UBA1- BQ UBA1- BQ Sumário: •Princípios básicos: velocidade de reacção •Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática: - Concentração de enzima -Concentração de substrato -equação de Michaelis-Menten -Determinação dos parâmetros cinéticos: equação de Lineweaver-Burk - pH -Temperatura •As Enzimas no Diagnóstico Clínico -As isoenzimas e as doenças do coração -diagnóstico do enfarte do miocárdio Universidade Católica Portuguesa UBA1- BQ UBA1- BQ Princípios básicos: velocidade de reacção A velocidade da reacção enzimática (V): é medida pela quantidade de produto (ou produtos) formado por unidade de tempo. •Velocidade inicial •Velocidade num instante t1 Universidade Católica Portuguesa UBA1- BQ UBA1- BQ Princípios básicos: velocidade de reacção A velocidade é mais elevada no início e vai decrescendo com o tempo. Isto acontece essencialmente porque: P reacção mais lenta vo E S P (i) com o aumento de [P], começa a dar-se também a reacção inversa, P → S (ii) [S] vai decrescendo ao longo do tempo de reacção, o que também diminui a velocidade da reacção directa S → P. (iii) se a reacção for muito prolongada, começa a haver desnaturação da molécula enzimática. reacção inicial (mais elevada) Tempo (t) Para evitar estes problemas, utiliza-se sempre a velocidade inicial (vo), uma vez que se estará então a contabilizar apenas S → P, com [S] conhecida e [P] = 0: Universidade Católica Portuguesa UBA1- BQ UBA1- BQ Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática: A- Concentração de Enzima •Traçando um gráfico com as velocidades obtidas nestas experiências, em função das concentrações de enzima, verificamos que a variação é linear [E] Universidade Católica Portuguesa UBA1- BQ UBA1- BQ Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática: B- Concentração de substrato •A relação entre a concentração de substrato e as velocidades iniciais obtidas é hiperbólica. V0 [S] Universidade Católica Portuguesa UBA1- BQ UBA1- BQ Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática: B- Concentração de substrato •KM = concentração de S para a qual a velocidade da reacção é metade da velocidade máxima (Vmax) ( metade de todos os locais activos estão ocupados) Universidade Católica Portuguesa UBA1- BQ UBA1- BQ Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática: B- Concentração de substrato: determinação dos parâmetros cinéticos (Km e Vmax) •A equação que traduz o comportamento da curva de vo em função de [S] (curva de Michaelis-Menten) é a equação de Michaelis-Menten: Permite, após determinação experimental das variações de v em função de [S], obter o valor de Vmax e calcular KM S1: maior afinidade S2: menor afinidade KM1 ... KM é uma medida da afinidade da enzima para o substrato (= 1/KM) (KM elevado → afinidade baixa) KM2 Universidade Católica Portuguesa UBA1- BQ UBA1- BQ Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática: B- Concentração de substrato: determinação dos parâmetros cinéticos (Km e Vmax) Devido às dificuldades de cálculo de KM através da equação de Michaelis -Menten, procurou-se obter uma representação linear da relação entre V0 e S que pudesse ser traduzida por uma recta... Universidade Católica Portuguesa UBA1- BQ UBA1- BQ Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática: B- Concentração de substrato: determinação dos parâmetros cinéticos (Km e Vmax) Exemplo velocidades iniciais de reacção da fosfatase ácida a várias concentrações de glicerol, [S]. Universidade Católica Portuguesa UBA1- BQ UBA1- BQ Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática: B- Concentração de substrato: determinação dos parâmetros cinéticos (Km e Vmax) Como medir a eficiência de uma enzima em dadas condições??? Kcat=Vmax/Et ...usando a razão Kcat/KM (Kcat –velocidade de catálise máxima) (Máxima) Perfeição enzimática Algumas enzimas aproximam-se destes valores... Universidade Católica Portuguesa UBA1- BQ UBA1- BQ Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática: B- Concentração de substrato: determinação dos parâmetros cinéticos (Km e Vmax) Estas enzimas são limitadas apenas pela velocidade com que encontram o substrato em solução Universidade Católica Portuguesa UBA1- BQ UBA1- BQ Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática: C- Efeito do pH Os pH extremos modificam irremediavelmente a estrutura das enzimas, quer devido a desnaturação, quer devido a alterações na ligação entre apoenzima e coenzima As enzimas podem apresentar dois tipos de curva de actividade em função do pH Universidade Católica Portuguesa UBA1- BQ UBA1- BQ Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática: C- Efeito do pH possível efeito duma alteração de pH ao nível do centro activo de um enzima: A. pH óptimo Universidade Católica Portuguesa B. pH inferior ao óptimo (maior [H+]) UBA1- BQ UBA1- BQ Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática: C- Efeito do pH Nem todas as enzimas têm o mesmo pH. Por exemplo, a pepsina, que hidrolisa proteínas a péptidos no estômago, extremamente ácido, e a tripsina, que hidrolisa péptidos a aminoácidos nas condições alcalinas do duodeno, têm óptimos de pH adaptados ao seu ambiente Em laboratório, quando estudamos a actividade de um enzima, temos que ter o cuidado de incluir um sistema tampão no meio de ensaio, de modo a estabilizar o pH; Universidade Católica Portuguesa UBA1- BQ UBA1- BQ Factores que afectam a velocidade de uma reacção enzimática: C- Efeito da temperatura Universidade Católica Portuguesa UBA1- BQ UBA1- BQ As Enzimas no Diagnóstico Clínico: •Libertadas para o plasma por células especificas (pequeno nº) (o figado liberta zimogénios envolvidos na coagulação) Enzimas plasmáticas: •Libertadas para o plasma durante o “turnover” celular (grande nº) (s seus níveis mantêm-se extremamente constantes e em equilibrio) Deste modo, determinando as variações da actividade enzimática no plasma sanguíneo, podem-se diagnosticar doenças Universidade Católica Portuguesa UBA1- BQ UBA1- BQ As Enzimas no Diagnóstico Clínico: Algumas enzimas apresentam apenas actividade elevada em órgãos específicos O aumento dos níveis plasmáticos dessas enzimas reflecte danos nesses tecidos Universidade Católica Portuguesa UBA1- BQ UBA1- BQ As Enzimas no Diagnóstico Clínico: •As isoenzimas e as doenças do coração … têm a mesma função mas pequenas diferenças em aminoácidos Podem ser separadas por electroforese •O padrão de isoenzimas plasmáticas pode servir para detectar o local da lesão LDH e CK Especialmente úteis quando o electrocardiograma é difícil de interpretar (episódios anteriores de doenças cardíacas) Universidade Católica Portuguesa UBA1- BQ UBA1- BQ As Enzimas no Diagnóstico Clínico: •As isoenzimas e as doenças do coração: diagnóstico do enfarte do miocárdio. •O miocárdio é o único tecido que possui + de 5% de CK2 (MB) → presença MB = enfarte do Miocárdio •CK2 (MB) → Pico de actividade às 24 h •LDH → Pico de actividade das 36 às 40 h •Importante no diagnóstico em pessoas que dão entrada após 48 h o enfarte do miocárdio •A presença de níveis elevados de CK3 (MM) é indicativa de danos musculares do miocárdio. 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