
Absorbância do padrão = 0,610
0,269
Uréia (mg/dL) =
PREPARO DE REAGENTES
Ver observações 1 e 2.
x 70 = 31
0,610
Tampão de Uso:
Adicionar o conteúdo do frasco nº 2 (100 mL) a 400 mL de água
destilada ou deionizada e misturar. Estável 12 meses em
frasco âmbar entre 2 - 8 ºC.
Oxidante de Uso:
Adicionar o conteúdo do frasco nº 3 (25 mL) a 475 mL de água
destilada ou deionizada e misturar. Estável 12 meses em
frasco plástico entre 2 - 8 ºC.
A água deve ter uma resistividade ³ 1 megaohm ou uma
condutividade £ 1 microsiemens e concentração de silicatos
< 0,1 mg/L.
Devido a grande reprodutibilidade que pode ser obtida com a
metodologia pode-se utilizar o método do fator.
70
Fator de calibração =
Absorbância do padrão
mg/dL = Absorbância do teste x Fator
Exemplo:
70
Fator =
= 114,8
0,610
Urease Tamponada:
Adicionar 1,0 mL de Urease (nº 1) a 20 mL do Tampão de Uso.
Estável 21 dias em frasco de vidro âmbar entre 2 - 8 ºC.
Uréia (mg/dL) = 0,269 x 114,8 = 31
Não armazenar os reagentes nas proximidades de soluções
de amônia.
Urina (mg/24 horas) =
PROCEDIMENTO
Ver Precauções e Cuidados Especiais.
Para a dosagem de uréia na urina, diluir a amostra 1:50 (0,1 mL
de urina + 4,9 mL de água destilada ou deionizada). Multiplicar
o resultado obtido por 50.
Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:
BRANCO
TESTE
Amostra
---
0,01 mL
---
Padrão (nº 4)
---
---
0,01 mL
1,0 mL
1,0 mL
1,0 mL
Urease Tamponada
PADRÃO
Misturar e incubar a 37 ºC durante 5 minutos.
Oxidante de Uso
BRANCO
TESTE
PADRÃO
1,0 mL
1,0 mL
1,0 mL
mg/dL x volume de 24 horas (mL)
100
CALIBRAÇÃO
O padrão é rastreável ao Standard Reference Material (SRM)
912a do National Institute of Standards and Technology (NIST).
Calibrações Manuais
" Obter semanalmente o fator de calibração.
Sistemas Automáticos
" Branco de reagentes: água ou solução de NaCl 150 mmol/L
(0,85%);
" Padrões: usar calibradores protéicos. As concentrações de
"
Uréia no Calibra 1 e Calibra 2 da Labtest são rastreáveis ao
SRM 912a do NIST.
Intervalo de calibrações
Deve-se recalibrar o sistema nas seguintes situações:
Calibração de 2 ou 3 pontos ao mudar de lote;
Calibração de 2 ou 3 pontos quando o controle interno da
qualidade indicar.
"
"
Pagina: 2
DIAGNÓSTICA
LINEARIDADE
O resultado da medição é linear até 300 mg/dL. Quando a
absorbância do teste for maior que 1,0, diluir o produto corado
e o branco 1:5 com água destilada ou deionizada, fazer nova
leitura e multiplicar o resultado obtido por 5. Se após a diluição
for obtido um valor igual ou maior que 300 mg/dL, diluir a
amostra com NaCl 150 mmol/L (0,85 %), realizar nova
medição e multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição.
Diluir a amostra de tal modo que o valor encontrado se situe
entre 50 e 100 mg/dL.
CONTROLE INTERNO DA QUALIDADE
O laboratório deve manter um programa de controle interno da
qualidade que defina claramente os objetivos, procedimentos,
normas, critérios para limites de tolerância, ações corretivas e
registro das atividades. Ao mesmo tempo deve-se manter um
sistema definido para monitorar a variabilidade analítica que
ocorre em todo o sistema de medição. Portanto, o uso de
controles para avaliar a imprecisão e inexatidão das
determinações deve ser prática rotineira do laboratório clínico.
Sugere-se usar um controle com um valor situado na faixa de
referência ou no nível de decisão e outro controle com um valor
em outra faixa de significância clínica. Deve-se criar uma meta
de estado de controle para que a variação máxima encontrada
seja de 5% ou então utilizar o sistema de regras múltiplas de
5
Westgard para avaliação do estado de controle.
Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas Qualitrol 1 e
Qualitrol 2 da Labtest para controle interno da qualidade em
ensaios de química clínica.
VALORES DE REFERÊNCIA
Estes valores devem ser usados apenas como orientação.
Recomenda-se que cada laboratório estabeleça sua própria
faixa de valores de referência na população atendida.
Soro ou plasma: 15 a 40 mg/dL.
Urina: 26 a 43 g/24 horas.
Conversão: Unidades Convencionais (mg/dL) x 0,166 =
Unidades SI (mmol/L).
6
CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO
Exatidão
Em duas amostras com concentrações de uréia iguais a 20 e
50 mg/dL foram adicionadas quantidades diferentes do analito
obtendo-se recuperações entre 97 e 100%. O erro sistemático
proporcional médio obtido em um valor de 60 mg/dL foi igual a
0,9 mg/dL ou 1,5%.
Especificidade
O método proposto foi comparado com um método similar
utilizando 40 amostras com valores situados entre
17 e 116 mg/dL. A comparação resultou na equação da
regressão: y = 1,147 + 0,973x e um coeficiente de correlação
(r) igual a 0,998. O erro sistemático total (constante e
proporcional) verificado no nível de decisão (60 mg/dL) foi igual
a 0,47 mg/dL ou 0,78%. Como as amostras foram
selecionadas aleatoriamente em pacientes de ambulatório e
pacientes hospitalizados, pode-se inferir que o método tem
uma especificidade metodológica adequada.
Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio
N
MÉDIA
DP
CV%
Amostra 1
20
24
0,12
0,5
Amostra 2
20
60
0,48
0,8
Reprodutibilidade - Imprecisão total
N
MÉDIA
DP
CV%
Amostra 1
20
24
0,30
1,3
Amostra 2
20
60
0,57
0,9
Sensibilidade metodológica
Uma amostra protéica não contendo uréia foi utilizada para
calcular o limite de detecção do ensaio tendo sido encontrado
um valor igual a 2,03 mg/dL, equivalente à média de 20 ensaios
mais dois desvios padrão. Utilizando-se a absorbância do
padrão como parâmetro, verificou-se que o limite de detecção
fotométrica é de 0,11 mg/dL, correspondendo a uma
absorbância igual a 0,001.
Efeitos da diluição da matriz
Duas amostras com valores iguais a 74 e 264 mg/dL foram
utilizadas para avaliar a resposta do sistema nas diluições da
matriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usando fatores de
diluição que variaram de 2 a 16 foram encontradas
recuperações entre 99 e 108%.
SIGNIFICADO CLÍNICO
Fisiologicamente a uréia se eleva devido à dieta hiperprotéica
ou com a idade, particularmente após 40 anos. Sua diminuição
ocorre na gravidez normal e nos indivíduos em dietas com
baixo valor protéico e alto teor glicídico.
Elevações da uréia ocorrem também por catabolismo elevado
(febre, septicemia) e hemorragias internas, principalmente do
trato gastrointestinal.
As elevações da uréia por defeito de excreção se devem à
causas pré-renais (insuficiência cardíaca congestiva), causas
renais (nefrites, pielonefrites e insuficiência renal aguda ou
crônica). A uréia começa a se elevar no sangue quando a
velocidade de filtração glomerular é menor que 10 mL/minuto.
As causas pós-renais são obstruções no trato urinário
(cálculos, carcinomas ou pólipos).
Diminuições da uréia não têm expressão clínica e são
encontradas na soroterapia com carboidratos devido a
problemas de diluição, redução do catabolismo protéico e
aumento da diurese.
A dosagem sérica de creatinina é considerada mais específica
para a avaliação da função glomerular, mas pode ser menos
sensível em algumas doenças renais precoces. A disfunção
renal é melhor avaliada através das dosagens de uréia e
creatinina associadas.
OBSERVAÇÕES
1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são
fatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes e
obtenção de resultados corretos.
2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidade
adequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes e
usar nas medições, deve ter resistividade ³1 megaohm ou
condutividade £1 microsiemens e concentração de silicatos
<0,1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a água
pode ser do tipo III, com resistividade ³0,1 megaohms ou
condutividade £10 microsiemens. No enxágüe final utilizar
água tipo II. Quando a coluna deionizadora está com sua
capacidade saturada ocorre a produção de água alcalina com
liberação de vários íons, silicatos e substâncias com grande
poder de oxidação ou redução, que deterioram os reagentes
em poucos dias ou mesmo horas alterando os resultados de
modo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um
programa de controle da qualidade da água.
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DIAGNÓSTICA
3. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas e
medicamentosas de interferência nos resultados e na
metodologia sugere-se consultar Young DS. Effects of Drugs
on Clinical Laboratory Tests. 3ª edição, Washington DC: AACC
Press, 1990.
REFERÊNCIAS
1. Bergmeyer HU. Methods of Enzymatic Analisis, Volume 9,
pag 449-453, VCH Publishers, Florida, 1985.
2. Bollet WT, Bushman CJ, Tidwell PT. Anal Chem
1961;33:592-594.
3. Tonks DB. Quality Control in Clinical Laboratories.
Diagnostic Reagents Division, Ontario, 1970.
4. Weatherburn MW. Anal Chem 1967;39:971-974.
5. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR Clin Chem 1981;27:493501.
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APRESENTAÇÃO
Catálogo
Nº de testes*
Volume/teste
Urease
Tampão - Estoque
Oxidante - Estoque
Padrão
27-500
500
2,0 mL
1 x 25 mL
1 x 100 mL
1 x 25 mL
1 x 3 mL
*O número de testes em aplicações automáticas depende
dos parâmetros de programação.
Revisão: Agosto, 1999
Ref.: 260104
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